WO2022004805A1 - Ｎｋ細胞と抗体との結合を安定化する方法、及びその利用 - Google Patents

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吉和 米満
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Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing the binding between NK cells and an antibody.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in the fields of immunotherapy for cancer using NK cells and the manufacture of products such as regenerative medicine for that purpose.
  • Antibody drugs are designed to exert antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity and exhibit antitumor effects by specifically binding to tumor cells expressing on the cell surface with a specific antigen.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • it also binds to normal cells and exerts injury activity as well (on-target off-tumor effect). That is, the antibody drug itself cannot determine whether or not the cell is a tumor. Since this phenomenon is confirmed in the presence of leukocytes and in the absence of complement, it is shown that immune cells can also damage normal cells by ADCC activity if the antibody is bound.
  • administration of Rituxan which targets CD20 expressed by B cells, is known to damage normal B cells as a side effect.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • NK cells natural killer cells
  • NK cells are cytotoxic lymphocytes that act as a major factor in innate immunity and are important in the rejection of tumor cells and virus-infected cells.
  • Immunotherapy for cancer using NK cells in which NK cells amplified and activated in vitro are administered to patients, is attracting attention as a treatment method with relatively few side effects.
  • the present inventors have developed a novel cell of NK-like cells having high cytotoxic activity, and have obtained a unique idea that an antibody drug is bound to such cells in vitro and then administered to a patient. (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 is a chimeric fusion molecule having a tumor antigen-binding domain and an immune cell-binding domain for directing NK cells to antigen cells, and the antigen-binding domain is an isolation of the antigen-binding domain. It is suggested that the isolated antibody contains an immunoglobulin variable region and a constant region, and that the immune cell binding is a ligand specific to the NK cell receptor.
  • Patent Document 3 discloses that the NKp46-binding immunoglobulin region and a protein containing this variable region, for example, an antibody and a multispecific protein, are used to specifically redirect NK cells and lyse a target cell of interest.
  • Patent Document 4 proposes that a multispecific binding protein that binds to the NKG2D receptor and CD16 is bound to NK cells to activate NK cells, and the multispecific binding protein is human IgG1. It may contain an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acids 234-332 of the antibody.
  • NK cells can distinguish between tumor cells and normal cells. Therefore, if NK cells can be created as the only effector of ADCC activity by antibody drugs, theoretically, the on-target off-tumor effect can be completely eliminated.
  • the antibody drug itself should be administered systemically by instillation or the like. It is desirable to avoid the above and administer the antibody drug bound to NK cells.
  • the target antibody drug even if the target antibody drug is bound to the NK cell, the target antibody drug will be removed from the NK cell in the coexistence of a specific component or in a state where other antibodies compete with each other. It turned out. Therefore, there is a need for a technique that can stably moor the antibody on NK cells.
  • the present inventors have prepared a fusion protein consisting of a region I that can bind to the surface protein of NK cells, a region II that can bind to an antibody, and a linker that connects the region I and the region II, thereby producing a fusion protein.
  • a fusion protein consisting of a region I that can bind to the surface protein of NK cells, a region II that can bind to an antibody, and a linker that connects the region I and the region II, thereby producing a fusion protein.
  • the present invention provides: [1] A method for stabilizing the binding between NK cells and antibodies.
  • ⁇ Region I that can bind to surface proteins of NK cells and ⁇ Region II that can bind to antibodies
  • NK cell surface proteins were selected from the group consisting of NKp46, NKp30, NKG2D, IL-15R, IL-2R, KIR3DS1, NKG2C, NKp80, NKp65, NKp44, LALRA1, LILRA2, DNAM-1, and 2B4.
  • the method according to 1 or 2 wherein at least one of region I and region II is a single chain Fv fragment (scFv).
  • Method for producing NK cell population including the following steps: (1) Prepare a substance having a population of NK cells, an antibody, and a region I capable of binding to a surface protein of NK cells, and a region II capable of binding to an antibody; (2) An antibody is added to a population of NK cells in the presence of a protein to obtain a population of NK cells bound to the antibody. At this time, the NK cells and region I of the substance bind to the antibody. Region II of the substance binds and the substance stabilizes the binding of the antibody to NK cells.
  • a pharmaceutical composition comprising a population of NK cells to which an antibody drug is bound, wherein the binding of the antibody drug to the NK cells is stabilized by a substance having the following regions: -Region I that can bind to surface proteins of NK cells, and-Region II that can bind to antibodies.
  • the antibody drug will be used exclusively for NK cells, so that the side effect of damage to normal cells to which the antibody drug is bound by macrophage-based immune cells can be expected to be suppressed.
  • NK cells Conventional methods for enhancing antibody binding activity include modification of the sugar chain structure of the Fc region of the antibody (low fucose antibody) and modification of the amino acid sequence, but the present invention uses a completely different approach to apply the antibody on NK cells. Stable binding to.
  • a molecule having a favorable signal for activation and survival of NK cells can be selected as the surface protein of the NK cells to be anchored.
  • the lowercase part is NKp46 sFv
  • the enclosed part is Protein G
  • the underlined part is the linker.
  • the position (1) .. (57) is the 30K signal peptide-coding region
  • (58) .. (222) and (298) .. (432) are the protein G-coding region
  • (433) .. (477) is (G4S) 3linker-coding region, (478) ..
  • (1212) is scFv (NKp46) -coding region
  • (1213) .. (1233) is TEV protein-coding region
  • (1234) .. (1251) and (1276) .. (1293) are His Tag-coding regions
  • (1252) .. (1275) are Strep Tag II-coding regions.
  • the present invention relates to a method for stabilizing the binding between NK cells and an antibody using a substance having the following regions. ⁇ Region I that can bind to surface proteins of NK cells, and ⁇ Region II that can bind to antibodies
  • NK cells As the surface protein of NK cells to which region I of the substance of the present invention binds, various protein molecules on the surface of NK cells can be selected as long as the binding between the antibody and CD16 (Fc ⁇ RIII) on NK cells is not inhibited. .. Examples of such proteins include NKp46, NKp30, NKG2D, IL-15R, IL-2R, KIR3DS1, NKG2C, NKp80, NKp65, NKp44, LALRA1, LILRA2, DNAM-1, and 2B4.
  • NK cells Not inhibiting the binding of the antibody to CD16 (Fc ⁇ RIII) on NK cells means that, for example, when the substance binds to the cell surface protein and the antibody, the three-dimensional structure (for example, height) of the substance is appropriate. Point to. It was
  • the NK cell surface protein to which the region I of the substance of the present invention binds is expected to receive a favorable signal for NK cell activation or survival by binding. Is preferable. Examples of this include NKp30, NKp46, NKG2D and IL-15R. One of the particularly preferred examples is NKp46.
  • NKp46 has a large amount of ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) among the activated receptors possessed by NK cells, and is considered to be an extremely important molecule.
  • ITAM immunomunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • the anti-NKp46 antibody is commercially available as having an NK cell activating effect.
  • NK cell surface proteins molecules that bind to each are known.
  • NK cell surface proteins binding molecules (excluding anti-X antibodies)
  • NKp46 Cell Surface Vimentin (CSV)
  • NKp30 B7-H6 NKG2D: MICA, MICB, ULBP1 ⁇ 6 IL-15R: IL-15, IL-2 IL-2R: IL-15, IL-2 KIR3DS1: HLA-F, HLA-B NKG2C: HLA-E
  • NKp80 AICL
  • NKp65 KACL NKp44: MLL5,
  • PCNA LALRA1 HLA-B27dimer
  • LILRA2 soluble HLA DNAM-1: CD112, CD155
  • the region I of the substance of the present invention is defined as CSV, B7-H6, MICA, MICB, ULBP1-6, IL-15, IL-2, IL-15, IL-2, HLA-F, HLA-B, HLA.
  • -It can be selected from the group consisting of E, AICL, KACL, MLL5, PCNA, HLA-B27dimer, soluble HLA, CD112, CD155, and CD48.
  • Region I may also be an antibody or an antigen-binding fragment of an antibody capable of binding to the NK cell surface proteins described above.
  • Antigen-binding fragments of antibodies are single-chain Fv fragment (scFv), dimer scFv (di-scFv), diabody, triabody, tetrabody, Fab, F (ab' ) 2, including Fv.
  • region I is an antigen-binding domain of an antibody that binds to NKp46 and is described in Patent Document 3, more specifically, SEQ ID NO: 119, 120 in the sequence listing of this document. , 121, or 122, where region I is preferably a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 121 (in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 of the sequence listing herein). It has an amino acid sequence after position 141).
  • Region I is also a binding molecule to the NK cell surface proteins described above, namely CSV, B7-H6, MICA, MICB, ULBP1-6, IL-15, IL-2, HLA-F, HLA-B, HLA-E, Among AICL, KACL, MLL5, PCNA, HLA-B27dimer, soluble HLA, CD112, CD155, and CD48, the peptide may be a peptide containing a region capable of binding to an NK cell surface protein.
  • the region capable of binding to the NK cell surface protein in B7-H6 is SEQ ID NO: 3
  • the region capable of binding to the NK cell surface protein in MICA is SEQ ID NO: 4
  • the region capable of binding to the NK cell surface protein in MICA is SEQ ID NO: 4.
  • the region capable of binding to a protein is SEQ ID NO: 5
  • the region capable of binding to NK cell surface protein in IL-15 is SEQ ID NO: 6
  • the region capable of binding to NK cell surface protein in IL-2 is SEQ ID NO: 7
  • the region capable of binding to the NK cell surface protein in HLA-F is SEQ ID NO: 8
  • the region capable of binding to the NK cell surface protein in HLA-B is SEQ ID NO: 9
  • the region capable of binding to the NK cell surface protein in HLA-E is capable of binding to the NK cell surface protein.
  • Regions can bind to SEQ ID NO: 10, NK cell surface proteins in CD112, SEQ ID NOs: 11, regions that can bind to NK cell surface proteins in CD155, SEQ ID NOs: 12, and regions that can bind to NK cell surface proteins in CSV.
  • Region: 32 Region that can bind to NK cell surface protein in ULBP1 is SEQ ID NO: 33
  • Region that can bind to NK cell surface protein in ULBP2 is SEQ ID NO: 34
  • Binds to NK cell surface protein in ULBP3 Possible regions are SEQ ID NO: 35
  • regions capable of binding to NK cell surface proteins in ULBP4 are SEQ ID NOs: 36
  • regions capable of binding to NK cell surface proteins in ULBP5 are SEQ ID NOs: 37
  • regions capable of binding to NK cell surface proteins in ULBP6 are NK cell surface proteins.
  • the bindable region is SEQ ID NO: 38
  • the region that can bind to the NK cell surface protein in AICL is SEQ ID NO: 39
  • the region that can bind to the NK cell surface protein in KACL is SEQ ID NO: 40
  • the NK cell surface protein in PCNA is listed as SEQ ID NO: 41
  • the region capable of binding to NK cell surface protein is listed as SEQ ID NO: 42.
  • a sequence having high sequence identity with any one of these amino acid sequences, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in any one of these amino acid sequences, and Polypeptides capable of binding to NK cell surface proteins can be used as well.
  • the number of amino acids to be substituted or the like in the case of "amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added” is any of them, unless otherwise specified.
  • the protein is not particularly limited as long as the protein consisting of the amino acid sequence has a desired function, but the number is about 1 to 9 or 1 to 4, or even more if the protein is replaced with an amino acid having similar properties. There may be replacement of the number of.
  • identity the number of matching amino acids shared between the two sequences when the two sequences are arranged in the optimum manner, unless otherwise specified. Means percentage.
  • identity (number of matched positions / total number of positions) ⁇ 100.
  • Search and analysis of amino acid sequence identity can be performed by algorithms or programs well known to those of skill in the art (eg, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW). The parameters when using the program can be appropriately set by those skilled in the art, and the default parameters of each program may be used.
  • High identity means that the identity is at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 97.5% or more, still more preferably 99% or more. More preferably, it is 99.8% or more.
  • region II of the substance of the present invention various protein molecules having binding property to the antibody can be selected as long as the binding between the antibody and CD16 (Fc ⁇ RIII) on NK cells is not inhibited.
  • Fc-binding ligands for IgG such as protein A (yellow staphylococcal domain B (B1, B2, B3, B4, B5)), protein G (lensa bacillus).
  • Group C domain B (B1, B2), group G domain C (C1, C2, C3)), protein L, protein Z, protein LG, protein LA, protein AG, PAM, D-PAM, D-PAM -F, TWKTSRISIF, FGRLVSSIRY, Fc-III, Fc-III- (Sepharose) FcBP-2, Fc-III-4C, EPIHRSTLTALL, APAR, FcRM, HWRGWV, HYFKFD, HFRRHL, cyclo [(N ⁇ -Ac) S (A) )-, RWCitGWV, D 2 AAG DAAG, RWHYFK-Lact-E], cyclo [(N ⁇ -Ac)-Dap (A) -RWHYFK-Lact-E], cyclo [(N ⁇ -Ac) S (A) -RWHYFK -Lact-E], cyclo [Link-M-WFRHYK], NKFRGKYK, NARKF
  • Region II may also be an antibody or an antigen-binding fragment of an antibody.
  • Antigen-binding fragments of antibodies are single-chain Fv fragment (scFv), dimer scFv (di-scFv), diabody, triabody, tetrabody, Fab, F (ab' ) 2, including Fv.
  • Region II may be one that specifically binds to the Fc site of IgG using a cross-linking agent.
  • the cross-linking agent is a chemical substance for covalently linking an IgG-binding peptide and IgG Fc.
  • the cross-linking agent of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art, and desired amino acids (eg, lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosveric acid, etc. Alternatively, it can be a compound having at least two sites that can bind to (diaminopropionic acid, arginine, etc.).
  • Examples thereof are, but are not limited to, a cross-linking agent containing two or more succinimidyl groups such as DSG (discusin imidazole glutarate) and DSS (discusin imidazole svelate), DMA (dimethyldihydrochloride adipimide acid).
  • DTBP 3,3'-dithiobispropionimide acid
  • a cross-linking agent containing preferably two or more imidoic acid moieties such as salt
  • DMP dimethyl dichloride dihydrochloride
  • DMS dimethyl dichloride dihydrochloride
  • cross-linking agents having an SS bond such as (dimethyldihydrochloride) and DSP (dithiobiscucin-imidylpropionic acid).
  • the IgG-binding peptide modified with a cross-linking agent can be added to IgG in a short time and with almost no side reaction.
  • region II has an amino acid residue in its sequence that can react with the cross-linking agent.
  • amino acid residues are proteinogenic amino acids such as lysine residues, cysteine residues, aspartic acid residues, and glutamic acid residues, as well as non-proteinogenic amino acids such as diaminopropionic acid and 2-aminosveric acid. It is preferably a lysine residue.
  • Region II has no or few other residues in its sequence that are the same as amino acid residues capable of reacting with the cross-linking agent (eg, only one or two). Is preferable.
  • the amino acid residue capable of reacting with the cross-linking agent is a lysine residue
  • the peptide of the present invention has no lysine residue in the sequence at a place other than the amino acid residue to react with the cross-linking agent. It is preferable that there is no or almost no lysine.
  • region II peptides having amino acid residues capable of reacting with such cross-linking agents are peptides having the sequences set forth in the sequence listing of WO2016 / 186206 as SEQ ID NOs: 1-17, 36 and 37. Is. They are listed in the sequence listings herein as SEQ ID NOs: 13-29, 30 and 31, respectively.
  • a sequence having high sequence identity with any one of these amino acid sequences, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in any one of these amino acid sequences, and Polypeptides capable of binding to NK cell surface proteins can be used as well.
  • Such peptides bind to the Fc domain of IgG.
  • Lys248 residue corresponding to the 18th residue of human IgG CH2
  • Lys246 residue corresponding to the 18th residue of human IgG CH2
  • Eu numbering in human IgGFc (16th residue of human IgG CH2).
  • Region II may also be an aptamer and a small molecule compound that recognizes the Fc region.
  • the aptamer may be a variant as long as the Fc region can be recognized.
  • Examples of aptamers that recognize the Fc region include human IgG aptamers (International Publication No. 2007/004748, RNA, 2008, Vol.14, pp.1154-1163).
  • Small molecule compounds that recognize the Fc region include mannosyl erythritol lipids (J Biomedical Materials Res.A, 2003, Vol.65, pp.379-385) and transition metal ions (J Appl Polym Sci, 89, 1567-1572, J Chromatography B, 2003, Vol.
  • the substance of the present invention may have a linker portion that connects the region I and the region II.
  • the linker can have various structures as long as region I can bind to the surface protein of NK cells, region II can bind to the antibody, and the antibody binds to CD16 (Fc ⁇ RIII) on NK cells. ..
  • the linker is, for example, a mobile linker and a peptide linker having a length of 2 to 31 amino acids.
  • the linker sequence is about 16 amino acids long.
  • preferred linkers include sequences (G4S) x 3 or peptides consisting of any of SGGGGSGGGGSGGGGS (GS16), SG (GS2), SGGGGS (GS6), SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (GS31).
  • the linker is a rigid linker.
  • the rigid linker comprises the sequence (EAAAK) n, where n is 1-3.
  • the rigid linker comprises (EAAAK) n, where n is 1-10 or about 1-100.
  • n is at least 1, or at least 2, or at least 3, or at least 4, or at least 5, or at least 6, or at least 7, or at least 8, or at least 9, or at least 10.
  • n is less than 100.
  • n is less than 90, or less than about 80, or less than about 60, or less than about 50, or less than about 40, or less than about 30, or less than about 20, or less than about 10.
  • the linker is a cleavable linker.
  • the linker can be cleaved with a protease or peptidase.
  • NK cells In general, NK cells are large granular lymphocytes that do not express the T cell receptor (TCR), the T cell universal marker CD3, and the membrane immunoglobulin B cell receptor, usually humans. Is CD16 positive and CD56 positive. Those skilled in the art can easily determine whether or not they are NK cells based on the expression pattern of cell surface markers and the like. NK cells have cytotoxic activity, and the presence or absence and degree of this cytotoxic activity can be measured by various known methods.
  • TCR T cell receptor
  • CD3 the T cell universal marker
  • CD56 membrane immunoglobulin B cell receptor
  • NK cells includes the above-mentioned general NK cells, and the NK cells include peripheral blood NK cells, umbilical cord blood NK cells, primary NK cells, cultured NK cells, and high NK cells. Includes active NK cells and the NK or NK-like cells of [1], [2], [3] and [4] below.
  • NK cells with the following characteristics (1) and (2): (1) CD16 positive, CD56 highly expressed, and CD57 negative. (2) NKG2C positive, NKG2A negative to low expression, and CD94 positive.
  • the highly active NK cells of [1] may be highly expressed in CD16. Further, the highly active NK cells of [1] may further have the following characteristics regardless of whether or not they are highly expressed in CD16. (3)
  • the cytotoxic activity is 50% or more when the NK cells are used as effector cells (E) and K562 cells are used as target cells (T) and co-cultured at a mixing ratio (E: T) 1: 1.
  • Highly active NK cells in [1] can also be expressed as: From healthy human-derived peripheral blood mononuclear cells, CD3 beads (eg, CliniMACS CD3, Miltenyi Biotec, Catalog No. 130-017-601), LD columns (eg, Miltenyi Biotec, Catalog No. 130-042-901) and Cell populations from which CD3-positive cells have been removed using a separation buffer (eg, 0.5% human AB type serum (deactivated), PBS containing 2 mM EDTA) are placed in a suitable medium (eg, 5% human AB).
  • a separation buffer eg, 0.5% human AB type serum (deactivated)
  • PBS containing 2 mM EDTA eg, 5% human AB
  • NK cells obtained by culturing in Cosmedium 008) supplemented with type serum (deactivated) for 14 days and having the following characteristics (1) and (3): (1) CD16 positive, CD56 highly expressed, and CD57 negative. (3) The cytotoxic activity is 50% or more when the NK cells are used as effector cells (E) and K562 cells are used as target cells (T) and co-cultured at a mixing ratio (E: T) 1: 1.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-193303 can be referred to.
  • the cells of [2] may be further highly expressed with CD11c.
  • the cells in [2] can also be represented as: CCR5 positive, CCR6 positive, CXCR3 positive, Integrin ⁇ 1 positive, Integrin ⁇ 3 positive and Integrin ⁇ 3 negative and CD3 negative cells.
  • the cells of [2] show extremely high cytotoxic activity against solid cancers that have formed tumor masses.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-170176 can be referred to.
  • CD3 beads eg, CliniMACS CD3, Miltenyi Biotec, 130-017-601 ( 5 ⁇ L per 1x10 7 cells)
  • frozen apheresis blood were used on mononuclear cells obtained from fresh peripheral blood or frozen apheresis blood.
  • Further added and suspended CD34 beads eg, CliniMACS CD34, Miltenyi Biotec, 130-017-501 ( 2.5 ⁇ L per 1x10 7 cells)
  • a separation buffer eg, 0.
  • Add 5% human AB serum deactivated at 56 ° C.
  • [4] When obtaining the cells of [1] to [3], either at the same time as IL-2 or in place of IL-2, selected from the group consisting of IL-12, IL-15, and IL-18.
  • Leong JW et al. Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 463-473 can be referred to for a specific method for producing such cells.
  • the present invention may be described by taking the case of using highly active NK cells as an example, but those skilled in the art can use the present invention to use some cytokine in vitro. It is also possible to understand the case of using cells that have undergone activation by using them.
  • the term “active or cytotoxic activity” for highly active NK cells and the like refers to the lytic ability of a target cell (effector cell, E) to a target cell (T) unless otherwise specified.
  • the cytotoxic activity can be expressed as a percentage (%) of the target cells that have died due to the effector cells, and is calculated by the following formula.
  • the mixing ratio of effector cells and target cells (E: T) and the co-culture time of effector cells and target cells are determined according to the degree of cytotoxic activity of effector cells. , It can be appropriately adjusted according to the type of cells used and the strength of activity.
  • the target cells may be, but are not limited to, K562 cells, acute myelogenous leukemia cells, and chronic myelogenous leukemia cells. Effector cells and target cells, live cells and dead cells can be distinguished and quantified by reagents such as antibodies labeled with a radioactive substance, a fluorescent dye, or the like.
  • the incubation time can be measured under the condition of 0.5 to 18 hours, preferably 1 to 12 hours.
  • the activity is preferably 60% or more, more preferably 70% or more.
  • the activity on the cells of interest is preferably less than 3%, more preferably less than 1% or not detected.
  • the present invention also provides a method for producing a population of NK cells, which comprises the following steps. (1) Prepare a substance having a population of NK cells, an antibody, and a region I capable of binding to a surface protein of NK cells, and a region II capable of binding to an antibody; (2) An antibody is added to a population of NK cells in the presence of a protein to obtain a population of NK cells bound to the antibody. At this time, the NK cells and region I of the substance bind to the antibody. Region II of the substance binds and the substance stabilizes the binding of the antibody to NK cells.
  • the raw material for the population of NK cells may be peripheral blood, cord blood, bone marrow and / or lymph nodes, blood collected by the apheresis method (apheresis blood).
  • the raw materials are embryonic stem cells, adult stem cells, and hematopoietic stem cells derived from any stem cell selected from the group consisting of artificial pluripotent stem (iPS) cells, cord blood-derived hematopoietic stem cells, peripheral blood-derived hematopoietic stem cells, and the like.
  • iPS artificial pluripotent stem
  • the donor of the raw material may be a patient who receives immunotherapy with highly active NK cells or the like, a close relative of the patient, or a healthy person who has no blood relationship with the patient. There may be multiple donors.
  • the medium used for culturing and activating the cells that are the raw materials for obtaining a population of NK cells is KBM501 medium (Kojin Bio Co., Ltd., including IL-2 at 1,750 JRU / mL), Cosmedium 008 ( Cosmobio. Contains 1,750 JRU / mL of IL-2), FKCM101 (Fukoku.
  • IL-2 Contains no IL-2 or contains 175 IU / mL of IL-2), CellGro SCGM medium (Cergenics, Iwai Chemicals Co., Ltd.) Company), X-VIVO15 Medium (Ronza, Takara Bio Co., Ltd.), Gibco (registered trademark) CTS (registered trademark) AIM V (registered trademark) Medium (Thermo Fisher Scientific. Proliferation and manipulation of T cells and dendritic cells Contains CTS OpTmizer T Cell Expansion Basal Medium (thermofisher scientific for growth and proliferation of human T lymphocytes), IMDM, MEM, DMEM, RPMI-1640, etc. Not limited to these.
  • Preferred examples are KBM501 medium, FKCM101 or Cosmedium 008.
  • culture when the term "culture” is used for cells, unless otherwise specified, for any purpose selected from the group consisting of cell survival maintenance, cell amplification, and cell activation. It means to maintain cells in a medium or a similar solution for a certain period of time. When the treatment is performed at a specific temperature for a certain period of time, it is sometimes called incubation.
  • IL-2 may be added to the medium at a concentration that can achieve the object of the present invention.
  • concentration of IL-2 may range from 2500 IU / mL to 2813 IU / mL.
  • IL-2 preferably has a human amino acid sequence and is preferably produced by recombinant DNA technology for safety reasons.
  • IL-2 concentrations may be expressed in national standard units (JRU) and international units (IU). Since 1 IU is about 0.622 JRU, 1750 JRU / mL of existing medium corresponds to about 2813 IU / mL.
  • IL-12 When any one selected from the group consisting of IL-12, IL-15, and IL-18 is added at a concentration that can achieve the object of the present invention at the same time as or in place of IL-2 described above.
  • concentration There is (Leong JW et al. Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 463-473).
  • Each concentration may range from 1 pg / mL to 1 ⁇ g / mL with or without the presence or concentration of other cytokines.
  • IL-2 preferably has a human amino acid sequence and is preferably produced by recombinant DNA technology for safety reasons.
  • the subject's autologous serum, human AB type serum available from BioWhittaker and others, and blood donated human serum albumin available from the Japanese Red Cross Society may be added to the medium.
  • Autologous serum and human ABO blood group serum are preferably added at a concentration of 1 to 10%
  • blood donated human serum albumin is preferably added at a concentration of 1 to 10%.
  • Human platelet lysate (HPL) may be added with or in place of serum.
  • HPL is commercially available, and UltraGROT M series (AventaCell BioMedical) etc. are on sale. When HPL is used, heparin sodium may be further added to the medium.
  • the medium may contain appropriate proteins, cytokines, antibodies, compounds and other components, provided that it does not impair the culturing effect of NK cells.
  • Cytokines include IL-2, IL-12, IL-15, and IL-18 described above, as well as IL-3, IL-7, IL-21, stem cell factor (SCF), and / or FMS-like tyrosine kinases. May be 3 ligands (Flt3L). All of these preferably have a human amino acid sequence and are preferably produced by recombinant DNA technology for safety reasons.
  • the medium is preferably a serum-free medium.
  • the serum-free medium preferably contains serum albumin, transferrin, and insulin.
  • Serum-free media for culturing lymphocytes have been developed and marketed, and they can be utilized in the present invention.
  • One of the preferred examples of the serum-free medium is a basal medium supplemented with CTS Immuno Cell SR (Thermo Fisher Scientific), which is commercially available as a composition that supports the growth of human T cells.
  • the medium may be replaced or replenished at any time after the start of culturing, provided that the desired culturing effect is obtained, but it is preferably every 3 to 5 days.
  • Culture vessels used for culturing include, but are not limited to, commercially available dishes, flasks, plates, multi-well plates.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as the culture effect of NK cells is not impaired, but the culture conditions are generally 37 ° C., 5% CO 2 and a saturated steam atmosphere.
  • the culture period is not particularly limited as long as the desired culture effect can be obtained.
  • the term antibody refers to any class (isotype) of immunoglobulin, unless otherwise specified.
  • immunoglobulin there are five classes of antibodies: IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the term "antibody” includes an antibody and an antibody drug having a sequence derived from the antibody, in addition to the antibody, unless otherwise specified.
  • the term antibody drug is not limited to the species from which it is derived, unless otherwise specified.
  • the antibody drug used in the present invention may be a mouse antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, or an antibody having no substance indicating its origin.
  • the present invention may be described by taking the case where the antibody is IgG as an example, but those skilled in the art may appropriately apply the description to the case where another class of antibody is used. I can understand.
  • IgG includes not only IgG but also molecules derived from IgG, unless otherwise specified.
  • Molecules derived from IgG include antibody fragments. Examples of this include Fab, scFv, V H- V L , scFv-C H 3, VhH, Dab, their weight bodies, and their fusions. (Nature Biotechnology volume 23, pages 1126-1136 (2005)).
  • Molecules derived from IgG also include single domain antibodies. Examples of this include VHH, VNAR and sdAb. Single-domain antibodies are capable of selectively binding to specific antigens and have a lower molecular weight compared to IgG and antibody fragments such as Fab, scFv.
  • VHH antibody variant domain of heavy chain of heavy chain antibody
  • H chain of camel family animals llama, alpaca, etc.
  • It can be produced at low cost and is expected to be used as an antibody drug (Front Immunol. 2017 Jun 9; 8: 653.).
  • IgG also includes an antibody drug having an IgG-derived sequence.
  • antibody drugs having IgG or IgG-derived sequences include mouse antibodies muromonab-CD3, ibritumomab tiuxetan, iodine 131 Tositumomab, catumaxomab, blinatumomab, moxetumomab pasudotox, and chimeric antibodies abciximab, rituximab, basiliximab, infliximab.
  • brentuximab vedotin siltuximab, dinutuximab, obiloxaximab, humanized antibodies daclizumab, palivizumab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamicin, alemtuzumab, omalizumab, efalizumab, bevacizumab, natalizumab, tocilizumab , Vedolizumab, pembrolizumab, idarucizumab, mepolizumab, elotuzumab, ixekizumab, reslizumab, atezolizumab, ocrelizumab, inotuzumab ozogamicin, emicizumab, benralizumab, galcanezumab, fremanezumab, tildrakizumab, caplacizumab golimumab, ustekinumab,
  • the antibody drug used in the present invention is preferably an antibody drug for treating cancer or infectious diseases.
  • Step (2) Stabilization of binding between antibody and NK cells
  • an antibody is added to a population of NK cells in the presence of the substance of the present invention to obtain a population of NK cells bound to the antibody. It binds and the antibody and region II of the substance bind, and the substance stabilizes the binding between the antibody and NK cells.
  • the population of NK cells, the antibody, and the substance of the present invention can be mixed at the time of use. For example, populations of NK cells, antibodies and substances can be maintained in separate containers and mixed just prior to administration to a few hours prior to administration to the subject.
  • a population of NK cells and a substance may be mixed and incubated followed by an antibody and further incubated, or a population of NK cells and a substance may be mixed and incubated followed by a population of NK cells and further incubated. May be good.
  • the method for producing a population of NK cells there may be a step of removing an antibody that is not bound to NK cells. That is, the population of NK cells obtained by this production method contains NK cells and antibodies, but all the antibodies are bound to NK cells and substantially no antibodies that are not bound to NK cells. preferable.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a population of NK cells to which an antibody drug is bound, wherein the binding of the antibody drug to the NK cells is stabilized by a substance having the following regions: -Region I that can bind to surface proteins of NK cells, and-Region II that can bind to antibodies.
  • the pharmaceutical composition is typically a form in which NK cells to which an antibody is bound and whose binding is stabilized by a substance are suspended in a solution.
  • a solution for suspending NK cells for example, a protective solution for freezing containing DMSO, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), medium, serum and the like are common.
  • the solution may contain a pharmaceutically acceptable carrier for pharmaceuticals and quasi-drugs.
  • the production of the pharmaceutical composition of the present invention is carried out under the conditions (good manufacturing practice, GMP) conforming to the manufacturing control and quality control rules for pharmaceuticals and non-pharmaceutical products, and the standards for manufacturing control and quality control of products such as regenerative medicine (Good Gene). , Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice, GCTP).
  • GMP good manufacturing practice
  • GCTP Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice
  • the pharmaceutical composition provided by the present invention can be applied to the treatment of various diseases having sensitivity such as highly active NK cells.
  • diseases are cancer or infectious diseases, specifically skin cancer, oral cancer, bile sac cancer, bile duct cancer, lung cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, etc. It includes, but is not limited to, pancreatic cancer, kidney cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, neuroblastoma, leukemia, and infections caused by viruses, bacteria, and the like.
  • Cell therapy using the pharmaceutical composition of the present invention may be performed alone or in combination with surgical therapy, chemotherapy, radiotherapy, antibody drug, etc.
  • NK cells do not damage normal cells at all even when activated and cultured in vitro, regardless of the presence or absence of antibody drug binding.
  • This finding indicates that by limiting the effector cells of ADCC activity by the antibody drug to NK cells, the safety of the antibody drug is improved while maintaining the benefits of ADCC activity.
  • NK cells present only in peripheral blood are few in number and activity for treating malignant tumors and infectious diseases, it is preferable to carry out activated culture in vitro. Based on this finding, NK cells activated in vitro can be limited to effector cells with ADCC activity by antibody drugs, and antibody drugs and highly active NK cells can be more easily used in treatment. This finding is particularly important for safety, especially when using highly active NK cells.
  • the supernatant was removed and suspended in a 0.5 mL separation buffer with a maximum cell count of 1x10 8 cells per LD column (Milteyi Biotec, 130-042-901). After adding 2 mL of the separation buffer in advance, the cell suspension was added to the LD column, and the eluate from the LD column was recovered. Further, 1 mL of separation buffer was added to the LD column, and the eluate was collected. Then, the column was washed with 1 mL of the separation buffer, the number of cells in the collected liquid was counted, and the total number of cells was calculated.
  • Centrifugation was performed at 500 x g for 5 minutes, and after removing the supernatant, the cells were cultured or frozen as CD3, CD34-removed PBMCs in STEM-CELL BANKER at 1 x 10 7 cells / mL at -80 ° C.
  • frozen PBMCs were used for culturing, they were thawed in a medium containing serum at a 10-fold dilution and the culturing was started.
  • the culture should be suspended in KBM501 medium * 4 so as to be 1x10 6 cells / mL, and 6-well plate (Thermo Fisher Scientific, 140675), T-75 flask (Thermo Fisher Scientific, 156499) or adhesive culture bag. (Nipro) was used in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). On the 9th day of culture, add KBM501 medium so that the final volume is 6 mL per well for a 6-well plate, 50 mL per flask for a T-75 flask, and 500 ml per bag for a bag. It was added and incubated until day 14.
  • cytotoxic activity For the measurement of cytotoxic activity, we prepared a group in which thawed NK cells and K562 cells were reacted, a group in which only K562 cells were used as a negative control, and a group in which K562 cells were fixed with 10% formalin as a positive control.
  • ⁇ NK ⁇ The cells cultured for 3 hours after the above thawing were collected and adjusted to a concentration of 2x10 6 cells / ml with 10% FBS / RPMI1640.
  • ⁇ Tumor cell line K562 cells (human chronic myeloid leukemia cell line) and Hut78 cells (human T lymphoma (Sezary syndrome) cell line) were suspended in RPMI1640 medium containing no serum component, and PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26GL-1KT). Staining with 10% FBS / RPMI1640 was finally adjusted to 2x10 6 cells / mL.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells obtained by the procedure of A). Above were used. Suspended in RPMI1640 medium containing no serum components, stained with PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH67GL-1KT), and finally adjusted to 2x10 6 cells / mL with 10% FBS / RPMI1640. did.
  • NK cells, K562 cells, and PBMC were added to a 96-well plate (IWAKI, 4870-800SP) so that the cell ratio was 1: 1 or 1: 1: 1.
  • the mixture was added to / ml, mixed, and reacted at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours. After the reaction, the mixture was centrifuged (500 x g, 5 minutes), the supernatant was removed, 7-AAD solution diluted with PBS was added and suspended, and the mixture was incubated at room temperature for 20 minutes. Measurements were made using a flow cytometer and analyzed with FlowJo software to calculate cytotoxic activity (% Lysis) * 5 .
  • Peripheral blood is centrifuged at 2,000 xg for 15 minutes at room temperature (brake off), and the obtained supernatant is obtained.
  • Example 1 Preparation of prototype substance
  • a protein with a region that binds to the antigen NKp46 on the NK cell membrane and a region that binds to IgG, and attempted to anchor the antibody drug onto the cell.
  • Anti-human NKp46 scFv SEQ ID NO: 121 described in the same document
  • WO2017 / 114694 was used as the region bound to NKp46.
  • 373-297aa from the Protein G sequence https://www.uniprot.org/uniprot/P19909 was used as the region that binds to IgG.
  • the fusion protein was outsourced to KAICO Co., Ltd. (217, Fukuoka City Industry-Academia Collaboration Exchange Center, 4-1 Kyudaishinmachi, Nishi-ku, Fukuoka City, Japan 819-0388), and was produced by the technique of recombinant protein expression using silk moth.
  • the amino acid sequence (385 amino acids length) of the designed protein is shown in Fig. 6.
  • Herceptin was added to 25 ⁇ L of PBS containing 350 ⁇ g / mL prototype material to 1 ⁇ g / mL, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ L of GAIA-102 (1x10 6 cells / mL) was seeded, and after centrifugation, the cells from which the supernatant had been removed were suspended in a prototype substance + Herceptin solution that had been reacted for 1 hour. The cells were allowed to stand at room temperature for another 1 hour, washed once with PBS, antibody-stained and measured according to the procedure described in C), and the presence or absence of Herceptin binding was analyzed.
  • cetuximab (Arbitux (registered trademark) injection, Merck Biopharma), Herceptin, Poterigio, rituximab (Rituxan (registered trademark) intravenous drip infusion, all drugs (Industry), various antibody drugs of dinutuximab (United Therapeutics) were suspended in PBS containing 1 ⁇ g / mL.
  • GAIA-102 (without anchoring with the prototype material) was similarly suspended in PBS containing each antibody drug. After allowing to stand at room temperature for 1 hour, the cells were washed once with PBS, antibody-stained and measured according to the procedure described in C), and the presence or absence of binding of each antibody drug was analyzed.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence, pG / Fc-NKp46 / scFv SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence, pG / Fc-NKp46 / scFv SEQ ID NOs: 3-12, and 32-42 Domains capable of binding to NK cell surface protein SEQ ID NOs: 13-31 WO2016 / 186206, SEQ ID NOs: 1-17, 36 and 37

Abstract

NK細胞上に抗体を安定的に結合させることを課題とする。NK細胞と抗体との結合を安定化する方法であって、NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、抗体に結合可能な領域IIを有する物質を用いる方法を提供する。物質は、領域Iと領域IIと、連結リンカー部をさらに含んでいてもよい。

Description

ＮＫ細胞と抗体との結合を安定化する方法、及びその利用
　本発明は、NK細胞と抗体との結合を安定化する方法に関する。本発明は、NK細胞を用いたがんの免疫療法、そのための再生医療等製品の製造等の分野で有用である。
　抗体医薬品は特定の抗原が胞表面に発現している腫瘍細胞に特異的に結合することで抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を発揮して抗腫瘍効果を示すよう設計されている。しかし、対象となる抗原を発現してさえいれば正常細胞にも結合し、同様に傷害活性を発揮してしまうことが知られている(on-target　off-tumor効果)。つまり、抗体医薬そのものは細胞が腫瘍なのか否かを判断できない。そしてこの現象は白血球存在下であれば補体の非存在下でも確認されるため、免疫細胞は抗体が結合していればADCC活性により正常細胞をも傷害し得るということを示している。例えばB細胞が発現するCD20をターゲットとするリツキサンの投与により、副作用として正常なB細胞は傷害を受けることが知られている。現在までにこのon-target　off-tumor効果を回避する手法は知られておらず、最新の免疫細胞治療であるCAR-T細胞が抱える最大の課題の一つとなっている。抗体が結合した正常細胞を傷害するのは主にマクロファージ系の細胞であるということが多角的に確認されてきている(非特許文献1)。
　一方、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)は、自然免疫の主要因子として働く細胞傷害性のリンパ球であり、腫瘍細胞やウイルス感染細胞の拒絶において重要である。体外で増幅し、活性化したNK細胞を患者に投与するというNK細胞によるがんの免疫療法が、副作用の比較的少ない治療方法として注目されている。本発明者らは、高い細胞傷害活性を有するNK様細胞の新規な細胞を開発し、また、そのような細胞に抗体医薬品を体外で結合させてから患者に投与するという独自の着想を得てきた(特許文献1)。
　他方、NK細胞の表面タンパク質に結合可能な多重特異性結合タンパク質が提案されている。例えば、特許文献2は、NK細胞を抗原細胞に向かわせるためのものとして、腫瘍抗原結合ドメインと免疫細胞結合ドメインとを有するキメラ融合分子であって、抗原結合ドメインは同抗原結合ドメインの単離抗体又は断片を含むこと、単離抗体は免疫グロブリン可変領域及び定常領域を含むこと、免疫細胞結合はNK細胞受容体に特異的なリガンドであるものを提案する。また特許文献3は、NKp46結合免疫グロブリン領域、及びこの可変領域を含むタンパク質、例えば抗体及び多重特異的タンパク質を、NK細胞を特異的にリダイレクトして目的の標的細胞を溶解するために用いることを提案する。さらに特許文献4においては、NKG2D受容体、及びCD16に結合する多重特異性結合タンパク質をNK細胞に結合させてNK細胞を活性化することが提案されており、多重特異性結合タンパク質は、ヒトIgG1抗体のアミノ酸234～332と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含んでよいとする。
特開2018-193303号公報 特表2009-500346号公報 国際公開2017/114694(特表2019-503713号公報) 特表2020-506971号公報
Uchida J, et al. J Exp Med. 2004, Sugata K, et al. Sci Rep. 2016
　マクロファージ系の細胞が腫瘍細胞と正常細胞とを区別することが不可能である一方、NK細胞は腫瘍細胞と正常細胞とを見分けることができる。したがって、NK細胞が抗体医薬品によるADCC活性の唯一のエフェクターであるという状況を作りだすことができれば、理論的には、on-target　off-tumor効果を完全に消失させることができる。
　NK細胞がADCC活性の唯一のエフェクターであるという状況を作りだすためには、全身のマクロファージ系細胞を排除することは現実的でないことを鑑みると、抗体医薬品自体を点滴などにより全身的に投与することを避け、NK細胞に抗体医薬を結合させた状態で投与することが望ましい。
　しかし、本発明者らの検討によると、NK細胞に目的の抗体医薬を結合させても、特定の成分の共存や他の抗体が競合する状態では、目的の抗体医薬がNK細胞から外れてしまうことが分かった。したがって、抗体をNK細胞上に安定的に係留できる技術が必要である。
　今般、本発明者らは、NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域Iと抗体に結合可能な領域II、及び領域Iと領域IIを連結するリンカー部からなる融合タンパク質を作製し、これによりNK細胞と抗体との結合が安定的に維持できることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は以下を提供する。
[1]　NK細胞と抗体との結合を安定化する方法であって、
・NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び
・抗体に結合可能な領域II
を有する物質を用いる、方法。
[2]　NK細胞の表面タンパク質が、NKp46、NKp30、NKG2D、IL-15R、IL-2R、KIR3DS1、NKG2C、NKp80、NKp65、NKp44、LALRA1、LILRA2、DNAM-1、及び2B4からなる群より選択されるいずれかである、1に記載の方法。
[3]　領域I及び領域IIの少なくとも一方が、一本鎖Fvフラグメント(scFv)である、1又は2に記載の方法。
[4]　抗体が、がん又は感染症の処置用の抗体医薬品である、1～3のいずれか1項に記載の方法。
[5]　以下の工程を含む、NK細胞の集団の製造方法:
(1)NK細胞の集団、抗体、及びNK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び抗体に結合可能な領域IIを有する物質を準備し；
(2)NK細胞の集団に、タンパク質存在下で抗体を加えて、抗体と結合したNK細胞の集団を得る工程であって、このときNK細胞と物質の領域Iとが結合し、かつ抗体と物質の領域IIが結合し、物質が抗体とNK細胞との結合を安定化する。
[6]　抗体が、がん又は感染症の処置用の抗体医薬品である、5に記載の製造方法。
[7]　抗体医薬品が結合したNK細胞の集団を含み、抗体医薬品とNK細胞との結合が、下記の領域を有する物質により安定化されている、医薬組成物:
・NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び
・抗体に結合可能な領域II。
　本発明により、抗体医薬品はもっぱらNK細胞に利用されることとなるため、マクロファージ系の免疫細胞による抗体医薬品が結合した正常細胞の傷害という副作用の抑制が期待できる。
　従来の抗体の結合活性を高める方法は、抗体のFc領域の糖鎖構造の改変(低フコース抗体)やアミノ酸配列の改変等によるが、本発明はこれらとは全く異なるアプローチで抗体をNK細胞上に安定的に結合させる。抗体のNK細胞上への本発明によるアンカリングに際し、アンカリングするNK細胞の表面タンパク質として、NK細胞の活性化や生存に好ましいシグナルが入る分子を選択できる。
NK細胞による抗体医薬品併用時のAllo-WBCへの傷害 培地中でのNK細胞による抗体医薬品の保持 NK細胞と抗体医薬品の結合への培地添加物の影響 NK細胞と抗体医薬品の結合への血液成分の影響 NK細胞と抗体医薬品の結合への競合IgGの影響 実施例で用いた配列。小文字部分はNKp46 sFv、囲み部分はProtein G、下線部分はリンカーである。塩基配列において、位置(1)..(57)は30K signal peptide-coding region、(58)..(222)及び(298)..(432)はprotein G-coding region、(433)..(477)は(G4S)3 linker-coding region、(478)..(1212)はscFv(NKp46)-coding region、(1213)..(1233)はTEV protease-coding region、(1234)..(1251)及び(1276)..(1293)はHis Tag-coding region、(1252)..(1275)はStrep Tag II-coding regionである。 プロトタイプ物質による抗体医薬品のアンカリング。(1): 高活性NK細胞＋PBS、(2): 高活性NK細胞にプロトタイプ物質350μg/mlを加え、室温で1時間反応後、Herceptin　1μg/mlを加え、室温で1時間反応、(3): Herceptin　1μg/mlにプロトタイプ物質350μg/mlを加え、室温で1時間反応後、高活性NK細胞を加え、室温で1時間反応。 アンカリングによる細胞と抗体との結合の安定化。高活性NK細胞を、プロトタイプ物質の存在下又は非存在下で、各種抗体医薬品を含むPBSに同様に懸濁した後、PBSにて1回洗浄し、抗体染色、測定し、各抗体医薬品の結合の有無を解析した。いずれの抗体医薬品を用いた場合にも、プロトタイプ物質によるアンカリングにより細胞と抗体との結合が安定化されていることが分かった。
　本発明は、下記の領域を有する物質を用いる、NK細胞と抗体との結合を安定化する方法に関する。
・NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び
・抗体に結合可能な領域II
[領域I、領域II]
(NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I)
　本発明の物質の領域Iが結合するNK細胞の表面タンパク質としては、抗体とNK細胞上のCD16(FcγRIII)との結合を阻害しない限り、NK細胞の表面にある各種のタンパク質分子を選択しうる。このようなタンパク質の例として、NKp46、NKp30、NKG2D、IL-15R、IL-2R、KIR3DS1、NKG2C、NKp80、NKp65、NKp44、LALRA1、LILRA2、DNAM-1、及び2B4が挙げられる。
　抗体とNK細胞上のCD16(FcγRIII)との結合を阻害しないとは、例えば物質が、当該細胞表面タンパク質と抗体に結合した場合に、物質の立体構造(例えば、高さ)が適切であることを指す。　
　上述したNK細胞表面タンパク質のうち、本発明の物質の領域Iが結合するNK細胞の表面タンパク質としては、結合によりNK細胞の活性化又は生存のために好ましいシグナルが入ることが期待できるものであることが好ましい。この例として、NKp30、NKp46、NKG2D、IL-15Rが挙げられる。特に好ましい例の一つは、NKp46である。NKp46は、NK細胞が持つ活性化型レセプターの中でもITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)を多く持ち、極めて重要な分子だと考えられる。また、抗NKp46抗体がNK細胞活性化作用をするものとして市販されている。
　上述したNK細胞表面タンパク質については、各々結合する分子が知られている。
NK細胞表面タンパク質:結合分子(抗X抗体を除く)
NKp46　:　Cell　Surface　Vimentin　(CSV)
NKp30　:　B7-H6
NKG2D　:　MICA，　MICB，　ULBP1～6
IL-15R　:　IL-15，　IL-2
IL-2R　:　IL-15，　IL-2
KIR3DS1　:　HLA-F，　HLA-B
NKG2C　:　HLA-E
NKp80　:　AICL
NKp65　:　KACL
NKp44　:　MLL5，　PCNA
LALRA1　:　HLA-B27dimer
LILRA2　:　soluble　HLA
DNAM-1　:　CD112，　CD155
　したがって、本発明の物質の領域Iを、CSV、B7-H6、MICA、MICB、ULBP1～6、IL-15、IL-2、IL-15、IL-2、HLA-F、HLA-B、HLA-E、AICL、KACL、MLL5、PCNA、HLA-B27dimer、soluble　HLA、CD112、CD155、及びCD48からなる群より選択されるいずれかとすることができる。
　領域Iはまた、上述したNK細胞表面タンパク質に結合可能な、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合フラグメントは、一本鎖Fvフラグメント(scFv)、二量体scFv(di-scFv)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)、Fab、F(ab’)2、Fvを含む。
　特に好ましい態様の一つにおいて、領域Iは、NKp46に結合する抗体の抗原結合ドメインであって前掲特許文献3に記載されているもの、より特定するとこの文献の配列表の配列番号:119、120、121、又は122に示された配列であり、領域Iは、好ましくは配列番号:121に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(本明細書の配列表の配列番号:2のアミノ酸配列において、位置141以降のアミノ酸配列を有する)である。
　領域Iはまた、上述したNK細胞表面タンパク質に対する結合分子、すなわちCSV、B7-H6、MICA、MICB、ULBP1～6、IL-15、IL-2、HLA-F、HLA-B、HLA-E、AICL、KACL、MLL5、PCNA、HLA-B27dimer、soluble　HLA、CD112、CD155、及びCD48のうち、NK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を含むペプチドであってもよい。本明細書の配列表には、B7-H6におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:3、MICAにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:4、MICBにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:5、IL-15におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:6、IL-2におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:7、HLA-FにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:8、HLA-BにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:9、HLA-EにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:10、CD112におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:11、CD155におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:12、CSVにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:32、ULBP1におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:33、ULBP2におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:34、ULBP3におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:35、ULBP4におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:36、ULBP5におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:37、ULBP6におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:38、AICLにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:39、KACLにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:40、PCNAにおけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:41、CD48におけるNK細胞表面タンパク質に結合可能な領域を配列番号:42として掲載した。これらのアミノ酸配列のいずれか一と配列同一性の高い配列、又はこれらのアミノ酸配列のいずれかにおいて一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNK細胞表面タンパク質に結合可能なポリペプチドも同様に用いることができる。
　なお、本発明に関し、「1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1～9個又は1～4個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。また本発明に関し、アミノ酸配列について「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝(一致した位置の数/位置の全数)×100で算出できる。アミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム(例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。同一性が高いとは、同一性が、少なくとも80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97.5%以上、さらに好ましくは99%以上、さらに好ましくは99.8%以上であることをいう。
(抗体に結合可能な領域II)
　本発明の物質の領域IIとしては、抗体とNK細胞上のCD16(FcγRIII)との結合を阻害しない限り、抗体への結合性を有する各種のタンパク質分子を選択しうる。このようなタンパク質の例として、IgGのFc結合性のリガンドが挙げられ、この例として、プロテインA(黄色ブドウ球菌のドメインB(B1、B2、B3、B4、B5))、プロテインG(レンサ球菌のグループCのドメインB(B1、B2)、グループGのドメインC(C1、C2、C3))、プロテインL、プロテインZ、プロテインLG、プロテインLA、プロテインAG、PAM、D-PAM、D-PAM-F、TWKTSRISIF、FGRLVSSIRY、Fc-III、Fc-III-(Sepharose)　FcBP-2、Fc-III-4C、EPIHRSTLTALL、APAR、FcRM、HWRGWV、HYFKFD、HFRRHL、cyclo[(Nα-Ac)S(A)-、RWCitGWV、D2AAG　DAAG、RWHYFK-Lact-E]、cyclo[(Nα-Ac)-Dap(A)-RWHYFK-Lact-E]、cyclo[(Nα-Ac)S(A)-RWHYFK-Lact-E]、cyclo[Link-M-WFRHYK]、NKFRGKYK、NARKFYKG、FYWHCLDE、FYCHWALE、FYCHTIDE、Dual　1/3、RRGW、KHRFNKD、Fc-IIIペプチド(システイン残基中のチオール基がジスルフィド結合した環状ペプチドであり、IgGのFc領域におけるCH2とCH3の間と相互作用する機能を有する。国際公開2001/045746、Science, 2000, Vol.287, pp.1279-1283)又はその改変体(特開2016-88906)、YYWLHH、AV13(GFRKYLHFRRHLL)及びAV15(VRLGWLLAPADLDAR)(米国特許第7408030号明細書)、FcRMペプチド (Chem Bio Chem, 2005, Vol.6, pp.1242-1253)、ヒスチジン(J Chromatography, 1992, Vol.604, pp.29-37)、TG19318(J Molecular Recognition, 1998, Vol.11, pp.128-133)、TG19320(J Immunological Methods, 2002, Vol.271, pp.77-88)、IMG4K6Rペプチド(国際公開2013/027796、J Biol Chem, 2009, Vol.284, pp.9986-9993)、IgA結合ペプチド(国際公開2011/148952、J Biol Chem, 2012, Vol.287, pp.43126-43136)が挙げられる。当業者は、IgGのFc結合性リガンドに関しては、Materials 2016, 9, 994; doi:10.3390/ma9120994を参考にすることができる。
　領域IIはまた、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合フラグメントは、一本鎖Fvフラグメント(scFv)、二量体scFv(di-scFv)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)、Fab、F(ab’)2、Fvを含む。
　領域IIは、架橋剤を用いてIgGのFc部位特異的に結合するものであってもよい。架橋剤とは、IgG結合ペプチドと、IgG Fcを、共有結合により連結させるための化学物質である。本発明の架橋剤は、当業者であれば適宜選択することが可能であり、所望のアミノ酸(例えば、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸、及びアルギニン等)と結合可能な部位を少なくとも2箇所有する化合物とすることができる。その例として、限定するものではないが、DSG(ジスクシンイミジルグルタレート)、DSS(ジスクシンイミジルスベレート)等のスクシンイミジル基を好ましくは2以上含む架橋剤、DMA(アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DMP(ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩)、及びDMS(スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩)等のイミド酸部分を好ましくは2以上含む架橋剤、並びにDTBP(3，3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩)及びDSP(ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸)等のSS結合を有する架橋剤が挙げられる。架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、短時間で、しかもほとんど副反応なくIgGに付加することができる。
　この場合、領域IIは、その配列中に、架橋剤と反応可能なアミノ酸残基を有する。このようなアミノ酸残基の例は、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、及びグルタミン酸残基等のタンパク質構成アミノ酸、並びにジアミノプロピオン酸及び2-アミノスベリン酸等の非タンパク質構成アミノ酸、好ましくはリシン残基である。領域IIは、その配列中に架橋剤と反応可能なアミノ酸残基と同じ残基を、他にはまったく有さないか、ほとんど有さない(例えば、1個又は2個しか有さない)ことが好ましい。例えば、架橋剤と反応可能なアミノ酸残基がリシン残基である場合には、本発明のペプチドは、その配列中に架橋剤と反応させるアミノ酸残基ではない場所にリシン残基をまったく有さないか、ほとんど有さないことが好ましい。
　このような架橋剤と反応可能なアミノ酸残基を有する領域IIのペプチドの特に好ましい例は、WO2016/186206の配列表に配列番号:1～17、36及び37として記載されている配列を有するペプチドである。それぞれ、本明細書の配列表に、配列番号:13～29、30及び31として掲載する。これらのアミノ酸配列のいずれか一と配列同一性の高い配列、又はこれらのアミノ酸配列のいずれかにおいて一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつNK細胞表面タンパク質に結合可能なポリペプチドも同様に用いることができる。
　このようなペプチドは、IgGのFcドメインに結合する。また、IgG Fcの特定の領域、すなわち、ヒトIgG FcにおけるEu numberingに従うLys248残基(ヒトIgG　CH2の18番目の残基に相当する)又はLys246残基(ヒトIgG　CH2の16番目の残基に相当する)、好ましくはLys248と近接する。
　このような架橋剤を用いる反応は、前掲WO2016/186206を参照することができる。またこの実験スキームの例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  領域IIはまた、Fc領域を認識するアプタマー及び低分子化合物であってもよい。Fc領域を認識できる範囲でアプタマーは、改変体とされてもよい。Fc領域を認識するアプタマーとしては、ヒトIgGアプタマー(国際公開第2007/004748、RNA, 2008, Vol.14, pp.1154-1163)等が挙げられる。Fc領域を認識する低分子化合物としては、マンノシルエリスリトール脂質(J Biomedical Materials Res.A, 2003, Vol.65, pp.379-385)、遷移金属イオン(J Appl Polym Sci, 89, 1567-1572, J Chromatography B, 2003, Vol. 795, pp.93-103)、芳香族アミン(J Chromatography B, 2000, Vol.740, pp.1-15)、スルファメタジン(J Chromatography B, 2003, Vol.792, pp.177-185)等が挙げられる。
　本発明の物質は、領域Iと領域IIを連結するリンカー部を有していてもよい。リンカー部は、領域IがNK細胞の表面タンパク質に結合でき、かつ領域IIが抗体に結合でき、かつ抗体とNK細胞上のCD16(FcγRIII)との結合を阻害しない限り、種々の構造を取りうる。
　リンカーは例えば、可動性リンカーであり、2～31アミノ酸長のペプチドリンカーである。例えば、リンカー配列は約16アミノ酸長である。好ましいリンカーの例として、配列(G4S)×3、若しくはSGGGGSGGGGSGGGGS(GS16)、SG(GS2)、SGGGGS(GS6)、SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(GS31)のいずれかからなるペプチドが挙げられる。
　好ましい態様の一つでは、リンカーは剛性リンカーである。例えば、剛性リンカーは配列(EAAAK)nを含み、ここでnは1～3である。一例では、剛性リンカーは(EAAAK)nを含み、ここでnは1～10又は約1～100である。例えば、nは少なくとも1、又は少なくとも2、又は少なくとも3、又は少なくとも4、又は少なくとも5、又は少なくとも6、又は少なくとも7、又は少なくとも8、又は少なくとも9、又は少なくとも10である。一例では、nは100未満である。例えば、nは90未満、又は約80未満、又は約60未満、又は約50未満、又は約40未満、又は約30未満、又は約20未満、又は約10未満である。
　好ましい態様の一つでは、リンカーは切断可能リンカーである。例えば、リンカーは、プロテアーゼ又はペプチダーゼによって切断することができる。
(好ましい態様)
　本発明の物質が融合タンパク質である場合の特に好ましい態様の一つのアミノ酸配列及びそれをコードするポリヌクレオチドの配列を、図6及び配列表に示した。
(NK細胞)
　一般に、NK細胞とは、T細胞受容体(TCR)、T細胞普遍的マーカーであるCD3、及び膜免疫グロブリンであるB細胞受容体を発現していない大型の顆粒性リンパ球であり、通常ヒトではCD16陽性であり、かつCD56陽性である。NK細胞であるか否かは、当業者であれば、細胞表面マーカーの発現パターン等に基づき容易に判断することができる。NK細胞は、細胞傷害活性を有し、この細胞傷害活性の有無や程度は、公知の種々の方法で測定することができる。
　本発明に関しNK細胞というときは、特に記載した場合を除き、上記の一般的なNK細胞を含み、またNK細胞は、末梢血NK細胞、臍帯血NK細胞、初代NK細胞、培養NK細胞、高活性NK細胞、及び下記の[1]、[2]、[3]及び[4]のNK細胞又はNK様細胞を含む。
[1]　下記(1)及び(2)の特徴を備えるNK細胞:
(1)CD16陽性、CD56高発現性、かつCD57陰性である。
(2)NKG2C陽性、NKG2A陰性～低発現性、及びCD94陽性である。
　[1]の高活性NK細胞は、CD16高発現性であってもよい。また[1]の高活性NK細胞は、CD16高発現性であるか否かにかかわらず、さらに下記の特徴を備えていてもよい。
(3)該NK細胞をエフェクター細胞(E)とし、K562細胞を標的細胞(T)として混合比(E:T)1:1で共培養した場合の細胞傷害活性が50％以上である。
　[1]の高活性NK細胞は、下記のように表すこともできる:
　健常人由来末梢血単核球から、CD3ビーズ(例えば、CliniMACS　CD3，　ミルテニーバイオテク社，　カタログ番号130-017-601)、LDカラム(例えば、ミルテニーバイオテク，カタログ番号130-042-901)及び分離バッファー(例えば、0．5％ヒトAB型血清　(非働化処理したもの)、2mM　EDTAを含むPBS)を用いてCD3陽性細胞を除去した細胞集団を、適切な培地(例えば、5％ヒトAB型血清(非働化処理したもの)を添加したコスメディウム008)で14日間培養して得られ、下記(1)及び(3)の特徴を備えるNK細胞:
(1)CD16陽性、CD56高発現性、かつCD57陰性である。
(3)該NK細胞をエフェクター細胞(E)とし、K562細胞を標的細胞(T)として混合比(E:T)1:1で共培養した場合の細胞傷害活性が50％以上である。
　[1]の高活性NK細胞の特徴の詳細や、より具体的な製造方法は、特開2018-193303を参照することができる。
[2]　下記の細胞:
　CCR5陽性、CCR6陽性及びCXCR3陽性であり且つCD3陰性である細胞。
　[2]の細胞は、更にCD11c高発現性であってもよい。
　[2]の細胞は、下記のように表すこともできる:
　CCR5陽性、CCR6陽性、CXCR3陽性、Integrin　α1陽性、Integrin　α3陽性及びIntegrin　β3陰性であり且つCD3陰性である細胞。あるいは、CCR5陽性、CCR6陽性、CXCR3陽性、CD11a高発現性及びCD11c高発現性であり且つCD3陰性であり、高発現性は、末梢血から得た、実質的な培養を行なっていないNK細胞の集団における発現との比較により判断される、細胞。
　[2]の細胞は、本発明者らの検討によると、腫瘍塊を形成した固形がんに対し、極めて高い細胞傷害活性を示す。[2]の細胞の特徴の詳細や、より具体的な製造方法は、特開2019-170176を参照することができる。
[3]　下記の方法で得られうる、高活性NK細胞:
　新鮮末梢血から、又は凍結アフェレーシス血液から得た単核球にCD3　beads(例えば、CliniMACS　CD3、ミルテニーバイオテク、130-017-601(1x107細胞あたり5μL))、及び凍結アフェレーシス血液を使用した場合はさらにCD34　beads(例えば、CliniMACS　CD34、ミルテニーバイオテク、130-017-501(1x107細胞あたり2．5μL))を添加・懸濁し、4℃、15分間インキュベート後、分離バッファー(例えば、0．5％ヒトAB型血清(56℃で30分の非働化処理したもの)、2mM　EDTAを含むPBS)を加えてよく懸濁し、遠心する。上清を除去し、LDカラム(例えば、ミルテニーバイオテク、130-042-901)1カラムあたり最大1x108cellsまでの細胞数となるように0．5mLの分離バッファーに懸濁する。分離バッファー2mLをあらかじめ添加したのち、LDカラムに細胞懸濁液を添加して、LDカラムからの溶出液を回収した。さらに分離バッファー1mLをLDカラムに添加し、溶出液を回収する。回収した液の遠心分離を行い、上清を除去後、末梢血を使用した場合は5x105cells/mL、凍結アフェレーシス血液を使用した場合は1x106cells/mLとなるように適切な培地(例えば、5％ヒトAB型血清(56℃で30分の非働化処理したもの)あるいは5％UltraGRO(AventaCell、HPCPLCRL10)に2U/mLヘパリンナトリウムを添加したもの、のいずれか一方を含むKBM501培地)に細胞を懸濁し、適宜培地交換しながら、14日目まで培養する。
　[3]の高活性NK細胞の、具体的な製造方法は、特願2020-35297の明細書を参考にすることができる。
[4]　[1]～[3]の細胞を得るに際し、IL-2と同時に又はIL-2に代えて、IL-12、IL-15、及びIL-18からなる群より選択されるいずれかを本発明の目的を達成できる濃度で添加し、培養することにより得られる細胞。このような細胞の具体的な製造方法は、Leong JW et al. Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 463-473を参考にすることができる。
　なお本明細書において、本発明を、高活性NK細胞を用いる場合を例に説明することがあるが、当業者であればその説明に準じて、本発明を、他の、体外で何らかのサイトカインを用いることによる活性化操作を経た細胞を用いる場合についても理解できる。
(細胞傷害活性)
　本発明に関し、高活性NK細胞等について、活性又は細胞傷害活性というときは、特に記載した場合を除き、対象細胞(エフェクター細胞、E)の標的細胞(T)に対する溶解能を指す。細胞傷害活性は、エフェクター細胞により死に至った標的細胞の百分率(％)で表すことができ、次式により求められる。
(エフェクター細胞と共培養した場合の細胞死-自然細胞死(陰性コントロール))/(最大細胞死(陽性コントロール)-自然細胞死(陰性コントロール))×100
　細胞傷害活性の測定に際しては、一般的には、エフェクター細胞の細胞傷害活性の程度等に応じ、エフェクター細胞と標的細胞の混合比(E:T)、エフェクター細胞と標的細胞の共培養の時間は、用いる細胞の種類や活性の強さに応じて適宜とすることができる。NK細胞をエフェクター細胞とするとき、標的細胞は、K562細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。エフェクター細胞と標的細胞、生細胞と死細胞は、放射性物質、蛍光色素等で標識した抗体等の試薬により、区別し、また定量することができる。NK細胞をエフェクター細胞とするときの細胞傷害活性は、例えばK562細胞を標的細胞とし、E:T＝1:0．05～10、好ましくは1:0．1～5、より好ましくは1:1とし、インキュベート時間を0．5～18時間、好ましくは1～12時間の条件で測定することができる。
　本発明に関し、NK細胞等の活性が高いというときは、特に記載した場合を除き、標的細胞をK562細胞とし、E:T＝1:1で混合し、0．5～3時間、より特定すると2時間、インキュベートした場合の細胞傷害活性が50％以上であることをいう。活性は、60％以上であることが好ましく、70％以上であることがより好ましい。
　本発明に関し、NK細胞等によりある細胞(例えば、抗原腫瘍細胞以外の細胞、正常細胞)が傷害されないというときは、特に記載した場合を除き、目的の細胞をTとし、E:T＝1:1で混合し、0．5～3時間、より特定すると2時間、インキュベートした場合の細胞傷害活性が5％未満であることをいう。目的の細胞に対する活性は、3％未満であることが好ましく、1％未満か又は検出されないことがより好ましい。
[NK細胞の集団の製造方法]
　本発明はまた、以下の工程を含む、NK細胞の集団の製造方法を提供する。
(1)NK細胞の集団、抗体、及びNK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び抗体に結合可能な領域IIを有する物質を準備し；
(2)NK細胞の集団に、タンパク質存在下で抗体を加えて、抗体と結合したNK細胞の集団を得る工程であって、このときNK細胞と物質の領域Iとが結合し、かつ抗体と物質の領域IIが結合し、物質が抗体とNK細胞との結合を安定化する。
(工程(1):　NK細胞の集団等の準備)
　NK細胞の集団の原材料は、末梢血、臍帯血、骨髄及び/又はリンパ節、アフェレーシス法により採取された血液(アフェレーシス血液)であってよい。また原材料は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹(iPS)細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞、臍帯血由来の造血幹細胞、末梢血由来の造血幹細胞、骨髄血由来の造血幹細胞、臍帯血単核球、末梢血単核球からなる群から選択される少なくとも1種類の細胞から調製されたものであってもよい。原材料のドナーは、高活性NK細胞等による免疫治療を受ける患者自身、該患者の近縁者、又は患者とは血縁関係のない健常者である場合がある。ドナーは複数であってもよい。
(培地)
　NK細胞の集団を得るために、原材料である細胞を培養・活性化するために用いる培地は、KBM501培地(コージンバイオ株式会社。IL-2を1、750JRU/ mL含む。)、コスメディウム008(コスモバイオ。IL-2を1、750JRU/ mL含む。)、FKCM101(フコク。IL-2不含、又はIL-2を175IU/mL含む。)、CellGro　SCGM培地(セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社)、X-VIVO15培地(ロンザ、タカラバイオ株式会社)、Gibco(登録商標)　CTS(登録商標)　AIM　V(登録商標)　Medium(サーモフィッシャーサイエンティフィック。T細胞及び樹状細胞を増殖・操作するための既知組成の無血清培地)、CTS　OpTmizer　T　Cell　Expansion　Basal　Medium(サーモフィッシャーサイエンティフィック。ヒトTリンパ球の成長及び増殖用)、IMDM、MEM、DMEM、RPMI-1640等を含むが、これらに限定されない。好ましい例は、KBM501培地、FKCM101又はコスメディウム008である。なお、本発明に関し、細胞について培養(する)というときは、特に記載した場合を除き、細胞の生存維持、細胞の増幅、及び細胞の活性化からなる群より選択されるいずれかの目的のために細胞を一定時間、培地又はそれに準じた液の中で維持することをいう。処理を特定の温度で一定時間行う場合に、インキュベート(する)ということがある。
　培地には、IL-2が、本発明の目的を達成できる濃度で添加される場合がある。IL-2の濃度は、2500IU/mL～2813IU/mLの場合がある。IL-2は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えDNA技術で生産されることが好ましい。IL-2の濃度は、国内標準単位(JRU)及び国際単位(IU)で示される場合がある。1IUが約0．622JRUであるから、既存の培地の1750JRU/mLは、約2813IU/mLに相当する。
　上述したIL-2と同時に又はIL-2に代えて、IL-12、IL-15、及びIL-18からなる群より選択されるいずれかが本発明の目的を達成できる濃度で添加される場合がある(前掲Leong JW et al. Biol Blood Marrow Transplant 20 (2014) 463-473)。各々の濃度は、他のサイトカインの有無や濃度に関わらず、1pg/mL～1μg/mLの場合がある。IL-2は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えDNA技術で生産されることが好ましい。
　培地には、被験者の自家血清、BioWhittaker社その他から入手可能なヒトAB型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。自家血清及びヒトAB型血清は1～10％の濃度で添加されることが好ましく、献血ヒト血清アルブミンは1～10％の濃度で添加されることが好ましい。血清とともに、又は血清の代わりに、ヒト血小板溶解物(Human　platelet　lysate:HPL)を添加してもよい。HPLは市販されており、UltraGROTMシリーズ(AventaCell　BioMedical社)等が販売されている。HPLを用いる場合には培地にはさらにヘパリンナトリウムを添加してもよい。
　培地には、NK細胞の培養効果を損なわないことを条件として、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分が含まれる場合がある。サイトカインは、上述したIL-2、IL-12、IL-15、及びIL-18のほか、IL-3、IL-7、IL-21、幹細胞因子(SCF)、及び/又は、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt3L)の場合がある。これらはいずれも、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えDNA技術で生産されることが好ましい。
　培地は、無血清培地であることが好ましい。無血清培地は、血清アルブミン、トランスフェリン、及びインスリンを含んでいることが好ましい。リンパ球を培養するための無血清培地が開発、市販されており、本発明においてそれらを利用することができる。無血清培地の好ましい例の一つは、基礎培地に、ヒトT細胞の増殖をサポートする組成として市販されているCTS　Immune　Cell　SR(サーモフィッシャーサイエンティフィック)を添加したものである。
　培地の交換又は補充は、目的とする培養効果が得られることを条件として、培養開始後いつ行われてもかまわないが、3～5日毎が好ましい。
　培養の際に用いる培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。培養条件は、NK細胞の培養効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、37℃、5％CO2及び飽和水蒸気雰囲気下の培養条件が一般的である。培養期間は、目的とする培養効果が得られることを条件として、特に限定されない。
(抗体、抗体医薬品)
　本発明に関し、抗体というときは、特に記載した場合を除き、免疫グロブリンのいずれかのクラス(アイソタイプ)のものを指す。ヒトの場合、抗体には、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEの5種類のクラスがある。また、本発明に関し、抗体というときは、特に記載した場合を除き、抗体のほか、抗体由来の配列を有する抗体医薬品を含む。本発明に関し、抗体医薬品というときは、特に記載した場合を除き、由来する生物種は限定されない。本発明に用いられる抗体医薬品は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、由来を示すサブステムをもたない抗体であってもよい。本明細書及び図面では、本発明に関し、抗体がIgGである場合を例に説明することがあるが、当業者であれば、その説明を他のクラスの抗体を用いた場合にも適宜当てはめて理解することができる。
(IgG)
　本発明に関し、IgGというときは、特に記載した場合を除き、IgGのほか、IgGから派生した分子を含む。IgGから派生した分子には、抗体フラグメントが含まれる。この例として、Fab、scFv、VH-VL、scFv-CH3、VhH、Dab、それらの重量体、それらの融合体が挙げられる。(Nature Biotechnology volume 23, pages1126-1136(2005))。IgGから派生した分子にはまた、シングルドメイン抗体が含まれる。この例として、VHH、VNAR、sdAbが挙げられる。シングルドメイン抗体は特異的抗原に選択的に結合することができ、またIgG、及びFab、scFvなどの抗体フラグメントと比較して、低分子量である。VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)は、ラクダ科動物(ラマ、アルパカ等)のH鎖のみで構成される抗体(重鎖抗体)の可変領域であり、高い安定性を持ち、低コスト生産が可能であり、抗体医薬としての利用が期待されている(Front Immunol. 2017 Jun 9;8:653.)。
　本発明に関し、IgGというときはまた、IgG由来の配列を有する抗体医薬品を含む。IgG又はIgG由来の配列を有する抗体医薬品の例として、マウス抗体であるmuromonab-CD3、ibritumomab tiuxetan、iodine 131 Tositumomab、catumaxomab、blinatumomab、moxetumomab pasudotox、キメラ抗体であるabciximab、rituximab、basiliximab、infliximab、cetuximab、brentuximab vedotin、siltuximab、dinutuximab、obiltoxaximab、ヒト化抗体であるdaclizumab、palivizumab、trastuzumab、gemtuzumab ozogamicin、alemtuzumab、omalizumab、efalizumab、bevacizumab、natalizumab、tocilizumab、ranibizumab、eculizumab、certolizumab pegol、mogamulizumab、pertuzumab、trastuzumab emtansine、obinutuzumab、vedolizumab、pembrolizumab、idarucizumab、mepolizumab、elotuzumab、ixekizumab、reslizumab、atezolizumab、ocrelizumab、inotuzumab ozogamicin、emicizumab、benralizumab、galcanezumab、fremanezumab、tildrakizumab、caplacizumab、ibalizumab、ravulizumab、romosozumab、risankizumab、ヒト抗体であるadalimumab、panitumumab、golimumab、ustekinumab、canakinumab、ofatumumab、denosumab、ipilimumab、belimumab、raxibacumab、ramucirumab、nivolumab、secukinumab、evolocumab、alirocumab、necitumumab、daratumumab、brodalumab、olaratumab、bezlotoxumab、avelumab、durvalumab、dupilumab、bezlotoxumab、guselkumab、sarilumab、burosumab、erenumab、lanadelumab、由来を示すサブステムをもたない抗体であるemapalumabが挙げられる。
　本発明に用いられる抗体医薬品は、がん又は感染症の処置用の抗体医薬品であることが好ましい。
(工程(2):　抗体とNK細胞との結合の安定化)
　本発明においては、NK細胞の集団に、本発明の物質の存在下で抗体を加えて、抗体と結合したNK細胞の集団を得る工程であって、このときNK細胞と物質の領域Iとが結合し、かつ抗体と物質の領域IIが結合し、物質が抗体とNK細胞との結合を安定化する。ここで、NK細胞の集団、抗体、及び本発明の物質の混合は、用時に行うことができる。例えば、NK細胞の集団、抗体及び物質を別の容器に保持した状態で維持し、対象への投与の直前～数時間前に、混合することができる。
　混合に際しては、混合の順は適宜とすることができる。例えば、NK細胞の集団と物質を混合してインキュベートした後に、抗体を加えてさらにインキュベートしてもよく、また抗体と物質を混合してインキュベートした後に、NK細胞の集団を加えてさらにインキュベートしてもよい。
　NK細胞の集団の製造方法において、NK細胞と結合していない抗体を除去する工程があってもよい。すなわち、この製造方法により得られるNK細胞の集団においては、NK細胞と抗体を含むが、抗体はすべてNK細胞に結合しており、NK細胞に結合していない抗体は実質的に含まないことが好ましい。
[医薬組成物]
　本発明は、また、抗体医薬品が結合したNK細胞の集団を含み、抗体医薬品とNK細胞との結合が、下記の領域を有する物質により安定化されている、医薬組成物を提供する。
・NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び
・抗体に結合可能な領域II。
　医薬組成物は、典型的には、抗体が結合し、かつ物質でその結合が安定化されたNK細胞が、溶液に懸濁された形態である。NK細胞を懸濁するための溶液は、例えば、 DMSOを含む凍結用保護液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、培地、血清等が一般的である。溶液は、医薬品及び医薬部外品として薬学的に許容される担体を含む場合がある。
　本発明の医薬組成物の製造は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則に適合した条件(good manufacturing practice、GMP)及び再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準(Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice、GCTP)で実施されることが好ましい。
　本発明により提供される医薬組成物は、高活性NK細胞等感受性を有するさまざまな疾患の処置に適用することができる。このような疾患の例は、がん、又は感染症であり、具体的には、皮膚がん、口腔がん、胆嚢がん、胆管がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん、膵臓がん、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、神経芽腫、白血病や、ウイルス、細菌等による感染症を含むが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物による細胞療法は、単独で実施されることがあり、また外科療法、化学療法、放射線療法、抗体医薬品等と組み合わせて実施される場合がある。
　本発明で得られた重要な知見の一つは、NK細胞は体外で活性化培養を行ってもなお、抗体医薬の結合の有無に関わらず正常細胞を全く傷害しないことである。この知見は、抗体医薬品によるADCC活性のエフェクター細胞をNK細胞に限定することで、ADCC活性の恩恵はそのままに、抗体医薬品の安全性が向上することを示している。NK細胞は末梢血中に存在しているもののみでは、悪性腫瘍や感染症を治療するには数も活性も少ないため、体外で活性化培養を行うことが好ましい。本知見により、体外で活性化したNK細胞を、抗体医薬品によるADCC活性のエフェクター細胞に限定することができることとなり、治療において抗体医薬品及び高活性NK細胞がより用い易くなる。特に高活性NK細胞を用いるに際しては、この知見は安全上、特に重要である。
[実験・実施例間で共通の方法]
A). 高活性NK細胞GAIA-102の培養方法
　凍結アフェレーシス血液(HemaCare, PB001CLP)を解凍し、Lovo Cell Processing System(FRESENIUS KABI)を使用して洗浄と濃縮を行い、PBMCsを得た。得られたPBMCsにCD3 beads※1、CD34 beads※2を添加・懸濁し、4℃, 15分間インキュベート後、分離バッファー※3を加えてよく懸濁し、300 x g、10分間、遠心分離を行った。上清を除去し、LDカラム(ミルテニーバイオテク, 130-042-901)1カラムあたり最大1x108 cellsまでの細胞数となるように0.5 mLの分離バッファーに懸濁した。分離バッファー 2 mLをあらかじめ添加したのち、LDカラムに細胞懸濁液を添加して、LDカラムからの溶出液を回収した。さらに分離バッファー 1 mLをLDカラムに添加し、溶出液を回収した。その後、分離バッファー1 mLでカラムをwashし、回収された液中の細胞数をカウントし、総細胞数を算出した。500 x g、5分間、遠心分離を行い、上清を除去後、培養あるいはCD3,CD34除去PBMCsとしてSTEM-CELLBANKERにて1x107 cells/mLで-80℃で凍結した。凍結PBMCsを培養に使用する場合は、血清を含む培地にて10倍希釈で解凍して培養を開始した。
　培養は1x106 cells/mLとなるようにKBM501培地※4に懸濁し、6ウェルプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック, 140675)、T-75フラスコ(サーモフィッシャーサイエンティフィック, 156499)又は接着培養用バッグ(ニプロ)を使用し、CO2インキュベーターで行った(37℃, 5% CO2)。培養9日目に最終液量が、6ウェルプレートの場合は1ウェルあたり6 mL、T-75フラスコの場合は1フラスコあたり50 mL、バッグの場合は1バッグあたり500mlになるようにKBM501培地を添加し、14日目までインキュベートした。
※1: CliniMACS CD3, ミルテニーバイオテク, 130-017-601(1x107細胞あたり5μL)
※2: CliniMACS CD34, ミルテニーバイオテク, 130-017-501(1x107細胞あたり2.5μL)
※3: 0.5%ヒトAB型血清(コスモバイオ, 12181301, 56℃で30分の非働化処理したもの)、2 mM EDTA(サーモフィッシャーサイエンティフィック, 15575-020)を含むPBS(ナカライテスク, 14249-24)
※4: 5%ヒトAB型血清(コスモバイオ, 12181301, 56℃で30分の非働化処理したもの)あるいは5%UltraGRO (AventaCell, HPCPLCRL10) に2U/mL ヘパリンナトリウム(ニプロ)を添加したものを含むKBM 501(コージンバイオ,16025015)
B). 高活性NK細胞GAIA-102の回収方法
　培養14日目に培養液を回収、さらに培養容器に1mM EDTAを加え接着した細胞を剥離し、剥離細胞を回収したあとの培養容器をKBM501培地で洗浄した。すべての細胞回収液を遠心後、KBM501培地で洗浄、再懸濁した。
C). GAIA-102と抗体医薬品の結合確認
　各抗体医薬品と反応させたGAIA-102を以下に示す抗体各1μg/mLの濃度で混合した抗体液にて4℃、30分間染色後、遠心分離(500 x g, 5分間)、上清を除去し、PBSに懸濁後、フローサイトメーター(BD LSRFortessa, BDバイオサイエンス社)を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェア(FLOWJO, LLC)で解析した。
<使用した抗体>
　Alexa Fluor(登録商標)700標識抗ヒトCD56抗体(Biolegend, 318316)、PerCP/C5.5標識抗ヒトCD3抗体(Biolegend, 300430)、PE-Cy7標識抗ヒトCD16抗体(Biolegend, 302016)、PE標識抗ヒトIgG抗体(SouthernBiotech, 2043-09)
[実験1:　抗体医薬品併用時のAllo-WBCへの傷害の確認]
　上記B).に記載した手順にて得られたNK細胞の生細胞数をカウントし1x107cellsを1mLのSTEM-CELLBANKERで懸濁し-80℃で凍結したものを、37℃、ウォーターバスにて解凍したのち、PlasmaLyte-Aで10倍に希釈して1時間常温で保管したのち、KBM501培地に懸濁して3時間培養を行なった。
　細胞傷害活性の測定には、解凍NK細胞とK562細胞を反応させた群、陰性コントロールとしてK562細胞のみの群、陽性コントロールとしてK562細胞を10%ホルマリンで固定した群を用意した。
《NK》
　上記解凍後3時間培養した細胞を回収し、10%FBS/RPMI1640にて2x106cells/ mlの濃度に調整した。
《腫瘍細胞株》
　K562細胞(ヒト慢性骨髄性白血病細胞株)、Hut78細胞(ヒトTリンパ腫 (セザリー症候群) 細胞株)を血清成分非含有RPMI1640培地にて懸濁し、PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH26GL-1KT) を用いて染色し、最終的に10%FBS/RPMI1640にて2x106 cells/mLとなるように調整した。
《PBMC》
　末梢血単核球(PBMCs: Peripheral blood mononuclear cells)は上記A). の手順で得たものを用いた。血清成分非含有RPMI1640培地にて懸濁し、PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma, PKH67GL-1KT) を用いて染色し、最終的に10%FBS/RPMI1640にて2x106 cells/mLとなるように調整した。
　NK細胞とK562細胞、PBMCとは、細胞比で1:1或いは1:1:1となるように96ウェルプレート (IWAKI, 4870-800SP) に添加、ポテリジオ(+)にはポテリジオを終濃度10μg/mlとなるように添加し、混合し、37℃、5% CO2下で2時間反応させた。反応後、遠心分離(500 x g, 5分間)し、上清を除去後、PBSで希釈した7-AAD溶液を添加、懸濁し、室温で20分間インキュベートした。フローサイトメーターを用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析し、細胞傷害活性(%Lysis)を算出した※5。
※5:  細胞傷害活性(%Lysis)=(細胞死細胞率-陰性コントロール死細胞率)/(陽性コントロール死細胞率-陰性コントロール死細胞率)×100
　結果を図1に示す。ポテリジオ併用時でもPBMCへの傷害は見られなかった。
[実験2: 培地中でのNK細胞による抗体医薬品の保持]
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法に記載した手順にて得られたGAIA-102の生細胞数をカウントし1x106cells/mLとなるよう、100μg/mL モガムリズマブ(ポテリジオ点滴静注20mg, 協和キリン)を含むPBS(ナカライテスク, 14249-24)で懸濁した。懸濁したGAIA-102を低吸着6ウェルプレート(IWAKI, 4810-800SP)に播種し、室温で1時間静置した。1時間反応後、細胞を回収しPBSにて3回洗浄を行った後、PBSに懸濁したGAIA-102+モガムリズマブ、KBM501培地(5%UltraGRO ＋2U/mL ヘパリンナトリウム)に懸濁したGAIA-102+モガムリズマブをそれぞれ、C)に記載した手順にて抗体染色、測定し、CD56+かつCD3-を示す細胞集団中のCD16 low及びCD16 highにおけるGAIA-102とモガムリズマブの結合の有無を解析した。
　結果を図2に示す。GAIA-102は、KBM501培地中では抗体をCD16で保持できないことが分かった。
[実験3: 培地添加物の影響]
　実験2と同様の手順にてGAIA-102と100μg/mL　モガムリズマブを室温で1時間反応させた。PBSにて3回洗浄を行ったのち5群に分割し、(1)KBM501培地(5%UltraGRO ＋2U/mL ヘパリンナトリウム)、(2)血清成分を含まないKBM501培地(以下、無血清KBM501培地)、(3)3,000IU/mL IL-2(イムネース(登録商標)、塩野義製薬)を含む10%FBS/RPMI1640培地※5、(4)10%FBS/RPMI1640、(5)PBSで再懸濁した。各群およそ5分間静置後、C)に記載した手順にて抗体染色、測定し、CD56+かつCD3-を示す細胞集団中のCD16 low及びCD16 highにおけるGAIA-102とモガムリズマブの結合の有無を解析した。
※5: 10% FBS(ニチレイバイオサイエンス, 171012-500ML)及び100ユニットのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン(ナカライテスク, 26253-84)を含むRPMI1640培地
　結果を図3に示す。 GAIA-102は、UltraGroを含む培地中では抗体をCD16で保持できないことが分かった。
[実験4: 血液中での影響]
　実験2と同様の手順にてGAIA-102と100μg/mL　モガムリズマブを室温で1時間反応させた。PBSにて3回洗浄を行ったのち8群に分割し、(1)10%FBS/KBM501培地、(2)5%UltraGRO/KBM501培地、5%UltraGRO/KBM501培地から5倍ずつ無血清KBM501培地で段階的に希釈した(3)1%UltraGRO/KBM501培地、(4)0.2%UltraGRO KBM501培地、(5)5%UltraGRO/RPMI1640培地、(6)3,000IU/mL IL-2を含む5%UltraGRO/RPMI1640培地、(7)健常人ボランティアより採取した末梢血から分離したPPP (Platelet-pour Plasma) ※6、(8)健常人ボランティアより採取した末梢血 (PB)、にそれぞれ再懸濁した。各群およそ5分間静置後、C)に記載した手順にて抗体染色、測定し、CD56+かつCD3-を示す細胞集団中のCD16 low及びCD16 highにおけるGAIA-102とモガムリズマブの結合の有無を解析した。
※6: 末梢血を2,000 x g、15分間、室温(ブレーキオフ)で遠心し、得られた上清
　結果を図4に示す。培養液の種類に依らず、UG又は血液の存在でGAIA-102から抗体が外れた。GAIA-102は、ヒト血液中では抗体をCD16で保持できないことが分かった。
[実験5: IgGの影響]
　実験2に記載した手順にて同様にGAIA-102と100μg/mL　モガムリズマブを室温で1時間反応させた。PBSにて3回洗浄を行ったのち5群に分割し、(1)1mg/mL トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標)注射用, 中外製薬)を含む無血清KBM501培地、(2)5%UltraGRO/KBM501培地、(3)5%ヒトAB型血清/KBM501培地、(4)無血清KBM501培地、(5)PBSにそれぞれ再懸濁した。各群およそ5分間静置後、C)に記載した手順にて抗体染色、測定し、CD56+かつCD3-を示す細胞集団中のCD16 low及びCD16 highにおけるGAIA-102とモガムリズマブの結合の有無を解析した。
　結果を図5に示す。NK細胞に結合させた抗体医薬品は、他のIgGの競合により結合が外れることが分かった。
[実施例1: プロトタイプ物質の作製]
  NK細胞膜上の抗原NKp46に結合する領域と、IgGに結合する領域とを有するタンパク質を設計し、抗体医薬品の細胞上へのアンカリングを試みた。より詳細には、NKp46に結合する領域として、WO2017/114694に記載のAnti-human NKp46 scFv(同文献記載の配列番号: 121)を用いた。またIgGに結合する領域として、Protein Gの配列(https://www.uniprot.org/uniprot/P19909)のうち、373-297aaを用いた。
　融合タンパク質は、KAICO株式会社(〒819-0388　日本国福岡市西区九大新町4-1福岡市産学連携交流センター217)に委託し、カイコを利用した組換えタンパク質発現の技術により作製された。
　設計したタンパク質のアミノ酸配列(385アミノ酸長)を図6に示した。
[実施例2 : 抗体医薬品の細胞上へのアンカリング]
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法に記載した手順にて得られたGAIA-102に対し、精製したプロトタイプ物質(pG2-NKp46)によるアンカリングを下記方法にて行った。
　低吸着96ウェルプレート(IWAKI, 4870-800SP)を使用し、GAIA-102 (1x106cells/mL)を25μL播種、遠心(500 x g、5分間)した後、上清を除去し、350　μg/mLプロトタイプ物質を含むPBS 25μLに懸濁した。1時間、室温で静置後、PBSにて1回洗浄し、1μg/mLハーセプチンを含むPBS 25μLで置換し、さらに1時間、室温で静置した。その後、PBSにて1回洗浄し、C)に記載した手順にて抗体染色、測定し、ハーセプチン結合の有無を解析した。
　低吸着96ウェルプレートを使用し、350　μg/mLプロトタイプ物質を含むPBS 25μLに1μg/mLとなるようハーセプチンを添加し、1時間、室温で静置した。予めGAIA-102 (1x106 cells/mL)を25μL播種し、遠心後、上清を除去した細胞を、1時間反応させたプロトタイプ物質＋ハーセプチン液にて懸濁した。さらに1時間、室温で静置し、PBSにて1回洗浄し、C)に記載した手順にて抗体染色、測定し、ハーセプチン結合の有無を解析した。
　GAIA-102とPBSを1時間反応させ、C)にて記載した手順にて抗体測定し、上記2群のコントロールとした。
　結果を図7に示す。プロトタイプ物質によりアンカリングが可能であることが確認された。プロトタイプ物質は、抗体やGAIA-102との混合の順に依らず、アンカリングが可能であることが分かった。
[実施例3: 種々の抗体医薬品に対する効果]
　高活性NK細胞の培養方法、回収方法に記載した手順にて得られたGAIA-102　1x105 cellsを13.3 μg/mLプロトタイプ物質を含む5%UltraGRO/KBM501培地100 μLに懸濁し、1時間、室温で静置した。1時間後、PBSにて1回洗浄したのち5群に分割し、セツキシマブ(アービタックス(登録商標)注射液,　メルクバイオファーマ)、ハーセプチン、ポテリジオ、リツキシマブ(リツキサン(登録商標)点滴静注, 全薬工業)、ジヌツキシマブ(ユニツキシン, United Therapeutics社)の各種抗体医薬品1 μg/mLを含むPBSにそれぞれを懸濁した。コントロールとしてGAIA-102(プロトタイプ物質によるアンカリング無し)を各抗体医薬品を含むPBSに同様に懸濁した。1時間、室温で静置後、PBSにて1回洗浄し、C)に記載した手順にて抗体染色、測定し、各抗体医薬品の結合の有無を解析した。
　結果を図8に示す。いずれの抗体医薬品を用いた場合にも、プロトタイプ物質によるアンカリングにより細胞と抗体との結合が安定化されていることが分かった。
SEQ ID NO:1 Nucleotide sequence, pG/Fc-NKp46/scFv
SEQ ID NO:2 Amino acid sequence, pG/Fc-NKp46/scFv
SEQ ID NOs:3-12, and 32-42 Domains capable of binding to NK cell surface protein
SEQ ID NOs:13-31 WO2016/186206, SEQ ID NOs:1～17、36 and 37

Claims (7)

  1. 　NK細胞と抗体との結合を安定化する方法であって、
    ・NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び
    ・抗体に結合可能な領域II
    を有する物質を用いる、方法。
  2. 　NK細胞の表面タンパク質が、NKp46、NKp30、NKG2D、IL-15R、IL-2R、KIR3DS1、NKG2C、NKp80、NKp65、NKp44、LALRA1、LILRA2、DNAM-1、及び2B4からなる群より選択されるいずれかである、請求項1に記載の方法。
  3. 　領域I及び領域IIの少なくとも一方が、一本鎖Fvフラグメント(scFv)である、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 　抗体が、がん又は感染症の処置用の抗体医薬品である、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　以下の工程を含む、NK細胞の集団の製造方法:
    (1)NK細胞の集団、抗体、及びNK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び抗体に結合可能な領域IIを有する物質を準備し；
    (2)NK細胞の集団に、タンパク質存在下で抗体を加えて、抗体と結合したNK細胞の集団を得る工程であって、このときNK細胞と物質の領域Iとが結合し、かつ抗体と物質の領域IIが結合し、物質が抗体とNK細胞との結合を安定化する。
  6. 　抗体が、がん又は感染症の処置用の抗体医薬品である、請求項5に記載の製造方法。
  7. 　抗体医薬品が結合したNK細胞の集団を含み、抗体医薬品とNK細胞との結合が、下記の領域を有する物質により安定化されている、医薬組成物:
    ・NK細胞の表面タンパク質に結合可能な領域I、及び
    ・抗体に結合可能な領域II。
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