JP2019503713A - NKp46結合タンパク質の可変領域 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、全ての図面及び配列表を含め、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、2015年12月28日出願の米国仮特許出願第62/271,474号明細書の利益を主張するものである。
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、2016年12月19日に作成された376KBサイズの「NKp46−7 PCT_ST25 txt」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
(a)それぞれ配列番号199又は200に示されているNKp46−1 H1又はH3可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%(又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号201に示されているNKp46−1 L1可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(b)それぞれ配列番号202、203、又は203に示されているNKp46−2 H1、H2、又はH3可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%(又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号205に示されているNKp46−2 L1可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(c)それぞれ配列番号206、207、又は208に示されているNKp46−3 H1、H3、又はH4可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%(又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号209に示されているNKp46−3 L1可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(d)配列番号210、211、又は212に示されているNKp46−4 H1、H2、又はH3可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%(又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号213に示されているNKp46−4 L2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(e)それぞれ配列番号215に示されているNKp46−9 H2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%(又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号217又は218に示されているNKp46−9 L1又はL2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;又は
(f)配列番号215に示されているNKp46−9 H3可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%(又は100%)同一であるアミノ酸配列を含むVH、及びそれぞれ配列番号217又は218に示されているNKp46−9 L1又はL2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL
からなる群から選択されるVH及びVLの組み合わせを含む。
(a)配列番号3に示されているアミノ酸配列を有するVHドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号4に示されているアミノ酸配列を有するVLドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−33遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(b)配列番号5に示されているアミノ酸配列を有するVHドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV4−30−4遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号6に示されているアミノ酸配列を有するVLドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−39遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(c)配列番号7に示されているアミノ酸配列を有するVHドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号8に示されているアミノ酸配列を有するVLドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV3−11及び/又はIGKV3−15遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(d)配列番号9に示されているアミノ酸配列を有するVHドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−46及び/又はIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号10に示されているアミノ酸配列を有するVLドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−NL1遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(e)配列番号13に示されているアミノ酸配列を有するVHドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV4−30−4遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号14に示されているアミノ酸配列を有するVLドメインのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−39遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL
からなる群から選択されるVH及びVLの組み合わせを含む。
抗NKp46抗原結合ドメインは、ヒトNKp46ポリペプチドの細胞外部分に結合する。一態様では、本開示のVH及びVLを含むタンパク質は、ヒト化抗体であるか又はそれを含む。一態様では、抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4定常ドメインから選択される定常ドメインを含み、任意選択的に1つ以上のアミノ酸改変を含む。一態様では、抗NKp46抗体は、Fab断片、Fab’断片、Fab’−SH断片、F(ab)2断片、F(ab’)2断片、Fv断片、重鎖Ig(ラマIg又はラクダIg)、VHH断片、単一ドメインFV、及び一本鎖抗体断片から選択される抗体断片を含む。一態様では、抗NKp46抗体は、scFV、dsFV、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、IgNARから選択される合成又は半合成抗体由来分子;及び多重特異的抗体を含む。この作用物質は、任意選択的に、Fcドメインをさらに含み得る。一態様では、抗体は、少なくとも部分的に精製された形態である。一態様では、抗体は、本質的に単離された形態である。
(a)配列番号3のCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号4のCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−33遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(b)配列番号5のCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV4−30−4遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号6のCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−39遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(c)配列番号7のCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号8のCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV3−11及び/又はIGKV3−15遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(d)配列番号9のCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−46及び/又はIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号10のCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−NL1遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;又は
(e)配列番号13のCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV4−30−4遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号14のCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−39遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL
が挙げられる。
(a)NKp46−1 H1又はH3可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及びNKp46−1 L1可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(b)NKp46−2 H1、H2、又はH3可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及びNKp46−2 L1可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(c)NKp46−3 H1、H3、又はH4可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及びNKp46−3 L1可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(d)NKp46−4 H1可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及びNKp46−4 L2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(e)NKp46−9 H2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及びNKp46−9 L1又はL2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL;又は
(f)NKp46−9 H3可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及びNKp46−9 L1又はL2可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL
が挙げられる。
NKp46に結合する抗原結合ドメイン(ABD)は、本明細書で提供される抗NKp46 CDR、VH、及びVL配列に由来し得る(「抗NKp46可変ドメイン」のセクションを参照されたい)。抗原結合ドメインは、NKp46(例えば、細胞表面で発現されるヒトNKp46)に結合することができる抗原結合ドメインを形成するように同一又は別々のポリペプチドに配置することができる。ABDは、例えば、scFv、直列型scFv、Bite、DART、Fab、F(ab)2、抗体、二重特異的抗体、又は単量体若しくは多量体Fcタンパク質として作製することができる。
一例では、多重特異的タンパク質は、単一ポリペプチド鎖中において、NKp46に結合する第1の抗原結合ドメイン(例えば、(ポリ)ペプチドリンカーによって分離された、本明細書に開示されるVH及びVLを含むABD)及びNKp46以外の抗原に結合する第2の抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、タンパク質又はポリペプチドは、本開示の抗NKp46 VH及びVLを含むscFv、又はNKp46に結合するscFvを含む直列型scFv、及び任意選択的に別のポリペプチド又はアミノ酸配列に融合された(ポリ)ペプチドリンカーによって連結された、NKp46又はNKp46以外の目的の抗原に結合する第2のscFvであるか、又はこれらを含む。
NKp46に結合するABD(例えば、本明細書に開示されるVH及びVLを含むABD)を含む多量体二重特異的タンパク質、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、及び四量体(後者は、例えば、2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する抗体を含む)は、様々な形態に従って作製することができる。
Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−(CH1又はCK)b。
Vb−1−(CH1又はCK)c、又は
Vb−1−(CH1又はCK)c−Fcドメイン
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)cが中心鎖の(CH1又はCK)aと二量体化し、Va−1とVb−1とが抗原結合ドメインを形成する。
Vb−2−(CH1又はCK)d
を含むことができ、それにより、(CH1又はCK)dが中心鎖の(CH1又はCK)b単位と二量体化し、Va−2とVb−2とが抗原結合ドメインを形成する。
(a)第1のCH1又はCK定常領域に融合された第1の可変ドメイン(V)、第2のCH1又はCK定常領域に融合された第2の可変ドメイン(V)、及び第1の可変ドメインと第2の可変ドメインとの間に配置されたFcドメイン又はその一部を含む、第1のポリペプチド鎖、
(b)第1及び第2のポリペプチドがCH1−CKヘテロ二量体を形成するように、第1のポリペプチド鎖の第1のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択されたCH1又はCK定常領域にそのC末端で融合された可変ドメイン、及び任意選択的にFcドメインを含む、第2のポリペプチド鎖、及び
(c)CH1又はCK定常領域に(例えば、そのC末端で)融合された可変ドメインを含む、第3のポリペプチド鎖であって、この可変ドメイン及び定常領域が、第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメイン及び第2のCH1又はCK定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第1及び第3のポリペプチドが、非共有結合により、及び任意選択的に、第3のポリペプチドのCH1又はCK定常領域と第1のポリペプチドの第1のCH1又はCK定常領域との間ではなく、第3のポリペプチドのCH1又はCK定常領域と第1のポリペプチドの第2のCH1又はCK定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によりさらに結合されたCH1−CKヘテロ二量体を形成する、第3のポリペプチド鎖
を含み、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドと第3のポリペプチドとがCH1−CKヘテロ三量体を形成し、第1のポリペプチド鎖の第1の可変ドメインと第2のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第1の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、且つ第1のポリペプチド鎖の第2の可変ドメインと第3のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、目的の第2の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。目的の2つの抗原の1つは、NKp46であり、NKp46に結合するABDは、本開示のVH−VL可変ドメイン対を含む。
NKp46に結合する抗原結合ドメインを含む本開示による化合物は、例えば、NKp46ポリペプチド及び/又はNKp46ポリペプチドを発現する細胞(例えば、NK細胞)への結合、これらの検出、除去、精製、又はこれらの活性の調節を含め、様々な用途に使用することができる。
抗huNKp46抗体の作製
パートA:抗huNKp46抗体の作製
Balb/cマウスを組換えヒトNKp46細胞外ドメイン組換えFcタンパク質で免疫した。マウスは、50μgのNKp46タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、50μgのNKp46タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により2回目の免疫を行い、最後に、10μgのNKp46タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を追加免疫の3日後にX63.Ag8.653不死化B細胞に融合し、これを放射線照射脾細胞の存在下で培養した。
本明細書の表Bに示されているそれぞれの可変領域を有する抗体NKp46−1、−2、−3、及び4を、以下に示されているアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖の相補性決定領域(CDR)移植によってヒト化抗体として作製した。抗体は、CHO細胞を用いて産生し、ヒトNKp46への結合について試験した。
3Dモデリング研究に基づいて、NKp46−1 CDR及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトIgG1抗体として作製し、カニクイザルNKp46への結合について試験した。重鎖と軽鎖の2つの組み合わせは、ヒト及びカニクイザルNKp46の両方に結合することができる。重鎖可変領域「H1」及び重鎖「H3」は、いずれの場合も軽鎖「L1」と組み合わせた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、NKp46−1重鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、ヒトIGHV1−69*06遺伝子フレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGHJ6*01遺伝子フレームワーク4領域を含んでいた。軽鎖可変領域:NKp46−1軽鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、ヒトIGKV1−33*01遺伝子フレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGKJ4*01遺伝子フレームワーク4領域。CDRは、Kabat付番に従って選択した。H1鎖、H3鎖、及びL1鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた(以下に太字及び下線付きで示されている)。L1は、Kabat軽鎖残基87にフェニルアラニンを有していた。H1は、Kabat重鎖残基27にチロシンを、且つKabat残基66及び67にそれぞれリジン及びアラニンを有していた。加えて、H3は、Kabat残基37にグリシンを、Kabat残基48にイソロイシンを、且つKabat残基91にフェニルアラニンを有していた。
NKp46−1:“H1”重鎖可変領域
3Dモデリング研究に基づいて、NKp46−2 CDR及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトIgG1抗体として作製し、カニクイザルNKp46への結合について試験した。重鎖と軽鎖の3つの組み合わせは、ヒト及びカニクイザルNKp46の両方に結合することができる。重鎖可変領域「H1」、「H2」、及び重鎖「H3」は、いずれの場合も軽鎖「L1」と組み合わせた。興味深いことに、さらに、H1L1は、配列番号5及び6のVH及びVLを有する親抗体NKp46−2と比較して改善された結合親和性を有していた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、NKp46−2重鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、ヒトIGHV4−30−4*01遺伝子フレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGHJ1*01遺伝子フレームワーク4領域を含んでいた。軽鎖可変領域:NKp46−2軽鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、ヒトIGKV1−39*01遺伝子フレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGKJ4*01遺伝子フレームワーク4領域。CDRは、Kabat付番に従って選択した。L1鎖、H1鎖、H2鎖、及びH3鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた(以下に太字及び下線付きで示されている)。L1は、Kabat軽鎖残基48にバリンを有していた。H1は、Kabat重鎖残基27にチロシンを、且つKabat残基71にアルギニンを有していた。加えて、H2は、Kabat残基48にメチオニンを、且つKabat残基67にイソロイシンを有していた。加えて、H3は、Kabat残基31にトレオニンを有していた。
NKp46−2:“H1”重鎖可変領域
3Dモデリング研究に基づいて、NKp46−3 CDR及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトIgG1抗体として作製し、カニクイザルNKp46への結合について試験した。重鎖及び軽鎖の3つの組み合わせは、ヒト及びカニクイザルNKp46の両方に結合することができる。重鎖可変領域「H1」、「H3」、及び重鎖「H4」は、いずれの場合も軽鎖「L1」と組み合わせた。興味深いことに、さらに、H3L1は、配列番号7及び8のVH及びVLを有する親抗体NKp46−3と比較して改善された結合親和性を有していた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、NKp46−3重鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、ヒトIGHV1−69*02遺伝子フレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGHJ6*01遺伝子フレームワーク4領域を含んでいた。軽鎖可変領域:NKp46−3軽鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、IGKV3−15由来のFR1及びFR2並びにIGKV3−11由来のFR3を用いるモザイクアプローチによって形成されたフレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGKJ2*01遺伝子フレームワーク4領域。CDRは、Kabat付番に従って選択した。L1鎖、H1鎖、H3鎖、及びH4鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた(以下に太字及び下線付きで示されている)。L1は、Kabat軽鎖残基49にリジンを有していた。H1は、Kabat重鎖残基27にチロシンを有していた。加えて、H3は、Kabat残基48にイソロイシンを、且つKabat残基67にアラニンを有していた。加えて、H4は、Kabat残基69にロイシンを有していた。
NKp46−3:“H1”重鎖可変領域
3Dモデリング研究に基づいて、NKp46−4 CDR及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトIgG1抗体として作製し、カニクイザルNKp46への結合について試験した。軽鎖「L2」と組み合わせられた重鎖可変領域「H1」は、ヒト及びカニクイザルNKp46の両方、並びに親抗体に結合することができた。2つの他の抗原結合領域(1つが「L2」及び「H2」から構成され、もう1つが「L2」及び「H3」から構成されている)は、カニクイザルNKp46に中等度で結合することができたが、その親和性は、ヒトNK−46の親和性の10分の1であった。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、NKp46−4重鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、IGHV1646由来のFR1、IGHV1−69由来の0FR3、及び共通FR2(IGHV1−46とIGHV1−69が同じFR2を共有する)を用いるモザイクアプローチを用いて設計されたヒトフレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGHJ6*01遺伝子フレームワーク4領域を含んでいた。軽鎖可変領域:NKp46−4軽鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、IGKV1−NL1由来のフレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGKJ4*01遺伝子フレームワーク4領域。CDRは、Kabat付番に従って選択した。L2鎖、H1鎖、H2鎖、及びH3鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた(以下に太字及び下線付きで示されている)。L2は、Kabat軽鎖残基36にフェニルアラニンを、且つKabat残基48にバリンを有していた。H1は、Kabat重鎖残基30にトレオニンを、Kabat残基48にイソロイシンを、且つKabat残基93にバリンを有していた。H2は、Kabat残基67にトレオニンを有していた。加えて、H3は、Kabat残基69にロイシンを有していた。
NKp46−4:“H1”重鎖可変領域
3Dモデリング研究に基づいて、NKp46−9 CDR及びヒトフレームワークを含む様々な重鎖及び軽鎖可変領域を設計し、ヒトIgG1抗体として作製し、カニクイザルNKp46への結合について試験した。軽鎖可変領域「L1」又は「L2」のいずれかと組み合わせられたときの重鎖可変領域「H2」、及び軽鎖可変領域「L1」又は「L2」のいずれかと組み合わせられたときの重鎖可変領域「H3」は、親抗体(配列番号13及び14のVH及びVLを有する)よりも高い親和性でヒト及びカニクイザルNKp46の両方に結合することができた。「H1」鎖は、試験されたいずれの軽鎖を有するカニクイザルNKp46とも結合できなかったが、ヒトNKp46には十分に結合できた。これらの交差結合可変領域は、重鎖可変領域について、NKp46−9重鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、IGHV4−30−4*01由来のヒトフレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGHJ6*01遺伝子フレームワーク4領域を含んでいた。軽鎖可変領域:NKp46−9軽鎖CDR(以下に下線付きで示されている)、IGKV1−39*01由来のフレームワーク1、2、及び3領域、並びにヒトIGKJ2*01遺伝子フレームワーク4領域。CDRは、Kabat付番に従って選択した。L1鎖、L2鎖、H1鎖、H2鎖、及びH3鎖は、特定のアミノ酸置換を有していた(以下に太字及び下線付きで示されている)。L1は、Kabat残基36にシステインを有していた。L2は、Kabat軽鎖残基48にバリンを有していた。H1は、Kabat重鎖残基71にアルギニンを有していた。加えて、H2は、Kabat残基27にチロシンを有していた。H3は、Kabat残基48にメチオニンを、且つKabat残基67にイソロイシンを有していた。
NKp46−9:“H1”重鎖可変領域
エフェクター細胞受容体を標的とする、FcRnには結合するがFcγRには結合しない二重特異的抗体形態の同定
この実験の目的は、Fcドメインを、抗NKp46結合ドメイン及び抗標的抗原結合ドメインと共にポリペプチドに配置する新規な二重特異的タンパク質形態を開発することにあった。二重特異的タンパク質は、その抗NKp46結合ドメインを介してNKp46に一価で結合する。単量体Fcドメインは、ヒト新生児Fc受容体(FcRn)に対する少なくとも部分的な結合性を維持するが、ヒトCD16及び/又は他のヒトFcγ受容体には実質的に結合しない。結果として、二重特異的タンパク質は、Fcγ媒介(例えば、CD16媒介)標的細胞溶解を誘導しない。
このようなタンパク質が機能的であり得るか否かを示すことができる抗NKp46二重特異的抗体が作製されていないため、NKp46を介したNK細胞の標的化前に新規な一価二重特異的タンパク質形態の機能を調べるために、NKp46の代わりにCD3をモデル抗原として使用した。
コード配列を直接合成及び/又はPCRによって構築した。PCRは、PrimeSTAR MAX DNAポリメラーゼ(Takara,#R045A)を用いて行い、PCR産物を、NucleoSpinゲル及びPCR clean−upキット(Macherey−Nagel,#740609.250)を用いて1%アガロースゲルから精製した。精製した後、PCR産物を定量してから、製造者のプロトコル(ClonTech,#ST0345)に記載されているようにIn−Fusion連結反応を行った。プラスミドは、Nucleospin 96プラスミドキット(Macherey−Nagel,#740625.4)を用いてEVO200(Tecan)で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、CHO細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。
細胞を回収して、抗CD19−F1−抗CD3産生細胞の細胞上清で4℃において1時間染色した。染色緩衝液(PBS 1X/BSA 0.2%/EDTA 2mM)で2回洗浄した後、細胞をヤギ抗ヒト(Fc)−PE抗体(IM0550 Beckman Coulter−1/200)で4℃において30分間染色した。2回の洗浄後、染色物をBD FACS Canto IIで得て、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。
精製抗CD19−F1−抗CD3によるT細胞及びB細胞の凝集
精製抗CD19−F1−抗CD3をT/B細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、CD19及びCD3発現細胞の凝集において機能するか否かを評価した。
二重特異的単量体FcポリペプチドのFcRnに対する結合性
表面プラズモン共鳴(SPR)による親和性試験
Biacore T100の一般的な手順及び試薬
SPR測定をBiacore T100装置(Biacore GE Healthcare)において25℃で行った。全てのBiacore実験では、酢酸緩衝液(50mM酢酸 pH5.6、150mM NaCl、0.1%界面活性剤p20)及びHBS−EP+(Biacore GE Healthcare)がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをBiacore T100 Evaluationソフトウェアで分析した。組換えマウスFcRnをR&D Systemsから購入した。
組換えFcRnタンパク質をSensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をEDC/NHS(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩及びN−ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化した。FcRnタンパク質を結合緩衝液(10mM酢酸、pH5.6)で10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベル(即ち、2500RU)に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、100mMエタノールアミン pH8(Biacore GE Healthcare)を用いて行った。
一価親和性試験をSingle Cycle Kinetic(SCK)プロトコルに従って行った。5段階希釈の41.5〜660nMの可溶性分析物(抗体及び二重特異的分子)を(再生なしで)FcRnに添加し、再生の10分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、1:1SCK結合モデルを用いてフィッティングした。
そのCH2−CH3ドメインが2つの抗原結合ドメイン(ここでは2つのscFv)間に配置された抗CD19−F1−抗CD3を評価して、このような二重特異的単量体Fcタンパク質が、FcRnに対する結合性を維持することができ、それにより、従来の二重特異的抗体と比較して改善されたin vivo半減期を有するか否かを決定した。結果は、FcRN結合性が維持されたことを示し、このモデルは、正常なIgGに対して、2:1の比率(各抗体に対して2つのFcRn)ではなく1:1の比率(各単量体Fcに対して1つのFcRn)を示唆している。
抗CD19x抗NKp46二重特異的単量体Fcドメインポリペプチドの作製
NK細上の活性化受容体が標的細胞の溶解に寄与し得るかは不明であり、さらに抗NKp46抗体がNKp46をブロックし得るため、細胞毒性がNKp46によって媒介することができたか否かはさらに不明であった。そのため、本発明者らは、二重特異的タンパク質形態が、NKp46のトリガーを引き起こすことができたか否か、及びそれが標的細胞の非存在下でNKp46アゴニズムを誘導し、それにより、標的から離れた不適切なNK活性化及び/又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらすことができたか否かを調べた。
形態1(F1)のドメイン構造が図2Aに示されている。二重特異的Fc含有ポリペプチドを、腫瘍抗原CD19(抗CD19 scFv)に特異的なscFv及びNKp46受容体に特異的なscFvをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
(Vκ−VH)抗CD19−CH2−CH3−(VH−Vκ)抗NKp46
F2ポリペプチドのドメイン構造が図2Aに示されている。単量体CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、実施例2−1と同様であり、それは、同様にCH3ドメイン変異(変異(EU付番)L351K、T366S、P395V、F405R、T407A、及びK409Y)を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
(Vκ−VH)抗CD19−CH2−CH3−VH抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CK。
F3ポリペプチドのドメイン構造が図2Aに示されている。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、同じポリペプチド鎖上の2つのCH3ドメインが互いに結合し、それにより、異なる二重特異的タンパク質間の二量体化が防止される直列型CH3ドメインを含んでいた。
(Vκ−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−(VH−Vκ)抗NKp46
F4ポリペプチドのドメイン構造が図2Aに示されている。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F3のように直列型CH3ドメインを含み、さらにN結合型グリコシル化を防止し、且つFcγR結合を消失させるN297S変異を含む。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、1mg/Lの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロファイルを示した。NKp46−3可変ドメインを有するF4タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号143に示されている。
F8ポリペプチドのドメイン構造が図2Bに示されている。単量体CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F2と同様であり、且つ同様にCH3ドメイン変異(変異(EU付番)L351K、T366S、P395V、F405R、T407A、及びK409Y、並びにN連結グリコシル化を防止してFcγR結合性をさらに消失させるN297S変異)を含む。F8タンパク質の3つの変異体を作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なまま残ったもの(野生型、F8Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換された第2のもの(F8B)、及び(c)ヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換しているリンカー配列GGGSSを含む第3のもの(F8C)。変異体F8B及びF8Cは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止するため作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される;
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−VH抗NKp46−Cκ、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VK抗NKp46−CH1、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
Vκ抗CD19−Cκ。
F9ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びそれぞれCH1−Cκの二量体化によって中心鎖に結合された2つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。三量体F9タンパク質のドメイン構造が図2Bに示されており、CH1とCκドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。2つの抗原結合ドメインは、抗体がscFv形態で機能を維持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするF(ab)構造を有する。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F4と同様の直列型CH3ドメインを含み、且つN297S置換を含むCH2ドメインを含む。F9タンパク質の3つの変異体を作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なまま残った第1のもの(野生型、F9Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換された第2のもの(F9B)、及び(c)ヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換しているリンカー配列GGGSSを含む第3のもの(F9C)。変異型F9B及びF9Cは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止することによって作製に利点を提供した。このヘテロ三量体は、以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−VH 抗NKp46−Cκ、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
Vκ抗NKp46−CH1、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
Vκ抗CD19−Cκ。
F10ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖、及びCH1−Cκの二量体化によって中心鎖に結合された第2のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。二量体F10タンパク質のドメイン構造が図2Bに示され、CH1とCκドメインとの間の結合は、鎖間ジスルフィド結合である。2つの抗原結合ドメインの一方はFab構造を有し、且つ他方はscFvである。CH2−CH3 Fc部分のDNA及びアミノ酸配列は、形態F4に示されているように直列型CH3ドメインを含み、且つN297S置換を含むCH2ドメインを含む。F10タンパク質の3つの変異体も作製した:(a)ヒンジ領域のシステイン残基が完全なまま残った第1のもの(野生型、F10Aと呼ばれる)、(b)ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基によって置換された第2のもの(F10B)、及び(c)ヒンジの残基DKTHTCPPCPを置換しているリンカー配列GGGSSを含む第3のもの(F10C)。変異型F10B及びF10Cは、中心鎖のホモ二量体の形成を防止するため作製に利点を提供した。(Vκ−VH)単位は、VHドメイン、リンカー、及びVκ単位(scFv)から構成されていた。ヘテロ二量体は、以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−(VH−Vκ)抗NKp46、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
Vκ抗CD19−Cκ。
F11ポリペプチドのドメイン構造が図2Cに示されている。このヘテロ二量体タンパク質は、抗原結合ドメインの構造が逆である点を除いてF10と同様である。2つの抗原結合ドメインの一方はFab様構造を有し、且つ他方はscFvである。このヘテロ二量体は、以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
(Vκ−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−VH抗NKp46−Cκ、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
Vκ抗NKp46−CH1。
二量体F12ポリペプチドのドメイン構造が図2Cに示されており、CH1とCκドメインとの間の結合は、ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質は、F11に類似しているが、F(ab)構造内のCH1及びCκドメインが逆である。このヘテロ二量体は、以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
(Vκ−VH)抗CD19−CH2−CH3−CH3−VH 抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
Vκ抗NKp46−Cκ。
三量体F17ポリペプチドのドメイン構造が図2Cに示されており、CHとCκドメインとの間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質は、F9と同様であるが、VH及びVκドメイン、並びにC末端F(ab)構造内のCH1及びCκドメインは、それぞれ、それらのパートナーと逆である。このヘテロ三量体は、以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−CH3−Vκ抗NKp46−CH1、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
VH 抗NKp46−Cκ、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
Vκ抗CD19−Cκ。
二量体Fcドメインを有する二重特異的NKp46抗体形態
二量体Fcドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発し、このタンパク質構築物は、実施例3の単量体Fcドメインタンパク質の多数の利点を共有するが、高い親和性でFcRnに結合する。FcγR(CD16を含む)に対して低い結合性を有する若しくは結合性が消失しているか、又はFcγR(CD16を含む)に対する結合性を有する様々なタンパク質形態を作製し、例えば、ヒトCD16に対する結合親和性は、SPRによって評価される野生型ヒトIgG1抗体の結合親和性の1−logの範囲内であった(例えば、実施例16の方法を参照されたい)。この様々なポリペプチド形態を、(VH−(CH1/Cκ)−CH2−CH3−)単位又は(Vκ−(CH1又はCκ)−CH2−CH3−)単位を有する中心鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験し、比較した。CH3ドメインの一方又は両方は、任意選択的に介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン(分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン)、直列型可変ドメイン(例えば、scFv)、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。2つの鎖が、CH1−Cκ二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成するか、又は第3鎖と結合する場合には三量体を形成する。
三量体F5ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合(鎖上のCH1/CκドメインとCH2ドメインとの間に図形で示されている)及びCH1とCκドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−VH 抗NKp46−Cκ、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
Vκ抗CD19−CK−CH2−CH3、及び
(3)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第3のポリペプチド鎖:
Vκ抗NKp46−CH1。
ヘテロ三量体F6ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されている。F6タンパク質は、F5と同じであるが、N連結グリコシル化を防止するためのN297S置換を含む。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、12mg/Lの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロフィールを示した。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号172(第2鎖)、173(第1鎖)、及び174(第3鎖)に示されている。
ヘテロ三量体F7ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されている。F7タンパク質は、中心鎖とVκ抗NKp46−CH1鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのC末端でFcドメインに連結されたCH1及びCκドメインにシステインのセリンでの置換を有する点を除いてF6と同じである。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、11mg/Lの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロフィールを示した。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号175(第2鎖)、176(第1鎖)、及び177(第3鎖)に示されている。
二量体F13ポリペプチドのドメイン構造が図2Dに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合(鎖上のCH1/CκドメインとCH2ドメインとの間に示されている)及びCH1ドメインとCκドメインとの間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される:
(1)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第1(中心)のポリペプチド鎖:
VH 抗CD19−CH1−CH2−CH3−(VH−Vκ)抗NKp46、及び
(2)以下のように(N末端からC末端に)配置されたドメインを有する第2のポリペプチド鎖:
Vκ抗CD19−Cκ−CH2−CH3。
二量体F14ポリペプチドのドメイン構造が図2Eに示されている。F14ポリペプチドは、F13形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Fcドメイン(CH2−CH3)の代わりに、F14二重特異的形態は、N連結グリコシル化をなくすためにCH2ドメイン変異N297Sを有する。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、2.4mg/Lの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なSECプロフィールを示した。2つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号180(第2鎖)及び181(第1鎖)に示されている。
三量体F15ポリペプチドのドメイン構造が図2Eに示されている。F15ポリペプチドは、F6形態の構造を共有するが、中心鎖と第2鎖との間のN末端VH−CH1とVκ−Cκ単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、prot−Aビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つSECによって精製した。このタンパク質は、0.9mg/Lの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質で単純なSECプロフィールを示した。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号182(第2鎖)、183(第1鎖)、及び184(第3鎖)に示されている。
三量体F16ポリペプチドのドメイン構造が図2Eに示されている。F16ポリペプチドは、F6形態の構造を共有するが、中心鎖と第2鎖との間のC末端VH−CKとVκ−CH1単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。3つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号185(第2鎖)、186(第1鎖)、及び187(第3鎖)に示されている。
三量体T5ポリペプチドのドメイン構造が図2Fに示されている。T5ポリペプチドは、F5形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第3鎖(Fcドメインを欠いている鎖)のC末端におけるscFv単位の融合により異なる。従って、このタンパク質は、目的の抗原に対する2つの抗原結合ドメイン及びNKp46に対する1つの抗原結合ドメインを有し、且つそのFcドメインを介してCD16に結合する。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。T5タンパク質は、異なる抗体に由来するヒトCD20に結合する(且つCD20上の異なるエピトープに結合する)2つの抗原結合ドメインを有していた。第1の抗CD20 ABDは、親抗体GA101(GAZYVA(登録商標)、Gazyvaro(登録商標)、オビヌツズマブ、Roche Pharmaceuticals)のVH及びVLを含んでいた。第2の抗CD20 ABDは、親抗体リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、Mabthera(登録商標)、Roche Pharmaceuticals)のVH及びVLを含んでいた。第3の抗原結合ドメインは、ヒトNKp46に結合する。T5タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列が以下に示されている(リツキシマブ配列は太字で下線付きであり、抗GA101配列は下線付きであり、抗NKp46配列はイタリック体である)。
三量体T6ポリペプチドのドメイン構造が図2Fに示されている。T6ポリペプチドは、F6形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第3鎖(Fcドメインを欠いている鎖)のC末端におけるscFv単位の融合により異なる。この三量体タンパク質は、目的の抗原に対する2つの抗原結合ドメイン及びNKp46に対する1つの抗原結合ドメインを含み、N297置換によりそのFcドメインを介してCD16に結合しない。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。T6タンパク質は、ヒトCD20に結合する2つの抗原結合ドメインを含む。第1の抗CD20 ABDは、親抗体GA101のVH及びVLを含み、且つ第2の抗CD20 ABDは、リツキシマブのVH及びVLを含む。T6タンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列が配列番号191、192、及び193に示されている。
三量体T9Bポリペプチドのドメイン構造が図2Fに示されている。T9Bポリペプチドは、F9形態(F9B変異体)の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、遊離CH1ドメイン(第3鎖上)のC末端におけるscFv単位の融合により異なる。このタンパク質は、目的の抗原に対する2つの抗原結合ドメイン及びNKp46に対する1つの抗原結合ドメインを含むが、単量体Fcドメイン及び/又はN297置換によりそのFcドメインを介してCD16に結合しない。上記のような三量体タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。T9Bタンパク質は、ヒトCD20に結合する2つの抗原結合ドメインを有していた。第1の抗CD20 ABDは、親抗体GA101のVH及びVLを含み、且つ第2の抗CD20 ABDは、親抗体リツキシマブのVH及びVLを含んでいた。T9Bタンパク質の3つの鎖のアミノ酸配列が以下に示されている。
二量体T11ポリペプチドのドメイン構造が図2Fに示されている。T11ポリペプチドは、F11形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、遊離CH1ドメインのC末端におけるscFv単位の融合により異なる。この二量体タンパク質は、目的の抗原に対する2つの抗原結合ドメイン及びNKp46に対する1つの抗原結合ドメインを含むが、単量体Fcドメイン及び/又はN297置換によりそのFcドメインを介してCD16に結合しない。タンパク質を実施例2−1と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。T11タンパク質は、ヒトCD20に結合する2つの抗原結合ドメインを含む。第1の抗CD20 ABDは、親抗体GA101のVH及びVLを含み、且つ第2の抗CD20 ABDは、リツキシマブのVH及びVLを含んでいた。T11タンパク質の2つの鎖のアミノ酸配列が以下に示されている。
表面プラズモン共鳴(SPR)による、二重特異的タンパク質によるNKp46結合親和性
Bacore T100の一般的な手順及び試薬
SPR測定をBiacore T100装置(Biacore GE Healthcare)において25℃で行った。全てのBiacore実験では、HBS−EP+(Biacore GE Healthcare)及びNaOH 10mMは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをBiacore T100 Evaluationソフトウェアで分析した。プロテインAを(GE Healthcare)から購入した。ヒトNKp46組換えタンパク質をクローニングし、産生し、且つInnate Pharmaで精製した。
プロテインAタンパク質をSensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をEDC/NHS(N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩及びN−ヒドロキシスクシンイミド(Biacore GE Healthcare))で活性化した。プロテインAを結合緩衝液(10mM酢酸、pH5.6)で10μg/mlに希釈し、適切な固定化レベル(即ち、2500RU)に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、100mMエタノールアミン pH8(Biacore GE Healthcare)を用いて行った。
まず、二重特異的タンパク質を、NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、又はNKp46−4の抗体からの異なる抗NKp46可変領域を有する実施例2に記載の形態F1で試験した。次に、抗体を、NKp46−3抗体からの抗NKp46可変領域を有する異なる形態F3、F4、F5、F6、F9、F10、F11、F13、F14として試験し、完全長ヒトIgG1のようなNKp46−3抗体と比較した。
一価親和性試験を、製造者(Biacore GE Healthcare kinetic wizard)が推奨する正規のCapture−Kineticプロトコルに従って行った。62.5〜400nMの範囲のヒトNKp46組換えタンパク質の7段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の10分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、1:1動態結合モデルを用いてフィッティングした。
SPRは、NKp46−1、2、3、及び4 scFv結合ドメインを有する形態F1の二重特異的ポリペプチドは、NKp46に結合したが、他の抗NKp46抗体のscFvを有する他の二重特異的ポリペプチドは、NKp46結合性を維持しなかったことを示した。単量体二重特異的形態で結合性を維持しなかった結合ドメインは、当初はNKp46に結合したが、二重特異的形態への変換時に結合性を失った。形態F1、F2、F3、F4、F5、F6、F9、F10、F11、F13、F14の二重特異的ポリペプチドの全ては、NKp46−3可変領域を用いる場合にNKp46に対する結合性を維持した。一価親和性並びに動力学的結合及び解離速度定数が以下の表3に示されている。
Daudi腫瘍標的に対するNK細胞とFc含有NKp46xCD19二重特異的タンパク質との結合
単量体Fcドメイン及び実施例3に記載の一本鎖F1又は二量体F2形態に従って配置されたドメイン、及びNKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、又はNKp46−4をベースとするNKp46結合領域を有する二重特異的抗体を、NK細胞にCD19陽性腫瘍標的細胞(Bリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるDaudi)を溶解させる機能的能力について試験した。F2タンパク質は、scFv形態ではNKp46に対する結合性を失うが、F2のF(ab)様形態では結合性を維持するNKp46−9の可変領域をさらに含んでいた。
KHYG−1 hNKp46 NK実験モデルでは、各二重特異的抗体NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、又はNKp46−9が、陰性対照(ヒトIgG1アイソタイプ対照(IC)及びCD19/CD3二重特異的抗体)と比較して、ヒトKHYG−1 hNKp46 NK細胞株によるDaudi細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、CD19/NKp46架橋によってKHYG−1 hNKp46によるDaudi標的細胞の溶解を誘導することが示された。
完全長抗NKp46 mAbと枯渇抗腫瘍mAbとの比較:NKp46xCD19二重特異的タンパク質が非特異的NK活性化を防止する
これらの試験は、二重特異的抗体が、非特異的NK細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するNKp46媒介NK活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。
(a)完全長単一特異的抗NKp46抗体(ヒトIgG1のようなNKp46−3)、及び
(b)ADCC誘導抗体対照比較(ADCC inducing antibody control comparator)としての完全長ヒトIgG1のような抗CD19抗体。
>NK細胞のみ
>NK細胞対Daudi(C19+)
>NK細胞対HUT78(CD19−)
エフェクター:標的(E:T)比は、2.5:1(50,000E:20,000T)とし、抗体の希釈範囲は、1/4希釈で10μg/mLから始めた(n=8の濃度)。抗体、標的細胞、及びエフェクター細胞を混合し、300gで1分間回転させ、37℃で4時間インキュベートし、500gで3分間回転させ、染色緩衝液(SB)で2回洗浄し、50μLの染色Abミックスを加え、300gで30分間インキュベートし、CellFixを含むSB再懸濁ペレットで2回洗浄し、4℃で一晩保存し、Canto II(HTS)で蛍光を明らかにした。
1.NK細胞のみ
結果は図4Aに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下において、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)はいずれも、CD69又はCD107の発現による評価によるとNK細胞を活性化しなかった。完全長抗CD19もNK細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗NKp46抗体は、NK細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでNK細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
結果は図4Bに示されている。標的抗原発現細胞の存在下において、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の結合ドメインのそれぞれを含む)は全て、NK細胞を活性化した。完全長抗CD19は、最良でも非常に低いNK細胞の活性化のみを示した。完全長抗NKp46抗体もアレムツヅマブも、NK細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図4は、完全長抗NKp46抗体が、NK細胞のみの存在下で観察されたベースライン活性化と同様のレベルを示すことを示す。アレムツヅマブも、NK細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのNK細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度(ET 2.5:1)では、活性化は、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
結果は図4Cに示されている。標的抗原陰性HUT78細胞の存在下において、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)は全て、NK細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗NKp46抗体及びアレムツヅマブは、NK細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでNK細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。
低いET比での枯渇抗腫瘍mAb:NKp46xCD19二重特異的タンパク質の比較効果
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター:標的比において、癌標的細胞に対するNKp46媒介NK細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるET比は、実施例7で使用された2.5:1のET比又は実施例6の10:1のET比よりもin vivoで遭遇するであろう設定に近いと考えられる1:1とした。
(a)完全長単一特異的抗NKp46抗体(ヒトIgG1のようなNKp46−3)、及び
(b)ADCC誘導抗体対照比較としての完全長ヒトIgG1のような抗CD19抗体。
結果は図5に示されている(図5A:CD107及び図5B:CD69)。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗NKp46x抗CD19抗体(NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、及びNKp46−9の可変領域のそれぞれを含む)は全て、Daudi細胞の存在下でNK細胞を活性化した。
NKp46の動作機序
NKp46−3からの抗NKp46可変ドメインを有する実施例3又は4に記載のF2、F3、F5、又はF6形態に従った配置を有するNKp46x抗CD19二重特異的抗体を、CD16−/NKp46+NK細胞株にCD19陽性腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力について、リツキシマブ(抗CD20 ADCC誘導抗体)、及びヒトIgG1アイソタイプ対照抗体と比較した。
結果は、図6A(KHYG−1対Daudi)及び図6B(KHYG−1対B221)に示されている。KHYG−1 hNKp46 NK実験モデルでは、各NKp46xCD19二重特異的タンパク質(形態F2、F3、F5、及びF6)は、ヒトKHYG−1 hNKp46 NK細胞株によるDaudi細胞又はB221細胞の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトIgG1アイソタイプ対照(IC)抗体は誘導しなかった。
新鮮なヒトNK細胞を用いる二重特異的抗体と従来のIgG抗体との比較効果
NKp46−3由来の抗NKp46可変ドメインを有するF5形態に従った配置を有するヒトCD16に結合するNKp46xCD19二重特異的タンパク質を、精製されたNK細胞にCD19陽性Daudi腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力について、F6形態(CD16結合を欠いている)と同じ二重特異的抗体及びヒトIgG1アイソタイプ抗CD19抗体、並びにヒトIgG1アイソタイプ対照抗体と比較した。
様々な二重特異的形態のFcRnに対する結合性
様々な抗体形態のヒトFcRNに対する親和性を、実施例2〜6に記載されているように、組換えFcRnタンパク質をSensor Chip CM5上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することにより、表面プラズモン共鳴(SPR)によって試験した。
FcγRへの結合
このような二重特異的単量体Fcタンパク質がFcγ受容体への結合性を維持できるか否かを評価するために、様々な多量体Fcタンパク質を評価した。
抗NKp46抗体のエピトープマッピング
A.競合アッセイ
競合アッセイを以下に記載の方法に従って表面プラズモン共鳴(SPR)によって行った。
抗NKp46抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、NKp46の2つのドメイン上の分子表面に露出された1つ、2つ、又は3つのアミノ酸置換によって定義されるNKp46変異体を設計した。このアプローチにより、以下の表に示されている、Hek−293T細胞でトランスフェクトされた42の変異体が作製された。以下の表5の標的アミノ酸変異は共に、配列番号1の付番を用いて示されている(Jaron−Mendelson et al.(2012)J.Immunol.88(12):6165−74で使用された付番にも一致している)。
NKp46変異体をPCRによって生成した。増幅された配列をアガロースゲルにかけて、Macherey Nagel PCR Clean−Up Gel Extractionキット(参照番号740609)を用いて精製した。次いで、それぞれの変異体について生成された2つ又は3つの精製PCR産物をClonTech InFusionシステムで発現ベクターに連結した。変異配列を含むベクターをMiniprepで調製し、配列決定した。配列決定後、変異配列を含むベクターを、Promega PureYield(商標)Plasmid Midiprep Systemを用いてMiniprepで調製した。HEK293T細胞をDMEM培地(Invitrogen)で増殖させ、InvitrogenのLipofectamine 2000を用いてベクターでトランスフェクトし、導入遺伝子発現の試験前にCO2インキュベーターで37℃において24時間インキュベートした。
全ての抗NKp46抗体をそれらのそれぞれの変異体に対する結合性についてフローサイトメトリーによって試験した。1つ又はいくつかの変異体に対する結合性をある濃度(10μg/ml)で失う抗体を決定するために最初の実験を行った。結合性の消失を確認するために、抗体の滴定を、結合性がNKp46変異体(1〜0,1〜0.01〜0.001μg/ml)によって影響を受けると思われる抗体に対して行った。
抗体NKp46−1は、野生型NK46と比較して、残基K41、E42、及びE119(NKp46野生型で付番)に変異を有する変異体2に対して低い結合性を有していた。同様に、NKp46−1はまた、残基Y121及びY194に変異を有する追加変異Supp7に対して低い結合性を有していた。
Claims (40)
- ヒトNKp46ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインであって、
(a)配列番号199又は200(NKp46−1 H1又はH3可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号201(NKp46−1 L1可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVL;
(b)配列番号202、203、又は204(NKp46−2 H1、H2、又はH3可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号205(NKp46−2 L1可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVL;
(c)配列番号206、207、又は208(NKp46−3 H1、H3、又はH4可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号209(NKp46−3 L1可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVL;
(d)配列番号210、211、又は212(NKp46−4 H1可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号213(NKp46−4 L2可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVL;
(e)配列番号215(NKp46−9 H2可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号217又は218(NKp46−9 L1又はL2可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVL;又は
(f)配列番号216(NKp46−9 H3可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号217又は218(NKp46−9 L1又はL2可変ドメイン)のアミノ酸配列を含むVL
からなる群から選択される重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の組み合わせを含む、抗原結合ドメイン。 - 請求項1に記載の抗原結合ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド。
- 前記タンパク質は、抗体である、請求項2に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、多重特異的抗原結合タンパク質である、請求項2に記載の組成物。
- 前記VH及び前記VLは、単一ポリペプチド鎖上に位置し、且つペプチドリンカーを介して互いに融合されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記VHは、前記タンパク質内の第1のポリペプチド鎖上に位置し、及び前記VLは、前記タンパク質内の第2のポリペプチド鎖上に位置する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、完全長IgG抗体、又は前記NKp46ポリペプチドとの結合性を維持するその断片である、請求項3に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、目的の抗原に結合する第2の抗原結合ドメインをさらに含む多重特異的タンパク質であり、前記多重特異的タンパク質は、NKp46発現NK細胞に、前記目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- ヒトNKp46ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質であって、前記抗原結合ドメインは、抗体:NKp46−1 H1L1、NKp46−1 H3L1、NKp46−2 H1L1、NKp46−2 H2L1、NKp46−2 H3L1、NKp46−3 H1L1、NKp46−3 H3L1、NKp46−3 H4L1、NKp46−4 H1L2、NKp46−4 H2L2、NKp46−4 H3L2、NKp46−9 H2L1、NKp46−9 H2L2、NKp46−9 H3L1、又はNKp46−9 H3L2のいずれか1つのそれぞれのVH及びVドメインと少なくとも80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH及びVLドメインを含む、タンパク質。
- ヒトNKp46ポリペプチド及び非ヒト霊長類NKp46ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドであって、前記抗原結合ドメインは、ヒト起源のフレームワーク配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)、及びヒト起源のフレームワーク配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)を含み、前記タンパク質は、
(a)配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL(NKp46−1);
(b)配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL(NKp46−2);
(c)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL(NKp46−3);又は
(d)配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL(NKp46−4);又は
(e)配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH、及び配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVL(NKp46−9)
からなる群から選択されるVH及びVLの組み合わせを含む、タンパク質又はポリペプチド。 - 前記タンパク質は、
(a)配列番号3のアミノ酸配列を有するVHのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号4のアミノ酸配列を有するVLのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−33遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(b)配列番号5のアミノ酸配列を有するVHのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV4−30−4遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号6のアミノ酸配列を有するVLのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−39遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(c)配列番号7のアミノ酸配列を有するVHのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号8のアミノ酸配列を有するVLのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV3−11及び/又はIGKV3−15遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(d)配列番号9のアミノ酸配列を有するVHのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV1−46及び/又はIGHV1−69遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号10のアミノ酸配列を有するVLのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−NL1遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有するVHのCDR1、2、及び3と、ヒトIGHV4−30−4遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVH、並びに配列番号14のアミノ酸配列を有するVLのCDR1、2、及び3と、ヒトIGKV1−39遺伝子セグメントのFR1、2、及び3とを含むVL
からなる群から選択される重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の組み合わせを含む、請求項1〜10のいずれかに一項に記載の組成物。 - 前記抗原結合ドメインは、抗体:NKp46−1 H1L1、NKp46−1 H3L1、NKp46−2 H1L1、NKp46−2 H2L1、NKp46−2 H3L1、NKp46−3 H1L1、NKp46−3 H3L1、NKp46−3 H4L1、NKp46−4 H1L2、NKp46−4 H2L2、NKp46−4 H3L2、NKp46−9 H2L1、NKp46−9 H2L2、NKp46−9 H3L1、又はNKp46−9 H3L2のいずれか1つのそれぞれのVH及びVLドメインと少なくとも80%、90%、95%、又は98%同一であるアミノ酸配列を含むVH及びVLドメインを含む、請求項10又は11に記載の組成物。
- 前記抗原結合ドメイン又はそれを含む前記タンパク質若しくはポリペプチドは、
a.野生型NKp46に対する結合性と比較して、残基R101、V102、E104、及び/又はL105に変異を有する変異NKp46ポリペプチド;
b.前記野生型NKp46に対する結合性と比較して、残基K41、E42、E119、Y121、及び/又はY194のいずれか1つ以上に変異を有する変異NKp46ポリペプチド;並びに
c.前記野生型NKp46に対する結合性と比較して、残基P132、E133、I135、及び/又はS136のいずれか1つ以上に変異を有する変異NKp46ポリペプチド
からなる群から選択される変異NKp46ポリペプチドに対して低い結合性を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記VH及びVLドメインは、同じポリペプチド鎖上に存在する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗原結合ドメイン。
- 前記VH及びVLドメインは、ペプチドリンカーによって分離されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗原結合ドメイン。
- 目的の抗原に結合する第2の抗原結合ドメインをさらに含む多重特異的タンパク質であり、前記多重特異的タンパク質は、NKp46発現NK細胞に、前記目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができる、請求項1〜15のいずれか一項に記載のタンパク質。
- 単一ポリペプチド鎖からなる、請求項16に記載の多重特異的タンパク質。
- NKp46ポリペプチドに結合する前記抗原結合ドメイン及び目的の抗原に結合する前記抗原結合ドメインは、リンカーを介してVLに融合されたVHをそれぞれ含む、請求項16又は17に記載の多重特異的タンパク質。
- 二量体、三量体、又は四量体から選択される多量体ポリペプチドである、請求項16又は18に記載の多重特異的タンパク質。
- 前記タンパク質は、Fcドメインの少なくとも一部を含み、且つ完全長野生型ヒトIgG1抗体と比較して、ヒトCD16ポリペプチドに対して低い結合性を有する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、Fcドメインの少なくとも一部を含み、前記Fcドメインは、二量体であり、且つヒトCD16に対する結合性を維持している、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、ヒトCH1又はCκ定常ドメイン(V−(CH1/Cκ)単位)に融合された少なくとも1つの重鎖又は軽鎖可変ドメイン及びFcドメインをそれぞれ含む少なくとも2つの異なるポリペプチド鎖を含むヘテロ多量体タンパク質であり、前記タンパク質鎖は、CH1−Cκ二量体化され、且つ非共有結合により、及び任意選択的に、それぞれのCH1ドメインとCκドメインとの間に形成されたジスルフィド結合により、且つそれぞれのFc部分のCH3ドメイン間の非共有結合により、さらに互いに結合されている、請求項1〜16又は18〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第1及び第2ポリペプチド鎖の両方は、前記CH1及び/又はCκドメインと前記Fcドメインとの接合部にヒンジドメインを含む、請求項22に記載のタンパク質。
- 前記抗原結合ドメイン、ポリペプチド、又は多重特異的タンパク質は、前記NKp46ポリペプチドに一価で結合する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、ヘテロ二量体であり、且つ
(a)ドメイン配置:
Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−Vb−2
を有する第1のポリペプチド、及び
(b)ドメイン配置:
Vb−1−(CH又はCK)b−Fcドメイン
を有する第2のポリペプチド鎖
を含み、
Va−1及びVb−1の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり、Va−2及びVb−2の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり;
(CH1又はCK)bは、中心鎖上の前記(CH1又はCK)aと二量体化し、及び前記Vb−1は、前記中心鎖のVa−1と共に抗原結合ドメインを形成し、Va−2とVb−2とは、抗原結合ドメインを共に形成する、請求項1〜16又は18〜21のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記タンパク質は、ヘテロ三量体であり、且つ
(a)ドメイン配置:
Va−1−(CH1又はCK)a−Fcドメイン−Va−2−(CH1又はCK)b
を有する第1のポリペプチド鎖、
(b)ドメイン配置:
Vb−1−(CH1又はCK)c−Fcドメイン
を有する第2のポリペプチド鎖、及び
(c)ドメイン配置:
Vb−2−(CH1又はCK)d
を有する第3のポリペプチド鎖
を含み、
Va−1及びVb−1の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり、Va−2及びVb−2の一方は、軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は、重鎖可変ドメインであり;
(CH1又はCK)cは、中心鎖上の前記(CH1又はCK)aと二量体化し、且つ前記Va−1と前記Vb−1とは、抗原結合ドメインを形成し;及び
(CH1又はCK)dは、前記中心鎖上の前記(CH1又はCK)b単位と二量体化し、且つ前記Va−2と前記Vb−2とは、抗原結合ドメインを形成する、請求項1〜16又は18〜21のいずれか一項に記載の組成物。 - Va−2とVb−2とは、NKp46に結合する抗原結合ドメインを共に形成する、請求項25又は26に記載の組成物。
- 前記ヒトNKp46ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1〜30のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、カニクイザル(macaca fascicularis)(カニクイザル)NKp46ポリペプチドに結合する、請求項1〜31のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記タンパク質は、ヒトNKp46ポリペプチドとの結合について、NKp46−1、NKp46−2、NKp46−3、NKp46−4、又はNKp46−9の前記VH及びVLドメインを有するモノクローナル抗体と競合する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載のタンパク質又はそのポリペプチド鎖をコードする単離された核酸。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載の組成物を産生する組換え細胞。
- タンパク質を産生する方法であって、請求項1〜33のいずれか一項に記載のタンパク質の発現に適した条件下において、請求項36に記載の細胞を培養するステップと、前記タンパク質を回収するステップとを含む方法。
- 疾患の処置のための薬剤としての、請求項1〜34のいずれか一項に記載のポリペプチド又は組成物の使用。
- 対象の疾患を処置する方法であって、請求項1〜34のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 前記疾患は、癌、感染病、又は炎症性若しくは自己免疫疾患である、請求項38又は39に記載の方法又は使用。
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