JP2023517889A

JP2023517889A - ＮＰＭ１ｃ陽性がんの免疫療法のための組成物および方法

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Publication number: JP2023517889A
Application number: JP2022553053A
Authority: JP
Inventors: チェン，ジャンツ; シェ，グゥオツ
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2023-04-27
Also published as: KR20220167276A; BR112022017924A2; MX2022011178A; CA3173981A1; EP4118112A1; CN115485295A; US20210283178A1; WO2021183207A1; AU2021232853A1; IL296241A; US11896619B2

Abstract

本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成しているか、もしくはそれによって提示される変異型ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１ｃ）のネオエピトープに結合する化合物（例えば、抗体、その抗原結合断片、二重特異性分子、またはキメラ抗原受容体ポリペプチド）、またはそのような化合物を発現する細胞、および、がんの１つもしくは複数の症状を治療するか、もしくは寛解させるための方法におけるそれらの使用に関する。

Description

政府の実施権の記載
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＣＡ１９７６０５に基づき、政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９８７，６１２号明細書の利益を主張する。その内容はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。

細胞ベースの免疫療法が、がんの治療のために開発中である。Ｔ細胞、単球由来細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の養子細胞移入を使用するアプローチが、がん治療として検討されている（例えば、Andreesen, R. et al (1990) Cancer Res 50:7450-7456; Ruggeri, L. et al (2002) Science 295:2097-2100; Rezvani, K. (2019) Bone Marrow Transplantation 54:785-788を参照）。具体的には、ｅｘｖｉｖｏで活性化／増大させたＴ細胞を患者に投与する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、現在試験されているがん治療の１つである。（Rosenberg et al. (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299; Dudley et al. (2002) Science 298(5594): 850; June et al. (2007) J Clin Invest 117(5): 1204; Stephan et al. (2007) Nat Med 13(12): 1440; Yee et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99(25): 16168）。これらのアプローチは、患者から採取され、ｅｘｖｉｖｏで活性化／増大されて、次いで腫瘍、例えば、転移性腫瘍と闘うために再注入される自己Ｔ細胞の使用を伴う。ＡＣＴＴ細胞の持続性、ｉｎｖｉｖｏ増大、およびエフェクター機能を増強する戦略が、客観的奏効の頻度を高めるために使用されてきた。（Rosenberg SA et al. (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299; June CH et al. (2007) J Clin Invest 117(5): 1204）。ＡＣＴＴ細胞の機能を増強する１つの方法は、例えば、キメラ受容体または共刺激分子を導入することによって、細胞それ自体の遺伝子操作を介する方法である（例えば、Stephan et al. (2007) Nat Med 13(12): 1440; Morgan et al. (2006) Science 314(5796): 126; Gade et al. (2005) Cancer Res 65(19): 9080を参照）。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療は、がん治療のための戦略の１つとして登場してきた。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原（例えば、リガンド）に対する規定された特異性を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞または他の免疫細胞）に付与して、抗原を認識してそれに結合した際にエフェクター細胞の活性化をもたらす、遺伝子操作された人工膜貫通受容体である。典型的には、これらのキメラ受容体は、モノクローナル抗体の抗原特異性を、当技術分野でＣＡＲＴ細胞と称されるＴ細胞に与えるために使用される。ＣＡＲＴ細胞の表面上での操作されたキメラ抗原受容体の発現により、キメラ受容体によって認識される特定の抗原の表面発現を有する任意の標的細胞を溶解させる能力が、Ｔ細胞に付与される。

しかし、細胞系譜限定的な抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする現在のＣＡＲは、正常組織で低い抗原発現があるため、強い毒性を伴う可能性がある（Coulie et al., NAT REV CANCER 14: 135 (2014); Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018)を参照）。さらに、ＴＡＡは腫瘍細胞の生存に必要ではないため、ＴＡＡ発現の喪失は、ＣＡＲ－Ｔ療法に対する腫瘍抵抗性の発生の主な原因となる（Srivastava & Riddell, J IMMUNOL 200: 459 (2018)を参照）。ネオ抗原は腫瘍特異的な遺伝子変異に由来し、その形成および発現は悪性細胞に限定される（Blankenstein et al.,. CURR OPIN IMMUNOL 33 112 (2015); Schumacher et al. SCIENCE 348: 69 (2015); van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019)を参照）。しかし、ネオ抗原の大多数は、免疫編集が原因で失われて腫瘍免疫回避をもたらす可能性のある、患者に特異的なパッセンジャー変異によってコードされている（Verdegaal et al., NATURE 536: 91 (2016)を参照）。加えて、現行のＣＡＲは、主として標的細胞の表面にある抗原に結合するように設計されている。実際には、変異遺伝子由来の大部分のタンパク質は細胞内で発現され、そのため、従来のＣＡＲの標的としては利用できない（Uhlen et al., SCIENCE 347: 1260419 (2015)を参照）。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対するがん免疫療法の適用は限られている。ＡＭＬは急速に進行する造血器悪性腫瘍の１つであり、骨髄内で分化が停止した悪性骨髄系前駆細胞の蓄積によって特徴付けられる（van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019); Thomas et al., BLOOD 129: 1577 (2017)を参照）。ＡＭＬに対する現行の標準治療は、強力な化学療法および自己性または同種性造血幹細胞移植（ａｌｌｏＳＣＴ）に依然として依拠している（Dombret & Gardin, BLOOD 127: 53 (2016); Dohner et al., N Engl J Med 373: 1136 (2015)を参照）。大部分の患者は標準治療に反応して完全寛解を達成することができるが、これらの患者の約５０％に再発が起こる（Ossenkoppele et al., HAEMATOLOGICA 101 20 (2016)を参照）。強力な化学療法またはａｌｌｏＳＣＴの後の再発性または難治性ＡＭＬ患者は通常、予後が非常に不良であり（van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019)を参照）、このため、これらの患者に対する新しく効果的で毒性の少ない治療法を開発することには、大きな需要がある。

一部の態様では、本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、および／または（ｂ）ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、対照ペプチドは、ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープまたはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである。

一部の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、および（ｂ）ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、対照ペプチドは、ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープまたはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである。

一部の態様では、抗体、またはその抗原結合断片は、（ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、（ｂ）ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド、任意選択で、対照ペプチドはＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープもしくはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである、および／または（ｃ）ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独には結合しないか、または実質的に結合しない。

一部の態様では、抗体、またはその抗原結合断片は、（ａ）ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、（ｂ）ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド、任意選択で、対照ペプチドはＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープもしくはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである、および（ｃ）ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独には結合しないか、または実質的に結合しない。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９を含み、式中、Ｘ_１はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ_２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＱから選択され、Ｘ_３はＱまたはＮから選択され、Ｘ_４はＤまたはＥから選択され、Ｘ_５はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＦから選択され、Ｘ_６はＣ、Ｓ、またはＡから選択され、Ｘ_７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦから選択され、Ｘ_８はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ_９はＬ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡから選択される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９を含み、式中、Ｘ_１はＡまたはＶから選択され、Ｘ_２はＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ_３はＱまたはＮから選択され、Ｘ_４はＤまたはＥから選択され、Ｘ_５はＬまたはＩから選択され、Ｘ_６はＣまたはＳから選択され、Ｘ_７はＶ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ_８はＡまたはＶから選択され、Ｘ_９はＶ、Ｉ、またはＬから選択される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９を含み、式中、Ｘ_１はＡであり、Ｘ_２はＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ_３はＱであり、Ｘ_４はＤであり、Ｘ_５はＬであり、Ｘ_６はＣであり、Ｘ_７はＬであり、Ｘ_８はＡであり、Ｘ_９はＶ、Ｉ、またはＬから選択される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸残基長のペプチド内にある。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）またはＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸残基長である。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされる。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲであり、ＣＤＲはＩＭＧＴによって定義される通りである、ＶＨ；ならびに／または
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲであり、ＣＤＲはＩＭＧＴによって定義される通りである、ＶＬ
を含む抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、ＶＨＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、ＶＨを含む抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、ＶＬＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、ＶＬをさらに含む抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体、またはその抗原結合断片であって、ＶＨは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体、またはその抗原結合断片であって、ＶＨは配列番号５のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは配列番号３のアミノ酸配列を含む、抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、または単鎖抗体分子である抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、ｓｃＦｖである抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一部の態様では、ｓｃＦｖはヒトｓｃＦｖである。一部の態様では、ｓｃＦｖはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、ｓｃＦｖは、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、ＶＨＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、ＶＨＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、ＶＨＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、ＶＨ；および／または（ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、ＶＬＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、ＶＬＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、ＶＬＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、ＶＬを含む。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、ｓｃＦｖは配列番号２のアミノ酸配列を有する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、抗体である抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一部の態様では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体アイソタイプからなる群から選択される。一部の態様では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプのものである。一部の態様では、抗体は、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。一部の態様では、抗体は、変異型ＩｇＧ１重鎖定常領域または変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、抗体は変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域は、以下の置換のうちのいずれか１つを含む：ＥＵ番号付けによるＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、またはそれらの組合せ。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、抗体は、少なくとも１つの変異を含むＦｃドメインを含む。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、抗原は、がん細胞の表面にある。一部の態様では、がんは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、抗体、またはその抗原結合断片は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、２０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、０．５ｎＭから１００ｎＭまで、または１ｎＭから１５ｎＭまでの平衡解離定数（Ｋｄ）で結合する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、免疫エフェクター細胞上の第２の抗原にさらに特異的に結合する二重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一部の態様では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞またはマクロファージである。一部の態様では、第２の抗原はＣＤ３である。一部の態様では、ＣＤ３は、Ｔ細胞上に発現されるヒトＣＤ３である。一部の態様では、第２の抗原はＮＫｐ４６である。一部の態様では、ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞上に発現されるヒトＮＫｐ４６である。一部の態様では、第２の抗原はＣＤ１６Ａである。一部の態様では、ＣＤ１６Ａは、ＮＫ細胞上に発現されるヒトＣＤ１６Ａである。一部の態様では、第２の抗原は、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ、ＴＧＦ－β、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＤまたはＤＮＡＭ－１である。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、精製された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。

一部の態様では、本開示は、単離された核酸であって、核酸が、本明細書に記載される抗体、またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を含む核酸を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、単離された核酸は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、単離された核酸は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸を含む発現ベクターを提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸を含む発現ベクターによって形質転換された細胞を提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体、またはその抗原結合断片を作製するための方法であって、本明細書に記載される核酸を含む発現ベクターによって形質転換された細胞を、抗体、またはその抗原結合断片の発現を可能にする条件下で維持するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、本方法は、抗体、またはその抗原結合断片を精製するステップをさらに含む。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体、またはその抗原結合断片の治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

一部の態様では、本開示は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、細胞外結合ドメインが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、ＣＡＲポリペプチドを提供する。

一部の態様では、本開示は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、細胞外結合ドメインが、本明細書に記載される抗体、またはその抗原結合断片を含む、ＣＡＲポリペプチドを提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含む。一部の態様では、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、細胞内ドメインがＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドがＣＤ８ヒンジ領域をさらに含む、ＣＡＲポリペプチドを提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示はＣＡＲポリペプチドであって、細胞内ドメインは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域を含み、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、細胞外結合ドメインは、抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む、ＣＡＲポリペプチドを提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞外結合ドメイン内の、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、細胞内ドメインは、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断によりサイトカインが放出される。一部の態様では、サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、またはＣＣＬ１９である。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むＣＡＲポリペプチドを提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。一部の態様では、単離された核酸は、配列番号３０のヌクレオチド配列、または配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、もしくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターであって、発現ベクターがウイルス発現ベクターまたは非ウイルス発現ベクターである発現ベクターを提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターであって、発現ベクターがウイルス発現ベクターであり、ウイルス発現ベクターがレンチウイルス発現ベクターである発現ベクターを提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターによって形質転換された細胞を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を提供する。一部の態様では、細胞は免疫エフェクター細胞であり、ＣＡＲポリペプチドの発現は、免疫エフェクター細胞を、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原を発現するがん細胞に標的化させる。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、野生型ＮＰＭ１を発現するがん細胞を実質的に標的とせず、および／またはその殺滅を誘導しない。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、野生型ＮＰＭ１を発現するがん細胞を実質的に標的としない。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、野生型ＮＰＭ１を発現するがん細胞の殺滅を実質的に誘導しない。一部の態様では、細胞はＴ細胞である。一部の態様では、Ｔ細胞はヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞である。一部の態様では、細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の態様では、細胞はマクロファージである。一部の態様では、がん細胞は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターによって形質転換された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現する細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を作製するための方法であって、（ｉ）対象の末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）から細胞を精製するステップ、（ｉｉ）任意選択で、抗ＣＤ３抗体、またはその抗原結合断片および／または抗ＣＤ２８抗体、またはその抗原結合断片によって細胞を活性化するステップ、（ｉｉｉ）本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターによって細胞に形質導入するステップ、（ｉｖ）ＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を単離するステップ、ならびに（ｖ）任意選択で、単離された細胞を増大させるステップを含む方法を提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現する細胞を作製するための方法であって、（ｉ）多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導して、免疫エフェクター細胞に分化させるステップ、（ｉｉ）本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸を含む発現ベクターにより、免疫エフェクター細胞に形質導入するステップ、（ｉｉｉ）ＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞を単離するステップ、および（ｉｖ）任意選択で、単離された免疫エフェクター細胞を増大させるステップを含む方法を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。一部の態様では、免疫エフェクター細胞はマクロファージである。一部の態様では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。

一部の態様では、本開示は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し、本明細書に記載される抗体、もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載される細胞、または本明細書に記載される医薬組成物を、がんを治療するのに十分な量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、がんは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。一部の態様では、がんを治療する方法は、がんの量を減少させる方法、または対象における生存期間を延長させる方法である。

一部の態様では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療を必要とする対象においてＡＭＬを治療する方法であって、本明細書に記載される抗体、もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載される細胞、または本明細書に記載される医薬組成物を、ＡＭＬを治療するのに十分な量で対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、ＡＭＬは、再発性ＡＭＬまたは難治性ＡＭＬである。

一部の態様では、本開示は、ＡＭＬから寛解している対象においてＡＭＬの再発を予防する方法であって、本明細書に記載される抗体、もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載される細胞、または本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、投与のステップの前に、対象がＮＰＭ１ｃを発現するか否か、または対象がＮＰＭ１遺伝子におけるＮＰＭ１ｃ変異を有するか否かを検出し、対象がＮＰＭ１ｃを発現するかまたはＮＰＭ１ｃ変異を有する場合、投与のステップに進むステップを含む方法を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、投与が静脈内、髄腔内、骨内、または脊髄内である方法を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本方法は、１つまたは複数の追加の治療薬または手順を投与するステップをさらに含む。一部の態様では、追加の治療薬は免疫チェックポイント分子の阻害剤であり、任意選択で、免疫チェックポイント分子はＴＩＭ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４であり、任意選択で、阻害剤は抗体である。

一部の態様では、本開示は、対象におけるがんを治療するための医薬の製造における、本明細書に記載される抗体、もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド、本明細書に記載される細胞、または本明細書に記載される医薬組成物の使用であって、がんを含む細胞の細胞表面が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し；任意選択で、使用が、１つまたは複数の追加の治療薬または手順と組み合わされたものである、使用を提供する。

前記の態様または関連する態様のいずれかにおいて、対象はヒトである。

一部の態様では、本開示は、（ｉ）本明細書に記載される抗体、もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド、本明細書に記載される細胞、または本明細書に記載される医薬組成物；（ｉｉ）任意選択で、１つまたは複数の追加の治療薬、および（ｉｉｉ）対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む１つもしくは複数の容器を含むキットを提供する。

別の態様では、ＭＨＣ（例えば、ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書に記載される。この態様のある特定の実施形態では、ＭＨＣ（例えば、ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、例えば、（ｉ）抗原に結合する抗体クローンを、酵母表面ディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーまたはファージディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーを使用して単離するステップ、および（ｉｉ）酵母表面ディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーまたはファージディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーを使用し、抗体クローンを、複数回（２回、３回、４回またはより多くの回数）の陽性選択（抗原に結合する酵母またはファージのクローンを選択する）および複数回（２回、３回、４回またはより多くの回数）の陰性選択（例えば、ＭＨＣタンパク質単独および／または対照ペプチド（すなわち、ネオエピトープとは異なるペプチド）複合体を形成したＭＨＣタンパク質に結合する酵母またはファージのクローンを選択して除去する）に供することによって、抗原に特異的に結合する抗体クローンを選択するステップ）によって生成され；選択された抗体クローンは、抗原には結合し、ＭＨＣタンパク質単独および／または対照ペプチドと複合体を形成したＭＨＣタンパク質には結合しないか、または実質的に結合しない。この態様のある特定の実施形態では、抗原は、二量体ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体である。この態様のある特定の実施形態では、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２である。

図１Ａ～１Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの酵母表面ディスプレイによる単離を示す図である。図１Ａは、エピトープペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体、酵母表面上にディスプレイされたｓｃＦｖ、および酵母細胞表面上のｓｃＦｖへのペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体の結合の概略を示す。概略図はChao et al., NAT PROTOC 1: 755 (2006)から改編した。図１Ａ～１Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの酵母表面ディスプレイによる単離を示す図である。図１Ｂ－１および１Ｂ－２は、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を特異的に認識するｓｃＦｖをディスプレイする酵母細胞を単離するために使用した戦略およびステップを示す。選択のラウンドを左側に示す（図１Ｂ－１にラウンド１～５を、図１Ｂ－２にラウンド６～９を示す）。「抗原」は、陽性選択または陰性選択に使用したペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体またはＨＬＡ－Ａ２単独を示す。選択の最初の２ラウンドでは、酵母細胞は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によって選択した。残りの選択のラウンドでは、酵母細胞はＦＩＴＣ標識抗ｃ－Ｍｙｃ抗体およびＰＥ標識抗マウスＩｇＧまたはＡＰＣ標識ストレプトアビジンによる染色に基づくフローサイトメトリーによって選別した。選別した細胞についてのゲートを示す。ＦＡＣＳプロットは＃１から＃７まで標識した。図１Ａ～１Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの酵母表面ディスプレイによる単離を示す図である。図１Ｂ－１および１Ｂ－２は、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を特異的に認識するｓｃＦｖをディスプレイする酵母細胞を単離するために使用した戦略およびステップを示す。選択のラウンドを左側に示す（図１Ｂ－１にラウンド１～５を、図１Ｂ－２にラウンド６～９を示す）。「抗原」は、陽性選択または陰性選択に使用したペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体またはＨＬＡ－Ａ２単独を示す。選択の最初の２ラウンドでは、酵母細胞は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によって選択した。残りの選択のラウンドでは、酵母細胞はＦＩＴＣ標識抗ｃ－Ｍｙｃ抗体およびＰＥ標識抗マウスＩｇＧまたはＡＰＣ標識ストレプトアビジンによる染色に基づくフローサイトメトリーによって選別した。選別した細胞についてのゲートを示す。ＦＡＣＳプロットは＃１から＃７まで標識した。図１Ａ～１Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの酵母表面ディスプレイによる単離を示す図である。図１Ｃ－１および１Ｃ－２は、生存細胞についてのフローサイトメトリーデータ（ＦＡＣＳ）を示す。ラウンド４から９までの選別した酵母細胞を増大させ、次いでＦＩＴＣ標識抗ｃ－Ｍｙｃ抗体およびビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２、ＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、またはＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２、次にＡＰＣ標識ストレプトアビジンで染色し、生存細胞（ＤＡＰＩ陰性）についてフローサイトメトリーによってゲーティングした。ラウンド４および５についてのデータを図１Ｃ－１に、ラウンド６～９についてのデータを図１Ｃ－２に示す。ＦＡＣＳプロットは＃１から＃２９まで標識した。図１Ａ～１Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの酵母表面ディスプレイによる単離を示す図である。図１Ｃ－１および１Ｃ－２は、生存細胞についてのフローサイトメトリーデータ（ＦＡＣＳ）を示す。ラウンド４から９までの選別した酵母細胞を増大させ、次いでＦＩＴＣ標識抗ｃ－Ｍｙｃ抗体およびビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２、ＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、またはＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２、次にＡＰＣ標識ストレプトアビジンで染色し、生存細胞（ＤＡＰＩ陰性）についてフローサイトメトリーによってゲーティングした。ラウンド４および５についてのデータを図１Ｃ－１に、ラウンド６～９についてのデータを図１Ｃ－２に示す。ＦＡＣＳプロットは＃１から＃２９まで標識した。図１Ａ～１Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの酵母表面ディスプレイによる単離を示す図である。図１Ｄは、フローサイトメトリーデータを示す。ＹＧ１またはＹＧ２クローンを発現する酵母細胞を染色し、図１Ｃのように解析した。図１Ｂ、図１Ｃ、および図1Ｄにおけるパーセンテージは、ゲーティングした領域内の細胞のパーセンテージを示す。図２Ａ～２Ｅは、ＡＭＬ細胞上のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対するＹＧ１ｓｃＦｖの特異的かつ高親和性の結合を示す図である。図２Ａは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を発現するための切り替え可能な酵母ディスプレイ／分泌ベクターの概略を示す図である。この切り替え可能な系において、ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ＯｍｅＹが培養に添加されるか否かによって、酵母細胞上に分泌またはディスプレイされ得る（Van Deventer et al., PROTEIN ENG DES SEL 28: 317 (2015)）。図２Ｂは、精製されたＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１：タンパク質ラダー、レーン２：非還元ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質（１μｇ）、レーン３：還元ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質（１μｇ）。ゲルはクーマシーブルーを使用して染色した。図２Ａ～２Ｅは、ＡＭＬ細胞上のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対するＹＧ１ｓｃＦｖの特異的かつ高親和性の結合を示す図である。図２Ｃは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、Ｔ２、ＧＭＢ、ＰＣ－３、およびＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞によるＨＬＡ－Ａ２発現のフローサイトメトリーデータを示す。暗い陰影を付けたヒストグラム：抗ＨＬＡ－Ａ２で染色、および明るい陰影を付けたヒストグラム：アイソタイプ対照抗体で染色。図２Ｄは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、Ｔ２、ＧＭＢ、およびＰＣ－３細胞によるＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２発現のフローサイトメトリーデータを示す。暗い陰影を付けたヒストグラム：ＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび抗ＨＡで染色、明るい陰影を付けたヒストグラム：ＢＳＡおよびそれに続いて抗ＨＡで染色。三連測定からの代表的なデータを示す。図２Ａ～２Ｅは、ＡＭＬ細胞上のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対するＹＧ１ｓｃＦｖの特異的かつ高親和性の結合を示す図である。図２Ｅは、バイオレイヤー干渉法によるＹＧ１ｓｃＦｖ－ＦｃとＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ２との間の相互作用の速度論的解析を示す。ＦｏｒｔｅＢｉｏＯｃｔｅｔＲＥＤ９６のストレプトアビジンバイオセンサーチップを、ビオチン化ＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質でコートした。増加する濃度（結合曲線の下に示す）のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ２にチップを浸漬してｓｃＦｖ－Ｆｃへの結合（会合）を測定し、続いて緩衝液を含むウェルに移して解離速度（解離）を測定した。３回の個別の実験からの代表的なデータを示す。図３Ａ～３Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）の生成を示す図である。図３Ａは、ｓｃＦｖ（ＹＧ１またはＣＤ１９）、ＣＤ８α細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζ活性化ドメイン、それに続く自己切断型Ｐ２ＡおよびＥＧＦＰからなるＣＡＲベクターの概略を示す。図３Ｂは、ＡＭＬ細胞上のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体のＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞による認識の概略を示す。図３Ａ～３Ｄは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）の生成を示す図である。図３Ｃは、非形質導入Ｔ細胞および形質導入したＴ細胞によるＣＡＲ発現のフローサイトメトリーデータを示す。形質導入したＴ細胞はＧＦＰ＋細胞の選別によって富化し増大させて、ｓｃＦｖを認識するＡＦ６４７標識抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖抗体で染色した。非形質導入Ｔ細胞は選別せずに活性化し増大させた。生存細胞（ＤＡＰＩ^－）のＧＦＰと抗ヒトＩｇＧによる染色のプロファイルを示す。図３Ｄは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を認識することを示すフローサイトメトリーデータを示す。非形質導入Ｔ細胞および形質導入したＴ細胞をビオチン化したＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２またはＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２複合体とインキュベートし、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣで染色した。生存している（ＤＡＰＩ^－）非形質導入Ｔ細胞、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞、およびＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞のＧＦＰとストレプトアビジン－ＡＰＣによる染色プロファイルを示す。図３Ｃおよび３Ｄのデータは、少なくとも３回の独立した実験の代表である。パーセンテージは、ゲーティングした領域中の細胞のパーセンテージを示す。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ａ～４Ｂは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞をｉｎｖｉｔｒｏで殺滅することを示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を、表示したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＯＣＩ－ＡＭＬ３、ＧＭＢ、およびＰＣ－３腫瘍細胞とともに２４時間、共培養した。細胞混合物をＣＤ８およびＣＤ３３、ＣＤ１９、またはｍＣｈｅｒｒｙについて染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージをＣＤ８染色によって、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞のパーセンテージをＣＤ３３によって、ＧＭＢ細胞のパーセンテージをＣＤ１９によって、ＰＣ－３のパーセンテージをｍＣｈｅｒｒｙによって定量化した。腫瘍細胞の特異的溶解のパーセンテージを計算した（計算式については実施例の材料および方法の部を参照）。異なるＥ：ＴにおけるＣＤ８に対するＣＤ３３、ＣＤ１９、またはｍＣｈｅｒｒｙの染色プロファイル（図４Ａ）および特異的溶解のパーセンテージ（図４Ｂ）を示す。ゲーティングした領域の細胞のパーセンテージを示している。ｐ値は、同じＥ：Ｔ比におけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞との比較を示している。図４Ａ（続き）である。図４Ａ（続き）である。図４Ａ（続き）である。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ａ～４Ｂは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞をｉｎｖｉｔｒｏで殺滅することを示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を、表示したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＯＣＩ－ＡＭＬ３、ＧＭＢ、およびＰＣ－３腫瘍細胞とともに２４時間、共培養した。細胞混合物をＣＤ８およびＣＤ３３、ＣＤ１９、またはｍＣｈｅｒｒｙについて染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージをＣＤ８染色によって、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞のパーセンテージをＣＤ３３によって、ＧＭＢ細胞のパーセンテージをＣＤ１９によって、ＰＣ－３のパーセンテージをｍＣｈｅｒｒｙによって定量化した。腫瘍細胞の特異的溶解のパーセンテージを計算した（計算式については実施例の材料および方法の部を参照）。異なるＥ：ＴにおけるＣＤ８に対するＣＤ３３、ＣＤ１９、またはｍＣｈｅｒｒｙの染色プロファイル（図４Ａ）および特異的溶解のパーセンテージ（図４Ｂ）を示す。ゲーティングした領域の細胞のパーセンテージを示している。ｐ値は、同じＥ：Ｔ比におけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞との比較を示している。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ｃは、ＣＡＲ－Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞との間のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の発現の比較を示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞を、モネンシンおよびブレフェルジンＡの存在下で、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、ＧＭＢ、またはＰＣ－３と１２時間、共培養した。細胞をＣＤ３について染色し、次いで透過処理して、細胞内ＩＦＮ－γまたはＩＬ－２について染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。ＩＦＮ－γ^＋またはＩＬ－２^＋のＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞のパーセンテージを示す。Ｐ値を示している。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ｄは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋標的細胞によって刺激されて多種のサイトカインを分泌することを示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞をＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞とともに１６時間、共培養した。培養上清を採取し、ＱｕａｎｔｉｂｏｄｙＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅＡｒｒａｙを使用して２０種の異なるサイトカインについて同時にアッセイした。それぞれのサイトカインは、四連測定の抗体スポットを含んでいた。異なる４名の健康なドナー由来のＴ細胞を個別に分析した。ｎ＝４の反復抗体スポット。グラフのバーおよびエラーバーは平均±ｓ．ｅ．を表す。ｐ値を示している。図４Ｄ（続き）である。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ｅ～４Ｆは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋標的細胞に応答して増殖することを示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞をＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞とともに５日間、共培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞の絶対細胞数を、プレシジョンカウントビーズを使用するフローサイトメトリーによって決定した。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞によるＫｉ－６７の発現を、細胞内染色、それに続くフローサイトメトリーによってアッセイした。図４Ｅは、５日目におけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞の数の比較を提供する。図４Ｆは、非形質導入Ｔ細胞とＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞との間の細胞内Ｋｉ－６７染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較を提供する。ｐ値はＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞との間の比較を示す。ｎ＝５の生物学的に独立した試料。グラフのバーおよびエラーバーは平均±ｓ．ｅ．を表す。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ｇ～４Ｈは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋ヒト腫瘍細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す。ＯＣＩ－ＡＭＬ２（ＨＬＡ－Ａ２陽性）およびＰＣ－３（ＨＬＡ－Ａ２陰性)細胞に、ＮＰＭ１ｃを発現するレンチウイルス（レンチ－ＮＰＭ１ｃ）または空の陰性対照（レンチ－ＮＣ）を形質導入した。形質導入した細胞を選別し、増大させた。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞による形質導入した、または対照のＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞（図４Ｇ）およびＰＣ－３細胞（図４Ｈ）の特異的殺滅の比較を示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を、形質導入したまたは対照のＯＣＩ－ＡＭＬ２またはＰＣ－３標的細胞とともに表示したＥ：Ｔ比で２４時間、共培養した。標的細胞の殺滅は、生存している標的細胞のルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって測定した。異なるＥ：Ｔ比における腫瘍細胞の特異的溶解のパーセンテージを計算した。それぞれの反応における標的細胞およびＴ細胞を示す。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ｉは、異なる濃度のＡＩＱペプチド（左のパネル）またはＳＬＬペプチド（右のパネル）でパルス処理したＴ２細胞に結合するＹＧ１ｓｃＦｖ－ＦＣのフローサイトメトリー解析を示す。図４Ａ～４Ｊは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ＨＬＡ－Ａ２＋ＮＰＭ１ｃ＋ヒトＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅することを示す図である。図４Ｊは、異なる濃度のＡＩＱペプチド（左のパネル）またはＳＬＬペプチド（右のパネル）でパルス処理したＴ２細胞の、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞による特異的殺滅の比較を示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を、ペプチドでパルス処理したＴ２標的細胞とともに表示したＥ：Ｔ比で２４時間、共培養した。標的細胞の殺滅は、生存している標的細胞のルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって測定した。ｐ値は、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞との間の同じＥ：Ｔ比における比較を示す。ｎ＝３の生物学的に独立した試料。データ点およびエラーバーは平均±ｓ．ｅ．を表す。図５Ａ～５Ｈは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）療法がＮＰＭ１ｃ陽性ＡＭＬ細胞を有するマウスにおいて白血病負荷を低減し生存期間を延長するが、ＮＰＭ１ｃ陰性ＡＭＬ細胞を有するマウスではそうでないことを示す図である。図５Ａは、実験デザインを示す。ＮＳＧマウスにＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞（１×１０^６）またはＧＭＢ細胞（２×１０^６）を静脈内注射し（Ｄ－４）、４日後（Ｄ０）に生着についてイメージングした。次いでマウスに１×１０^７個のＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内注射した。マウスを生物発光イメージングによって３日ごとにモニタリングして、腫瘍負荷および生存を評価した。図５Ａ～５Ｈは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）療法がＮＰＭ１ｃ陽性ＡＭＬ細胞を有するマウスにおいて白血病負荷を低減し生存期間を延長するが、ＮＰＭ１ｃ陰性ＡＭＬ細胞を有するマウスではそうでないことを示す図である。図５Ｂは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスと非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスとの間の、Ｔ細胞注射後の表示した日（Ｄ０～Ｄ１８）における生物発光イメージングによって測定したＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病負荷の比較を示す（ｎ＝５）。各実験群についての全フラックス（全身ＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病細胞からのルシフェラーゼシグナル）の比較を示す。実験は、１群あたり４または５匹のマウスで２回繰り返した。図５Ｃは、図５ＢのようにＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線（ｎ＝９）を示す。Ｐ値を示している。図５Ａ～５Ｈは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）療法がＮＰＭ１ｃ陽性ＡＭＬ細胞を有するマウスにおいて白血病負荷を低減し生存期間を延長するが、ＮＰＭ１ｃ陰性ＡＭＬ細胞を有するマウスではそうでないことを示す図である。図５Ｄは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞、非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスとＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスとの間の、Ｔ細胞注射後の表示した日（Ｄ０～Ｄ２１）における生物発光イメージングによって測定したＧＭＢリンパ腫負荷の比較を示す（ｎ＝３～５）。各実験群についての全フラックス（全身ＧＭＢ細胞からのルシフェラーゼシグナル）の比較を示す。実験は、１群あたり３～５匹のマウスで２回繰り返した。全フラックスについてのＰ値は、非形質導入Ｔ細胞とＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔについてｐ＝０．９９２、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔと非形質導入Ｔ細胞についてｐ＝０．００３、ＣＤ１９ＣＡＲ－ＴとＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔについてｐ＝０．０４７。図５Ｅは、図５ＤのようにＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞またはＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線（ｎ＝３～５）を示す。Ｐ値：非形質導入ＴとＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔについてｐ＝０．１２４、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔと非形質導入Ｔについてｐ＝０．０１２、およびＣＤ１９ＣＡＲ－ＴとＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔについてｐ＝０．０１５。図５Ａ～５Ｈは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）療法がＮＰＭ１ｃ陽性ＡＭＬ細胞を有するマウスにおいて白血病負荷を低減し生存期間を延長するが、ＮＰＭ１ｃ陰性ＡＭＬ細胞を有するマウスではそうでないことを示す図である。図５Ｆは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞、非形質導入Ｔ細胞、またはＰＢＳを投与したマウスにおいてＴ細胞／ＰＢＳの注射後の表示した日（Ｄ０～Ｄ２１）に生体発光イメージングによって測定したＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病負荷の比較を提供する（ｎ＝３～４）。全フラックス（全身のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞からのルシフェラーゼシグナル)の比較を示す。Ｐ値は、ＰＢＳと非形質導入Ｔｐ＝０．３９５、ＰＢＳとＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔｐ＝０．０１８、および非形質導入ＴとＮＰＭ１ｃＣＡＲ－ｔｐ＝０．０１１である。図５Ｇは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ｎ＝５）で処置したマウスと非形質導入Ｔ細胞（ｎ＝５）で処置したマウスとの間においてＴ細胞の注射後の表示した日（Ｄ０～Ｄ２１）に生体発光イメージングによって測定したＯＣＩ－ＡＭＬ２白血病負荷の比較を提供する。全フラックス（全身のＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞からのルシフェラーゼシグナル）の比較を示す。図５Ｈは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ｎ＝５）または非形質導入Ｔ細胞（ｎ＝５）で処置した図５Ｇに示すマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を提供する。データ点およびエラーバーは平均±ｓ．ｅ．を表す。ｐ値を示す。図６Ａ～６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、血液、脾、骨髄、および肝において白血病負荷を低減することを示す図である。図６Ａは、ＯＣＩ－ＡＭＬ３ＡＭＬ細胞、および次に非形質導入Ｔ細胞を注射したＮＳＧマウス、またはＯＣＩ－ＡＭＬ３ＡＭＬ細胞、および次にＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を注射したＮＳＧマウスの間で生物発光イメージングによって測定したＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病負荷の比較を示す。全フラックス（全身のＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞からのルシフェラーゼシグナル)の比較を示す。マウス（ｎ＝５）は、Ｔ細胞の注射の日（０日目）および１８日後にイメージングした。図６Ａ～６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、血液、脾、骨髄、および肝において白血病負荷を低減することを示す図である。図６Ｂ～６Ｃは、図６Ａで表されるマウスから得た細胞集団についてのゲーティング戦略および発現プロファイルを示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す。血液、脾、骨髄、および肝を１８日目に収集して単一細胞懸濁液を調製し、マウスＣＤ４５ならびにヒトＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＰＤ－１、およびＴｉｍ－３について染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。血液および脾（図６Ｂ）ならびに骨髄および肝（図６Ｃ）についての代表的な染色プロファイルおよびゲーティング戦略を示す。ゲーティング戦略には、生細胞（ＤＡＰＩ^－）におけるｍＣＤ４５対ｈＣＤ４５のゲーティング、ｈＣＤ４５^＋細胞におけるｈＣＤ３３対ｈＣＤ８のゲーティング、ｈＣＤ８^＋細胞におけるｈＰＤ－１対ｈＣＤ８のゲーティング、およびｈＣＤ８^＋細胞におけるｈＴｉｍ－３対ｈＣＤ８のゲーティングが含まれる。数字は、ゲーティングした領域内の細胞のパーセンテージを示す。図６Ａ～６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、血液、脾、骨髄、および肝において白血病負荷を低減することを示す図である。図６Ｂ～６Ｃは、図６Ａで表されるマウスから得た細胞集団についてのゲーティング戦略および発現プロファイルを示す代表的なフローサイトメトリープロットを示す。血液、脾、骨髄、および肝を１８日目に収集して単一細胞懸濁液を調製し、マウスＣＤ４５ならびにヒトＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＰＤ－１、およびＴｉｍ－３について染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。血液および脾（図６Ｂ）ならびに骨髄および肝（図６Ｃ）についての代表的な染色プロファイルおよびゲーティング戦略を示す。ゲーティング戦略には、生細胞（ＤＡＰＩ^－）におけるｍＣＤ４５対ｈＣＤ４５のゲーティング、ｈＣＤ４５^＋細胞におけるｈＣＤ３３対ｈＣＤ８のゲーティング、ｈＣＤ８^＋細胞におけるｈＰＤ－１対ｈＣＤ８のゲーティング、およびｈＣＤ８^＋細胞におけるｈＴｉｍ－３対ｈＣＤ８のゲーティングが含まれる。数字は、ゲーティングした領域内の細胞のパーセンテージを示す。図６Ａ～６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、血液、脾、骨髄、および肝において白血病負荷を低減することを示す図である。図６Ｄは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞を投与したマウス間の異なる組織におけるｈＣＤ３３^＋白血病細胞およびｈＣＤ８^＋Ｔ細胞の全数の比較を示す（左のバーは非形質導入Ｔ細胞による処置を表し、右のバーはＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞による処置を表す）。図６Ａ～６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、血液、脾、骨髄、および肝において白血病負荷を低減することを示す図である。図６Ｅは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスと非形質導入Ｔ細胞を投与したマウスとの間の異なる組織におけるｈＣＤ４５^＋細胞の中のｈＣＤ３３^＋白血病細胞およびｈＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージの比較を示す（左のバーは非形質導入Ｔ細胞による処置を表し、右のバーはＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞による処置を表す）。図６Ａ～６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、血液、脾、骨髄、および肝において白血病負荷を低減することを示す図である。図６Ｆは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を投与したマウスの異なる組織におけるｈＣＤ３３^＋白血病細胞に対するｈＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージの比を示す（左のバーは非形質導入Ｔ細胞による処置を表し、右のバーはＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞による処置を表す）。図６Ｇ～６Ｈは、異なる組織におけるヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のＰＤ１^＋Ｔ細胞（図６Ｇ）またはＴｉｍ－３^＋Ｔ細胞（図６Ｈ）のパーセンテージを示す（左のバーは非形質導入Ｔ細胞による処置を表し、右のバーはＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞による処置を表す）。Ｐ値は図６Ａ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、および６Ｈにおいて示す（ｎ＝５）。図６Ａ～６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、血液、脾、骨髄、および肝において白血病負荷を低減することを示す図である。図６Ｉは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲＴ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞の注射後３０日で骨髄中の白血病細胞を効果的に排除することを示す。ＮＳＧマウスにＯＣＩ－ＡＭＬ３を移植し、４日後にＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞、非形質導入Ｔ細胞、またはＰＢＳを注射した（マウスは図５Ｆに示す）。Ｔ細胞の注射の３０日後に生存しているマウスの骨髄から細胞を収集した。細胞をマウスＣＤ４５ならびにヒトＣＤ４５、ＣＤ８、およびＣＤ３３について染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。全細胞のＦＳＣとＤＡＰＩによる染色プロファイル（左）、生（ＤＡＰＩ^－）細胞についてゲーティングしたｈＣＤ４５とｍＣＤ４５による染色プロファイル（中）、およびｈＣＤ４５^＋細胞のｈＣＤ３３とｈＣＤ８による染色プロファイル（右）を示す。数字は、ゲーティングした領域内の細胞のパーセンテージを示す。図６I（続き）である。図６I（続き）である。図６I（続き）である。図７Ａ～７Ｇは、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて初代ヒトＡＭＬ芽細胞を効果的に殺滅するが、正常なヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対して細胞傷害性を呈さないことを示す。図７Ａは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎｖｉｔｒｏにおいて３名のドナーからのＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋初代ＡＭＬ芽細胞を殺滅することを示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞をＡＭＬ芽細胞とともに表示した比で２４時間、インキュベートした。ＡＭＬ芽細胞の絶対数は、ＣＤ８およびＣＤ３３について染色し、続いてプレシジョンカウントビーズを用いるフローサイトメトリーによって定量化した。異なるＥ：Ｔ比における腫瘍細胞の特異的溶解のパーセンテージを計算した。ｎ＝３の生物学的反復。グラフのバーおよびエラーバーは平均±ｓ．ｅ．を表す。ｐ値を示す。図７Ａ～７Ｇは、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて初代ヒトＡＭＬ芽細胞を効果的に殺滅するが、正常なヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対して細胞傷害性を呈さないことを示す。図７Ｂは、ＨＳＰＣによるＨＬＡ－Ａ２発現のフローサイトメトリー解析を示す。ＥａｓｙＳｅｐＨｕｍａｎＣＤ３４ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＫｉｔを使用して、２名のドナー胎児肝からヒトＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを精製した。濃いヒストグラム：抗ＨＬＡ－Ａ２で染色、および薄いヒストグラム：アイソタイプ対照抗体で染色。技術的三連測定からの代表的なデータを示す。図７Ｃは、ＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃ結合についてのＨＳＰＣのフローサイトメトリー解析を示す。濃い陰影のヒストグラム：ＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび抗ＨＡで染色、薄い陰影のヒストグラム：ＢＳＡおよび続いて抗ＨＡで染色。技術的三連測定による３回の個別の実験の代表的なデータを示す。図７Ａ～７Ｇは、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて初代ヒトＡＭＬ芽細胞を効果的に殺滅するが、正常なヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対して細胞傷害性を呈さないことを示す。図７Ｄは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを殺滅しないことを示す。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞をＨＳＰＣと表示したＥ：Ｔ比で２４時間、インキュベートした。細胞混合物をＣＤ８およびＣＤ３４について染色し、プレシジョンカウントビーズを用いるフローサイトメトリーによって定量化した。異なるＥ：Ｔ比におけるＣＤ８（Ｔ細胞）とＣＤ３４（ＨＳＰＣ）の染色プロファイルの例を示す。ゲーティングした領域内の細胞のパーセンテージを示す。図７Ａ～７Ｇは、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて初代ヒトＡＭＬ芽細胞を効果的に殺滅するが、正常なヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対して細胞傷害性を呈さないことを示す。図７Ｅは、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞との間の異なるＥ：Ｔ比における特異的細胞溶解の比較を示す。ｐ値は、同じＥ：Ｔ比におけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞と非形質導入Ｔ細胞との間の比較を示す。ｎ＝３の生物学的反復。データ点およびエラーバーは平均±ｓ．ｅ．を表す。図７Ａ～７Ｇは、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて初代ヒトＡＭＬ芽細胞を効果的に殺滅するが、正常なヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対して細胞傷害性を呈さないことを示す。図７Ｆは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞による処置が初代ＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋ＡＭＬ異種移植における白血病負荷を低減することを示す。ＮＳＧＳマウスにヒトＡＭＬ芽細胞を移植した。２週後にＡＭＬ芽細胞が血液中に検出可能になったとき、マウスにＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を投与した。Ｔ細胞の移入後の表示した日にマウスから採血し、単核細胞をｍＣＤ４５、ｈＣＤ４５、およびｈＣＤ８について染色した。ｈＣＤ８^－の生細胞についてゲーティングしたｈＣＤ４５とｍＣＤ４５の代表的な染色プロファイルを示す。ＡＭＬ芽細胞はｈＣＤ４５^＋ｈＣＤ８^－であった。数字はゲーティングした領域内の細胞のパーセンテージを示す。図７Ａ～７Ｇは、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）が、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて初代ヒトＡＭＬ芽細胞を効果的に殺滅するが、正常なヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対して細胞傷害性を呈さないことを示す。図７Ｇは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスと非形質導入Ｔ細胞を投与したマウスとの間の末梢血中のｈＣＤ４５^＋ＣＤ８^－ＡＭＬ芽細胞のパーセンテージの比較を示し、ＡＭＬ芽細胞のレベルは、Ｔ細胞の注射の前（０日目）、ならびにＴ細胞注射後９日目および１８日目に測定した。左のバーは非形質導入Ｔ細胞による処置を表し、右のバーはＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞による処置を表す。グラフのバーおよびエラーバーは平均±ｓ．ｅ．を表す。ｐ値（両側独立試料ｔ検定）を示す（ｎ＝５）。

本開示は、少なくとも一部には、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープに、特異的に、かつ高い親和性で結合する単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）の同定に基づく。本開示は、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したそのようなＮＰＭ１ｃネオエピトープに結合する新規ｓｃＦｖ、抗体およびその抗原結合断片を提供する。加えて、本開示は、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したそのようなＮＰＭ１ｃネオエピトープに特異的に結合し、別の標的にもさらに結合する、本開示のｓｃＦｖに基づく二重特異性結合分子を提供する。

さらに、本開示は、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを提供する。

さらに、本開示は、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞を提供する。本明細書に記載され、本明細書に提示される実施例に示されているように、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでＡＭＬ細胞を特異的に殺滅し、ＡＭＬマウスモデルにおいてｉｎｖｉｖｏで白血病の量を減少させ、生存期間を延長させる。

したがって、抗体およびその抗原結合断片、二重特異性分子、ＣＡＲポリペプチド、ならびに本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＮＰＭ１ｃ変異を保有するがんを治療するための標的化免疫療法のために有用である。例えば、本明細書に開示される、抗体およびその抗原結合断片、ＣＡＲポリペプチド、ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するための標的化免疫療法のために有用である。一態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に、そのようなエピトープがクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）場合に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一態様では、以下のアミノ酸配列：ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）を有するネオエピトープのうちの１つまたは複数に、そのようなエピトープがクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した場合に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質単独には結合しないか、または実質的に結合しない、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド（例えば、対照ペプチドは、ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープ（例えば、配列番号６２を含むペプチド）またはインフルエンザウイルスＭ１エピトープ（例えば、配列番号６３を含むペプチド）である）には結合しないか、または実質的に結合しない抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独（ＭＨＣクラスＩタンパク質を伴わない）には結合しないか、または実質的に結合しない抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）である。一部の態様では、抗原はがん細胞の表面にある（例えば、がんがＮＰＭ１ｃ＋である場合、例えば、がんがＡＭＬである場合）。一態様では、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。本明細書に提供される抗体およびその抗原結合断片について、以下に記載する。

一態様では、（ｉ）クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する第１の結合ドメイン、および（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性分子が、本明細書において提供される。一部の態様では、第２の抗原は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞上に発現される抗原である。一部の態様では、第２の抗原は、ＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）、ＮＫｐ４６（例えば、ヒトＮＫｐ４６）、またはＣＤ１６Ａ（例えば、ヒトＣＤ１６Ａ）である。一態様では、（ｉ）ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性分子が、本明細書において提供される。本明細書に提供される二重特異性分子について、以下に記載する。

一態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片（および任意選択で、薬学的に許容される担体）を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。一態様では、本明細書に記載される二重特異性分子（および任意選択で、薬学的に許容される担体）を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。本明細書に提供される医薬組成物については、以下に記載する。

一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、細胞外ドメインが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、ＣＡＲポリペプチドが本明細書において提供される。一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、細胞外ドメインが、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列に特異的に結合する、ＣＡＲポリペプチドが本明細書において提供される。一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片を含む、ＣＡＲポリペプチドが本明細書において提供される。一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドであって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子を含む、ＣＡＲポリペプチドが本明細書において提供される。本明細書に提供されるＣＡＲポリペプチドについては、以下に記載する。

一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞であって、細胞外ドメインが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、免疫エフェクター細胞が本明細書において提供される。一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞であって、細胞外ドメインが、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列に特異的に結合する、免疫エフェクター細胞が本明細書において提供される。一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞であって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫エフェクター細胞が本明細書において提供される。一態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞であって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子を含む、免疫エフェクター細胞が本明細書において提供される。一態様では、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞が、本明細書において提供される。一態様では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージである。一態様では、ＣＡＲポリペプチドの発現は、免疫エフェクター細胞を、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）を表面に提示しているがん細胞（例えば、がんはＡＭＬである）に標的化させる。一態様では、ＣＡＲポリペプチドの発現は、免疫エフェクター細胞を、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を表面に提示しているがん細胞（例えば、がんはＡＭＬである）に標的化させる。本明細書に提供される免疫エフェクター細胞については、以下に記載する。

一態様では、本明細書に記載されるいずれかの免疫エフェクター細胞（および任意選択で、薬学的に許容される担体）を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。

一態様では、対象（例えば、ヒト）においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し、本明細書に記載されるいずれかの抗体または抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、対象（例えば、ヒト）においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、対象（例えば、ヒト）においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を提示し、本明細書に記載されるいずれかの抗体または抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、対象（例えば、ヒト）においてがんを治療する方法であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を提示し、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。

一部の態様では、対象（例えば、ヒト）においてＮＰＭ１ｃ陽性がんを治療する方法であって、本明細書に記載されるいずれかの抗体または抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一部の態様では、対象（例えば、ヒト）においてＮＰＭ１ｃ陽性がんを治療する方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。

一態様では、対象（例えば、ヒト）においてＡＭＬを治療する方法であって、本明細書に記載されるいずれかの抗体または抗原結合断片を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、対象（例えば、ヒト）においてＡＭＬを治療する方法であって、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。

本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片、本明細書に提供されるＣＡＲポリペプチド、本明細書に提供されるＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞、および本明細書に提供されるそれを含む医薬組成物を使用する治療の方法、それらの使用、ならびにそれらを含むキットについては、以下に記載する。

本開示はまた、少なくとも一部には、ＭＨＣタンパク質（特に、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したネオエピトープ（特に、がんネオエピトープ）に特異的に結合するｓｃＦｖの同定に基づく。そのような特異的で親和性の高い抗体が単離されたことは、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片の開発には多くの課題が伴うことから驚くべきことであった。特に、ネオエピトープペプチドはＭＨＣタンパク質から容易に解離し、そのことがこの複合体に対して特異的な抗体を産生させることを困難にする。いかなる理論にも拘束されないが、酵母表面ディスプレイ法を使用した、ＭＨＣタンパク質単独または対照ペプチドと複合体を形成したＭＨＣタンパク質に結合することなくネオエピトープ－ＭＨＣ複合体には特異的に結合する酵母集団の複数回の陽性選択および陰性選択の使用により、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に特異的に結合するｓｃＦｖの同定がもたらされることが発見された。選択のステップは、実施例１および付属書類１に記載されている。いかなる理論にも拘束されないが、二量体ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体を抗原として使用したことも、高親和性の特異的ｓｃＦｖの単離の成功に寄与した可能性がある。

したがって、一態様では、ＭＨＣ（例えば、ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ネオエピトープ（例えば、がんネオエピトープ）を含む抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。この態様のある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、酵母表面ディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーまたはファージディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーを使用して生成され、任意選択で、複数回（２回、３回、４回またはより多くの回数）の陽性選択（抗原に結合する酵母またはファージの集団を選択する）および複数回（２回、３回、４回またはより多くの回数）の陰性選択（例えば、ＭＨＣタンパク質単独および／または対照ペプチド（すなわち、ネオエピトープとは異なるペプチド）と複合体を形成したＭＨＣタンパク質に結合する酵母またはファージの集団を選択して除去する）を使用して、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に対する特異的結合剤について濃縮される。この態様の特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、酵母表面ディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーまたはファージディスプレイ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーを使用して生成され、任意選択で、複数回（少なくとも３回、少なくとも４回または少なくとも５回）の陽性選択（抗原に結合する酵母またはファージの集団を選択する）および複数回（少なくとも２回、少なくとも３回、または少なくとも４回）の陰性選択（例えば、ＭＨＣタンパク質単独および／または対照ペプチドと複合体を形成したＭＨＣタンパク質に結合する酵母またはファージの集団を選択して除去する（例えば、ＭＨＣタンパク質単独に結合する酵母またはファージの集団を少なくとも２回、選択して除去する、および対照ペプチドと複合体を形成したＭＨＣタンパク質に結合する酵母またはファージの集団を少なくとも２回、選択して除去する））を使用して、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に対する特異的結合剤について濃縮される。ある特定の実施形態では、細胞集団は、選択ステップの後に（例えば、１回または複数回の陽性選択ステップの後に、１回または複数回の陰性選択ステップの後に、または各選択ステップの後に）増大される。この態様のある特定の実施形態では、抗原は、二量体ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体（特に、例えば、ＩｇＧＦｃ、例えば、マウスまたはヒトＩｇＧ１を介して連結された２つのネオエピトープ：ＭＨＣ分子を有する）である。ある特定の実施形態では、酵母ディスプレイ法およびライブラリーが使用される。ある特定の実施形態では、陽性選択は、両方の抗原（ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体）および抗体（例えば、ｓｃＦｖ）について染色される酵母またはファージの集団の選択（例えば、少なくとも１回または少なくとも２回の選択）を含む。ある特定の実施形態では、酵母またはファージの集団は、標識された抗原および抗体／断片（例えば、ｓｃＦｖ）分子を使用する磁気ソーティング（ＭＡＣＳ）および／またはフローサイトメトリーソーティングによって選択される。例えば、抗原は、ビオチンを抗原に共有結合性に結び付けることによってビオチン化され（これはフルオロフォアにコンジュゲートされた二次薬剤、例えば、ストレプトアビジンによって検出可能である）、および／またはＩｇＧ分子（これはＩｇＧに特異的な標識抗体によって検出される）に結合され、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）はエピトープタグ（例えば、赤血球凝集素またはｃ－Ｍｙｃ）（これはエピトープタグに対する蛍光標識抗体によって検出される）に結合される。一実施形態では、以下の選択ステップのうちの少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つを使用して、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生成させる：（ｉ）標識されたネオエピトープ：ＭＨＣ複合体に結合する抗体保有クローン／細胞の陽性選択（例えば、標識されたネオエピトープ－ＭＨＣ複合体を介して選択することによる）、（ｉｉ）対照ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合する抗体保有クローン／細胞の陰性選択（選択除去）（例えば、標識された対照ペプチド－ＭＨＣ複合体による結合を受けない抗体保有クローン／細胞を選択することによる）、（ｉｉｉ）ネオエピトープ－ＭＨＣに結合する抗体保有クローンの陽性選択（例えば、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）およびネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に関して二重陽性染色される抗体保有クローン／細胞を選択することによる）、（ｉｖ）標識されたネオエピトープ：ＭＨＣ複合体に結合する抗体保有クローン／細胞の陽性選択（例えば、標識されたネオエピトープ－ＭＨＣ複合体によって染色され、任意選択で、抗体に関して染色される抗体保有クローン／細胞を選択することによる）、（ｖ）対照ペプチド－ＭＨＣ複合体またはＭＨＣ複合体単独に結合する抗体保有クローン／細胞の陰性選択（選択除去）（例えば、標識された対照ペプチド－ＭＨＣ複合体または標識されたＭＨＣタンパク質による結合を受けない抗体保有クローン／細胞を選択することによる）、（ｖｉ）ネオエピトープ－ＭＨＣに結合する抗体保有クローンの陽性選択（例えば、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に関して染色される抗体保有クローン／細胞を選択することによるか、または抗体（例えば、ｓｃＦｖ）発現およびネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に関して二重陽性染色される抗体保有クローン／細胞を選択することによる）、（ｖｉｉ）ＭＨＣ複合体単独に結合する抗体保有クローン／細胞の陰性選択（選択除去）（例えば、標識されたＭＨＣタンパク質による結合を受けない抗体保有クローン／細胞を選択することによる）、（ｖｉｉｉ）ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に結合する抗体保有クローン／細胞の陽性選択（例えば、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）およびネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に関して二重陽性染色される抗体保有クローン／細胞を選択することによる）、（ｉｘ）ＭＨＣ複合体単独に結合する抗体保有クローン／細胞の陰性選択（選択除去）（例えば、標識されたＭＨＣタンパク質による結合を受けていない抗体保有クローン／細胞を選択することによる）。一部の実施形態では、前の文に列挙されているうちの少なくとも５つ、６つ、７つ、８つまたは９つのステップが、少なくとも２つの陽性選択ステップおよび少なくとも２つの陰性選択ステップを含む、特異的抗体または断片の選択プロセスにおいて使用される。一部の実施形態では、少なくとも６つ、７つ、８つまたは９つのステップが、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体に関する少なくとも２つの（好ましくは少なくとも３つの）陽性選択ステップ、対照ペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するクローン／細胞を選択除去するための少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２つの）陰性選択ステップ、およびＭＨＣタンパク質単独に結合するクローン／細胞を選択除去するための少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２つの）陰性選択ステップを含む、特異的抗体または断片の選択プロセスにおいて使用される。この態様の特定の実施形態では、ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）である。この態様の特定の実施形態では、ネオエピトープは、ＮＰＭ１ｃネオエピトープである。特定の一実施形態では、ネオエピトープ：ＭＨＣ複合体は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）である。この態様の一部の実施形態では、ネオエピトープは、本開示において参照されるいずれかのＮＰＭ１ｃエピトープ（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するエピトープ）である。特定の一実施形態では、ネオエピトープ：ＭＨＣ複合体は、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ：ＨＬＡ－Ａ２である。一部の実施形態では、ネオエピトープ：ＭＨＣ複合体に対して特異的な抗体または抗原結合断片が、以下の付属書類１に記載されるいずれかの４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはすべての選択ステップを使用して得られる。一部の実施形態では、酵母表面ディスプレイまたはファージ表面ディスプレイ法およびライブラリーの代わりに、細菌ディスプレイ、真核生物ウイルスディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、または無細胞（例えば、リボソームディスプレイ）抗体スクリーニング技術が使用される。酵母表面ディスプレイ法およびライブラリーは、当技術分野で公知である（例えば、Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768を参照）。ファージディスプレイ方法およびライブラリーは、当技術分野で公知である。Merz et al. (1995) J Neurosci Methods 62(1-2):213-9; Di Niro et al. (2005) Biochem J 388(Pt 3):889-894; and Engberg et al. (1995) Methods Mol Biol 51:355-376.

抗体
一態様では、ＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ネオエピトープ（例えば、がんネオエピトープ）を含む抗原に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法のうちの１つによって（例えば、酵母表面ディスプレイ法、ファージディスプレイ法などによって特異的結合剤を同定するために複数回の選択ステップを使用して；任意選択で、二量体ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体を抗原として使用して；例えば、ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体または二量体ネオエピトープ－ＭＨＣ複合体を抗体産生を誘発するための抗原として用いる免疫処置を対象に行うことを介して）得られるＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ネオエピトープ（例えば、がんネオエピトープ）を含む抗原に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法のうちの１つによって得られる、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）がんネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＭＨＣタンパク質単独には結合しないか、または実質的に結合しない、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一態様では、ＭＨＣタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合しない、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一態様では、ネオエピトープ単独（ＭＨＣタンパク質を伴わない）には結合しないか、または実質的に結合しない、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

機能的ＭＨＣクラスＩ分子は、α重鎖およびβ２－ミクログロブリン鎖を含む。ＭＨＣクラスＩ分子によるペプチド結合は、ペプチドアミノ酸側鎖と、重鎖のα１およびα２ドメインによって形成されるＭＨＣ分子のペプチド結合グルーブ内部の分散したポケットとの相互作用によって達成される。典型的には、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の場合、主な結合エネルギーは、ペプチドの位置２およびＣ末端の残基とＭＨＣ分子のそれぞれＢおよびＦ結合ポケットとの相互作用に由来するが、ペプチド全域にわたる側鎖がＭＨＣの結合能力を向上させるかまたは減じさせることができる（例えば、Guo, et al (1992) Nature 360:364; Silver et al (1992) Nature 360:367; Gorga et al (1992) Proteins 12;87; Madden (1995) Annu Rev Immunol 13:587; Madden et al (1993) Cell 75;693; Madden et al (1992) Cell 70:1035; Bjorkman, et al (1987) Nature 329:512; Saper et al (1991) J Mol Biol 219:277を参照）。９アミノ酸残基のペプチドの場合、Ｃ末端残基（位置９）は、ＭＨＣ分子のＦ結合ポケットと相互作用する。

ＭＨＣ分子は極めて多型性であり、数千ものアレル変異体がクラスＩＡおよびＢ座位で同定されている。多型のほとんどはペプチド結合ポケットに存在し、その結果、ＭＨＣ分子は多岐にわたるペプチド結合特異性を有する。この多型性にもかかわらず、当技術分野では、ＨＬＡクラスＩ分子を、共通のペプチド結合特異性に基づいて、複数のグループ（すなわち、スーパータイプ）にまとめることができることが公知である。各グループ（スーパータイプ）は、「アンカー残基」またはＭＨＣ結合のために重要な残基であるペプチドの位置を反映するペプチドコンセンサス配列によって定義される。例えば、Ａ２－スーパータイプのＨＬＡクラスＩ分子（すなわち、ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質）は、ペプチドの位置２に小型の脂肪族残基（例えば、アラニン、チロシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン）、ならびにＣ末端に脂肪族残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン）または小型の疎水性残基（例えば、アラニン、バリン）を有するペプチドに対して、共通の特異的結合を有する（例えば、Sidney, et al (2008) BMC Immunology 9:1を参照）。

ある特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）関連変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

ＡＭＬのゲノム解析により、ＡＭＬは他のほとんどの成人がんよりも変異負荷が少なく、ＡＭＬ患者あたりのコーディング変異は平均１３個であることが示されている（Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Alexandrov et al., NATURE 500: 415 (2013); Kandoth et al., NATURE 502 333 (2013)を参照）。しかし、ＡＭＬにおける体細胞変異は、しばしば同一の遺伝子に存在し（Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016)を参照）、このため、これらのホットスポット変異に由来するネオ抗原は、腫瘍特異的免疫療法の魅力的な標的となっている（van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019)を参照）。最もよく見られる変異の１つに、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１；ＮＰＭ１によってコードされる）をコードする重要なドライバー遺伝子における４ヌクレオチド重複があり、これは成人ＡＭＬ患者全体の３０～３５％に存在する（Ley et al., N Engl J Med 368: 2059 (2013); Papaemmanuil et al., N Engl J Med 374: 2209 (2016); Falini et al., N Engl J Med 352: 254 (2005)を参照）。ＮＰＭ１におけるそのような変異はその異常な細胞質局在をもたらし、この変異型タンパク質はＮＰＭ１ｃと称される。ＡＭＬに関連するＮＰＭ１ｃ変異型タンパク質は、ＨＬＡクラスＩ拘束性であって、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルおよび他のいくつかのアレルを有する患者の白血病性芽球上に提示される白血病性ネオ抗原を生成する。例えば、ＮＰＭ１ｃは、最も一般的なＨＬＡ－Ａ＊０２０１アレル（ヒト集団の約５０％）によって提示される白血病特異的ネオ抗原エピトープ（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱと略記）を生じる（Greiner et al., BLOOD 120: 1282 (2012)を参照）。

一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドにとって妥当である任意の長さである。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは、５～２０アミノ酸、６～１９アミノ酸、７～１８アミノ酸、８～１７アミノ酸、８～１６アミノ酸、８～１５アミノ酸、８～１５アミノ酸、８～１４アミノ酸、８～１３アミノ酸、８～１２アミノ酸、９～１２アミノ酸、または９～１１アミノ酸である。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸である。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは１２アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは１１アミノ酸である。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは１０アミノ酸である。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは９アミノ酸である。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープの長さは８アミノ酸である。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、１０、１５、２０、３０、４０、５０、または１００アミノ酸残基長のポリペプチドの内部の、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５個の連続したアミノ酸のペプチドである。

一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＨＬＡ－Ａ２であるＭＨＣクラスＩタンパク質に結合する。一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ２に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列の位置２が小型の脂肪族残基（例えば、アラニン、チロシン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン）であって、アミノ酸配列のＣ末端残基が脂肪族残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン）または小型の疎水性残基（例えば、アラニン、バリン）である、アミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ２に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列の位置２がバリン、イソロイシンまたはロイシンであって、アミノ酸配列のＣ末端残基がバリン、ロイシン、またはイソロイシンである、アミノ酸配列を含む。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが８アミノ酸残基長である、一部の態様では、Ｃ末端アミノ酸は位置８である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが９アミノ酸残基長である、一部の態様では、Ｃ末端アミノ酸は位置９である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが１０アミノ酸残基長である、一部の態様では、Ｃ末端アミノ酸は位置１０である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが１１アミノ酸残基長である、一部の態様では、Ｃ末端アミノ酸は位置１１である。ＮＰＭ１ｃネオエピトープが１２アミノ酸残基長である、一部の態様では、Ｃ末端アミノ酸は位置１２である。

ＨＬＡ－Ａ２に結合する、ＮＰＭ１ｃに由来するネオエピトープは、当技術分野で公知である。例えば、Greiner (2012) Blood 120:1282は、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）およびＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）を含む、ＨＬＡ－Ａ２に結合する９ｍｅｒのＮＰＭ１ｃネオエピトープのアミノ酸配列を同定している。さらなる一例として、van der Lee (2019) J Clin Invest 129:774は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）を含む、ＨＬＡ－Ａ２クラスＩ分子に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープのアミノ酸配列、さらには、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）を含む、他のＨＬＡハプロタイプによってコードされるＭＨＣクラスＩ分子に結合するＮＰＭ１ｃネオエピトープのアミノ酸配列を同定している。

一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質のネオエピトープを含む抗原に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体およびその抗原結合断片であって、ヌクレオフォスミンタンパク質における変異が、ヌクレオフォスミンをコードする遺伝子における４ヌクレオチド重複に起因する、抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）細胞質性（細胞質中に位置する）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、ネオエピトープは、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質のＣ末端の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質は、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質は、野生型ヌクレオフォスミンのアミノ酸配列（例えば、配列番号５４）に比して１つまたは複数の変異（例えば、挿入、欠失、置換）を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号５６のアミノ酸配列を含むタンパク質に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、野生型ヌクレオフォスミンのアミノ酸配列（例えば、配列番号５４）に比して１つまたは複数の変異（例えば、挿入、欠失、置換）を有するアミノ酸配列を含むタンパク質に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、野生型ヌクレオフォスミンのアミノ酸配列（例えば、配列番号５４）に比して１つまたは複数の変異（例えば、挿入、欠失、置換）を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドであって、１つまたは複数の変異は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基長のタンパク質の領域内にあり、ネオエピトープは、１つまたは複数の変異を含むタンパク質の領域に由来する。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端の１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープは、野生型ヌクレオフォスミンのアミノ酸配列（例えば、配列番号５４）に比して１つまたは複数の変異（例えば、挿入、欠失、置換）を有するアミノ酸配列を有するタンパク質に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドであって、１つまたは複数の変異は、Ｃ末端の近位（例えば、Ｃ末端から約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基）にあるタンパク質の領域内にあり、ネオエピトープは、１つまたは複数の変異を含むタンパク質の領域に由来する。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）配列番号５６のアミノ酸配列を含むタンパク質のネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、が本明細書において提供される。

一部の態様では、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質は、Ｃ末端アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含む。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）Ｃ末端アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むＮＰＭ１ｃタンパク質のネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ネオエピトープは、ＮＰＭ１ｃタンパク質のＣ末端アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）に由来する８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチドである。一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質（すなわち、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃはヒトＮＰＭ１ｃである。

一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）細胞質性変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体またはその抗原結合断片であって、ネオエピトープのアミノ酸配列が、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）またはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）を含む、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む抗原に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む抗原に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＭＨＣクラスＩタンパク質単独および／またはＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド（例えば、対照ペプチドは、ネオエピトープと同じ数のアミノ酸を有するが、ネオエピトープの由来となったタンパク質とは異なるタンパク質に由来する）には結合しないか、または実質的に結合しない。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、細胞質性変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープ単独（ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２を伴わない）には結合しないか、または実質的に結合しない。

一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）である。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）である。

一部の態様では、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されている、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗原およびその抗原結合断片であって、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶのうちのいずれか１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸は置換されている、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。一部の態様では、アミノ酸置換は、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ配列（配列番号１）における既存の残基と類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。一部の態様では、アミノ酸置換は、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合断片の抗原への結合に影響しない（または実質的に影響しない）。

一部の態様では、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちの１つ、２つ、またはより多くのアンカー残基が置換されている（例えば、配列番号１の位置２および／または位置９、例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の下線が付された残基）、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、アミノ酸置換は、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合断片の抗原への結合、またはクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）へのネオエピトープの結合に影響しない（または実質的に影響しない）。一部の態様では、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の第２位にあるアミノ酸残基Ｉは、アミノ酸残基Ｌ（ロイシン）で置換されている。一部の実施形態では、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の第２位にあるアミノ酸残基Ｉは、アミノ酸残基Ｖ（バリン）、Ｍ（メチオニン）、チロシン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）またはＡ（アラニン）で置換されている。一部の実施形態では、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）の第９位にあるアミノ酸残基Ｖは、アミノ酸残基Ｉ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｍ（メチオニン）、またはＡ（アラニン）で置換されている。

一部の態様では、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶを含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、置換は保存的アミノ酸置換である、抗体またはその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した、表１に特定されているアミノ酸配列を含むネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に特異的に結合する抗体または抗原結合断片であって、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸が置換されており、抗体または抗原結合断片が、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に対して同じまたは実質的に同じ結合親和性を有する、抗体または抗原結合断片を提供する。一部の態様では、本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、抗体およびその抗原結合断片は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に対して、同じまたはより良好な親和性で特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合断片は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、抗体または抗原結合断片は、０．１～１００ｎＭ（例えば、０．１～５０ｎＭ、０．１～２５ｎＭ、１０．１～１５ｎＭ）のＫ_Ｄを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合断片は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したアミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）に結合し、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸は置換されており、抗体およびその抗原結合断片は、１００ｎＭ未満（例えば、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満）のＫ_Ｄで結合する。

一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ２（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）によって提示されるＮＰＭ１ｃエピトープに結合し、抗がん効果または抗腫瘍効果（例えば、ｉｎｖｉｖｏの抗がん効果、任意選択で、がんはＡＭＬである）を有する抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本開示は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一部の態様では、ネオエピトープは、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループを含むＨＬＡ－Ａアレルによってコードされる。一部の態様では、ＨＬＡ－ＡアレルはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。

一部の態様では、本明細書に記載される重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有する（例えば、ＹＧ１ｓｃＦＶの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の配列を有する、例えば、配列の項および実施例を参照）抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、本明細書に記載される１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する（例えば、ＹＧ１ｓｃＦｖのＣＤＲを有する。例えば、配列の項および実施例を参照）抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体、またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するｓｃＦｖの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。一部の態様では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するｓｃＦｖが、本明細書において提供される。一部の態様では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するｓｃＦｖであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列との同一性の違いの少なくとも９５％が、ｓｃＦｖのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）ｓｃＦｖが、本明細書において提供される。

一部の態様では、アミノ酸配列配列番号５（ＹＧ１ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列）を有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、配列番号５に示されるアミノ酸配列（ＹＧ１ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨであって、配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも９５％が、ＶＨのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）ＶＨが、本明細書において提供される。

一部の態様では、アミノ酸配列配列番号３（ＹＧ１ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列）を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＹＧ１ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬであって、配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも９５％またはすべてが、ＶＬのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）ＶＬが、本明細書において提供される。

一部の態様では、アミノ酸配列配列番号５（ＹＧ１ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列）を有するＶＨ、およびアミノ酸配列配列番号３（ＹＧ１ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列）を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、配列番号５に示されるアミノ酸配列（ＹＧ１ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨ、および配列番号３に示されるアミノ酸配列（ＹＧ１ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、それぞれ配列番号５および配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨおよびＶＬであって、配列番号５および配列番号３に示されるアミノ酸配列との同一性における違いの少なくとも９５％またはすべてが、ＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域にある（または相補性決定領域（ＣＤＲ）にはない）ＶＨおよびＶＬが、本明細書において提供される。

本開示の抗体または抗原結合断片のＣＤＲは、当技術分野において、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、およびＩＭＧＴを含む様々な方法で定義されている。

一部の態様では、本開示の抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムに従って定義され、これは配列可変性に基づく（例えば、Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391; Kabat EA et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照。ＫａｂａｔＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、本明細書に記載される抗体およびその断片のＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して決定される。一部の態様では、Ｋａｂａｔシステムを使用して決定される、ＹＧ１ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本開示の抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムに従って定義され、これは免疫グロブリン構造ループ領域の位置に基づく（例えば、Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273 : 927-948; Chothia C et al, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82；および米国特許第７，７０９，２２６号明細書を参照）。「ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ」という用語および同様の用語は、当技術分野で認識されており、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196:901-917の方法に従って決定される抗体ＣＤＲ配列を指し、これを本明細書では「ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ」と称する（例えば、米国特許第７，７０９，２２６号明細書およびMartin, A., "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001)を参照）。ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一部の態様では、本明細書に記載される抗体およびその断片のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムを使用して決定される。一部の態様では、Ｃｈｏｔｈｉａシステムを使用して決定される、ＹＧ１ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本開示の抗体のＣＤＲは、ＡｂＭシステムに従って定義され、これはＫａｂａｔＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの折衷案に相当するＡｂＭ超可変領域に基づいており、ＣＤＲはＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を使用して決定される。ＡｂＭＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、本明細書に記載される抗体およびその断片のＣＤＲは、ＡｂＭシステムを使用して決定される。一部の態様では、ＡｂＭシステムを使用して決定される、ＹＧ１ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本開示の抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムに従って定義される（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のウェブサイトimgt.org, founder and director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Franceを参照；例えば、Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136およびLefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照。これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＩＭＧＴＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、本明細書に記載される抗体のおよびその断片ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムを使用して決定される。一部の態様では、ＩＭＧＴシステムを使用して決定される、ＹＧ１ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本開示の抗体のＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔシステムに従って定義される。Ｃｏｎｔａｃｔの定義は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく（bioinf.org.uk/abs）（MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 5: 732-745を参照；例えば、Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer- Verlag, Berlin (2001)も参照のこと）。ＣｏｎｔａｃｔＣＤＲの位置は、当技術分野で公知の方法に従って決定される。一態様では、本明細書に記載される抗体およびその断片のＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔシステムを使用して決定される。一部の態様では、Ｃｏｎｔａｃｔシステムを使用して決定される、ＹＧ１ｓｃＦｖの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＮＰＭ１ｃエピトープに特異的に結合し、上記のシステムのいずれかに従って定義される、ＹＧ１ｓｃＦｖの１つ、２つ、もしくは３つのＶＨＣＤＲおよび／または１つ、２つ、もしくは３つのＶＬＣＤＲを含む抗体またはその断片が、本明細書において提供される。例えば、一実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＮＰＭ１ｃエピトープに特異的に結合し、ＩＭＧＴによって定義される、ＹＧ１ｓｃＦｖの１つ、２つ、もしくは３つすべてのＶＨＣＤＲおよび／または１つ、２つ、もしくは３つすべてのＶＬＣＤＲを含む抗体またはその断片が、本明細書において提供される。

当技術分野で公知であるように、ＶＨおよびＶＬは、フレームワーク領域によって囲まれたＣＤＲを含有する（ＣＤＲおよびＦＲ配列は、ＶＨおよびＶＬにおいて以下の順序で出現する：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４）。任意選択で、フレームワーク領域はヒトフレームワーク領域である。

ある特定の態様では、アミノ酸配列配列番号５（ＹＧ１ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列）を有するＶＨの１つ、２つまたは３つすべてのＶＨＣＤＲを有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＩＭＧＴによって定義される、アミノ酸配列配列番号５を有する重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＨＣＤＲを有するＶＨを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、アミノ酸配列配列番号３（ＹＧ１ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列）を有するＶＬの１つ、２つまたは３つすべてのＶＬＣＤＲを有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ＩＭＧＴによって定義される、アミノ酸配列配列番号３（ＹＧ１ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列）を有するＶＬの１つ、２つまたは３つすべてのＶＬＣＤＲを有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、アミノ酸配列配列番号５（ＹＧ１ｓｃＦｖの重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列）を有するＶＨの１つ、２つまたは３つすべてのＶＨＣＤＲを有するＶＨ、およびアミノ酸配列配列番号３（ＹＧ１ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列）を有するＶＬの１つ、２つまたは３つすべてのＶＬＣＤＲを有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、アミノ酸配列配列番号９のＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨＣＤＲ２、および／またはアミノ酸配列配列番号１１のＶＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、アミノ酸配列配列番号９のＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号１１のＶＨＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片であって、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸が置換されている抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片の抗原への結合に影響せず（または実質的に影響せず）、または改善もしない。

一部の態様では、アミノ酸配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬＣＤＲ２、および／またはアミノ酸配列配列番号８のＶＬＣＤＲ３を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、アミノ酸配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬＣＤＲ２、および／またはアミノ酸配列配列番号８のＶＬＣＤＲ３を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片であって、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸が置換されている、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、類似のサイズのアミノ酸残基による置換である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合断片の抗原への結合に影響を及ぼさない（または実質的に影響を及ぼさない）か、または改善する。

一部の態様では、アミノ酸配列配列番号９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号１１のＶＨＣＤＲ３を有するＶＨ、ならびに／またはアミノ酸配列配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号８のＶＬＣＤＲ３を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列配列番号９の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号１０のＶＨＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号１１のＶＨＣＤＲ３を有するＶＨ、ならびにアミノ酸配列配列番号６の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、アミノ酸配列配列番号７のＶＬＣＤＲ２、およびアミノ酸配列配列番号８のＶＬＣＤＲ３を有するＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＶＨおよびＶＬを含む抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片であって、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸が置換されている、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体およびその抗原結合断片が、本明細書において提供される。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体または断片のＶＨおよび／またはＶＬ領域における１つまたは複数のＣＤＲは、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２への特異的結合が維持される限り、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸が異なってもよい。

一部の態様では、本明細書に提供される抗体または断片は、親和性成熟しており、すなわち、記載される抗体または断片と比較して、１つまたは複数の相補性決定領域において１つまたは複数の変更を有し、そのような１つまたは複数の変更は、記載される抗体または断片に比して、抗原に対する抗体または断片の親和性の改善をもたらす。一部の態様では、本明細書に提供される抗体または断片は、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１００ｎＭ未満（例えば、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満）のＫｄを有する。一部の態様では、本明細書に提供される抗体または断片は、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、７ｎＭ未満、５ｎＭ未満、または１ｎＭ未満（例えば、０．０１から１５ｎＭ、０．０１から１０ｎＭ、０．０１から７ｎＭ、０．０１から５ｎＭ、０．０１から１ｎＭ、０．１から１５ｎＭ、０．１から１０ｎＭ、０．１から７ｎＭ、０．１から５ｎＭ、０．１から１ｎＭ、１から１５ｎＭ、１から１０ｎＭ、１から７ｎＭ、１から５ｎＭ、５から１５ｎＭ、５から１０ｎＭ、または５から７ｎＭ）のＫｄを有する。

一部の態様では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、３つの軽鎖可変領域相補性決定領域（ＶＬＣＤＲ１～３）および３つの重鎖可変領域相補性決定領域（ＶＨＣＤＲ１～３）を含む。一部の態様では、ＶＨＣＤＲ１は、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＨＣＤＲ２は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＨＣＤＲ３は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、ＶＬＣＤＲ１は、配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＬＣＤＲ２は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＶＬＣＤＲ３は、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８１％の配列同一性、または少なくとも８２％の配列同一性、または少なくとも８３％の配列同一性、または少なくとも８４％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも８６％の配列同一性、または少なくとも８７％の配列同一性、または少なくとも８８％の配列同一性、または少なくとも８９％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９１％の配列同一性、または少なくとも９２％の配列同一性、または少なくとも９３％の配列同一性、または少なくとも９４％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９６％の配列同一性、または少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、単離された抗体または断片である。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、精製された抗体または断片である。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動またはキャピラリー電気泳動による）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）法による決定で、９５％を上回る、９７％を上回る、９８％を上回る、または９９％を上回る純度に精製される（例えば、Flatman, et al., J. Chromotogr. 848:79-87 (2007)を参照）。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する単離された抗体または断片である。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する精製された抗体または断片である。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、本明細書に記載されるいずれか１つである。一部の態様では、ＮＰ１Ｍ１ｃネオエピトープはＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）である。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ）に対して少なくとも１０^－７Ｍの結合親和性（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも１０^－７Ｍもしくはより強い、少なくとも１０^－８Ｍもしくはより強い、少なくとも１０^－９Ｍもしくはより強い、少なくとも５００ｎＭもしくはより強い、少なくとも２５０ｎＭもしくはより強い、少なくとも１００ｎＭもしくはより強い、少なくとも５０ｎＭもしくはより強い、少なくとも２５ｎＭもしくはより強い、少なくとも２０ｎＭもしくはより強い、少なくとも１５ｎＭもしくはより強い、または少なくとも１０ｎＭもしくはより強い結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも約２５ｎＭもしくはより強い、少なくとも約１５ｎＭもしくはより強い、または少なくとも約１０ｎＭもしくはより強い結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、０．１ｎＭと５００ｎＭ、０．１ｎＭと１００ｎＭ、０．５ｎＭと１００ｎＭ、０．１ｎＭと５０ｎＭ、０．５ｎＭと５０ｎＭ、０．１ｎＭと２５ｎＭ、０．５ｎＭと２５ｎＭ、０．１ｎＭと１５ｎＭ、０．５ｎＭと１５ｎＭ、０．１ｎＭと１０ｎＭ、もしくは０．５ｎＭと１０ｎＭの間（または前の値から後の値まで）、または１ｎＭから１００ｎＭ（またはその間の任意の値）の結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、約０．１ｎＭと約１００ｎＭの間（または前の値から後の値まで）または約０．５ｎＭから約１００ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）を有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、約０．１ｎＭと約５０ｎＭの間（または前の値から後の値まで）または約０．５ｎＭから約５０ｎＭの結合親和性（Ｋｄ）を有する。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも０．５±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１またはより高いＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも１±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１またはより高いＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも２．５±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１またはより高いＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、少なくとも５±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１またはより高いＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、０．５±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１と５０±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｎを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１と１０±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｎを有する。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、５０±０．０２×１０^－４ｓ^－１未満のＫｏｆｆを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、１０±０．０２×１０^－４ｓ^－１未満のＫｏｆｆを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、５±０．０２×１０^－４ｓ^－１未満のＫｏｆｆを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、０．５±０．０２×１０^－４ｓ^－１と５０±０．０２×１０^－４ｓ^－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｆｆを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して、ｂｅｔｗｅｅｎ１±０．０２×１０^－４ｓ^－１と１５±０．０２×１０^－４ｓ^－１の間（または前の値から後の値まで）のＫｏｆｆを有する。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。一部の態様では、本明細書に記載される抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体である。一部の態様では、ヒト抗体またはヒト抗体の抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、ヒト化抗体またはヒト化抗体の抗原結合断片が、本明細書において提供される。一部の態様では、キメラ抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片（キメラ抗体は、１つの種の可変領域および別の種の定常領域を有する抗体である）が、本明細書において提供される。

本明細書に提供される抗体としては、抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に特異的に結合する免疫グロブリン分子、および抗体と同じまたは実質的に同じ抗原のエピトープに結合するそのような分子の免疫学的活性断片が挙げられる。一部の態様では、抗体、またはその抗原結合断片による結合を受けた抗原は、がん細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）によって提示される。一部の実施形態では、がん細胞はＡＭＬ細胞である。

一部の態様では、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体は、本明細書に記載される３つのＶＨＣＤＲおよび／または３つのＶＬＣＤＲ、ヒトまたはヒト由来のフレームワーク領域、ならびにヒトまたはヒト由来の定常領域を含む、ヒト抗体もしくはヒト化抗体または免疫グロブリンである。ヒトフレームワーク領域の非限定的な例は、当技術分野で記載されており、例えば、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Sims et al. J. Immunol. 151 :2296 (1993); Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol., 151 :2623 (1993); Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008); Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997); Rosok et al., J. Biol. Chem. 271 :22611-22618 (1996); Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)を参照。好ましくは、本明細書に記載される抗体のＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２への結合を改善するために、１つまたは複数のアミノ酸置換をフレームワーク領域に加えることができる。

抗体が免疫グロブリンである一部の態様では、使用し得る抗体のタイプとして、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹが挙げられるが、これらに限定されない。使用し得る抗体のクラスとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２が挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、抗体はＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体である。一部の態様では、抗体は、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。一部の態様では、抗体は、野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。一部の態様では、抗体は、変異型ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。一部の態様では、抗体は、変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。一部の態様では、変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けによる置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、またはそれらの組合せのうちのいずれか１つを含む。一部の態様では、抗体は、少なくとも１つの変異を含むＦｃドメインを含む。

一部の態様では、単鎖抗体、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、本明細書において提供される。一部の態様では、ｓｃＦｖは、ヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。一部の態様では、ｓｃＦｖはリンカーを含む。一部の態様では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される。一部の態様では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む。一部の態様では、抗体の抗原結合断片であって、断片は、限定されないが、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）であり得る、抗体の抗原結合断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｆｖ断片が本明細書において提供される。一実施形態では、Ｆａｂ断片が本明細書において提供される。一実施形態では、Ｆ（ａｂ’）断片が本明細書において提供される。一実施形態では、Ｆ（ａｂ’）_２断片が本明細書において提供される。

一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、そのような抗体または断片によって標的化されるがん細胞に対する細胞傷害を誘導することができ、細胞傷害は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、またはそのような抗体もしくは断片に結合した毒素もしくは薬物の細胞傷害性に起因するものであり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを有する。一部の態様では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、ＡＤＣＣ活性のみまたはＣＤＣ活性のみを有する。

一実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を媒介する。ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ機能を有する抗体を製造する方法は、当技術分野で公知である。一般に、抗体のＦｃ領域は、ＡＤＣＣにつながる好中球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好酸球およびマスト細胞上のＦｃ受容体へのその結合、ならびにＡＤＣＰにつながるマクロファージ、好中球および樹状細胞上のＦｃ受容体へのその結合を媒介する。一部の態様では、ＡＤＣＣ活性を有する抗体であって、抗体のＦｃ領域がヒトＩｇＧまたはＩｇＥタイプである抗体が、本明細書において提供される。一実施形態では、想定される抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。一実施形態では、想定される抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。一実施形態では、想定される抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ３アイソタイプのものである。抗体を、そのＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性が増加するように生物工学的に操作することができる（例えば、変異、架橋、ジスルフィド結合形成、またはオリゴ糖付加による）（例えば、Natsume et al., 2009, Drug Des Devel Ther. 3:7-16を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、抗体のＦｃ領域のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を改善する目的でフコース残基を減少させるかまたは除去するために、それらのグリコシル化部位で改変される（例えば、Liu et al., 2015, Ca Immunol. Res. 3:173-183; Satoh et al., 2006, Expert Opin Biol. Ther. 6:1161-1173を参照；これは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域は、ＣＨ２ドメインの位置３３３でアラニン置換により変異している。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域は、以下の残基で変異している：Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌ（例えば、Lazar et al., 2006, PNAS 103:4005-4010を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域は、以下の残基に変異している：Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＧ２３６Ａ（例えば、Richards et al., 2008, Mol. Cancer Ther. 7:2517-27を参照）。一実施形態では、Ｆｃ領域は、位置２９８、３３３および／または３３４（ＥＵ番号）にアミノ酸置換を含み、これにより、ＡＤＣＣ活性が改善される。

一実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＣＤＣ機能を有する抗体を製造方法は、当技術分野で公知である。一部の態様では、ＣＤＣ活性を有する抗体であって、抗体のＦｃ領域がヒトＩｇＧまたはＩｇＭタイプである抗体が、本明細書において提供される。一実施形態では、想定される抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。一実施形態では、想定される抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。一実施形態では、想定される抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ３アイソタイプのものである。抗体を、そのＣＤＣ活性を増加させるように生物工学的に操作する（例えば、変異させる）ことができる（例えば、Moore et al., 2010, MAbs 2(2):181-189; Idusogie et al., 2001, J Immunol. 166(4):2571-5; Natsume et al., 2009, Drug Des Devel Ther. 3:7-16を参照；これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ＩｇＧＦｃを有する抗体を、そのＦｃ領域で、そのグリコシル化部位におけるＮ－グリカン構造が、フコースおよびシアル酸残基を伴わないＮ－アセチルグルコサミンで終結するＧ０グリカン型に変化するように生物工学的に操作する。一実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、またはIdusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)に記載されているように、ＣＤＣ活性を改善するために、Ｆｃ領域を改変する。

一実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、細胞傷害性薬剤（例えば、毒素または薬物）に結合される。細胞傷害性薬剤は、細胞死を誘導するか、または重要な細胞機能を阻害する薬剤であり得る。細胞傷害性薬剤は、化学療法剤、増殖阻害剤、放射性同位体、または毒素であり得るが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片は、毒素（例えば、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、ジアンチンタンパク質、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クロチン、ゲロニン、ネオマイシン、トリコテセン、フェノマイシン、ミトゲリン、レストリクトシン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、クルシン、ヨウシュヤマゴボウ（ＰｈｙｔｏｌａｃａＡｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、またはαサルシン）に結合される（例えば、コンジュゲートされる）。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片は、放射性同位元素（例えば、Ｐ^３２、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ａｔ^２１１、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、またはＰｂ^２１２）に結合される（例えば、コンジュゲートされる）。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片は、薬物（例えば、代謝拮抗薬、葉酸拮抗薬、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）、メトトレキサート、タキサン（例えば、ドセタキセル）、パクリタキセル、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、またはカリチアマイシン）に結合される（例えば、コンジュゲートされる）。抗体－薬物コンジュゲートを製造する方法は、当技術分野で公知である（そのようなコンジュゲートに使用し得る薬物、および抗体を薬物に連結するために使用し得るリンカーを含む）（例えば、Peters & Brown, 2015, Biosci. Rep. 35, e00225, doi:10.1042/BSR20150089を参照）。

また、同じエピトープに結合する抗体もしくはその断片、および／またはヒトＮＭＰ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２への結合について、本明細書に記載されるいずれかの抗体および断片（例えば、それぞれ配列番号５および３によって示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片）と競合する抗体もしくはその断片も、本開示による範囲に含まれる。同じエピトープを認識するか、または結合について競合する抗体およびその断片は、慣行的な手法を使用して同定することができる。そのような手法としては、例えば、１つの抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合を阻止する能力を示すイムノアッセイ、すなわち、競合結合アッセイが挙げられる。競合結合は、被験抗体が、共通抗原、例えば、ＮＭＰ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に対する参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定される。数多くの種類の競合結合アッセイが公知であり、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照）；Ｉ－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546 (1990)）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)）が挙げられる。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面に結合させた精製抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）またはこれらのいずれかを有する細胞、非標識被験抗体および標識参照抗体（例えば、それぞれ配列番号５および３によって示されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む抗体）の使用を伴う。競合阻害は、被験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を測定することによって測定される。通常、被験抗体は過剰に存在する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは参照抗体の共通抗原への特異的結合を少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％またはそれを上回って阻害する。他の手法としては、例えば、エピトープマッピング法、例えば、エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析が挙げられる。他の方法では、抗原断片または抗原の変異した変形物への抗体の結合をモニターし、抗原配列内のアミノ酸残基の改変に起因する結合の減少がエピトープ構成要素の指標であるとしばしばみなされる。加えて、エピトープマッピングのためのコンピュータ計算による組合せ法を使用することもできる。これらの方法は、目的の抗体が、特異的な短いペプチドを、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーからアフィニティー分離する能力に依拠している。次いで、これらのペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリードとみなされる。エピトープマッピングについては、立体構造的に不連続なエピトープをマッピングすることが示されている計算アルゴリズムも開発されている。

ネオエピトープを同定するための方法
一部の実施形態では、本開示は、ＭＨＣ分子と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態では、ネオエピトープは、腫瘍特異的またはがん特異的ネオエピトープである。一部の実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子である。

ネオエピトープの由来となった腫瘍特異抗原またはがん特異抗原は、非サイレント体細胞変異に起因する変化したアミノ酸配列を含有する。例えば、変異由来のネオエピトープは、点変異（例えば、タンパク質中に異なるアミノ酸をもたらす非同義変異）；終止コドンが改変されるかまたは欠失して、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有するより長いタンパク質の翻訳をもたらすリードスルー変異；成熟ｍＲＮＡへのイントロンの包含をもたらし、それ故に特有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらすスプライス部位変異；２つのタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じさせる染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームをもたらすフレームシフト変異または欠失；および転座によって生じる。

腫瘍特異的またはがん特異的変異に起因する腫瘍ネオエピトープの同定のための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Richters, et al. (2019) Genome Medicine 11:56; Liu, et al (2017) Cell 168:600を参照）。そのような方法としては、一般に、腫瘍特異的変異の同定（例えば、核酸またはタンパク質のディープシークエンシング法の使用）、患者のヒト白血球抗原型の同定および腫瘍に存在する対応する主要組織適合抗原複合体の予測、ネオエピトープの同定（例えば、患者のＨＬＡアレルに結合する可能性があり、腫瘍に存在する変異に基づく候補Ｔ細胞エピトープのセットを生成させるために、検証されたペプチド－ＭＨＣ結合予測アルゴリズムまたは分析手法の適用を使用すること）、任意選択で、選択されたネオエピトープに対する抗原特異的Ｔ細胞の実証、または候補ネオエピトープが腫瘍表面上のＨＬＡタンパク質に結合していることの実証が挙げられる。

ディープ核酸手法は当技術分野で公知である。任意の好適な配列分析法が使用される。そのような方法としては、例えば、チェーンターミネーションシークエンシング法に基づく従来のＳａｎｇｅｒシークエンシングを使用する配列分析が挙げられる（例えば、Sanger, et al (1977) PNAS 74:5463を参照）。さらなる一例として、配列分析の方法として、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の使用が挙げられる。ＮＧＳの方法は当技術分野で公知であり、ピロシークエンス法に基づくシークエンシング技術、合成によるＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑａｎｄＭｉＳｅｑシークエンシング、ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｌｉｇａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）、ＤＮＡナノボールシークエンシング、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、Ｈｅｌｉｃｏｓシークエンシング、およびＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシングが挙げられる。

核酸シークエンシングは、全腫瘍ゲノム、腫瘍エキソーム（タンパク質をコードするＤＮＡ）、ゲノムの標的化部分（例えば、ＨＬＡ遺伝子座）または腫瘍トランスクリプトームに対して行われる。一部の態様では、シークエンシングの結果は、既知の対照セットと、または正常組織もしくは患者の対応する正常組織に対して行われるシークエンシング分析と比較される。１つまたは複数のアルゴリズムを使用して、シークエンシングデータに存在する体細胞変異の異なるクラスを同定する。例えば、一部の実施形態では、アルゴリズムは、単一ヌクレオチドバリアントによって生じる多様性を検出するため（例えば、Cornish, et al (2015) Biomed Res Int 2015:456479; Ghoneim, et al (2014) BMC Res Notes 7:864; Kroigard, et al (2016) PLoS One 11:e0151664を参照）、および／またはインデルによって生じる多様性を検出するために使用される（例えば、Mose, et al (2014) 30:2813-2815; Narzisi, et al (2014) Nat Methods 11:1033-1036を参照）。さらに、一部の実施形態では、２つのタンパク質コード配列の融合の検出が、ＲＮＡシークエンシングデータおよび／または全ゲノムシークエンシングデータの分析によって行われる（例えば、Li, et al (2011) Bioinformatics 27:1708; Scolnick, et al (2015) PLoS One 10:30128916; Zhang, et al (2016) Genome Res 26:108; Kumar, et al (2016) Wiley Interdiscip Rev RNA 7:811を参照）。腫瘍ＤＮＡまたはＲＮＡにおけるバリアントがひとたび検出されると、翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列に対する各バリアントの影響が、当技術分野で公知のコンピュータ計算ツールを使用して決定される。さらに、翻訳されたポリペプチドにおける切断部位の予測およびＭＨＣクラスＩ抗原プロセシングに由来するペプチドの同定を助ける複数のツールが利用可能である。そのようなツールの非限定的な例としては、ＮｅｔＣｈｏｐ２０Ｓ、ＮｅｔＣｈｏｐＣｔｅｒｍ、およびＰｒｏｔｅａＳＭＭが挙げられる（例えば、Nielsen, et al (2005) Immunogenetics 57:33; Tenzer, et al (2005) Cell Mol Life Sci 62:1025を参照）。

タンパク質シークエンシングの方法も当技術分野で公知である。一部の態様では、トロテインシークエンシングが腫瘍プロテオームに対して行われる。一部の態様では、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異ペプチドの存在を同定または検証する。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降されたＨＬＡ分子から酸溶出され、次いで質量分析を使用して同定される。

一部の態様では、バリアント腫瘍特異的ペプチドがひとたび同定されると、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子へのその結合の予測は、患者のＨＬＡハプロタイプの知識を必要とする。ヒトのＭＨＣは、染色体６ｐ２１．３上に位置するＨＬＡ遺伝子複合体によってコードされている。この座位は多型性が高く、１２，０００種を上回るアレルが確定している。ＨＬＡ遺伝子は個別化しているため、正確なＨＬＡハプロタイプ決定が必要である。ＨＬＡハプロタイプ決定の方法は当技術分野で公知である。例えば、ＨＬＡハプロタイプ決定は、配列特異的ＰＣＲ増幅およびＳａｎｇｅｒシークエンシングまたはＮＧＳに基づく方法を使用するシークエンシングを使用して行われる。シークエンシングデータに基づくＨＬＡクラスＩおよびＩＩハプロタイプの同定には、複数のアルゴリズム、例えば、Ｐｏｌｙｓｏｌｖｅｒ（Shukla, et al (2015) Nat Biotech 33:1152）、ＨＬＡＭｉｎｅｒ（Warren, et al (2012) Genome Med 4:95）、およびＯｐｔｉＴｙｐｅ（Szolek, et al (2014) Bioinformatics 30:3310）が利用可能である。

一部の態様では、コンピュータアルゴリズムが、推定されるネオエピトープ、すなわち、ペプチド提示複合体の形でクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子による結合を受け、次いでこの形でＴリンパ球のＴ細胞受容体によって認識されるペプチド配列を予測するために使用される。ＭＨＣクラスＩに結合するペプチドを同定するために有用なプログラムの非限定的な例としては、ＳＭＭ（Nielsen, et al (2007) BMC Bioinformatics 8:238）、ＳＭＭＰＭＢＥＣ（Kim et al (2009) BMC Bioinformatics 10:394）、Ｐｉｃｋｐｏｃｋｅｔ（Zhang, et al 2009) Bioinformatics 25:1293）、ＮｅｔＭＨＣ（Andreatta, et al 2016) Bioinformatics 32:511）、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（Jurtz et al (2017) J Immunol 199:3360）、ＮｅｔＭＨＣｃｏｎｓ（Karosiene, et al (2012) Immunogenetics 64:177）、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ（O’Donnell, et al (2018) Cell Syst 7:129）、およびＥＤＧＥ（Bulik-Sullivan et al (2018) Nat Biotech）が挙げられる。

一部の態様では、推定されるネオエピトープがひとたび選択されると、それらがｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏのアッセイを使用してさらに試験される。一部の態様では、選択されたペプチドを合成して、異なるＨＬＡハプロタイプによってコードされるＭＨＣ分子への結合を決定するために、ヒトＨＬＡパネルにおいてスクリーニングする。

抗体を製造する方法
本明細書に記載される抗体および断片は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、ファージディスプレイ技術、細菌ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、真核生物ウイルスディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、および無細胞（例えば、リボソームディスプレイ）抗体スクリーニング手法を含むことができる（例えば、Etz et al. (2001) J Bacteriol 183:6924-6935; Cornelis (2000) Curr Opin Biotechnol 11:450-454; Klemm et al. (2000) Microbiology 146:3025-3032; Kieke et al. (1997) Protein Eng 10:1303-1310; Yeung et al. (2002) Biotechnol Prog 18:212-220; Boder et al. (2000) Methods Enzymology 328:430-444; Grabherr et al. (2001) Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192; Michael et al. (1995) Gene Ther 2:660-668; Pereboev et al. (2001) J Virol 75:7107-7113; Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231:119-135; Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768;およびHanes et al. (2000) Nat Biotechnol 18:1287-1292を参照）。

様々なファージディスプレイ法を使用する抗体を同定するための方法が当該技術分野で公知である。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。そのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗体の抗原結合ドメイン、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド結合安定化Ｆｖ抗体断片を提示させることができる。これらの方法に使用されるファージは、典型的には、繊維状ファージ、例えば、ｆｄおよびＭ１３である。抗原結合ドメインは、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、またはｐＩＸのいずれかに組換えで融合されたタンパク質として発現される。例えば、Shi et al. (2010) JMB 397:385-396を参照。本明細書に記載される免疫グロブリン、またはその断片を製造するために使用し得るファージディスプレイ法の例としては、Brinkman et al. (1995) J Immunol Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J Immunol Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur J Immunol 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene 187:9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280;ならびにＰＣＴ公開国際公開第９０／０２８０９号パンフレット、国際公開第９１／１０７３７号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、国際公開第９３／１１２３６号パンフレット、国際公開第９５／１５９８２号パンフレット、および国際公開第９５／２０４０１号パンフレットに開示されているものが挙げられる。好適な方法は、例えば、米国特許第５，６９８，４２６号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，７５０，７５３号明細書；同第５，８２１，０４７号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，５１６，６３７号明細書；同第５，７８０，２２５号明細書；同第５，６５８，７２７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書および同５，９６９，１０８号明細書にも記載されている。

一部の実施形態では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、免疫処置を受けた哺乳動物からのＢ細胞から収集したｍＲＮＡを使用して生成させることができる。例えば、Ｂ細胞を含む脾臓細胞試料は、上記のようなＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２複合体による免疫処置を受けたマウスから単離することができる。ｍＲＮＡを細胞から分離して、標準的な分子生物学的手法を使用してｃＤＮＡに変換することができる。例えば、Sambrook et al. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane (1988), 上記; Benny K. C. Lo (2004), 上記; およびBorrebaek (1995), 上記を参照。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、ファージディスプレイライブラリーを構築する。そのようなライブラリーを作製するための方法は、例えば、Merz et al. (1995) J Neurosci Methods 62(1-2):213-9; Di Niro et al. (2005) Biochem J 388(Pt 3):889-894;およびEngberg et al. (1995) Methods Mol Biol 51:355-376に記載されている。

酵母表面ディスプレイ法を使用して抗体を同定するための方法は、当技術分野で周知である。本明細書に記載される抗体および断片を製造するために使用することができる酵母表面ディスプレイ法の一例は、Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768に記載されている方法を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体を製造する方法は、対象（例えば、非ヒト哺乳動物）に、好適な免疫原による免疫処置を行うステップを含み得る。本明細書に記載される抗体のいずれかを生成させるための好適な免疫原について、本明細書に記載する。例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体を生成させるために、当業者は、好適な対象（例えば、非ヒト哺乳動物、例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ラマ、ウマ、または非ヒト霊長類）に、例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープがＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）である場合に、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２複合体を含む抗原による免疫処置を行うことができる。好適な対象（例えば、非ヒト哺乳動物）に、その哺乳動物による抗体の産生を誘発するのに十分な回数の以後の追加免疫処置とともに、好適な抗原により免疫処置を行うことができる。免疫原は、アジュバントとともに対象（例えば、非ヒト哺乳動物）に投与することができる。

ハイブリドーマ技術を使用して抗体を作製する方法は、当技術分野で周知である。一部の実施形態では、本方法は、免疫原に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製するステップを含む。例えば、好適な哺乳動物、例えば、実験用マウスに、上記のようなＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２複合体による免疫処置を行う。免疫処置を受けた哺乳動物の抗体産生細胞（例えば、脾臓のＢ細胞）は、免疫原の少なくとも１回の追加免疫処置の２日後から４日後までに単離することができ、次いで培養下で短時間増殖させた後に、好適な骨髄腫細胞株の細胞との融合を行う。細胞は、例えば、融合促進剤、例えば、ワクシニアウイルスまたはポリエチレングリコールの存在下で融合させることができる。融合で得られたハイブリッド細胞をクローニングして、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する。例えば、好適な免疫原による免疫処置を受けたＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞を、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０－Ａｇ１４の細胞と融合させることができる。融合後に、細胞を、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰増殖させるのを防ぐために、選択培地、例えば、ＨＡＴ培地を一定間隔で添加した好適な培地中で増大させる。次いで、得られたハイブリッド細胞を、所望の抗体（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体）の分泌についてスクリーニングする。

一部の実施形態では、当業者は、例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書（Knappik et al.; Morphosys AGに対する）およびSchoonbroodt et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(9):e81に記載されているように、非免疫ベースのライブラリーから目的の抗体を同定することができる。

一部の実施形態では、選択とスクリーニングの組合せを使用して、例えば、ハイブリドーマ由来の抗体の集団またはファージディスプレイ抗体ライブラリーから目的の抗体を同定することができる。好適な方法は当技術分野で公知であり、例えば、Hoogenboom (1997) Trends in Biotechnology 15:62-70; Brinkman et al. (1995), 上記; Ames et al. (1995), 上記; Kettleborough et al. (1994), 上記; Persic et al. (1997), 上記; および Burton et al. (1994), 上記に記載されている。例えば、それぞれがバクテリオファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩまたはｐＩＸ）と異なる抗原結合領域との融合タンパク質をコードする複数のファージミドベクターを、標準的な分子生物学的手法を使用して作製し、次いで細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））の集団に導入する。細菌におけるバクテリオファージの発現は、一部の実施形態では、ヘルパーファージの使用を必要とする可能性がある。一部の実施形態では、ヘルパーファージは必要とされない（例えば、Chasteen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34(21):e145を参照）。細菌から産生されたファージを回収し、次いで、例えば、固体支持体に結合した（固定化された）標的抗原と接触させる。また、ファージを溶液中で抗原と接触させてもよく、次いでこの複合体を固体支持体に結合させる。

上記の方法を使用してスクリーニングされた抗体の部分集団を、当技術分野で公知の任意の免疫学または生化学に基づく方法を使用して、特定の抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対するそれらの特異性および結合親和性について特徴付けることができる。例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に対する抗体の特異的結合を、免疫学または生化学に基づく方法、例えば、限定はされないが、上記のようなＥＬＩＳＡアッセイ、ＳＰＲアッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析を使用して決定することができる。抗体の免疫特異的結合および交差反応性を分析するために使用し得るイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの手法を使用する競合および非競合アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは慣行的であり、当技術分野で周知である。

キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202-7; Oi and Morrison, 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1989, J Immunol. Methods 125:191-202;および米国特許第５，８０７，７１５号明細書、同第４，８１６，５６７号明細書、同第４，８１６，３９７号明細書および同第６，３３１，４１５号明細書を参照）。

ヒト化抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、国際公開公報第９１／０９９６７号パンフレット；Padlan, 1991, Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka et al, 1994, Prot Engineering 7(6): 805-814; Roguska et al, 1994, PNAS 91: 969-973;国際公開第９３／１７１０５号パンフレット；Tan et al, 2002, J Immunol 169: 1119-25; Caldas et al, 2000, Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea et al, 2000, Methods 20(3): 267-79; Baca et al, 1997, J Biol Chem 272(16):10678-84; Roguska et al, 1996, Protein Eng 9(10): 895 904; Couto et al, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto et al, 1995, Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150(2):409-10; Pedersen et al, 1994, J Mol Biol 235(3): 959-73を参照。例えば、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティングによって作製することができる。

ヒト抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、ヒト抗体は、上記のように、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、ファージディスプレイまたは酵母表面ディスプレイ法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号明細書、同第４，７１６，１１１号明細書および同第５，８８５，７９３号明細書；国際公開公報第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開公報第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開公報第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開公報第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開公報第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開公報第９６／３３７３５号パンフレット、および国際公開公報第９１／１０７４１号パンフレットも参照のこと。また、ヒト抗体を、マウス－ヒトハイブリドーマを使用して製造することもできる（Shinmoto et al, 2004, Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa et al, 2005, Human Antibodies 14: 27-31を参照）。

抗体断片を製造する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片は、ペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成させるため）またはパパイン（Ｆａｂ断片を生成させるため）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク分解切断によって生成させることができる。ｓｃＦｖ断片を製造する方法も当技術分野で公知である（例えば、Ahmad et al., 2012, Clinical and Developmental Immunology, doi: 10.1155/2012/980250; Wang et al., 2006, Anal. Chem. 78, 997-1004; Pansri et al., 2009, BMC Biotechnology 9:6; Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768を参照）。所望の抗原結合特性を有するｓｃＦｖを、ファージディスプレイ技術または酵母表面ディスプレイ技術によって選択することができる。ｓｃＦｖは、短いポリペプチドリンカーを介して免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを融合させること（組換え発現手法を使用して）によって構築することができる。単一ドメイン抗体（例えば、軽鎖を欠く抗体）を製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Riechmann & Muyldermans, 1999, J Immunol 231:25- 38; Nuttall et al, 2000, Curr Pharm Biotechnol 1(3):253-263; Muyldermans, 2001, J Biotechnol 74(4): 277-302を参照）。

二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Konterman, 2012, MAbs 4: 182-197; Gramer et al., 2013, MAbs 5:962-973を参照）。

選択されたＣＤＲアミノ酸配列が短い配列（例えば、１０～１５アミノ酸長未満）である実施形態では、ＣＤＲをコードする核酸を、例えば、Shiraishi et al. (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129-130および米国特許第６，９９５，２５９号明細書に記載されたように化学合成することができる。アクセプター抗体をコードする所与の核酸配列について、ＣＤＲをコードする核酸配列の領域を、標準的な分子生物学の手法を使用して化学合成された核酸で置き換えることができる。化学合成された核酸の５’および３’末端は、その核酸をドナー抗体の可変領域をコードする核酸へとクローニングする際に使用するための粘着末端制限酵素部位を含むように合成することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、その対応する変更されていない定常領域に比して増強または低減されたエフェクター機能を有する（またはエフェクター機能を有しない）変更された重鎖定常領域を含む。本明細書に記載される抗体の定常領域が関与するエフェクター機能は、定常領域またはＦｃ領域の特性を変更することによって調節することができる。変更されたエフェクター機能としては、例えば、以下の活性：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、アポトーシス、１つまたは複数のＦｃ受容体への結合、および炎症誘発性応答のうちの１つまたは複数における調節が挙げられる。調節は、変更されていない形態の定常領域の活性と比較して、変更された定常領域を含有する対象抗体によって示されるエフェクター機能活性の増加、減少、または消失を指す。変更されたＦｃＲ結合親和性および／またはＡＤＣＣ活性および／または変更されたＣＤＣ活性を有する変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域と比較して、増強または低減されたＦｃＲ結合活性および／またはＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性のいずれかを有するポリペプチドである。ＦｃＲへの結合増加を示す変更された定常領域は、少なくとも１つのＦｃＲに、変更されていないポリペプチドよりも高い親和性で結合する。ＦｃＲへの結合の減少を示す変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域よりも低い親和性で、少なくとも１つのＦｃＲに結合する。

抗体にＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性を付与する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Kellner et al., 2014, Methods 65: 105-113;国際公開第２０１２０１０５６２号パンフレット；Natsume et al., 2009, Drug Design, Development and Therapy 3(3):7-16を参照）。そのような方法には、Ｆｃアイソタイプシャッフリング、増強されたＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性を付与するＦｃ領域におけるアミノ酸変異、ならびに増強されたＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性を付与するＦｃ領域グリコシル化プロファイルの変化が含まれるが、これらに限定されない。

例えば、本明細書に記載される抗体は、増強または低減された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す変更された定常領域を含有してもよい。調節されたＣＤＣ活性は、抗体のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を導入することによって達成することができる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書を参照。代替的または追加的に、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることもできる。そのようにして生成されたホモ二量体抗体は、インターナリゼーション能力が改善もしくは低減しているか、および／または補体媒介性細胞殺滅が増加または減少している可能性がある。例えば、Caron et al. (1992) J Exp Med 176:1191-1195およびShopes (1992) Immunol 148:2918-2922;ＰＣＴ公開国際公開第９９／５１６４２号パンフレットおよび国際公開第９４／２９３５１号パンフレット；Duncan and Winter (1988) Nature 322:738-40;および米国特許第５，６４８，２６０号明細書および同第５，６２４，８２１号明細書を参照。

本明細書に記載される抗体のいずれかを、当技術分野で公知の任意の免疫学または生化学に基づく方法を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏのいずれかで、抗原、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に起因する活性または機能のいずれかを調節するその能力について、スクリーニングおよび／または試験することができる。

本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片は、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野で公知の種々の手法を使用して作製することができる。例えば、抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含む、転写調節配列および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができる。調節配列には、プロモーター、ならびに転写開始配列および転写停止配列が含まれる。加えて、発現ベクターは、それが２つの異なる生物において、例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆虫細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において維持され得るように、複数の複製系を含み得る。

哺乳動物細胞における核酸からの、クローニングされた重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現のために、いくつかの可能性のあるベクター系を利用することができる。ベクターの１つのクラスは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノムへの組込みに依拠する。安定に組み込まれたＤＮＡを有する細胞は、薬剤耐性遺伝子、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｔ（Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072）またはＴｎ５ｎｅｏ（Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327）を、同時に導入することによって選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ遺伝子配列に連結させてもよく、またはコトランスフェクションによって同じ細胞に導入することもできる（Wigler et al. (1979) Cell 16:77）。ベクターの第２のクラスは、染色体外プラスミドに自己複製能を付与するＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス（Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147）、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス（Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292）、またはＳＶ４０ウイルス（Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79）に由来し得る。

発現ベクターは、核酸のその後の発現のために好適な様式で、細胞に導入することができる。導入の方法は、以下に述べるように、標的となる細胞の型によって主に決まる。例示的な方法には、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、カチオン性リポソーム、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接マイクロインジェクションが含まれる。

抗体またはその抗原結合断片の発現のための適切な宿主細胞には、酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が含まれる。特に関心が持たれるのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株（例えば、ヒト細胞株）、ならびに初代細胞株である。

一部の実施形態では、抗体またはその断片を、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）において発現させ、そこから精製することができる。例えば、抗体を、Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik- Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9(2):155-159;およびPollock et al. (1999) J Immunol Methods 231(1-2):147-157に記載されているように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯類）において産生させ、例えば、乳から単離することができる。

抗体およびその断片は、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、タンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下で、ある長さの時間をかけて培養することによって、細胞から産生させることができる。タンパク質発現のためのそのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なると考えられ、慣行的な実験を通して当業者によって容易に確認されるであろう。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された抗体を、封入体からリフォールディングさせることができる（Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30を参照）。細菌発現系およびそれらの使用のための方法は、当技術分野で周知である（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning--A Laboratory Manual --3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)を参照）。コドン、好適な発現ベクターおよび好適な宿主細胞の選択は、いくつかの要因に応じて異なり、必要に応じて容易に最適化され得る。本明細書に記載される抗体（またはその断片）は、哺乳動物細胞において、または酵母、バキュロウイルス、およびｉｎｖｉｔｒｏ発現系を含むがこれらに限定されない、他の発現系において発現させることができる（例えば、Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220を参照）。

発現の後に、抗体およびその断片を単離することができる。抗体またはその断片は、試料中にどのような他の構成成分が存在するかに応じて、当業者に公知の種々の方法で単離または精製することができる。標準的な精製方法には、電気泳動的、分子的、免疫学的な手法、ならびにイオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー手法が含まれる。例えば、抗体は、標準的な抗抗体カラム（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム）を使用して精製することができる。タンパク質濃縮と組み合わせた、限外濾過およびダイアフィルトレーションの手法も有用である。例えば、Scopes (1994) “Protein Purification, 3rd edition,”Springer-Verlag, New York City, New Yorkを参照。必要な精製の度合いは、所望の用途よって異なると考えられる。一部の例では、発現された抗体またはその断片の精製は必要ではない。

精製された抗体またはその断片の収量または純度を決定するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＵＶ分光法、Ｂｉｕｒｅｔタンパク質アッセイ、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、質量分析（ＭＳ）法、およびゲル電気泳動法（例えば、タンパク質染色、例えば、クーマシーブルーまたはコロイド銀染色を使用する）が含まれる。

抗体またはその抗原結合断片は、その発現および精製の後に改変することができる。改変は、共有結合性または非共有結合性の改変であり得る。そのような改変は、例えば、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、抗体または断片に導入することができる。改変のための好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造分析またはアミノ酸配列分析を含む、種々の基準のいずれかを使用して選択することができる。

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、異種部分にコンジュゲートさせることができる。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療薬もしくは細胞傷害性薬剤（例えば、毒素または薬物）、または検出可能な標識、例えば、限定はされないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどのアフィニティータグであり得る。好適な異種ポリペプチドには、例えば、抗体または断片の精製に使用するための、抗原タグ（例えば、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４４））、ポリヒスチジン（６－Ｈｉｓ；ＨＨＨＨＨＨ（配列番号４５）、ヘマグルチニン（ＨＡ；ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４６））、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク（ＭＢＰ））が含まれる。異種ポリペプチドにはまた、診断マーカーまたは検出マーカーとして有用であるポリペプチド（例えば、酵素）、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も含まれる。好適な放射性標識には、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈが含まれる。好適な蛍光標識には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、およびＣｙ７が含まれるが、これらに限定されない。発光標識には、例えば、種々の発光ランタニド（例えば、ユーロピウムまたはテルビウム）キレートのいずれかが含まれる。例えば、好適なユーロピウムキレートには、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）のユーロピウムキレートが含まれる。酵素標識には、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。

２つのタンパク質（例えば、抗体および異種部分）は、いくつかの公知の化学架橋剤のいずれかを使用して架橋することができる。そのような架橋剤の例は、「妨害された」ジスルフィド結合を含む連結を介して２つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元型グルタチオンまたは酵素ジスルフィド還元酵素の作用による還元から、（ジスルフィド結合の両側の妨害基によって）保護される。１つの好適な試薬である４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、一方のタンパク質の末端リシンおよび他方のものの末端システインを利用して、２つのタンパク質間にそのような連結を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能性試薬を使用することもできる。他の有用な架橋剤には、２つのアミノ基を連結する試薬（例えば、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基を連結する試薬（例えば、１，４－ビス－マレイミドブタン）、アミノ基とスルフヒドリル基とを連結する試薬（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基とカルボキシル基とを連結する試薬（例えば、４－［ｐ－アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、およびアミノ基とアルギニンの側鎖に存在するグアニジニウム基とを連結する試薬（例えば、ｐ－アジドフェニルグリオキサール一水和物）が含まれるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、放射性標識を、抗体のアミノ酸骨格に直接コンジュゲートさせることができる。あるいは、放射性標識を、遊離アミノ基に結合して関連タンパク質のメタヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成するより大きな分子（例えば、メタ－［１２５Ｉ］ヨードフェニル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ中の１２５Ｉ）（例えば、Rogers et al. (1997) J Nucl Med 38:1221-1229を参照）またはキレート剤（例えば、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡ）の一部として含めて、次いでそれをタンパク質骨格に結合させてもよい。放射性標識またはそれを含有するより大きな分子／キレート剤を、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片にコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で公知である。そのような方法は、タンパク質への放射性標識またはキレート剤の結合を助長する条件（例えば、ｐＨ、塩濃度、および／または温度）下で、タンパク質を放射性標識とインキュベートすることを伴う（例えば、米国特許第６，００１，３２９号明細書を参照）。

蛍光標識（「フルオロフォア」と称される場合もある）を、タンパク質（例えば、抗体）にコンジュゲートさせる方法は、タンパク質化学の技術分野で公知である。例えば、フルオロフォアを、フルオロフォアに結び付いたスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分を使用して、タンパク質の遊離アミノ基（例えば、リシンの）またはスルフヒドリル基（例えば、システインの）にコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態では、フルオロフォアを、スルホ－ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋剤部分にコンジュゲートさせることができる。好適なコンジュゲーション法は、抗体タンパク質、またはその断片を、フルオロフォアのタンパク質への結合を助長する条件下でフルオロフォアとインキュベートすることを伴う。例えば、Welch and Redvanly (2003) “Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,”John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)を参照。

一部の実施形態では、抗体または断片を、例えば、循環中、例えば、血液、血清、または他の組織中での抗体の安定化および／または保持を改善する部分によって改変することができる。例えば、抗体または断片を、例えば、Lee et al. (1999) Bioconjug Chem 10(6): 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485;およびRoberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476に記載されているようにＰＥＧ化すること、またはＨＥＳ化することができる（Fresenius Kabi, Germany;例えば、Pavisic et al. (2010) Int J Pharm 387(1-2):110-119を参照）。安定化部分は、抗体（または断片）の安定性または保持を、少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、もしくは５０倍またはそれ以上）に改善し得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片を、グリコシル化することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片を、抗体または断片のグリコシル化が減少しているかまたは存在しないように、酵素的もしくは化学的な処理に供するか、または細胞から産生させることができる。グリコシル化が減少した抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９３３，３６８号明細書；Wright et al. (1991) EMBO J 10(10):2717-2723; and Co et al. (1993) Mol Immunol 30:1361に記載されている。

二重特異性分子
ある特定の実施形態では、二重特異性分子を形成するために使用し得る抗原結合性構築物が、本明細書において提供される。ＭＨＣタンパク質（例えば、抗ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩ抗体）と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に対する抗体、またはその抗原結合断片を、誘導体化するか、または別の分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のリガンド）に連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。例えば、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体、またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を、Ｔ細胞上（例えば、ＣＤ３）またはナチュラルキラー細胞上に発現される抗原に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）に連結させることができる。２種を上回る異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を、誘導体化すること、または本明細書に記載されるような抗体、もしくはその抗原結合断片を複数の他の分子に連結させることによって作り出すこともでき；そのような多重特異性分子も、本明細書で使用される「二重特異性分子」という用語の範囲に含まれることを意図している。本明細書に記載される二重特異性分子を生成させるためには、本明細書に記載されるような抗体、またはその抗原結合断片を、二重特異性分子が生じるように、１つまたは複数の他の分子、例えば、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体に連結させるとよい（例えば、化学的カップリングまたはコンジュゲーション、遺伝子融合、非共有結合性会合などによって）。

したがって、ある特定の実施形態では、ＭＨＣタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に対する少なくとも１つの第１の結合特異性（すなわち、二重特異性分子の第１の抗原結合ドメイン）および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性（すなわち、二重特異性分子の第２の抗原結合ドメイン）を含む二重特異性分子が、本明細書において提供される。本明細書に記載される二重特異性分子が多重特異性である実施形態では、分子は第３の結合特異性をさらに含むことができる。

ある特定の実施形態では、二重特異性分子の第１の抗原結合ドメインと二重特異性分子の第２の抗原結合ドメインの特異性は同じである。ある特定の実施形態では、二重特異性分子の第１の抗原結合ドメインと二重特異性分子の第２の抗原結合ドメインの特異性は異なる。

一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子としては、少なくとも１つの抗体、またはその抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、もしくは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、または単鎖抗体分子が挙げられる。また、その内容が全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｄｎｅｒｅｔａｌ．米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載されているように、抗体が、軽鎖二量体もしくは重鎖二量体、またはその任意のごく小さい断片、例えば、Ｆｖもしくは単鎖構築物であってもよい。

ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性分子は、二重特異性単鎖抗体である。一実施形態では、本開示の二重特異性分子における抗原結合ドメインのうちの少なくとも１つは、抗体の可変領域の単鎖断片である。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子中に使用される抗体または抗原結合断片は、ヒト性（例えば、ヒトモノクローナル抗体）である。本明細書に記載される二重特異性分子中に使用し得る他の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体（例えば、マウス、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体）である。

本明細書に記載される二重特異性分子は、構成要素である抗原結合ドメインを、当技術分野で公知の方法を使用してコンジュゲートすることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各抗原結合ドメインを別々に生成させて、次いで互いにコンジュゲートさせることができる。

抗原結合ドメインがタンパク質またはペプチドである場合、種々のカップリング剤または架橋剤を、共有結合性コンジュゲーションのために使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸エステル（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照）。他の方法には、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83)、およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されているものが含まれる。好ましいコンジュゲーション剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ－ＳＭＣＣであり、いずれもＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。

抗原結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートさせることができる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーションの前に、奇数個の、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含有するように改変される。

あるいは、両方の抗原結合ドメインを同一のベクターによってコードさせ、同一の宿主細胞内で発現させて集合させてもよい。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂおよびｍＡｂ、ｍＡｂおよびＦａｂ、ｍＡｂおよびＦａｂ’、ｍＡｂおよびＦ（ａｂ’）_２、ｍＡｂおよびＦｖ、ｍＡｂおよびｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２、ＦａｂおよびＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ、ＦｖおよびＦｖ、またはリガンドおよびＦａｂ融合タンパク質を含む場合に、特に有用である。二重特異性抗体は、各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含んでもよい。本明細書に記載される二重特異性分子は、１つの単鎖抗体および１つの結合決定基を含む単鎖分子、または２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性抗体は、各重鎖のＮ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含んでもよい。二重特異性抗体は、各軽鎖のＮ末端またはＣ末端にｓｃＦｖを含む抗体を含んでもよい。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含んでもよい。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている。

二重特異性分子とその特異的標的との結合は、当技術分野で認知された方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイを使用して確認することができる。これらのアッセイはそれぞれ一般に、目的の複合体に対して特異的である標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原に結合し（例えば、特異的に結合し）、同時に、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３）またはナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫｐ４６またはＣＤ１６Ａ）上の１つまたは複数の抗原にも結合する（例えば、特異的に結合する）。一部の実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合し、同時に、免疫エフェクター細胞上の１つまたは複数の抗原にも特異的に結合する。一部の態様では、そのような結合は、免疫エフェクター細胞の腫瘍細胞への再標的化を可能にする（例えば、Chames et al., 2009, MAbs 1:539-547を参照）。免疫エフェクター細胞としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞およびＢリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、本明細書に記載される二重特異性抗体によって標的化される免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３）、ナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫｐ４６またはＣＤ１６Ａ）、またはマクロファージである。一部の実施形態では、二重特異性分子は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、および免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３）、ナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫｐ４６またはＣＤ１６Ａ）、またはマクロファージ上の抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ）を含む抗原に結合し（例えば、特異的に結合し）、同時に、以下の抗原：ＣＤ３、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ、ＴＧＦ－β、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＤまたはＤＮＡＭ－１のうちの１つまたは複数にも結合する（例えば、特異的に結合する）。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＣＤ３に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＮＫｐ４６に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＣＤ１６Ａに対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＣＤ４０に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＣＤ４７に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、４－１ＢＢに対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＴＧＦ－βに対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＬＡＧ－３に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＰＤ－１に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＴＩＭ－３に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＣＴＬＡ－４に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＯＸ－４０に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＮＫｐ３０に対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＮＫＧ２Ａに対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＮＫＧ２Ｄに対する第２の結合特異性を含む。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＤＮＡＭ－１に対する第２の結合特異性を含む。

一部の実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性単鎖抗体であってもよい。「二重特異性単鎖抗体」または「単鎖二重特異性抗体」とぃう用語は、完全な免疫グロブリンに存在する定常部分および／またはＦｃ部分を欠く、単一のポリペプチド鎖中で少なくとも２つの抗体可変領域を接続することから生じる抗体構築物を指す。例えば、二重特異性単鎖抗体の各抗原特異的部分は、抗体Ｖ_Ｈ領域および抗体Ｖ_Ｌ領域を含む。

二重特異性単鎖抗体の有利なバリアントを、以下にＮ末端からＣ末端まで記載する（「ＣＤ３」は、第２の特異性の一例として使用されるが、別の抗原、例えば、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ、ＴＧＦ－β、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＤまたはＤＮＡＭ－１によって置換され得る）：
Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）、
Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）、
Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）、
Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）、
Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）、
Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）、
Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）、または
Ｖ_Ｌ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｈ（ＣＤ３）－Ｖ_Ｌ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）－Ｖ_Ｈ（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）。

本開示の二重特異性分子の抗原結合ドメインは、好ましくは、例えば、それらの由来となった抗体または免疫グロブリン鎖の結合特異性と少なくとも実質的に同一な特異性を有する。

ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３）またはナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫｐ４６またはＣＤ１６Ａ）上の１つまたは複数の抗原に結合する二重特異性分子の抗原結合ドメインは、抗原に対して、少なくとも１０^－４Ｍ、少なくとも１０^－５Ｍ、少なくとも１０^－６Ｍ、または少なくとも１０^－７Ｍ結合親和性（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３）またはナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫｐ４６またはＣＤ１６Ａ）上の１つまたは複数の抗原に結合する抗原結合ドメインは、抗原に対して、１０^－７Ｍよりも強くない（例えば、１０^－４Ｍと１０^－７Ｍの間、または１０^－５Ｍと１０^－７Ｍの間の）結合親和性（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原に結合する二重特異性分子の抗原結合ドメインは、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原に対して、少なくとも１０^－７Ｍまたはより強い、少なくとも１０^－８Ｍまたはより強い、少なくとも１０^－９Ｍまたはより強い、少なくとも５００ｎＭまたはより強い、少なくとも２５０ｎＭまたはより強い、少なくとも１００ｎＭまたはより強い、少なくとも５０ｎＭまたはより強い、少なくとも２５ｎＭまたはより強い、少なくとも２０ｎＭまたはより強い、少なくとも１５ｎＭまたはより強い、または少なくとも１０ｎＭまたはより強い結合親和性（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原に結合する二重特異性分子の抗原結合ドメインは、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原に対して、少なくとも２０ｎＭまたはより強い、少なくとも１５ｎＭまたはより強い、または少なくとも１０ｎＭまたはより強い結合親和性（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原に結合する二重特異性分子の抗原結合ドメインは、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原に対して、０．１ｎＭと５００ｎＭ、０．１ｎＭと１００ｎＭ、０．５ｎＭと１００ｎＭ、０．１ｎＭと５０ｎＭ、０．５ｎＭと５０ｎＭ、０．１ｎＭと２５ｎＭ、０．５ｎＭと２５ｎＭ、０．１ｎＭと１５ｎＭ、０．５ｎＭと１５ｎＭ、０．１ｎＭと１０ｎＭ、もしくは０．５ｎＭと１０ｎＭの間（または前の値から後の値まで）、または１ｎＭから１００ｎＭ（またはその間の任意の値）の結合親和性（Ｋｄ）を有する。そのような抗原結合ドメインは、免疫エフェクター細胞上の抗原（例えば、ＣＤ３抗原）に対して、少なくとも１０^－５Ｍの、例えば、１０^－７Ｍよりも強くない結合親和性を有することができ、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原に対して、例えば、１０^－８Ｍまたはより強い、５０ｎＭまたはより強い、２５ｎＭまたはより強い、１５ｎＭまたはより強い、１０ｎＭまたはより強い結合親和性を有することができる。本開示の二重特異性分子のある特定の実施形態では、（ａ）第１の抗原結合ドメインの前記結合部位（ＮＰＭ１ｃ：ＭＨＣクラスＩに結合する）は、少なくとも約１０^－７Ｍ、少なくとも約１０^－８Ｍ、少なくとも約１０^－９Ｍ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、もしくは少なくとも約２５ｎＭ、もしくは少なくとも約１５ｎＭの親和性を有し；および／または（ｂ）第２の抗原結合ドメインの前記結合部位は、約１０^－７Ｍよりも弱い、約１０^－６Ｍよりも弱い、もしくは１０^－５Ｍのオーダーの親和性を有する。本開示の二重特異性分子の一部の実施形態では、（ａ）第１の抗原結合ドメインの前記結合部位（ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する）は、少なくとも約１００ｎＭもしくは少なくとも約２５ｎＭの親和性を有し；および／または（ｂ）第２の抗原結合ドメインの前記結合部位は、約１０^－７Ｍよりも弱い、約１０^－６Ｍよりも弱い、または１０^－５Ｍのオーダーの親和性を有する。

上記で言及したある特定の実施形態によれば、ＭＨＣタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗原）と複合体を形成した変異型ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原を認識する結合部位が、破壊しようとする標的細胞を高い効率で捕捉するためには、高い親和性を有することが有利である。一方、免疫エフェクター細胞上の抗原（例えば、ＣＤ３抗原）を認識する結合部位の結合親和性は、抗原に対する天然受容体（例えば、ＣＤ３受容体）の結合親和性、または免疫エフェクター細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）とそのリガンド、すなわち標的細胞表面上のＭＨＣ－ペプチド複合体との相互作用について通常見出される結合親和性のオーダーであり得る。

本開示の一実施形態では、本開示の二重特異性分子の前記第１および／または第２のドメインは、天然抗体由来のＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域を模倣するか、またはそれらに対応する。本開示の二重特異性分子に関する結合部位を与える抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、合成抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片など、またはこれらのいずれかの化学的に改変された誘導体であり得る。モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3によって最初に記載された手法によって調製することができ、これはマウス骨髄腫細胞を、当技術分野によって開発された改変を伴う免疫処置を受けた哺乳動物に由来する脾細胞と融合させることを含む。さらに、前述の抗原に対する抗体またはその断片を、例えば、Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載されている方法を使用することによって得ることもできる。抗体は、ヒトを含むいくつかの種から得ることができる。前記抗体の誘導体がファージディスプレイ手法によって得られる場合には、ＢＩＡｃｏｒｅシステムで使用される表面プラズモン共鳴を使用して、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２または第２の抗原に結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97 105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7 13）。キメラ抗体の作製は、例えば、国際公開第８９／０９６２２号パンフレットに記載されている。ヒト化抗体の作製のための方法は、例えば、欧州特許出願公開第１０２３９４００号明細書および国際公開第９０／０７８６１号パンフレットに記載されている。本開示に従って利用される抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。異種抗体、例えば、マウスにおけるヒト抗体の産生に関する一般原理は、例えば、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレットおよび国際公開第９６／３３７３５号パンフレットに記載されている。本開示に従って利用される抗体の別の供給源は、例えば、Chao et al., 2006, Nature Protocols 1(2):755-768に記載されているように、酵母表面ディスプレイを使用して単離され、操作されたヒト抗体である。

一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子のＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２特異的ドメインは、配列番号１１（ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ）として示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれである少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号１０（ＩＳＧＳＧＧＳＴ）として示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれである少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ２、および／または配列番号９（ＧＦＴＦＳＳＹＡ）として示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれである少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ１を含む。

本開示の二重特異性分子は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２特異的ドメインの１つまたは複数のＶ_Ｌ領域ＣＤＲも含んでもよい。ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２特異的ドメインのそのようなＶ_Ｌ領域ＣＤＲは、配列番号８（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）として示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれである少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ３、配列番号７（ＡＡＳ）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれである少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ２、および／または配列番号６（ＱＳＩＳＳＹ）として示されるアミノ酸配列を含むかもしくはそれである少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ１を含む。

一実施形態では、二重特異性分子は、１つの構築物（例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ）においてＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_ＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

一実施形態では、本明細書で言及される抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２ＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従う。ＩＭＧＴ番号付けスキームは、抗体における残基の一貫した様式での番号付けのために広く採用されている基準である（ＩＭＧＴ（登録商標）、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のウェブサイトimgt.org, founder and director: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Franceを参照；例えば、Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136およびLefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27:209-212を参照。これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体または断片）は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＣＤ３に同時に結合する。一部の実施形態では、二重特異性分子は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する単鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、およびＣＤ３に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。

本明細書で使用される場合、「ヒトＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体複合体の一部としてヒトＴ細胞上に発現される抗原を表し、ＣＤ３は、５つの異なる鎖：ＣＤ３－ε、ＣＤ３－γ、ＣＤ３－δ、ＣＤ３－ηおよびＣＤ３－ζからなる。

例えば、抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞上のＣＤ３のクラスター化により、抗原の結合に類似するが、Ｔ細胞サブセットのクローン特異性に非依存的なＴ細胞の活性化がもたらされる。したがって、その抗原結合ドメインのうちの１つでヒトＣＤ３に特異的に結合する二重特異性分子は、ヒトＴ細胞上に発現されるヒトＣＤ３複合体に結合することができ、標的細胞の除去／溶解を誘導することができ、そのような標的細胞は、二重特異性分子の他方の非ＣＤ３結合部分が結合する抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）を保有／提示している。ＣＤ３特異的結合剤（例えば、本明細書に開示される二重特異性分子）によるＣＤ３複合体の結合は、当技術分野で公知のＴ細胞の活性化をもたらす；例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレットまたは国際公開第２００４／１０６３８１号パンフレットを参照。一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、有利なことに、ｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏで標的細胞を除去／溶解することができる。対応する標的細胞は、その表面上に腫瘍抗原、例えば、二重特異性分子（すなわち、二重特異性分子の非ＣＤ３結合部分）の別の抗原結合ドメインによって認識されるＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２を発現するかまたは提示する細胞であり得る。一実施形態では、さらなる特異性は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に対するものである。

本開示の一実施形態では、二重特異性分子のＣＤ３特異的ドメインのＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、ＯＫＴ－３、Ｘ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２およびＦ１０１．０１からなる群から選択されるＣＤ３特異的抗体に由来する。これらの抗体のそれぞれは、当技術分野で十分に記載されている（例えば、米国特許第８００７７９６号明細書および米国特許第８８４０８８号明細書を参照）。

一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子のＣＤ３特異的ドメインは、配列番号５０（ＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ）として示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号４９（ＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）として示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ２、および／または配列番号４７（ＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ）もしくは配列番号４８（ＲＹＴＭＨ）として示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ１を含む。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性分子は、ＣＤ３特異的ドメインの１つまたは複数のＶ_Ｌ領域ＣＤＲを含む。ＣＤ３特異的ドメインのそのようなＶ_Ｌ領域ＣＤＲは、配列番号５３（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ）として示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ３、配列番号５２（ＤＴＳＫＶＡＳ）のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ２、および／または配列番号５１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）として示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ１を含む。

一実施形態では、二重特異性分子は、１つの構築物（例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ）においてＣＤ３に特異的に結合する抗体のＶ_Ｈおよび／またはＶ_ＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

一実施形態では、二重特異性分子の前記ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２特異的ドメインは、配列番号１１（ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ）に示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ３領域を含み、二重特異性分子の前記ＣＤ３特異的ドメインは、配列番号４９（ＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ）に示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ２領域を含み、および／または配列番号４７（ＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ）もしくは配列番号４８（ＲＹＴＭＨ）に示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＨＣＤＲ１領域を含む。一部の実施形態では、そのような二重特異性分子は、各々の抗原結合抗体のＶ_ＬＣＤＲをさらに含む。例えば、二重特異性分子の前記ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２特異的ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列（ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ）を含む少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ３領域、配列番号７（ＡＡＳ）のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ２領域を含み、および／または前記ＣＤ３特異的ドメインは、配列番号５１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ）として示されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＶ_ＬＣＤＲ１領域を含む。一実施形態では、上記で言及されたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、単一の二重特異性分子１つに含まれる。

本開示の一実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＣＤ３二重特異性分子は、抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。本開示の一実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＣＤ３二重特異性分子は、抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体の重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。本開示の一部の実施形態では、本開示のＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＣＤ３二重特異性分子は、抗ＣＤ３抗体の重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに抗ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体の重鎖および軽鎖両方のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

一実施形態では、本明細書で言及される抗ＣＤ３ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。Ｋａｂａｔ番号付けスキームは、抗体における残基の一貫した様式での番号付けのために広く採用されている基準である（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991。これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

本開示の一実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＣＤ３二重特異性分子は、
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）；および／または配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）；
ならびに
（ｂ）ＣＤ３特異的抗体（例えば、ＯＫＴ－３、Ｘ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＴＲ－６６、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２およびＦ１０１．０１からなる群から選択される抗体）由来のＣＤ３重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。

本開示の一実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＣＤ３二重特異性分子は、
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）；および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）；
ならびに
（ｂ）ＣＤ３特異的抗体（例えば、ＯＫＴ－３、Ｘ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＴＲ－６６、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２およびＦ１０１．０１からなる群から選択される抗体）由来のＣＤ３重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性は、活性化シグナルおよび抑制シグナルの両方を含む複雑な機構によって調節される。ＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞のＮＫ細胞媒介性の認識および殺滅において重要な役割を果たす、いくつかの異なるＮＫ細胞受容体が同定されている。受容体の１つは、ＮＫ細胞に特異的ではないが、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）であり、これはＮＫ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する。別のＮＫ細胞受容体は、ＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＮＫｐ４６である。これはＮＫ細胞に特異的であり、特異的なｍＡｂによって誘導されるその架橋は強いＮＫ細胞活性化を招き、それは細胞内Ｃａ＋＋レベルの増加、細胞傷害性の誘導、およびリンホカイン遊離をもたらす。

一部の態様では、本開示の二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体または断片）は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＮＫｐ４６に同時に結合する。一部の実施形態では、本開示の二重特異性分子は、腫瘍細胞上に発現または提示されたＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＮＫ細胞上に発現されたＮＫｐ４６に同時に結合する。一部の実施形態では、本二重特異性分子は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２を認識する単鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、およびＮＫｐ４６に結合するその抗体または抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。ＮＫｐ４６に特異的に結合する抗体および／または抗原結合断片は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第１５／１９７５９３号パンフレット、国際公開第１７／１１４６９４号パンフレットを参照）。

一部の実施形態では、本開示の二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体または断片）は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＣＤ１６Ａに同時に結合する。一部の実施形態では、本開示の二重特異性分子は、腫瘍細胞上に発現または提示されたＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２およびＮＫ細胞上に発現されたＣＤ１６Ａに同時に結合する。一部の実施形態では、本二重特異性分子は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２を認識する単鎖可変（ｓｃＦｖ）断片、およびＣＤ１６Ａに結合するその抗体または抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。ＣＤ１６Ａに特異的に結合する抗体および／または抗原結合断片は、当技術分野で公知である（例えば、Stein et al., (2012) Antibodies 1:88-123、およびそこに引用されている参考文献を参照）。

一部の実施形態では、本開示によって提供される二重特異性分子のＮＫ細胞への結合により、ＮＫ細胞が活性化される。一部の実施形態では、本開示によって提供される二重特異性分子のＮＫ細胞への結合により、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性が誘導される。一部の実施形態では、本開示によって提供される二重特異性抗体のＮＫ細胞への結合により、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が誘導される。

したがって、一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；および
（ｉｉ）以下のもの：ＣＤ３、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ、ＴＧＦ－β、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＤまたはＤＮＡＭ－１のうちの１つに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。

一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；および
（ｉｉ）ＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞上に発現されたヒトＣＤ３に特異的に結合する。

一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；および
（ｉｉ）ＮＫｐ４６（例えば、ヒトＮＫｐ４６）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現されたヒトＮＫｐ４６に特異的に結合する。

一部の実施形態では、本開示は、
（ｉ）クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；および
（ｉｉ）ＣＤ１６Ａ（例えば、ヒトＣＤ１６Ａ）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫ細胞上に発現されたヒトＣＤ１６Ａに特異的に結合する。

一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、以下のものから選択されるアミノ酸配列を含む：ＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）。一実施形態では、ＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。

一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループを含むＨＬＡ－Ａアレルによってコードされる。一部の実施形態では、ＨＬＡ－ＡアレルはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、それぞれ配列番号９、１０および１１に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３配列、ならびに／またはそれぞれ配列番号６、７および８に示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含む。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、それぞれ配列番号９、１０および１１に示されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号６、７および８に示されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３配列を含む。

一部の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２を含み、第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、およびＦａｂ、またはＦ（ａｂ’）２を含む。

本開示に従って使用される抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖を、当技術分野で公知の従来の手法を使用して、例えば、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加、および／もしくは組換え、ならびに／または当技術分野で公知の任意の他の改変を単独または組合せのいずれかで使用することによって、さらに改変することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にそのような改変を導入するための方法は、当業者に周知である；例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.を参照。言及された改変は好ましくは核酸レベルで行われる。

二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む種々の方法によって作製することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照。伝統的に、二重特異性抗体の組換え作製は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいており、２つの重鎖／軽鎖対は、異なる特異性を有する（Milstein and Cuello, (1983) Nature 305:537-539）。所望の結合特異性（抗体－抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。重鎖可変領域の融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。二重特異性抗体を生成させるための例示的な現在知られる方法のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., (1986) Methods Enzymol. 121:210; PCT Publication No. WO 96/27011; Brennan et al., (1985) Science 229:81; Shalaby et al., J. Exp. Med. (1992) 175:217-225; Kostelny et al., (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Gruber et al., (1994) J. Immunol. 152:5368;およびTutt et al., (1991) J. Immunol. 147:60を参照。二重特異性抗体には、架橋抗体またはヘテロコンジュゲート抗体も含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して製造することができる。好適な架橋剤は当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に、多数の架橋手法とともに開示されている。

組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を製造し、単離するための様々な手法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されている。例えば、Kostelny et al. (1992) J Immunol 148(5):1547-1553を参照。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結され得る。抗体ホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロ二量体を形成することができる。この方法を、抗体ホモ二量体の作製のために利用することもできる。Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448によって記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的な機構を提供している。この断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を許容するには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと強制的に対合し、それによって２つの抗原結合部位が形成される。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。例えば、Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368を参照。あるいは、抗体は、例えば、Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062に記載されているような「直鎖状抗体」であり得る。手短に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。

本開示はまた、多重特異性抗体のバリアント形態、例えば、Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1290-1297に記載されている二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－Ｉｇ）分子も包含する。ＤＶＤ－Ｉｇ分子は、２つの異なる親抗体からの２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、組換えＤＮＡ技術によって直接または短いリンカーを介してタンデムに連結され、次いで軽鎖定常ドメインが連結されるように設計される。同様に、重鎖は、タンデムに連結された２つの異なる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く定常ドメインＣＨ１およびＦｃ領域を含む。２つの親抗体からＤＶＤ－Ｉｇ分子を製造するための方法は、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第０８／０２４１８８号パンフレットおよび国際公開第０７／０２４７１５号パンフレットにさらに記載されている。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、第２の特異性を有する軽鎖可変領域が抗体全体の重鎖可変領域に融合されているＦａｂ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリンである。そのような抗体は、例えば、国際特許出願公開第２０１５／１０３０７２号パンフレットに記載されている。

キメラ抗原受容体
一態様では、細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含む、ＣＡＲが本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ネオ抗原（例えば、がんネオ抗原または腫瘍ネオ抗原）に結合する細胞外ドメインを含む。がんネオ抗原は、がん細胞に起こる変異が原因で、そのようながん細胞のみに存在する抗原である。がん抗原は、細胞内で発現されて、ＭＨＣクラスＩタンパク質によってがん細胞の表面に提示され得る。例えば、本明細書で想定されるＣＡＲによって標的化されるがんネオ抗原は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２であり得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を製造することができる。一実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを生成させる。ある特定の実施形態では、細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外結合ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含み、そのような抗体、その抗原結合断片、または二重特異性分子が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ）に結合する、ＣＡＲが本明細書において提供される。

ＣＡＲは、遺伝子操作された人工的な膜結合タンパク質であり、免疫エフェクター細胞において発現された場合に、そのような免疫エフェクター細胞を抗原に導き、一般に、免疫エフェクター細胞を刺激して、抗原を提示する細胞を殺滅する。したがって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用して、免疫エフェクター細胞に所望の抗原特異性、例えば、抗腫瘍特異性を付与することができる（特に、抗原特異性はＣＡＲの細胞外ドメインによって付与される）。

ＣＡＲは一般に、細胞上に提示される１つまたは複数の抗原に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外ドメインが１つまたは複数の抗原に結合した際に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達する細胞内ドメインとを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、以下の３つのドメインを含有する：１）典型的にはシグナルペプチド、リガンドまたは抗原認識領域（例えば、ｓｃＦｖ）および可動性スペーサーを含む、細胞外ドメイン；２）膜貫通（ＴＭ）ドメイン；３）典型的には１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン（細胞質ドメインとしても知られる）。ＣＡＲの細胞外ドメインは細胞の外側に存在し、細胞外空間に露出されているため、そのリガンド／抗原との相互作用のためにアクセス可能である。ＴＭドメインは、ＣＡＲがエフェクター細胞の細胞膜に係留されることを可能にする。ＣＡＲの細胞内ドメインは、細胞外ドメインの由来となったタンパク質とは異なるシグナル伝達タンパク質に由来する１つまたは複数の細胞質ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、ＣＡＲがそのリガンド／抗原に結合した際にエフェクター細胞活性化を助ける。一部の実施形態では、エフェクター細胞活性化は、サイトカインおよびケモカインの産生の誘導、ならびにエフェクター細胞の細胞溶解活性の活性化を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞傷害性を腫瘍細胞へと再方向付けする。

ＣＡＲの抗原結合ドメインと標的細胞の表面上のその標的抗原とのエンゲージメントは、ＣＡＲのクラスター化をもたらし、活性化刺激をＣＡＲ含有細胞に送達する。一部の実施形態では、ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性を再方向付けし、それによって、増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス、またはモノクローナル抗体、可溶性リガンド、もしくは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）非依存的な様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発する、その能力である。ＣＤ３ζまたはＦｃＲｙからのシグナル伝達ドメインを含有するように操作されたｓｃＦｖに基づくＣＡＲは、Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能のための強力なシグナルを送達することが示されているが、共刺激シグナルがない場合にＴ細胞の生存および増殖を促進するシグナルを誘発するには十分ではない可能性がある。結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζまたはＦｃＲｙに由来するシグナル伝達ドメインを、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４およびＣＤ２７８に由来する細胞内共刺激ドメイン）とともに含有する新世代のＣＡＲは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞において、より効果的に抗腫瘍活性を導くことに加えて、サイトカイン分泌、溶解活性、生存および増殖を増加させることが、ｉｎｖｉｔｒｏ、動物モデルおよびがん患者において示されている（Milone et al., Molecular Therapy, 2009; 17: 1453-1464; Zhong et al., Molecular Therapy, 2010; 18: 413-420; Carpenito et al., PNAS, 2009; 106:3360-3365）。

一部の態様では、細胞外（抗原結合）ドメイン、膜貫通ドメイン、および抗原結合ドメインが抗原に結合した場合にＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζ配列の細胞質配列を含む細胞内（細胞質）ドメイン、ならびに任意選択で、抗原結合ドメインが抗原に結合した場合にＴ細胞の共刺激をもたらす、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、または４つの）共刺激タンパク質の細胞質配列（例えば、Ｂ７－Ｈ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１２、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドのうちの１つまたは複数の細胞質配列）を含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、リンカーをさらに含み得る。例示的な細胞外（抗原結合）ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内（細胞質）ドメインを含む、ＣＡＲおよびＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞のさらなる態様は、例えば、Kakarla et al., Cancer J. 20:151-155, 2014; Srivastava et al., Trends Immunol. 36:494-502, 2015; Nishio et al., Oncoimmunology 4(2): e988098, 2015; Ghorashian et al., Br. J. Haematol. 169:463-478, 2015; Levine, Cancer Gene Ther. 22:79-84, 2015; Jensen et al., Curr. Opin. Immunol. 33:9-15, 2015; Singh et al., Cancer Gene Ther. 22:95-100, 2015; Li et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1753-1756, 2014; Gill et al., Immunol. Rev. 263:68-89, 2015; Magee et al., Discov. Med. 18:265-271, 2014; Gargett et al., Front. Pharmacol. 5:235, 2014; Yuan et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 22:1137-1141, 2014; Pedgram et al., Cancer J. 20:127-133, 2014; Eshhar et al., Cancer J. 20:123-126, 2014; Ramos et al., Cancer J. 20:112-118, 2014; Maus et al., Blood 123:2625-2635, 2014; Jena et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 9:50-56, 2014; Maher et al., Curr. Gene Ther. 14:35-43, 2014; Riches et al., Discov. Med. 16:295-302, 2013; Cheadle et al., Immunol. Rev. 257:83-90, 2014; Davila et al., Int. J. Hematol. 99:361-371, 2014; Xu et al., Cancer Lett. 343:172-178, 2014; Kochenderfer et al., Nat. Rev. Clin. Oncol. 10:267-276, 2013; Hosing et al., Curr. Hematol. Malig. Rep. 8:60-70, 2013; Hombach et al., Curr. Mol. Med. 13:1079-1088, 2013; Xu et al., Leuk. Lymphoma 54:255-260, 2013; Gilham et al., Trends Mol. Med. 18:377-384, 2012; Lipowska-Bhalla et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:953-962, 2012; Chmielewski et al., Cancer Immunol. Immunother. 61:1269-1277, 2013; Jena et al., Blood 116:1035-1044, 2010; Dotti et al, Immunology Reviews 257(1): 107-126, 2013; Dai et al., Journal of the National Cancer Institute 108(7): djv439, 2016; Wang and Riviere, Molecular Therapy-Oncolytics 3: 16015, 2016；米国特許出願公開第２０１８／００５７６０９号明細書号明細書；同２０１８／００３７６２５号明細書；同２０１７／０３６２２９５号明細書；同２０１７／０１３７７８３号明細書；同２０１６／０１５２７２３号明細書、同２０１６／０２０６６５６号明細書、同２０１６／０１９９４１２号明細書、同２０１６／０２０８０１８号明細書、同２０１５／０２３２８８０号明細書、同２０１５／０２２５４８０号明細書；同２０１５／０２２４１４３号明細書；同２０１５／０２２４１４２号明細書；同２０１５／０１９０４２８号明細書；同２０１５／０１９６５９９号明細書；同２０１５／０１５２１８１号明細書；同２０１５／０１４００２３号明細書；同２０１５／０１１８２０２号明細書；同２０１５／０１１０７６０号明細書；同２０１５／００９９２９９号明細書；同２０１５／００９３８２２号明細書；同２０１５／００９３４０１号明細書；同２０１５／００５１２６６号明細書；同２０１５／００５０７２９号明細書；同２０１５／００２４４８２号明細書；同２０１５／００２３９３７号明細書；同２０１５／００１７１４１号明細書；同２０１５／００１７１３６号明細書；同２０１５／００１７１２０号明細書；同２０１４／０３７００４５号明細書；同２０１４／０３７００１７号明細書；同２０１４／０３６９９７７号明細書；同２０１４／０３４９４０２号明細書；同２０１４／０３２８８１２号明細書；同２０１４／０３２２２７５号明細書；同２０１４／０３２２２１６号明細書；同２０１４／０３２２２１２号明細書；同２０１４／０３２２１８３号明細書；同２０１４／０３１４７９５号明細書；同２０１４／０３０８２５９号明細書；同２０１４／０３０１９９３号明細書；同２０１４／０２９６４９２号明細書；同２０１４／０２９４７８４号明細書；同２０１４／０２８６９７３号明細書；同２０１４／０２７４９０９号明細書；同２０１４／０２７４８０１号明細書；同２０１４／０２７１６３５号明細書；同２０１４／０２７１５８２号明細書；同２０１４／０２７１５８１号明細書；同２０１４／０２７１５７９号明細書；同２０１４／０２５５３６３号明細書；同２０１４／０２４２７０１号明細書；同２０１４／０２４２０４９号明細書；同２０１４／０２２７２７２号明細書；同２０１４／０２１９９７５号明細書；同２０１４／０１７０１１４号明細書；同２０１４／０１３４７２０号明細書；同２０１４／０１３４１４２号明細書；同２０１４／０１２０６２２号明細書；同２０１４／０１２０１３６号明細書；同２０１４／０１０６４４９号明細書；同２０１４／０１０６４４９号明細書；同２０１４／００９９３４０号明細書；同２０１４／００８６８２８号明細書；同２０１４／００６５６２９号明細書；同２０１４／００５０７０８号明細書；同２０１４／００２４８０９号明細書；同２０１３／０３４４０３９号明細書；同２０１３／０３２３２１４号明細書；同２０１３／０３１５８８４号明細書；同２０１３／０３０９２５８号明細書；同２０１３／０２８８３６８号明細書；同２０１３／０２８７７５２号明細書；同２０１３／０２８７７４８号明細書；同２０１３／０２８０２２１号明細書；同２０１３／０２８０２２０号明細書；同２０１３／０２６６５５１号明細書；同２０１３／０２１６５２８号明細書；同２０１３／０２０２６２２号明細書；同２０１３／００７１４１４号明細書；同２０１２／０３２１６６７号明細書；同２０１２／０３０２４６６号明細書；同２０１２／０３０１４４８号明細書；同２０１２／０３０１４４７号明細書；同２０１２／００６０２３０号明細書；同２０１１／０２１３２８８号明細書；同２０１１／０１５８９５７号明細書；同２０１１／０１０４１２８号明細書；同２０１１／００３８８３６号明細書；同２００７／００３６７７３号明細書；および同２００４／００４３４０１号明細書に記載されている。例示的な細胞外（抗原結合）ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内（細胞質）ドメインを含むＣＡＲおよびＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞のさらなる態様は、国際公開第２０１６／１６８５９５号パンフレット；国際公開第１２／０７９０００号パンフレット；同２０１５／０１４１３４７号パンフレット；同２０１５／００３１６２４号パンフレット；同２０１５／００３０５９７号パンフレット；同２０１４／０３７８３８９号パンフレット；同２０１４／０２１９９７８号パンフレット；同２０１４／０２０６６２０号パンフレット；同２０１４／００３７６２８号パンフレット；同２０１３／０２７４２０３号パンフレット；同２０１３／０２２５６６８号パンフレット；同２０１３／０１１６１６７号パンフレット；同２０１２／０２３０９６２号パンフレット；同２０１２／０２１３７８３号パンフレット；同２０１２／００９３８４２号パンフレット；同２０１２／００７１４２０号パンフレット；同２０１２／００１５８８８号パンフレット；同２０１１／０２６８７５４号パンフレット；同２０１０／０２９７０９３号パンフレット；同２０１０／０１５８８８１号パンフレット；同２０１０／００３４８３４号パンフレット；同２０１０／００１５１１３号パンフレット；同２００９／０３０４６５７号パンフレット；同２００４／００４３４０１号パンフレット；同２０１４／０３２２２５３号パンフレット；同２０１５／０１１８２０８号パンフレット；同２０１５／００３８６８４号パンフレット；同２０１４／００２４６０１号パンフレット；同２０１２／０１４８５５２号パンフレット；同２０１１／０２２３１２９号パンフレット；同２００９／０２５７９９４号パンフレット；同２００８／０１６０６０７号パンフレット；同２００８／０００３６８３号パンフレット；同２０１３／０１２１９６０号パンフレット；同２０１１／００５２５５４号パンフレット；および同２０１０／０１７８２７６号パンフレットに記載されている。

一部の態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含むＣＡＲであって、細胞外ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の態様では、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外結合ドメインが、本明細書に記載されるいずれかの抗体、もしくはその抗原結合断片、または二重特異性分子を含み、そのような抗体、その抗原結合断片、または二重特異性分子が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合するＣＡＲが、本明細書において提供される。

一部の態様では、実施例の項に記載されている、ＮＰＭ１ｃＣＡＲの細胞内、膜貫通および／または細胞外ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、本明細書において提供される（例えば、実施例３を参照）。

一部の態様では、以下：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２、からなる群から選択される、１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインと、任意選択で、４－１ＢＢ共刺激ドメインとを含む細胞内ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の態様では、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の態様では、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）変異型ヌクレオフォスミンタンパク質エピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ）を含む抗原に特異的に結合する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬを含む、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲであって、ＶＨが、配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ２、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＶＨを含み、ならびに／または配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲであるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨを含み、ならびに／または配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲであるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬを含む、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ、または配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。

本明細書に提供されるＣＡＲの細胞外、膜貫通および細胞内ドメインの例について、以下に記載する。

ＣＡＲの細胞外（抗原結合）ドメインを含む、抗体抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）（例えば、完全ヒト抗体またはキメラ（例えば、ヒト化）抗体）、抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）_２断片）（例えば、完全ヒト抗体またはキメラ（例えば、ヒト化）抗体の断片）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ，（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦａｂ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ｈｃ－ＩｇＧ、ＢｉＴＥ、単一ドメイン抗体（例えば、Ｖ－ＮＡＲドメインまたはＶｈＨドメイン）、ＩｇＮＡＲ、および多重特異性（例えば、二重特異性抗体）抗体。一実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。これらの抗原結合ドメインを製造する方法は当技術分野で公知である。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的抗原に特異的に結合し得る抗体、例えば、免疫グロブリン分子（例えば、軽鎖または重鎖免疫グロブリン分子）および免疫グロブリン分子の免疫学的活性（抗原結合）断片の、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの）ＣＤＲ（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン由来の３つのＣＤＲのうちのいずれか、および／または免疫グロブリン重鎖可変ドメイン由来の３つのＣＤＲのうちのいずれか）を含む。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖抗体（例えば、Ｖ－ＮＡＲドメインもしくはＶ_ＨＨドメイン、または本明細書に記載される単鎖抗体のいずれか）である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体分子全体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）またはマルチマー抗体（例えば、二重特異性抗体）である。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインには、抗体断片および多重特異性（例えば、二重特異性）抗体または抗体断片が含まれる。抗体およびその抗原結合断片の例には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含有する断片が含まれるが、これらには限定されない。

本明細書において提供されるさらなる抗原結合ドメインは、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性（マルチマー、例えば、二重特異性）の、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ）、単鎖抗体、細胞内で生成される抗体（すなわち、イントラボディ）、およびそれらの抗原結合断片である。抗体またはその抗原結合断片は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、またはサブクラスのものであり得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合断片である。一部の例では、抗原結合ドメインは、ＩｇＧ４抗体またはその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含む免疫グロブリンである。

抗原結合ドメインのさらなる例は、ＩｇＧの抗原結合断片（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の抗原結合断片）（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ、例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４の抗原結合断片）、ＩｇＡの抗原結合断片（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２の抗原結合断片）（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ、例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２の抗原結合断片）、ＩｇＤの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＤの抗原結合断片）、ＩｇＥの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＥの抗原結合断片）、またはＩｇＭの抗原結合断片（例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＭの抗原結合断片）である。

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、例えば、食塩水中またはリン酸緩衝食塩水中で、特定の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に、約１×１０^－７Ｍまたはより強い（例えば、約１×１０^－８Ｍもしくはより強い、約１×１０^－９Ｍもしくはより強い、約５００ｎＭもしくはより強い、約１００ｎＭもしくはより強い、約２５ｎＭもしくはより強い、約１５ｎＭもしくはより強い、約７ｎＭもしくはより強い、約５ｎＭまたはそれ未満、または約１ｎＭもしくはより強い）親和性（Ｋ_Ｄ）で結合することができる。

当業者には理解されるように、ＣＡＲに含められる抗原結合ドメインの選択は、それを必要とする対象において標的とされる細胞（例えば、がん細胞または腫瘍）の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインを、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、例えば、がんネオ抗原を認識するように選択してもよい。例えば、腫瘍特異的抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＭＰ１ｃネオ抗原であってもよい。一部の実施形態では、ＮＭＰ１ｃネオ抗原は、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。

一部の実施形態では、ＣＡＲ分子は、急性骨髄性白血病の腫瘍抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、例えば、急性骨髄性白血病ネオ抗原である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体内の他の細胞上には存在しない。一実施形態では、腫瘍抗原は腫瘍特異的抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍特異的抗原は、患者の腫瘍細胞を配列決定し、腫瘍中にのみ見出される変異したタンパク質を同定することによって決定される。これらの抗原は、「ネオ抗原」と称される。ネオ抗原がひとたび同定されると、それに対して治療用抗体を産生させて、本明細書に記載される方法に使用することができる。一実施形態では、ネオ抗原はＮＰＭ１ｃネオ抗原である。一実施形態では、ＮＭＰ１ｃネオ抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成している（またはそれによって提示される）。

ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）によって標的化し得る腫瘍抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ））には、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２が含まれるが、これには限定されない。一実施形態では、腫瘍特異的抗原はＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２である。

ＣＡＲのドメイン間のリンカー
任意選択でリンカーを、（１）細胞外（抗原結合）ドメインと膜貫通ドメインの間、および／または（２）膜貫通ドメインと細胞内（細胞質）ドメインの間に含み得るＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカーであり得る。例えば、リンカーは、約１アミノ酸と約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、約６アミノ酸、約４アミノ酸、もしくは約２アミノ酸の間；約２アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、約６アミノ酸、もしくは約４アミノ酸まで；約４アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、約８アミノ酸、もしくは約６アミノ酸まで；約６アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、約１０アミノ酸、もしくは約８アミノ酸まで；約８アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、約１２アミノ酸、もしくは約１０アミノ酸まで；約１０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、約１４アミノ酸、もしくは約１２アミノ酸まで；約１２アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、約１６アミノ酸、もしくは約１４アミノ酸まで；約１４アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、約１８アミノ酸、もしくは約１６アミノ酸まで；約１６アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、約２０アミノ酸、もしくは約１８アミノ酸まで；約１８アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、約２５アミノ酸、もしくは約２０アミノ酸まで；約２０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、約３０アミノ酸、もしくは約２５アミノ酸まで；約２５アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、約３５アミノ酸、もしくは約３０アミノ酸まで；約３０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、約４０アミノ酸、もしくは約３５アミノ酸まで；約３５アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、約５０アミノ酸、もしくは約４０アミノ酸まで；約４０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、約６０アミノ酸、もしくは約５０アミノ酸まで；約５０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、約７０アミノ酸、もしくは約６０アミノ酸まで；約６０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、約８０アミノ酸、もしくは約７０アミノ酸まで；約７０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、約９０アミノ酸、もしくは約８０アミノ酸まで；約８０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、約１００アミノ酸、もしくは約９０アミノ酸まで；約９０アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、約２００アミノ酸、もしくは約１００アミノ酸まで；約１００アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、約３００アミノ酸、もしくは約２００アミノ酸まで；約２００アミノ酸から約５００アミノ酸、約４００アミノ酸、もしくは約３００アミノ酸まで；約３００アミノ酸から約５００アミノ酸もしくは約４００アミノ酸まで；または約４００アミノ酸から約５００アミノ酸までの長さを有し得る。

ＣＡＲの膜貫通ドメイン
本明細書に提供されるＣＡＲは、膜貫通ドメインも含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、天然の供給源に由来し得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用し得る膜貫通ドメインの非限定的な例は、Ｔ細胞受容体のα、β、もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来し得る（例えば、その少なくとも膜貫通配列、またはその膜貫通配列の一部を含む）。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４分子由来である。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８分子由来である。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは合成性であり得る。例えば、膜貫通ドメインが合成供給源に由来する一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性残基（例えば、ロイシンおよびバリン）を含む（例えば、主として含む）ことができる。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインは、合成膜貫通ドメインの末端に、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットを、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ）含むと考えられる。一部の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインを含み得る。

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞質ドメイン内の配列に天然に付随している。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、そのドメインの他の膜貫通ドメイン（例えば、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメイン）への結合を回避するための１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個の）アミノ酸置換によって改変され得る。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ζ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３－ζ、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。これらの実施形態のうちの一部では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、以下のもの：ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される共刺激分子の共刺激ドメインを含む。

ＣＡＲの細胞内（細胞質）ドメイン
細胞内ドメインは、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージの活性化を引き起こすシグナルを伝達するように機能することが知られている任意のポリペプチドドメインであり得る。そのようなドメインまたはモチーフは、ＣＡＲの細胞外ドメインの標的抗原への結合に応答したＴリンパ球の活性化のために必要な一次抗原結合シグナルを伝達することができる。細胞内ドメインの例には、ＩＬＲ鎖、ＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζが含まれるが、これらに限定されない。

典型的には、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ）を含む。

一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達配列（例えば、そのＩＴＡＭ含有部分）であるか、またはそれを含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、リンパ球受容体鎖を含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、ＴＣＲ／ＣＤＲ３複合体タンパク質を含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、Ｆｃ受容体サブユニットを含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ－２受容体サブユニットを含む。

本明細書に提供されるＣＡＲの細胞内ドメインは、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含むことができる：ＴＣＲを介した抗原依存性活性化を開始させるシグナル伝達配列（初代細胞質シグナル伝達配列）（例えば、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達配列）、および二次または共刺激シグナルを与えるように抗原非依存的様式で作用する共刺激タンパク質のうちの１つまたは複数の細胞質配列（二次細胞質シグナル伝達配列）。

ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインが抗原に結合した場合にＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζの細胞質配列、および任意選択で、Ｔ細胞の共刺激をもたらす、共刺激タンパク質のうちの１つまたは複数の細胞質配列（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＣＤ２４４、ＣＤ８０、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１２、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、および本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知であるＩＴＡＭ配列のいずれかのうちの１つまたは複数の細胞質配列）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメイン全体が、ＣＡＲの細胞内ドメインに含められる。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分（例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞においてエフェクター機能シグナルを伝達する細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分）を含む。細胞内ドメインに含めることができる細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、抗原受容体のエンゲージメント後にシグナル伝達を開始するために協働して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびに少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個）の置換を含み、同じまたはほぼ同じ機能的能力を有する、これらの配列の任意のバリアントが挙げられる。

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを、それ自体で、またはＣＡＲの状況において有用な任意の他の所望の細胞質シグナル伝達配列と組み合わせて含むように設計することができる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激細胞質シグナル伝達配列を含み得る。共刺激細胞質シグナル伝達配列は、共刺激タンパク質（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド）の細胞質シグナル伝達配列を含むＣＡＲの一部分を指す。

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序で配置される。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメイン内の細胞質シグナル伝達配列は、特定の順序で互いに連結される。一部の実施形態では、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカーのいずれか）を、異なる細胞質シグナル伝達配列の間に連鎖を形成するために使用することができる。

一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質ＣＤ２８の細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列および共刺激タンパク質４－ＩＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達配列ならびに共刺激タンパク質ＣＤ２８および４－１ＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、４－１ＢＢの細胞質シグナル伝達配列を含まない。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－ｌＢＢとしても知られる）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０としても知られる）およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）などのタンパク質に由来する１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７に由来する共刺激ドメインを含まない。

ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、サイトカインをさらに含む。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、自己切断性ドメイン（例えば、Ｐ２Ａ自己切断性ペプチド）およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ドメインの切断によりサイトカインが放出される。一部の実施形態では、自己切断性ドメイン（例えば、Ｐ２Ａ自己切断性ペプチド）およびサイトカインは、ＣＡＲタンパク質およびその細胞内ドメインのＣ末端に配置される。一部の実施形態では、サイトカインは、以下のもの：ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＧＦ－βおよびＣＣＬ１９のうちの１つまたは複数である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１２である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－７である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１３である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１５である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－４である。一実施形態では、サイトカインはＩＬ－１０である。一実施形態では、サイトカインはＴＮＦ－αである。一実施形態では、サイトカインはＩＦＮ－γである。一実施形態では、サイトカインはＴＧＦ－βである。一実施形態では、サイトカインはＣＣＬ１９である。サイトカインを発現するように改変された免疫エフェクター細胞は、当技術分野で公知である（例えば、Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376; Liu et al., 2018, Leukemia 32:520-531を参照）。ある特定の実施形態では、サイトカインを発現させるための、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞の改変は、Adachi et al, 2018, Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4086; Liu et al., 2019, J. Immunol., doi:10.4049/jimmunol.1800033; Krenciute et al., 2017, Cancer Immunol. Res. 597):571-581, doi:10.1158/2326-6066,CIR-16-0376；もしくはLiu et al., 2018, Leukemia 32:520-531に記載されているものと同じであるか、またはそこに記載されている方法に従う。

ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞
一態様では、本明細書に記載されるいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫エフェクター細胞が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸によって形質転換された免疫エフェクター細胞が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞が、本明細書において提供される。

ＣＡＲを保有させるかまたは発現させるために使用し得る免疫エフェクター細胞としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）である。一実施形態では、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞である。一実施形態では、免疫エフェクター細胞はマクロファージである。

一部の態様では、本明細書に提供される免疫エフェクター細胞は、末梢血、臍帯血、またはリンパ液から単離されているか、または増大されている。

一部の態様では、本明細書に提供される免疫エフェクター細胞は、（本明細書に記載されるＣＡＲを発現するようなその改変の後に）それが投与される対象にとって自己性である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される免疫エフェクター細胞は、（本明細書に記載されるＣＡＲを発現するようなその改変の後に）それが投与される対象にとって同種性である。同種免疫エフェクター細胞を使用してＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を調製する場合、対象における移植片対宿主病の可能性を低下させる免疫エフェクター細胞を選択することができ、または免疫エフェクター細胞を１つもしくは複数の免疫抑制剤と同時投与することができる。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は対象から得られ、任意選択で増大されて、本明細書に記載されるＣＡＲを発現するポリヌクレオチドによって形質転換され、任意選択でさらに増大される。

一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、疾患または状態（例えば、がん、例えば、ＡＭＬ）を有する患者に由来し、本明細書に記載されるいずれかの抗原（例えば、ネオ抗原）に対する特異性を有する少なくとも１つのＣＡＲを発現するようにｉｎｖｉｔｒｏで遺伝子改変されている。例えば、抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質によって提示されるがんネオ抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンタンパク質ネオエピトープを含む抗原）であり得る。これらの実施形態の一部では、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）によって提示されるがんネオ抗原に対する特異性を有するＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、次いで、患者におけるがん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）を治療するために投与される。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リガンドまたは抗原のＣＡＲへの特異的結合によって刺激または誘導され、同じ患者の疾患または状態の治療のために有用な、少なくとも１つのエフェクター機能（例えば、サイトカインの誘導）を果たす。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、標的または標的細胞（例えば、がん細胞）に接触または近接した場合に、標的細胞上でそのエフェクター機能（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を発揮するＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）である（例えば、Chang and Chen (2017) Trends Mol Med 23(5):430-450を参照）。

（例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインのがんネオ抗原への結合による）ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞の刺激は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の１つまたは複数の抗がん活性の活性化をもたらし得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の刺激は、サイトカインの分泌を含む、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の細胞溶解活性またはヘルパー活性の増加をもたらし得る。

一部の実施形態では、ＣＡＲエフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、本明細書に記載されるいずれかの抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に結合するＣＡＲ分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲＴ細胞）を含む免疫エフェクター細胞は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した（またはそれによって提示される）ＮＰＭ１ｃネオエピトープ、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法において有用なＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）は、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。

Ｔ細胞のそのコグネイト抗原への長時間の曝露は、エフェクター機能の枯渇をもたらし、感染細胞または形質転換細胞の持続が可能になる。免疫チェックポイント阻害を誘導する薬剤を使用して宿主エフェクター機能を刺激または活性化するために最近開発された戦略は、いくつかのがんの治療で成功を収めている。新たな証拠により、Ｔ細胞の枯渇がキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）による長寿命の抗腫瘍活性の持続における重大な障害となる可能性が示唆されている。ＣＡＲ形質導入前の患者から採取したＴ細胞の分化状態、およびＣＡＲＴ細胞を再導入する前に患者が受ける移植前処理（例えば、アルキル化剤、フルダラビン、全身照射の追加または排除）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性および細胞傷害能に大きく影響し得る。Ｔ細胞集団を（抗ＣＤ３／ＣＤ２８または刺激細胞を介して）刺激し、（サイトカイン、例えばＩＬ－２を介して）増大させるｉｎｖｉｔｒｏ培養条件は、ＣＡＲＴ細胞の分化状態およびエフェクター機能も変化させ得る（Ghoneim et al., (2016) Trends in Molecular Medicine 22(12):1000-1011）。

ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を製造する方法
本明細書に記載されるいずれかのＣＡＲを含む、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のいずれかを生成させるために使用することができる方法が、本明細書において提供される。

一部の実施形態では、対象の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、キメラ抗原受容体によって遺伝子改変する（Sadelain et al., Cancer Discov. 3:388-398, 2013）。例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を用意し、キメラ抗原受容体をコードする組換え核酸を患者由来の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入して、ＣＡＲ細胞を生成させる。一部の実施形態では、対象に由来しない免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、キメラ抗原受容体によって遺伝子改変する。例えば、一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、「既製の」養子細胞療法、例えば、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社によって開発されているユニバーサルキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＵＣＡＲＴ）として使用されるように操作された同種細胞である。

当技術分野で公知の種々の異なる方法を使用して、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸のいずれか、または本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターを、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することができる。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に核酸を導入するための方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高度分岐有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマーに基づくトランスフェクション、光学的トランスフェクション、粒子に基づくトランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、またはリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用するトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インパレフェクション、流体力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション、およびヌクレオフェクションが挙げられる。さらに、当技術分野で公知のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術を使用して、ＣＡＲ核酸を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入し、および／または他の遺伝子改変（例えば、下記のように）を免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入して、ＣＡＲＴ細胞活性を増強することができる（ＣＡＲＴ細胞との関連におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の使用については、例えば、米国特許第９，８９０，３９３号明細書；米国特許第９，８５５，２９７号明細書；米国特許出願公開第２０１７／０１７５１２８号明細書；米国特許出願公開第２０１６／０１８４３６２号明細書；米国特許出願公開第２０１６／０２７２９９９号明細書；国際公開第２０１５／１６１２７６号パンフレット；国際公開第２０１４／１９１１２８号パンフレット；中国特許第１０６７５５０８８号明細書；中国特許第１０６５９１３６３号明細書；中国特許第１０６４８００９７号明細書；中国特許第１０６３９９３７５号明細書；中国特許第１０４８９４０６８号明細書を参照）。

一部の態様では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞を産生する方法は、（ｉ）末梢血、臍帯血またはリンパ液から（例えば、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）から）細胞を得るステップ、（ｉｉ）任意選択で、得られた細胞を精製するステップ、（ｉｉｉ）任意選択で、細胞を増大させるステップ、（ｉｖ）任意選択で、細胞を（例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合断片により）活性化するステップ、（ｖ）任意選択で、活性化された細胞を増大させるステップ、（ｖｉ）本明細書に記載されるＣＡＲを含む発現ベクターにより細胞に形質導入するステップ、（ｖｉｉ）ＣＡＲを発現する細胞を単離するステップ、および（ｖｉｉｉ）任意選択で、単離された細胞を増大させるステップを含む。

一部の態様では、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞を作製するための方法は、（ｉ）多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を得るステップ、（ｉｉ）ｉＰＳＣを誘導して免疫エフェクター細胞に（例えば、ＮＫ細胞、マクロファージまたはＴ細胞（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）に）分化させるステップ、（ｉｉｉ）任意選択で、免疫エフェクター細胞を増大させるステップ、（ｉｖ）本明細書に記載されるＣＡＲを含む発現ベクターにより免疫エフェクター細胞に形質導入するステップ、（ｖ）ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を単離するステップ、および（ｖｉ）任意選択で、単離された細胞を増大させるステップを含む。

組成物
一態様では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片を含む組成物（例えば、医薬組成物）が、本明細書において提供される。医薬組成物中の抗体または断片は精製されていてもよい。

一態様では、本明細書に開示される二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）を含む組成物（例えば、医薬組成物）が、本明細書において提供される。医薬組成物中の二重特異性分子は精製されていてもよい。

一態様では、本明細書に開示されるいずれかの免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲポリペプチド発現免疫エフェクター細胞）を含む組成物（例えば、医薬組成物）が、本明細書において提供される。

医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。賦形剤および安定剤を含むがこれらに限定されない、適切な薬学的に許容される担体が、当技術分野で公知である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAを参照）。

医薬組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体（例えば、本明細書において想定されるヒトまたは他の対象への投与のために好適な、１つまたは複数の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質）の中に、細胞、係留手段（例えば、脂質ナノ粒子）および／またはタンパク質もしくはペプチドを含む無菌組成物であり得る。担体は、有機または無機成分、天然性または合成性、であり得、それが細胞、係留手段（例えば、脂質ナノ粒子）および／またはタンパク質もしくはペプチドと組み合わされることで、投与が容易になる。医薬組成物の構成成分は、それらの所望の医薬効率を実質的に損なうと考えられる相互作用が起こらないような様式で混合される。

薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、分散剤、等張剤、湿潤剤、キレート剤、封鎖剤、ｐＨ緩衝剤、溶解促進剤、抗菌剤、麻酔剤、および／または抗酸化剤が挙げられるが、これらに限定されない。

医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための手法は、当技術分野で公知である（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照；これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内であると考えられるが、ただし、任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生じることによって、または別様に医薬組成物の他のいずれかの構成成分と有害な様式で相互作用することによって、物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除く。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング剤、圧縮補助剤、崩壊剤、色素（着色剤）、エモリエント、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング剤、滑剤（流動増強剤）、潤沢剤、保存剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、および水和の水が挙げられる。例示的な賦形剤としては、食塩水、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、スクロース、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、麦芽、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、デンプン（例えば、アルファ化デンプン）、プロピレン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、シリカゲル、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、タルク、ベースクリーム、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される塩を含み得る。本開示の組成物中に含まれ得る、薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の酸付加塩、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素塩、塩酸塩、ヨウ化水素塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの他、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。

医薬組成物は、対象（例えば、ヒト）への投与のために好適であるように製剤化することができる。医薬組成物は、任意の投与経路のために製剤化することができる。

医薬組成物は、それを全身性に送達することが望ましい場合には、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。そのような製剤は、注射の前に溶液または懸濁液にするのに好適な液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは固体形態として調製することができる。注射用の製剤は、例えば、アンプルまたは複数回投与容器の中にある、単位剤形として用意することができる。非経口用の医薬製剤には、成分の水溶液が含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有することができる。あるいは、成分の懸濁液を、油性の懸濁液として調製することもできる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、胡麻油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非経口的に投与される場合、好適な薬学的に許容される担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはグルコースを含有する溶液が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合断片、二重特異性分子またはＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、治療有効量で使用されるか、または本明細書に開示される医薬組成物中に治療有効量で存在することができる。治療有効量は、標準的な臨床手法によって決定することができる。

本明細書において想定される薬学的に許容される組成物は、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合断片、二重特異性分子またはＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞に加えて、追加の抗がん剤（例えば、本明細書に記載される任意の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の抗がん剤）を含み得る。

治療方法および使用
一態様では、本開示は、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する（例えば、がん増殖を抑制する、がん進行を抑制する）ための方法であって、本明細書に記載されるいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性がんを治療するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「ＮＰＭ１ｃ陽性がん」は、ＮＰＭ１遺伝子に変異（例えば、ＮＰＭ１における４ｎｔ重複変異）を有する腫瘍細胞を含むがんを指し、ＮＰＭ１における変異は、野生型ＮＰＭ１を発現する細胞と比較した場合に、ＮＰＭ１タンパク質の細胞質局在の増加をもたらす。特定の遺伝子変異（例えば、ＮＰＭ１における４ｎｔ重複変異）の存在を決定するために、がんにおける遺伝子発現を測定する方法は、当技術分野で公知であり、対象から収集した悪性腫瘍試料（例えば、血液、骨髄、腫瘍、および／または組織試料）の分析が含まれる。一部の態様では、遺伝子における小さな重複、挿入、または欠失を検出するための方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、液滴デジタルＰＣＲ、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング、および次世代シークエンシング（例えば、全ゲノムシークエンシング、例えば、全エクソームシークエンシング）を使用して行われる。一部の態様では、ＮＰＭ１ｃ陽性がんは、ＮＰＭ１遺伝子における変異（例えば、遺伝子のエクソン１２における４塩基対フレームシフト挿入、代替的リーディングフレームにおけるＣ末端１１アミノ酸をコードする変異、または以下のＣ末端アミノ酸配列：ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むタンパク質の発現をもたらすＮＰＭ１変異）を有することが検出される。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ陽性がんは、ＮＰＭ１タンパク質の細胞質局在が増加した腫瘍細胞を含む。ＮＰＭ１の細胞局在を評価する方法は当技術分野で公知であり、例えば、標識された抗ＮＰＭ１抗体を使用し、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによって局在を評価する。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ陽性がんから単離された腫瘍細胞は、健常な非がん性組織試料から単離された細胞と比較した場合に、ＮＰＭ１タンパク質の細胞質局在が増加している。

一部の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性がんの治療を必要とする対象においてＮＰＭ１ｃ陽性がんを治療する（例えば、がんの増殖または進行を抑制する）ための方法であって、本明細書に記載される抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載される二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。

一態様では、本開示は、ＡＭＬの治療を必要とする対象においてＡＭＬを治療する（例えば、ＡＭＬの増殖または進行を抑制する）ための方法であって、本明細書に記載されるいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、患者はヌクレオフォスミン１遺伝子における変異を持つ。一部の実施形態では、ＡＭＬは、ＮＰＭ１ｃ陽性腫瘍細胞またはヌクレオフォスミン１遺伝子における変異を発現する腫瘍細胞を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性ＡＭＬの治療を提供する。

ある特定の実施形態では、本開示の、抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、二重特異性分子、ＣＡＲポリペプチド、ＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を、がんを治療するための標的化免疫療法の開発に使用することができる。一部の実施形態では、がんはＮＰＭ１ｃ陽性がんである。

ある特定の実施形態では、本開示の、抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、二重特異性分子、ＣＡＲポリペプチド、ＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を、ＡＭＬの治療のために使用することができる。一部の実施形態では、ＡＭＬはＮＰＭ１ｃ陽性である。

ある特定の実施形態では、本開示の、抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、二重特異性分子、ＣＡＲポリペプチド、ＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を、ＡＭＬ細胞を殺滅するための細胞傷害性薬剤として使用することができる。一部の実施形態では、ＡＭＬ細胞、またはその亜集団は、ＮＰＭ１ｃ陽性である。

一部の実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ａ２をコードするアレル（すなわち、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレル）を保有する対象においてＮＰＭ１ｃ陽性がん（例えば、ＡＭＬ）を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃ陽性がん（例えば、ＡＭＬ）は、ＨＬＡ－Ａ２の発現を有する腫瘍細胞を含む。ＨＬＡ発現を決定する方法は当技術分野で公知であり、ＨＬＡ－Ａ２を認識する標識抗体を使用するフローサイトメトリー、免疫組織化学、およびウエスタンブロット法が含まれる。ＨＬＡ発現を、ＲＴ－ＰＣＲおよびＲＮＡシークエンシングによって決定することもできる。

ある特定の実施形態では、本開示は、がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）の治療を必要とする対象におけるがんの治療であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し、治療が、本明細書に記載されるいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、治療を提供する。

ある特定の実施形態では、本開示は、がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）の治療を必要とする対象におけるがんの治療であって、がんを含む細胞の細胞表面が、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされるタンパク質、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされるタンパク質）と複合体を形成したＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）ネオエピトープを提示し、治療が、本明細書に記載されるいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、治療を提供する。

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がん（例えば、がんはＮＰＭ１ｃ陽性であり、例えば、がんはＡＭＬである）を有する対象におけるがんの量の減少、または生存期間の延長を提供する。ある特定の実施形態では、がんを含む細胞の細胞表面は、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、配列番号１）を提示する。

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、がんから寛解している対象におけるがんの予防を提供する。

一実施形態では、がんは再発がんである。一実施形態では、がんは難治性がんである。一実施形態では、がんは進行期がんである。一実施形態では、がんは、１つまたは複数の他の治療法（例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、または別の免疫療法）に対して抵抗性である。

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるいずれかの抗体もしくは抗原結合断片、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含むいずれかの免疫エフェクター細胞、または本明細書に記載されるいずれかの医薬組成物を対象に投与するステップを含む、ＡＭＬの予防を必要とする対象におけるＡＭＬの予防を提供する。一実施形態では、本開示は、ＡＭＬから寛解している対象におけるＡＭＬの予防を提供する。

ある特定の実施形態では、治療しようとするがんはＡＭＬである。一部の実施形態では、がんは再発性ＡＭＬである。一部の実施形態では、がんは難治性ＡＭＬである。一部の実施形態では、がんは進行ＡＭＬである。一実施形態では、がんは、１つまたは複数の他の治療法（例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、または別の免疫療法）に対して抵抗性であるＡＭＬである。

本明細書に記載される任意の治療法の有効性は、（例えば、治療される対象または治療されるがんの動物モデルへの）治療法の前後のパラメーター（例えば、腫瘍量）を評価することによって評価することができる。当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して、本明細書に記載される治療法の治療有効性を評価することができる。

投与の方法
本明細書に記載される治療法は、非経口的な投与経路を含むがこれに限定されない任意の好適な手段によって対象に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、患者に非経口的に投与される。非経口的投与の好適な経路の非限定的な例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、腫瘍内、髄腔内および腹腔内投与が挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、静脈内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、腹腔内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、筋肉内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、皮下に投与される。ある特定の実施形態では、投与は、静脈内、髄腔内、骨内または脊髄内である。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、脊髄内または脊柱管内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、髄腔内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、骨内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、骨髄内に投与される。

適切な投与量は、治療される特定のがん、治療される対象の年齢、体重および身体状態、がんの重症度、投与の経路、治療の期間、治療される対象の反応性、同時または併用療法の性質（もしあれば）、具体的な投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門知識の範囲にある同様の要因によって異なると考えられる。ある特定の実施形態では、最大耐量、すなわち、堅実な医学的判断による最大の安全用量が使用されるべきである。好ましい態様では、治療法は、有効量で投与されるべきである。有効量は、医学的に望ましい結果を提供するのに十分な組成物の投与量である。

例えば、対象が腫瘍を有する場合、有効量は、（例えば、腫瘍を画像化することによって決定される）腫瘍体積または負荷を減少させる量であり得る。有効量を、血液または他の体液もしくは組織（例えば、生検試料）中のがん細胞の存在および／または頻度によって評価してもよい。腫瘍が組織または臓器の正常な機能に影響を及ぼしている場合、有効量は、組織または臓器の正常な機能を測定することによって評価することができる。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、約または少なくとも１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１００^１０、５×１００^１０、１×１０^１１、または５×１０^１１、１×１０^１１２、または５×１０^１２個（またはその間の任意の値もしくは範囲）の量で投与される。

単回投与またはある期間にわたる複数回投与を含む、本明細書に記載される治療法の様々な投薬スケジュールが想定されている。投与の方法には、ボーラス投与および注入（例えば、連続注入またはパルス注入）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載される方法に使用するための治療レジメンとしては、１週間に２回、毎週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、１か月間もしくは４週間ごとに１回、６週間ごとに１回、２か月間もしくは８週間ごとに１回、または３か月間もしくは１２週間ごとに１回の治療法の投与を挙げることができる。ある特定の実施形態では、対象は、本明細書に記載されるいずれかの治療法の単回の用量を投与される。ある特定の実施形態では、対象は、本明細書に記載されるいずれかの治療法の少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも８回、または少なくとも１０回の用量を投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、毎日、１日おきに、または１週間に２回投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される治療法は、ある期間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、または１年間にわたり投与される。

一部の実施形態では、最初の治療期間（治療法が、例えば、単回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に２回、または１か月間に１回投与される）に続いて、抗体が投与されない休薬期間（例えば、１週間、２週間、３週間、１か月間もしくは４週間、６週間、２か月間もしくは８週間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、または１年間にわたる）があり、次いで、第２の治療期間（治療法が、例えば、単回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に２回、または１か月間に１回投与される）がある。そのような最初の治療期間およびそのような第２の治療期間は、例えば、２週間、３週間、４週間、６週間、２か月間、または３か月間継続され得る（最初の治療期間は第２の治療期間と同じであってもよく、または異なってもよい）。

患者集団
本明細書に記載される方法に従って治療される対象としては、ヒトおよび非ヒト脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、哺乳動物、例えば、家飼いペット（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなど）、家畜または農業動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリまたは別の家禽）、ウマ（例えば、純血種のウマ）、サル、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）その他である。対象にはまた、魚類および他の水生動物種も含まれる。好ましい一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象はヒトである。一実施形態では、本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のための標的化免疫療法によって利益を得る可能性が高いと考えられるあらゆる対象において実施することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＮＰＭ１ｃ陽性がん（例えば、ＡＭＬ）を有する対象における使用のためのものである。

一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、本明細書に記載されるいずれかの免疫療法から利益を得ることができる（またはその可能性が高い）がんを有する（例えば、それを有すると診断された）任意の対象において実施することができる。がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）を有する対象は、検出可能ながん細胞を有する対象である。本開示は、がん（例えば、ＮＰＭ１ｃ陽性がん、例えば、ＡＭＬ）を有する対象に対する、本明細書に記載されるいずれかの抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、本明細書に記載されるいずれかの二重特異性分子、および本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現するいずれかの免疫エフェクター細胞の投与を想定している。

一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、ＮＰＭ１遺伝子における変異（例えば、遺伝子のエクソン１２における４塩基対フレームシフト挿入、代替的リーディングフレームにおけるＣ末端１１アミノ酸をコードする変異、または以下のＣ末端アミノ酸配列：ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むタンパク質の発現をもたらすＮＰＭ１変異）によって特徴付けられる（例えば、それを有することが知られている、有することが予想される、または有することが検出された）がんを有する、任意の対象において実施することができる。ある特定の実施形態では、本開示の治療方法および使用は、変異型ＮＰＭ１タンパク質（例えば、細胞質局在を有するＮＰＭ１ｃ変異型タンパク質、Ｃ末端ドメインにおける変異を有するタンパク質、フォールディングしたＣ末端ドメインを欠く変異型タンパク質、以下のＣ末端アミノ酸配列：ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むタンパク質、配列番号５６によって示されるタンパク質、またはＮＰＭ１ｃ）の発現によって特徴付けられる（例えば、発現することが知られている、発現することが予想される、または発現することが検出された）がんを有する、任意の対象において実施することができる。ＮＰＭ１ｃの変異したＣ末端配列は当技術分野で公知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、van der Lee et al., 2019, J. Clin. Invest. 129(2):774-785を参照。例えば、図１を参照）。一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、がんを有する任意の対象において実施することができ、そのがんを含む細胞の細胞表面は、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成した変異型ヌクレオフォスミンネオエピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ、例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を提示する（例えば、提示することが知られている、提示することが予想される、または提示することが検出された）。一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、がんを有する任意の対象において実施することができ、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）は、そのがんを含む細胞の細胞表面に、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を提示するかまたは呈する。

任意選択で、本明細書に記載される方法に従って治療される予定の見込みのある患者のがん細胞が、ＮＰＭ１遺伝子もしくはＮＰＭ１タンパク質における変異について検査され、またはがんを含む細胞の細胞表面がクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を含む抗原を提示するか否かを決定するために検査される。一部の態様では、そのような検査が、ＮＰＭ１遺伝子における変異もしくはＮＰＭ１タンパク質における変異に関して陽性である場合、またはクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ（例えば、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１））を含む抗原をがん細胞の細胞表面に提示していると決定された場合には、患者は、本明細書に記載される方法に従って治療される。

一部の態様では、本開示の治療方法および使用は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象において実施することができる。特定の一実施形態では、本開示の治療方法および使用は、ＡＭＬと診断された対象において実施される。

本明細書に記載される方法によって治療されるがんを診断するための検査は、当技術分野で公知であり、通常の医療従事者には熟知されていると考えられる。これらの臨床検査には、顕微鏡分析、培養依存性検査（培養など）、および核酸検出検査が挙げられるが、これらに限定されない。これらには、湿式マウント、染色増強顕微鏡検査、免疫顕微鏡検査（例えば、ＦＩＳＨ）、ハイブリダイゼーション顕微鏡検査、粒子凝集、酵素結合免疫吸着検定法、尿スクリーニング検査、ＤＮＡプローブハイブリダイゼーション、血清学的検査などが含まれる。医師は一般に、以上に列挙した臨床検査を実行することに加えて、全病歴を聴取し、完全な身体診察を行う。

ＡＭＬの検出のための方法には、白血病細胞に関するＰＢＭＣのフローサイトメトリーと、それに続くＮＰＭ１ｃ変異に関するＰＣＲおよび配列決定が含まれるが、これらに限定されない。ＡＭＬ診断のための臨床的方法は当技術分野で公知である。ＡＭＬ発症の危険因子には、喫煙、化学療法、放射線療法、特定の血液疾患、および加齢が含まれる。

一実施形態では、治療される対象は、早期がん（例えば、ＡＭＬ）と診断されている。一実施形態では、治療される対象は、進行期がん（例えば、ＡＭＬ）と診断されている。

一部の実施形態では、治療される対象は、ＡＭＬ進行のいずれかの段階にある。

一部の態様では、治療される対象は、以前に１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けている。ある特定の実施形態では、治療される対象は、以前に１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けており、対象のがんが再発している。ある特定の実施形態では、治療される対象は、以前に１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けており、対象は、１つまたは複数の他のがん治療に対して抵抗性を生じている。ある特定の実施形態では、治療される対象は、寛解状態にある（例えば、がんの部分寛解または完全寛解にある）。ある特定の実施形態では、治療される対象は、１つまたは複数の他のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）に対して難治性である。

他の実施形態では、本開示の治療方法および使用に従って、本明細書に記載されるいずれかの免疫療法から利益を得ることができる（または得られる可能性が高い）がんを発症するリスクのある対象を治療することが、本明細書において想定される。がん（例えば、ＡＭＬ）を発症するリスクのある対象は、がんを発症する確率が通常よりも高い対象である。これらの対象には、例えば、がんを発症する可能性の高さと関連することが実証されている遺伝子異常を有する対象、がんの家族性素因を有する対象、タバコ、アスベスト、または他の毒性化学物質などのがん原因物質（すなわち、発がん物質）に曝露された対象、およびがんの治療歴があって見かけ上は寛解状態にある対象が含まれる。本開示は、がん（例えば、ＡＭＬ）を発症するリスクのある対象への、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、本明細書に記載される二重特異性分子、および本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞の投与を想定している。

一実施形態では、治療される対象は成人である。一実施形態では、対象は、１８歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、２１歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、４５歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、６５歳以上のヒト対象である。一実施形態では、対象は、１８歳未満のヒト対象である。一実施形態では、対象は、４５歳未満（または１８歳から４５歳の間、もしくは２１歳から４５歳の間）のヒト対象である。一実施形態では、対象は、６５歳未満（または１８歳から６５歳の間、２１歳から６５歳の間、もしくは４５歳から６５歳の間）のヒト対象である。

併用療法
一部の態様では、本明細書に記載される治療方法および使用は、治療応答を増強する、例えば、対象における抗腫瘍応答を増強する、および／または腫瘍に対して細胞傷害性である（例えば、化学療法剤）、追加の薬剤による対象の治療をさらに含む。

一部の態様では、本明細書に記載される治療法は、１つまたは複数の抗がん療法、例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、抗がん活性を有する小分子、別の抗がん免疫療法（例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のＴ細胞療法）、または当技術分野で公知の任意の他の抗がん療法と組み合わせて、対象に投与される。

一部の態様では、本明細書に記載される、抗体、抗原結合抗体断片、二重特異性分子、またはそれを含む組成物のうちの１つまたは複数は、１つまたは複数の抗がん療法、例えば、化学療法、放射線療法、幹細胞移植、抗がん活性を有する小分子、別の抗がん免疫療法（例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のＴ細胞療法）、または当技術分野で公知の任意の他の抗がん療法と組み合わせて、対象に投与される。

一部の態様では、本明細書に記載される、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、またはそれを含む組成物のうちの１つまたは複数は、幹細胞移植または別の抗がん免疫療法（例えば、別の抗がん抗体もしくはその断片、または別のＴ細胞療法）と組み合わせて、対象に投与される。ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞による投与については、免疫エフェクター細胞の生存性に負の影響を及ぼさないと考えられるいずれかの併用療法が、本明細書において想定される。

併用療法における使用のために好適な治療薬には、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤を含む小分子化学療法薬、ならびに以下でさらに考察するものを含むがこれらに限定されない生物学的抗がん剤、例えば、抗がん抗体が含まれる。

一部の態様では、併用療法は、抗腫瘍免疫を増強するための免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、またはＣＴＬＡ－４阻害剤を、対象に投与するステップを含む。免疫チェックポイントの他のモジュレーターは、ＴＩＭ－３、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０ＬまたはＩＣＯＳを標的とすることができる。一実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は、抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３またはＯＸ－４０に対する拮抗抗体）である。別の実施形態では、免疫チェックポイントを調節する薬剤は、タンパク質モジュレーターまたは低分子モジュレーターである。別の実施形態では、薬剤（例えば、ｍＲＮＡ）は、免疫チェックポイントの抗体モジュレーターをコードする。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＴＩＭ－３阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＰＤ－１阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法が、ＣＴＬＡ－４阻害剤と組み合わせて投与される。併用療法に使用することができる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ペムブロリズマブ、アレムツズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＡＭＰ－２２４、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ－１２１０、ＴＳＲ－０４２、アフィマー、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ＢＭＳ９３６５５９、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＡＧＥＮ１８８４、ＭＥＤＩ６４６９およびＭＯＸＲ０９１６が挙げられる。

特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、化学療法と組み合わせて対象に投与される。本明細書に記載される併用療法に使用することができる化学療法薬の種類の例としては、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、代謝拮抗剤、白金錯体誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、植物由来のアルカロイド、ホルモン拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、およびＰ糖タンパク質阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される併用療法に使用することができる化学療法薬の具体的な例としては、タキソール、パクリタキセル、ｎａｂ－パクリタキセル、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、コルヒチン、ミトキサントロン、タモキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ウラムスチン、ムスタルゲン、イホスファミド、ベンダムスチン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン、テトラジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、アルトレタミン、ヘキサレン、トロホスファミド、エストラムスチン、トレオスルファン、マンノスルファン、トリアジクオン、カルボクオン、ニムスチン、ラニムスチン、アザチオプリン、スルファニラミド、フルオロピリミジン、チオプリン、チオグアニン、メルカプトプリン、クラドリビン、カペシタビン、ペメトレキセド、フルダラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、ネララビンまたはクロファラビン、シタラビン、デシタビン、プララトレキサート、フロクスウリジン、チオクアニン、アザシチジン、クラドリビン、ペントスタチン、メルカプトプリン、イマチニブ、ダクチノマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、ペリウィンクル、ビンカ、タキサン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、テニポシド、ピラルビシン、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、アムサクリン、抗アンドロゲン薬、抗エストロゲン薬、ビカルタミド、メドロキシプロゲステロン、フルオキシメステロン、ジエチルスチルベストロール、エストラース、オクトレオチド、メゲストロール、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、プレドニゾン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン、ファドロゾール、アンドロステン、レスベラトロール、ミオスミン、カテキン、アピゲニンエリオジクチオールイソリキリチゲニン、マンゴスチン、アミオダロン、アジスロマイシン、カプトプリル、クラリスロマイシン、シクロスポリン、ピペリン、ケルセチン、キニジン、キニン、レセルピン、リトナビル、タリキダル、ベラパミル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、トランスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、トリプラチンおよびカルボプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、ＡＭＬの治療のための１つまたは複数の化学療法と組み合わせて、対象に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学療法は、シタラビン、ダウノルビシン、イダルビシン、クラドリビン、フルダラビン、ミトキサントロン、エトポシド、６－チオグアニン、ヒドロキシ尿素、プレドニゾン、デキサメタゾン、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、アザシチジン、およびデシタビンから選択される。

特定の一実施形態では、本明細書に記載される治療法は、放射線療法と組み合わせて対象に投与される。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法は、幹細胞移植と組み合わせて対象に投与される。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの治療法は、１つまたは複数の追加の抗がん治療法の前、その間（すなわち、同時に）またはその後に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、以前に抗がん治療を受けていない。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、以前に抗がん療法（例えば、化学療法、放射線療法、または幹細胞移植）を受けている。

診断用途
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗体断片組成物は、診断用途に使用される。例えば、本明細書に記載される標識抗体または抗原結合断片は、試料（例えば、生体試料）における標的抗原（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）の存在または量を検出するためのアッセイに使用される。別の例では、標的抗原（例えば、ＭＨＣＩ、例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープ）に結合する本明細書に記載される標識抗体または抗原結合断片は、標的抗原に結合する追加の化合物（例えば、小分子、アプタマー、または抗体）を同定するために陽性対照として使用される。

一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体または抗体断片組成物は、例えば、フローサイトメトリーまたは顕微鏡検査によって、ＭＨＣＩ（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示する細胞を特徴付けるかまたは同定するためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイに使用される。例えば、本明細書に記載される抗体または抗原結合断片組成物がＭＨＣＩ（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープに結合する一部の実施形態では、組成物は、試料（例えば、生体試料）における標的抗原を提示する細胞を同定するために使用される。したがって、本明細書に記載される抗体、またはその抗原結合断片は、患者における疾患（例えば、がん、例えば、ＮＰＭ１遺伝子における変異を有するがん、例えば、ＮＰＭ１遺伝子における変異を有するＡＭＬ）を診断するため、予後判定のため、および／またはその進行を判定するために使用される。

キット
一態様では、（ｉ）本明細書に記載される抗体もしくはその抗原結合断片、本明細書に記載される二重特異性分子、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチド、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、または本明細書に記載される医薬組成物；（ｉｉ）任意選択で、１つまたは複数の追加の抗がん剤（例えば、化学療法薬）、および（ｉｉｉ）任意選択で、対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む１つまたは複数の容器を含むキットが、本明細書において提供される。

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片、および使用のための説明書を含むキットに関する。キットは、本明細書に開示されるＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）、および使用のための説明書を含み得る。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、および使用のための説明書を含むキットに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるような、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原および第２の抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する二重特異性分子、ならびに使用のための説明書を含むキットに関する。

一実施形態では、キットは、同一または別々の好適な容器内に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝液）とを含み得る。一実施形態では、キットは、同一または別々の好適な容器内に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合する単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）と、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝液）とを含み得る。一実施形態では、キットは、同一または別々の好適な容器内に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原および第２の抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する二重特異性分子と、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝液）とを含み得る。一実施形態では、キットは、同一または別々の好適な容器内に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドと、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝液）とを含み得る。一実施形態では、キットは、同一または別々の好適な容器内に、ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原および第２の抗原（例えば、ＣＤ３）に結合するＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞と、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝液）とを含み得る。

好適な容器としては、限定はされないが、バイアル、ウェル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、注入バッグ、または他の容器手段を挙げることができ、その中に、本明細書に記載される抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）、本明細書に記載される二重特異性分子、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、または本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞を収めることができる（場合によっては、好適に分割されている）。追加の構成成分が用意される場合、キットは、この構成成分を収めることができる追加の容器を含むことができる。容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器をさらに含んでもよい。容器および／またはキットは、使用上の指示および／または警告を記載したラベルを含むことができる。

以下の実施例は、説明のために提供され、限定としては提供されない。本発明の様々な他の実施形態は、本明細書において提供される一般的な説明を前提として、実施することができる。

定義
本明細書で使用される場合、「ＮＰＭ１ｃ」という用語は、ＮＰＭ１遺伝子における４ヌクレオチド重複に起因し、細胞質局在を有する、変異型ヌクレオフォスミンタンパク質（ＮＰＭ１）を指す。野生型ＮＰＭ１遺伝子によってコードされるヒトヌクレオフォスミンは、配列番号５４によって示されるアミノ酸配列（受託番号ＮＭ＿００２５２０）を有する。４ヌクレオチド重複を有するＮＰＭ１遺伝子によってコードされる例示的なＮＰＭ１ｃタンパク質は、配列番号５６によって示されるアミノ酸配列を含む。さらに、前記例示的なＮＰＭ１ｃタンパク質のＣ末端アミノ酸配列は、ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含み、これは、太字で強調表示されている、野生型ヌクレオフォスミンタンパク質に比して変異している配列の部分を有する（例えば、van der Lee et al., 2019, JCI 129(2):774-785; Verhaak, R. et al (2005) Blood 106:3747を参照）。一部の実施形態では、本開示のＮＰＭ１ｃネオエピトープは、アミノ酸配列ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むＮＰＭ１ｃタンパク質に由来するネオエピトープを含む。一部の実施形態では、本開示のＮＰＭ１ｃネオエピトープは、ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号５７）を含むアミノ酸配列を有するＮＰＭ１ｃの部分に由来するネオエピトープを含む。

本明細書で使用される場合、「ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２」という用語は、ＨＬＡ－Ａ２タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃのネオエピトープを指す。一部の実施形態では、ＮＰＭ１ｃのネオエピトープは、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む。

本明細書で使用される場合、用語「ＹＧ１」または「ＹＧ１ｓｃＦｖ」は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）がそれぞれ配列番号５および３によって示されるアミノ酸配列を有する、配列番号２によって示される完全長アミノ酸配列を含む例示的なｓｃＦｖを指す。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値を改変して使用される場合、その数値の最大で上下１０％の偏差が、列挙された値の意図される意味の範囲内にあることを示す。

本明細書で使用される場合、「ＶＨ」または「Ｖ_Ｈ」という用語は、抗体の重鎖可変領域を指す。

本明細書で使用される場合、「ＶＬ」または「Ｖ_Ｌ」という用語は、抗体の軽鎖可変領域を指す。

本明細書で使用される場合、参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」または「パーセント配列同一性」という用語は、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野で公知の様々な方法で、例えば、公開されているコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成することができる。比較の目的のためのギャップありアラインメントを得るためには、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているように利用することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）のアルゴリズムを、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重で使用して、決定することができる。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含む抗体を指す（この用語が使用される文脈が別のものを示唆する場合を除く）。抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプが含まれる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、種々の種、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、およびマウスのいずれかにおいて作られるか、またはそれらに由来し得る。抗体は、精製された抗体または組換え抗体であることができる。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」、「抗原結合断片」という用語、または類似の用語は、標的抗原に結合する能力を保っている抗体の断片を指す。そのような断片には、例えば、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）_２断片が含まれる。この用語には、例えば、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ単一ドメイン抗体も含まれる。例えば、Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263; Reichmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38；ＰＣＴ出願国際公開第９４／０４６７８号パンフレットおよび国際公開第９４／２５５９１号パンフレット；ならびに米国特許第６，００５，０７９号明細書を参照されたく、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示は、単一ドメイン抗体が形成されるような改変を有する２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。加えて、イントラボディ、ミニボディ、トリボディ、およびダイアボディも、抗体断片の定義に含まれ、本明細書に記載される方法における使用に適合する。例えば、Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson and Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon and Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283を参照されたく、それぞれの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換」または「置換された」という用語（そのような用語が置換されたアミノ酸と称される場合）は、所定のアミノ酸配列における少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の、異なるアミノ酸残基による置き換えを指す。「アミノ酸挿入」という用語は、少なくとも１つの追加のアミノ酸の、所定のアミノ酸配列への組み入れを指す。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、より大きな「ペプチド挿入」を行うこともできる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、天然に存在するものであってもよく、天然に存在しないもの（改変されたもの）であってもよい。「アミノ酸欠失」という用語は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、これには以下のものが含まれる：
（１）疎水性側鎖：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ；
（２）中性親水性側鎖：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性側鎖：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性側鎖：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する側鎖：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族側鎖：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

例えば、非保存的アミノ酸置換は、実質的に異なる側鎖（すなわち、異なるファミリーのメンバーであるアミノ酸残基）を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換である。

一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基のハイドロパシー指数を考慮することによって行われる。各アミノ酸に、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。それらは以下の通りである：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（－０．４）；Ｔｈｒ（－０．７）；Ｓｅｒ（－０．８）；Ｔｒｐ（－０．９）；Ｔｙｒ（－１．３）；Ｐｒｏ（－１．６）；Ｈｉｓ（－３．２）；Ｇｌｕ（－３．５）；Ｇｌｎ（－３．５）；Ａｓｐ（－３．５）；Ａｓｎ（－３．５）；Ｌｙｓ（－３．９）；およびＡｒｇ（－４．５）。ポリペプチドに相互作用機能を付与する上でのハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で理解されている（例えば、Kyte et al (1982) J Mol Biol 157:105-131を参照）。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸残基を、同一または類似の（例えば、約＋２、＋１．５、＋１、＋０．５、－０．５、－１、－１．５、または－２以内）ハイドロパシー指数を有する別のアミノ酸残基で置き換えることによって行われる。

一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮することによって行われる。以下の親水性値が割り当てられている：Ａｒｇ（＋３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０±１）；Ａｓｐ（＋３．０±１）；Ｇｌｕｔ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｔｈｒ（－０．４）；Ｐｒｏ（－０．５±１）；Ａｌａ（－０．５）；Ｈｉｓ（－０．５）；Ｃｙｓ（－１．０）；Ｍｅｔ（－１．３）；Ｖａｌ（－１．５）；Ｌｅｕ（－１．８）；Ｉｌｅ（－１．８）；Ｔｙｒ（－２．３）；Ｐｈｅ（－２．５）；およびＴｒｐ（－３．４）。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸残基を、同一または類似の（例えば、約＋２、＋１．５、＋１、＋０．５、－０．５、－１、－１．５、または－２以内）親水性を有する別のアミノ酸残基で置き換えることによって行われる。

例示的なアミノ酸置換は表２に示されている。

本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、その天然環境の構成要素から分離されている抗体を指す。単離された抗体は、典型的には、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。単離された抗体は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えば、ＮＭＰ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する単離された抗体は、ＮＭＰ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。

本明細書で使用される場合、「単離された核酸分子」という用語は、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子は、その天然の染色体位置とは異なる位置に存在する。

本明細書で使用される場合、「ネオエピトープ」は、疾患特異的変異によって生じるペプチドを含む疾患特異的抗原を指し、これは自己とは異なるものとして認識され、正常細胞ではなく、疾患によって影響を受けた細胞の表面上に提示される。「腫瘍ネオエピトープ」または「がんネオエピトープ」という用語は、腫瘍特異的またはがん特異的変異から生じるペプチドを含む腫瘍特異的またはがん特異的抗原を指し、これは自己とは異なるものとして認識され、正常細胞ではなく、腫瘍／がん細胞の表面上に提示される。腫瘍特異的またはがん特異的ネオエピトープの提示は、腫瘍細胞内での腫瘍特異的またはがん特異的抗原の細胞内プロセシングおよび切断の後に生じ、それによって、腫瘍特異的またはがん特異的変異を含む８～１５アミノ酸の１つまたは複数の異なるペプチドが生成される。それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞への提示のためにＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子に結合するこれらのペプチドのサブセットが、腫瘍のネオエピトープを構成する。

本明細書で使用される場合、「Ｋ_Ｄ」または「Ｋｄ」または「Ｋ_Ｄ」という用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、抗体（またはその抗原結合断片）と抗原との間の結合反応の平衡解離定数を指す。Ｋ_Ｄの値は、抗体オフ速度定数（ｋｏｆｆ）の抗体オン速度定数（ｋｏｎ）に対する比の数値表現である。Ｋ_Ｄの値は、抗原に対する抗体の結合親和性に反比例する。Ｋ_Ｄ値が小さいほど、抗原に対する抗体の親和性は高い。親和性は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。

本明細書で使用される場合、用語「ｋｏｆｆ」または「ｋ_ｏｆｆ」は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関するオフ速度定数を指す。ｋｏｆｆの値は、１秒間あたりに崩壊または解離する複合体の割合の数値表現であり、単位ｓｅｃ^ー１で表される。

本明細書で使用される場合、「ｋｏｎ」または「ｋ_ｏｎ」という用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有し、抗体と抗原との会合に関するオン速度定数を指す。ｋｏｎの値は、抗体および抗原の１モル（１Ｍ）溶液中で１秒間あたりに形成される抗体／抗原複合体の数の数値表現であり、単位Ｍ^ー１ｓｅｃ^ー１で表される。

本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」および「選択的に結合する」という用語は、特定の抗原またはエピトープ（例えば、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２）に対して感知可能な親和性を示し、一般に、他の抗原およびエピトープ（例えば、ＨＬＡ－Ａ２単独、例えば、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独、例えば、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した非ＮＰＭ１ｃネオエピトープ）には結合しないか、または実質的に結合しない、抗体またはその抗原結合断片を意味することを意図している。「感知可能な」または好ましい結合には、１０^－７、１０^－８、１０^－９、もしくは１０^－１０Ｍまたはより良好なＫ_Ｄとの結合が含まれる。抗体抗原相互作用のＫ_Ｄ（親和定数）は、抗体および抗原分子の５０％が結合する抗体の濃度を示す。したがって、好適な一定の抗原濃度では、親和性のより高い（すなわち、より強い）抗体の５０％は、親和性のより低い抗体と同じパーセント結合を達成するために必要とされるよりも低い抗体濃度で抗原分子に結合すると考えられる。したがって、Ｋ_Ｄ値が低いほど、より高い（強い）親和性を示す。本明細書で使用される場合、「より良好な」親和性は、より強い親和性であり、その比較対象よりも低い数値であり、１０^－７ＭのＫ_Ｄは、１０^－６ＭのＫ_Ｄよりも低い数値であり、したがって、より良好な親和性を表す。１０^－７Ｍよりも良好な（すなわち、Ｋ_Ｄ値が低く、したがってより強い）、好ましくは１０^－８Ｍよりも良好な親和性が一般に好ましい。本明細書に記載される値の中間値も想定しており、好ましい結合親和性は親和性の範囲として示すことができ、例えば、本明細書に開示されるＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体について好ましい結合親和性は１０^－７～１０^－１２Ｍ、より好ましくは１０^－８～１０^－１２Ｍである。

抗原に「結合しない」または「実質的に結合しない」抗体は、オフターゲット抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、例えば、ネオエピトープ単独、例えば、ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチド）に感知できる程度には結合しないものである。例えば、一実施形態では、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する抗体は、例えば、ＨＬＡ－Ａ２単独、ＮＰＭ１ｃネオエピトープ単独、および／またはＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成した非ＮＰＭ１ｃネオエピトープよりも、ＮＰＭ１ｃ：ＨＬＡ－Ａ２に対して少なくとも２桁、好ましくは３桁、または４桁もしくはそれを上回る高さの良好な結合親和性（すなわち、２桁、３桁、または４桁もしくはそれよりも小さいＫ_Ｄ値を示す結合）を示す。特異的または選択的結合は、そのような結合を決定するための当技術分野で認識されている任意の手段に従って決定することができ、これには例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析、Ｂｉａｃｏｒｅ分析、バイオレイヤー干渉法、および／または競合的（競合）結合アッセイが含まれる。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有し、それに連結された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、この場合は追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートすることができる。ある特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、ある特定のベクターは、それに作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ手法に使用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、互換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）も含むことを意図している。

本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ－Ａ」という用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有し、ヒトにおけるＨＬＡ－Ａ座位によってコードされるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の群を指す。ＨＬＡは、ヒトに特異的な主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）抗原である。ＨＬＡ－Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の主要な３種類のうちの１つである。他にはＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃがある。ＨＬＡ－Ａタンパク質はヘテロ二量体であり、α重鎖およびより小さいβ鎖で構成される。α鎖はバリアントＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされ、β鎖（β２－ミクログロブリン）はインバリアントなβ２ミクログロブリン分子である。β２ミクログロブリンタンパク質は、ヒトゲノムの別の領域によってコードされる。ＨＬＡ－Ａ＊０２（Ａ＊０２）は、ＨＬＡ－Ａ血清型群に属するヒト白血球抗原血清型である。この血清型は、ＨＬＡ－Ａα鎖のα２ドメインの抗体認識によって決定される。Ａ＊０２の場合、α鎖はＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子によってコードされ、β鎖はＢ２Ｍ座位によってコードされる。

本明細書で使用される場合、「有効用量」または「有効量」という用語は、所望の治療効果を達成するのに、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。

大部分のキメラ抗原受容体－Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的としている。この療法は、正常組織中での低いレベルの発現によるオンターゲット／オフ腫瘍毒性、および腫瘍細胞によるＴＡＡ発現の喪失による腫瘍耐性をもたらすことがある。本明細書に記載したように、腫瘍特異的発がんドライバー遺伝子変異に起因する細胞内ネオ抗原由来のネオエピトープを標的とするｓｃＦＶを、ヌクレオフォスミンにおける４ヌクレオチドの複製であり、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の約３５％におけるドライバー発がん遺伝子変異であるＮＰＭ１ｃにおいて同定した。ＮＰＭ１における変異はクローナルであり、白血病誘発の初期における悪性の形質転換に重要である。変異によって、最も一般的なＨＬＡ－Ａ２アレルによって提示されるネオエピトープが創成される。具体的には、ＮＰＭ１ｃによって、最も一般的なＨＬＡ－Ａ^＊０２０１アレル（ヒト人口の約５０％）によって提示される白血病特異的ネオ抗原エピトープ（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱと略す）が産生される（Greiner et al., BLOOD 120: 1282 (2012)を参照）。

ＡＩＱネオエピトープに対して特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答を有するＮＰＭ１ｃ^＋のＡＭＬ患者は、ネオエピトープに対するＣＤ８Ｔ細胞応答を有しないＮＰＭ１ｃ^＋のＡＭＬ患者より劇的に良好な全生存期間を有することが示された（Greiner, J. et al., BLOOD 122:1087 (2013)）。さらに、ＶａｎｄｅｒＬｅｅらは、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＮＰＭ１ｃネオエピトープＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定し、そのようなＴＣＲを形質導入されたＴ細胞はＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋のＡＭＬの殺滅に効果的であることを示した（van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019)を参照）。しかし、そのような療法の欠点は、外因性と内因性のＴＣＲのα鎖とβ鎖との間のＴＣＲ鎖の誤対合のリスクであり、これは毒性の可能性および有効性の低減をもたらす（van der Lee et al., J CLIN INVEST 129: 774 (2019); Bendle et al., NAT MED 16: 565, 1p (2010); van Loenen et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107: 10972 (2010)を参照）。ＴＣＲについてのもう１つの主要な課題は、腫瘍抗原に対する結合親和性が低いことである（Zhang. & Wang,. Technol Cancer Res Treat 18 1078098716 (2019)を参照）。

本明細書に記載したように、一連の陽性および陰性の選択ステップを使用する酵母表面ディスプレイを使用して、ＮＰＭ１ｃエピトープ－ＨＬＡ－Ａ２複合体（すなわちＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２）には特異的に結合するが、ＨＬＡ－Ａ２単独または対照ペプチドもしくはその他の抗原ペプチドがロードされたＨＬＡ－Ａ２（例えばがん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号６２）がロードされたＨＬＡ－Ａ２すなわちＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、例えばインフルエンザウイルスＭ１エピトープＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号６３）がロードされたＨＬＡ－Ａ２すなわちＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２）に結合しないヒトｓｃＦｖを同定した。さらに、単離したｓｃＦｖのＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対する親和性は約７ｎＭと決定され、これは典型的なＴＣＲの関連するペプチド－ＭＨＣ複合体に対する親和性より１０～１００倍高い。単離されたｓｃＦｖを発現する操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏとｉｎｖｉｖｏの両方でＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋白血病細胞に対して強力な細胞傷害性を呈することが見出されたが、ＮＰＭ１ｃ^－ＨＬＡ－Ａ２^＋白血病細胞またはＨＬＡ－Ａ２^－腫瘍細胞に対しては細胞傷害性を呈さなかった。本明細書に記載した結果は、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＡＭＬ等のＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋がんを処置するためのがん特異的免疫療法として有用であり、おそらく低減したオンターゲット／オフ腫瘍毒性および腫瘍耐性を伴うことを示している。

本明細書に記載したように、ｓｃＦｖ（「ＹＧ１」と称する)は、ＨＬＡ－Ａ２との複合体中のＮＰＭ１ｃネオエピトープ（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ；配列番号１）と高い親和性（約７ｎＭ）で特異的に結合することが示された。ＨＬＡ－Ａ２との複合体中のＮＰＭ１ｃネオエピトープ（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ；配列番号１）と特異的に結合するＹＧ１ｓｃＦｖを含むＣＡＲポリペプチド（ＮＰＭ１ｃＣＡＲ）を生成した。ＮＰＭ１ｃＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞（特にＣＤ８^＋Ｔ細胞）は、ＡＭＬ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで特異的に殺滅し、白血病負荷を低減し、ＡＭＬマウスモデル（ＡＭＬ腫瘍細胞を注射）におけるｉｎｖｉｖｏの生存期間を延長する。具体的には、ＹＧ１ｓｃＦｖを発現する操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏとｉｎｖｉｖｏの両方でＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋白血病細胞と初代ＡＭＬ芽細胞とに対して強力な細胞傷害性を呈するが、ＮＰＭ１ｃ^－ＨＬＡ－Ａ２^＋白血病細胞またはＨＬＡ－Ａ２^－腫瘍細胞に対しては細胞傷害性を呈さない。

したがって、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞集団の不均一性にも関わらず、ＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋白血病細胞を特異的に標的とし、したがって腫瘍耐性の進行を低減することが期待される。さらに、健常な組織ではＮＰＭ１ｃの発現がないので、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔはオンターゲット／オフ腫瘍毒性がない、またはごくわずかで、抗腫瘍免疫を媒介することが期待される。実際、ＹＧ１ｓｃＦｖを発現する操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３４^＋の正常な造血幹／前駆細胞と反応しないことが見出された。

さらに、ＴＣＲおよび従来のＣＡＲアプローチと比較して、ペプチド－ＨＬＡ複合体を標的とするｓｃＦｖは、ＮＫ細胞を武装させる独特の利点を有していることが期待される。ＮＫ細胞は通常、ＨＬＡの発現がないか、または低い標的細胞を認識してこれを殺滅する（Vivier et al., SCIENCE 331: 44 (2011)）。理論には縛られないが、ＨＬＡの発現を欠く、または低レベルのＨＬＡ分子を有する白血病細胞は、高レベルのＨＬＡを発現する白血病細胞と同様に、ＮＫ細胞によって優先的に殺滅され、したがってより多くのＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２標的がＮＰＭ１ｃＣＡＲ－ＮＫ細胞によって効率的に殺滅される。抗原の喪失はＣＡＲ－Ｔ療法に続く腫瘍耐性の重要な機序である（Shah & Fry, NAT REV CLIN ONCOL 16: 372 (2019)）ので、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－ＮＫ細胞は治療への耐性および疾患の再発を低減するために特に有効であろう。例えば、本明細書に開示した結果に基づいて、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をＮＫ細胞に分化させて（Hermanson,. et al., STEM CELLS 34: 93 (2016)を参照）、標準化された標的化「既製」リンパ球を抗がん免疫療法のための臨床的スケールで提供することができる（Li et al., CELL STEM CELL 23: 181 (2018)を参照）。したがって、ＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋のがん患者（例えばＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋のＡＭＬ患者）における抗白血病有効性を改善するためのＮＰＭ１ｃＣＡＲのＮＫ細胞への組み込みも、本明細書で企図される。

略語
ＡＩＱ：ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＭＬ：急性骨髄性白血病、アロＳＣＴ：同種造血幹細胞移植、ＢＬＩ：生物発光イメージング、ＣＡＲ:キメラ抗原受容体、ＣＡＲ－Ｔ：キメラ抗原受容体Ｔ細胞、ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞選別、ＦＢＳ：ウシ胎児血清、ＧＩＬ：ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号６３）、ＨＳＣ：造血幹細胞、ＭＡＣＳ：磁気活性化細胞選別、ＮＰＭ１：ヌクレオフォスミン、ＮＰＭ１ｃ：変異型ヌクレオフォスミン、ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片、ＳＬＬ：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号６２）、ＴＡＡ：腫瘍随伴抗原、ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体、ＨＳＰＣ：造血幹／前駆細胞。

実施例１～７で使用した材料および方法
ペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体の調製
変異体ＮＰＭ１ｃ由来のＣＤ８Ｔ細胞エピトープペプチド（ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）、ＡＩＱと略す）およびがん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１由来の対照ペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号６２）、ＳＬＬと略す）、ならびにインフルエンザウイルスＭ１タンパク質（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号６３）、ＧＩＬと略す）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成し、精製した。組換えヒトＨＬＡ－Ａ２：Ｉｇ融合タンパク質（ＤｉｍｅｒＸＩ）はＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。ペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体は製造者のプロトコールに従って調製した。簡単に述べると、ペプチドをＨＬＡ－Ａ２：Ｉｇ融合タンパク質とモル比６４０：１で混合し、混合物を３７℃で終夜インキュベートして自発的に複合体を形成させた。ペプチドがロードされたＨＬＡ－Ａ２：Ｉｇ融合タンパク質をペプチド－ＨＬＡ－Ａ２と称し、４℃で１週間まで保存した。

酵母培地の処方
ＳＤＣＡＡ培地：２０ｇのデキストロース、６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース、５ｇのバクトカザミノ酸、１０．２ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４．７Ｈ_２０、および８．５６ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４．Ｈ_２Ｏを脱イオン水に溶解して体積１リットルとし、０．２μｍのフィルターユニットを使用して濾過滅菌した。

ＳＧＣＡＡ培地：２０ｇのガラクトース、６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース、５ｇのバクトカザミノ酸、１０．２ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４．７Ｈ_２０、および８．５６ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４．Ｈ_２Ｏを脱イオン水に溶解して体積１リットルとし、０．２μｍのフィルターユニットを使用して濾過滅菌した。

ＳＤＣＡＡプレート：１０．２ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４．７Ｈ_２０および８．５６ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４．Ｈ_２Ｏ、１８２ｇのソルビトールおよび１５ｇのバクトアガーを脱イオン水に溶解して体積９００ｍｌとし、オートクレーブした。別個のビーカー中で２０ｇのデキストロース、６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース、および５ｇのバクトカザミノ酸を脱イオン水に溶解して体積１００ｍｌとし、濾過によって滅菌した。オートクレーブした混合物を撹拌しながら５０１Ｃ未満まで冷却し、濾過滅菌した溶液と合わせて混合してプレートに注いだ。

ＳＧ－２×ＳＣＡＡ培地：ＳＧ（６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース、２０ｇのガラクトース、１０．２ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４．７Ｈ_２０、および８．５６ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４．Ｈ_２Ｏ）、１９０ｍｇのＡｒｇ, ４００ｍｇのＡｓｐ、１，２６０ｍｇのＧｌｕ、１３０ｍｇのＧｌｙ、１４０ｍｇのＨｉｓ、２９０ｍｇのＩｌｅ、４００ｍｇのＬｅｕ、４４０ｍｇのＬｙｓ、１０８ｍｇのＭｅｔ、２００ｍｇのＰｈｅ、２２０ｍｇのＴｈｒ、５２ｍｇのＴｙｒ、３８０ｍｇのＶａｌ、および１ｇのＢＳＡを脱イオン水に溶解して体積１リットルとし、濾過によって滅菌した。

細胞株の培養
ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞、Ｔ２細胞、およびＰＣ－３細胞はＡＴＣＣから購入した。ＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞はＤＳＭＺから購入した。ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞およびＯＣＩ－ＡＭＬ２は、１０％のＦＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈおよびＶＷＲ）および２ｍＭのＬ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＧＭＢ細胞は、発がん遺伝子ｃ－ＭｙｃおよびＢｃ１２を形質導入したヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を既に述べたように免疫欠損マウスに移植することによって生成した（Leskov et al., ONCOGENE 32: 1066 (2013); Pallasch et al., CELL 156: 590 (2014)を参照）。ＧＭＢ細胞は、１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、１×２－メルカプトエタノール、および１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。Ｔ２細胞（１７４×ＣＥＭ．Ｔ２）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１９９２（商標））は、２０％のＦＢＳを補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＰＣ－３細胞は、１０％のＦＢＳを補充したＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。すべての培地には、１％ｖ／ｖのペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した。

ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの単離
ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を認識するヒトｓｃＦｖを、既述のように、酵母表面にディスプレイされた非免疫ヒトｓｃＦｖライブラリーから磁気活性化細胞選別選択（ＭＡＣＳ）を使用して単離し、続いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ、Ａｒｉａ２）を使用して選択した（Chao et al., NAT PROTOC 1: 755 (2006)を参照）。ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なｓｃＦｖを富化するため、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２複合体およびＨＬＡ－Ａ２タンパク質を陰性選択に使用した。ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、およびＨＬＡ－Ａ２は、選択の各ラウンドの前にビオチン化した。各ラウンドからの選択した酵母のプールをＳＤＣＡＡ培地中で終夜増殖させ、ＳＧＣＡＡ培地中でｓｃＦｖを発現するように誘導した。後の方の選択のラウンドに使用した誘導された酵母細胞の数は、前の選択のラウンドからの選択された酵母細胞の数の約１０倍であった。ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を認識するｓｃＦｖの単離の戦略を図１Ａおよび図１Ｂに示す。ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２による陽性選択およびそれに続くＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２による陰性選択を含む２ラウンドのＭＡＣＳ選択の後で、選択した酵母プールを多数ラウンドのＦＡＣＳ選択に供した（図１Ｂ）。各ラウンドのＦＡＣＳ選択の間に、選択した酵母細胞プールをフローサイトメトリーによってＨＬＡ－Ａ２、ＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、およびＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２への結合についてアッセイした（図１Ｃ）。

選択した酵母細胞からのプラスミドＤＮＡの単離およびｓｃＦｖのシーケンシング
選択した酵母細胞の集団からのプラスミドＤＮＡを、Ｚｙｍｏｐｒｅｐキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、製造者の使用説明書に従って単離した。プラスミドの単離に使用した酵母細胞の数は、選択した集団中の異なる酵母クローンのそれぞれからディスプレイプラスミドを得るために期待された集団多様性より少なくとも１０倍高かった（Chao et al., NAT PROTOC 1: 755 (2006)を参照）。アルファセレクトゴールド大腸菌（E. coli）コンピテント細胞（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を５μLのプラスミドＤＮＡで形質転換し、ＬＢＡｍｐプレートに播種し、３７℃で終夜インキュベートした。２５個の単一コロニーをランダムに採取し、ＬＢＡｍｐ培地に接種して、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で終夜増殖させた。次いでこれら２５個の培養からミニプレップ(ＱＩＡＧＥＮ)によってプラスミドＤＮＡを調製し、以下のプライマーを使用してｓｃＦｖをシーケンシングした。フォワード、５’－ＧＴＣＡＧＴＡＡＴＴＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＣＣ－３’（配列番号６４）、リバース、５’－ＧＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＣＧ－３’（配列番号６５）。

ｓｃＦｖクローンの特徴解析
Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ＲＪＹ１００コンピテント酵母細胞を調製した。目的の単一ｓｃＦｖクローンのためのディスプレイプラスミドを、製造者のプロトコールに従ってコンピテント酵母細胞に形質転換した。単一クローンは、形質転換した酵母細胞をＳＤＣＡＡプレートに播種し、それが視認できるコロニーを形成するまで３０℃で２日を超えてインキュベートすることによって得た。３～５個のクローンをランダムに選択して５ｍＬのＳＤＣＡＡ培養中に個別に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で終夜増殖させた。酵母表面におけるｓｃＦＶの発現を誘導するため、ＳＤＣＡＡ培養からの５×１０^７個の酵母細胞を５ｍｌのＳＧＣＡＡ培地に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら２０℃で少なくとも２０時間、誘導した。得られた酵母細胞をビオチン標識ＨＬＡ－Ａ２、ＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、またはＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２とともにインキュベートし、続いて氷上、暗所でストレプトアビジン－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＦＩＴＣ標識抗ｃ－Ｍｙｃ抗体（Ａｂｃａｍ）によって２０分、染色した。染色した酵母細胞をフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩＨＴＳ－１）により、１試料あたり少なくとも２０，０００イベントを収集して解析した。

可溶性ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質の発現
可溶性ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質は、切り替え可能な酵母ディスプレイ／分泌系を使用して産生した（Van Deventer et al., PROTEIN ENG DES SEL 28: 317 (2015)を参照）。ＳｃＦｖＤＮＡを合成し（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）、Ｑ５Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２×ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮＥＢ）を使用するＰＣＲによってＦｃ断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは５’－ＣＣＧＧＧＧＴＡＧＡＡＣＣＴＡＡＡＡＧＴＴＣＣＧ－３’（配列番号６６）（フォワード）および５’－ＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣ－３’(配列番号６７)（リバース）であった。切り替え可能な酵母ディスプレイ／分泌ベクター骨格ｐＣＨＡ－ＦｃＳｕｐ－ＴＡＧは、酵素ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩによって二重消化した。ゲル精製の後、ベクター骨格、ｓｃＦｖＤＮＡ、およびＦｃＤＮＡ断片を、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ、ＮＥＢ）を使用して製造者のプロトコールに従ってアセンブルした。２μＬのアセンブリー反応混合物をアルファセレクトゴールド大腸菌（E. coli）コンピテント細胞（Ｂｉｏｌｉｎｅ）中に形質転換した。形質転換した細胞を３７℃で６０分振盪（２００ｒｐｍ）し、次いでＬＢアンピシリンプレートに播種した。コロニーを採取し、プラスミド抽出のためにアンピシリン含有液体ＬＢ培地中で増殖させた。得られたプラスミドをシーケンシングした。シーケンシングプライマーは５’－ＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＧＡＴＧ－３’（配列番号６８）（フォワード）および５’－ＧＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＣＧ－３’（配列番号６５）（リバース）であった。正しいプラスミドをＲＪＹ１００コンピテント酵母細胞中に形質転換した。形質転換した酵母細胞をＳＤ－ＳＣＡＡ培地中、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で飽和するまで終夜増殖させた。飽和した培養物をペレット化し、２００ｍｌのＳＧ－２×ＳＣＡＡ誘導培地中でＯＤ_６００が１．０になるよう再懸濁した。次いで再懸濁した培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら２０℃で４日間、増殖させた。酵母細胞を１０，０００×ｇで１５分、ペレット化し、０．２μＭのフィルター（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して上清を濾過した。濾液のｐＨは１０×ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）でｐＨ７．４、最終濃度１×に調整した。ｓｃＦｖ－Ｆｃは、１ｍｌのレジン（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を含有する前平衡化したプロテインＡカラムに、製造者のプロトコールに従って濾液を２回通すことによって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってレジンへの結合効率を測定するために、通過した培地を採取した。ｓｃＦＶ－Ｆｃが結合したレジンを、１０ｍＬの結合／洗浄緩衝液を使用して３回洗浄した。１０ｍＬの溶出緩衝液を使用してｓｃＦｖ－Ｆｃをレジンから溶出させた。ｓｃＦｖ－Ｆｃを含有する溶出液を、直ちに中和緩衝液（全溶出液の１／１０体積）でｐＨ７．４に中和した。中和した溶出液を濃縮し、遠心濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ３０ｋＤａ分子量カットオフ）を使用して１×ＰＢＳに緩衝液交換した。ＳｃＦｖ－ＦｃはＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）におけるＡ２８０の測定によって定量化し、５％のスタッキングゲルおよび６％の分離ゲルを使用するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度を評価した。標的細胞の表面上のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対する精製したｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質の特異的結合を、５ｎＭのタンパク質を使用して２００μｌのＰＢＳ緩衝液中の５×１０^５個の標的細胞とともに室温で３０分間インキュベートし、続いてＰＥ標識抗ＨＡタグ抗体で染色してフローサイトメトリーによって評価した。

バイオレイヤー干渉法によるｓｃＦｖ－Ｆｃの親和性の決定
バイオレイヤー干渉法実験は、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏＩｎｃ．）を使用して２５℃で実施した。すべてのステップで使用した同じ緩衝液は、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および０．１％のＢＳＡを含む結合緩衝液で構成された。ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ－ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化した。ストレプトアビジンでコートしたバイオセンサー（ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＤｉｐａｎｄＲｅａｄＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、ＦｏｒｔｅｂｉｏＩｎc.)に、体積２００μＬの２０μｇ／ｍＬのビオチン化ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質を、すべてのセンサー（参照センサーを除く）が０．５ｎｍの捕捉閾値に達するまでロードした。６０秒のそそぎ、および緩衝液単独でのベースラインステップの後、１：２の希釈系列(０ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、および８０ｎＭ)の抗原（ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２複合体、またはＨＬＡ－Ａ２）にセンサーを曝露した。抗原との会合を１，０００秒間モニターし、解離を緩衝液単独中で１，５００秒、行った。データ解析はＦｏｒｔｅＢｉｏＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ８．２（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して実施した。データの組は、Ｋ_ｏｎ、Ｋ_ｏｆｆ、およびＫ_Ｄを決定するための１：１結合モデルに適合した。

ＣＡＲベクターの設計
ＹＧ１またはＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８αリーダー配列、細胞外ヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータ活性化ドメインからなるＣＡＲの配列は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって特注で合成した。自己切断性Ｐ２Ａ、それに続くＥＧＦＰからなる第２の断片（Ｐ２Ａ－ＧＦＰ）を、同じ手段で合成した。ｐＨＩＶベクター(プラスミド＃２１３７３)は、酵素ＸｂａＩおよびＣｌａＩによって二重消化した。ベクター骨格をゲル精製した後、ｐＨＩＶ骨格、ＣＡＲ断片、およびＰ２Ａ－ＧＦＰ断片を、ＨｉＦｉＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）を使用し、製造者のプロトコールに従って、５’および３’末端におけるそれらの重複領域に基づいてアセンブルした。得られたプラスミドを、以下のシーケンシングプライマー、５’－ＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴ－３’（配列番号６９）（フォワード）および５’－ＡＧＧＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＧＣＴＧ－３’（配列番号７０）（リバース）を使用してシーケンシングした。適正な配列を有するプラスミドを、ｐＨＩＶ－ＣＡＲ－ＧＦＰと命名した。

ＣＡＲ発現初代ヒトＴ細胞の生成
レンチウイルスは、２９３Ｔ細胞にｐＨＩＶ－ＣＡＲ－ＧＦＰ、ｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ、ｐＣＭＶ－Δ８．９、およびｐＡｄｖプラスミドをトランスフェクトすることによって生成した。４８時間および７２時間で培養上清を採取し、２５，０００ｒｐｍ、４℃、２時間の超遠心によってレンチウイルス粒子をペレット化した。レンチウイルス粒子を１００μＬの無血清ＤＭＥＭ培地中に懸濁し、－８０℃で凍結した。ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２^＋のドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＨｕｍａｎＣＤ８^＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して単離した。単離したＴ細胞の純度（＞９５％）は、ＣＤ３およびＣＤ８を染色するＦＡＣＳを使用して定量化した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＴＣｅｌｌＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して活性化および増大させ、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、３％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＴｅｘＭＡＣＳＭｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で培養した。ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）による刺激の４日後に、Ｔ細胞にレンチウイルスを形質導入した（ＭＯＩ＝１０）。ＧＦＰ^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞をＦＡＣＳによって精製し、Ｔ細胞上のＣＡＲの発現を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して決定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、３％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％ｖ／ｖのペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＴｅｘＭＡＣＳＭｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で使用前１０日間、増大させた。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性
標的細胞を殺滅するＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を評価するため、ＣＤ８^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を、表示したエフェクター：標的比で標的細胞とインキュベートした。細胞を混合した直後（０時間）およびインキュベーション後２４時間で、血清を含まないＰＢＳで細胞を洗浄し、Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＦｉｘａｂｌｅＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎＫｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者のプロトコールに従って染色した。次いで細胞をＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８、ＰＥ抗ヒトＣＤ３３、またはＰＥ抗ヒトＣＤ１９抗体によって氷上、暗所で３０分、染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩＨＴＳ－１）によって解析した。各試料の特異的細胞溶解は以下の式を使用して計算した。細胞溶解（％）＝｛１－［ＣＡＲ－Ｔ群中の（２４時間における標的細胞％／０時間における標的細胞％）／非形質導入Ｔ群中の（２４時間における標的細胞％／０時間における標的細胞％）］｝×１００。

細胞内サイトカインの染色
ＣＡＲを形質導入した、または非形質導入ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレートで、いかなるサイトカインも含まず１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０中、タンパク質輸送阻害剤であるモネンシン（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびブレフェルジンＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下、２×１０^６個細胞／ｍＬ、標的細胞と１：１の比で、３７℃、５％ＣＯ_２中、１２時間、共培養した。細胞を洗浄し、Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＦｉｘａｂｌｅＡｑｕａＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎで染色し、続いてＣＤ３について表面染色し、次いで固定し、透過処理して、抗ＩＦＮ－γ－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ＩＬ－２－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって細胞内染色した。細胞をフローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＨＴＳ－２）によって解析し、生存しているＣＤ３^＋リンパ球をさらなる解析のためにゲーティングした。

ｉｎｖｉｖｏにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の殺滅
ＮＯＤ－ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ^ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスはＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＩＴ）の特定病原体のない（ＳＰＦ）動物舎に収容した。マウスを用いるすべての実験は、ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。簡単に述べると、ルシフェラーゼを発現するＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞（１×１０^６個）、ＧＭＢ細胞（２×１０^６個）、またはＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞（１×１０^６個）を２００μＬのＰＢＳ中で尾静脈注射によってＮＳＧマウスに注射した。４日後に、ＧＦＰの発現に基づいて選別した１×１０^７個のＣＡＲ－Ｔ細胞または活性化したが非形質導入ヒトＴ細胞を腫瘍担持マウスに注射した。３日ごとにＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ－２００Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラを使用して生体発光イメージング（ＢＬＩ）を実施した。

フローサイトメトリーによってＴ細胞および腫瘍細胞を解析するため、Ｔ細胞注射の１８日後に血液、脾、骨髄、および肝を収集した。４ｍＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳが入ったミクロ遠心管の中に心穿刺によって約２００μＬの血液を採取した。細胞を１，５００ｒｐｍで５分、遠心分離することによってペレット化し、混合物を１ｍLのＡＣＫＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（ＬｏｎｚａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で穏やかに上下にピペッティングすることによって再懸濁し、室温に５分間、保った。細胞を１，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、次いでＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。臓器の収集に先立って、上腸間膜静脈を通して５ｍＬのＰＢＳで肝を灌流した。脾および肝は、シリンジプランジャーを使用して７０μｍのストレーナーを通して加圧することによって、機械的に破壊した。破壊した肝を、２ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）により、３７℃で３０分間、消化した。骨髄細胞は、５ｍｌの冷ＰＢＳを流すことによって両側の大腿骨から採取した。単一細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解させた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１，５００ｒｐｍ、４℃で５分間、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、トリパンブルー染色で計数した。

フローサイトメトリー解析のため、５百万個の細胞を分注し、２０μＬのヒト血清と混合して５分間、Ｆｃ受容体をブロックした。次いで、細胞を以下のコンジュゲート抗体によって、氷上、暗所で３０分間、染色した。抗ｍＣＤ４５．１－ＢＵＶ７３７（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ｈＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ｈＣＤ８－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３３－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ｈＰＤ１－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、および抗Ｔｉｍ－３－ＢＶ７１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。フローサイトメトリー解析は、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＨＴＳ－２フローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、１試料あたり１００，０００イベントを収集して実施した。

統計解析
他に述べない限り、データは少なくとも３回の独立した実験からの平均±ｓ．ｅ．として表す。２つの独立群を比較するために、両側ｔ検定を使用した。ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍成長は、２方向繰り返し測定ＡＮＯＶＡを使用して比較した。腫瘍担持マウスにおける生存パターンを解析するためにカプラン・マイヤー法を使用し、統計的差はマンテル・コックスログランク検定に従って評価した。ｐ値０．０５未満を統計的有意とみなした。すべての統計解析はＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ２２ソフトウェアを使用して実施した。

ルシフェラーゼ活性の測定による細胞傷害性のアッセイ
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性のアッセイを、ルシフェラーゼ発現標的細胞株を使用して実施した。Ｔ細胞を、表示したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間、標的細胞とともにインキュベートした。次いで細胞をＰＢＳ中で１回すすぎ、ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、続いてルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。プレート分光光度計（ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ、ＴＥＣＡＮ）を使用して、細胞溶解物の発光を解析した。標的細胞単独の発光をベースライン対照として使用した。各試料の比細胞溶解性は、以下の式を使用して計算した。比細胞溶解性（％）＝１００×｛１－［（ＣＡＲ－Ｔ群における発光／標的細胞単独における発光）／（非形質導入Ｔ群における発光／標的細胞単独における発光）］｝。

ＱｕａｎｔｉｂｏｄｙＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅｓＡｒｒａｙ
ＱｕａｎｔｉｂｏｄｙＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅｓＡｒｒａｙ１（ＱＡＨ－ＣＹＴ－１）は、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈから購入した。１枚のガラススライドに１６ウェルの同一のサイトカイン抗体アレイをスポットする。各ウェルは、２０種のヒトサイトカインについて四連測定の抗体スポットを含んでいた。４名の健康なドナーから誘導した２×１０^５個のＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を、９６ウェルの丸底プレート中でいかなるサイトカインも含まず１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０中で、１×１０^５個のＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と、３７℃、５％ＣＯ_２で１６時間、共培養し、次いでサイトカインの定量のため、１００μｌの無細胞上清を各ウェルから採取した。アレイスライドは、製造者の使用説明書に従って取り扱い、処理した。数枚のスライドウェルは、標準曲線を計算するために純抗原で処理した。蛍光シグナルはレーザースキャナー（ＡｘｏｎＧｅｎｅＰｉｘ）で検出した。データ抽出は、このアレイに特有のＧＡＬファイル（ｗｗｗ．ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／Ｇａｌ－Ｆｉｌｅｓ．ｈｔｍｌ．）と一緒にマイクロアレイ解析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｉｘ）を使用して行い、スポットからのＦ４８８全強度をＥＬＩＳＡＣａｌｃソフトウェアによって解析した。各サイトカインの既知の濃度の標準曲線を確定し、次いで標準曲線への内挿によって試料中のサイトカインの濃度を計算した。

プレシジョンカウントビーズを用いるフローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ
患者由来の初代ＡＭＬ試料は、Ｄａｎａ－ＦａｒｂｅｒＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を、表示したエフェクター：標的比で初代ＡＭＬ細胞とともにインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、細胞を無血清ＰＢＳで洗浄し、Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＦｉｘａｂｌｅＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎＫｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者のプロトコールに従って染色した。次いで細胞を、ＦＩＴＣ－抗ヒトＣＤ８、ＰＥ－抗ヒトＣＤ３３によって、氷上、暗所で３０分間、染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、次いで２０μｌのプレシジョンカウントビーズ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、製造者の使用説明書に従って総体積２００μｌで細胞懸濁液に加えた。細胞はフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩＨＴＳ－１）によって解析した。初代ＡＭＬ細胞の絶対細胞計数は、製造者の使用説明書の式に従って計算した。各試料の特異的細胞溶解は、以下の式：特異的細胞溶解（％）＝１００×［１－（ＣＡＲ－Ｔ群中の初代ＡＭＬ細胞の絶対細胞計数／非形質導入Ｔ群中の初代ＡＭＬ細胞の絶対細胞計数）］を使用して計算した。

ヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、２名のドナーの胎児肝からＥａｓｙＳｅｐＨｕｍａｎＣＤ３４ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、既に述べたように精製した（Chen, Q. et al (2013) Stem Cells 31:1160; Kaur, M. et al (2019) J Immunol 202:1885を参照）。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を、表示したエフェクター：標的比でＣＤ３４^＋ＨＳＰＣとともにインキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、細胞を無血清ＰＢＳで洗浄し、Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＦｉｘａｂｌｅＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎＫｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者のプロトコールに従って染色した。次いで細胞を、ＦＩＴＣ－抗ヒトＣＤ８、ＰＥ－抗ヒトＣＤ３４によって、氷上、暗所で３０分間、染色した。上記のように、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、次いで２０μｌのプレシジョンカウントビーズ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、製造者の使用説明書に従って総体積２００ｕｌで細胞懸濁液に加えた。細胞はフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩＨＴＳ－１）によって解析した。ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの絶対細胞計数は、製造者の使用説明書の式に従って計算した。各試料の特異的細胞溶解は、以下の式：特異的細胞溶解（％）＝１００×［１－（ＣＡＲ－Ｔ群中のＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの絶対細胞計数／非形質導入Ｔ群中のＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの絶対細胞計数）］を使用して計算した。本研究におけるヒト組織の使用は、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄによって承認された。

初代ＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋ＡＭＬ異種移植片のＣＡＲ－Ｔ細胞による殺滅
患者由来の初代ＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋ＡＭＬ試料は、Ｄａｎａ－ＦａｒｂｅｒＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。１０週齢のＮＳＧ－ＳＧＭ３（ＮＳＧＳ）マウスはＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＩＴ）の特定病原体のない（ＳＰＦ）動物舎に収容した。マウスにおけるヒト初代ＡＭＬの生着効率を改善するため、ＮＳＧＳマウスに初代ＡＭＬを注射する２４時間前に、既に述べたように、ヒトＩＬ－３およびＧＭ－ＣＳＦをコードする１００μｇのＤＮＡプラスミドを水力学的に注射した（Chen, et al (2009) PNAS 106:21783を参照）。ＮＳＧＳマウスは２５０ｃＧｙで照射し、続いて照射後２４時間以内に１×１０^６個の初代ＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋ＡＭＬ細胞を尾静脈に注射した。２週後に、ＧＦＰの発現に基づいて選別した１×１０^７個のＣＡＲ－Ｔ細胞、または同じ数の活性化したが非形質導入ヒトＴ細胞を腫瘍担持マウスに注射した。ＡＭＬ負荷は９日ごとに尾静脈からの採血によって末梢血中で定量化し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＨＴＳ－２、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって解析した。ＡＭＬの生着は、循環ヒトＣＤ４５^＋ＣＤ８^－細胞のパーセンテージとして定義した。

増殖アッセイ
ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞（１×１０^５個）を、９６ウェルの丸底プレート中でいかなるサイトカインも含まず１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０中で、１×１０^５個のＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と、３７℃、５％ＣＯ_２で５日間、共培養した。次いで細胞を収集し、Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＦｉｘａｂｌｅＡｑｕａＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＩＴＣ－抗ヒトＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびＰＥ－抗ヒトＣＤ３３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、フローサイトメトリー解析の前にプレシジョンカウントビーズ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を加えた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の絶対細胞計数は、プレシジョンカウントビーズの製造者の使用説明書における式に従って計算した。細胞内Ｋｉ－６７染色のため、細胞を洗浄し、Ｌｉｖｅ／ＤｅａｄＦｉｘａｂｌｅＡｑｕａＤｅａｄＣｅｌｌＳｔａｉｎで染色し、続いてＣＤ８について表面染色し、次いで固定し、透過処理し、ＰＥ－抗ヒトＫｉ６７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって、製造者のプロトコールに従って細胞内染色した。細胞はフローサイトメトリー（ＬＳＲＩＩＨＴＳ－１）によって解析し、生存しているＣＤ８^＋リンパ球をさらなる解析のためにゲーティングした。

ウエスタンブロット
同数の細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。全細胞抽出物をＳＤＳローディング緩衝液に溶解し、９５℃で５分間煮沸し、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％の脱脂ミルクＴＢＳ－Ｔ溶液で膜をブロックした後、変異体ＮＰＭ１ｃ（ＮＢ１１０－６１６４６ＳＳ；ＮｏｖｕｓＢｉｏ）またはＧＡＰＤＨ（＃３６８３；ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に特異的な抗体で膜を精査した。

[実施例１]
酵母表面ディスプレイによるＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの単離
ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なヒトｓｃＦｖの単離は、ＮＰＭ１ｃ変異を有するＡＭＬの腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ療法を開発する基礎を形成した。酵母表面ディスプレイ（ＹＳＤ）（Chao et al., NAT PROTOC 1: 755 (2006)を参照）を使用して、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的な高親和性のｓｃＦｖを同定した。ＹＳＤによって、フローサイトメトリーによる酵母細胞表面における抗原への結合に基づく異なるｓｃＦｖバリアントの間の定量的な区別が可能になるので、高親和性ｓｃＦｖの選択をスクリーニングプロセスの間に達成することができる。さらに、ヒト脾Ｂ細胞からの（すなわち、完全にヒトの抗体配列からの）可変領域遺伝子断片の全レパートリーを使用して酵母ディスプレイライブラリーを構築したので、単離したｓｃＦｖは既にヒト起源であって免疫原性が低下しており、したがってヒトへの使用のための療法の開発に好適である。ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を特異的に認識するｓｃＦｖを単離するため、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を陽性選択のために使用し、ＨＬＡ－Ａ２単独またはＮＹ－ＥＳＯ－１から誘導した対照エピトープペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号６２）がロードされたＨＬＡ－Ａ２（ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２と略す）を陰性選択のために使用した（図１Ａおよび図１Ｂ）。使用したＹＳＤライブラリーは、１×１０^７～１×１０^９の異なるクローンの多様性を有すると推定された。

がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープ（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号６２）、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２と略す）等の他の抗原ペプチドの存在下または非存在下でＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体には特異性を有するが、ＨＬＡ－Ａ２には特異性を有しないｓｃＦｖを単離するために、一連の陽性および陰性選択を実施した（図１Ａおよび図１Ｂ）。ほぼ１×１０^１０個（ライブラリーの多様性の少なくとも１０倍）の酵母細胞を、可溶性ビオチン標識ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体、続いてストレプトアビジン標識磁気ビーズとインキュベートし、磁気活性化細胞選別選択（ＭＡＣＳ）精製を行った（図１Ｂ、ラウンド１）。陽性選択した酵母細胞をほぼ１０倍に増大させ、可溶性ビオチン標識ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２複合体、続いてストレプトアビジン標識磁気ビーズとインキュベートし、ＭＡＣＳ陰性選択を行った（図１Ｂ、ラウンド２）。結合していない酵母細胞を増大させ、可溶性ビオチン標識ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体、続いてマウスＩｇＧに特異的なＰＥ標識抗体（ＨＬＡ－Ａ２二量体のＦｃ部分、図１Ａ)およびｓｃＦｖのＣ末端のｃ－Ｍｙｃエピトープを検出するＦＩＴＣ標識抗ｃ－Ｍｙｃ抗体とインキュベートした（図１Ａ）。図１Ｂ（ラウンド３、プロット＃１）に示すように、約３．６％の酵母細胞が抗マウスＩｇＧおよびｃ－Ｍｙｃエピトープに対して陽性であった。二重陽性の酵母細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離した（図１Ｂ、ラウンド３）。

ＡＩＱ－ＨＡＬ－Ａ２複合体に対するｓｃＦｖの特異性をさらに富化するために、選別した酵母細胞を増大させ、一連の陽性選択（ビオチン標識ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２による）および陰性選択（ビオチン標識ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２による）に供し、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣおよびＦＩＴＣ標識抗ｃ－Ｍｙｃ抗体による染色および細胞選別を行った。富化を評価するため、選択した酵母細胞を、ＨＬＡ－Ａ２、ＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２［インフルエンザウイルスＭ１由来のＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号６３）（ＧＩＬと略す）ペプチドがロードされたＨＬＡ－Ａ２（Choo et al., J VIROL 88: 10613 (2014)を参照）］、およびＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２に対する非特異的結合、ならびにＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２に対する特異的結合について解析した（図１Ｃ）。例えば、ラウンド６（図１Ｂ）において、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対して高い親和性を有するｓｃＦｖをディスプレイする酵母細胞を精製した。しかし、精製した酵母細胞の大部分はＨＬＡ－Ａ２とＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２の両方に結合したが、ＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２およびＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２には結合せず（図１Ｃ、プロット＃１１～１４）、選択したｓｃＦｖの大部分はペプチドを含まないＨＬＡ－Ａ２に結合できることが示された。ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２に特異的なｓｃＦｖをディスプレイする酵母細胞を選択するため、酵母細胞をＨＬＡ－Ａ２で染色し、ＨＬＡ－Ａ２陰性酵母細胞を細胞選別によって精製した（図１Ｂ、ラウンド７、プロット＃５）。選択した酵母細胞の約１２％がＨＬＡ－Ａ２およびｃ－Ｍｙｃについて陽性（図１Ｃ、プロット＃１６）、２２．８％がＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２およびｃ－Ｍｙｃについて陽性（図１Ｃ、プロット＃１９）、および１％未満がＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２またはＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２について陽性であり（図１Ｃ、プロット＃１７および１８）、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２についてのｓｃＦｖの富化を示した。さらなる陽性および陰性の選択（図１Ｂ、ラウンド８および９）について、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２およびｃ－Ｍｙｃについて大部分陽性（約６０％、図１Ｃ、プロット＃２９）であるがＨＬＡ－Ａ２について大部分陰性（３％未満、図１Ｃ、プロット＃２６）であった酵母細胞を選択した。

ｓｃＦｖの配列を同定するため、選択した酵母細胞プールからプラスミドＤＮＡを抽出し、大腸菌（E. coli）に形質転換した。プラスミドの単離およびシーケンシングのために、２５個の単一コロニーをランダムに採取した。２５個のうち２４個は同一のｓｃＦｖＤＮＡ配列（ＹＧ１と称する。以下の「配列」の部を参照)を有し、残りの１つは異なるｓｃＦｖＤＮＡ配列（ＹＧ２と称する）を有していた。次いでＹＧ１およびＹＧ２を個別にＲＪＹ１００コンピテント酵母細胞に形質転換し、酵母細胞をＳＧＣＡＡ培地中で培養することによってｓｃＦｖの発現を誘導した。フローサイトメトリー解析によって、ｃ－Ｍｙｃ陽性のＹＧ１発現酵母細胞はＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体についても陽性に染色されるが、ＨＬＡ－Ａ２、ＧＩＬ－ＨＬＡ－Ａ２、またはＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２複合体については染色されず、一方ｃ－Ｍｙｃ陽性のＹＧ２発現酵母細胞はＨＬＡ－Ａ２とＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２との両方について弱く染色されることが示された（図１Ｄ）。これらの結果は、ＹＧ１由来のｓｃＦｖがＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的であることを示している。

[実施例２]
ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体へのＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃの特異的かつ高親和性の結合
ＹＧ１ｓｃＦｖをさらに特徴付けるため、切り替え可能な酵母ディスプレイ／分泌系を使用して、ＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を産生した（図２Ａ）。融合タンパク質は、プロテインＡレジンを使用して精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析した。非還元条件下で、主なバンドはほぼ６０、１４０、および２６０ｋＤａで検出され、単量体、二量体、および四量体のｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質産生物のサイズに対応した（図２Ｂ）。還元すると、６０ｋＤａのバンドの強度は増加し、２６０ｋＤａのバンドは消失して、単量体ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質産生物の予想される分子量と一致した。１４０ｋＤａのバンドの持続はおそらく、融合タンパク質のグリコシル化等の翻訳後修飾によるものである（Van Deventer et al., PROTEIN ENG DES SEL 28: 317 (2015)を参照）。

フローサイトメトリーを使用して、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、すなわちＮＰＭ１ｃ変異を有するＨＬＡ－Ａ２^＋ＡＭＬ細胞株（Quentmeier et al., LEUKEMIA 19: 1760 (2005)を参照）；ＯＣＩ－ＡＭＬ２、すなわち野生型ＮＰＭ１ａを有するＨＬＡ－Ａ２^＋ＡＭＬ細胞株；Ｔ２、すなわち野生型ＮＰＭ１を有するＨＬＡ－Ａ２^＋リンパ芽細胞株（Lorente et al., J BIOL CHEM 286: 38054 (2011)を参照）；ＧＭＢ、すなわちＭｙｃおよびＢｃｌ２の過発現由来のＨＬＡ－Ａ２^＋Ｂ細胞白血病／リンパ腫株（Leskov et al., ONCOGENE 32: 1066 (2013)）；およびＰＣ－３、すなわち野生型ＮＰＭ１を有するＨＬＡ－Ａ２^－前立腺がん細胞株（Matsueda et al., PLOS ONE 7: e45756 (2012)を参照）を含むＮＰＭ１ｃおよびＨＬＡ－Ａ２の陽性および陰性の細胞株のパネルにおけるＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃタンパク質のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体への特異的結合を検証した。細胞をＨＬＡ－Ａ２について染色した場合、予想されたように、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、ＯＣＩ－ＡＭＬ２、Ｔ２、およびＧＭＢ細胞は陽性であり、ＰＣ－３細胞は陰性であった（図２Ｃ）。融合タンパク質中のＨＡエピトープを検出するために、細胞をＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質および続いてＰＥ標識抗ＨＡ抗体で染色した場合（図２Ａ参照）、ほとんどすべてのＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞は陽性であったが、Ｔ２、ＧＭＢ、またはＰＣ－３細胞のいずれも、陽性でなかった（図２Ｄ）。さらに、ＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞のいずれも、陽性でなかった（データは示していない）。したがって、ＹＧ１ｓｃＦｖは、ＮＰＭ１ｃ変異を有するヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＡＭＬ細胞上のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的に結合することができる。

バイオレイヤー干渉法を使用して、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に対するＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃの親和性を測定した。精製したＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーに捕捉した。ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２を添加すると、結合振幅は濃度依存的に増加した（図２Ｅ）一方、結合振幅は増加する濃度のＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２複合体の添加によって顕著には変化しなかった。会合および解離の速度論に基づいて、ＹＧ１ｓｃＦｖ－ＦｃとＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２の会合定数（Ｋ_Ｏｎ）は５．３３±０．０２×１０^４Ｍｓ^－１、解離定数（Ｋ_Ｏｆｆ）は３．７７±０．０２×１０^－４ｓ^－１、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は７．０７±０．０８ｎＭであった。合わせて、これらの結果は、ＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質がＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に高い特異性および親和性で結合することを示している。

[実施例３]
ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的なＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＮＰＭ１ｃＣＡＲを構築するために、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通（ＴＭ）ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ活性化ドメイン、それに続く自己切断性のＰ２ＡおよびＥＧＦＰを含有するＣＡＲ骨格にインフレームでＹＧ１ｓｃＦｖをクローニングした（図３Ａおよび図３Ｂ、ならびに以下の配列の部）。対照として、ＣＤ１９に特異的なＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲ）を発現するために同じ構造骨格を使用した。ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞はドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４日間、活性化し、次いで形質導入しないか、またはＮＰＭ１ｃＣＡＲもしくはＣＤ１９ＣＡＲを発現するレンチウイルスを形質導入した。４日後、形質導入したＴ細胞をＧＦＰ^＋細胞についての選別によって単離し、さらに１０日間、増大させた。得られたＴ細胞を、ｓｃＦｖを認識するＡＦ６４７標識抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖抗体による染色によって、ＧＦＰおよびＣＡＲの発現について解析した。図３Ｃに示すように、ＮＰＭ１ｃＣＡＲを発現するレンチウイルスを形質導入したＴ細胞は、ＧＦＰとｓｃＦｖの両方について陽性であった一方、ＣＤ１９ＣＡＲを発現するレンチウイルスを形質導入したＴ細胞はＧＦＰについては陽性であったが、ｓｃＦｖについては弱い陽性のみであった。後者はおそらくＣＤ１９ｓｃＦｖがマウスの配列からヒト化されていたためであろう（米国特許出願公開第２０１４／０２７１６３５号明細書を参照）。得られたＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を特異的に認識するか否かを判定するため、ＣＡＲ－Ｔ細胞をビオチン化したＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２、またはＨＬＡ－Ａ２とインキュベートし、続いてストレプトアビジン－ＡＰＣによって染色した。ＧＦＰ^＋ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞はＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に特異的に結合したが、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２には結合しなかった（図３Ｄ）一方、非形質導入Ｔ細胞とＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞との両方は３種の複合体のいずれにも結合を示さなかった。これらの結果は、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体へのＮＰＭ１ｃ－ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）の特異性を確認するものである。

[実施例４]
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞によるヒトＡＭＬ細胞の特異的殺滅
ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性および特異性を検討するため、非形質導入Ｔ細胞およびＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）を、ＯＣＩ－ＡＭＬ３、ＧＭＢ、およびＰＣ－３腫瘍細胞と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間、共培養した。Ｔ細胞と腫瘍細胞との相対的割合は、ＣＤ８とＣＤ３３（ＯＣＩ－ＡＭＬ３について）、ＣＤ１９（ＧＭＢについて）、またはｍＣｈｅｒｒｙ（ＰＣ－３について）を染色するフローサイトメトリーによって定量化した。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞はＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を用量依存的に殺滅したが、ＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^－ＧＭＢ細胞またはＨＬＡ－Ａ２^－ＮＰＭ１ｃ^－ＰＣ－３細胞をＥ：Ｔ比に関わらず殺滅しなかった。これと一致して、ＧＭＢまたはＰＣ－３細胞と比較してＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と共培養した場合、非形質導入Ｔ細胞と比較して有意により高いパーセンテージのＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＦＮ－γを発現した（図４Ｃ、左パネルのバーを参照（陰影を付けたバーの左の組がＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞に相当し、陰影を付けたバーの右の組が非形質導入Ｔ細胞に相当する）。同様に、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と共培養した場合、非形質導入Ｔ細胞と比較して有意により高いパーセンテージのＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＬ－２を発現したが、パーセンテージはずっと低かった（＜２％）（図４Ｃ、右パネルのバーを参照（陰影を付けたバーの左の組がＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞に相当し、陰影を付けたバーの右の組が非形質導入Ｔ細胞に相当する）。これらの結果は、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がｉｎｖｉｔｒｏでＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋ＡＭＬ細胞を特異的に殺滅することができることを示している。ＯＣＩ－ＡＭＬ３標的細胞と共培養した場合のＩＬ－２を発現する極めて少ない割合（＜２％）のＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上に存在するＮＰＭ１ｃペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体の密度が低いことによるものであろう。この可能性を支持して、Ｗａｔａｎａｂｅらは、Ｔ細胞のサイトカイン産生を誘導するために必要な標的抗原の密度は、ＣＡＲ媒介細胞溶解を刺激するために必要な標的抗原の密度よりずっと高いことを示した。ＣＤ２０特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、最小密度のＣＤ２０（約２００分子／細胞）で標的細胞を溶解することができるが、サイトカインの産生にはより高い密度のＣＤ２０（約５，０００分子／細胞）が必要であった（Watanabe et al., J IMMUNOL 194: 911 (2015)）。最近、ＷａｌｋｅｒらはＮａｌｍ６細胞を使用してＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化するために必要な抗原の密度を検討し、ＣＡＲＴ細胞は最小のＣＤ２０発現で標的細胞を溶解し、あまり高くない抗原密度でＩＦＮ－γの産生を誘導することができるが、ＩＦＮ－γの産生と比較してＩＬ－２の産生には有意により高いＣＤ２０密度の閾値が必要であることを見出した（同文献）。ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞上のＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２の密度は未知であるが、がん細胞上のペプチド－ＭＨＣＩ複合体の密度は通常、１００～数千分子の範囲であり（Dubrovsky et al., ONCOIMMUNOLOGY 5: e1049803 (2016)）、これはＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性を誘発するためには十分であるが、ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン産生を誘発するには十分ではないであろう（Watanabe et al., FRONT IMMUNOL 9: 2486 (2018)）。この点に関して、ペプチド－ＭＨＣ複合体を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を使用すれば、サイトカイン放出症候群のリスクは、例えば高度に発現されるＴＡＡよりもおそらく低いであろう。

標的細胞による刺激の後のＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞によるより広い範囲のサイトカインの放出を評価するため、ＱｕａｎｔｉｂｏｄｙＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅＡｒｒａｙを使用して、４名の健康なドナーから調製したＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）または非形質導入Ｔ細胞と、ＯＣＩ－ＡＭＬ３標的細胞との共培養からの上清中の２０種のヒトサイトカインおよびケモカインの分泌を定量的に測定した。非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞からの上清において、ＧＭ－ＣＳＦ（ドナー４名中４名）、ＩＬ－１３（ドナー４名中４名）、ＭＩＰ－１β（ドナー４名中４名）、ＩＬ－８（ドナー４名中４名）、ＩＦＮ－γ（ドナー４名中３名）、ＭＩＰ－１α（ドナー４名中３名）、ＲＡＮＴＥＳ（ドナー４名中３名）、ＩＬ－２（ドナー４名中２名）、ＭＣＰ－１（ドナー４名中２名）の分泌の有意な増加が見出された（図４Ｄ）。

ＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋標的細胞がＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を刺激するか否かを評価するため、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）または非形質導入Ｔ細胞をＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と５日間、共培養し、Ｔ細胞の数およびＫｉ－６７の発現をフローサイトメトリーによって定量化した。プレシジョンカウントビーズを使用するフローサイトメトリーによって決定して、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の絶対数は非形質導入Ｔ細胞の絶対数より有意に高かった（図４Ｅ）。分子内Ｋｉ－６７染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定して、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞において、非形質導入Ｔ細胞と比較して増加したＫｉ－６７の発現が観察された（図４Ｆ）。これらの結果は、ＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋標的細胞に応答して増殖するＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を示している。

ＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２^＋ＡＭＬ細胞のターゲティングにおけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性をさらに検証するために、ＨＬＡ－Ａ２^＋のＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞およびＨＬＡ－Ａ２^－のＰＣ－３細胞にレンチウイルスを形質導入して、ＮＰＭ１ｃを安定的に発現するようにした（データは示していない）。外因性ＮＰＭ１ｃ発現に続いて、ＨＬＡ－Ａ２^＋のＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞はＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃについて陽性染色され（データは示していない）、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む)によってＥ：Ｔ比依存的に殺滅された（図４Ｇ）。しかし、ＮＰＭ１ｃを発現するＨＬＡ－Ａ２^－のＰＣ－３細胞はＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃによって染色されず（データは示していない）、非形質導入Ｔ細胞と比較していずれのＥ：Ｔ比でもＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）によって殺滅されなかった（図４Ｈ）。

さらに、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原特異性を実証するために、Ｔ２細胞に異なるペプチドをロードした。Ｔ２細胞はＨＬＡ－Ａ２^＋であるが、抗原プロセシングに関連する輸送体（ＴＡＰ）を欠いている。したがって、Ｔ２細胞表面上のＨＬＡ－Ａ２分子の多くは内因性ペプチドがロードされていないが、外因性ペプチドをロードすることができる（例えば、Hosken, N., et al., SCIENCE 248:367 (1990); Bossi, G. et al., ONCOIMMUNOLOGY 2:e26840 (2013)を参照）。Ｔ２細胞に０．１μＭ～１μＭ～１０μＭの範囲の異なる濃度のＮＰＭ１ｃペプチド（ＡＩＱ）またはＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＳＬＬ）をパルス処理した。ＡＩＱペプチドをパルス処理したがＳＬＬペプチドをパルス処理していないＴ２細胞を、ＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃで染色した（図４Ｉ）。これと一致して、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）はＡＩＱパルス処理したＴ２細胞をペプチド濃度依存的に殺滅したが、ＳＬＬパルス処理したＴ２細胞を殺滅しなかった（図４Ｊ）。これらの結果は、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞認識および細胞表面上にＮＰＭ１ｃ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を有する標的細胞の殺滅の特異性をさらに支持している。

[実施例５]
ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ療法は白血病負荷を低減し、生存期間を延長する
ｉｎｖｉｖｏにおけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を試験するため、ルシフェラーゼを発現するＯＣＩ－ＡＭＬ３腫瘍細胞（マウス1匹あたり１×１０^６個、図５Ａ）をＮＳＧマウスに静脈内注射した。注射の４日後に生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって生着を確認した後、マウスにＣＡＲ－Ｔまたは対照の非形質導入Ｔ細胞（マウス1匹あたり１×１０^７個）を単回静脈内注射した。３日ごとにＢＬＩを使用して白血病負荷をモニターした。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）で処置したマウスは白血病負荷の顕著な低減を示し、非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスと比較して生存期間の延長がもたらされた（図５Ｂおよび図５Ｃ）。ｉｎｖｉｖｏにおけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅の特異性を試験するため、ルシフェラーゼを発現するヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ１９^＋ＧＭＢ細胞（Leskov et al., ONCOGENE 32: 1066 (2013); Pallasch et al., CELL 156: 590 (2014)）をＮＳＧマウスに注射した。腫瘍を担持するマウスに、単回用量のＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）、非形質導入Ｔ細胞、またはＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞はリンパ腫負荷を低減しない、または生存期間を延長しなかった一方、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞はリンパ腫負荷を大きく低減し、生存期間を延長した（図５Ｄおよび図５Ｅ）。これらの結果は、ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＨＬＡ－Ａ２^＋であり、ＮＰＭ１ｃ^＋であるＡＭＬをｉｎｖｉｖｏで殺滅することができるが、ＮＰＭ１ｃの変異がないＨＬＡ－Ａ２^＋のリンパ腫細胞を殺滅しないことを示しており、優れた特異性を実証している。

ＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞はＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞と同様の背景を有しているが、野生型ＮＰＭ１タンパク質を発現する（例えばvan der Lee, D. I. et al., J CLIN INVEST 129 774 (2019)を参照）。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性の陰性対照として、ルシフェラーゼを発現するＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞（マウス1匹あたり１×１０^６個）をＮＳＧマウスに注射し、続いて４日後にＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）または対照の非形質導入Ｔ細胞（マウス１匹あたり１×１０^７個）を静脈内単回注射した。図５Ｆに示すように、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＰＢＳ対照または非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病負荷を効果的に低減した。しかし、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＮＳＧマウスにおけるＯＣＩ－ＡＭＬ２白血病負荷も低減せず、処置したマウスの生存期間も延長しなかった（図５Ｇ～図５Ｈ）。これらの結果は、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＰＭ１ｃ陽性ＡＭＬ細胞を特異的に殺滅するが、ＮＰＭ１ｃ陰性ＡＭＬ細胞を殺滅しないことをさらに支持している。

[実施例６]
ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ療法は異なる組織において白血病細胞数を低減する
ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞の抗白血病活性を検討するため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の移入の１８日後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞と異なる組織中の白血病細胞をフローサイトメトリーによって解析した。図６Ａに示すように、白血病負荷はＴ細胞の移入の日（ＯＣＩ－ＡＭＬ３の注射の４日後)には同様であったが、Ｔ細胞の移入の１８日後までに白血病負荷はＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）を受けたマウスにおいて、非形質導入Ｔ細胞を受けたマウスより有意に低かった。１８日目に血液、脾、骨髄、および肝を収集し、単一細胞懸濁液を調製して、マウスＣＤ４５（ｍＣＤ４５）、ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）、ｈＣＤ８、ｈＣＤ３３、ｈＰＤ－１、およびｈＴｉｍ－３について染色した。図６Ｂ～６Ｃに示すように、ｈＣＤ４５^＋細胞は、ｈＣＤ８^＋Ｔ細胞およびｈＣＤ３３^＋白血病細胞からなっていた。ｈＣＤ３３^＋白血病細胞の数およびパーセンテージは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）で処置したマウスの４種すべての組織において、非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの組織におけるよりも有意に少なかった（図６Ｄおよび図６Ｅ）。これと一致して、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）で処置したマウスの４種すべての組織において、非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの組織よりも高いパーセンテージのｈＣＤ８^＋Ｔ細胞が存在していた。さらに、ｈＣＤ３３^＋白血病細胞に対するｈＣＤ８^＋Ｔ細胞の比は、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）で処置したマウスのすべての組織において、非形質導入Ｔ細胞を投与したマウスよりも有意に高かった（図６Ｆ）。ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＰＤ－１およびＴｉｍ－３の発現についても解析した（図６Ｃ）。ＰＤ－１を発現したｈＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージは血液、脾、骨髄、および肝の間で有意に変動したが、非形質導入Ｔ細胞を投与したマウス、またはＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスの間の同じ組織では有意な相違はなかった（図６Ｇ）。興味あることに、Ｔｉｍ－３を発現したＴ細胞のパーセンテージは、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスの脾および骨髄においては有意に高かったが、パーセンテージは低かった（＜５％）（図６Ｈ）。これらの結果は、図５Ｂおよび６Ａにおける白血病負荷の生物発光イメージング解析に基づく結果と一致している。

ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）もしくは非形質導入Ｔ細胞、またはＰＢＳを注射した３０日後に生存しているマウスの骨髄における白血病負荷をさらに解析した（マウスは図５Ｆで代表され、実施例５に記載したマウスである）。ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔで処置した４匹のマウスのうち３匹の骨髄ではＯＣＩ－ＡＭＬ３白血病細胞はほぼ完全に消失していた（図６Ｉ）一方、骨髄中にヒトＴ細胞の大きな集団が検出された。対照的に、非形質導入Ｔ細胞で処置した生存している１匹のマウス（他のマウスは３０日以内に死亡した）およびＰＢＳで処置した生存している２匹のマウス（他のマウスは３０日以内に死亡した）の骨髄において多数の白血病細胞が検出された（図６Ｉ）。したがって、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞は骨髄中で増大してＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞を殺滅することができるようであり、疾患の進行を有意に制御する。

[実施例７]
ＮＭＰ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞はｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて初代ヒトＡＭＬ芽細胞を効果的に殺滅する
ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＰＭ１ｃ^＋ＨＬＡ－Ａ２＋初代ＡＭＬ芽細胞を殺滅するか否かをさらに評価した。３名の異なるドナーからのＮＰＭ１ｃ＋ＨＬＡ－Ａ２＋初代ＡＭＬ芽細胞を異なるＥ：Ｔ比でＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）とインキュベートし、２４時間後にプレシジョンカウントビーズを含むフローサイトメトリーによってＡＭＬ芽細胞の数を定量化した。図７Ａに示すように、殺滅活性は試料の間で変動したが、３種すべての初代ＡＭＬ試料はＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞によってＥ：Ｔ比依存的に効果的に殺滅された。対照的に、２名の異なるドナーからのヒトＨＬＡ－Ａ２^＋ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）はＹＧ１ｓｃＦｖ－Ｆｃによって染色されず（図７Ｂおよび図７Ｃ）、非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞によって殺滅されなかった（図７Ｄおよび図７Ｅ）。

患者由来の異種移植におけるＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ療法の有効性を評価するため、ＮＳＧＳマウスにＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋ヒト初代ＡＭＬ芽細胞を注射した。ヒト初代ＡＭＬの生着効率を改善するため、既に述べたように、初代ＡＭＬの注射の２４時間前に、ヒトＩＬ－３およびＧＭ－ＣＳＦをコードする１００μｇのＤＮＡプラスミドをＮＳＧＳマウスに水力学的に注射した（例えばChen, Q et al (2009) PNAS 106:21783を参照）。ＡＭＬ負荷は、尾静脈の採血およびヒトＣＤ４５^＋ＣＤ８^－細胞をアッセイするフローサイトメトリーによって末梢血中で定量化した。ＡＭＬ芽細胞が注射の２週後に血液中で検出され（図７Ｆ）、マウスにＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞（ＹＧ１ｓｃＦｖを含む）または非形質導入Ｔ細胞を注射した。９日ごとに血液中のＡＭＬ芽細胞のレベルをモニターした。図７Ｆおよび図７Ｇに示すように、ＡＭＬ芽細胞のレベルは、Ｔ細胞の注射の９日後と１８日後の両方で、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞で処置したマウスにおいて、非形質導入Ｔ細胞と比較して低減していた。差異は１８日目までに有意となった。これらの結果は、ＮＰＭ１ｃＣＡＲ－Ｔ細胞が患者由来の異種移植モデルにおいても初代ＨＬＡ－Ａ２^＋ＮＰＭ１ｃ^＋ＡＭＬ芽細胞の殺滅に効果的であることを示している。

参考文献

付録１
特異的抗ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ：ＨＬＡ－Ａ２抗体の選択のためのステップの例（いずれの理論にも縛られないが、実施例１に基づく）：
第１のラウンドの選択：
ビオチン化ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２抗原に陽性に結合する酵母集団の磁気選別（ＭＡＣＳ）による選択。
選択の第２ラウンド：
他のペプチド-ＨＬＡ－Ａ２複合体抗原に結合する可能性のある選別された酵母細胞を除外するため、対照ペプチド（ＳＬＬ）－ＨＬＡ－Ａ２複合体を使用して第１のステップで選別された酵母細胞を染色し、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２抗原に結合できなかった酵母細胞を磁気選別によって採取する。
選択の第３ラウンド：
選択の第１および第２のラウンドでは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に結合することができる酵母細胞を１×１０^１０酵母細胞まで大まかに富化することができる。図１Ｂ＃１に示すように、２ラウンドのＭＡＣＳ選別の後で、ＡＩＱ－ＨＡＬ－Ａ２複合体抗原およびｓｃＦｖの発現について二重陽性に染色された細胞は僅かに３．６４％であった。したがって、第３のラウンドの選択において、これらの二重陽性の酵母細胞の３．６４％を、フローサイトメトリー選別によって選別することができる。
選択の第４のラウンド：
図１Ｂ＃２に示すように、第３の選択によって、ＡＩＱ－ＨＡＬ－Ａ２複合体抗原およびｓｃＦｖの発現について二重陽性に染色される酵母集団をさらに富化（４１．４％）することができる。したがって、第４のラウンドの選択において、これらの二重陽性の酵母細胞の４１．４％は、フローサイトメトリー選別によってさらに選別することができる。
選択の第の５ラウンド：
図１ｃ＃１～＃４に示すように、第４の選択によって、ＡＩＱ－ＨＡＬ－Ａ２複合体抗原およびｓｃＦｖの発現について二重陽性に染色される酵母集団をさらに富化（４５．１％）することができる。しかし、ＧＩＬ－ＨＡＬ－Ａ２またはＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２複合体およびｓｃＦｖの発現について二重陽性に染色される酵母細胞の少量の分画があった。したがって、第５のラウンドの選択では、他のペプチド－ＨＬＡ－Ａ２複合体抗原に結合する可能性のある酵母細胞をさらに除外するために、ＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２複合体を使用して第４ラウンドの選択で選別された酵母細胞を染色することができ、ｓｃＦｖは陽性であるがＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２抗原には陰性染色される酵母細胞を選別することができる（図１Ｂ＃３）。
選択の第６のラウンド：
図１Ｃ＃７～＃９に示すように、第５の選択によって、ＡＩＱ－ＨＡＬ－Ａ２複合体抗原およびｓｃＦｖの発現について二重陽性に染色される酵母集団をさらに富化（５５．８％）し、対照ペプチドであるＧＩＬまたはＳＬＬ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に陽性に結合する酵母細胞のパーセンテージを減少させることができる。予期しないことに、本発明者らは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２について陽性染色された酵母細胞の大部分がＨＬＡ－Ａ２タンパク質についても陽性染色される（２８．１％、図１Ｃ＃６）ことを見出した。第６の選択において、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に高親和性で結合する酵母集団を単離することができる（図１Ｂ＃４）。
選択の第７のラウンド：
図１Ｃ＃１４に示すように、第６の選択によって、ＡＩＱ－ＨＡＬ－Ａ２複合体抗原に高親和性で結合する酵母集団（７４．９％）が富化された。しかし、ＨＡＬ－Ａ２抗原に高親和性で結合する酵母集団（７６．７％）も富化され、これは、選別された酵母細胞のほとんどすべてがＨＬＡ－Ａ２単独に結合できることを示していた。したがって、選択の第７のラウンドでは、ＨＬＡ－Ａ２抗原に陰性結合する酵母細胞（約０．５％）を選別することができる。選択の第７のラウンドの後、本発明者らは、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２について陽性染色される酵母集団が富化された（２２．８％、図１Ｃ＃１９）一方、ＨＬＡ－Ａ２単独で陽性染色されるパーセンテージが減少した（１２．１％、図１Ｃ＃１６）ことを見出した。
選択の第８のラウンド：
ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体について陽性染色される酵母集団をさらに富化するため、図１Ｂ＃６に示すように、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２染色陽性の酵母細胞を第８の選択でさらに選別することができる。この選択の後、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に高親和性で結合する酵母細胞の６９．５％までを富化した（図１Ｃ＃２４）が、ＨＬＡ－Ａ２抗原単独に陽性結合するこれらの酵母細胞の半分（３１．３％、図１Ｃ＃２１）がまだ存在していた。
選択の第９のラウンド：
ＨＬＡ－Ａ２抗原単独に結合することができる酵母集団をさらに除外するため、ＨＬＡ－Ａ２抗原単独について陰性染色された酵母細胞をさらに選別することができる（図１Ｂ＃７）。この選択の後、ＡＩＱ－ＨＬＡ－Ａ２複合体に高親和性で結合する酵母細胞を高度に富化し（６０．６％、図１Ｃ＃２９）、酵母細胞の２．８７％だけ（図１Ｃ＃２６）がＨＬＡ－Ａ２抗原単独に結合した。

配列

参照による組み込み
本明細書で引用した特許、特許出願、および刊行物等のすべての参考文献の開示は、全体としてこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片。
（ａ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質単独、および／または（ｂ）前記ＭＨＣクラスＩタンパク質と複合体を形成した対照ペプチドには結合しないか、または実質的に結合せず、任意選択で、前記対照ペプチドがＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープまたはインフルエンザウイルスＭ１エピトープである、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９を含み、式中、Ｘ_１はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ_２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＱから選択され、Ｘ_３はＱまたはＮから選択され、Ｘ_４はＤまたはＥから選択され、Ｘ_５はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＦから選択され、Ｘ_６はＣ、Ｓ、またはＡから選択され、Ｘ_７はＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦから選択され、Ｘ_８はＡ、Ｖ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ_９はＬ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡから選択される、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
Ｘ_１がＡまたはＶから選択され、Ｘ_２がＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ_３がＱまたはＮから選択され、Ｘ_４がＤまたはＥから選択され、Ｘ_５がＬまたはＩから選択され、Ｘ_６がＣまたはＳから選択され、Ｘ_７がＶ、ＬまたはＩから選択され、Ｘ_８がＡまたはＶから選択され、Ｘ_９がＶ、Ｉ、またはＬから選択される、請求項３に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
Ｘ_１がＡであり、Ｘ_２がＶ、Ｉ、またはＬから選択され、Ｘ_３がＱであり、Ｘ_４がＤであり、Ｘ_５がＬであり、Ｘ_６がＣであり、Ｘ_７がＬであり、Ｘ_８がＡであり、Ｘ_９がＶ、Ｉ、またはＬから選択される、請求項４に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）またはＡＩＱＤＬＣＶＡＶ（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＮＰＭ１ｃネオエピトープが、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ（配列番号７２）、ＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７３）、ＡＶＥＥＶＳＬＲ（配列番号７４）、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７５）、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ（配列番号７６）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ネオエピトープが、アミノ酸配列ＡＩＱＤＬＣＬＡＶ（配列番号１）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ネオエピトープが、７、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸残基長である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＭＨＣクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＭＨＣクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレルによってコードされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲである、ＶＨ、ならびに／または
（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲである、ＶＬ
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨを含み、前記ＶＨＣＤＲ１がアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、前記ＶＨＣＤＲ２がアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、前記ＶＨＣＤＲ３がアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬをさらに含み、前記ＶＬＣＤＲ１がアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、前記ＶＬＣＤ２がアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、前記ＶＬＣＤ３がアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、請求項１３に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、ならびに／または前記ＶＬが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨが配列番号５のアミノ酸配列を含み、および／または前記ＶＬが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、または単鎖抗体分子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
ｓｃＦｖである、請求項１８に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ｓｃＦｖがヒトｓｃＦｖである、請求項１９に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ｓｃＦｖがリンカーを含む、請求項１９または２０に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項２１に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ペプチドリンカーがＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、請求項２２に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号５８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６０）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６１）からなる群から選択される、請求項２３に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号４）を含む、請求項２３に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ｓｃＦｖが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有し、任意選択で、前記ｓｃＦｖが、（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含むＶＨであって、前記ＶＨＣＤＲ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号９）を有し、前記ＶＨＣＤＲ２はアミノ酸配列ＩＳＧＳＧＧＳＴ（配列番号１０）を有し、前記ＶＨＣＤＲ３はアミノ酸配列ＡＲＬＧＹＰＴＴＴＬＬＰＦＤＹ（配列番号１１）を有する、ＶＨ；ならびに／または（ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含むＶＬであって、前記ＶＬＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号６）を有し、前記ＶＬＣＤ２はアミノ酸配列ＡＡＳ（配列番号７）を有し、前記ＶＬＣＤ３はアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号８）を有する、ＶＬを含む、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ｓｃＦｖが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
抗体である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体アイソタイプからなる群から選択される、請求項２８に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項２９に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記抗体が、野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域または野生型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、請求項３０に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記抗体が、変異型ＩｇＧ１重鎖定常領域または変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、請求項３０に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記抗体が変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、前記変異型ＩｇＧ４重鎖定常領域が、以下の置換：ＥＵ番号付けによるＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａのうちのいずれか１つ、またはそれらの組合せを含む、請求項３２に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記抗体が、少なくとも１つの変異を含むＦｃドメインを含む、請求項２８～３０、３２または３３のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記抗原ががん細胞の表面にある、請求項１～３４のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記がんが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項３５に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に、１００ｎＭまたはそれ未満、５０ｎＭまたはそれ未満、２０ｎＭまたはそれ未満、１０ｎＭまたはそれ未満、０．５ｎＭから１００ｎＭまで、または１ｎＭから１５ｎＭまでの平衡解離定数（Ｋｄ）で結合する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
免疫エフェクター細胞上の第２の抗原にさらに特異的に結合する二重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞またはマクロファージである、請求項３８に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記第２の抗原がＣＤ３である、請求項３８または３９に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＣＤ３が、Ｔ細胞上に発現されるヒトＣＤ３である、請求項４０に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記第２の抗原がＮＫｐ４６である、請求項３８または３９に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＮＫｐ４６が、ＮＫ細胞上に発現されるヒトＮＫｐ４６である、請求項４２に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記第２の抗原がＣＤ１６Ａである、請求項３８または３９に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記ＣＤ１６Ａが、ＮＫ細胞上に発現されるヒトＣＤ１６Ａである、請求項４４に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
前記第２の抗原が、ＣＤ４０、ＣＤ４７、４－１ＢＢ、ＴＧＦ－β、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２ＤまたはＤＮＡＭ－１である、請求項３８または３９に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
精製されている、請求項１～４６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
単離された核酸であって、請求項１～４６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を含む核酸。
配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、請求項４８に記載の単離された核酸。
請求項４８または４９に記載の核酸を含む発現ベクター。
請求項５０に記載の発現ベクターによって形質転換された細胞。
請求項１～４６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片を作製するための方法であって、請求項５１に記載の細胞を、前記抗体、またはその抗原結合断片の発現を可能にする条件下で維持するステップを含む方法。
前記抗体、またはその抗原結合断片を精製するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
請求項１～４７のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片の治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、前記細胞外結合ドメインが、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原に特異的に結合する、ＣＡＲポリペプチド。
細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、前記細胞外結合ドメインが、請求項１～２７および３８～４６のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片を含む、ＣＡＲポリペプチド。
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の膜貫通ドメインを含む、請求項５５または５６に記載のＣＡＲポリペプチド。
前記細胞内ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７およびＤＡＰ１２からなる群から選択される１つまたは複数の共刺激分子の１つまたは複数の共刺激ドメインを含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド。
前記細胞内ドメインがＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、前記膜貫通ドメインがＣＤ８膜貫通ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドがＣＤ８ヒンジ領域をさらに含む、請求項５５～５８のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド。
前記細胞内ドメインが、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメイン、および配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み、前記ＣＡＲポリペプチドがＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域を含み、前記ＣＤ８膜貫通ドメインおよびＣＤ８ヒンジ領域が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、前記細胞外結合ドメインが、前記抗体、またはその抗原結合断片、および配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むリーディング配列を含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド。
前記抗体、またはその抗原結合断片が、前記細胞外結合ドメインにおいて、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項５５～６０のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド。
前記細胞内ドメインが、自己切断性ペプチド配列およびサイトカインをさらに含み、自己切断性ペプチドの切断により前記サイトカインが放出される、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド。
前記サイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、またはＣＣＬ１９である、請求項６２に記載のＣＡＲポリペプチド。
配列番号２２に示されるアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項５５または５６に記載のＣＡＲポリペプチド。
請求項５５～６４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチドをコードする、単離された核酸。
配列番号３０のヌクレオチド配列、または配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一な、少なくとも７５％同一な、少なくとも８０％同一な、少なくとも８５％同一な、少なくとも９０％同一な、もしくは少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項６５に記載の単離された核酸。
請求項６５または６６に記載の単離された核酸を含む発現ベクターであって、ウイルス発現ベクターまたは非ウイルス性発現ベクターである発現ベクター。
前記発現ベクターがウイルス発現ベクターであり、前記ウイルス発現ベクターがレンチウイルス発現ベクターである、請求項６７に記載の発現ベクター。
請求項６７または６８に記載の発現ベクターによって形質転換された細胞。
請求項５５～６４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチドを発現する細胞。
前記細胞が免疫エフェクター細胞であり、前記ＣＡＲポリペプチドの発現が、前記免疫エフェクター細胞を、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを含む抗原を発現するがん細胞に標的化させる、請求項６９または７０に記載の細胞。
前記ＭＨＣクラスＩタンパク質が、ＨＬＡ－Ａ＊０２タンパク質であるか、またはＨＬＡ－Ａ＊０２アレルグループによってコードされる、請求項７１に記載の細胞。
前記免疫エフェクター細胞が、野生型ＮＰＭ１を発現するがん細胞を実質的に標的とし、および／またはその殺滅を誘導する、請求項７１または７２に記載の細胞。
前記細胞がＴ細胞である、請求項６９～７３のいずれか一項に記載の細胞。
前記Ｔ細胞がヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞である、請求項７４に記載の細胞。
前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項６９～７３のいずれか一項に記載の細胞。
前記細胞がマクロファージである、請求項６９～７３のいずれか一項に記載の細胞。
前記がん細胞が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の細胞。
請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞を作製するための方法であって、
（ｉ）対象の末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）から細胞を精製するステップ、
（ｉｉ）任意選択で、前記細胞を、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合断片によって活性化するステップ、
（ｉｉｉ）請求項６７または６８に記載の発現ベクターによって前記細胞に形質導入するステップ、
（ｉｖ）前記ＣＡＲポリペプチドを発現する前記細胞を単離するステップ、ならびに
（ｖ）任意選択で、前記単離された細胞を増大させるステップ
を含む方法。
請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞を作製するための方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導して、免疫エフェクター細胞に分化させるステップ、
（ｉｉ）請求項６７または６８に記載の発現ベクターによって前記免疫エフェクター細胞に形質導入するステップ、
（ｉｉｉ）前記ＣＡＲポリペプチドを発現する前記免疫エフェクター細胞を単離するステップ、および
（ｉｖ）任意選択で、前記単離された免疫エフェクター細胞を増大させるステップ
を含む方法。
前記免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞である、請求項８１に記載の方法。
前記免疫エフェクター細胞がマクロファージである、請求項８１に記載の方法。
がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、前記がんを含む細胞の細胞表面が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し、前記方法が、請求項１～４７のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合断片、請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項５４もしくは７９に記載の医薬組成物を、前記がんを治療するのに十分な量で前記対象に投与するステップを含む、方法。
前記がんが急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項８４に記載の方法。
がんを治療する前記方法が、がんの量を減少させる方法、または前記対象における生存期間を延長させる方法である、請求項８４または８５に記載の方法。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療を必要とする対象においてＡＭＬを治療する方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合断片、請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項５４もしくは７９に記載の医薬組成物を、前記ＡＭＬを治療するのに十分な量で前記対象に投与するステップを含む方法。
前記ＡＭＬが、再発性ＡＭＬまたは難治性ＡＭＬである、請求項８５～８７のいずれか一項に記載の方法。
ＡＭＬから寛解している対象においてＡＭＬの再発を予防する方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合断片、請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項５４もしくは７９に記載の医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法。
前記投与のステップの前に、前記対象がＮＰＭ１ｃを発現するか否か、または前記対象がＮＰＭ１遺伝子におけるＮＰＭ１ｃ変異を有するか否かを検出し、前記対象がＮＰＭ１ｃを発現するかまたはＮＰＭ１ｃ変異を有する場合、前記投与のステップに進むステップを含む、請求項８４～８９のいずれか一項に記載の方法。
前記投与が、静脈内、髄腔内、骨内、または脊髄内である、請求項８４～９０のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数の追加の治療薬または手順を投与するステップをさらに含む、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
前記追加の治療薬が、免疫チェックポイント分子の阻害剤であり、任意選択で、前記免疫チェックポイント分子が、ＴＩＭ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４であり、任意選択で、前記阻害剤が抗体である、請求項９２に記載の方法。
対象におけるがんを治療するための医薬の製造における、請求項１～４７のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合断片、請求項５５～６４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド、請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項５４もしくは７９に記載の医薬組成物の使用であって、前記がんを含む細胞の細胞表面が、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）タンパク質と複合体を形成したＮＰＭ１ｃネオエピトープを提示し；任意選択で、前記使用が、１つまたは複数の追加の治療薬または手順と組み合わされたものである、使用。
前記対象がヒトである、請求項８４～９３のいずれか一項に記載の方法、または請求項９４に記載の使用。
（ｉ）請求項１～４７のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合断片、請求項５５～６４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチド、請求項６９～７８のいずれか一項に記載の細胞、または請求項５４もしくは７９に記載の医薬組成物；（ｉｉ）任意選択で、１つまたは複数の追加の治療薬、および（ｉｉｉ）対象におけるがんの治療に使用するための説明書を含む１つまたは複数の容器を含むキット。