DE69133566T2 - Bildung von xenogenen Antikörpern - Google Patents

Description

• Technischer Bereich
• Der Bereich dieser Erfindung ist die Produktion von xenogenen, spezifischen Bindungsproteinen in einem lebensfähigen Säugerwirt.
• Hintergrund
• Monoclonale Antikörper finden sowohl in der Diagnose als auch der Therapie Verwendung. Aufgrund ihrer Fähigkeit, an ein spezifisches Epitop zu binden, können sie einzigartig verwendet werden, um Moleküle zu identifizieren, die jenes Epitop tragen, oder können durch sich selbst oder in Verbindung mit einer anderen Einheit auf eine spezifische Stelle für eine Diagnose oder eine Therapie gerichtet werden.
• Monoclonale Antikörper umfassen schwere und leichte Ketten, die aneinander binden, um eine Bindungsregion für das Epitop zu definieren. Jede der Ketten besteht aus einer variablen Region und einer konstanten Region. Die Aminosäuresequenz der konstanten Region ist spezifisch für einen bestimmten Isotyp des Antikörpers so wie den Wirt, der den Antikörper produziert.
• Aufgrund der Beziehung zwischen der Sequenz der konstanten Region und der Art, von der der Antikörper produziert wird, kann das Einbringen eines xenogenen Antikörpers in das Gefäßsystem des Wirts eine Immunantwort produzieren. Wo der xenogene Antikörper wiederholt eingebracht werden kann, wird es im Fall einer chronischen Krankheit unmöglich, den Antikörper zu verabreichen, da er schnell zerstört werden wird und eine schädliche Wirkung haben kann. Daher hat es viele Bemühungen gegeben, eine Quelle von syngenen oder allogenen Antikörpern bereitzustellen. Eine Technik hat die Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie involviert, die durch die Gene für die schweren und leichten Ketten vom Wirt identifiziert und die Regionen, die die konstante Region codieren, isoliert wurden. Diese Regionen wurden dann mit dem die variable Region bindenden Teil von anderen Immunglobulingenen von einer anderen Spezies, der gegen ein spezifisches Epitop gerichtet ist, verknüpft.
• Während der resultierende chimäre, teilweise xenogene Antikörper im Wesentlichen nützlicher ist als die Verwendung eines vollständig xenogenen Antikörpers, hat er noch eine Reihe von Nachteilen. Die Identifizierung, Isolierung und das Verknüpfen der variablen und konstanten Regionen erfordern beträchtliche Arbeit. Zusätzlich kann das Verknüpfen einer konstanten Region von einer Spezies mit einer variablen Region einer anderen Spezies die Spezifität und Affinität der variablen Regionen ändern, so dass sie die erwünschten Eigenschaften der variablen Region verlieren. In der variablen Region gibt es auch Gerüst- und hypervariable Sequenzen, die spezifisch für eine Spezies sind. Diese Gerüst- und hypervariablen Sequenzen können in unerwünschten antigenen Antworten resultieren.
• Es wäre daher wünschenswerter, allogene Antikörper für die Verabreichung an einen Wirt durch Immunisieren des Wirts mit einem Immunogen von Interesse zu produzieren. Für Primaten, insbesondere Menschen, ist dieser Ansatz nicht praktikabel. Die menschlichen Antikörper, die produziert worden sind, basieren auf dem zufälligen Vorkommen einer verfügbaren Milz von einem Wirt, der vorher gegen das Epitop von Interesse immunisiert worden war, zu Grunde gelegt. Während menschliche periphere Blut-Lymphocyten für die Produktion von monoclonalen Antikörpern verwendet werden können, sind diese in Fusionen nicht besonders erfolgreich gewesen und haben normalerweise nur zu IgM geführt. Darüber hinaus ist es besonders schwierig, eine menschliche Antikörperantwort gegen ein menschliches Protein, ein erwünschtes Ziel in vielen therapeutischen und diagnostischen Anwendungen, zu erzeugen. Es gibt daher ein wesentliches Interesse für das Finden von alternativen Wegen für die Produktion von allogenen Antikörpern für Menschen.
• Relevante Literatur
• Thomas und Capecchi, Cell, 51, 503-512, 1987. Koller und Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8932-8935, 1989, beschreiben das Inaktivieren des B2- Microglobulin-Locus durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen. Berman et. al., EMBO J. 7, 727-738, 1988, beschreiben den menschlichen Ig-VH-Locus. Burke, et al., Science, 236, 806-812, 1987, beschreiben künstliche Hefechromosomen-Vektoren. Siehe auch Garza et al., Science, 246, 641-646, 1989 und Brownstein et al., Science, 244, 1348-1351, 1989. Sakano, et al., beschreiben ein Diversitäts-Segment der Gene der schweren Immunglobulin-Kette. Sakano et al., Nature, 290, 562-565, 1981. Tucker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7684-7688, 1981 beschreiben die Gensequenz der schweren Maus-IgA-Kette. Blankenstein und Kruwinkel Eur. J. Immunol, 17, 1351-1357, 1987 beschreiben die variable Region der schweren Kette der Maus. Siehe auch Joyner et al., Nature, 338, 153-155, 1989, Traver et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 5898-5902, 1989 und Panchis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5109-5113, 1990.
• Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft einen homologen Rekombinations-Zielvektor, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die Homologie zu den intronischen Sequenzen 3' und 5' von sowie proximal zu den Verknüpfungsregion (J)-Segmentgenen einer schweren Kette oder einer kappa-leichten Kette in einem endogenen Immunglobulin-Locus einer Maus aufweist und ein dazwischenlegendes Markergen hat, wobei der Vektor homolog mit dem endogenen Maus-Immunglobulin-Locus rekombinieren und alle Verknüpfungsregion (J)-Gene mit dem Markergen ersetzen kann, um die funktionelle Umlagerung des Locus und die Produktion einer funktionellen Botschaft zu verhindern, die ein Immunglobulin codiert.
• Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung eines endogenen Immunglobulin-Locus der schweren oder kappa-leichten Kette in einem nicht-menschlichen Säuger, umfassend den Schritt des Zerstörens bzw. Deletierens von genügend Sequenzen des Ig-Locus, um eine Umlagerung des Ig-Locus zu verhindern oder um die Produktion einer funktionellen Botschaft zu verhindern, die den Ig-Locus codiert.
• Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Mäuse, die in den Ansprüchen charakterisiert werden.
• Xenogene, spezifische Bindungsproteine werden in einem lebensfähigen, nicht-Primaten-Säugerwirt durch Immunisierung des Säugerwirts mit einem geeigneten Immunogen produziert.
• Der Wirt ist charakterisiert durch: (1) die Unfähigkeit, endogenes Immunglobulin zu produzieren; (2) einen exogenen Immunglobulin-Locus, umfassend mindestens eine konstante Immunglobulin-Region oder ein Protein davon, Immunglobulinsequenzen, die Komponenten der variablen Region von mindestens einer der leichten und schweren Ketten liefern, und mindestens ein Intron mit geeigneten Spleißstellen für das Ausschneiden und den Zusammenbau einer funktionellen Immunglobulin-Untereinheit. Daher wird der Säugerwirt mindestens eine xenogene konstante Region oder ein Protein davon umfassen, die/das in der Lage ist, an eine funktionelle J-Region eines endogenen oder exogenen Immunglobulin-Locus gespleißt zu werden, kann einen vollständigen Immunglobulin-Locus des Wirts haben, der durch einen Teil oder einen vollständigen xenogenen Immunglobulin-Locus substituiert ist, oder kann einen xenogenen Immunglobulin-Locus, der in ein Chromosom der Wirtszelle inseriert wurde, und eine inaktivierte endogene Immunglobulin-Region haben. Diese verschiedenen Alternativen werden zumindest zum Teil durch Verwenden der homologen Rekombination an den Immunglobulin-Loci für die schweren und leichten Ketten erreicht werden.
• BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Andere neue transgenen Säugerwirte als Primaten, insbesondere andere als Menschen werden bereitgestellt, wobei der Wirt zum Errichten einer Immunantwort auf ein Immunogen in der Lage ist, wobei die Antwort Antikörper produziert, die konstante und/oder variable Regionen von Primaten, insbesondere Menschen, oder solche anderen Effektorpeptidsequenzen von Interesse aufweisen. Die Wirte sind dadurch charakterisiert, dass sie zum Produzieren von xenogenen oder modifizierten Antikörpern als ein Ergebnis einer Substitution und/oder Inaktivierung der endogenen Immunglobulin-Untereinheit-codierenden Loci in der Lage sind. Die Modifikationen bewahren mindestens einen Teil der konstanten Regionen, die die Anordnung der Bindungsstelle der variablen Region, die an den C-Terminus gebunden ist, an ein funktionelles Peptid liefert. Das funktionelle Peptid kann viele Formen oder Konformationen annehmen und kann als ein Enzym, ein Wachstumsfaktor, ein Bindungsprotein, ein Ligand, ein Cytokin, ein Effektorprotein, chelatbildende Proteine usw. dienen. Die Antikörper können jeglicher Isotyp, z.B. IgA, D, E, G oder M oder Subtypen innerhalb des Isotyps sein.
• Eine Reihe von Strategien kann verwendet werden, um die erwünschten transgenen Wirte zu erzielen. Verschiedene transgene Wirte können verwendet werden, insbesondere murine, Lagomorpha, Schaf, Schwein, Pferd, Hund, Katze oder dergleichen, normalerweise andere als Primaten. Zum größten Teil sind Mäuse für die Produktion von B-Lymphocyten für die Immortalisierung für die Produktion von Antikörpern verwendet worden. Da Mäuse leicht zu handhaben sind, in großen Mengen produziert werden können und bekannt dafür sind, dass sie ein umfangreiches Immunrepertoire aufweisen, werden Mäuse normalerweise das Tier der Wahl sein. Daher wird sich die folgende Diskussion auf Mäuse beziehen, aber es sollte verstanden werden, dass die Mäuse unter Befolgen derselben Vorgehensweisen leicht durch andere Tiere, insbesondere Säuger, ersetzt werden können.
• In einer Strategie werden die Immunglobulin-Gen-Komplexe der menschlichen schweren und leichten Kette in individuellen Schritten in die Maus-Keimbahn eingebracht, und in einem getrennten Schritt werden die entsprechenden Maus-Gene nicht-funktionell gemacht. Gene der menschlichen schweren und leichten Kette werden in einem geeigneten eukaryontischen oder prokaryontischen Mikroorganismus rekonstruiert, und die resultierenden DNA-Fragmente können in die Pronuclei von fertilisierten Mausoocyten oder embryonalen Stammzellen eingebracht werden. Die Inaktivierung der endogenen Maus-Immunglobulin-Loci wird durch gezielte Zerstörung der geeigneten Loci durch homologe Rekombination in embryonalen Maus-Stammzellen erreicht. In jedem Fall werden chimäre Tiere hergestellt, die zum Teil von den modifizierten embryonalen Stammzellen abstammen und zur Weitergabe der genetischen Modifikationen durch die Keimbahn in der Lage sind. Das Paaren der Mausstämme mit den menschlichen Immunglobulin-Loci mit Stämmen mit inaktivierten Maus-Loci wird Tiere ergeben, deren Antikörperproduktion rein menschlich ist.
• In der nächsten Strategie werden Fragmente der Immunglobulin-Loci der menschlichen schweren und leichten Kette verwendet, um direkt die entsprechenden Maus-Loci durch homologe Rekombination in embryonalen Maus-Stammzellen zu ersetzen. Darauf folgt die Erzeugung von chimären transgenen Tieren, in denen die von embryonalen Stammzellenabstammenden Zellen zu der Keimbahn beitragen.
• Diese Strategien basieren auf der bekannten Organisation der Immunglobulin-Ketten-Loci in einer Reihe von Tieren, da die Organisation, die relative Lage von Exons, die individuelle Domänen codieren, und die Lage von Spleißstellen und transkriptionellen Elementen in unterschiedlichen Ausmaßen verstanden wird. Beim Menschen ist der Locus der schweren Immunglobulin-Kette auf dem Chromosom 14 gelegen. In der 5'-3'-Richtung der Transkription umfasst der Locus ein großes Cluster von Genen der variablen Region (V_H), Gene der Diversitäts (D)-Region, gefolgt von den Genen der Verknüpfungs (J_H) Region und dem Cluster der konstanten (C_H) Gene. Es wird geschätzt, dass die Größe des Locus etwa 2500 Kilobasen (kb) ist. Während der B-Zellentwicklung werden die diskontinuierlichen Gensegmente des Keimbahn-IgH-Locus mittels einer physikalischen Umlagerung der DNA umgelagert, dass sie nebeneinander zu liegen kommen. Damit ein funktionelles schweren Ketten-Ig-Polypeptid produziert wird, müssen drei diskontinuierliche DNA-Segmente von den V_H-, D und J_H-Regionen in einer bestimmten sequenziellen Art verbunden sein; V_H an DJ_H, was die funktionelle Einheit V_HDJ_H bildet. Sobald V_HDJ_H gebildet worden ist, werden nach der Transkription des Ig-Locus spezifische schwere Ketten unter Verwendung der spezifischen V_HDJ_HC_H-Einheit als eine Matrize produziert, die Exons und Introns umfasst. Es gibt zwei Loci für leichte Ig-Ketten, den κ-Locus auf dem menschlichen Chromosom 2 und den λ-Locus auf dem menschlichen Chromosom 22. Die Struktur der IgL-Loci ist ähnlich zu jener des IgH-Locus, außer dass die D-Region nicht vorhanden ist. Nach der IgH-Umlagerung wird die Umlagerung eines Locus der leichten Kette auf ähnliche Weise durch V_L- und J_L-Verknüpfung der κ- oder λ-Kette erreicht. Die Größen der λ- und κ-Loci sind ungefähr je 1000 kb. Die Expression des umgelagerten IgH und einer leichten Igκ- oder Igλ-Kette in einer bestimmten B-Zelle erlaubt die Herstellung von Antikörpermolekülen.
• Um den IgH_hu-Locus zu isolieren, zu clonieren und zu transferieren kann ein künstliches Hefe-Chromosom angewendet werden. Der gesamte IgH_hu-Locus kann in einem oder einigen künstlichen Hefe-Chromosom (YAC)-Clon(en) enthalten sein. Dasselbe gilt für die Loci der leichten Ig-Kette. Ein nachfolgendes Einbringen der geeigneten YAC-Clone der schweren Kette oder der leichten Kette in Empfängerhefe erlaubt die Rekonstruktion der intakten Keimbahn-Ig-Loci durch homologe Rekombination zwischen den überlappenden Regionen der Homologie. Auf diese Weise wird die Isolation der DNA-Fragmente, die die menschliche Ig-Kette codieren, erhalten.
• Um ein breites Spektrum von Antikörpern mit hoher Affinität zu erhalten, ist es nicht nötig, dass man die gesamte V-Region einschließt. Verschiedene V-Region-Genfamilien sind innerhalb des V-Regionclusters verstreut. Daher kann der transgene Wirt eher durch den Erhalt einer Untergruppe der bekannten V-Region-Gene der Ig-Loci der menschlichen schweren und leichten Kette (Berman et al., EMBO J. (1988) 7: 727-738) als des gesamten Komplements von V-Regionen immunisiert werden und in der Lage sein, eine starke Immunantwort zu errichten, und Antikörper mit hoher Affinität liefern. Auf diese Weise können relativ kleine DNA-Fragmente des Chromosoms angewendet werden, zum Beispiel ist ein berichtetes 670 kb-Fragment des Ig_Hu-Locus in 1b gezeigt. Dieses NotI-NotI-Restriktionsfragment würde dazu dienen, um eine Vielzahl von V-Regionen zu liefern, die durch das Rekombinieren mit den verschiednen D- und J-Regionen und dem Durchmachen einer somatischen Mutation eine erhöhte Diversität bereitstellen werden.
• Um die Produktion von menschlichen Antikörpern in einem xenogenen Wirt zu liefern, ist es nötig, dass der Wirt kompetent ist, die nötigen Enzyme und anderen Faktoren, die in die Produktion von Antikörpern involviert sind, bereitzustellen, während ihm die kompetenten endogenen Gene für die Expression der schweren und leichten Untereinheiten der Immunglobuline fehlen. Daher werden jene Enzyme und andere Faktoren, die mit der Keimbahn-Umlagerung, der Spleißung, der somatischen Mutation und dergleichen assoziiert sind, im xenogenen Wirt funktionell sein. Was fehlen wird, ist eine natürliche funktionelle Region, die die verschiedenen Exons umfasst, die mit der Produktion von endogenen Immunglobulin-Untereinheiten assoziiert sind.
• Die menschliche DNA kann in die Pronuclei von fertilisierten Oocyten oder in embryonale Stammzellen eingebracht werden. Die Integration kann zufällig oder homolog sein, abhängig von der bestimmten Strategie, die angewendet werden soll. So können durch Verwenden der Transformierung unter Verwendung von repetitiven Schritten oder in Kombination mit dem Züchten transgene Tiere, die menschliche Antikörper in der wesentlichen Abwesenheit von leichten oder schweren Wirts-Immunglobulin-Untereinheiten produzieren können, erhalten werden.
• Um die Wirts-Immunglobulin-Loci zu inaktivieren, kann die homologe Rekombination angewendet werden, wo die DNA an den Immunglobulin-Loci der schweren und leichten Kette eingebracht wird, was die Produktion von endogenen Immunglobulin-Untereinheiten verhindert. Da es zwei Allele der schweren Kette und zwei Loci der leichten Kette gibt, jeder mit zwei Allelen, muss es mehrere Transformationen geben werden, die in der Inaktivierung von jedem der Allele resultieren, obwohl man wählen kann, die λ-Loci zu ignorieren. (Transformierung soll jegliche Technik zum Einbringen von DNA in eine lebensfähige Zelle bezeichnen, wie Konjugierung, Transformierung, Transfektion, Transduktion, Elektroporation, Lipofektion, Biolistik oder dergleichen.) Die homologe Rekombination kann angewendet werden, um jeden der Loci durch Einbringen der homologen DNA in embryonale Stammzellen, gefolgt vom Einbringen der modifizierten Zellen in Empfänger-Blastocysten, funktionell zu inaktivieren. Eine nachfolgende Züchtung erlaubt eine Keimbahntransmission des inaktivierten Locus. Man kann daher auswählen, heterozygote Nachkommen zu züchten und auf homozygote Nachkommen von den heterozygoten Eltern zu selektieren, oder man kann wieder die embryonale Stammzelle für eine homologe Rekombination und Inaktivierung des vergleichbaren Locus verwenden.
• Die Zahl der Transformierungsschritte kann durch Bereitstellen von mindestens einem Fragment des menschlichen Locus einer Immunglobulin-Untereinheit für die homologe Rekombination mit dem analogen endogenen Immunglobulin reduziert werden, so dass der menschliche Locus zumindest einen Teil des Wirts-Immunglobulin-Locus mit resultierender Inaktivierung des Locus der Wirts-Immunglobulin-Untereinheit substituiert. Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Transformierung für eine einzelne Inaktivierung, gefolgt von der Züchtung der heterozygoten Nachkommen, um einen homozygoten Nachkommen zu produzieren. Wo der menschliche Locus für die Substitution oder Insertion in den Wirts-Locus für die Inaktivierung verwendet wird, kann die Zahl der Transformierungen auf drei Transformierungen limitiert werden, und, wie schon angedeutet, kann man wählen, den weniger verwendeten λ-Locus zu ignorieren und die Transformierungen auf zwei Transformierungen zu limitieren. Alternativ kann man wählen, das Anwenden von embryonalen Stammzellen von Nachkommen, von denen vorher ein oder mehrere Loci inaktiviert wurden, für die Inaktivierung als einen separaten Schritt für jeden Locus bereitzustellen. In dem Fall, wenn nur die Transformierung verwendet wird und der menschliche Locus in zufälliger Art in das Wirtsgenom integriert wird, können insgesamt acht Transformierungen erforderlich sein.
• Für die Inaktivierung kann jede Störung im Ziellocus, die in der Verhinderung der Expression einer Immunglobulin-Untereinheit jenes Locus resultiert, verwendet werden. So kann die Störung in einer Region sein, die den Enhancer z.B. 5'-stromaufwärts oder ein Intron in den V-, J- oder C-Regionen umfasst, und bei der schweren Kette existiert die Möglichkeit in der D-Region, oder sie kann eine Kombination davon sein. Daher ist der wichtige Faktor, dass die Ig-Keimbahn-Gen-Umlagerung verhindert wird oder eine funktionelle Botschaft, die die Immunglobulin-Untereinheit codiert, entweder aufgrund des Versagens der Transkription, eines Versagens der Prozessierung der Botschaft oder dergleichen nicht produziert werden kann.
• Wenn man nur an der Inaktivierung des Immunglobulin-Untereinheits-Locus interessiert ist, wird die Störung vorzugsweise in die J-Region des Immunglobulin-Untereinheits-Locus eingebracht werden. Daher produziert man ein Konstrukt, dem eine funktionelle J-Region fehlt und das die Sequenzen der J-Region umfassen kann, die benachbart zu und stromaufwärts und/oder stromabwärts von der J-Region sind, oder das die gesamte oder einen Teil der Region mit einer inaktivierenden Insertion in der J-Region umfasst. Die Insertion kann 50 bp oder mehr sein, wobei eine solche Insertion in der Zerstörung der Bildung einer funktionellen mRNA resultiert. Wünschenswerterweise wird die gesamte J-Region oder ein wesentlicher Teil davon, normalerweise mindestens etwa 75% des Locus, vorzugsweise mindestens etwa 90% des Locus deletiert. Wenn gewünscht, kann sich die Störung zwischen den zwei flankierenden Sequenzen, die die homologe Region definieren, über die J-Region hinaus in die variable Region und/oder in die konstante Region erstrecken.
• Wünschenswerterweise wird ein Markergen verwendet, um die J-Region zu ersetzen. Verschiedene Marker können angewendet werden, insbesondere jene, die eine positive Selektion ermöglichen. Von besonderem Interesse ist die Verwendung der G418-Resistenz, die aus der Expression des Gens für die Neomycin-Phosphotransferase resultiert.
• Stromaufwärts und/oder stromabwärts des Zielgen-Konstrukts kann ein Gen liegen, das eine Identifizierung liefert, ob ein doppeltes Überkreuzen erfolgt ist. Zu diesem Zweck kann das Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen verwendet werden, da Zellen, die das Thymidinkinase-Gen exprimieren, durch die Verwendung von Nucleosid-Analogen wie Acyclovir oder Gancyclovir durch ihre cytotoxischen Wirkungen auf Zellen, die ein funktionelles HSV-tk-Gen enthalten, getötet werden können. Das Fehlen der Empfindlichkeit gegenüber diesen Nucleosid-Analogen weist auf das Fehlen des HSV-Thymidinkinase-Gens hin, und somit, dass auch ein doppeltes Crossover erfolgt ist, wenn eine homologe Rekombination erfolgt ist.
• Während die Anwesenheit des Markergens im Genom darauf hinweisen wird, dass eine Integration erfolgt ist, wird es noch notwendig sein, zu bestimmen, ob eine homologe Integration erfolgt ist. Dies kann durch eine Reihe von Wegen erzielt werden. Zum größten Teil wird eine DNA-Analyse angewendet werden, um die Lage der Integration zu etablieren. Durch Anwenden von Sonden für die Insertion und dann Sequenzieren der 5'- und 3'-Regionen, die die Insertion flankieren, auf das Vorliegen des Ziel-Locus, der sich über die flankierenden Regionen des Konstrukts erstreckt, oder Identifizieren des Vorliegens einer Deletion, wenn solch eine Deletion eingebracht worden ist, kann die gewünschte Integration etabliert werden.
• Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann vorteilhafterweise im Nachweisen des Vorliegens einer homologen Rekombination verwendet werden. Sonden können verwendet werden, die komplementär zu einer Sequenz innerhalb des Konstrukts und komplementär zu einer Sequenz außerhalb des Konstrukts und am Ziel-Locus sind. Auf diese Weise kann man nur DNA-Ketten erhalten, die beide Primer haben, die in den komplementären Ketten vorliegen, wenn eine homologe Rekombination erfolgt ist. Durch Demonstrieren des Vorliegens der Sonden für die Sequenz mit der erwarteten Größe wird das Erfolgen der homologen Rekombination unterstützt.
• Das Konstrukt kann darüber hinaus ein Replikationssystem einschließen, das in der Säuger-Wirtszelle funktionell ist. Zum größten Teil werden diese Replikationssysteme virale Replikationssysteme wie Affenvirus 40, Epstein-Barr-Virus, Polyomavirus, Papillomvirus und dergleichen einschließen. Verschiedene transkriptionelle Startsysteme können angewendet werden, entweder von Viren oder von Säuger-Genen wie SV40, Metallothionein-I- und II-Gene, β-Actin-Gen, frühe und späte Adenovirus-Gene, Phosphoglyceratkinase-Gen, RNA-Polymerase II-Gen oder dergleichen. Zusätzlich zu Promotoren können Wildtyp-Enhancer angewendet werden, um die Expression des Markergens weiter zu verstärken.
• Beim Konstruieren der betreffenden Konstrukte für die homologe Rekombination kann eine Replikationssystem für Prokaryonten, insbesondere E. coli, für das Herstellen des Konstrukts, das Clonieren nach jeder Manipulation, die Analyse wie die Restriktionskartierung oder die Sequenzierung, die Expansion und Isolierung der erwünschten Sequenz eingeschlossen werden. Wo das Konstrukt groß ist, im Allgemeinen etwa 50 kbp übersteigend, normalerweise 100 kbp übersteigend und normalerweise nicht mehr als etwa 1000 kbp, kann ein künstliches Hefechromosom (YAC) für die Clonierung des Konstrukts verwendet werden.
• Sobald ein Konstrukt hergestellt worden ist und jegliche unerwünschte Sequenzen, z.B. prokaryontische Sequenzen, entfernt worden sind, kann das Konstrukt in die Zielzelle eingebracht werden. Jede praktische Technik für das Einbringen der DNA in die Zielzellen kann angewendet werden. Die Techniken schließen Sphäroblastenfusion, Lipofektion, Elektroporation, Calciumphosphat-vermittelten DNA-Transfer oder direkte Mikroinjektion ein. Nach der Transformierung oder Transfektion der Zielzellen können die Zielzellen mit Hilfe von positiven und/oder negativen Markern, wie vorher angezeigt, Neomycin-Resistenz und Acyclovir- oder Gancyclovir-Resistenz, selektiert werden. Jene Zellen, die den erwünschten Phänotyp zeigen, können dann durch Restriktionsanalyse, Elektrophorese, Southern-Analyse, PCR oder dergleichen weiter analysiert werden. Durch Identifizieren von Fragmenten, die die Anwesenheit der Störungen) am Ziel-Locus zeigen, kann man die Zellen identifizieren, in denen eine homologe Rekombination erfolgt ist, um eine Kopie des Ziel-Locus zu inaktivieren.
• Der oben beschriebene Vorgang kann zuerst mit einem Locus der schweren Kette in einer embryonalen Stammzelle und dann Reifen der Zellen, um einen reifen, fertilen Wirt zu liefern, durchgeführt werden. Dann kann durch Züchten der heterozygoten Wirte ein homozygoter Wirt erhalten werden, oder embryonale Stammzellen können isoliert und transformiert werden, um den zweiten IgH-Locus zu inaktivieren, und der Vorgang wiederholt werden, bis alle erwünschten Loci inaktiviert worden sind. Alternativ kann der Locus der leichten Kette der erste sein. Bei jedem Stadium können die menschlichen Loci eingebracht werden.
• Wie bereits angedeutet, kann der Ziel-Locus mit dem analogen menschlichen Locus substituiert werden. Auf diese Weise wird der menschliche Locus im Wesentlichen in dieselbe Region wie der analoge Wirts-Locus platziert werden, so dass jegliche, mit der Position des Locus assoziierte Regulierung im Wesentlichen dieselbe für den menschlichen Immunglobulin-Locus sein wird. Zum Beispiel kann man durch Isolieren des gesamten V_H-Genlocus (einschließlich der V-, D- und J-Sequenzen) oder eines Teils davon und Flankieren des menschlichen Locus mit Sequenzen des Maus-Locus, vorzugsweise Sequenzen, die durch mindestens etwa 5 kbp im Wirts-Locus, vorzugsweise mindestens etwa 10 kbp im Wirts-Locus getrennt sind, das menschliche Fragment in diese Region in (einem) rekombinatorischen Vorgang (Vorgängen), der (die) den menschlichen Immunglobulin-Locus für die variable Region des Wirts-Immunglobulin-Locus substituiert (substituieren), inserieren. Auf diese Weise kann man die Fähigkeit des Wirts, eine endogene Immunglobulin-Untereinheit zu produzieren, zerstören, während man dem Promotor des menschlichen Immunglobulin-Locus erlaubt, durch den Wirts-Enhancer aktiviert und durch das regulatorische System des Wirts reguliert zu werden.
• Sobald die menschlichen Loci entweder durch homologe Rekombination oder durch zufällige Integration in das Wirtsgenom eingebracht worden sind und die Wirtstiere mit den endogenen Immunglobulin-Loci produziert worden sind, die durch geeignete Züchtung der verschiedenen transgenen oder mutierten Tieren inaktiviert worden sind, kann man einen Wirt produzieren, dem die natürliche Fähigkeit fehlt, endogene Immunglobulin-Untereinheiten zu produzieren, aber der die Fähigkeit hat, menschliche Immunglobuline mit zumindest einem beträchtlichen Teil des menschlichen Repertoires zu produzieren.
• Die funktionelle Inaktivierung der zwei Kopien von jedem der drei Wirts-Ig-Loci, wobei der Wirt das menschliche IgH und die menschlichen Ig-κ- und/oder -λ- Loci enthält, würde die Produktion von rein menschlichen Antikörpermolekülen ohne die Produktion von Wirts- oder chimären Wirt/Mensch-Antikörpern ermöglichen. Solch ein Wirtsstamm würde durch die Immunisierung mit spezifischen Antigenen mit der Produktion von Maus-B-Zellen antworten, die spezifische menschliche Antikörper produzieren, wobei die B-Zellen mit Maus-Myelomzellen fusioniert werden oder auf irgendeine andere Weise für die kontinuierliche, stabile Produktion von menschlichen, monoclonalen Antikörpern immortalisiert werden könnten.
• Die betreffende Methodik und die Strategien müssen nicht auf das Produzieren von vollständigen Immunglobulinen limitiert sein, sondern liefern die Möglichkeit, Regionen bereitzustellen, die mit einem Teil der konstanten Region, z.B. C_H1, C_H2, C_H3 oder C_H4 oder Kombinationen davon, verknüpft sind. Alternativ können ein oder mehrere der Exons der C_H- und C_κ oder C_λ-Regionen ersetzt oder mit einer Sequenz verknüpft werden, die ein unterschiedliches Protein wie ein Enzym, z.B. den Plasminogen-Aktivator, die Superoxiddismutase usw.; eine Toxin-A-Kette, z.B. Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin usw.; Wachstumsfaktoren; ein cytotoxisches Mittel, z.B. TNF oder dergleichen codiert. Siehe zum Beispiel WO 89/07142; WO 89/09344; und WO 88/03559. Durch Inserieren des Proteins von Interesse in ein Exon der konstanten Region und Bereitstellen der Spleißung der variablen Region an das modifizierte Exon der konstanten Region kann das resultierende Bindungsprotein eine unterschiedliche C-terminale Region von dem Immunglobulin haben. Durch Bereitstellen einer Stoppsequenz mit dem inserierten Gen wird das Proteinprodukt das inserierte Protein als die C-terminale Region haben. Wenn erwünscht, kann die konstante Region durch Bereitstellen eines Konstrukts mit den geeigneten Spleißstellen zum Verknüpfen der variablen Region mit dem anderen Protein vollständig durch das andere Protein substituiert werden.
• Die Antikörper- oder Antikörper-Analoge-produzierenden B-Zellen von dem transgenen Wirt können für eine Fusion an eine myeloide Maus-Zelle verwendet werden, um Hybridome zu produzieren, oder durch eine andere konventionelle Vorgehensweise, z.B. die Transfektion mit Oncogenen, immortalisiert werden. Diese immortalisierten Zellen können dann in kontinuierlicher Kultur gezüchtet oder für die Produktion von Ascites in das Peritoneum eines kompatiblen Wirts eingebracht werden.
• Die betreffende Erfindung liefert die Produktion eines menschlichen polyclonalen Antiserums oder von menschlichen monoclonalen Antikörpern oder Antikörperanalogen. Wenn der Säugerwirt mit einem Immunogen immunisiert worden ist, können die resultierenden menschlichen Antikörper von anderen Proteinen durch die Verwendung einer Affinitätssäule isoliert werden, die eine Fc-Bindungseinheit wie Protein A oder dergleichen aufweist.
• Für das Produzieren von Tieren aus embryonalen Stammzellen können die Zellen nach der Transformierung auf Feeder-Zellen in einem geeigneten Medium, z.B. einem mit fötalem Rinderserum angereicherten DMEM plattiert werden. Die Zellen, die das Konstrukt enthalten, können durch Anwenden eines selektiven Mediums nachgewiesen werden, und nach ausreichender Zeit für Kolonien, um zu wachsen, können Kolonien gepickt und auf das Auftreten einer Integration oder einer homologen Rekombination analysiert werden. Wie vor kurzem beschrieben, kann die PCR mit Primern innerhalb der oder ohne die Konstruktsequenz, aber am Ziel-Locus verwendet werden.
• Jene Kolonien, die eine homologe Rekombination zeigen, können dann für die Embryomanipulation und Blastocysten-Injektion verwendet werden. Blastocysten können von Weibchen durch Spülen des Uterus 3-5 Tage nach der Ovulation erhalten werden. Die embryonalen Stammzellen können dann mit Trypsin behandelt und die modifizierten Zellen zu einem Tropfen, der die Blastocyste enthält, zugefügt werden. Mindestens eine und bis zu 30 modifizierte embryonale Stammzellen können in das Blastocoel der Blastocyste injiziert werden. Nach der Injektion werden mindestens eine und nicht mehr als etwa 15 der Blastocysten in jedes uterine Horn von pseudo-schwangeren Weibchen zurückgegeben. Den Weibchen wird dann erlaubt, die Jungen auszutragen, und der resultierende Wurf wird auf mutierte Zellen durchmustert, die das Konstrukt haben.
• Die Säuger können jeder nicht-menschliche, insbesondere nicht-Primaten-Säuger wie Labortiere, insbesondere kleine Labortiere wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen usw., domestizierte Tiere, Haustiere usw. sein.
• Die folgenden Beispiele werden als Illustration angeboten und nicht als Limitierung.
• EXPERIMENTELLES
• Inaktivierung der J-Gene der schweren Kette der Maus
• Konstruktion des Inaktivierungsvektors
• Ein 6,4 Kb-EcoRI-Fragment, das die J-Gene der schweren Kette der Maus und flankierende Sequenzen enthält, wird von einer genomischen Balb/c-Mausembryo-Genbank unter Verwendung der Sonden, die in Sakano et al., Nature 290: 562-565, 1981, beschrieben sind, cloniert. Dieses Fragment (mDJ) wird in ein EcoRI-verdautes pUC19-Plasmid (pmDJ) inseriert. Ein 2,9 Kb-Fragment, das die 4 J-Gene enthält, wird durch einen XhoI-ScaI-Verdau (pmDδJNeo, siehe Diagramm 1) deletiert. Ein 1150 bp-XhoI-BamHI-Fragment, das ein Neomycin-Resistenzgen enthält, das durch den Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (HSV-tk)-Promotor und einen Polyoma-Enhancer gelenkt wird, wird von pMC1Neo (Thomas und Capecchi, Cell, 51, 503-512, 1987) isoliert. Ein synthetischer Adapter wird an dieses Fragment angefügt, um das BamHI-Ende in ein ScaI-Ende zu konvertieren, und das resultierende Fragment wird mit dem XhoI-ScaI-pmDδJ verknüpft, um den Inaktivierungsvektor (pmDδJ.Neo) zu bilden, in dem die 5'- zu 3'-Orientierung des Neomycins und der Promotoren der schweren Kette identisch ist. Dieses Plasmid wird vor der Transfektion in ES-Zellen durch einen NdeI-Verdau linearisiert. Die Sequenzen, die den homologen Rekombinationsvorgang lenken, sind 3 kb- und 0,5 kb-Fragmente, die 5' beziehungsweise 3' vom Neomycingen gelegen sind.
• Diagramm 1 Inaktivierungsvektor der J-Gene der schweren Kette der Maus (A) Angezielte J-Gene der schweren Kette der Maus

  
• (B) Inaktivierungsvektor mDΔJ.Neo

  
• Die ES-Zelllinie E14TG2a (Hooper et al., Nature, 326: 292-295, 1987) wird auf Mitomycin-behandelten primären embryonalen Fibroblasten-Feederzellen, im Wesentlichen wie beschrieben (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45, 1985), kultiviert. Die embryonalen Fibroblasten werden von Embryonen von C57BL/6-Weibchen hergestellt, die 14 bis 17 Tage vorher mit einem Männchen, das homozygot für ein Neomycin-Transgen ist (Gossler et al., PNAS 83: 9065-9069, 1986), gepaart worden sind. Diese Zellen sind zum Wachstum in Medien, die G418 enthalten, in der Lage. Die Elektroporationsbedingungen werden von Boggs et al., Ex. Hematol. (NY) 149: 988-994, 1986, beschrieben. Die ES-Zellen werden mit Trypsin behandelt, in Kulturmedium in einer Konzentration von 4 × 10⁷/ml resuspendiert und in der Anwesenheit der Ziel-DNA in einer Konzentration von 12 nM im ersten Experiment und 5 nM DNA im zweiten einer Elektroporation unterzogen. Eine Spannung von 300 V mit einer Kapazität von 150-250 μF wird mit einer Elektroporationskammer von 5 mm Länge und 100 mm² Querschnitt als optimal befunden. 5 × 10⁶ durch Elektroporation behandelte Zellen werden auf Mitomycin-behandelte Fibroblasten in 100 mm-Schalen in der Anwesenheit von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, plattiert. Das Medium wird 24 h nach der Elektroporation mit Medium, enthaltend 200 μg/ml G418, ersetzt.
• ES-Kolonien, die 10-14 Tage nach der Elektroporation resultieren, werden mit ausgezogenen Kapillarpipetten für die Analyse unter Verwendung der PCR gepickt. Die Hälfte einer jeden gepickten Kolonie wird in Platten mit 24 Vertiefungen, in die schon mit Mitomycin-behandelte Feeder-Zellen ausgesät wurden, aufgehoben. Die anderen Hälften werden, in Pools von 3-4 kombiniert, in Eppendorf-Röhrchen übertragen, die ungefähr 0,5 ml PBS enthalten, und durch PCR auf eine homologe Rekombination analysiert. Die Bedingungen für die PCR-Reaktionen sind im Wesentlichen, wie beschrieben (Kim und Smithies, Nucleic Acids Res. 16: 8887-8893, 1988). Nach dem Pelletieren werden die ES-Zellen in 5 μl PBS resuspendiert und werden durch die Zugabe von 55 μl H₂O zu jedem Röhrchen lysiert. DNAsen werden durch Erhitzen jedes Röhrchens bei 95°C für 10 min inaktiviert. Nach der Behandlung mit Proteinase K bei 55°C für 30 min werden 30 μl von jedem Lysat in ein Röhrchen übertragen, enthaltend 20 μl eines Reaktionsgemisches, einschließlich PCR-Puffer: 1,5 μg von jedem Primer, 3 E Taq-Polymerase, 10% DMSO und je 0,2 mM dNTPs. Die PCR-Expansion verwendet 55 Zyklen unter Verwendung eines Thermocyclers mit 65 Sekunden Schmelzen bei 92°C und einer 10 min-Anlagerungs- und Extensionszeit bei 65°C. Die zwei Primer-Oligonucleotide sind TGGCGGACCGCTATCCCCCAGGAC und TAGCCTGGGTCCCTCCTTAC, die einer Region 650 Basen 3' des Startcodons des Neomycingens bzw. Sequenzen entsprechen, die im Gen der schweren Kette der Maus 1100 Basen 3' der Insertionsstelle liegen. 20 μl des Reaktionsgemisches werden der Elektrophorese auf Agarosegelen unterzogen und auf Nylonmembranen (Zeta Bind) transferiert. Die Filter werden mit einem ³²P-markierten Fragment des 991 bp-XbaI-Fragments der J-C-Region sondiert.
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• Inaktivierung der J-Gene der schweren Ig-Kette der Maus in ES-Zellen. Konstruktion des Inaktivierungsvektors
• Ein 6,1 Kb-EcoRI-Fragment, das die J-Region-Gene und flankierende Sequenzen der schweren Immunglobulin-Kette der Maus enthält, von einer genomischen Balb/c-Mausembryo-Genbank cloniert und in pUC18 (pJH) inseriert, wurde mit XhoI und NaeI verdaut, um ein etwa 2,3 kbp-Fragment zu deletieren, das die vier J-Gene enthält (siehe Diagramm 2A). Ein etwa 1,1 kbp-XhoI-BamHI-Fragment, das an der BamHI-Stelle abgestumpft ist und ein Neomycin-Resistenzgen, das durch den Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (HSV-tk)-Promotor und einen Polyoma-Enhancer gelenkt wird, enthält, wurde von pMC1Neo (Thomas und Capecchi, Cell, 51, 503-512, 1987) isoliert. Dieses Fragment wurde in das XhoI-NaeI-deletierte pJH inseriert, um den Inaktivierungsvektor zu bilden (pmHδJ, siehe Diagramm 2B), in dem die transkriptionelle Orientierung des der Gene Neomycins und der schweren Kette dieselbe ist. Dieses Plasmid wurde durch NdeI-Verdau vor der Transfektion in ES-Zellen linearisiert. Die Sequenzen, die den homologen Rekombinationsvorgang lenken, sind etwa 2,8 kbp und etwa 1,1 kbp-Fragmente, die 5' beziehungsweise 3' des Neomycingens liegen.
• Kultivieren, Elektroporation und Selektion von ES-Zellen
• Die ES-Zelllinie E14TG2a (Koller und Smithies, 1989, PNAS, USA, 86, 8932-8935) wurde auf Mitomycin C-behandelten embryonalen Fibroblasten-Feederzellschichten kultiviert, wie beschrieben (Koller und Smithies, 1989, PNAS, USA, 86, 8932-8935). Die ES-Zellen wurden mit Trypsin behandelt, in HBS-Puffer (pH 7,05; 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 0,7 mM Na₂HPO₄, 21 mM HEPES pH 7,1) in einer Konzentration von 2 × 10⁷/ml resuspendiert und in der Anwesenheit von 50 μg/ml des linearisierten Inaktivierungsvektors einer Elektroporation unterzogen. Die Elektroporation wurde mit einem BioRad-Gene Pulser unter Verwendung von 240 Volt und 500 μF Kapazität durchgeführt. 5 × 10⁶ durch Elektroporation behandelte Zellen wurden auf Mitomycin C-behandelte Fibroblasten in 100 mm-Schalen in der Anwesenheit von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol plattiert. Das Medium wurde 24 h nach der Elektroporation mit Medium, enthaltend 200 μg/ml G418, ersetzt. G418-resistente ES-Kolonien, die 12-14 Tage nach der Elektroporation resultierten, wurden mit ausgezogenen Kapillarpipetten für die Analyse unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gepickt. Die Hälfte einer jeden gepickten Kolonie wurde in eine individuelle Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen transferiert, in die schon mit Mitomycin C-behandelte Feeder-Zellen ausgesät wurden. Die anderen Hälften wurden, in Pools von 4 kombiniert, in Eppendorf-Röhrchen übertragen, die 0,3 ml PBS enthielten, und die Zelllysate wurden für die PCR-Analyse vorbereitet, wie von Joyner et al beschrieben (Nature, 338: 153-155, 1989). Die PCR-Reaktion schloss 5-20 μl des Zelllysats, 1 μM von jedem Primer, 1,5 E Taq-Polymerase und 200 μM der dNTPs ein. Die PCR-Amplifikation verwendete 45 Zyklen unter Verwendung eines Thermalcyclers (Perkin-Elmer Cetus) mit 1 min Schmelzen bei 94°C, 2 min Anlagern bei 55°C und 3 min Extension bei 72°C. Die zwei Primer-Oligonucleotide sind ACGGTATCGCCGCTCCCGAT und AGTCACTGTAAAGACTTCGGGTA, die etwa 120 Basen 5' der BamHI-Stelle des Neomycingens bzw. den Sequenzen, die im Gen der schweren Kette der Maus etwa 160 Basen 3' der Insertionsstelle liegen, entsprachen. Eine erfolgreiche homologe Rekombination erbringt ein etwa 1,4 kbp-Fragment. 20 μl des Reaktionsgemisches werden auf 1% Agarosegelen der Elektrophorese unterzogen, mit Ethidiumbromid gefärbt und auf Nylonmembranen (Gene Screen) transferiert. Die Filter wurden mit einem ³²P-markierten etwa 1,4 kbp-EcoRI-PstI-Fragment sondiert, das in der schweren Kette der Maus 3' der Insertionsstelle gelegen ist (siehe Diagramm 2). Für eine weitere Analyse wurde genomische DNA von ES-Zellen hergestellt, mit Restriktionsenzymen verdaut, wie es von den Herstellern empfohlen wurde, und die Fragmente wurden auf 1% Agarosegelen aufgetrennt. Die DNA wurde auf Nylonmembranen (Gene Screen) transferiert und mit dem ³²P-markierten Fragment sondiert, wie oben beschrieben.
• Analyse von G418-resistenten ES-Kolonien
• Im ersten Experiment wies die PCR-Analyse der gepoolten Kolonien ein positives PCR-Signal von der erwarteten Größe (etwa 1,4 kbp) bei 34 Pools, die 136 G418-resistente Kolonien repräsentieren, nach. Die vier individuellen Kolonien, die zu diesem positiven Pool beigetragen hatten, wurden individuell durch PCR analysiert, und ein positiver Clon, ES33D5, wurde identifiziert. Eine ähnliche Analyse von 540 G418-resistenten Kolonien, die im zweiten Experiment erhalten wurden, ergab 4 zusätzliche positive Clone (ES41-1, ES61-1, ES65-1, ES110-1).
• Um die gezielte Zerstörung einer Kopie der J-Gene zu bestätigen (das Gen ist autosomal und daher in zwei Kopien vorhanden), wurden die PCR-positiven Clone expandiert, und genomische DNA wurde hergestellt, mit HindIII oder mit SacI verdaut und durch Southern-Analyse, wie beschrieben, unter Verwendung der EcoRI-PstI-Sonde analysiert.
• Der Ersatz der J-Gene durch die Insertion des Neomycin-Gens durch einen homologen Rekombinationsvorgang resultiert in einem, mit der EcoRI-PstI-Sonde nachweisbaren HindIII-Fragment, das aufgrund des Verlustes von zwei HindIII-Stellen, die in der deletierten J-Gen-Region liegen, etwa 1,9 kbp länger ist als das äquivalente Fragment im natürlichen Locus (siehe Diagramm 2C). Die Southern-Analyse von jedem der 5 positiven Clone durch HindIII-Verdau ergab ein Muster, das darauf hinwies, dass eine der zwei Kopien der J-Gene der schweren Kette zerstört worden war. Drei markierte Fragmente wurden nachgewiesen: ein Fragment (etwa 760 bp), das in der Größe identisch mit jenem ist, das in unbehandelten Zellen in derselben Intensität vorhanden ist, ein Fragment (etwa 2,3 kbp), das in der Größe identisch mit jenem ist, das in unbehandelten Zellen vorhanden ist, aber in verminderter Intensität im PCR-positiven Clon, und ein zusätzliches Fragment von etwa 4,2 kbp, die Größe, die für einen homologen Rekombinationsvorgang vorhergesagt wird, das nur in den PCR-positiven Clonen vorhanden ist. Auf ähnliche Weise resultiert der Ersatz der J-Gene durch das Neomycingen durch einen homologen Rekombinationsvorgang in einem Verlust einer SacI-Stelle und dem Auftreten eines Fragments, das mit der EcoRI-PstI-Sonde nachweisbar ist und das etwa 570 bp kleiner als das äquivalente Fragment im natürlichen Locus ist (siehe Diagramm 2C). Die Southern-Analyse der Clone durch SacI-Verdau ergab das erwartete Muster von einem natürlichen und einem angezielten Allel: ein etwa 4,0 kbp-Fragment, das in der Größe identisch zu jenem ist, das in unbehandelten Zellen vorhanden ist, aber von verminderter Intensität in den 5 positiven Clonen ist, und ein zusätzliches Fragment von etwa 3,4 kbp, die Größe, die für einen gezielten homologen Rekombinationsvorgang vorhergesagt wurde, das nur in den identifizierten Clonen vorhanden ist. Die Rehybridisierung der Southern-Blots mit einer Sonde für das Neomycingen zeigt, dass nur die 4,2 kbp- und 3,4 kbp- Fragmente, die aus dem HindIII beziehungsweise dem SacI-Verdau resultieren, an die Sonde hybridisierten, wie durch den Zielvorgang vorhergesagt.
• Inaktivierung der J-Gene der schweren Immunglobulin-Kette der Maus in Mäusen
• Injektion von angezielten ES-Zellen in Maus-Blastocysten und Herstellung von chimären Nachkommen
• Die Mäuse wurden von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) gekauft. Dreieinhalb Tage alte C57BL/6-Blastocysten wurden von 4-5 Wochen alten, superovulierten Weibchen erhalten, wie von Koller et al. 1989 (vorstehend) beschrieben. ES-Zellen wurden trypsiniert, einmal mit frischem DMEM-Medium gewaschen und auf etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml in M2-Medium verdünnt. Etwa 5 μl der Zellen wurden zu einem 150 μl-Tropfen von M2-Medium unter Paraffinöl, der die Blastocysten enthielt, zugefügt. Zehn bis 15 Zellen wurden in das Blastocoel von jeder Blastocyste injiziert. Sechs bis neun ES-Zellen-enthaltende Blastocysten wurden in jedes Uterushorn von pseudo-schwangeren C57BL/6 × DBA-F1-Weibchen, die 2,5 Tage vorher mit vasectomierten Männchen gepaart wurden, zurückgegeben. Junge, die von den injizierten Blastocysten stammen, wurden im Allgemeinen 16-18 Tage später geboren. Der Beitrag der ES-Zellen zu dem Nachkommen wurde optisch durch Untersuchung der Fellfarbe der Jungen beurteilt. Die Blastocysten wurden von C57BL/6-Mäusen erhalten, die eine einheitlich schwarze Farbe hatten. Die ES-Zelllinie E14TG2a, die Eltern-Linie, von der die angezielten Zelllinien stammten, wurde von 129/01a-Mäusen isoliert. Dieser Mausstamm ist cremefarben, die kombinierte Wirkung von drei Farbgenen, dem dominanten A^W+-Allel am Agouti-Locus, dem rezessiven pink-eyed-dilute-Allel am p-Locus und dem rezessiven C^ch-Allel am C-Locus. Nachkommen, in denen die ES-Zellen an der Bildung des Tieres teilnahmen, hatten Felle, die braune und cremefarbene Haare enthielten. Die ES-Zelllinie ES41-1, die die inaktivierte schwere Immunglobulin-Kette der Maus trägt, wurde in C57BL/6-Mausblastocysten injiziert, wie oben beschrieben. Sechs der 18 überlebenden Jungen hatten einen hohen Grad an Fellfarben-Chimärismus (70-90%). Die PCR-Analyse der DNA, die von den chimären, neugeborenen Jungen eines Weibchens isoliert wurde, in das Blastocysten implantiert wurden, in die die inaktivierten ES-Zellen injiziert worden waren, wies darauf hin, dass der mutierte Locus der schweren Immunglobulin-Kette in einer Vielzahl von Organen wie der Milz, dem Thymus, der Niere, der Leber, dem Gehirn und der Haut vorhanden ist.
• Inaktivierung der J-Gene der leichten Ig-kappa-Kette der Maus in ES-Zellen Ein 5,6 Kb-HindIII-BamHI-Fragment, das die J-Region-Gene der Maus-Immunglobulin-kappa-Kette und die 3' flankierenden Sequenzen enthielt, wurde von einer genomischen Balb/c-Mausembryo-Genbank cloniert und in den pBluescriptSK-Vektor inseriert, um das Plasmid (pKJ) zu ergeben. pKJ wurde mit HindIII und PstI verdaut, um ein etwa 1,7 Kb-Fragment zu deletieren, das die 5 J-Gene enthielt (siehe Diagramm 3). Ein stumpfes 570 bp-HindIII-Fragment, das die Region 5' der HindIII-Stelle angrenzend an die kappa-J-Region umspannte, wurde von der genomischen Maus-DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) cloniert. Dieses Fragment wurde in den HindIII-SmaI-verdauten plc-Clonierungsvektor (Marsh et al., 1984, Gene, 32: 481-485) inseriert und wurde durch Verdau mit KpnI-XhoI ausgeschnitten. Ein etwa 1,1 Kb-XhoI-BamHI-Fragment, das an der BamHI-Stelle abgestumpft war und das Neomycin-Resistenzgen enthielt, das durch den Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (HSV-tk)-Promotor und den Polyoma-Enhancer gelenkt wird, wurde von pMC1Neo (Thomas und Capecchi, 1987, vorstehend) isoliert. Das Neomycin-Fragment wurde in das HindIII-PstI-deletierte pKJ, das an der PstI-Stelle stumpf war, 5' der kappa-Sequenzen inseriert. Das resultierende Plasmid wurde mit KpnI und XhoI verdaut, und das 570 bp-KnpI-XhoI-kappa-Fragment wurde in den KpnI-XhoI-gespaltenen Vektor 5' des Neomycingens inseriert, um den Inaktivierungsvektor (pmKδJ, siehe Diagramm 3) herzustellen. Die transkriptionelle Orientierung des Neomycins und der kappa-Ketten-Gene ist dieselbe in pmKδJ. Das Plasmid wurde durch ApaLI vor der Transfektion in ES-Zellen linearisiert. Die linearisierte Sequenz hat über etwa 3,8 Kb und 570 bp Homologie mit den zellulären Sequenzen, die 3' beziehungsweise 5' des Neomycingens liegen.
• Diagramm 3: Kappa-Ketten-Inaktivierungsvektor

  
• Analyse der G418-resistenten ES-Kolonien
• Die Elektroporation des kappa-Inaktivierungsvektors in ES-Zellen und das Durchmustern auf homologe Rekombinationsvorgänge wurden durchgeführt, wie für die Inaktivierung der schweren Immunglobulin-Kette beschrieben. G418-resistente ES-Kolonien wurden auf homologes Rekombinations-Targeting durch PCR unter Verwendung von zwei primenden Oligonucleotiden, CGGTTGCTGCCGTATCCATAACTC und CATCAGAGCAGCCGATTGTCTG, analysiert, die den Sequenzen entsprechen, die im Maus-kappa-Ketten-Gen etwa 67 bp 5' der Insertionsstelle bzw. etwa 370 bp 3' der XhoI-Stelle des Neomycingens gelegen sind. Ein ³²P-markiertes 80 Basen-Oligonucleotid, das etwa 10 bp 5' der Insertionsstelle beginnt, wurde als eine Sonde verwendet, um das Ziel-PCR-Produkt nachzuweisen. Eine erfolgreiche homologe Rekombination erbringt ein etwa 1030 bp-Fragment. Die PCR-Analyse von 650 G418-resistenten Kolonien wies 3 positive Kolonien (ES56-1, ES69-4, ES147-1) nach. Eine Southern-Analyse dieser Kolonien bestätige die Integration des Inaktivierungvektors in ein Allel der kappa-Immunglobulin-Loci, was zu einer Deletion der J-Region führte.
• Produktion von menschlichem Ig in transgenen Mäusen
• Beispiel: Produktion der menschlichen schweren Kette in einem transgenen Maus-DNA-Vektor
• Ein SpeI-Fragment, das die VH6-D-J-Cμ-Cδ-Region der menschlichen schweren Kette umspannt (Berman et al., EMBO J. (1988) 7: 727-738; siehe Diagramm 4), wird von einer menschlichen Genbank isoliert, die in einen künstlichen Hefe-Chromosom (YAC)-Vektor (Burke et al., Science, 236: 806-812) unter Verwendung von DNA-Sonden cloniert war, die von Berman et al. (EMBO J. (1988) 7: 727-738) beschrieben wurden. Ein Clon wird erhalten, von dem geschätzt wird, dass er etwa 100 Kb ist. Der isolierte YAC-Clon wird durch Pulsfeld-Gelelektrophorese (Burke et al., vorstehend; Brownstein et al., Science, 244: 1348-1351) unter Verwendung von radioaktiv markierten Sonden für die menschliche schwere Kette (Berman et al., vorstehend) charakterisiert.
• Einbringen von YAC-Clonen in Embryonen
• DNA mit hohem Molekulargewicht wird in Agarosestoppeln von Hefezellen hergestellt, die das YAC von Interesse enthalten (d.h. ein YAC, das das vorher erwähnte SpeI-Fragment vom IgH-Locus enthält). Die DNA wird auf einem CHEF-Gel-Apparat größenfraktioniert, und die YAC-Bande wird aus dem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt ausgeschnitten. Das Gelfragment wird mit Polyaminen äquilibriert und dann geschmolzen und mit Agarase behandelt, um die Agarose zu verdauen. Die Polyamin-beschichtete DNA wird dann in den männlichen Pronucleus von fertilisierten Mausembryonen injiziert, die chirurgisch in den Uterus eines pseudo-schwangeren Weibchen eingebracht werden, wie oben beschrieben. Das transgene Wesen der Neugeborenen wird durch einen Slot-Blot mit DNA analysiert, die von den Schwänzen isoliert wurde, und die Produktion der menschlichen schweren Kette wird durch Erhalten einer kleinen Menge von Serum und Testen davon auf das Vorliegen von Ig-Ketten mit Kaninchen-anti-menschlichen Antikörpern analysiert.
• Als eine Alternative zur Mikroinjektion wird die YAC-DNA durch ES-Zellen:Hefe-Protoplasten-Fusion in murine ES-Zellen transferiert (Traver et al, 1989 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 5898-5902; Pachnis et al., 1990, ebenda 87: 5109-5113). Zuerst werden das Neomycin-Resistenzgen von pMC1Neo und ein Hefe-selektierbarer Marker in nicht-wesentliche YAC-Vektorsequenzen in einem Plasmid inseriert. Dieses Konstrukt wird verwendet, um einen Hefestamm zu transformieren, der das IgH-YAC enthält, und pMC1Neo wird in die Vektorsequenzen des IgH-YAC durch homologe Rekombination integriert. Das modifizierte YAC wird dann durch Protoplasten-Fusion in eine ES-Zelle transferiert (Traver et al., 1989; Pachnis et al., 1990), und resultierende G418-resistente ES-Zellen, die die intakten menschlichen IgH-Sequenzen enthalten, werden verwendet, um chimäre Mäuse herzustellen.
• Produktion von menschlichem Ig durch chimäre Mäuse
• Konstruktion eines Ersatzvektors der menschlichen schweren Kette.
• Die ersetzenden menschlichen Sequenzen schließen das 100 kbp-SpeI-Fragment der genomischen DNA, die die menschliche VH6-D-J-Cμ-Cδ-Region der schweren Kette umspannt, ein, die von einer menschlichen YAC-Genbank isoliert wurde, wie vorher beschrieben. Die flankierenden schwere Kette-Sequenzen der Maus, die den homologen Rekombinations-Ersatzvorgang lenken, enthalten ein 10 kbp-BamHI-Fragment der schweren Cε-Cα-Kette der Maus und ein 5'-J558-Fragment, das die 5'-Hälfte des J558-Fragments der variablen Region der schweren Kette der Maus umfasst, an den 3'- beziehungsweise 5'-Enden der menschlichen Sequenzen (Diagramm 4). Diese Maussequenzen werden von einer genomischen Mausembryo-Genbank unter Verwendung der Sonden isoliert, die in Tucker et al., PNAS USA, 78: 7684-7688, 1981, beziehungsweise Blankenstein und Krawinkel (1987, vorstehend) beschrieben sind. Das 1150 bp-XhoI bis BamHI-Fragment, das ein Neomycin-Resistenzgen enthält, das durch den Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen (HSV-tk)-Promotor und einen Polyoma-Enhancer gelenkt wird, wird von pMC1Neo (Koller und Smithies, 1989, vorstehend) isoliert. Ein synthetischer Adapter wird an dieses Fragment angefügt, um das XhoI-Ende in ein BamHI-Ende zu konvertieren, und das resultierende Fragment wird mit BamHI-Maus-Cε-Cα in einem Plasmid verknüpft.
• Vom YAC-Clon, der den Locus der menschlichen schweren Kette enthält, werden DNA-Sequenzen von jedem Ende der Insertion entweder durch inverse PCR (Silverman et al., PNAS, 86: 7485-7489, 1989) oder durch Plasmid-Rescue in E. coli (Burke et al., 1987; Garza et al., Science, 246: 641-646, 1989; Traver et al., 1989) gewonnen (siehe Diagramm 4). Die isolierte menschliche Sequenz vom 5'-V6-Ende des YAC wird an die Maus-J558-Sequenz in einem Plasmid ligiert, und desgleichen wird die menschliche Sequenz, die vom 3'-Cδ-Ende des YAC stammt, an das Neo-Gen in dem Plasmid ligiert, das Neo und Maus-Cε-Cα enthält, wie oben beschrieben. Das menschliche V6-Maus-J558-Segment wird jetzt in einen Halb-YAC-Clonierungsvektor subcloniert, der einen Hefe-selektierbaren Marker (HIS3), der nicht im ursprünglichen IgH-YAC vorhanden ist, ein Centromer (CEN) und ein einzelnes Telomer (TEL) einschließt. Das menschliche Cδ-Neo-Maus-Cε-Cα wird gleichermaßen in einen separaten Halb-YAC-Vektor mit einem anderen Hefe-selektierbaren Marker (LEU2) und einem einzelnen TEL subcloniert. Der Halb-YAC-Vektor, der die menschliche V6-DNA enthält, wird linearisiert und verwendet, um einen Hefestamm zu transformieren, von dem die chromosomalen HIS3- und LEU2-Loci deletiert sind und der das IgH-YAC trägt. Die Selektion auf Histidin-Prototrophie erbringt Hefe-Kolonien, die eine homologe Rekombination zwischen den menschlichen V6-DNA-Sequenzen durchgemacht haben und ein rekombinantes YAC enthalten. Der Halb-YAC-Vektor, der die menschliche Cδ-DNA enthält, wird

  

  

  

  dann linearisiert und verwendet, um den Hefestamm zu transformieren, der im vorigen Schritt hergestellt wurde. Die Selektion auf Leucin-Prototrophie resultiert in einem Hefestamm, der das vollständige IgH-Ersatz-YAC enthält (siehe Diagramm 4). Dieses YAC wird isoliert und durch Mikroinjektion in ES-Zellen eingebracht, wie vorher für Embryonen beschrieben.
• In Übereinstimmung mit den obigen Vorgehensweisen kann ein antigener oder ein chimärer nicht-Primaten-Wirt, insbesondere ein Maus-Wirt, produziert werden, der immunisiert werden kann, um menschliche Antikörper oder Analoge zu produzieren, die spezifisch für ein Immunogen sind. Auf diese Weise werden die Probleme, die mit dem Erhalten von menschlichen monoclonalen Antikörpern assoziiert sind, vermieden, da Mäuse mit Immunogenen immunisiert werden können, die nicht mit einem menschlichen Wirt verwendet werden könnten. Darüber hinaus kann man Auffrischungsinjektionen und Adjuvanzien bereitstellen, die bei einem menschlichen Wirt nicht erlaubt sein würden. Die resultierenden B-Zellen können dann für eine Immortalisierung für die kontinuierliche Produktion des erwünschten Antikörpers verwendet werden. Die immortalisierten Zellen können für die Isolierung der Gene, die das Immunglobulin oder ein Analog codieren, verwendet und durch in vitro-Mutagenese oder eine andere mutagenisierende Technik einer Mutation unterworfen werden, um die Eigenschaften der Antikörper zu modifizieren. Diese mutagenisierten Gene können dann an die immortalisierten Zellen für eine homologe Rekombination zurückgegeben werden, um eine kontinuierliche, zelluläre Säuger-Quelle der erwünschten Antikörper bereitzustellen. Die betreffende Erfindung stellt eine praktische Quelle von menschlichen Antikörpern bereit, wobei die menschlichen Antikörper auf analoge Weise zu der Produktion von Antikörpern in einem menschlichen Wirt produziert werden. Die Maus-Zellen stellen zweckmäßig die Aktivierung und Umlagerung der menschlichen DNA in Maus-Zellen für die Produktion von menschlichen Antikörpern bereit.

Claims (7)

1. Homologer Rekombinations-Zielvektor, der eine Nucleotidsequenz mit Homologie zu intronischen Sequenzen umfasst, die 3' und 5' von sowie proximal zu Verknüpfungsregion (J)-Segmentgenen einer schweren Kette oder einer kappa-leichten Kette in einem endogenen Immunglobulin-Locus einer Maus gelegen sind, und der ein dazwischenliegendes Markergen hat, wobei der Vektor homolog mit dem endogenen Maus-Immunglobulin-Locus rekombinieren und alle Verknüpfungsregion (J)-Gene mit dem Markergen ersetzen kann, um die funktionelle Umlagerung des Locus und die Herstellung einer funktionellen Botschaft zu verhindern, die ein Immunglobulin codiert.
2. Zielvektor nach Anspruch 1, wobei das Markergen ein Neomycin-Resistenzgen ist.
3. Verfahren zur Inaktivierung eines endogenen Immunglobulin-Locus der schweren oder kappa-leichten Kette in einem nicht-menschlichen Säuger, umfassend den Schritt des Zerstörens von genügend Sequenzen des Ig-Locus, um Umlagerung des Ig-Locus oder die Herstellung einer funktionellen Botschaft zu verhindern, die den Ig-Locus codiert.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Ig-Locus der schwere Kette-Ig-Locus ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Ig-Locus der kappa-leichte Kette-Ig-Locus ist.
6. Maus, die nach dem Verfahren von Anspruch 3 hergestellt wird, wobei die Zerstörung in einer C-Region des Immunglobulin-Locus der schweren Kette ist.
7. Maus, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zerstörung im Immunglobulin-Locus der kappa-leichten Kette ist.