JP5692746B2 - 全身性疼痛症候群の治療または予防薬 - Google Patents
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Description
〔2〕LPA1アンタゴニストがLPA1に対するアンチセンス核酸、siRNAおよびアンタゴニスト抗体、可溶型LPA1ならびにLPA1に結合してシグナル伝達を阻害する低分子化合物からなる群より選ばれるものである、前記〔1〕記載の治療または予防薬。
〔3〕中枢神経系に投与されるものである前記〔1〕または〔2〕に記載の治療または予防薬。
〔4〕全身性疼痛症候群が線維筋痛症、慢性疲労症候群または過敏性大腸炎である、前記〔1〕〜〔3〕いずれかに記載の治療または予防薬。
〔5〕オートタキシン阻害物質を有効成分として含有してなる全身性疼痛症候群の治療または予防薬。
〔6〕オートタキシン阻害物質がオートタキシンに対するアンチセンス核酸、siRNAおよび阻害抗体ならびにオートタキシンの酵素活性を阻害する低分子化合物からなる群より選ばれるものである、前記〔5〕記載の治療または予防薬。
〔7〕中枢神経系に投与されるものである前記〔5〕または〔6〕に記載の治療または予防薬。
〔8〕全身性疼痛症候群が線維筋痛症、慢性疲労症候群または過敏性大腸炎である、前記〔5〕〜〔7〕いずれかに記載の治療または予防薬。
〔9〕有効量のLPA1アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、全身性疼痛症候群の治療または予防方法。
〔10〕LPA1アンタゴニストがLPA1に対するアンチセンス核酸、siRNAおよびアンタゴニスト抗体、可溶型LPA1ならびにLPA1に結合してシグナル伝達を阻害する低分子化合物からなる群より選ばれるものである、前記〔9〕記載の治療または予防方法。
〔11〕中枢神経系に投与される、前記〔9〕または〔10〕に記載の治療または予防方法。
〔12〕全身性疼痛症候群が線維筋痛症、慢性疲労症候群または過敏性大腸炎である、前記〔9〕〜〔11〕いずれかに記載の治療または予防方法。
〔13〕有効量のオートタキシン阻害物質をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、全身性疼痛症候群の治療または予防方法。
〔14〕オートタキシン阻害物質がオートタキシンに対するアンチセンス核酸、siRNAおよび阻害抗体ならびにオートタキシンの酵素活性を阻害する低分子化合物からなる群より選ばれるものである、前記〔13〕記載の治療または予防方法。
〔15〕中枢神経系に投与される、前記〔13〕または〔14〕に記載の治療または予防方法。
〔16〕全身性疼痛症候群が線維筋痛症、慢性疲労症候群または過敏性大腸炎である、前記〔13〕〜〔15〕いずれかに記載の治療または予防方法。
〔17〕前記〔1〕〜〔4〕いずれかに記載の全身性疼痛症候群の治療または予防薬を製造するための、LPA1アンタゴニストの使用。
〔18〕前記〔5〕〜〔8〕いずれかに記載の全身性疼痛症候群の治療または予防薬を製造するための、オートタキシン阻害物質の使用。
WO2002/062389、WO2003/007991、WO2003/024402(特表2005−508319)またはWO2005/032494(特表2007−508324)に開示された化合物などがあげられる。市販のアンタゴニストとして、
(S)−リン酸モノ−{2−オクタデカ−9−エノイルアミノ−3−[4−(ピリジン−2−イルメトキシ)−フェニル]−プロピル}エステル アンモニウム塩、
(S)−リン酸モノ−[3(4−ベンジルオキシ−フェニル)−2−オクタデカ−9−エノイルアミノ−プロピル]エステル アンモニウム塩、
などがあげられる。
常温と寒冷環境を反復負荷させる(SART)ストレスモデルは、副交感神経優位型の自律神経失調症のモデルとして一般に知られており、持続的低血圧、免疫バランスの異常、痛覚過敏など多種の異常が報告されている。一方で、SARTストレスモデルは線維筋痛症をはじめとした全身性疼痛症候群の動物モデルとしても有用であると言われている。SARTストレスによるモデルの作出方法は、マウス等の動物の飼育環境を室温(24℃前後)と冷温(4℃前後)下に反復して変化させる方法であるが、慢性疼痛を示さない対照ストレスとして室温に戻さない冷温ストレスのみの条件、constant cold stress(CCSストレス)と対比させるためintermittent cold stress(ICS)と呼ぶことが望ましい。実施例に記載されているように、ICSストレスは従来報告されてきたSARTストレスに比べて、より厳密に定義している。同様にCCSストレスによるモデルの作出方法も実施例に記載されている。
SART(ICS)ストレス負荷群
SART(ICS)ストレスは、極度に異なる飼育環境温度を繰り返し変化させることで曝露した。設定温度は室温(24℃)、および冷温(4℃)とした。それぞれの温度に設定した環境に飼育ケージを設置し、日中(10時から16時30分まで)は30分毎にマウスのみを移動させ、夜間(16時30分から翌日の10時まで)は冷温下で飼育した。この繰り返しストレスをストレス前日の16時30分からストレス3日目の10時まで3日間行った。なお、前記ストレス負荷期間中は、固形の餌と水分補給用の寒天をケージ内に常に置き、自由に摂取できる環境にした。
正常対照群のマウスとして、上記ストレス負荷期間中、常に24℃で飼育したこと以外は、ストレス負荷群と同様にして飼育したマウスを用いた。
全身性疼痛疾患のモデル動物として、ICSストレスによる過敏応答誘発実験を、リゾホスファチジン酸(以下、LPAと記載)受容体遺伝子に相補的に結合し、その発現を阻害するantisense oligodeoxynucleotide(以下、AS−ODNと記載)を予め投与したマウスに対して適用し、製造例1のストレス曝露を行った。
C57BL/6Jマウス6週齢(20〜22g)を、正常対照群およびICSストレス負荷群それぞれ10〜12匹用いた。
AS−ODNとして、「5’−AGCTGCCATGACAGTGCTGT−3’(配列番号5)」を用い、BLAST検索して、その配列がLPA1受容体に特異的であることを確認した。比較対照として、非相補的配列を持つmissense oligodeoxynucleotide(以下、MS−ODNと記載)を投与したマウスおよびVehicleとして人工脳脊髄液(ACSF)を投与したマウスを用いた。MS−ODNとして、「5’−AGCAGCGTTGTCACTGCAGT−3’(配列番号6)」を用い、BLAST検索して、その配列が他の受容体とも類似しないことを確認した。
ODNおよびACSF投与後のマウスに対して、上記製造例1に基づくSART(ICS)ストレスを負荷し、負荷後の疼痛閾値を測定し、経日的変化を調べた。
LPA2 AS−ODN処置マウス
C57BL/6Jマウス6週齢(20〜22g)を、正常対照群およびICSストレス負荷群それぞれ10〜12匹用いた。
AS−ODNとして、「5’−TACTACAACGAGACCATCGG−3’(配列番号7)」を用い、BLAST検索して、その配列がLPA1受容体に特異的であることを確認した。比較対照として、非相補的配列を持つMS−ODNを投与したマウスおよびVehicleとして人工脳脊髄液(ACSF)を投与したマウスを用いた。MS−ODNは「5’−CGATACACTAGAACGCTCGA−3’(配列番号8)」を用い、BLAST検索して、その配列が他の受容体とも類似しないことを確認した。
ODNおよびACSF投与後のマウスに対して、上記製造例1に基づくSART(ICS)ストレスを負荷し、負荷後の疼痛閾値を測定し、経日的変化を調べた。
実施例3では、製造例および実施例に基づきストレス負荷したマウスについて、慢性疼痛を評価した。慢性疼痛の評価方法としては、機械刺激誘発性疼痛試験により経日的な疼痛閾値を評価した。なお、前記機械刺激誘発性疼痛試験は、デジタル式von Frey法に従って行った。
AS−ODN処置法
AS−ODNはSART(ICS)ストレス負荷5日前から、1日に10μg1回脳室内投与した。連続的に5日間前処置した後、SART(ICS)ストレスを開始し、ストレス負荷期間中も1日1回脳室内投与した。ただし、ストレス3日目は投与せず、以降投与は中止し計7回の投与を行った。1回の投与量は5μlとした。
上記処置法と同様にMS−ODNおよびVehicleをストレス前とストレス負荷期間におよび計7回行った。
機械刺激誘発性疼痛試験
5mm×5mmの格子の網上で環境に適応させた(アダプテーションをかけた)マウスに対して、特製のプラスチックチップをマウスの足底部に下から一定の圧力で加えた。この時、反応する重量閾値をデジタル測定した。
図1〜3は、LPA1受容体のAS−ODNを投与した実施例1のマウスにおける疼痛閾値を経日的に測定した結果であり、図1はVehicle処置群を示し、図2はAS−ODN処置群を示し、図3はMS−ODN処置群を示した観察結果である。
図4および5は、LPA2受容体のAS−ODNを投与した実施例2のマウスにおける疼痛閾値を経日的に測定した結果であり、図4はAS−ODN処置群を示し、図5はMS−ODN処置群を示した観察結果である。
以下の実施例においては、6週齢のC57BL/6J雄性マウス(20〜25g)を使用した。これらマウスは室温22±2℃、湿度55±5%の部屋で昼夜自然条件下にて飼育した。マウスには、自由に水(水道水)と固形飼料(MF、オリエンタル酵母、東京)を摂取させた。
実験環境としては研究室の一室を使用し、恒温(22±2℃)、恒湿(55±5%)の状態で行った。実験に使用するマウスは実験開始24時間前までに部屋に運び入れ、昼夜自然管理下にて飼育し、上記と同様に飼料および水道水を自由に摂取させた。実験は午前10時から午後17時の間に行った。
全ての実験は、長崎大学動物実験指針ならびに疼痛実験に対する国際委員会で定める方法に準じて行った(動物実験許可番号:0706130596)。
薬物投与
1)ATX−アンチセンス
ATX−アンチセンスは、LPAの合成酵素であるATXのmRNAの合成を抑える薬物である。ATX−アンチセンス(ATX‐AS)の塩基配列は
「5’−GTC TTG CCA TGC CGA GGG AT−3’(配列番号13)」、
ATX−ミスセンス(ATX‐MS)の塩基配列は
「5’−GTT CTC GCA GTC GCA GGA GT−3’(配列番号14)」と設計されたものを用いた。投与量はアンチセンス、ミスセンスともに10μg/5μlであった。
ATX−アンチセンス(operon,3170003)は、ストレスを負荷する日を含め、5日前から脳室内に連続投与を行った(図8A)。投与には人工脳脊髄液に溶解したものを使用した。対照群としてATX−ミスセンス(operon,3170004)と溶媒をそれぞれ同量投与した。50μlハミルトンマイクロシリンジおよび針つきカニューレを使用し、全量5μlを脳室内投与した。26ゲージ脳室内投与用針を使用した。
PLA2阻害剤としてBromoenol lactone(Cayman chemical)を使用した。薬物投与は、ストレス負荷において繰り返し寒冷刺激を行なう前の午前10時に計2回投与を行った(図9A)。
薬物は、全量5mgを200μlのDMSOに溶解し、20nmol/10μlに分注した。これに人工脳脊髄液384μl加えた。対照群として、それぞれ同量のDMSOおよび人工脳脊髄液を加えたものを同量投与した。50μlハミルトンマイクロシリンジおよび針つきカニューレを使用し、全量5μlを脳室内投与した。26ゲージ脳室内投与用針を使用した。
SART(ICS)モデルおよびCCSモデルの作出
線維筋痛症モデルマウスの作出のため、ICS(Intermittent Cold Stress)を負荷した。マウスの飼育環境温度を昼間は30分毎に室温(24±2℃)と低温(4±2℃)を繰り返し、夜間は低温下で飼育した。飼育環境は、湿気をさけるためケージを上下反転させたものをケージの網の上に置き、ケージと網の間には一般実験用の固形飼料(MF, オリエンタル酵母, 東京)のかけらを使用して隙間をつくった。また、固形飼料および水分として水道水を寒天で固め約1cm角に切ったものを自由に摂取させ恒湿(55±5%)で昼夜自然条件下にて飼育した。ひとつのケージで2匹または1匹ずつマウスを飼育した。
初日に、16時30分に低温条件下(4℃)である冷蔵庫内へ使用するマウスを移動し、翌日の10時まで飼育した。10時に室温に移し、以後16時30分まで30分ごとに低温条件下と室温条件下で交互に飼育した。この日を繰り返しストレス開始日とし、ストレス1日目とした。16時30分からストレス2日目の10時までは、ストレス前日と同様に4℃で飼育した。2日目も1日目と同様に繰り返しストレスを与えた。3日目の10時に室温に移し終了とした。また、終了日をP1(Post Stress day 1)とした。
対照群(Control)は、同様の時間(ストレス負荷前日の16時30分から3日目の10時まで)を3日間終始室温で飼育した。
CCSモデルマウスは、同様の時間(ストレス負荷前日の16時30分から3日目の10時まで)を3日間終始低温で飼育した(Molecular Pain 6, 4:52 November 2008)。
コルチコステロン濃度測定における血液採取
血清コルチコステロン採取は、P1、P5、P12およびP19に行なった。マウスの首を切断し、全ての血液を集めた。採取後、血液を3000rpmで30分間遠心分離機にかけて血漿を分離した。上澄を採取し、ドライアイス中で凍結し、分析まで−80℃で保存した。血液サンプル採取は、血液中のコルチコステロンの日内変化のリズムに合わせ、最も濃度が高くなる21時から22時の間に行なった。
疼痛関連行動評価法
下記1)〜2)の試験法は、10分程度の間隔をあけて測定した。連続測定による組織障害を防ぐためである。
1) 自動デジタル式von Frey試験:機械的侵害試験法
実験前にマウスを網目上のラックの上に置き、上からケージをかぶせ1時間以上実験と同じ環境に慣れさせた。プラスチックのチップの先端をラックの下からマウスの後肢足蹠の中心に対して垂直に押し付け、該マウスが後肢の逃避行動を示したときに、自動的に測定された値を読み取った。刺激の強さは、正常マウスにおいて10g前後になるように設定した。測定は3回以上行ない、平均値を採用した。
実験前にマウスをガラス板の上に置き、上からケージをかぶせ1時間以上実験と同じ環境に慣れさせた。マウスの後肢足蹠に熱刺激を与え、該マウスが刺激からの逃避行動を示したときに、自動的に測定された値を読み取った。刺激となるビームは、正常マウスにおいて10秒前後の測定になるように設定した。組織損傷を避けるためにカットオフ時間は20秒とした。測定は3回以上行ない、平均値を採用した。
ICSの負荷終了日をP1とし、P3、P5、P12およびP19に疼痛閾値を測定した。
統計処理
全てのデータの統計学上の分析には、Sheffe’s F testを用いた。一元配置分散分析の検定の結果、水準間に差があると認められた場合に、多重比較検定を行い、どの群間に差があるかを判定した。*または♯印1つが危険率5%以下、2つが危険率1%以下と定めた。すべての結果は(平均値)±S.E.M.で表した。
1) ICSにおける機械刺激に対する経日的な過敏応答
ストレス負荷終了後、ICS群および対照群ともにP1、P3、P5、P12、P19のスケジュールで経日的に観察を続けた。疼痛評価には機械的侵害試験法を用いてマウスの右肢に対して行なった(図6)。ストレス負荷を行なう前では、対照群とICS群の閾値に差はみられなかった。ストレス負荷終了後よりICS群と対照群には有意な差があった(P<0.01)。P1では対照群:9.5±0.2g、ICS群:4.8±0.5gであり、P19まで持続した閾値の低下を確認することができた(対照群:9.1±0.3g、ICS群:5.9±0.4g)。この過敏応答は、当研究室で行なっている坐骨神経の部分結紮を施した神経因性疼痛モデルが示す閾値と同程度である。
また、モデル作出中に以下の2点を観察した。1点目は、ICS群では、対照群と比べると、摂食量が多かったように感じ、特に温度環境が変わった直後にその様子は見られた。これは、摂食量を増やし発熱効果により、体温の低下を防ごうとする適応現象かもしれない。2点目は、ストレス中は体重に関してICS群は減少傾向にあることが確認できた。しかしながら、体重はストレス終了後、回復傾向を示し、対照群と同程度まで回復した。他の動物の行動に関しては、対照群と違いはなかった。
ストレス負荷の指標として、血中コルチコステロン濃度を測定した。濃度測定サンプルはストレス負荷終了後1、5、12、19日目に採取した。繰り返しストレス終了後1日目には、ICS群のコルチコステロン濃度は32.7±4.1μg/dlを示し、対照(CCS)群の濃度(10.0±2.4μg/dl)と比較して有意な濃度上昇を示した(図7)。しかし、経日的変化をみると、ICS群の濃度上昇はストレス負荷終了後5日目には認められなかった。それ以降は、ICS群、対照群ともに10μg/dl程度の値を示している。この結果より、繰り返し寒冷ストレスではストレスを受けているのに対し、連続寒冷ストレスでは、コルチコステロン濃度上昇を引き起こす程の慢性的なストレスを受けていないと考えられる。
ICSとCCSのモデルマウスを作出する際にみられた違いがある。摂食量および行動量ともにICSの方が多かった。特に、摂食量に関しては、ICSでは30分毎の温度変化を与えた直後に餌を食べる行動が多くみられた。行動量に関しては、CCSでは、一箇所にとどまる傾向がみられたが、異常な行動はみられなかった。
最近、Nishiyori and UedaはICSストレスモデルにおける疼痛過敏やアロディニアといった異常痛が少量のギャバペンチン脳室内投与により4日の長期にわたり抑制されたことを報告している(Molecular Pain 6, 4:52 November 2008)。ギャバペンチンは、Caα2δ-1を分子標的とした薬剤である。Caα2δ-1は、神経因性疼痛を誘発する神経傷害やその原因分子LPAの脊髄くも膜下腔内への適用時に有髄A線維に発現し、神経因性疼痛の責任分子の一つであることが示されている(やさしい痛み学 植田弘師、戸田一雄 ブレーン出版 pp.89-90;Nature Medicine Volume.10 Number.7 July 2004, pp.712−718; Mol Pain. 2008 Apr 1;4:11. Review)。そこで、ICSストレスモデルにおいても傷害性神経因性疼痛モデル同様、LPAが脳内で産生されている可能性を考えた。本実験では、LPA合成酵素阻害剤であるATX-ASをストレス負荷開始日を含めて5日前から脳室内に連続投与し、異常痛形成に対する効果をみた(図8A)。ストレス負荷終了後1、3、5、12日目に機械的侵害試験法、5、6日目に電気的侵害試験法を実施した。両試験法において、Artificial cerebro-spinal fluid (人工脳脊髄液、ACSF)+ストレス群とACSF群には有意な差(P<0.05)が認められた。
ACSF対照群及びATX-MS投与群では、ICSストレス後に有意な機械的侵害応答閾値低下がP1からP12に至るまで観察された。これに対しATX-AS投与群ではICSストレスにより殆ど閾値変化が認められなかった。ATX-MS投与群とATX-AS投与群との比較においてはP1からP12に至るまで有意な差が観察された。
Bromoenol lactone(BEL)はPLA2阻害剤である。LPA産生の過程には、ホスホリパーゼA2(PLA2)によりホスファチジルコリンからリゾホスファチジルコリン(LPC)が産生され、続いてATXによりLPAが産生される経路が最も重要であるとされている。ICSモデルマウスにおいては、過敏が持続する一方で、CCSモデルマウスでは一過性の過敏が見られる。このことより、ICSモデルマウスでの過敏形成には常温と低温の繰り返し刺激が関係していると考えている。このため、寒冷繰り返し刺激を与える直前の午前10時に薬物投与を行った(図9A)。ストレス負荷終了後日1、3、5日目に機械的侵害試験法(図9B)および熱的侵害試験法(図10)において疼痛閾値を検討した。
図9Bにおいて、ICSストレスによる機械的侵害応答閾値低下はBEL投与によりP1からP5の範囲でいずれも抑制される傾向を示し、P3では有意な変化を示した。
図10において、ICSストレスによる熱的疼痛過敏はBEL投与によりP1からP5の範囲でいずれも抑制される傾向を示し、P3では有意な変化を示した。
Claims (6)
- LPA1に対するアンチセンス核酸、siRNAおよびアンタゴニスト抗体、ならびに可溶型LPA1からなる群より選ばれるLPA1アンタゴニストを有効成分として含有してなる全身性疼痛症候群の治療または予防薬。
- 全身性疼痛症候群が線維筋痛症、慢性疲労症候群または過敏性大腸炎である、請求項1に記載の治療または予防薬。
- オートタキシンに対するアンチセンス核酸、siRNAおよび阻害抗体からなる群より選ばれるオートタキシン阻害物質を有効成分として含有してなる全身性疼痛症候群の治療または予防薬。
- 全身性疼痛症候群が線維筋痛症、慢性疲労症候群または過敏性大腸炎である、請求項3に記載の治療または予防薬。
- 請求項1または2に記載の全身性疼痛症候群の治療または予防薬を製造するための、LPA1に対するアンチセンス核酸、siRNAおよびアンタゴニスト抗体、ならびに可溶型LPA1からなる群より選ばれるLPA1アンタゴニストの使用。
- 請求項3または4に記載の全身性疼痛症候群の治療または予防薬を製造するための、オートタキシンに対するアンチセンス核酸、siRNAおよび阻害抗体からなる群より選ばれるオートタキシン阻害物質の使用。
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