KR20100102152A

KR20100102152A - Ｅｇｆｌ8 길항제를 사용하여 혈관신생을 억제하는 방법

Info

Publication number: KR20100102152A
Application number: KR1020107015528A
Authority: KR
Inventors: 웨일런 예; 한 루
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2008-01-14
Filing date: 2009-01-14
Publication date: 2010-09-20
Also published as: US9549971B2; CA2710619A1; AU2009205428A1; RU2486200C2; ZA201005341B; IL206730A0; JP2014221769A; WO2009091810A1; JP2011510011A; AU2009205428B2; BRPI0905660A2; MX2010007669A; RU2010133957A; CN101970670B; HK1149205A1; CN101970670A; US20110014194A1; EP2235189A1

Abstract

본 발명은 혈관 발달을 억제하고 관련 질병을 치료하기 위해 EGFL8 길항제를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

ＥＧＦＬ8 길항제를 사용하여 혈관신생을 억제하는 방법 {METHODS FOR INHIBITING ANGIOGENESIS USING EGFL8 ANTAGONISTS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2008년 1월 14자 출원된 미국 가출원 제61/020,960호 (이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 이익을 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 혈관신생과 관련된 상태 및 질환을 치료하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 EGF-유사 도메인 8 (EGFL8)의 길항제에 관한 것이다.

현재 혈관신생이 다양한 질환의 발병기전에 중요한 원인이라는 것은 널리 확립되어 있다. 이들은 고형 종양 및 전이, 죽상동맥경화증, 수정체후 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 질환, 예를 들어 증식성 망막병증, 예를 들어 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 연령-관련 황반 변성 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 다른 조직의 면역 거부, 류마티스성 관절염 및 건선을 포함한다 (문헌 [Duda et al. J. Clin. Oncology 25(26): 4033-42 (2007)]; [Kesisis et al. Curr. Pharm. Des. 13: 2795-809 (2007)]; [Zhang ＆ Ma Prog. Ret. ＆ Eye Res. 26: 1-37 (2007)]).

종양 성장의 경우에, 혈관신생은 정상 세포에 비해 종양 세포가 성장 이익과 증식 자율성을 얻도록 한다. 종양은 보통 이용가능한 모세혈관층으로부터의 거리 때문에 수 세제곱 밀리미터의 크기로만 증식할 수 있는 단일 이상 세포로서 시작하고, 장시간 동안 추가의 성장 또는 보급 없이 '휴면상태'로 머무를 수 있다. 이어서, 일부 종양 세포는 혈관신생 표현형으로 전환되어 내피 세포 (EC)를 활성화시키고, 이는 증식하여 새로운 모세혈관으로 성숙한다. 이들 새로 형성된 혈관은 1차 종양의 지속적인 성장을 허용할 뿐만 아니라, 전이성 종양 세포의 보급 및 재콜로니형성을 허용한다. 혈관신생 전환을 조절하는 메카니즘은 잘 이해되지 않지만, 종양 덩어리의 신생혈관형성은 많은 혈관신생 자극제와 억제제의 총(net) 균형으로부터 생성되는 것으로 생각된다.

지금까지, 대부분 주변 세포에 의해 생산된 분비형 인자인 상당수의 분자가 EC 분화, 증식, 이동 및 코드(cord)-유사 구조로의 유착을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관신생을 자극하며 혈관 투과성을 유도하는데 관여하는 핵심 인자로서 확인되었다 (문헌 [Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)]). 또한, 표피 성장 인자-유사 7 (EGFL7)이라 불리는 ECM-관련 단백질은 내피 세포에 의해 발현되며 혈관신생에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Parker et al., Nature 428: 754-58 (2004)]; [Fitch et al., Dev. Dynamics 230: 316-24 (2004)]; [Campagnolo et al., Am. J Path. 167(1): 275-284 (2005)]; [Schmidt et al., Development, 134(16): 2913-23. (2007)]; 미국 특허출원 US2007/0031437). 또한, 피치(Fitch) 등은 Egfl8이라 불리는 Egfl7의 파라로그를 기술하는데, 그의 발현은 Egfl7의 것과 유사하지만 EGFL7 및 EGFL8은 기능에 있어서 중복되지 않을 수 있다고 나타낸다.

혈관신생 분야의 많은 진보에도 불구하고, 기존 항-혈관신생 요법의 효능을 보충 또는 향상시킬 수 있는 표적을 확인하고 수단을 개발하는 것이 여전히 필요하다.

본 발명은 적어도 부분적으로는, EGF-유사 도메인 8 (EGFL8)이 혈관신생에 관여한다는 발견을 기초로 한다. 따라서, 본 발명은 혈관신생 성분이 존재하는 병리학적 과정을 억제하기 위한 신규 조성물 및 그의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 혈관신생과 관련된 병리학적 상태를 갖는 대상체에게 EGFL8 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관신생을 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, EGFL8 길항제는 항-EGFL8 항체이다. 일부 실시양태에서, 병리학적 상태는 신생물, 예를 들어 암종이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 화학치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 병리학적 상태는 눈과 관련된다. 일부 실시양태에서, 병리학적 상태는 안내 신생혈관 질환이다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 제2 항혈관신생제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 항혈관신생제는 EGFL8 길항제의 투여 전 또는 투여 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 항혈관신생제는 EGFL8 길항제와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 제2 항혈관신생제는 EGFL7의 길항제 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)의 길항제, 예를 들어 항-EGFL7 항체 또는 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주마브(bevacizumab))이다.

도 1a 및 도 1b는 E10.5 마우스 배아 뇌 혈관계에서 Egfl7 및 Egfl8의 발현 패턴을 나타낸다.
도 2는 Egfl8 넉아웃(knockout) 마우스를 생성시키는데 이용된 전략을 나타낸다.
도 3은 Egfl7+/-, Egfl8-/- 및 Egfl7-/-, Egfl8-/- 마우스의 망막에서 혈관 표현형을 나타낸다.
도 4는 Egfl8 넉아웃 마우스에서 각막 마이크로-포켓 혈관신생 표현형을 나타낸다.

정의

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley ＆ Sons (New York, NY 1994)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)] 참조). 본 발명의 목적을 위해, 특정 용어를 아래에 정의한다.

본원에서 사용된 용어 "EGFL8" 및 "EGFL8 폴리펩티드"는 그의 제조 방식 또는 종에 상관없이, 자연에서 유래된 EGFL8 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 따라서, EGFL8은 자연발생 인간 EGFL8, 뮤린 EGFL8, 또는 임의의 다른 종으로부터의 EGFL8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 전체 길이 인간 EGFL8 아미노산 서열은 다음과 같다:

전체 길이 뮤린 EGFL8 아미노산 서열은 다음과 같다:

이러한 EGFL8 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다.

"단리된 EGFL8"은 EGFL8 공급원으로부터 정제되거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조되고 정제된 EGFL8을 의미한다. 정제된 EGFL8은 다른 폴리펩티드 또는 펩티드가 실질적으로 없다. 여기서 "실질적으로 없는"은 다른 공급원 단백질에 의한 오염이 약 5％ 미만, 바람직하게는 약 2％ 미만, 보다 바람직하게는 약 1％ 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.5％ 미만, 가장 바람직하게는 약 0.1％ 미만인 것을 의미한다.

용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, EGFL8의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 길항제 분자는 구체적으로 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 EGFL8 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, EGFL8 수용체(들)의 가용성 단편, 안티센스 RNA, 리보자임, RNAi, 작은 유기 분자 등을 포함한다. EGFL8 폴리펩티드의 길항제를 확인하는 방법은, EGFL8 폴리펩티드를 후보 길항제 분자와 접촉시키고, 정상적으로 EGFL8 폴리펩티드와 관련된 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

본원의 목적상 "활성인" 또는 "활성"은 EGFL8의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유하는 EGFL8의 형태(들)을 나타내며, 여기서 "생물학적" 활성은 EGFL8이 갖는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유발하는 능력 이외에 EGFL8이 일으키는 생물학적 기능 (억제성 또는 자극성)을 나타내고, "면역학적" 활성은 EGFL8이 갖는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유발하는 능력을 나타낸다. EGFL8의 주요 생물학적 활성은 혈관 형성을 촉진하고 내피 세포 부착 및 이동을 지지하는 능력이다.

"EGFL8 수용체"는 EGFL8이 결합하고 EGFL8의 생물학적 활성을 매개하는 분자이다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 인간, 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 및 인간화 모노클로날 항체 (전체 길이 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.

"천연 항체"는 통상적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술파이드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술파이드 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 이소형(isotype)의 중쇄 사이에서 변한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 단부에서 가변 도메인 (V_H)에 이어 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 단부에서 가변 도메인 (V_L) 및 그의 다른 단부에서 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 경계면을 형성하는 것으로 생각된다.

항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각 단일 항원-결합 부위를 가짐), 및 잔류 "Fc" 단편 (이 명칭은 쉽게 결정화하는 능력을 반영함)을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 여러개의 잔기가 부가되어 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래, 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 다른 종류 중 하나로 지정될 수 있다.

그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다.

"항체 단편"은 전체 길이 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 도메인을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 나타내는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 특이성이 높다. 또한, 일반적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 변경표현 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이며 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메릭" 항체, 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 한 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 함유하는 키메릭 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린 (수여자 항체)이며, 이는 수여자의 초가변 영역 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역 잔기로 대체된다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 항체 성능을 보다 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 면역글로불린의 초가변 영역에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응한다. 또한, 인간화 항체는 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al, Nature 321:522-525 (1986)]; [Reichmann et al, Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

본원에서 사용된 "치료"는 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 검출가능하든지 검출가능하지 않든지 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된 (즉, 악화하지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 개량 또는 경감, 및 완화 (부분 또는 완전)를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우의 예상되는 생존에 비해 연장되는 생존을 의미한다. "치료"는 질병의 발달을 예방하거나 질병의 병리를 변경시키는 의도로 수행된 개입이다. 따라서, "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 모두들 나타낸다. 치료를 필요로 하는 자는 이미 질병에 걸린 자와 질병을 예방해야 하는 자를 포함한다. 구체적으로, 치료는 직접적으로 세포 변성 또는 손상의 병리, 예를 들어 암 치료에서 종양 세포의 병리를 예방하거나, 지연시키거나, 감소시킬 수 있으며, 또는 세포를 다른 치료제에 의한 치료에 보다 감수성이 되도록 할 수 있다.

"만성" 투여는 연장된 기간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하기 위해 급성 방식에 반대로 연속 방식으로 약제(들)을 투여함을 나타낸다. "간헐" 투여는 중단 없이 연속적으로 수행되는 것이 아니라 사실상 주기적인 치료이다.

본원에서 사용된 "종양"은 악성이든지 양성이든지 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다.

용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 폐암 (예를 들어 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종), 복막암, 간세포암, 위암 (예를 들어 위장관암), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 종류의 두경부암, 및 B-세포 림프종 (예를 들어 저급/여포 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종 (NHL); 소림프구성 (SL) NHL; 중급/여포 NHL; 중급 확산 NHL; 고급 면역모세포 NHL; 고급 림프아구성 NHL; 고급 소형 비분할 세포 NHL; 벌키(bulky) 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 (Waldenstrom) 거대글로불린혈증); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모(hairy)세포 백혈병; 만성 골수모세포성 백혈병; 및 이식후 림프세포증식성 질병 (PTLD), 및 모반증과 관련된 비정상 혈관 증식, 부종 (예를 들어, 뇌종양과 관련된 부종), 및 메이그스(Meigs) 증후군을 포함한다.

"화학치료제"는 암 치료에 유용한 화학 화합물이다. 또한, 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM)가 포함된다.

"안내 신생혈관 질환"은 눈 신생혈관형성을 특징으로 하는 질환이다. 안내 신생혈관 질환의 예는 증식성 당뇨병성 망막병증을 비롯한 증식성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병 및 다른 허혈증-관련 망막병증, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 병리학적 근시, 폰 힙펠-린다우(von Hippel-Lindau) 질환, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 분지된 망막 중심 정맥 폐쇄 (BRVO), 각막 신생혈관형성, 망막 신생혈관형성, 미숙아 망막증 (ROP), 결막하 출혈, 고혈압성 망막병증 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

질환의 "병리"는 환자의 안녕을 손상하는 모든 현상을 포함한다. 암의 경우, 이는 비정상 또는 조절불가능한 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상 기능의 저해, 비정상 수준으로 시토카인 또는 다른 분비성 생성물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

하나 이상의 추가의 치료제"와 조합한" 투여는 동시 (병행) 투여 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함한다.

본원에서 사용된 "담체"는 사용되는 용량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에게 무독성인 제약학상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학상 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 완충액, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™를 포함한다.

"소분자"는 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 본원에서 정의된다.

본 발명을 수행하기 위한 방법

EGFL8

인간 Egfl8 유전자는 진화적으로 보존되는 ~32 kD의 분비형 단백질을 코딩한다. 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) 아미노산 서열 (서열 1)은 마우스 (무스 무스쿨루스(Mus musculus))의 아미노산 서열 (서열 2)에 약 80％ 상동성을 공유한다. EGFL8 폴리펩티드의 기탁 번호는 다음과 같다: NM_030652 (호모 사피엔스), NM_152922 (무스 무스쿨루스).

EGFL8 활성의 길항제의 제조 및 확인

길항제 약물 후보에 대한 스크리닝 분석은 EGFL8 폴리펩티드에 결합하거나 복합체를 형성하는 화합물, 또는 달리 EGFL8과 다른 세포성 단백질의 상호작용을 저해하는 화합물을 확인하도록 설계된다.

소분자는 EGFL8 길항제로서 작용하는 능력을 가지므로 치료적으로 유용할 수 있다. 상기 소분자는 자연발생 소분자, 합성 유기 또는 무기 화합물 및 펩티드를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 소분자는 이들 형태로 제한되지 않는다. 소분자의 광범한 라이브러리가 상업적으로 입수가능하며, 목적하는 활성에 대해 이들 분자를 스크리닝하기 위한 매우 다양한 분석이 당업계에 잘 알려져 있다.

일부 실시태양에서, 소분자 EGFL8 길항제는 EGFL8의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하는 그들의 능력에 의해 확인된다. 따라서, 후보 화합물은 EGFL8과 접촉된다. 이어서, EGFL8의 생물학적 활성이 평가된다. 한 실시태양에서 내피 세포 부착 및 이동을 지지하는 EGFL8의 능력. 화합물은 EGFL8의 생물학적 활성을 억제하는 경우 길항제로서 확인된다.

EGFL8 길항제로서 확인된 화합물은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, EGFL8 길항제는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

암에 대해, 다양한 공지된 동물 모델을 사용하여 종양의 발달 및 발병기전에서 EGFL8의 역할을 보다 이해하고, 천연 EGFL8 폴리펩티드의 항체 및 다른 길항제, 예를 들어 소분자 길항제를 비롯한 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 상기 모델의 생체내 특성은 특히 인간 환자의 반응을 예상할 수 있게 한다. 종양 및 암 (예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선암, 페암 등)의 동물 모델은 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉(transgenic)) 동물을 모두 포함한다. 비-재조합 동물 모델은 예를 들어 설치류, 예를 들어 뮤린 모델을 포함한다. 이러한 모델은 표준 기술, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신피막하 이식, 또는 오르토핀(orthopin) 이식, 예를 들어, 결장암 세포의 결장 조직 내로의 이식을 사용하여 종양 세포를 공통유전자형 마우스 내로 도입함으로써 생성시킬 수 있다 (예를 들어, 1997년 9월 18일 공개된 PCT 공개 WO 97/33551 참조). 종양학 연구에서 아마도 가장 자주 사용되는 동물 종은 면역결핍 마우스, 특히 누드 마우스이다. 흉선 저형성/무형성 누드 마우스가 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용할 수 있다는 발견을 통해 이 마우스가 상기 목적을 위해 광범위하게 사용되었다. 상염색체 열성 nu 유전자가 예를 들어 ASW, A/He, AKR, BALB/c, B1O.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL을 비롯한, 매우 많은 특유한 유사유전자형의 누드 마우스 종에 도입되었다. 또한, 누드 마우스 이외에 면역학적 결함이 유전된 매우 다양한 다른 동물도 사육되어 종양 이종이식의 수여자로서 사용되었다. 보다 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991)]을 참조한다.

상기 동물에 도입된 세포는 공지의 종양/암 세포주, 예를 들어 상기 나열한 임의의 종양 세포주 및 예를 들어 B104-1-1 세포주 (neu 원발암유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras-형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2 (ATCC® HTB-37); 또는 중등도로 잘 분화된 II등급 인간 결장 선암종 세포주, HT-29 (ATCC® HTB-38)로부터; 또는 종양 및 암으로부터 유래될 수 있다. 종양 또는 암 세포의 샘플은 액체 질소에 냉동 보관하는 것을 수반하는 표준 조건을 사용하여 수술중인 환자로부터 얻을 수 있다 (문헌 [Karmali et al., Br. J. Cancer 48:689-696 (1983)]).

종양 세포는 다양한 절차에 의해 동물, 예를 들어 누드 마우스 또는 EGFL8 넉아웃 마우스 내로 도입할 수 있다. 마우스의 피하 (s.c.) 공간이 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고체 블록으로서, 투관침을 사용한 바늘 생검으로서, 또는 세포 현탁액으로서 s.c. 이식할 수 있다. 고체 블록 또는 투관침 이식을 위해, 적합한 크기의 종양 조직 단편을 s.c. 공간 내로 도입한다. 세포 현탁액은 1차 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 새로 제조하여 피하 주사한다. 또한, 종양 세포는 피하 이식물로서 주사할 수도 있다. 이 위치에서, 접종물은 피부 연결 조직의 하부와 s.c. 조직 사이에 침적된다.

유방암 동물 모델은, 본질적으로 문헌 [Drebin et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9129-9133 (1986)]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 래트 신경모세포종 세포 (그로부터 neu 종양유전자가 처음 단리됨) 또는 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포를 누드 마우스 내로 이식함으로써 생성될 수 있다.

유사하게, 결장암 동물 모델은 결장암 세포를 동물, 예를 들어 누드 마우스에서 계대배양하여 상기 동물에서 종양을 발생시킴으로써 생성될 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장암의 동소 이식 모델은 예를 들어 문헌 [Wang et al., Cancer Research 54:4726-4728 (1994)] 및 [Too et al., Cancer Research 55:681-684 (1995)]에 기재되어 있다. 이 모델은 안티캔서, 인크.(AntiCancer, Inc.) (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 시판하는 소위 "METAMOUSE®"를 기초로 한 것이다.

동물에서 발생하는 종양은 제거하여 시험관내에서 배양할 수 있다. 이어서, 시험관내 배양액으로부터의 세포를 동물에 계대배양시킬 수 있다. 상기 종양은 추가의 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 작용할 수 있다. 별법으로, 계대배양으로부터 생성된 종양을 단리하고, 계대배양전 세포 및 1회 이상의 계대배양 후에 단리된 세포로부터의 RNA를 관심 유전자의 차등 발현에 대해 분석할 수 있다. 상기 계대배양 기술은 임의의 공지의 종양 또는 암 세포주를 사용하여 수행할 수 있다.

예를 들어, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 암컷 마우스의 화학적으로 유도된 섬유육종이며 (문헌 [DeLeo et al., J. Exp. Med. 146:720 (1977)]), 이는 다양한 작용제의 항-종양 활성 연구를 위한 고도로 조절가능한 모델 시스템을 제공한다 (문헌 [Palladino et al., J. Immunol. 138:4023-4032 (1987)]). 간략하게, 종양 세포는 세포 배양시에 시험관내에서 번식한다. 동물에 주사하기 전에, 세포주를 세척하고, 약 1Ox10⁶ 내지 10x10⁷ 세포/ml의 세포 밀도로 완충액에 현탁시킨다. 이어서, 동물을 10 내지 100 μl의 세포 현탁액으로 피하 감염시켜, 종양이 나타나도록 1 내지 3주 방치한다.

또한, 가장 철저하게 연구된 실험 종양의 하나인 마우스의 루이스(Lewis) 폐 암종을 연구 종양 모델로서 사용할 수 있다. 상기 종양 모델에서의 효능은 소세포 폐 암종 (SCCL)으로 진단된 인간 환자 치료시에 유익한 효과와 상관관계가 있었다. 상기 종양은 이환된 마우스로부터의 종양 단편 또는 배양시에 유지된 세포의 주사시에 정상 마우스에 도입될 수 있다 (문헌 [Zupi et al., Br. J. Cancer 41:suppl. 4, 30 (1980)]). 증거는 종양이 단일 세포의 주사로부터 출발할 수 있으며 매우 높은 비율의 감염 종양 세포가 생존함을 나타낸다. 상기 종양 모델에 대한 추가의 정보는 문헌 [Zacharski, Haemostasis 16:300-320 (1986)]을 참조한다.

이식 종양을 갖는 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방법은 처리 전 및 후의 종양 크기를 측정하는 것이다. 전형적으로, 이식된 종양의 크기는 2차원 또는 3차원으로 슬라이드 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 2차원으로 제한된 측정치는 종양의 크기를 정확하게 반영하지 못하므로, 일반적으로 수학 공식을 사용하여 대응하는 부피로 전환시킨다. 그러나, 종양 크기의 측정치는 매우 부정확하다. 약물 후보의 치료 효과는 처리-유도된 성장 지연 및 특이적인 성장 지연으로서 보다 잘 설명될 수 있다. 종양 성장 설명시의 다른 중요한 변수는 종양 부피 배가 시간이다. 종양 성장의 계산 및 설명을 위한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 문헌 [Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p. 301]에 보고된 프로그램도 이용가능하다. 그러나, 처리 후의 괴사 및 염증 반응은 실제로 종양 크기를 적어도 초기에 증가시킬 수 있다는 것을 주목한다. 따라서, 이러한 변화는 형태학적 방법 및 유동 세포 분석의 조합에 의해 주의깊게 모니터링할 필요가 있다.

본원에서 확인된 EGFL8에 특이적으로 결합하는 항체 및 다른 약물 후보의 효능은 또한 자발적 동물 종양의 치료에서 시험할 수 있다. 상기 연구를 위한 적합한 표적은 고양이 구강 편평세포 암종 (SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이러한 고양이 종에서 보고되는 구강 종양의 60％ 이상을 차지하는, 고양이의 가장 흔한 구강 악성종양인 고침습성 악성 종양이다. 먼 부위로 거의 전이되지 않지만, 이러한 낮은 전이율은 상기 종양을 갖는 고양이의 짧은 생존 시간을 반영하는 것일 수 있다. 상기 종양은 통상, 주로 고양이 구강의 해부학적 구조 때문에 수술이 불가능하다. 현재, 상기 종양에 대한 효과적인 치료법은 존재하지 않는다. 연구에 들어가기 전에, 각각의 고양이에 대해 완전한 임상 조사 및 생검을 실시하고, 컴퓨터 단층촬영 (CT)으로 스캔한다. 설하 구강 편평세포 종양으로 진단된 고양이는 연구로부터 배제한다. 혀는 상기 종양 때문에 마비될 수 있고, 심지어 치료가 종양을 파괴하더라도 동물은 스스로 먹이를 섭취할 수 없다. 각각의 고양이를 보다 긴 기간에 걸쳐서 반복적으로 치료한다. 종양 사진을 치료 기간 동안 매일 및 각각의 후속 재조사시에 찍을 것이다. 치료 후에, 각각의 고양이에 대해 추가의 CT 스캔을 실시한다. CT 스캔 및 흉부 방사선 사진을 이후 8주마다 평가한다. 데이타를 대조군에 비교한 생존, 반응 및 독성의 차이에 대해 평가한다. 양성 반응은 바람직하게는 삶의 질 개선 및/또는 수명 연장과 함께 종양 퇴행의 증거를 필요로 할 수 있다.

또한, 개, 고양이 및 비비의 다른 자발적 동물 종양, 예를 들어 섬유육종, 선암종, 림프종, 연골종 또는 평활근육종도 시험할 수 있다. 이들 중, 외형과 거동이 인간과 매우 유사하기 때문에 개 및 고양이의 유선암종이 바람직한 모델이다. 그러나, 상기 모델의 사용은 동물에서 상기 종류의 종양의 드문 발생율에 의해 제한된다.

또한, 당업계에 공지된 다른 시험관내 및 생체내 심혈관, 내피 및 혈관신생 시험도 본원에서 적합하다.

항체 결합 연구

심혈관, 내피 및 혈관신생 분석에 사용되는 내피 세포 또는 다른 세포에 대한 EGFL8의 효과를 억제하는 항-EGFL8 항체의 능력을 시험한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합(heteroconjugate) 항체를 포함하며, 이들의 제조는 아래에서 설명된다.

항체 결합 연구는 임의의 공지의 분석 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석으로 수행할 수 있다 (문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pp.147-158]).

경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체에 결합하기 위해 시험 샘플 분석물질과 경쟁하는 표지된 표준물질의 능력에 의존한다. 시험 샘플 내의 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위해, 항체는 항체에 결합한 표준물질 및 분석물질을 미결합 상태의 표준물질 및 분석물질로부터 편리하게 분리할 수 있도록 경쟁 전 또는 후에 불용성인 것이 바람직하다.

샌드위치 분석은, 각각의 항체가 검출되는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물질은 고체 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합된 후, 제2 항체가 분석물질에 결합하여 불용성의 3부분 복합체를 형성한다 (예를 들어 미국 특허 4,376,110 참조). 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석), 검출가능한 잔기로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 한 종류의 샌드위치 분석은 ELISA 분석이며, 여기서 검출가능한 잔기는 효소이다.

면역조직화학을 위해, 조직 샘플은 신선하거나 냉동된 것일 수 있거나, 파라핀에 포매되어 예를 들어 포르말린과 같은 방부제로 고정될 수 있다.

심혈관, 내피 및 혈관신생 질병의 치료에 유용한 조성물은 표적 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스, siRNA 및 리보자임 분자, 삼중 나선 분자 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

효능있는 길항제의 보다 구체적인 예는 EGFL8에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 특히 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단쇄 항체, 항-개체특이형 항체, 및 상기 항체 또는 단편의 키메릭 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편 (이로 제한되지 않음)을 포함하는 항체를 포함한다. 별법으로, 효능있는 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 효과를 발휘하지 못하여 EGFL8의 작용을 경쟁적으로 억제하는 EGFL8의 돌연변이 형태일 수 있다.

또다른 효능있는 EGFL8 길항제는, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자가 표적 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 하는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구성체이다. 안티센스 기술은 삼중 나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있으며, 두 방법은 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합에 기초한 것이다. 예를 들어, 본원에서 성숙 EGFL8 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분은 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용된다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 영역에 상보성이어서 EGFL8의 전사 및 생산을 방지하도록 설계된다 (삼중 나선 - 문헌 [Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979)]; [Cooney et al., Science 241:456 (1988)]; [Dervan et al., Science 251:1360 (1991)] 참조). 본원에서 언급되는 RNA의 일부에 대한 서열 "상보성"은 RNA에 혼성화되어 안정한 이중체를 형성할 수 있는 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하고; 이중가닥 안티센스 핵산의 경우에, 이중체 DNA의 단일 가닥이 시험될 수 있거나 삼중 나선 형성이 분석될 수 있다. 혼성화 능력은 안티센스 핵산의 상보성 정도 및 길이 둘 다에 의존할 것이다. 일반적으로, 혼성화 핵산이 길수록 RNA와의 염기 미스매치(mismatch)가 더 많을 수 있고, 안정한 이중체 (또는 경우에 따라 삼중체)를 계속 형성할 수 있다. 당업자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위해 표준 과정을 사용하여 허용될 수 있는 미스매치 정도를 확인할 수 있다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 혼성화하여 mRNA 분자의 EGFL8로의 번역을 차단한다 (안티센스 - 문헌 [Okano, Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)]).

안티센스 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 또는 그의 키메릭 혼합물 또는 유도체 또는 변형 형태, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 분자의 안정성, 혼성화 등을 개선시키기 위해 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 주쇄에서 변형될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다른 매달린 기, 예를 들어 펩티드 (예를 들어, 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위한 것), 또는 세포막을 통한 수송을 촉진하는 작용제 (예를 들어 문헌 [Letsinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989)]; [Lemaitre, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652 (1987)]; 1988년 12월 15일 공개된 PCT 공보 W088/09810 참조) 또는 혈관-뇌 장벽 (예를 들어, 1988년 4월 25일 공개된 PCT 공보 W089/10134 참조), 혼성화-촉발 절단제 (예를 들어, 문헌 [Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988)] 참조) 또는 삽입제(intercalating agent) (예를 들어, 문헌 [Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988)] 참조)를 포함할 수 있다. 이를 위해, 올리고뉴클레오티드는 다른 분자, 예를 들어 펩티드, 혼성화 촉발 가교결합제, 수송제, 혼성화-촉발 절단제 등에 접합될 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형된 염기 잔기를 포함할 수 있다.

또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일룰로스 및 헥소스를 포함하지만 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형된 당 잔기를 포함할 수 있다.

또다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르 및 포름아세탈 또는 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 변형된 포스페이트 주쇄를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아노머 올리고뉴클레오티드이다. 아노머 올리고뉴클레오티드는 통상적인 단위와 달리 가닥이 서로 평행하게 연장되는 상보성 RNA와 특이적인 이중 가닥 하이브리드를 형성한다 (문헌 [Gautier, et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-6641 (1987)]). 올리고뉴클레오티드는 2'-0-메틸리보뉴클레오티드 (문헌 [Inoue, et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148 (1987)]) 또는 키메릭 RNA-DNA 유사체이다 (문헌 [Inoue, et al., FEBS Lett. 215:327-330 (1987)]).

일부 실시양태에서, 길항제는 억제성 이중 RNA, 예를 들어 siRNA, shRNA 등이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어 자동 DNA 합성기 (예를 들어 바이오서치(Biosearch), 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 등으로부터 상업적으로 입수가능한 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Stein, et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)]의 방법에 의해 합성할 수 있고, 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 조절된 기공 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다 (문헌 [Sarin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)]).

상기한 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA가 EGFL8의 생산을 억제하기 위해 생체내에서 발현될 수 있도록 세포에 전달될 수도 있다. 안티센스 DNA를 사용할 때, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 번역 개시 부위, 예를 들어 약 -10 내지 +10 위치로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.

효능있는 길항제는 EGFL8에 결합하여 그의 활성을 차단하는 소분자를 추가로 포함한다. 소분자의 예는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

추가의 효능있는 길항제는 RNA의 특이적인 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자인 리보자임이다. 리보자임은 상보성 표적 RNA에 서열-특이적 혼성화, 이어서 뉴클레오티드 내부분해(endonucleolytic) 절단에 의해 작용한다. 잠재적인 RNA 표적 내의 특이적인 리보자임 절단 부위는 공지의 기술로 확인할 수 있다. 추가의 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology 4:469-471 (1994)] 및 PCT 공보 WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개)을 참조한다.

부위 특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임을 사용하여 표적 유전자 mRNA를 파괴할 수 있지만, 해머헤드(hammerhead) 리보자임의 사용이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보성 염기쌍을 형성하는 인접 영역에 의해 지시된 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 요건은 표적 mRNA가 2개의 염기로 이루어진 서열 5'-UG-3'을 갖는 것이다. 해머헤드 리보자임의 구성 및 생산은 당업계에 잘 알려져 있고, 문헌 [Myers, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York (1995)] (특히 도 4, 페이지 833 참조) 및 문헌 [Haseloff and Gerlach, Nature, 334:585-591 (1988)] (전문이 본원에 참고로 포함됨)에 보다 상세히 설명되어 있다.

바람직하게는, 리보자임은 절단 인식 부위가 표적 유전자 mRNA의 5' 말단 가까이에 위치하도록, 즉 효율을 증가시키고 비기능성 mRNA 전사체의 세포내 축적을 최소화하도록 조작된다.

또한, 본 발명의 리보자임은 RNA 엔도리보뉴클레아제 (이하 "Cech-형 리보자임"으로 칭함), 예를 들어 테트라히메나 써모필라(Tetrahymena thermophila) (IVS 또는 L-19 IVS RNA로 알려짐)에서 자연발생되고 토마스 체크(Thomas Cech) 및 동료연구자들에 의해 상세하게 설명된 바 있는 것을 포함한다 (문헌 [Zaug, et al., Science, 224:574-578 (1984)]; [Zaug and Cech, Science, 231:470-475 (1986)]; [Zaug, et al., Nature, 324:429-433 (1986)]; 공개된 국제특허출원 WO 88/04300 (유니버시티 패이턴츠 인크.(University Patents Inc.)); [Been and Cech, Cell, 47:207-216 (1986)]). Cech-형 리보자임은 표적 RNA 서열에 혼성화한 후 표적 RNA의 절단이 일어나는 8개 염기쌍의 활성 부위를 갖는다. 본 발명은 표적 유전자에 존재하는 8개 염기쌍의 활성 부위 서열을 표적으로 하는 Cech-형 리보자임을 포함한다.

안티센스 접근법에서와 같이, 리보자임은 변형 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있으며 (예를 들어 개선된 안정성, 표적화 등을 위해), 생체내에서 표적 유전자를 발현하는 세포로 전달되어야 한다. 바람직한 전달 방법은, 형질감염된 세포가 내인성 표적 유전자 메시지를 파괴하고 번역을 억제하기에 충분한 양의 리보자임을 생산하도록 강력한 구성적 pol III 또는 pol II 프로모터의 조절 하에 리보자임을 "코딩"하는 DNA 구성체를 사용하는 것을 수반한다. 안티센스 분자와 달리 리보자임은 촉매활성을 갖기 때문에, 효율을 위해 보다 낮은 세포내 농도가 요구된다.

전사를 억제하기 위해 사용되는 삼중 나선 형성시의 핵산 분자는 단일가닥이어야 하고, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 이중체의 한 가닥 상에 퓨린 또는 피리미딘의 크기조정 가능한 스트레치를 필요로 하는 훅스틴(Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중 나선 형성을 촉진하도록 설계된다. 보다 상세한 내용은 예를 들어 상기 PCT 공보 WO 97/33551을 참조한다.

EGFL8 길항제의 다른 용도는 성장 및/또는 전이를 가능하게 하는 종양의 혈관형성을 수반하는 종양 혈관신생의 방지이다. 상기 과정은 새 혈관의 성장에 의존한다. 종양 혈관신생을 수반하는 신생물 및 관련 상태의 예는 편평세포암, 폐암 (예를 들어 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종), 복막암, 간세포암, 위암 (위장관암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 종류의 두경부암, 및 B-세포 림프종 (예를 들어 저급/여포 비-호지킨 림프종 (NHL); 소림프구성 (SL) NHL; 중간 등급/여포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고급 면역모세포 NHL; 고급 림프아구성 NHL; 고급 소형 비분할 세포 NHL; 벌키 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모세포 백혈병; 만성 골수모세포성 백혈병; 및 이식후 림프세포증식성 질환 (PTLD), 및 모반증과 관련된 비정상 혈관 증식, 부종 (예를 들어, 뇌종양과 관련된 부종), 및 메이그스 증후군을 포함한다.

또한, EGFL8 길항제는 증식성 당뇨병성 망막병증을 비롯한 증식성 망막병증, 맥락막 신생혈관형성 (CNV), 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병 및 다른 허혈증-관련 망막병증, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 병리학적 근시, 폰 힙펠-린다우 질병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐쇄 (CRVO), 분지된 망막 중심 정맥 폐쇄 (BRVO), 각막 신생혈관형성, 망막 신생혈관형성, 미숙아 망막증 (ROP), 결막하 출혈, 고혈압성 망막병증 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 안내 신생혈관 질환의 치료에 유용할 수 있다.

류마티스성 관절염은 또다른 적응증이다. 혈관계를 통한 염증 세포의 혈관 성장 및 표적화는 류마티스의 발병기전 및 관절염의 음성 혈청반응 형태에서 중요한 성분이다.

상기 내용에 비추어, 내피 세포 기능 및 이동을 변경시키거나 영향을 주는 것으로 밝혀진, 본원에 기재된 EGFL8, 이의 길항제는 상기 설명한 많은 또는 모든 질병의 병인 및 발병기전에서 중요한 역할을 수행할 것으로 보이고, 따라서 상기 과정을 억제하기 위한 치료 표적으로서 작용하거나 상기 질병에서 혈관-관련 약물 표적화를 위해 작용할 수 있다.

투여 프로토콜, 계획, 투여량 및 제제화

EGFL8 길항제는 상기 논의한 다양한 질병 및 질환에 대한 예방제 및 치료제로서 제약상 유용하다.

EGFL8 길항제의 치료 조성물은 보관을 위해, 적절한 정도의 순도를 갖는 목적 분자를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 완충액, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

상기 담체의 추가의 예는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 완충액 물질, 예를 들어 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염, 또는 전해질, 예를 들어 황산프로타민, 제이인산나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 길항제의 국소 또는 겔-기재 형태를 위한 담체는 다당류, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 또는 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 목재 왁스 알콜을 포함한다. 모든 투여를 위해, 통상적인 저장 형태가 적합하게 사용된다. 상기 형태는 예를 들어 마이크로캡슐, 나노캡슐, 리포좀, 고약, 흡입 형태, 코 스프레이, 설하 정제 및 지연 방출 제제를 포함한다. EGFL8 길항제는 일반적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도에서 상기 비히클에 제제화될 것이다.

또다른 제제화는 형성된 물품 내로 EGFL8 길항제를 혼입시키는 것을 포함한다. 상기 물품은 내피 세포 성장 및 혈관신생의 조절에 사용될 수 있다. 또한, 종양 침습 및 전이는 상기 물품을 사용하여 조절할 수 있다.

생체내 투여를 위해 사용되는 EGFL8 길항제는 멸균되어야 한다. 이는 동결건조 전 또는 후에 멸균 여과막을 통해 여과하고 재구성함으로써 쉽게 달성된다. 동결건조 형태일 경우, EGFL8 길항제는 일반적으로 사용시에 적절한 희석제로 재구성하기 위한 다른 성분과 조합하여 제제화된다. EGFL8 길항제의 액체 제제의 예는 피하 주사용 단일 투여 바이알 내에 충전된 멸균, 투명, 무색의 비보존된 용액이다. 반복 사용에 적합한 보존된 제약 조성물은 예를 들어, 주로 폴리펩티드의 적응증 및 종류에 따라 다음을 함유할 수 있다:

EGFL8 길항제;

용액 내의 폴리펩티드 또는 다른 분자의 최대 안정성 범위 내의 pH, 바람직하게는 약 4-8을 유지할 수 있는 완충액;

교반-유도된 응집에 대해 폴리펩티드 또는 분자를 1차적으로 안정화시키는 세제/계면활성제;

등장화제(isotonifier);

페놀, 벤질 알콜 및 벤제토늄 할라이드, 예를 들어 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제; 및

물.

사용되는 세제가 비이온성일 경우, 이는 예를 들어 폴리소르베이트 (예를 들어 POLYSORBATE™ (TWEEN™) 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들어 POLOXAMER™ 188)일 수 있다. 비이온성 계면활성제를 사용하면 폴리펩티드의 변성을 야기하지 않으면서 제제를 전단 표면 응력에 노출시킬 수 있다. 또한, 상기 계면활성제-함유 제제는 에어로졸 장치, 예를 들어 폐 투여에 사용하는 것 및 무바늘 제트 주사총에 사용될 수 있다 (예를 들어 EP 257,956 참조).

등장화제는 EGFL8 길항제의 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 존재할 수 있고, 다가 당 알콜, 바람직하게는 3가 이상의 당 알콜, 예를 들어 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 상기 당 알콜은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 별법으로, 염화나트륨 또는 다른 적합한 무기 염이 용액을 등장성으로 만드는데 사용될 수 있다.

완충액은 목적하는 pH에 따라, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 또는 포스페이트 완충액일 수 있다. 본 발명의 액체 제제의 한 종류의 pH는 약 4 내지 8, 바람직하게는 대략 생리학적 pH로 완충된다.

보존제 페놀, 벤질 알콜 및 벤제토늄 할라이드, 예를 들어 클로라이드는 사용될 수 있는 공지의 항미생물제이다.

본원에 기재된 치료적 폴리펩티드 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 투과될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 공급된다. 제제는 바람직하게는 반복된 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.) 또는 근내 (i.m.) 주사, 또는 비내 또는 폐내 전달에 적합한 에어로졸 제제 (폐내 전달에 대해서는 예를 들어 EP 257,956 참조)로서 투여된다.

치료적 폴리펩티드는 또한 지연 방출 제제의 형태로 투여될 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 문헌 [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)] 및 [Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)]에 기재된 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌 [Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)]), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트 (Langer et al., 상기 문헌), 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 Lupron Depot® (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988)을 포함한다.

중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 단백질이 장기간 동안 신체에 남아있을 때, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변화를 야기할 수 있다. 관여 메카니즘에 따라 단백질 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성임이 밝혀진다면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.

지연 방출 EGFL8 길항제 조성물은 또한 리포좀에 포획된 길항제를 포함한다. 이러한 리포좀은 DE 3,218,121; [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980)]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 4,485,045 및 동 4,544,545; 및 EP 102,324에 공지된 방법에 의해 제조된다. 통상 리포좀은 지질 함량이 약 30 mol％ 초과의 콜레스테롤인 작은 (약 200-800Å) 단일라멜라 종류이고, 최적 요법을 위해 선택되는 비율이 조정된다.

EGFL8 길항제의 치료 유효량은 물론 치료 (예방 포함)되는 병리학적 상태, 투여 방법, 치료에 사용되는 화합물의 종류, 관여되는 병용 요법, 환자의 연령, 체중, 일반적인 의학적 상태, 병력 등과 같은 인자에 따라 상이할 것이고, 이는 의사가 잘 결정할 수 있다. 따라서, 치료자는 최대 치료 효과를 얻기 위해 필요한 투여량을 결정하고 투여 경로를 변경할 필요가 있을 것이다.

상기 지침에서, 유효량은 일반적으로 약 0.001 내지 약 1.0 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 mg/kg이다.

EGFL8 길항제 투여 경로는 공지의 방법에 따라, 예를 들어 정맥내, 근내, 뇌내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 안내, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 주사 또는 주입에 의해, 또는 아래 설명되는 지연 방출 시스템에 의해 수행된다. EGFL8 길항제는 또한 국소 및 전신 치료 효과를 발휘하기 위해 종양내, 종양주위, 병소내 또는 병소주위 경로에 의해 적합하게 투여된다. 복강내 경로는 예를 들어 난소 종양의 치료에 특히 유용할 것으로 예상된다.

펩티드 또는 소분자가 길항제로서 사용되는 경우, 액체 또는 고체 형태로 포유동물에게 경구 또는 비경구 투여되는 것이 바람직하다.

염을 형성하는 유용한 분자의 약리학상 허용되는 염의 예는 알칼리 금속염 (예를 들어, 나트륨염, 칼륨염), 알칼리 토금속염 (예를 들어, 칼슘염, 마그네슘염), 암모늄염, 유기염기염 (예를 들어, 피리딘염, 트리에틸아민염), 무기산염 (예를 들어, 히드로클로라이드, 술페이트, 니트레이트), 및 유기산의 염 (예를 들어, 아세테이트, 옥살레이트, p-톨루엔술포네이트)을 포함한다.

조합 요법

해당 질병의 예방 또는 치료에 있어서 EGFL8 길항제의 효능은 활성제를 연속적으로, 또는 동일한 조성물 또는 별개의 조성물로 상기 목적에 효과적인 다른 약제와 조합하여 투여함으로써 개선될 수 있다.

예를 들어, 혈관신생 관련 상태, 예를 들어 암 또는 안질환 치료에 사용되는 EGFL8 길항제는 상기 확인한 세포독성제, 화학치료제 또는 항혈관신생제와 조합될 수 있다. EGFL8 길항제를 다른 항혈관신생제와 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, EGFL8 길항제는 VEGF 길항제, 예를 들어 항체, 예를 들어 베바시주마브와 조합하여 사용한다. 일부 실시양태에서, EGFL8 길항제는 EGFL7 길항제와 조합하여 사용한다.

EGFL8 길항제와 조합 투여되는 치료제의 유효량은 의사 또는 수의사의 판단에 따를 것이다. 투여량은 치료되는 상태의 최대 치료를 달성하도록 투여 및 조정된다. 예를 들어, 고혈압 치료를 위해 상기 양은 이상적으로는 이뇨제 또는 디지탈리스(digitalis)의 사용, 및 고혈압 또는 저혈압, 신장 손상 등과 같은 상태를 고려한다. 투여량은 추가로 사용되는 치료제의 종류 및 치료되는 특정 환자와 같은 인자에 의해 좌우될 것이다. 일반적으로, 사용되는 양은 소정의 치료제가 EGFL8 없이 투여될 경우 사용되는 투여량과 동일할 것이다.

EGFL8 항체

본 발명에 따른 가장 유망한 약물 후보의 일부는 EGFL8의 생산을 억제하고/거나 EGFL8의 활성을 감소시킬 수 있는 항체 및 항체 단편이다.

폴리클로날 항체

폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게에 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제의 1회 이상의 주사에 의해 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및/또는 보조제는 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 EGFL8 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 이는 면역화되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 접합시키는데 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로인트(Freund) 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 리피드 A 또는 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이도 당업자가 선택할 수 있다.

모노클로날 항체

항-EGFL8 항체는 다르게는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 전형적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 생성시킨다. 별법으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.

면역화제는 일반적으로 EGFL8 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 바람직할 경우 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 바람직할 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불사 세포주와 융합된다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103]). 불사 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불사 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배지 중에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배지는 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이다.

바람직한 불사 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 보다 바람직한 불사 세포주는 뮤린 골수종 세포주이며, 이는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (미국 버지니아주 매나사 소재)로부터 얻을 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 설명된 바 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63]).

이어서, 하이브리도마 세포가 배양되는 배지를 EGFL8 폴리펩티드에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성면역분석 (RIA) 또는 효소-연계 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정된다. 상기 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980)]의 스캐챠드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.

목적하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 (Goding, 상기 문헌). 이러한 목적에 적합한 배지는 예를 들어 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체내에서 성장할 수 있다.

서브클론에서 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 방법, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배지 또는 복수 유체로부터 단리 또는 정제될 수 있다.

또한, 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법, 예를 들어 미국 특허 4,816,567에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용할 수 있다. 일단 단리된 후에, DNA는 발현 벡터 내로 도입된 후, 숙주 세포, 예를 들어 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열을 사용하거나 (미국 특허 4,816,567; Morrison et al., 상기 문헌), 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다. 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인 대신에 사용되거나 본 발명의 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신에 사용되어 키메릭 2가 항체를 생성시킬 수 있다.

항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 일반적으로 중쇄 가교결합을 방지하기 위해 Fc 영역 내의 임의의 지점에서 끝이 잘린다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.

시험관내 방법도 1가 항체 제조에 적합하다. 그의 단편, 특히 Fab 단편을 생산하기 위한 항체의 소화는 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 달성할 수 있다.

인간 및 인간화 항체

항-EGFL8 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 인간 면역글로불린 (수여자 항체)를 포함하며, 이는 수여자의 CDR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 것이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 수여자 항체나 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 바람직하게는 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다 (문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]).

비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 일반적으로 "도입(import)" 가변 도메인으로부터 취한 "도입" 잔기로서 종종 언급된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 윈터(Winter) 및 공동연구자의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)])에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 치환된 키메릭 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있다 (문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)]). 콜(Cole) 등 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스에 도입함으로써 제조할 수 있다. 공격(challenge) 시에, 유전자 재배열, 회합 및 항체 레파토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 관찰된 것과 매우 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이러한 접근법은 예를 들어 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 및 5,661,016, 및 다음 학술 공개문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]에 기재되어 있다.

이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 모노클로날 항체이다. 본 발명에서, 한 결합 특이성은 EGFL8 폴리펩티드에 대한 것이고, 다른 결합 특이성은 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마(quadroma))는 단지 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 정확한 분자의 정제는 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 절차가 WO93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유한 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]을 참조한다.

이종접합 항체

이종접합 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 구성된다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화하기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 항체는 가교결합제를 수반하는 것을 비롯한, 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 디술파이드-교환 반응 또는 티오에테르 결합 형성에 의해 면역독소를 제작할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 예를 들어 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있는 것을 포함한다.

면역접합체

본 발명은 또한 화학치료제, 독소 (예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기에서 설명되었다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종이 방사성접합된 항체의 생산에 이용될 수 있다. 그 예는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다.

항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조한다.

또다른 실시태양에서, 항체는 종양 예비표적화에 사용하기 위한 "수용체" (예를 들어 스트렙타비딘)에 접합될 수 있으며, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후, 제거제(clearing agent)를 사용하여 순환계로부터 비결합 접합체를 제거한 다음, 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

면역리포좀

본원에 개시된 항체는 또한 면역리포좀으로서 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 및 미국 특허 4,485,045 및 동 4,544,545]에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 기공 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술파이드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학치료제 (예를 들어 독소루비신)는 임의로 리포좀 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)]을 참조한다.

항체의 제약 조성물

본원에서 확인된 EGFL8 폴리펩티드 및 상기 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 상기한 다양한 질병의 치료를 위해 하기 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.

본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 끼치지 않는 상보적인 활성을 갖는 하나 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 조성물은 그의 기능을 향상시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 시토카인, 화학치료제 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

활성 성분은 또한 예를 들어 액적형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌]에 개시되어 있다.

생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐이다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT® (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장기간 동안 신체에 남아있을 때, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변화를 야기할 수 있다. 관여 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성임이 밝혀진다면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.

항체를 사용한 치료 방법

EGFL8 폴리펩티드에 대한 항체는 상기 설명한 다양한 혈관신생 관련 상태의 치료에 사용될 수 있음이 고려된다.

항체는 공지의 방법, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여, 근내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.

다른 치료 요법을 상기한 본 발명의 항체 투여와 조합할 수 있다. 예를 들어, 항체가 암을 치료하기 위한 것일 경우, 상기 항체로 치료되는 환자는 방사선 요법을 받을 수도 있다. 별법으로, 또는 추가로, 화학치료제가 환자에게 투여될 수 있다. 상기 화학치료제의 제제 및 투여 계획은 제조자의 지시에 따라 사용되거나 또는 숙련의에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 상기 화학치료법을 위한 제제 및 투여 계획은 또한 문헌 [Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry (Williams ＆ Wilkins: Baltimore, MD, 1992)]에 기재되어 있다. 화학치료제는 항체의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있거나, 항체와 동시에 투여될 수 있다.

항체가 암 치료에 사용될 경우, 다른 종양 관련 항원에 대한 항체, 예를 들어 하나 이상의 ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체(들)에 결합하는 항체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이들은 상기 제시된 작용제도 포함한다. 또한, 항체는 방사선 조사나 방사성 물질의 투여를 수반하는 방사선 치료와 순차적으로 또는 그와 조합되어 적합하게 투여된다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 동일한 또는 2개 이상의 상이한 항원에 결합하는 2개 이상의 항체를 환자에게 동시 투여할 수 있다. 때때로, 환자에게 하나 이상의 시토카인을 투여하는 것이 유리할 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 성장억제제와 동시 투여된다. 예를 들어, 성장억제제가 먼저 투여된 후, 본 발명의 항체가 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 본 발명의 항체의 선행 투여도 고려된다. 성장억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이고, 성장억제제 및 본 발명의 항체의 조합 작용 (시너지)에 의해 감소될 수 있다.

한 실시태양에서, 종양의 혈관형성이 조합 요법시에 공격을 받는다. 항-EGFL8 항체 및 다른 항체 (예를 들어 항-VEGF)가 예를 들어 종양 또는 그의 전이성 환부 (존재하는 경우)의 괴사를 관찰함으로써 결정되는 치료 유효량으로 종양 보유 환자에게 투여된다. 추가의 항-종양제, 예를 들어 알파-, 베타- 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린, 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 또는 종양의 미세혈관 응고를 촉진하는 작용제, 예를 들어 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체, 또는 C4b 결합 단백질 (1991년 2월 21일 공개된 WO 91/01753 참조), 또는 열 또는 방사선이 추가로 투여될 수 있다.

다른 실시태양에서, FGF 또는 PDGF 길항제, 예를 들어 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항체가 항-EGFL8 항체와 함께 환자에게 투여된다. 항-EGFL8 항체를 사용한 치료는 바람직하게는 상처 치유 기간 또는 바람직한 신생혈관형성 동안 유지될 수 있다.

심혈관, 내피 및 혈관신생 질병의 예방 또는 치료를 위해, 본원 항체의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료되는 질병의 종류, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지에 상관없이 질환의 중증도 및 경과, 이전 치료법, 환자의 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 항체는 일정 시점에 또는 일련의 치료 기간에 걸쳐서 환자에게 적합하게 투여된다.

예를 들어, 질병의 종류 및 중증도에 따라, 항체 약 1 μg/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여 또는 연속적인 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 또는 매주 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 치료는 상태에 따라 목적하는 질환 증상 억제가 발생할 때까지 반복되거나 유지된다. 그러나, 다른 투여 계획을 사용할 수 있다. 상기 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 분석, 예를 들어 방사선 종양 영상에 의해 쉽게 모니터링된다.

하기 실시예는 단지 예시의 목적으로만 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하고자 한 것이 아니다.

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 문헌의 개시 내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.

<실시예>

실시예에 나타낸 상업적으로 입수가능한 시약은 달리 나타내지 않는 한 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 본원에서 ATCC® 기탁 번호로 확인된 세포의 공급원은 미국 20108 버지니아주 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션이다.

본원에 인용된 모든 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1. Egfl8 은 혈관계에서 발현된다

본 발명자들은 Egfl8의 발현 패턴을 결정하는, 특히 그의 발현을 Egfl7의 발현과 비교하는 실험을 수행하였다. 계내 혼성화를 위한 안티센스 리보프로브는 다음과 같았다:

Egfl7의 경우:

Egfl8의 경우:

마우스 배아를 자궁으로부터 절개하고, PBS (RNase 무함유)로 세척하였다. E10.5 CD1 마우스 배아를 실온 (RT)에서 4시간 동안 PBS 중 새로 제조된 4％ 파라포름알데히드에 고정시키고, PBT (PBS + 0.1％ 트윈(Tween)™ 20)로 2X5분 세척하고, 얼음 상에서 PBT 중 25％, 50％, 75％, 2X100％ 메탄올을 통해 각각 5-10분 동안 탈수시켰다. 배아를 실온에서 1시간 동안 메탄올/H₂O₂ (4:1)로 표백시키고, 얼음 상에서 100％ 메탄올로 2X10분 세척하고, 혼성화를 위한 준비가 될 때까지 -20℃에서 100％ 메탄올에 보관하였다.

배아를 얼음 상에서 다음 완충액들, 즉 PBT 중 75％, 50％, 25％ 메탄올에서 각각 5-10분 동안 연속적으로 인큐베이션하였다. 배아를 얼음 상에서 PBT로 3X5분 세척하고, 이어서 천천히 흔들면서 실온에서 PBT 중 20 μg/ml 프로테이나제 K로 30분 동안 세척하고, 주의하면서 냉각 PBT로 2회 세정하고, 천천히 흔들면서 실온에서 PBS 중 0.2％ 글루타르알데히드 + 4％ PFA로 20분 동안 고정시키고, 실온에서 PBT로 3X5분 세척하였다. 이어서, 이들을 50％ PBT + 50％ 예비혼성화 혼합물 (25 ml 초순수 탈이온화 포름아미드; 12.5 ml 20XSSC (5X 최종); 40 μl 50 mg/ml 헤파린; 500 μl 10 mg/ml 연어 정액 DNA; 125 μl 20 mg/ml 효모 tRNA; 500 μl 10％ 트윈™ 20; ~2-4 ml 1M 무수 시트르산 (pH = 4.5-5까지); 50 ml로 맞추기 위한 RNase 무함유 물)에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 예비혼성화 혼합물에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 제거한 다음, 이를 흔들면서 68-70℃에서 3 내지 6시간 동안 예비혼성화 혼합물에서 예비혼성화하고, 이후 하기 혼합물에서 진탕하면서 70℃에서 밤새 혼성화하였다: 50 μl 포름아미드 및 1 μg/ml 디그-리보프로브 (혼성화 혼합물에 첨가하기 전에 80℃에서 5-10분 동안 리보프로브를 변성시킴)를 함유하는 2 ml 예비혼성화 혼합물.

혼성화 후, 배아를 다음과 같이 여러번 세척하였다: 68-70℃에서 예비가온된 용액 I (125 ml 포름아미드; 62.5 ml 20XSSC (최종 5X); 2.5 ml 10％ 트윈™ 20; 250 ml로 맞추기 위한 물)로 2회 세정; 이어서 흔들면서 68-70℃에서 예비가온된 용액 I로 2X30분; 이어서 흔들면서 68-70℃에서 용액 II (125 ml 포름아미드; 25 ml 20XSSC (최종 2X); 2.5 ml 10％ 트윈™ 20; 250 ml로 맞추기 위한 물)로 3X60분; 흔들면서 실온에서 TBST (8 g NaCl; 0.2 g KCl; 2.5 ml 1M 트리스(Tris) (pH 7.4 또는 7.5); 10 ml 10％ 트윈™ 20; 1 리터가 되도록 물 첨가)로 3X5분; 및 이어서 흔들면서 실온에서 TBST/10％ 열 불활성화 양 (또는 램) 혈청 60분. 이어서, TBST/1％ 열 불활성화된 양 혈청 중 1/2000로 희석된 양 항-디그 항체 (로슈 몰레큘라 다이아그노스틱스(Roche Molecular Diagnostics))를 첨가하고, 흔들면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

이어서, 배아를 흔들면서 실온에서 TBST로 3X5분 세척하고, 흔들면서 실온에서 하루종일 세척하고, 매시간마다 TBST를 변경한 다음, 흔들면서 4℃에서 밤새 TBST로 세척하였다. 이어서, 배아를 흔들면서 실온에서 새로 제조된 AP 완충액 (2 ml 5M NaCl, 0.2 g KCl, 2.5 ml 1M 트리스 (pH 7.4 또는 7.5), 10 ml 10％ 트윈™ 20, 100 ml로 맞추기 위한 물)으로 2X20분 세척하였다. 이어서, 10 ml AP 완충액 + 200 μl NBT/BCIP 용액을 첨가하고, 튜브를 호일로 감싸고, 흔들어서, 발색시켰다. PBT/1 mM EDTA의 3회 세척에 의해 반응을 중단시키고, 배아를 실온에서 20분 동안 PBS 중 4％ PFA로 후고정시키고, PBT로 여러번 세척하고, 4℃에서 PBS + 0.1％ NaN₃ 중 80％ 글리세롤에 보관하였다.

Egfl7이 동맥 및 정맥을 비롯한 뇌 혈관의 대부분에서 발현된 반면, Egfl8은 뇌 동맥의 일부에서만 발현되었다는 것을 관찰하였다 (도 1a 및 도 1b). 구체적으로, Egfl8은 동맥 분지 구조의 특정 단편에서 제한적으로 나타났다. 또한, 생체내 마우스 종양 모델을 사용하여 유사한 실험을 수행하고, Egfl8이 종양의 특정 혈관에서 발현된다는 것을 관찰하였다.

실시예 2. Egfl8 넉아웃 마우스는 혈관신생에서 결함을 나타낸다

LacZ 및 네오마이신 내성 유전자로 대체된 Egfl8의 엑손 2-7을 이용하여 구성체를 제조하고, 이를 표준 상동 재조합 방법에 의해 Egfl8 넉아웃 마우스를 생성하는데 사용하였다 (도 2 참조). 생성된 넉아웃 대립유전자는 단지 EGFL8의 첫번째 35개 아미노산을 코딩하며, 이중 28개는 신호 서열을 코딩한다. Egfl8 이형 넉아웃 마우스 (Egfl8+/-)를 Egfl7+/- 마우스에 교차시켜 (문헌 [Schmidt et al., Development, 134(16): 2913-23. (2007)]에 기재됨) 이중 동형 마우스 (Egfl7-/- Egfl8-/-)를 생성시켰다.

먼저 망막 혈관계에 대한 Egfl7 및/또는 Egfl8의 돌연변이 효과를 결정하기 위해 온조직 표본 염색을 수행하였다. 출생 8일 후의 마우스 (상이한 유전자형을 가짐)를 살생하고, 안구를 절개해내고, 이를 밤새 4℃에서 PBS (포스페이트 완충 식염수 (pH 7.4)) 중 4％ PFA로 고정시켰다. 이어서, PBS로 3회 세척하고, 망막을 절개해내고, 수정체 혈관을 제거하고, 이를 염색하기 위해 48 또는 96 웰 플레이트에 넣었다. 1시간 동안 PBST (PBS + 0.5％ 트리톤(Triton)® X100)로 투과시키고, 4℃에서 2-16시간 동안 블로킹 완충액 (5％ 정상 염소 혈청 + 0.5％ 트리톤® X100 + PBS 중 0.01％ NaN₃)과 함께 망막을 인큐베이션하였다. 블로킹 완충액을 제거한 다음, 회전기 상 4℃에서 밤새 1차 염색제와 함께 인큐베이션하였다 (1차 염색제는 비오티닐화-이소렉틴 B4임: 시그마(Sigma), Cat.# = L2140. 이소렉틴 B4는 혈관 내피에 특이적으로 결합함). 비오티닐화 이소렉틴 B4 스탁 용액을 하기와 같이 제조하였다: 1 mg/ml의 농도로 0.9％ (0.15 M NaCl)에 용해시키고, -20℃에서 소량의 등분물을 보관함. 50X (작업 농도 = 20 μg/ml)로 스탁을 사용하였다. 4℃에서 PBST로 각각 1시간 동안 6회 이상 세척한 다음, PBST + 10％ 염소 혈청에서 2차 염색제 (몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes)의 스트렙타비딘 알렉사(Streptavidin Alexa) 488 (1:150))와 함께 인큐베이션하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 회전시켰다. 이어서, 회전기 상 4℃에서 PBST로 각각 1시간 동안 6회 이상 세척한 다음, DAPI를 함유하는 PBS로 1X 세척하였다. 조직을 5분 이하 동안 PBS 중의 4％ 포름알데히드로 1x 고정시킨 다음, PFA가 조직에서 완전히 헹궈져나갈 때까지 (약 30분 내지 1시간) PBS로 4회 이상 세정하였다.

각각의 망막을 PBS를 함유하는 작은 페트리-디쉬로 옮기고, 가장자리로부터 반경의 약 2/3까지 방사상 축을 따라 4-5 슬릿을 절단하였다. 유리측을 들어올려 유리 슬라이드 상에 망막을 놓고, 가능한 한 많은 양의 액체를 제거한 다음, 한 쌍의 핀셋을 사용하여 망막을 슬라이드 상에 평평하게 폈다. 이어서, 신속하게 플루오로마운트(Fluoromount)-G 한두방울을 첨가하고, 샘플 상에 커버슬립을 덮었다. 망막에 작은 주름이 존재하는 경우, 망막이 완벽하게 평평해질 때까지 커버슬립을 서서히 이동시켰다. 또한, 조직에 기포가 발견되지 않도록 하였다. 제이스(Zeiss) 공초점 현미경을 사용하여 사진을 찍고, 각 망막의 전체 두께를 커버하는 연속적인 광학 영상을 취한 다음, 제이스 소프트웨어를 사용하여 연속적인 단일 프레임 영상으로부터 3D 영상을 재구성하였다.

야생형 및 Egfl7-/- 망막 (데이타는 나타내지 않음) 뿐만 아니라 Egfl7+/-, Egfl8-/- 망막 (도 3, 왼쪽 패널)에서, 정상적인 분포 및 개별 수직 스프라우트(sprout)의 형태를 관찰하였으며, 이는 NFL 혈관으로부터 자라는 혈관신생에 의해 형성된 것이다. 그러나, Egfl7-/-, Egfl8-/- 망막 (도 3, 오른쪽 패널)에서, 수직 스프라우트는 함께 밀집되어 과도하게 큰 스프라우트를 형성하였다. 따라서, 이러한 결과는 Egfl7과 Egfl8이 함께 작용하여 망막의 심부층에서 자라는 혈관신생을 조절함을 나타냈다. 유전자 손실만으로는 혈관 기형을 유발하기에 불충분하다.

다음으로, 마우스 각막에서의 혈관신생 모델에서 Egfl8 돌연변이체의 표현형을 분석하였다 (예를 들어, 문헌 [Kenyon et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37: 1625-32 (1996)] 참조). 과정 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용하였다. 7 내지 10주령의 성체 마우스를 2.5％ 아버틴(Avertin)®을 복강내 주사하여 마취시켰다. 일반적인 마취 이외에, 눈을 0.5％ 프로파라카인 (알러간(Allergan), 미국 캘리포니아주 이르빈 소재)으로 국소 마취시켰다. 서지컬 스코프 하에 작업하면서, 서지컬 블레이드를 이용하여 중앙의 기질내 선형 각막절개술을 외직근 삽입과 병행하여 수행하였다. 변형된 본 그래프(von Graefe) 나이프를 사용하여, 라멜라 마이크로포켓을 관자놀이 주변을 향해 절개하였다. bFGF (40 내지 50 ng/펠렛)를 함유하는 히드론(Hydron) 펠렛을 보석상의 핀셋을 사용하여 포켓의 기저에서 각막 표면 상에 놓고, 핀셋의 한쪽 뿌분을 사용하여 펠렛을 포켓의 관자놀이 말단으로, 주변 혈관으로부터 1 mm 전진시켰다. 항생제 연고 (0.5％ 에리트로마이신; E. Fougera ＆ Co)를 눈에 도포하여, 감염을 방지할 뿐만 아니라 불규칙적 안구 표면으로 인한 자극을 감소시켰다. 마우스의 양쪽 눈을 연구에 이용하였다.

펠렛 이식 6일 후, 디지탈 카메라 (악시오캠(AxioCam) MRc5, 제이스)가 연결된 해부 현미경 (스테미(Stemi) 2000-C, 제이스)을 사용하여 마우스 안구의 사진을 찍었다. 안락사시에, 마우스를 10 ml HBSS-헤파린에 이어 10 ml의 FITC-덱스트란/5.5 mg/mL 폴리-L-리신 용액으로 관류하였다. 각막 온조직 표본은 탈핵된 안구로 제조하였다. 플루오레세인을 함유한 새로운 혈관의 영상을 현미경 하에 찍었다. FITC로 표지된 신생혈관 면적 및 각막 크기를 컴퓨터-보조 영상 분석 (이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus) 6.0, 미디어사이버네틱스(MediaCybernetics))에 의해 측정하였다. 혈관 면적의 백분율을 다음 식에 따라 계산하였다: (새로운 혈관 면적/각막의 크기)x100.

Egfl8-/- 마우스에서의 각막 혈관 밀도는 야생형 마우스에서의 각막 혈관 밀도의 절반보다 약간 더 낮음을 관찰하였다 (도 4). 이러한 결과는 Egfl8이 단독으로 혈관형성에 역할을 한다는 것을 확인하였다.

상기 기재된 발명의 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실시하는데 충분한 것으로 생각된다. 그러나, 본원에 도시 및 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재로부터 당업자에게 명백할 것이며, 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 속할 것이다.

Sequence Listing <110> Genentech, Inc.; Ye, Weilan; Lu, Han <120> METHOD FOR INHIBITING ANGIOGENESIS USING EGFL8 ANTAGONISTS <130> P4156R1 WO <150> US 61/020,960 <151> 2008-01-14 <160> 4 <210> 1 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Arg Ala Glu Leu Cys Thr Leu Leu Gly Gly Phe Ser 1 5 10 15 Phe Leu Leu Leu Leu Ile Pro Gly Glu Gly Ala Lys Gly Gly Ser 20 25 30 Leu Arg Glu Ser Gln Gly Val Cys Ser Lys Gln Thr Leu Val Val 35 40 45 Pro Leu His Tyr Asn Glu Ser Tyr Ser Gln Pro Val Tyr Lys Pro 50 55 60 Tyr Leu Thr Leu Cys Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 Thr Met Tyr Arg Val Met Trp Arg Glu Val Arg Arg Glu Val Gln 80 85 90 Gln Thr His Ala Val Cys Cys Gln Gly Trp Lys Lys Arg His Pro 95 100 105 Gly Ala Leu Thr Cys Glu Ala Ile Cys Ala Lys Pro Cys Leu Asn 110 115 120 Gly Gly Val Cys Val Arg Pro Asp Gln Cys Glu Cys Ala Pro Gly 125 130 135 Trp Gly Gly Lys His Cys His Val Asp Val Asp Glu Cys Arg Thr 140 145 150 Ser Ile Thr Leu Cys Ser His His Cys Phe Asn Thr Ala Gly Ser 155 160 165 Phe Thr Cys Gly Cys Pro His Asp Leu Val Leu Gly Val Asp Gly 170 175 180 Arg Thr Cys Met Glu Gly Ser Pro Glu Pro Pro Thr Ser Ala Ser 185 190 195 Ile Leu Ser Val Ala Val Arg Glu Ala Glu Lys Asp Glu Arg Ala 200 205 210 Leu Lys Gln Glu Ile His Glu Leu Arg Gly Arg Leu Glu Arg Leu 215 220 225 Glu Gln Trp Ala Gly Gln Ala Gly Ala Trp Val Arg Ala Val Leu 230 235 240 Pro Val Pro Pro Glu Glu Leu Gln Pro Glu Gln Val Ala Glu Leu 245 250 255 Trp Gly Arg Gly Asp Arg Ile Glu Ser Leu Ser Asp Gln Val Leu 260 265 270 Leu Leu Glu Glu Arg Leu Gly Ala Cys Ser Cys Glu Asp Asn Ser 275 280 285 Leu Gly Leu Gly Val Asn His Arg 290 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Gly Leu Trp Ala Glu Leu Cys Ile Ser Leu Arg Gly Leu Ser 1 5 10 15 Phe Phe Leu Val Leu Met Thr Gly Glu Gly Thr Arg Gly Gly Ser 20 25 30 Phe Lys Glu Ser Leu Gly Val Cys Ser Lys Gln Thr Leu Leu Val 35 40 45 Pro Leu Arg Tyr Asn Glu Ser Tyr Ser Gln Pro Val Tyr Lys Pro 50 55 60 Tyr Leu Thr Leu Cys Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 Thr Thr Tyr Arg Val Ala Trp Arg Glu Val Arg Arg Glu Val Pro 80 85 90 Gln Thr His Val Val Cys Cys Gln Gly Trp Lys Lys Pro His Pro 95 100 105 Gly Ala Leu Thr Cys Asp Ala Ile Cys Ser Lys Pro Cys Leu Asn 110 115 120 Gly Gly Val Cys Thr Gly Pro Asp Arg Cys Glu Cys Ala Pro Gly 125 130 135 Trp Gly Gly Lys His Cys His Val Asp Val Asp Glu Cys Arg Ala 140 145 150 Ser Leu Thr Leu Cys Ser His Gly Cys Leu Asn Thr Leu Gly Ser 155 160 165 Phe Leu Cys Ser Cys Pro His Pro Leu Val Leu Gly Leu Asp Gly 170 175 180 Arg Thr Cys Ala Gly Gly Pro Pro Glu Ser Pro Thr Ser Ala Ser 185 190 195 Ile Leu Ser Val Ala Val Arg Glu Ala Asp Ser Glu Glu Glu Arg 200 205 210 Ala Leu Arg Trp Glu Val Ala Glu Leu Arg Gly Arg Leu Glu Lys 215 220 225 Leu Glu Gln Trp Ala Thr Gln Ala Gly Ala Trp Val Arg Ala Val 230 235 240 Leu Pro Met Pro Pro Glu Glu Leu Arg Pro Glu Gln Val Ala Glu 245 250 255 Leu Trp Gly Arg Gly Asp Arg Ile Glu Ser Leu Ser Asp Gln Val 260 265 270 Leu Leu Leu Glu Glu Arg Leu Gly Ala Cys Ala Cys Glu Asp Asn 275 280 285 Ser Leu Gly Pro Ser Leu Arg Gly 290 <210> 3 <211> 1337 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 gtagggctct gccgggacct gggtcttccc tctcctggag ctgcagaggc 50 cagaagttca gtggtgaggg gtccaaggag agtccgggga gaccagggag 100 gctctgtcca tcccctgtcc ctgtccctgt gggaagcccc cggcagcagc 150 aagacgctgg ctgttccacc tgcccacaag aacagccacc accagtaccc 200 aggggatgac aagcggccgg accacaggcc acaaaaagaa gaaggctacc 250 ccacttacag atgcagacca tgtggggctc cggagaactg cttgtagcat 300 ggtttctagt gttggcagca gatggtacta ctgagcatgt ctacagaccc 350 agccgtagag tgtgtactgt ggggatttcc ggaggttcca tctcggagac 400 ctttgtgcag cgtgtatacc agccttacct caccacttgc gacggacaca 450 gagcctgcag cacctaccga accatctacc ggactgccta tcgccgtagc 500 cctggggtga ctcccgcaag gcctcgctat gcttgctgcc ctggttggaa 550 gaggaccagt gggctccctg gggcttgtgg agcagcaata tgccagcctc 600 catgtgggaa tggagggagt tgcatccgcc caggacactg ccgctgccct 650 gtgggatggc agggagatac ttgccagaca gatgttgatg aatgcagtac 700 aggagaggcc agttgtcccc agcgctgtgt caatactgtg ggaagttact 750 ggtgccaggg atgggaggga caaagcccat ctgcagatgg gacgcgctgc 800 ctgtctaagg aggggccctc cccggtggcc ccaaacccca cagcaggagt 850 ggacagcatg gcgagagagg aggtgtacag gctgcaggct cgggttgatg 900 tgctagaaca gaaactgcag ttggtgctgg ccccactgca cagcctggcc 950 tctcggtcca cagagcatgg gctacaagat cctggcagcc tgctggccca 1000 ttccttccag cagctggacc gaattgattc actgagtgag caggtgtcct 1050 tcttggagga acatctgggg tcctgctcct gcaaaaaaga tctgtgataa 1100 cctctcacca cccaggctgg atagagcagt catccctaga tcccttgtag 1150 ccagagttca ggcgctgtct ggtggtgcct atgagcagaa ggccctgcct 1200 cattgtccct ctttcttagg aggttcctag gacttgggca tggggagtgg 1250 ggtcttgtgt gactcttcag tggggctccc tgtctaagtg gtaaggtggg 1300 gattgtctcc atctttgtca taataaagct gagactt 1337 <210> 4 <211> 501 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 ggaggatctt tcaaagagag tttgggagtg tgctccaagc agacgctgct 50 ggttcctctc cgttacaacg agtcctatag tcaaccggtg tacaaaccct 100 acctgacctt gtgtgcgggg aggcgcatat gtagcaccta caggaccaca 150 taccgtgtgg cctggcggga ggtgaggcgg gaggtaccac agacacacgt 200 ggtgtgctgt cagggctgga agaagccaca cccaggagct ctcacctgtg 250 atgccatctg ctccaagcct tgtcttaatg gaggtgtctg cactggacca 300 gaccggtgcg agtgtgcccc aggctgggga ggaaagcatt gccacgtgga 350 tgtcgatgaa tgcagggcca gccttaccct ctgctctcat ggctgcctca 400 acacactggg cagcttcttg tgcagctgtc cacaccccct ggtgctgggt 450 ctcgatggac gcacctgtgc aggaggccca ccggagagtc caaccagcgc 500 g 501

Claims

혈관신생과 관련된 병리학적 상태를 갖는 대상체에게 EGFL8 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 혈관신생을 감소시키거나 억제하는 방법.
제1항에 있어서, EGFL8 길항제가 항-EGFL8 항체인 방법.
제1항에 있어서, 병리학적 상태가 신생물인 방법.
제3항에 있어서, 신생물이 암종인 방법.
제4항에 있어서, 화학치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 병리학적 상태가 눈과 관련된 것인 방법.
제6항에 있어서, 병리학적 상태가 안내 신생혈관 질환인 방법.
제1항에 있어서, 대상체에게 제2 항혈관신생제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 제2 항혈관신생제를 EGFL8 길항제의 투여 전 또는 투여 후에 투여하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 제2 항혈관신생제를 EGFL8 길항제와 함께 투여하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 제2 항혈관신생제가 EGFL7의 길항제 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)의 길항제인 방법.
제11항에 있어서, EGFL7 길항제가 항-EGFL7 항체인 방법.
제11항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
제13항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주마브(bevacizumab)인 방법.