TWI609692B

TWI609692B - 新穎ｓｔｉｐ１多肽及其用途

Info

Publication number: TWI609692B
Application number: TW103103730A
Authority: TW
Inventors: 王子豪; 蔡佳龍; 趙安琪
Original assignee: 長庚醫療財團法人
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2018-01-01
Also published as: TW201442720A; US20140220025A1; US9145449B2; US9724385B2; US20160008426A1

Abstract

本發明係關於包含經分離之多肽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。本發明亦揭示結合於經分離之多肽的抗體或其抗原結合部分。亦揭示抑制癌細胞生長之方法，包含向有需要之個體投與本文所述之經分離之多肽或抗體。

Description

新穎STIP1多肽及其用途

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2013年2月4日申請之美國申請案第61/760,597號之權益，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。

壓力誘導之磷蛋白(STIP1,SEQ ID NO：3)為62.6kDa蛋白質，亦稱為熱休克蛋白(HSP)組織蛋白(HOP)，因為其已展示調節HSP 90及HSP 70之伴隨蛋白活性。STIP1含有九個三四氨基酸重複(TPR)模體及一個核定位信號(NLS)(Longshaw等人，2004)。STIP1之TPR結構域涉及將HSP70及HSP90一起固持在HSP90伴隨蛋白機制中(Odunuga等人，2004)。此蛋白質複合物形成參與數個細胞過程，包括轉錄、蛋白質摺疊、蛋白質易位、病毒複製、信號轉導及細胞分裂。

癌症仍為全世界主要公共健康問題。其深深地影響每年美國診斷出超過1百萬人以及其家庭及朋友。儘管化學療法於近50年的進步，但醫學界仍面臨治癒許多不同類型癌症之挑戰。因此，仍需要開發各種類型癌症之有效且安全的治療。本發明滿足此需要。

在一個實施例中，本發明揭示一種包含經分離之多肽的醫藥組合物，其中該經分離之多肽包含與SEQ ID NO：1至少90%同源的胺基酸序列。該醫藥組合物可另外包含針對STIP1之抗體。

在另一實施例中，本發明揭示一種抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列。

在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的抗體或其抗原結合部分；及醫藥學上可接受之載劑。

本發明亦關於用於抑制癌細胞生長之方法，包含向有需要之個體投與(i)一分離之多肽包含與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列(ii)一抗體或其抗原結合部分結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列。

本發明亦揭示一種經分離之多肽，包含與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列。

當閱讀隨後的附圖及實施方式時，本發明會變得更加顯而易見。

專利或申請案文件含有至少一個彩色製圖。具有彩圖之此專利或專利申請公開案的複本應按需求由智慧財產局提供且支付必要費用。

圖l說明各種癌細胞及相應正常組織中STIP1之免疫組織化學分析(表示為組織學計分)。

圖2說明鼻咽癌(NPT-TW04)、肺癌(CL1-5)及肝細胞癌(Hep3B)中各種STIP1多肽(SEQ ID NO：4-25)的存在。

圖3說明STIP1抗體於卵巢癌細胞(MDAH2774)、子宮內膜癌細胞(RL95-2)、胰臟癌細胞(BXPC3)、鼻咽癌細胞(NPC-BM1)、肺癌細胞(CL1-0)、結腸癌細胞(HT29)及乳癌細胞(MCF7)的細胞毒性效應。

圖4說明STIP1抗體轉染之SKOV3細胞(下部畫面)及對照IgG轉染之SKOV3細胞(上部畫面)中的裂解卡斯蛋白酶3含量。

圖5A說明各種卵巢癌細胞株(BG1、BR、TOV112D、TOV21G、MDAH2774、SKOV3、ES2及OV90)及子宮內膜癌細胞株(RL95-2)中內源性STIP1含量。

圖5B說明在ES2細胞株及TOV21G細胞株中STIP1抗體與對照IgG相比之細胞毒性效應。

圖6A說明各種癌細胞株上重組人類STIP1蛋白(rh STIP1)之SMAD1/5磷酸化效應。

圖6B說明由STIP1抗體抑制SMAD1/5磷酸化。

圖6C說明rhSTIP1及STIP1抗體對於卵巢癌細胞遷移之效應。

圖7A說明DMSO、ALK抑制劑(LDN193189)及ERK抑制劑(PD98059)對於BrdU併入之效應。

圖7B說明DMSO、ALK抑制劑(LDN193189)及ERK抑制劑(PD98059)對於Ki67免疫細胞化學之效應。

圖7C說明與STIP1抗體相比，rhSTIP1、對照IgG對於BrdU併入之效應。

圖7D說明對照IgG與STIP1抗體相比對於Ki67免疫細胞化學之效應。

圖7E說明對照siRNA、ALK2 siRNA及STIP1siRNA對於BrdU併入之效應。

圖7F說明對照siRNA、ALK2 siRNA及STIP1siRNA對於Ki67免疫細胞化學之效應。

圖8A說明STIP1抗體對於MOSEC細胞之效應。

圖8B及圖8C說明與對照IgG治療之小鼠相比，STIP1抗體治療之小鼠中腫瘤體積的變化。

圖8D說明與對照IgG治療之小鼠相比，STIP1抗體治療之小鼠的存活時間。

圖9A說明STIP1抗體對於一組重疊STIP1胺基酸(a.a.)序列之結合親和力，包括rhSTIP1(對照)、胺基酸序列號445-469(SEQ ID NO：26)、458-482(SEQ ID NO：27)、470-494(SEQ ID NO：28)、482-506(SEQ ID NO：2)、495-519(SEQ ID NO：29)、507-531(SEQ ID NO：30)及520-543(SEQ ID NO：1)。

圖9B說明各種濃度之STIP1多肽520-543(肽520)對於STIP1抗體之中和效應。

圖10A說明僅用STIP1抗體處理之組及用STIP1抗體與各種濃度之STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)之組合處理之組中之癌細胞(MDAH2774)活力。

圖10B說明用各種濃度之STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)及其他STIP1多肽(SEQ ID NO：26、27及29)處理之組之癌細胞(MDAH2774)活力。

圖11為說明卵巢癌細胞之細胞溶質中存在STIP1多肽520-543的顯微圖像集合。

圖12展示STIP1多肽520-543對於HSP90及STIP1相互作用之效應。

圖13為說明STIP1多肽520-543(肽520)對於測試癌細胞株之LDH活性及MTT活性之效應的條形圖集合。

圖14展示與對照相比，用STIP1多肽520-543(肽520)處理之小鼠的腫瘤塊尺寸。

圖15為西方墨點法圖像集合。圖15A展示各種濃度之STIP1多肽520-543(肽520)對於卵巢及子宮內膜癌細胞中JAK2及pSTAT3蛋白質之效應。圖15B展示STIP1多肽520-543(肽520)對於JAK2及Bcl-x1蛋白質之效應。

定義

如上文及整個說明書中所用，除非另外指示，否則下列術語應理解為具有下列含義。

如本文所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數。

如本文所用，「有效量」包括足以減少癌症之症狀及體征之藥劑的劑量，該等症狀及病徵包括(但不限於)體重減輕、疼痛及腫瘤塊，腫瘤塊可在臨床上由觸診或經由各種放射性影像偵測，諸如疼痛、體重減輕或在放射圖像上證明之腫瘤塊。或者，可使用任何其他診斷方式評估藥劑之有效量，諸如使用基於抗體之分析(例如ELISA)之循環抗原或其他腫瘤標記物之血清偵測。

如本文所用之術語「治療(treating、treated或treatment)」包括預防性(例如防治性)、緩解性及治癒性用途或結果。

術語「抑制」及「抑止」包括(但不限於)降低、減緩或停止生長。

如本文所用之術語「個體」包括(但不限於)生物體，諸如哺乳動物，例如人類、非人類靈長類(例如狒狒、猩猩、猴)、小鼠、豬、母牛、山羊、貓、兔、大鼠、天竺鼠、倉鼠、馬、猴、綿羊或其他非人類哺乳動物；非哺乳動物，包括例如非哺乳動物脊椎動物，諸如鳥(例如雞或鴨)或魚及非哺乳動物無脊椎動物。較佳地，個體為人類。

本文中之所有數目可由「約」修飾。

術語「STIP抗體」及「針對STIP1之抗體」可互換使用。

在一個實施例中，可用於本發明之用於預防及/或治療上文所論述之病狀之方法的一或多種治療劑與醫藥學上可接受之載劑、媒劑或佐劑一起調配。術語「醫藥學上可接受之載劑、媒劑或佐劑」係指可與本發明化合物一起投與患者且不破壞其藥理學活性並在投與足以傳遞治療量之化合物的劑量時無毒的載劑、媒劑或佐劑。

化合物可以鹽形式(諸如醫藥學上可接受之鹽形式)調配，其包括(但不限於)與無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸及其類似物)一起形成之酸加成鹽及與有機酸(諸如(但不限於)乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、蘋果酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、雙羥萘酸、海藻酸、聚麩胺酸、萘磺酸、萘二磺酸及多聚半乳糖醛酸)一起形成之鹽。醫藥學上可接受之鹽亦包括可在存在之酸性質子能夠與無機或有機鹼反應時形成之鹼加成鹽。合適之醫藥學上可接受之鹼加成鹽包括金屬鹽類，諸如由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉及鋅製成之鹽或由有機鹼製成之鹽，有機鹼包括一級胺、二級胺及三級胺、經取代之胺(包括環胺)，諸如咖啡鹼、精胺酸、二乙胺、N-乙基哌啶、組胺酸、葡糖胺、異丙胺、離胺酸、嗎啉、N-乙基嗎啉、哌嗪、哌啶、三乙胺、三甲胺。所有此等鹽可藉由使例如適當酸或鹼與本發明之化合物反應而由相應本發明之化合物藉由習知方法製備。Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,and Use(P.H.Stahl及C.G.Wermuth編，Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)[1]。

可用於本發明之劑型之醫藥學上可接受之載劑、佐劑及媒劑包括(但不限於)離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(SEDDS)，諸如丁二酸d-E生育酚聚乙二醇1000；用於醫藥劑型之界面活性劑，諸如Tweens或其他相似聚合傳遞基質；血清蛋白，諸如人血清白蛋白；緩衝物質，諸如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸之偏甘油酯混合物、水、鹽；或電解質，諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠狀二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、基於纖維素之物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚環氧丙烷-嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。環糊精(諸如α、β及γ-環糊精)或經化學修飾之衍生物(諸如羥烷基環糊精，包括2-及3-羥丙基-β環糊精或其他溶解衍生物)亦適宜用於增強本文所述之式之化合物的傳遞，該等化合物可用於本發明之用於預防及/或治療纖維變性病狀之方法。額外合適之賦形劑可見於Handbook of Pharmaceutical Excipients,R.C.Rowe等人，Pharmaceutical Press,2009[9]。在某些實施例中，單位劑量調配物經混配用於立即釋放，但亦揭示經混配用於一種或兩種藥劑之延遲或延長釋放的單位劑量調配物。

在一個實施例中，可用於本發明方法之治療劑被調配於單個單位劑量中，使得藥劑在不同時間自劑量釋放。

抑止癌症生長之方法

在一個實施例中，本發明係關於減少或抑制個體之癌細胞生長的方法，該方法包含投與經分離之多肽(其與SEQ ID NO：1至少90%同源)以抑制癌細胞生長且減少個體之癌症體征及症狀。在一個實施例中，經分離之多肽包含與SEQ ID NO：1中所示之胺基酸序列具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%一致性的胺基酸序列。

經分離之多肽可單獨或與STIP1抑止劑組合使用以抑制或減少癌細胞生長。

STIP1抑止劑可為STIP1抗體或針對全長人類STIP1蛋白質(SEQ ID NO：3)之抗體或針對部分序列之抗體。STIP1抗體之非限制性實例包括可購自Abnova Biotechnology Inc.(Taipei City,Taiwan)之STIP1 MaxPab小鼠多株抗體或可購自Sigma-Aldrich(Switzerland)之單株STIP1抗體。STIP1抑止劑亦可為靶向STIP1 RNA轉錄物之小型干擾性RNA(例如siRNA、短干擾性RNA或沉默RNA)以減少STIP1之表現。舉例而言，STIP1抑止劑可為靶向STIP1之小型干擾性RNA的生物合成前驅物。小型干擾性RNA通常為具有磷酸化5’端及羥基化3’端與兩個外伸核苷酸之短的(例如約21個核苷酸長)雙股RNA種類。STIP1抑止劑可為任何RNA種類，包括(但不限於)微RNA(miRNA)、短髮夾型RNA、核糖核酸內切酶製備之siRNA(esiRNA)、天然反義短干擾性RNA(natsiRNA)，其中該等RNA種類靶向STIP1 RNA以減少細胞中STIP1之表現。

在另一實施例中，本發明揭示減少或抑制個體之癌細胞生長的方法，包含投與結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的抗體或抗原結合部分。

癌症可為任何實體腫瘤或血液科腫瘤，諸如卵巢癌、子宮內膜癌、鼻咽癌、肝癌、乳癌、肺癌、胃癌、胰臟癌、結腸癌、白血病、淋巴瘤、CNS腫瘤(諸如神經膠母細胞瘤)或肉瘤。在一個實施例中，癌症可為胰臟癌、子宮內膜癌、肺癌、鼻咽癌、乳癌及結腸癌。或者，在另一實施例中，個體實質上無卵巢癌。

具有本文所述之抗體或其抗原結合片段及/或經分離之多肽的治療劑可單獨或作為佐劑投與手術、冷凍療法或放射療法，例如在手術之前以減小腫瘤尺寸及/或在手術之後以減小復發及轉移之可能性，例如藉由抑制腫瘤細胞生長及循環腫瘤細胞經由血流遷移。

治療劑可在抗癌劑之前、之後或同時投與。

抗癌劑包括習知化學治療劑、靶向癌症療法或放射療法。在某些情況下，治療劑包括各種抗癌劑之組合。

結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的抗體或抗原結合片段或包含與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的經分離之多肽的劑量可由熟習此項技術者決定，其不經過度實驗，根據待治療個體之年齡、體重及病狀而變化。

結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的抗體或抗原結合片段或包含與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的經分離之多肽可藉由任何合適之途徑投與，包括顱內、腦內、心室內、鞘內、脊椎內、經口、局部、直腸、經皮、皮下、靜脈內、肌肉內、鼻內、腹膜內、腫瘤內及其類似物，且可囊封於諸如脂質體之載體中。

抗體

如本文所用，術語「抗體」包括多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、Fv、Fab及F(ab')₂；雙功能雜交抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17：105,1987)、單鏈(Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879,1988；Bird等人，Science 242：423,1988)；及具有經改造之恆定區的抗體(例如美國專利第5,624,821號)。

單株抗體為單一分子物種之抗體，而多株抗體是藉由用抗原注射動物(諸如嚙齒動物、兔或山羊)且由該動物提取血清所產生。人類化抗體為經遺傳工程改造之(單株)抗體，其中來自小鼠抗體(「供體抗體」，其亦可為大鼠、倉鼠或其他類似物種)之CDR移植於人類抗體(「受體抗體」)上。人類化抗體亦可用少於來自小鼠抗體之全部CDR製成。因此，人類化抗體為具有來自供體抗體之CDR及來自人類抗體之可變區構架及恆定區的抗體。通常，人類化抗體包含(i) 包含來自小鼠抗體之三個CDR、來自人類抗體之可變區構架及人類恆定區之輕鏈，及(ii)包含來自小鼠抗體之三個CDR、來自人類抗體之可變區構架及人類恆定區之重鏈。嵌合抗體為小鼠(或其他嚙齒動物)之可變區與人類抗體之恆定區組合的抗體；其藉助於遺傳工程建構為此項技術中所熟知(參見例如Imai等人，Comparing antibody and small molecule therapies for Cancer.Nature Reviews Cancer 6：714-727(2006)；亦參見BioAtla,11011 Torreyana Road,San Diego,California 92121))。該等抗體保留小鼠抗體之結合特異性，雖然約三分之二為人類的。小鼠抗體、嵌合抗體及人類化抗體中存在之非人類序列的比例表明嵌合抗體之免疫原性介於小鼠抗體與人類化抗體之間。可相對於小鼠抗體免疫原性減小的其他類型經遺傳工程改造之抗體包括使用噬菌體呈現方法(Dower等人，WO91/17271；McCafferty等人，WO92/001047；Winter,WO92/20791；及Winter,FEBS Lett.23：92,1998，其每一者以引用的方式併入本文中)或使用轉殖基因動物(Lonberg等人，WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741，其每一者以引用的方式併入本文中)製得之人類抗體。

本發明之抗體通常實質上經純化遠離不希望有的污染物。此意指抗體通常為至少約50% w/w(重量/重量)純以及實質上沒有干擾性蛋白質及污染物。較佳地，抗體為91、92、93、94、95、96、97、98或99% w/w純。

結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的抗體或抗原結合片段據稱抑制STIP1之一或多種生物學活性，諸如SMAD1/SMAD5磷酸化、ERK1/ERK2磷酸化、ID3基因表現活化、刺激DNA合成刺激及細胞增殖。

結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段包括呈天然四聚物形式(2條輕鏈及2條重鏈)之抗體，且可具有任何已知同型，亦即IgG、IgA、IgM、IgD及IgE以及其亞型，亦即人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。在另一實施例中，抗體或抗原結合部分結合與SEQ ID NO：1至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源之胺基酸序列。

本發明之抗體可藉由選擇一或多種產生針對SEQ ID NO：1之一或多種抗體的B細胞，且自該等B細胞回收該等抗體而自諸如人類之個體回收。針對SEQ ID NO：1之小鼠抗體係藉由此項技術中所熟知之標準方法來製得。在一個實施例中，製得結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列之抗體的步驟包括：用具有包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之肽於適當佐劑中腹膜內、靜脈內或皮下注入足墊而使諸如動物之個體免疫，隨後提取該動物之脾臟或淋巴結細胞，隨後與合適之永生化細胞株融合形成融合瘤，且隨後選擇產生結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列之抗體的融合瘤。經免疫之動物可為當投與免疫原時能夠產生可回收抗體之任何動物，諸如(但不限於)兔、小鼠、大鼠、倉鼠、山羊、馬、猴、狒狒及人類。在使宿主免疫且產生針對SEQ ID NO：1之抗體後，分析抗體以證實其特異性針對所關注之抗原且判定其是否展現與任何其他抗原之任何交叉反應性。一種進行該等分析之方法為如美國專利公開案第2004/0126829號中所述之血清篩查分析。針對SEQ ID NO：1之抗體可藉由多種已知技術就結合至多肽抗原(例如SEQ ID NO：1)加以表徵。舉例而言，在ELISA中，微量滴定板用含毒素或類毒素抗原之PBS塗佈，且隨後用稀釋於PBS中之不相關蛋白質(諸如牛血清白蛋白(BSA))阻斷。將經毒素免疫之小鼠之血漿稀釋液添加至每一孔且培育。洗滌板且隨後與結合至酶(例如鹼性磷酸酶)之二級抗體一起培育。在洗滌後，用酶受質(例如ABTS)使板顯影，且在特定OD下分析。在其他實施例中，為判定所選單株抗體是否結合至多肽抗原(例如SEQ ID NO：1)，抗體可經生物素標記且用抗生蛋白鏈菌素標記之探針偵測經標記之抗體。可藉由西方墨點法測試抗體與多肽抗原(例如SEQ ID NO：1)之反應性。

結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的抗體亦可藉由此項技術中熟知之噬菌體呈現或轉殖基因小鼠方法製得。在一個態樣中，宿主為轉殖基因的且產生人類抗體，例如表現人類免疫球蛋白基因區段之小鼠。美國專利第8,236,311號；第7,625,559號及第5,770,429號，其每一者之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。Lonberg等人，Nature 368(6474)：856-859,1994。Lonberg,N.,Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101,1994。Lonberg,N.及Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.,13：65-93,1995。Harding,F.及Lonberg,N.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,764：536-546,1995。在一個實施例中，抗體可藉由以下步驟製得：用包含SEQ ID NO：1之多肽使個體免疫；自該個體之B細胞回收mRNA；將該回收的mRNA轉化為cDNA；在噬菌體中表現該cDNA，使得由該cDNA編碼之抗體接著呈現於該等噬菌體表面上；選擇呈現該抗體之噬菌體；自編碼該抗體之該等所選噬菌體回收核酸分子；在宿主細胞中表現該等回收之核酸分子；及自該宿主細胞回收結合包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的抗體。

針對SEQ ID NO：1之經遺傳工程改造之抗體(例如嵌合抗體)可藉由多種熟知技術的已知方法來表現。舉例而言，編碼其輕鏈及重鏈V區之基因可由重疊寡核苷酸合成且與可用C區一起插入提供必需調節區(例如啟動子、強化子、聚A部位等)之表現載體(例如可購自Invitrogen)。使用CMV啟動子-強化子為較佳。表現載體可隨後使用各種熟知方法(諸如脂質體轉染或電穿孔法)轉染進入多種哺乳動物細胞株(諸如CHO或非生產骨髓瘤，包括Sp2/0及NS0)，且藉由適當抗生素選擇來選擇表現抗體之細胞。參見例如美國專利第5,530,101號。較大量抗體可藉由使細胞在市售生物反應器中生長來生產。

在表現後，針對SEQ ID NO：1之抗體可根據此項技術之標準程序加以純化，諸如微濾、超濾、蛋白質A或G親和性層析、尺寸排阻層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析及/或基於有機染料或其類似物之其他形式的親和性層析。

醫藥組合物

在一個態樣中，本發明提供醫藥組合物，包含經分離之多肽及醫藥學上可接受之載劑，該多肽包含與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列。在另一實施例中，醫藥組合物另外包含針對全長人類STIP1蛋白質(SEQ ID NO：3)之抗體。

醫藥組合物之經分離之多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同源。

在一個實施例中，醫藥組合物之經分離之多肽因少量功能上無關緊要的胺基酸取代(例如保守取代)、缺失或插入而不同於SEQ ID NO：1，同時保留SEQ ID NO：1之功能特性，亦即該多肽在本文所述之至少一個、且較佳所有活體外或活體內分析中抑制癌細胞生長。出於將胺基酸取代分類為保守或非保守之目的，胺基酸可分組如下：組I(疏水性側鏈)：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；組II(中性親水性側鏈)：cys、ser、thr；組III(酸性側鏈)：asp、glu；組IV(鹼性側鏈)：asn、gln、his、lys、arg；組V(影響鏈取向之殘基)：gly、pro；及組VI(芳族側鏈)：trp、tyr、phe。保守取代涉及同一類別胺基酸之間的取代。非保守取代由此等類別中之一者之成員交換另一者之成員而構成。

在一個實施例中，經分離之多肽不同於SEQ ID NO：1達至多5個胺基酸變化，諸如1、2、3、4或5個胺基酸變化。

本發明亦揭示醫藥組合物，包含結合至具有與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列之肽的抗體或抗原結合片段。

醫藥組合物可另外包含有助於進入細胞之信號肽(Horibe等人J Translation Med 9：8,2011)、生理學上可接受之載劑，視情況具有賦形劑或穩定劑，呈凍乾或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽或乙酸鹽，在通常5.0至8.0、最經常6.0至7.0之pH值下；鹽，諸如氯化鈉、氯化鉀等以獲得等張；抗氧化劑；防腐劑；低分子量多肽；蛋白質；親水聚合物，諸如聚山梨醇酯80；胺基酸；碳水化合物；螯合劑；糖；及熟習此項技術者已知的其他標準成分。

本發明之醫藥組合物可製備為可注射物，呈液體溶液或懸浮液形式或呈在注射之前適於溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。醫藥組合物亦可以固體形式、乳化或活性成分囊封於脂質體媒劑或用於持續傳遞之其他粒子載劑中來製備。舉例而言，醫藥組合物可呈油乳液、油包水型乳液、水包油包水乳液、特定部位乳液、長時間滯留乳液、黏性乳液、微乳液、奈米乳液、脂質體、微粒、微球體、奈米球體、奈米粒子及各種天然或合成聚合物形式，諸如不可再吸收不可滲透的聚合物，諸如乙酸伸乙基乙烯酯共聚物及Hytrel共聚物；可膨脹聚合物，諸如水凝膠；或可再吸收聚合物，諸如膠原蛋白及某些多元酸或聚酯，諸如用於製得可再吸收縫合線之彼等聚合物；使得醫藥組合物可持續釋放。

以下實例進一步說明本發明。此等實例僅意欲說明本發明且不應理解為對本發明之限制。

材料及方法

1.細胞培養物之製備

由ATCC(Rockville,MD,USA)獲得人類卵巢癌細胞株TOV112D、TOV21G、SKOV3、MDAH2774、ES2、MDAH2774,BG1；人類子宮內膜癌細胞株RL95-2、人類胰臟癌細胞株BxPC3、乳癌細胞株(MCF7)及結腸癌細胞株(HT29)。由CC Wu博士(Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science,Chang-Gung University,Taoyuan,Taiwan)，Wu等人Mol.Cell Proteomics 9(6)：11100(20101)獲得肺癌細胞株CL1-0及鼻咽癌細胞株NPC-BM1。由CL Chang博士(Department of Obstetrics and Gynecology,MackawMemorial Hospital,Taipei,Taiwan),Chang等人Cancer Research 67：10047(2007)獲得小鼠卵巢癌細胞株MOSEC。TOV112D、TOV21G、SKOV3、MDAH2774、ES2及RL95-2在補充以10%胎牛血清及抗生素之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)/F-12中，在37℃下5% CO2濕潤氛圍中培養。BxPC3、CL1-0、NPC-BM1及MOSEC細胞在補充以10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中培養。

2.來自癌細胞株之分泌蛋白的蛋白質組分析

先前記錄用於鑑定各種癌細胞株之分泌蛋白的程序(Wu等人2010)。簡言之，癌細胞在15-cm培養皿中生長匯合。洗滌癌細胞且用無血清培養基培育24小時。收集上清液且離心以移除細胞污染物。使用一維SDS-PAGE、凝膠內蛋白質消化、隨後逆相液相層析/串聯質譜分析(LC/MS-MS)進行蛋白質組分析。使用開放來源TPP軟體(版本3.3)、SEQUEST搜尋、PeptideProphet程式及ProteinProphet程式進行蛋白質鑑定。

3.抗體轉染

根據製造商方案，在PLUSin試劑(Polyplus-transfection Inc.,NY,USA)中用STIP1抗體轉染癌細胞。總而言之，將2×10³~6×10³個癌細胞接種於96孔板中隔夜，隨後PBS沖洗且添加180μl OPTI-MEM。將0.6μg小鼠STIP1抗體稀釋於20mM HEPES中，藉由旋渦與1.2μl PLUSin混合，隨後在室溫下培育15分鐘。藉由平緩旋動該板將抗體/PLUSin混合物添加至癌細胞。用於本文所述之實施例的STIP1抗體及對照IgG可購自Abnova Biotechnology Inc.(Taipei City,Taiwan)。本文所述之實施例中的STIP1抗體可用於偵測重組全長STIP1(SEQ ID NO：3)。

4.細胞遷移分析

用rhSTIP1(400nM)或無效STIP1處理之BG1及MDAH2774細胞(10⁶個/孔)在無血清培養基中培養24小時，隨後塗覆於8-μm孔隙(24孔)transwell插入物(Corning and Transwell,NY,USA)之上室中。下室用800μl DMEM/F12培養基及0.5μg/ml纖維蛋白連接素(Sigma,USA)填充。在26小時培育後，已遷移穿過孔隙且再附著於下室之細胞用螢光素鈣黃綠素-AM(4μg/ml)(BD,USA)染色。已橫越過濾器之活細胞的數目係藉由每一樣品在Tecan Infinite M200多孔讀取器(Tecan,Switzerland)中之螢光來測定。使用STIP1抗體(800nM)進行STIP1中和。在三個分離場合重複各細胞遷移分析。

6.細胞活力分析

在96孔板中每孔塗覆1~2×10⁴個癌細胞隔夜，接著用小鼠STIP1抗體(可購自Abnova Biotechnology Inc.)轉染48小時，隨後對其進行評估。藉由MTT[溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑]方法(Sigma St.Louis,MO)量測STIP1抗體對於癌細胞之抑制作用。使用自動化掃描多孔分光光度計(Wallac Victor2分光光度計；PerkinElmer,Boston,MA,USA)量測在570nm下的光密度。

7.西方墨點分析

使用含有新添加的蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Bionovas,Toronto)的RIPA緩衝劑(150mM NaCl、20mM Tris-Cl pH7.5、1% Triton X-100、1% NP40、0.1% SDS、0.5%去氧膽酸鹽)製備細胞溶解物。使用佈雷德福方法(Bradford method)量測蛋白質濃度。使50μg之各樣品在10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠中電泳，且轉移至硝化纖維素膜。STIP1抗體可購自Abnova Biotechnology及Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA，肌動蛋白可購自Sigma，相應辣根過氧化酶結合抗體可購自Santa Cruz Biotechnology，增強的化學發光劑可購自Millipore Inc.(Millipore,Billerica,MA)。使用UN-SCAN-IT軟體(Silk Scientific,Orem,UT)定量放射自顯影圖之信號強度，且藉由相應肌動蛋白強度校正各樣品之相對強度。對於抗體中和分析，癌細胞在無血清培養基中培養24小時，且在存在或不存在STIP1單株抗體的情況下用rhSTIP1再處理24小時，癌細胞在37℃下預先培育1小時。使用西方墨點分析偵測內源性磷酸-SMAD1/5。

8.免疫組織化學(IHC)

石蠟包埋之卵巢癌組織切片至4μm，接著用二甲苯去石蠟化且用乙醇溶液復水。卵巢癌組織切片在具有Ventana鹼性DAB(3,3’-二胺基聯苯胺)偵測套組(Tucson,AZ)之自動化IHC染色器中用對照小鼠IgG或STIP1抗體(Abnova,Taipei City,Taiwan)染色。蘇木精用於複染。為定量各IHC載玻片之免疫強度，藉由癌細胞之%(0~100%)乘以免疫強度(0~3)計算組織學計分，如先前所述(Chao等人2010，Chao等人2012)。市售組織陣列(FDA-805-1及2,Biomax Inc.,USA)用於偵測各種人類器官及相應癌症中STIP1之組織分佈。

9.免疫螢光顯微術

癌細胞以在6孔板中3×10⁵個細胞/孔之濃度培養於蓋玻片上隔夜，隨後再血清饑餓24小時。在用STIP1抗體轉染72小時後，癌細胞在4℃下用2%三聚甲醛固定30分鐘，且在室溫下於阻斷緩衝液(含5%正常山羊血清之PBS)中培育1小時以減少非特異性結合。癌細胞用抗小鼠Alexa Fluor-488(Invitrogen，1：100)培育以便偵測STIP1抗體及兔多株抗裂解卡斯蛋白酶3抗體(Cell Signaling Technology,Beverly,MA,USA，1：100)。在用抗兔Alexa Fluor-546(1：100，Invitrogen,Carlsbad,CA)培育後，載玻片用Vectashield封固劑(Vector Laboratories,Burlingame,CA)封固，且在Leica TCS SP2雷射掃描共焦系統(Leica Inc.,Germany)下分析。

10.BrdU增殖分析及Ki67免疫細胞化學

先前已記錄BrdU分析及Ki67染色程序(Tsai等人2012，Wang等人2010)。對於BrdU分析，癌細胞以10⁴個細胞/孔之密度接種於96孔板中隔夜，且在無血清培養基中培養24小時。癌細胞在BrdU存在下用0.4μM rhSTIP1處理24小時。使用BrdU ELISA套組(Roche Applied Science)量測DNA合成活性。對於Ki-67之免疫細胞化學研究，將MDAH2774細胞培養於Lab-Tek II腔室載玻片(Nalge Nunc International,Denmark)上隔夜。在血清饑餓或RNAi轉染72小時後，癌細胞用具有或不具有STIP1抗體之0.4μM STIP1再處理24小時。載玻片用99.9%乙醇固定，用PBS復水，用3%過氧化氫處理20分鐘，用0.1% Triton X-100(Sigma)滲透15分鐘且用抗Ki67抗體(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)染色。

11.細胞毒性分析

細胞以每孔1~2×10⁴個細胞接種於96孔板且在37℃下用STIP1抗體轉染48小時。為分析乳酸脫氫酶(LDH)之活性，將100μl反應混合物(Cytotoxicity Detection Kit PLUS®,Roche,Basel,Switzerland)及條件培養基添加至各孔且在黑暗中培育5-20分鐘。水溶性甲月朁染料在Victor2 ELISA讀取器中在約500nm下顯示寬吸收最大值。細胞死亡偵測ELISA光度酵素免疫分析法(Roche)用於活體外定量測定細胞質組蛋白相關DNA片段(單核小體及寡核小體)作為細胞凋亡之指標。在405nm下量測吸光度。

12.活體內動物模型

五週齡雌性C57BL/6小鼠自臺灣國家動物中心(National Animal Center,Taiwan)獲得，且在試驗期間自由獲取水及食物。在動物研究中進行的所有程序經臺灣長庚紀念醫院之實驗動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of the Chang Gung Memorial Hospital,Taiwan)批准。所有實驗遵照由美國國家衛生研究所出版之Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH出版號85-23，1996修訂)。

13.使用活體內成像系統監測腫瘤生長

將表現螢光素酶之小鼠卵巢表面上皮癌細胞(MOSEC/LUC)懸浮於漢克斯平衡鹽溶液(Hanks’balanced salt solution，HBSS)中。使用23規格針頭(Becton Dickson,Franklin Lakes,NJ,USA)給每一小鼠腹膜內注射10⁶個MOSEC細胞。第二天給每一小鼠腹膜內注射螢光素(100μl 0.4mg/mL螢光素，Promega)，且在注射後10分鐘用IVIS成像系統(Xenogen Corp.,Alameda,CA,USA)成像。所有小鼠用異氟烷鎮靜且在臺灣長庚紀念醫院之分子成像核心實驗室(Molecular Imaging Core Laboratory)成像。使用LivingImage軟體(Xenogen Corp.)定量光輸出。原始值以光子/秒/cm2/sr形式記錄。

結果

多種人類癌症中STIP1之偵測

如圖1中所說明，卵巢癌組織具有比正常卵巢組織(0)高得多的STIP1組織學計分(超過200)。數種其他癌症與其相應正常組織相比亦具有升高的STIP1組織學計分，包括腦癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、結腸癌及皮膚癌。

圖2展示各種STIP1多肽表現於鼻咽癌(NPC-TW04)、肺癌(CL1-5)及肝癌(Hep3B)細胞中。

STIP1抗體減小癌細胞活力且誘導癌細胞死亡

使用PLUSin試劑將以下癌細胞株轉染以STIP1抗體來阻斷內源性STIP1：MDAH2774(卵巢癌)、RL95-2(子宮內膜癌)、NPC-BM1(鼻咽癌)、BxPC3(胰臟癌)、CL1-0(肺癌)、HT29(結腸癌)及MCF7(乳癌)細胞。癌細胞活力使用MTT分析加以評估，而細胞死亡使用LDH分析加以評估。

圖3展示在所有測試癌細胞株中，STIP1抗體轉染引起較低MTT含量(較小細胞活力)及較高LDH含量(更多細胞死亡)。

卡斯蛋白酶3裂解亦用作細胞死亡之指標。在卵巢癌細胞(SKOV3)用STIP1抗體轉染後，使用免疫螢光顯微術評估裂解卡斯蛋白酶3含量。在圖4中，轉染有STIP1抗體之卵巢癌細胞相比轉染有對照IgG之癌細胞(圖4中之右上方畫面)具有較高含量的裂解卡斯蛋白酶-3(圖4中之右下方畫面)。

此等結果表明STIP1抗體有效抑制癌細胞生長。

圖5A展示八個卵巢癌細胞株及一個子宮內膜癌細胞株(RL95-2)中之內源性STIP1表現量。在此等細胞株中，最高內源性STIP1表現在ES2細胞株中且最低在TOV21G細胞株中。基於此等結果，ES2及TOV21G細胞株為用於測試STIP1抗體活體外效應及特異性之最適合的候選物之一。

在STIP1抗體轉染後，ES2細胞株(具有最高內源性STIP1表現)展示與TOV21G細胞(具有最低內源性STIP1表現)相比較低的MTT含量(較小細胞活力)及較高LDH 含量(更多細胞死亡)。參見圖5B。由於ES2細胞及TOV21G細胞皆為透明細胞卵巢癌細胞，故STIP1抗體之不同細胞毒性效應歸因於不同STIP1表現量而非不同癌症類型。

STIP1抗體中和分泌的STIP1對於癌細胞之信號誘導、細胞增殖及遷移的效應

在不受任何理論束縛的情況下，咸信STIP1觸發ALK2-SMAD1/5磷酸化路徑及ID3路徑以加速卵巢癌細胞增殖。圖6A展示在六個卵巢癌細胞株(ES2、SKOV3、TOV21G、TOV112D、BR及BG1)、一個子宮內膜癌細胞株(RL95-2)、一個肺癌細胞株(CL1-0)及一個鼻咽癌細胞株(NPC-BM1)中，rhSTIP1刺激SMAD1/5磷酸化。

投與STIP1抗體以驗證圖6A中之SMAD1/5磷酸化係由STIP1與STIP1細胞膜受體之間的相互作用所誘導。圖6B展示SMAD1/5磷酸化由在2：1莫耳濃度比率(STIP1抗體：rhSTIP1)下之STIP1抗體部分抑止，且SMAD1/5磷酸化由在4：1莫耳濃度比率(STIP1抗體：rhSTIP1)下之STIP1抗體完全抑止。此等結果表明STIP1抗體可中和由癌細胞分泌之STIP1。

圖6C展示STIP1抗體(Ab02及Ab04)抑止rhSTIP1刺激之細胞遷移。

BrdU為胸苷類似物，可在DNA複製期間置換胸苷，且Ki67為與細胞增殖相關的核蛋白。使用BrdU併入分析及內源性Ki67之免疫細胞化學作為細胞增殖之指標。用rhSTIP1處理增加卵巢癌細胞之BrdU併入率及Ki67染色(圖7A至圖7F)。此等活性藉由用ALK2/ALK3抑制劑 (LDN193189)及ERK抑制劑(PD98059)(圖7A及7B)、STIP1抗體(圖7C及7D)及ALK2 siRNA與STIP1 siRNA(圖7E及7F)處理來減小。值得注意的是，由PD98059抑制ERK活性強烈地抑制細胞增殖，但甚至在該抑制中，用rhSTIP1處理仍顯著刺激BrdU併入(圖7A)。此等結果指示ERK路徑對於細胞增殖極其重要，但ALK2-SMAD可對rhSTIP1刺激之細胞增殖更具特異性。此外，僅內源性STIP1減量並未抑制細胞增殖且亦未影響由外源rhSTIP1刺激細胞增殖(圖7E及7F)。

此等資料進一步支持STIP1抗體抑制癌細胞增殖及遷移之用途。

STIP1抗體在癌細胞抑制方面之活體內評估

小鼠卵巢表面上皮細胞(MOSEC)對STIP1抗體之細胞毒性效應敏感(參見圖8A)。將10⁶個MOSEC細胞接種於C57BL/6小鼠之腹腔中，隨後經由尾部靜脈每週靜脈內注射100μg STIP1抗體兩次。4週以後使用Xenogen IVIS 200活體內成像系統(Xenogen Corp.,Alameda,CA,USA)評估腫瘤生長。圖8B及8C展示用STIP1抗體處理之小鼠與用對照IgG處理之小鼠相比具有較小腫瘤體積。圖8D展示用STIP1抗體處理之小鼠與用對照IgG處理之小鼠(存活中時為53天)相比具有顯著較長的存活時間(存活中時為59天)。

此等結果表明STIP1抗體在癌細胞抑制及延長存活方面有效。

用於癌細胞抑制之STIP1抗原決定基

在圖9A中，將以下STIP1多肽點漬於耐綸膜上且與STIP1抗體一起培育：具有胺基酸(a.a.)序列號445-469、458-482、470-494、482-506(SEQ ID NO：2)、495-519、507-531及520-543(SEQ ID NO：1)之STIP1多肽。使用整個rhSTIP1(a.a.序列號1至543)作為陽性對照(左側泳道)。資料展示具有a.a.序列號520-543(SEQ ID NO：1)之STIP1多肽對此分析所用之STIP1抗體具有最高親和力，隨後為具有a.a.序列號482-506(SEQ ID NO：2)之STIP1多肽。

將在不同濃度下之整個rhSTIP1點漬於耐綸膜上且與STIP1抗體一起培育。STIP1抗體與STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)一起在各種抗體/多肽濃度比(1：1至1：8)下預培育。圖9B展示STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)以劑量依賴性方式中和STIP1抗體結合至rhSTIP1。此結果進一步表明用於癌細胞抑制之STIP1抗原決定基位於STIP1 a.a.序列號520至543(SEQ ID NO：1)。

STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)抑止癌細胞

考慮到STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)對於STIP1抗體之中和效應，在癌細胞中共轉染STIP1抗體及STIP1多肽520-543可減小STIP1抗體之抑止效應。圖10A及表1展示僅轉染有STIP1抗體(陽性對照)及轉染有STIP1抗體及各種濃度STIP1多肽520-543之卵巢癌細胞(MDAH2774)的細胞活力。使用MTT分析評估細胞活力。出乎意料的是，在癌細胞中共轉染STIP1抗體及STIP1肽520-543與僅轉染STIP1抗體相比展示細胞活力之協同抑止。舉例而言，STIP1抗體之細胞活力為78.81%(表1)，25μM STIP1多肽520-543之細胞活力為102%(表2)，且STIP1抗體及25μM STIP1多肽520-543之細胞活力為56.38%(表1)。類似地，200μM STIP1多肽520-543之細胞活力為28.64%(表2)，且STIP1抗體及25μM STIP1多肽520-543之細胞活力為27.67%(表1)。

圖10B及表2展示STIP1多肽520-543以劑量依賴型方式抑止癌細胞活力，而包含其他胺基酸序列445-469(肽445；SEQ ID NO：26)、458-482(肽458；SEQ ID NO：27)及495-519(肽495；SEQ ID NO：29)之STIP1多肽並未顯著抑止癌細胞活力。在不受任何理論束縛的情況下，咸信STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)競爭性抑制STIP1抗體。

結論：圖9A至圖10B中之結果表明抑止STIP1使細胞活力減小。可藉由使用結合至包含SEQ ID NO：1之抗原決定基的STIP1抗體或藉由投與具有SEQ ID NO：1之經分離之STIP1多肽來抑止STIP1。

STIP1多肽520-543(SEQ ID NO：1)之細胞滲透性

為驗證STIP1多肽520-543之癌細胞滲透性，卵巢癌細胞(MDAH2774)用10μM具有八個D-精胺酸殘基之STIP1多肽520-543處理24小時。在免疫螢光顯微術下使用抗myc抗體檢驗STIP1多肽520-543之胞內分佈。圖11B展示STIP1多肽520-543存在於卵巢癌細胞之細胞溶質中。

STIP1多肽520-543對於HSP90/STIP1相互作用之效應

藉由用各種濃度之STIP1多肽520-543處理癌細胞來評估STIP1多肽520-543對於HSP90與STIP1相互作用之效應。使用免疫沈澱方法評估HSP90-STIP1相互作用。

圖12展示STIP1與HSP90之結合能力隨著STIP1多肽520-543之濃度增加而減小。此資料展示STIP1多肽520-543可預防STIP1結合至HSP90及受質蛋白錯誤摺疊。

STIP1多肽520-543對於癌細胞之效應

進行STIP1多肽520-543對於癌細胞之效應的活體外評估。

將細胞可滲透的STIP1多肽520-543添加至以下癌細胞株：MDAH2774(卵巢癌)；ARK2(子宮內膜癌)；NPC-BM1(鼻咽癌)；SAS(口腔癌)；Colon 205(結腸癌)；CL 1-0(肺癌)；BxPC3(胰臟癌)；HepG2(肝癌)及MCF7(乳癌)細胞。癌細胞活力使用MTT分析加以評估且細胞死亡使用LDH分析加以評估。

圖13展示在所有測試癌細胞中細胞可滲透的STIP1多肽520-543(肽520)抑制細胞增殖(由減小的MTT活性來說明)且誘導細胞死亡(由增加的LDH活性來說明)。

進行STIP1多肽520-543對於裸小鼠之效應的活體內評估。

裸小鼠皮下接種以5×10⁵個人類卵巢癌細胞MDAH2774。100μg STIP1多肽520-543經由尾部靜脈投與一週三次。

圖14說明用STIP1多肽520-543處理之小鼠中腫瘤塊之尺寸小於對照組。此等結果表明STIP1多肽520-543在減少癌細胞方面的活體內功效。

STIP1多肽520-543誘發JAK2蛋白質之降解

一種HSP90受質蛋白為JAK2(Frid等人JAKSTAT 1(2)：77(2012)；Marubayashi等人J.Clin.Invest.120(10)：3578(2010)。JAK2-STAT3路徑在腫瘤轉化及進展中起重要作用(Miklossy等人，Nat Rev.Drug Discovery：12(8)：611(2013))。

使用卵巢癌細胞株(MDAH2774)及子宮內膜癌細胞株(ARK2)評估STIP1多肽520-543對於HSP90功能之效應。用各種濃度之STIP1多肽520-543處理癌細胞株。

四十八小時後，JAK2及磷光體-STAT3之胞內含量以劑量依賴性方式減小，如圖15A中所說明。此外，JAK2及Bcl-XL蛋白質在STIP1多肽520-543存在下調降，如由圖15B中之西方墨點法所說明。此等結果證明STIP1多肽520-543藉由阻斷JAK2-STAT3-Bcl XL路徑誘導細胞死亡。

對SEQ ID NO：1多肽具有反應性之單株抗體的產生

在每週2-4次的間隔下用SEQ ID NO：1多肽使BALB/c小鼠腹膜內免疫3-4次且在脾臟細胞移除之前3天用SEQ ID NO：1多肽攻擊。製備脾臟細胞懸浮液，與骨髓瘤NS1/1 AG4.1融合且使融合瘤生長並加以選殖。最初，藉由免疫螢光流動式細胞測量術(FACS)測試融合瘤培養物上清液與SEQ ID NO：1多肽之反應性。簡言之，SEQ ID NO：1多肽與未稀釋的融合瘤上清液一起培育(30分鐘，4℃)，洗滌且與異硫氰酸螢光素(FITC)-綿羊F(ab')2抗小鼠Ig(100μg/ml)一起培育。在最終洗滌後，藉由FACS分析檢驗結合至SEQ ID NO：1多肽之單株抗體。對於人類黑色素瘤細胞株MM-170篩查陽性融合瘤上清液以消除非內皮特異性mAb。對SEQ ID NO：1多肽之結合特異性由對於一組人類腫瘤細胞株以及人類淋巴細胞、單核細胞、嗜中性白血球、紅細胞及血小板篩查單株抗體而進一步加以確認。

本說明書中所引用及論述的所有參考文獻以其全部引用的方式併入本文中。本文所述之內容之變化形式、修改及其他實施例將在不悖離本發明之精神及範疇的情況下由一般熟習此項技術者想起。雖然已展示及描述本發明之某些實施例，但可在不悖離本發明之精神及範疇的情況下進行變化及修飾對熟習此項技術者顯而易見。先前描述及附圖中陳述之內容僅經由說明提供而非作為限制。

<110> 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院

<120> 新穎STIP1多肽及其用途

<130> 5076-0012

<150> 61/760,597

<151> 2013-02-04

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<220>

<223> 壓力誘導之磷蛋白1肽520(全長STIP1之胺基酸位置520-543)

<400> 1

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 壓力誘導之磷蛋白1肽482(全長STIP1之胺基酸位置482-506)

<400> 2

<210> 3

<211> 543

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 壓力誘導之磷蛋白1(GenBank寄存編號NP_006810)

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 6

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 8

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 9

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 13

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 14

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 17

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 18

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 19

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 20

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 21

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 22

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 23

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 24

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 來自癌細胞株之STIP1肽

<400> 25

<210> 26

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> STIP1肽445(全長STIP1之胺基酸位置445-469)

<400> 26

<210> 27

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> STIP1肽458(全長STIP1之胺基酸位置458-482)

<400> 27

<210> 28

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> STIP1肽470(全長STIP1之胺基酸位置470-494)

<400> 28

<210> 29

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> STIP1肽495(全長STIP1之胺基酸位置495-519)

<400> 29

<210> 30

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> STIP1肽507(全長STIP1之胺基酸位置507-531)

<400> 30

Claims

一種醫藥組合物，其包含與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的分離之多肽、醫藥學上可接受之載劑、以及針對STIP1之抗體。
一種抗體或其抗原結合部分，其結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列。
一種醫藥組合物，其包含：一抗體或其抗原結合部分結合至與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列；及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項3之醫藥組合物，其另外包含與SEQ ID NO：1至少90%同源之胺基酸序列的分離之多肽。
一種用於製造用以抑制癌細胞生長之藥劑的用途，其包含將有效量之含有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的分離之多肽投與有需要之個體，其中癌細胞表現STIP1。
如請求項5之用途，其中該癌症係選自由胰臟癌、子宮內膜癌、肺癌、鼻咽癌、乳癌及結腸癌組成之群。
如請求項5之用途，其另外包含投與針對STIP1之抗體的步驟。
一種用於製造用於抑制個體中的癌細胞生長之藥劑的用途，其包含投與有效量之結合至具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的胜肽之抗體或其抗原結合部分，其中癌細胞表現STIP1。
如請求項8之用途，其中該癌症係選自由胰臟癌、子宮內膜癌、肺癌、鼻咽癌、乳癌及結腸癌組成之群。
如請求項8之用途，其另外包含投與包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的分離之多肽。