CN103638521A - 神经延长促进剂及延长抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供有助于带状疱疹后神经痛的机理的阐明，促进损伤的神经再生的技术方案，还提供对由于带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、疱疹后神经痛、脑卒中、退行性疾病等伴随的神经细胞死亡所导致的障碍，或上述疾病的预防或治疗有效且副作用少的技术方案。神经突的延长促进剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分，神经性疾病的预防或治疗剂，含有上述抗体作为有效成分，神经突的延长抑制剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且抑制脑源性神经营养因子的抗体作为有效成分，伴随有由于选自带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶和压力中的状态引起的神经过敏的疾病的预防或治疗剂，含有上述抑制抗体作为有效成分。
Description
本申请是国际申请日为2007年11月16日、国际申请号为PCT／JP2007／072284、进入国家阶段的申请号为200780050105.6、发明名称为“神经延长促进剂及延长抑制剂”的PCT申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及神经延长促进剂以及延长抑制剂。具体地说，涉及识别水痘-带状疱疹病毒立即早期抗原的抗体用于神经突的延长促进、神经再生或神经突的延长抑制的用途。
背景技术
脑源性神经营养因子(BDNF)是被认识到在发育中和成人中，对存活、分化、突触可塑性以及末梢和中枢神经元的选择延长发挥重要作用的神经营养因子家族的成员(专利文献1，非专利文献1、2)。BDNF的cDNA编码由247个氨基酸残基构成的前体蛋白质。前体蛋白质具有信号肽和前蛋白，切断它们生成119个氨基酸残基的成熟BDNF。生物活性的BDNF(27kDa)为通过强的疏水性相互作用由两个相同亚单位形成的二聚物。熟知BDNF与突触的长期增强、学习以及记忆等频率依赖性可塑性机理相关。BDNF与形成临床上的痛觉过敏症的原因的可塑性相关(非专利文献3)。
水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染导致急性小脑共济失调症(ACA)、带状疱疹后神经痛(PHN)等神经学上的并发症。ACA为伴随水痘感染的最经常产生的神经学上的并发症。估计小于15岁的幼儿的每4000病例中产生1例。ACA在发疹开始数日前到3周后出现，直至完全恢复持续2～4周。带状疱疹在沿着伴随有感觉异常的生皮节的区域分布中出现水疱疹，一般群体的年发病率在英国每1000人为3.4(非专利文献4)。PHN为带状疱疹的频率最高的并发症，7～35％的患者(60岁以上的患者中超过50％)发病。PHN与急性神经炎伴随的疼痛不同，并发无间断的持续疼痛、电击痛和异常性疼痛(非专利文献5)。虽然PHN的病理生理学还不明确，但是两神经学上的并发症在病毒感染的恢复期或之后出现暗示对于VZV的免疫应答与它们的致病性过程相关。
专利文献1：日本特开平5-328974号公报
非专利文献1：Nagappan G.Lu B.，Trends in Neurosciences，28：464-471,2005
非专利文献2：Bramham CR et a1.，Progress in Neurology，76：99-125,2005
非专利文献3：Coull，J.A.M.et al.，Nature438：1017-1021,2005
非专利文献4：Johnson，R.W.et al.，BMJ326：748-750,2003
非专利文献5：Donald H.Gilden et al.，Neurology64：21-25,2005
发明内容
本发明的目的在于，提供有助于带状疱疹后神经痛的机理的阐明，促进损伤的神经再生的技术方案。此外，本发明的目的在于，提供对由于带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、疱疹后神经痛、脑卒中、退行性疾病等伴随的神经细胞死亡所导致的障碍，或上述疾病的预防或治疗有效且副作用少的技术方案。
本发明人由BDNF与导致临床上痛觉过敏症的可塑性相关，建立了可以分析PHN的病理机理的假说，对水痘-带状疱疹病毒(VZV)与BDNF的免疫学上的相关性进行了调查。VZV在潜伏感染的神经节中表达基因4、21、29、62、63，立即早期蛋白质(immediate-early protein)IE62在感染中对病毒基因的转录激活发挥主要作用。包含PHN患者的水痘恢复期血清在Western印迹分析中识别IE62和BDNF。本发明人对IE62与BDNF的免疫学上的关系进行了进一步调查，在它们之间发现了免疫交叉反应性。交叉反应的显著性差异使用它们各自的单克隆抗体进行检测。在与BDNF交叉反应的IE62抗体中，本发明人发现存在抑制BDNF的生物活性的抗体，和显著增加通过BDNF介导的trkB介导的信号转导和神经突的延长的其它抗体，从而完成了本发明。即，本申请发明如下所述。
[1]神经突的延长促进剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分。
[2]上述[1]记载的促进剂，其中，上述蛋白质为IE62，上述抗体识别具有序列号2的414-429位的氨基酸序列的肽。
[3]上述[1]或[2]记载的促进剂，其中，上述脑源性神经营养因子为二聚物。
[4]神经性疾病的预防或治疗剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分。
[5]上述[4]记载的预防或治疗剂，其中，上述蛋白质为IE62，上述抗体识别具有序列号2的414-429位的氨基酸序列的肽。
[6]上述[4]或[5]记载的预防或治疗剂，其中，上述脑源性神经营养因子为二聚物。
[7]上述[4]～[6]中任意一项记载的预防或治疗剂，其中，上述神经性疾病为伴随有由于选自脑卒中、缺氧症、窒息、身体损伤、暴露于毒素、恶性新生物、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症中的状态引起的损伤的神经细胞的疾病。
[8]商业包装，包括上述[1]～[3]中任意一项记载的神经突的延长促进剂、以及记载该促进剂可以或应该用于神经突的延长的关于该促进剂的记载物。
[9]商业包装，包括上述[4]～[7]中任意一项记载的神经性疾病的预防或治疗剂、以及记载该预防或治疗剂可以或应该用于神经性疾病的关于该预防或治疗剂的记载物。
[10]神经突的延长抑制剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分。
[11]上述[10]记载的抑制剂，其中，上述蛋白质为IE62，上述抗体为抑制脑源性神经营养因子的抗体。
[12]上述[11]记载的抑制剂，其中，上述抗体识别具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽。
[13]伴随有由于选自带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶和压力中的状态引起的神经过敏的疾病的预防或治疗剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分。
[14]上述[13]记载的预防或治疗剂，其中，上述蛋白质为IE62，上述抗体为抑制脑源性神经营养因子的抗体。
[15]上述[14]记载的预防或治疗剂，其中，上述抗体识别具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽。
[16]商业包装，包括上述[10]～[12]中任意一项记载的神经突的延长抑制剂、以及记载该抑制剂可以或应该用于神经突的延长抑制的关于该抑制剂的记载物。
[17]商业包装，包括上述[13]～[15]中任意一项记载的预防或治疗剂、以及记载该预防或治疗剂可以或应该用于伴随有由于选自带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶和压力中的状态引起的神经过敏的疾病的关于该预防或治疗剂的记载物。
[18]制备上述[1]～[7]中任意一项记载的抗体的方法，包括使用具有选自序列号2的414-429位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽作为抗原、筛选抗体文库的步骤。
[19]上述[18]记载的方法，其中，上述抗体文库为人抗体文库。
[20]制备上述[10]～[15]中任意一项记载的抗体的方法，包括使用具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽作为抗原、筛选抗体文库的步骤。
[21]上述[20]记载的方法，其中，上述抗体文库为人抗体文库。
[22]神经性疾病的预防或治疗方法，包括向对象给予有效量的识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体。
[23]上述[22]记载的预防或治疗方法，其中，上述蛋白质为IE62，上述抗体识别具有序列号2的414-429位的氨基酸序列的肽。
[24]上述[22]记载的预防或治疗方法，其中，上述脑源性神经营养因子为二聚物。
[25]上述[22]记载的预防或治疗方法，其中，上述神经性疾病为伴随有由于选自脑卒中、缺氧症、窒息、身体损伤、暴露于毒素、恶性新生物、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症中的状态引起的损伤的神经细胞的疾病。
[26]伴随有由于选自带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶和压力中的状态引起的神经过敏的疾病的预防或治疗方法，包括向对象给予有效量的识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体。
[27]上述[26]记载的预防或治疗方法，其中，上述蛋白质为IE62，上述抗体为抑制脑源性神经营养因子的抗体。
[28]上述[27]记载的预防或治疗方法，其中，上述抗体识别具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽。
根据本发明的神经突的延长促进剂，由于通过增强BDNF的作用可以促进神经突的延长，即使在少量BDNF存在下也可以期待有效地发挥效果。上述延长促进剂中含有的抗体由于与BDNF本身相比在生物体内的半衰期长，持续BDNF的增强作用的同时，活化BDNF的自分泌系统，促进BDNF自身的产生和分泌，持续地对神经细胞发生作用的BDNF活性升高。随着时间的进一步推移，BDNF本身的活性降低，但是通过半衰期长的抗体带来的持续性效果，可以持续提高BDNF的作用。根据本发明的神经性疾病的预防或治疗剂，可以使迄今为止没有有效技术方案的神经损伤后的神经再生。此外，本发明的神经突的延长抑制剂，由于通过抑制BDNF的作用可以抑制神经突的延长，期待对迄今为止没有有效技术方案的带状疱疹后神经痛、慢性疼痛等发挥效果。上述延长抑制剂中含有的抗体通过中和BDNF的作用，可以抑制BDNF的自分泌系统的活化，进一步地，通过这种协同或相加的抑制效果，还可以抑制由于分泌的BDNF而导致的神经细胞进一步诱导产生BDNF的二次反应。进一步地，本发明的预防或治疗剂也期待通过BDNF作用的抑制来改善经验依赖性社会厌恶(experience-dependent social aversion)、压力等伴随有神经过敏的疾病。
附图说明
图1A为表示水痘-带状疱疹病毒(VZV)的立即早期(IE)62蛋白质的片段的位置关系的简图。
图1B为IE62片段-GST融合蛋白质的电泳照片。
图1C为表示调查带状疱疹和PHN患者的血清对IE62和BDNF的反应性的Western印迹的总结。
图1D表示调查带状疱疹和PHN患者的血清对IE62和BDNF的反应性的Western印迹的一例。
图2A为表示抗IE62单克隆抗体和抗BDNF单克隆抗体对IE62片段的反应性的电泳照片。
图2B表示使用抗IE62单克隆抗体和抗BDNF单克隆抗体的VZV感染细胞的免疫组织染色。
图2C为BDNF蛋白质的SDS-PAGE照片以及使用抗IE62单克隆抗体和抗BDNF单克隆抗体的Western印迹的照片。
图3为确定抗IE62单克隆抗体和抗BDNF单克隆抗体的表位的电泳照片。
图4A表示抗IE62单克隆抗体提高BDNF外显子3～5的转录以及Arc的转录。
图4B表示通过(a)不添加和(b)添加IE62和BDNF培养的皮质(GABA性)神经元的神经突的形态。比例尺表示40μm。
图4C表示抗IE62单克隆抗体增加神经细胞体的面积。
图4D表示抗IE62单克隆抗体增加神经分枝点的数目。
图4E表示抗IE62单克隆抗体增加树突的总长度。
图5A表示抗IE62单克隆抗体增加脊髓神经细胞体的面积。
图5B表示抗IE62单克隆抗体增加脊髓神经元的分枝点的数目。
图5C表示抗IE62单克隆抗体增加脊髓神经元的神经突的总长度。
图5D表示通过(a)不添加(对照)以及(b)添加IE62和BDNF培养的脊髓后角神经元的神经突的形态。比例尺(scal bar)表示40μm。
图6A为使用单克隆抗体KSG1的大脑皮质细胞的免疫染色的照片。倍率为1000倍。
图6B为使用单克隆抗体KSG1的中脑细胞的免疫染色的照片。倍率为1000倍。
图6C为使用单克隆抗体KSG4的大脑皮质细胞的免疫染色的照片。倍率为400倍。
图6D为使用单克隆抗体KSG4的中脑细胞的免疫染色的照片。倍率为1000倍。
图7为表示往大鼠胎儿原代培养大脑皮质中添加用PHN患者血清处理过的BDNF时的BDNF mRNA表达量的变动结果的图。
具体实施方式
本发明的神经突的延长促进剂含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分。该抗体与后述的本发明的神经突的延长抑制剂中含有的抑制抗体区别时称为促进抗体。
上述抗体为识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质的抗体。其中，水痘-带状疱疹病毒(VZV)为α疱疹病毒属的成员，是水痘(varicella)和带状疱疹(zoster)的病原介质。VZV基因组为直链状双链DNA分子，例如J.Gen Virol.(1986)，67，1759-1816中公开了其全部核苷酸序列以及编码的蛋白质的氨基酸序列。此外，作为VZV(人疱疹病毒3)，在GenbankAccesion No：Nc_001348中，公开了全部基因组的核苷酸序列和由该基因组编码的蛋白质的氨基酸序列。VZV基因组编码约70种蛋白质。认为VZV的全部基因在立即早期(immediate-early)(IE)、早期(E)和后期(L)的三个宽动态类别(dynamic class)中，在受感染细胞中表达。VZV IE62蛋白质参与VZV蛋白质的三个动态类别的所有表达的活化。
上述抗体是在VZV编码的蛋白质中，将立即早期蛋白质、更优选IE62作为抗原制备的。作为抗原的IE62蛋白质在上述文献和Genbank等中也公开了其氨基酸序列。例如，人疱疹病毒3VZV-Oka株的情况下，在Genbank Accession No：AY016449中公开了IE62的核苷酸序列(序列号1)和氨基酸序列(序列号2)。此外，人疱疹病毒3VZV-野生株(Kawaguchi株)参照Journal of Virology2002p11447-144459。
上述促进抗体优选识别具有序列号2的IE62的氨基酸序列中414-429位氨基酸序列(PGYRSISGPDPRIRKT：序列号3)的肽。上述识别所述肽的促进抗体由于更显著地具有与后述BDNF的交叉反应性，所以优选。上述肽发挥作为本发明中的促进抗体的表位的功能，只要不丧失作为抗原决定簇的功能，则可以从序列号3的氨基酸序列的N末端和／或C末端缺失1～3个左右的氨基酸。此外，上述肽只要不丧失作为抗原决定簇的功能，则可以在其N末端或C末端具有1个～数个(通常1～5个、优选为1～3个)追加的氨基酸序列。作为追加的氨基酸残基，可以举出为了与后述高分子化合物(蛋白质)结合而导入的半胱氨酸残基等。
上述抗体的特征在于，可以高灵敏度且高特异性地识别立即早期蛋白质、优选为IE62，并且与脑源性神经营养因子(BDNF)交叉反应。
脑源性神经营养因子(BDNF)，在GenBank AccessionNo.NM_170731-170735、NM_001709中公开的是人BDNF的核苷酸序列和氨基酸序列。与上述促进抗体交叉反应的BDNF为成熟体，优选为成熟体的二聚物。
本说明书所称的“抗体”中，包括多克隆抗体、单克隆抗体等天然型抗体，使用基因重组技术制备的嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体，可以使用产生人抗体的转基因动物等制备的人抗体，通过噬菌体展示制备的抗体及它们的结合性片段。
结合性片段指的是上述抗体的一部分的区域，具体地说，可以举出例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(抗体的可变区)、sFv、dsFv(二硫键稳定性FV)、dAb(单域抗体)等(Exp.Opin.Ther.Patents，Vol.6，No.5，p.441-456，1996)。
对抗体类别不特别限定，还包括具有IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等任意同种型的抗体。优选为IgG或IgM，若考虑到纯化的容易性等，则更优选为IgG。
多克隆抗体或单克隆抗体可以通过已知的常规制备方法来制备。具体地，例如将免疫原、根据需要与弗氏佐剂一起免疫接种到哺乳动物中，例如多克隆抗体的情况下，免疫接种到小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猪、山羊、马或牛等，优选小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、山羊、马或兔，单克隆抗体的情况下，免疫接种到小鼠、大鼠、仓鼠。
在一个实施方式中，作为免疫原的IE62肽可以通过公知的方法制备。例如，可以根据常规方法合成含有序列号3的氨基酸序列的肽，与牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、卵白蛋白(OVA)、匙孔
血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白(TG)或免疫球蛋白等高分子化合物(蛋白质)形成复合体后，用作免疫原。
为了形成上述IE62肽与高分子化合物的复合体和其它目的，可以附加1个或数个氨基酸。对附加的氨基酸的数目不特别限定，但是若考虑到所制备的抗体的特异性，优选为1～10个、更优选为1～5个、进一步优选为1～2个、最优选为1个。附加的氨基酸的位置可以为多肽的N末端或C末端中的任意一端，但是优选为C末端。
复合体可以通过公知的方法形成，不特别限定。例如，可以通过混合酸酐法或活性酯法等使上述IE62肽的羧基与上述高分子化合物的官能团反应，形成复合体。此外，也可以向上述IE62肽的C末端导入半胱氨酸残基，通过该半胱氨酸的侧链SH基使上述肽与上述高分子化合物结合。
在另一实施方式中，例如，可以使用将编码含有序列号3的氨基酸序列的肽的核苷酸与编码其它的蛋白质(例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST))的核苷酸连结而成的表达载体，通过常规方法作为与其它蛋白质的融合蛋白质在宿主中表达，进行纯化，将纯化物用作免疫原。
多克隆抗体具体地说可以如下制备。即，对小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、山羊、马或兔，优选山羊、马或兔，更优选兔，皮下、肌内、静脉内、足垫内或腹腔内注射1次～数次免疫原，实施免疫致敏。通常，从初次免疫起约每1天～14天进行1次～5次免疫，从最终免疫起约1天～5天后，从免疫致敏的该哺乳动物取得血清。
虽然血清可以用作多克隆抗体，但是优选通过超滤、硫酸铵分级分离、优球蛋白沉淀法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱(DEAE或DE52等)，使用抗免疫球蛋白色谱柱、蛋白A/G色谱柱、或免疫原交联而成的色谱柱等的亲和柱色谱进行分离和／或纯化。
单克隆抗体如下制备：通过由上述免疫致敏动物得到的产生该抗体的细胞和无自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞制备杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择产生对于哺乳动物的免疫中使用的免疫原表现出特异性的亲和性、且表现出与BDNF的交叉反应性的单克隆抗体的克隆。
单克隆抗体具体地说可以如下制备。即，对小鼠、大鼠或仓鼠(包括产生人抗体的转基因小鼠等制成产生来自其它动物的抗体的转基因动物)的皮下、肌内、静脉内、足垫内或腹腔内注射1次～数次免疫原或移植免疫原，实施免疫致敏。通常，从初次免疫起约每1天～14天进行1次～4次免疫，从最终免疫起约1天～5天后，从免疫致敏的该哺乳动物取得产生抗体的细胞。
分泌单克隆抗体的杂交瘤(融合细胞)的制备可以通过Kohler和Milstein等的方法(Nature，Vol.256，p.495-497，1975)以及基于此的修饰方法来进行。即，通过使如上所述从免疫致敏的哺乳动物取得的脾脏、淋巴结、骨髓或扁桃体等，优选脾脏中含有的产生抗体的细胞与优选来自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物，更优选来自小鼠、大鼠或人的无自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞的细胞融合来制备。
细胞融合中使用的骨髓瘤细胞的例子包括来自小鼠的骨髓瘤P3／X63-AG8.653(653；ATCC No.CRL1580)、P3／NSI／1-Ag4-1(NS-1)、P3／X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2／0-Ag14(Sp2／0、Sp2)、PAI、F0或BW5147，来自大鼠的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.，来自人的骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15。
产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可以如下进行：将杂交瘤例如在微量滴定板中培养，对于已经见到增殖的孔的培养上清对在上述免疫致敏中使用的免疫原的反应性、以及上述上清对BDNF的反应性，例如通过ELISA等的酶免疫测定法进行测定。
上述杂交瘤可以使用培养基(例如，含有10％胎牛血清的DMEM)进行培养，将该培养液的离心上清作为单克隆抗体溶液。此外，可以通过将该杂交瘤注入到其来源的动物的腹腔中，生成腹水，将得到的腹水作为单克隆抗体溶液。单克隆抗体与上述多克隆抗体同样地优选进行分离和／或纯化。
此外，嵌合抗体例如可以参考《实验医学(临时增刊号)，Vol.6，No.10，1988》、日本特公平3-73280号公报等来制备，人源化抗体例如可以参考日本特表平4-506458号公报、日本特开昭62-296890号公报等来制备。人抗体可以参考例如《Nature Genetics，Vol.15，p.146-156，1997》、《Nature Genetics，Vol.7，p.13-21，1994》、日本特表平4-504365号公报、国际申请公开WO94／25585号公报、《Nikken Science、6月号、第40页～第50页、1995年》、《Nature，Vol.368，p.856-859，1994》、日本特表平6-500233号公报等来制备。
通过噬菌体展示进行的抗体制备中，由为了筛选抗体而制备的噬菌体文库，例如通过生物淘筛(biopanning)回收、浓缩对抗原具有亲和性的噬菌体，可以容易地得到Fab等抗体。此时，优选使用具有选自序列号2的414-429位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽作为抗原，对抗体文库进行筛选。对于优选的抗体文库和抗体的筛选方法，参照国际公开第01／062907号小册子、日本特开2005-185281号。
在噬菌体文库中，存在可以与所有抗原反应的克隆。因此，若抗原为IE62，则得到对于IE62中存在的所有表位的抗IE62抗体的克隆。对于该克隆组，若使用BDNF作为第二抗原进行筛选，则得到交叉的抗体。基于对BDNF活性的作用，可以选择具有抑制或促进人型BDNF活性的机能的抗体。所得到的人型抗体对人的应用是有利的。
F(ab’)2和Fab’可以通过分别用作为蛋白分解酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶对免疫球蛋白进行处理来制备。Fab可以通过对Fab表达噬菌体文库与通过上述噬菌体展示进行的抗体制备法同样地进行筛选来制备。
如此得到的识别IE62蛋白质的抗体可以通过利用通常的抗原-抗体反应的方法对IE62蛋白质进行检测或定量。上述方法不特别限定，可以举出放射性同位素免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(例如ELISA)、荧光或发光测定法、凝聚法、Western印迹法、免疫色谱法等(Meth.Enzymo1.，92，p.147-523(1983)，Antibodies Vol.II IRL Press Oxford(1989))。
作为本发明神经突的延长促进剂的有效成分上述促进抗体与迄今为止已知的VZV的抗体不同，具有促进通过BDNF的神经突的延长的作用。其中，神经突包括形成在神经细胞外侧的轴突、树状突和轴突侧枝。神经突的延长促进指的是，在显微镜下观察神经细胞测定神经突的总长度时，其总长度与对照相比增加。此时的对照指的是，除了未添加本发明的促进剂之外，置于相同条件下的神经细胞。
本发明的促进剂中含有的抗体的量只要发挥上述作用和效果则不特别限定，但是通常为0.001～90重量％、优选为0.005～50重量％、更优选为0.01～10重量％。
本发明的促进剂除了上述抗体以外还可以含有载体。作为上述载体，可以使用在制剂领域中通常使用的载体，可以举出例如，蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂，苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯等保存剂，柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等悬浮剂，表面活性剂等分散剂，水、生理盐水等稀释剂，甘油、聚乙二醇等底蜡等，但是不限于此。
作为本发明的促进剂作用的细胞，可以举出神经细胞，特别是损伤的神经细胞等。
本发明的促进剂可以用作研究用试剂。此外，可以在体内促进神经细胞的突起的延长。为了体内应用，可以举出例如，通过将本发明的促进剂添加到培养基中使其与培养中的神经细胞进行接触，并继续适当培养的方法。
本发明的促进剂可以向生物体给药，以促进神经细胞的突起的延长。作为向生物体给药的方法不进行限定，可以举出例如，皮下注射、肌肉注射、腹腔内注射、点滴注射等。除了口服给药、静脉内给药、肌内给药等全身给药之外，还可以举出向脑内或髓腔内(脊髓液中)、一侧背侧海马的局部给药。向脑内局部给药时，本发明的促进剂可以包含在含胶原的载体中。
具有促进神经突延长的作用的上述促进抗体期待使神经细胞、特别是损伤的神经细胞再生。本发明提供含有上述抗体作为有效成分的神经性疾病的预防或治疗剂。
本发明的预防或治疗剂中含有的促进抗体的量只要发挥上述作用效果则不特别限定，但是通常为0.001～90重量％、优选为0.005～50重量％、更优选为0.01～10重量％。
本发明的预防或治疗剂除了上述促进抗体之外，还可以含有载体。作为上述载体，可以举出上述促进剂中举出的载体。
适用本发明的预防或治疗剂的神经性疾病，是通过促进神经突的延长，可以期待病理的改善的疾病。可以举出例如，伴随有由于脑卒中、缺氧症、窒息、身体损伤、暴露于毒素、恶性新生物、痴呆、糖尿病相关的末梢神经障碍、神经退行性疾病(帕金森病、阿尔茨海默病、亨延顿舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓小脑变性症等)、免疫性神经疾病(多发性硬化症、格-巴综合征、重症肌无力、肌炎等)、感染性疾病(脑炎、脑膜炎等)、血管障碍(脑梗塞、脑出血等)、其它的神经性疾病(肌营养不良、癫痫、线粒体性脑肌病等)等状态引起的损伤的神经细胞的疾病。优选为缺氧症、窒息、身体损伤、暴露于毒素、恶性新生物、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症。
作为本发明的促进剂、预防或治疗剂的给药对象，可以举出小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、马、绵羊、猴、人等哺乳动物。
由于脑卒中发病时血脑屏障局部被破坏，可以期待本发明的促进剂容易地运送到脑中。作为血脑屏障开放剂，可以同时给予甘露糖醇、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗果低聚糖(fructoligosaccharide)、葡糖醛酸、甘油、蔗糖、亚戊基四唑(metrazol)、依托泊苷(etopside)、合成胆汁盐、胆酸类、二甲基亚砜、腺苷酸类、无机盐类或有机酸类。
促进剂、预防或治疗剂可以以口服、直肠内、胃肠外、脑池内(intracistemally)、阴道内、腹腔内、局部(以粉末、软膏、凝胶、点滴注射剂或透皮贴剂等形式)、口内、经口或鼻腔喷雾的形式给药。本说明书中使用的用语“胃肠外”指的是包括静脉内、肌内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射以及注入的给药方式。
促进剂、预防或治疗剂还可以通过缓释性系统适当地给药。缓释性试剂的适当的例子，包含适当的聚合物物质(例如，成型品(例如，膜或微囊)形态的半透性聚合物基质)、适当的疏水性物质(例如，可以接受的质量的油中的乳液的形式)或离子交换树脂、以及难溶性衍生物(例如，难溶性盐)。
使用本发明的促进剂、预防或治疗剂，考虑到各患者的临床状态、给药部位、给药方法、给药方案以及本领域技术人员公知的其它因素，以遵守医疗实施基准(Good Medical Practice)的方式制定处方以及给药。因此，本说明书中，所需的“有效量”进行这种考虑来决定。作为通常的提案，胃肠外给药的单位剂量的治疗剂中总的药学有效量为患者体重的约1μg／kg／天～10mg／kg／天，但是如上所述其依赖于治疗上的考虑。进一步优选该用量至少为0.01mg/kg／天，最优选对于人为约0.01mg/kg／天与约1mg／kg／天之间。连续给药时，代表性地以约1μg／kg／小时～约50μg／kg／小时的给药速度通过每天1次～4次的注射或连续皮下注入(例如使用微型泵)中的任意一种给予治疗剂。此外还可以使用静脉给药用的袋溶液。为了观察变化，根据所需的效果改变必要的处置时间和产生应答的处置后的间隔。
本发明的神经突的延长抑制剂含有识别水痘-带状疱疹病毒立即早期蛋白质、且与脑源性神经营养因子(BDNF)交叉反应的抗体作为有效成分。上述抑制剂中作为有效成分含有的抗体，与迄今为止已知的VZV的抗体不同，是通过与BDNF交叉反应抑制BDNF的作用，具有抑制神经突的延长的作用的抗体。上述抗体也简称为抑制抗体。
上述抑制抗体，优选识别具有选自序列号2的IE62的氨基酸序列中，268-341位的氨基酸序列(GPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPRKHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP：序列号18)中的至少7个连续氨基酸的肽。识别上述肽的抗体由于与BDNF交叉反应且抑制BDNF的作用，所以优选。上述肽发挥作为本发明中的抗体的表位的功能。
上述抑制抗体，除了使用由序列号18的氨基酸序列构成的肽或具有选自序列号18的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽来替代由序列号3的氨基酸序列构成的肽之外，可以与上述促进抗体的制备方法同样地制备。
本发明的抑制剂中含有的抑制抗体的量只要发挥上述作用效果则不特别限定，通常为0.001～90重量％、优选为0.005～50重量％、更优选为0.01～10重量％。
本发明的抑制剂除了上述抑制抗体以外还可以含有载体。作为上述载体，可以使用在制剂领域中通常使用的载体，可以举出例如，蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂，苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯等保存剂，柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸等稳定剂，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等悬浮剂，表面活性剂等分散剂，水、生理盐水等稀释剂，甘油、聚乙二醇等底蜡等，但是不限于此。
作为本发明的抑制剂作用的细胞，可以举出神经细胞，特别是损伤的神经细胞等。
本发明的抑制剂可以用作研究用试剂。此外可以在体内抑制神经细胞的突起的延长。为了适用于体内，可以举出例如，通过将本发明的抑制剂添加到培养基中使其与培养中的神经细胞接触，并继续适当培养的方法。
本发明的抑制剂可以向生物体给药，以抑制神经细胞的突起的延长。作为向生物体给药的方法不进行限定，可以举出例如，皮下注射、肌肉注射、腹腔内注射、点滴注射等。除了口服给药、静脉内给药、肌内给药等全身给药之外，还可以举出向脑内或髓腔内(脊髓液中)、一侧背侧海马的局部给药。向脑内局部给药时，本发明的抑制剂可以包含在含胶原的载体中。
具有抑制神经突延长的作用的上述抑制抗体期待抑制神经的过敏状态。本发明提供含有上述抗体作为有效成分的伴随有神经过敏的疾病的预防或治疗剂。
本发明的预防或治疗剂中含有的抑制抗体的量只要发挥上述作用效果则不特别限定，通常为0.001～90重量％、优选为0.005～50重量％、更优选为0.01～10重量％。
本发明的预防或治疗剂除了上述抑制抗体之外，还可以含有载体。作为上述载体，可以举出上述抑制剂中举出的载体。
作为适用本发明的抑制剂、预防或治疗剂的疾病，是通过抑制神经突的延长，可以期待病理的改善的疾病。可以举出例如，带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶、压力等。慢性疼痛分类为：
(1)认为伤害性感受器被持续刺激而产生的伤害性疼痛，
(2)由与疼痛传递或抑制机理相关的神经纤维的功能异常引起的神经源性疼痛，以及
(3)感情或情绪方面受到负荷的心因性疼痛。本说明书中的慢性疼痛指的是神经源性疼痛(神经的损伤、压迫等引起的疼痛)、伤害性疼痛(癌症、风湿等中的疼痛)两种。经验依赖性社会厌恶(社会的挫折压力)是指中脑缘多巴胺路径中的BDNF发挥必需的作用的状态。
作为本发明的抑制剂、预防或治疗剂的给药对象，可以举出小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、马、绵羊、猴、人等哺乳动物。
抑制剂、预防或治疗剂可以以口服、直肠内、胃肠外、脑池内(intracistemally)、阴道内、腹腔内、局部(以粉末、软膏、凝胶、点滴注射剂或透皮贴剂等形式)、口内、经口或鼻腔喷雾的形式给药。本说明书中使用的用语“胃肠外”指的是包括静脉内、肌内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射以及注入的给药方式。
抑制剂、预防或治疗剂还可以通过缓释性系统适当地给药。缓释性试剂的适当的例子，包含适当的聚合物物质(例如，成型品(例如，膜或微囊)形态的半透性聚合物基质)、适当的疏水性物质(例如，容许品质油中的乳液的形式)或离子交换树脂、以及难溶性衍生物(例如，难溶性盐)。
使用本发明的抑制剂、预防或治疗剂，在考虑各患者的临床状态、给药部位、给药方法、给药方案以及本领域技术人员公知的其它因素的基础上，以遵守医疗实施基准(Good Medical Practice)的方式制定处方以及给药。因此，本说明书中，所需的“有效量”进行这种考虑来决定。作为通常的提案，胃肠外给药的单位剂量的治疗剂的总药学有效量为患者体重的约1μg／kg／天～10mg／kg／天，但是如上所述其依赖于治疗上的考虑。进一步优选该用量至少为0.01mg／kg／天，最优选对于人为约0.01mg／kg／天与约1mg/kg/天之间。连续给药时，代表性地以约1μg/kg／小时～约50μg／kg/小时的给药速度通过每天1次～4次的注射或连续皮下注入(例如使用微型泵)中的任意一种给予治疗剂。此外还可以使用静脉给药用的袋溶液。为了观察变化，根据所需的效果改变必要的处置时间和产生应答的处置后的间隔。
实施例
以下通过实施例对本发明进行具体的说明，但是本发明不被这些实施例所限定。
病毒和细胞培养
使VZV的Oka株(用来自减毒水痘病毒Oka株(日本特公昭53-41202号或美国专利第3985615号)的病毒作为种子来制备，在世界各国广泛供于实用(Requirements for Varicella Vaccine(Live)Adopted1984；Revised1993：WHO Technical Report Series，No.848，pp.22-38，1994)。该减毒Oka株以保藏编号VR-795于1975年3月14日保藏在ATCC。)和VZV的Kawaguchi株(Journal of Virology，Nov.2002，P.11447-11459)在人胚胎肺细胞或人肺癌细胞株A549细胞中增殖。上述细胞分别在补加有10％和2％胎牛血清的Eagle’s最低必须培养基中生长、维持。
大鼠皮层神经元的原代培养细胞根据已经报道的方法(Tabuchi，A.，et al.，J.Biol.Chem.277，35920-35931(2002))，由17～18天龄大鼠胚胎(Sprague-Dawley)的大脑皮质制备。简要地说，将大脑皮质的小片依次通过酶(DNase I(Sigma)处理和胰蛋白酶(Sigma))处理以及机械分离形成片断，将该细胞以5×106个的密度接种到60mm的培养皿(Iwaki)中。使上述细胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(Nissui)中生长48小时，接着将培养基更换为含有葡萄糖(4.5mg／ml)、转铁蛋白(5μg／ml)、胰岛素(5μg／ml)、亚硒酸钠(5μg／ml)、牛血清白蛋白(1mg／ml)和硫酸卡那霉素(100μg／ml)的无血清Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(TIS培养基)。加入阿糖胞苷(Sigma)2μM，抑制神经胶质细胞的增殖。在DNA转染的2小时前，将培养基更换为新鲜的TIS培养基(不含阿糖胞苷)。
实施例1
GST-IE62融合蛋白质的表达和多克隆抗体的产生
将VZV的IE蛋白质的一部分分割成片段，合成为GST融合蛋白质。上述GST融合蛋白质如图1A所示，相互重叠覆盖分子整体。表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-IE62融合蛋白质的重组质粒通过扩增VZV基因的IE62基因，并将扩增DNA片段插入到载体pGEX-4T-1(Pharmacia)中来构建。
1)RNA的分离和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)
全RNA使用ISOGEN(日本Gene)从培养细胞中提取。RT-PCR根据已经报道的方法(Kawasaki，E.S.，et al.，Amplification of RNA.In PCRProtocol，A Guide to methods and applications，Academic Press，Inc.，SanDiego，21-27(1991))进行。简要地说，将全RNA(1μg)在20μl的1×第一链缓冲液中逆转录到cDNA。上述缓冲液含有下述物质：
作为引物的0.5μM Oligo(dT)15(5’-AAGCTTTTTTTTTTV-3’)(序列号6)，200单位的SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)，400μM dNTPs，以及10单位的RNase抑制剂(Invitrogen)。
逆转录反应后，对反应混合物用1.1单位的RNase H(Invitrogen)在37℃下处理20分钟，作为cDNA溶液用于PCR。PCR在含有1μl的cDNA溶液、1.25单位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶(PerkinElmer LifeSciences)、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs和0.5μM引物对的50μl的1×PCR缓冲液中进行。为了区别大鼠BDNF基因的四个外显子(外显子I、外显子II、外显子III和外显子IV)，使用
E-1(5’-ACTCAAAGGGAAACGTGTCTCT-3’)(序列号7)、
E-II(5’-CGGTGTAGGCTGGAATAGACT-3’)(序列号8)、
E-III(5’-CTCCGCCATGCAATTTCCACT-3’)(序列号9)、
E-IV(5’-GTGACAACAATGTGACTCCACT-3’)(序列号10)和
E-Vas(5’-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3’)(序列号11)。
作为内标，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)cDNA用GAPDH正义(5’-TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3’)(序列号12)和反义(5’-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3’)(序列号13)引物对进行扩增。BDNF cDNA的扩增中，PCR条件为，在95℃下预热10分钟后，如下进行：以在94℃变性1分钟，在55℃退火1分钟，在72℃延长1.5分钟作为一个循环，进行32个循环(外显子I)、31个循环(外显子II)、26个循环(外显子III)和29个循环(外显子IV)，并在72℃最终延长10分钟。GAPDH的扩增在与上述相同的条件下进行31个循环。PCR产物通过2％琼脂糖凝胶上的电泳分离，用溴化乙锭染色的DNA的带的密度，使用Bit-Map loader(ATTO)和软件(NIH Image1.52)分析。
2)GST-IE62融合蛋白质的表达
将构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，得到转化体。培养该转化体，并往其中添加1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，在37℃下培养4小时或在室温下培养一夜，由此诱导融合蛋白质的表达。诱导的融合蛋白质通过SDS-PAGE确认(图1B)。诱导的融合蛋白质，使用谷胱甘肽琼脂糖4B(Pharmacia)基于制造者的指令及用SDS-PAGE确认的分子量进行纯化。重组质粒的构建通过它们的序列确认。IE62融合蛋白质的抗原性通过免疫印迹程序确认。
3)多克隆抗体的产生
根据常规方法，将融合蛋白质1～5免疫接种到兔中，将其免疫血清用于免疫印迹和对于VZV感染细胞的免疫荧光抗体试验。
实施例2
IE62的单克隆抗体的产生
IE62的单克隆抗体，使用GST-IE62融合蛋白质，本质上根据已经报道的方法(Okuno et al，Virology129，357-368(1983))进行制备。通过对于GST蛋白质的ELISA和对于VZV感染细胞的免疫荧光抗体，筛选杂交瘤的培养上清，克隆产生IE62单克隆抗体的杂交瘤。
实施例3
免疫荧光抗体(IFA)分析
在-20℃下用丙酮固定VZV感染细胞，分别使用BDNF或IE62的单克隆抗体以及与荧光素结合的抗小鼠IgG血清作为一次抗体和二次抗体进行染色。所产生的GST-IE62融合蛋白质的兔抗血清使用与荧光素结合的抗兔IgG血清(Jackson)作为二次抗体，通过VZV感染细胞的免疫荧光抗体来确认。
实施例4
Western印迹
将GST-IE62融合蛋白质或VZV感染细胞的溶解液负载在SDS凝胶上，通过电泳进行分离，转印到硝酸纤维素膜(Millipore)上。上述膜通过GST-IE62融合蛋白质的兔抗血清、抗IE62单克隆抗体(1：10000稀释、阪大微生物学病研究所制)或抗人BDNF单克隆抗体(稀释成0.5μg／ml、R&D Systems制)进行探针标记。与过氧化物酶结合抗兔IgG血清或山羊抗小鼠IgG血清一起进一步培养1小时后，通过ECL法(Nacalai Tesque)展开免疫印迹。
实施例5
被抗IE62单克隆抗体识别的IE62的表位的决定
被抗IE62单克隆抗体识别的IE62的表位，通过使用合成肽的IE62的Western印迹的封闭进行分析。表位为图1A所示的融合蛋白质C与F之间的重复区域，对应于IE62的414-447位的氨基酸。
将上述区域分为三个部分，使用含有下述氨基酸序列的三种肽180μg：
肽I：PGYRSISGPDPRIRKT(序列号：3)
肽II：KRLAGEPGRQRQKSF(序列号：4)，和
肽III：SLPRSRTPIIPPVSG(序列号：5)
在Western印迹中封闭抗IE62单克隆抗体与IE62的相互作用。
实施例6
BDNF和抗IE62抗体对于原代培养神经元的作用
用氯胺酮(50mg／kg，i.p.)麻醉Sprague-Dawley大鼠(出生后0～1天)，接着通过颈椎脱臼处死。全部的努力是为了使所用的动物数目和它们的痛苦为最低限度来进行的。实验方法符合大阪大学医学部的动物管理委员会规则以及涉及实验动物的处理的NIH的指南。通过通常的微岛法(Kimura et al.，J Neurophysiol.May；77(5).2805-2815，1997)，培养孤立神经元。从脑取出视觉皮质的一片，用木瓜蛋白酶(20U／ml)进行酶解离，用磨光玻璃移液管进行粉碎。在置于琼脂糖片上的胶原点上，在前面制备的胶质细胞微岛上载置神经元，在以补加有B27(Gibco)的神经基础A培养基(Gibco)为基本的溶液中发育。如此将由相同的动物培养的神经元分为两组，以规定的浓度向培养基中添加BDNF(在大肠杆菌中表达的重组蛋白质：Sigma制、在昆虫细胞中表达的重组蛋白质：R&D Systems制)和实施例2中制备的抗IE62单克隆抗体，由日龄一致的姐妹培养物得到数据。平板接种后10～15天进行记录。
接着，就BDNF和抗IE62抗体以及作为TrK受体酪氨酸激酶的抑制剂的K252a对脊神经后根神经元的作用进行研究。结果如图5A-5D所示。
实施例7
形态的分析
记录荧光图像后，将神经元和与生物素结合的抗小鼠IgG1一起在37℃下培养1小时。然后，使用ABC试剂盒(Vector Laboratories)，使MAP2可视化。使用设置在倒置显微镜(TE300；Nikon)上的Neurolucida(MicroBrightField)，描绘神经元的神经突。神经突的形态的定量评价使用分析软件Neuroexplore(MicroBrightField)进行。
实施例8
通过抗IE62单克隆抗体实现的Arc(Activity-regulatedcytoskeleton-associated protein)和BDNF的转录增强
由实施例6中使用的大鼠原代培养神经元，使用ISOGEN(日本GENE)提取全RNA。定量PCR如下进行。对于大鼠BDNF基因的外显子III～V(Imamura L.et al.，J Pharmacol.，Exp.Ther316：136-143，2006)Arc cDNA和β-肌动蛋白cDNA，分别使用Arc正义(5’-CGCTGGAAGAAGTCCATCAA-3’)(序列号14)、Arc反义(5’-GGGCTAACAGTGTAGTCGTA-3’)(序列号15)、β-肌动蛋白正义(5’-TTTGAGACCTTCAACACCCC-3’)(序列号16)、β-肌动蛋白反义(5’-ACGATTTCCCTCTCAGCTGT-3’)(序列号17)引物，进行定量PCR扩增。
PCR的温度分布是在95℃预变性10分钟后如下所述：以在95℃变性45秒，在55℃退火45秒以及在72℃延长1分钟作为1个循环，进行45个循环(外显子I)、31个循环(外显子II)、26个循环(外显子III)和29个循环(外显子IV)，并在72℃最终延长10分钟。BDNF基因的外显子III～V的扩增使用57℃的退火温度。荧光在各72℃的延长步骤的最终阶段获得。各mRNA的表达水平使用β-肌动蛋白mRNA的水平进行归一化。
结果
融合蛋白质
重组质粒的构建通过它们的序列确认。GST-IE62融合蛋白质1～5的免疫原性通过使用VZV抗血清的Western印迹确认。该抗血清通过IFA试验确认VZV感染细胞的核染色为阳性，用Western印迹检出IE62蛋白质。接着，对IE62-GST融合蛋白质进行定量，作为IE62蛋白质进一步用于特性评价。图1A表示含有整个IE62分子和它们的产物的GST-IE62融合蛋白质1～5和A～G的简图。
通过带状疱疹恢复期血清识别IE62和BDNF
图1C和图1D表示来自带状疱疹患者的血清与BDNF、GST-IE62融合蛋白质2反应的总结，以及Western印迹的代表性图案的一例。带状疱疹患者血清(No.23)在Western印迹中识别IE62的片段2和F以及BDNF。另一方面，患者血清(No.28)识别IE62的片段2，但是未识别IE62的片段F或BDNF。6名患者的血清与BDNF反应，其中5名患者的血清识别IE62融合蛋白质。2名患者的血清识别IE62，但是未识别BDNF。IE62与BDNF的识别虽然在全部患者中不相关，但是来自6名患者的血清表现出与对IE62和BDNF的抗体应答的相关。
通过各单克隆抗体进行的BDNF和IE62的交叉识别
本发明人制备了IE62-GST融合蛋白质的单克隆抗体。该单克隆抗体对于覆盖整个IE62分子的IE62-GST融合蛋白质的反应性如图2A所示。如图2A所示，抗BDNF单克隆抗体和抗VZV IE62单克隆抗体两者都同样地识别VZV IE62的相同区域。图2B表示通过抗BDNF单克隆抗体和抗VZV IE62单克隆抗体染色的IFA图案，两抗体主要染色受感染细胞的核。通过Western印迹和IFA确认抗BDNF单克隆抗体识别IE62蛋白质。
如图2C所示，BDNF蛋白质被抗VZV IE62单克隆抗体和抗BDNF单克隆抗体两者印迹、探针标记，两抗体同样地识别BDNF。用抗IE62单克隆抗体探针标记BDNF时，与BDNF的二聚物反应，而不是与其单体反应。这暗示了抗IE62单克隆抗体识别通过BDNF二聚物形成的立体结构的表位。识别IE62的抗BDNF单克隆抗体与抗IE62单克隆抗体同样地，与BDNF的二聚物反应，而不是与BDNF的单体反应。VZV IE62与BDNF的这种免疫学交叉反应性通过各自的单克隆抗体确认。
BDNF与IE62的交叉反应表位的鉴定
抗IE62单克隆抗体除了识别GST融合蛋白质2之外，还识别区域C和F(图2A)。区域C和F的重叠区域表示IE62蛋白质的氨基酸414-447位，使用含有该区域的3个构建肽，在Western印迹中封闭反应，由此决定VZV IE62的表位。含有414位～429位氨基酸的肽封闭抗VZV IE62抗体与抗BDNF抗体两抗体的相互作用。这表示IE62的氨基酸414-447位的肽的表位被抗VZV IE62抗体和抗BDNF抗体识别(图3)。但是，该肽不能在Western印迹中封闭抗IE62和抗BDNF单克隆抗体与BDNF的反应。因此，两单克隆抗体的表位为IE62的氨基酸414-447位的线状的表位，但任意一种单克隆抗体都不能在相同条件下封闭通过二聚物形成的BDNF的立体结构的表位。
以上的结果暗示了交叉反应表位为VZV IE62的氨基酸414～429位。
本发明人使用培养神经元，将抗VZV IE62单克隆抗体对BDNF的生物活性的作用特征化。抗VZV IE62单克隆抗体如图4A所示，显著地促进Arc和BDNF外显子3-5的转录。进一步地，抗VZV IE62单克隆抗体显著地增加神经细胞体的面积、分枝点、被BDNF刺激的神经突的长度(图4C～图4E)。因此，抗VZV IE62单克隆抗体从生物学和生化学标志方面考虑，未中和反而增大BDNF的活性。因此，2个生物活性BDNF作为二价BDNF通过抗VZV IE62单克隆抗体连接，该二价的BDNF可能与两个相邻的TrkB分子结合，与一价的BDNF-TrkB相互作用相比传递更强的信号，其结果是促进Arc和BDNF的转录，促进神经细胞的神经突的发展。或者，认为抗体与BDNF的结合使BDNF的结构稳定化，促进与TrkB受体的结合。
通过BDNF促进GABA性神经元的形态学发展
为了评价BDNF对神经元的发育抑制的效果，本发明人对确认与抗GAD65抗体反应的皮质(GABA性)神经元的形态进行了定量分析。如图4B(a)和图4B(b)所示，与抗VZV IE62单克隆抗体和BDNF一起培养的皮质神经元与其它的对照神经元相比具有大的细胞体，具有更多的神经突的分枝。
为了对该发现进行定量，本发明人对体细胞区域和各神经元的神经突形态的三个参数进行计算(图4C～图4E)。与BDNF一起培养的10个神经元的体细胞的平均区域与11个对照神经元的平均区域相比显著增大(P＜0.01、ANOVA)(图4C)。BDNF处理过的神经元的原代神经突的平均数目与对照神经元的数目相比显著增大(P＜0.01、ANOVA)。此外，处理神经元的神经突的总长度的平均值与对照神经元相比显著增大(P＜0.01、ANOVA)(图4E)。最后，BNDF处理神经元的神经突的分枝点的平均数目与对照神经元的数目相比显著增大(P＜0.01、ANOVA)(图4D)。这些结果暗示了BDNF促进皮质神经元的体细胞神经元和神经突的发育。
通过BDNF促进脊神经后根神经元的形态学的发展
为了确认BDNF的这种作用通过TrkB受体的活化引起，将Trk受体酪氨酸激酶的抑制剂K252a适用于用BDNF处理过的脊神经后根神经元。我们发现上述试剂的处理阻断BDNF对脊神经后根神经元的增殖作用。这在神经突的体细胞区域和三个参数的定量分析中表现出来(图5A～图5D、从各图(panel)的右侧开始第三个柱)。用K252a处理过的10个神经元的体细胞的平均区域与对照神经元的平均区域无显著性差异。此外，K252a处理神经元的一次神经突的数目与对照神经元的值无显著性差异。K252a处理神经元的神经突的总长度与对照神经元的值无显著性差异。K252a处理神经元的神经突的分枝点的平均数目与对照神经元的值无显著性差异。可知K252a抑制BDNF的作用的同时抑制IE62抗体(IE10)的增强作用(图5A～图5D、各图的右边三个柱)。脊神经后根神经元为兴奋性神经元，该神经元直接传递痛感，因此可知本发明的抗体通过BDNF的活化促进脊髓后角的兴奋性神经元的神经突的延长。
实施例9
抑制BDNF活性的抗体的制备
1)GST-IE62融合蛋白质的表达
作为IE62蛋白质，使用VZV的野生株(Kawaguchi株)来替代VZV的Oka株，通过PCR扩增编码序列号2的268-341位的氨基酸序列的DNA，并与编码GST的DNA连结，除此之外与实施例1中记载的方法同样地操作，制备GST-IE62融合蛋白质。
2)单克隆抗体的制备和筛选
使用上述1)中得到的GST-IE62融合蛋白质，本质上根据已经报道的方法(Okuno et al，Virology129，357-368(1983))制备单克隆抗体。通过对于GST蛋白质的ELISA和对于VZV感染细胞的免疫荧光抗体筛选杂交瘤的培养上清，克隆产生IE-62单克隆抗体的杂交瘤。以BDNF作用的抑制作为指标对所得到的单克隆抗体(KSG1～13)进行的筛选，根据实施例6记载的方法通过记录神经元的神经突的延长来进行，由此得到本发明的抑制抗体。
3)单克隆抗体与IE62肽的反应性
通过Western印迹确认得到的单克隆抗体(KSG1～6、8、12和13)与IE62肽(图1A的片段A或片段E)或GST蛋白质的反应性。得到的所有单克隆抗体都不与GST蛋白质反应。KSG1、2和6与片段A反应，其它的单克隆抗体与片段A和片段E反应。
接着，通过斑点印迹确认单克隆抗体(KSG1～8、10、12和13)与IE62肽的反应性。即，通过斑点印迹确认分别用胰蛋白酶、蛋白酶K、凝血酶或V8蛋白酶切断IE62肽片段A或片段E的GST融合蛋白质得到的切断物与上述单克隆抗体的反应性。其结果推测是，KSG1、2和6的表位存在于IE62肽片段A的N末端侧，KSG3、4、5、12和13的表位存在于IE62肽片段A的中央部并且是片段E的N末端侧，KSG8的表位存在于IE62肽片段A的中央部并且是片段E的N末端侧和其C末端侧的两部位。
接着，合成选自序列号
18(GPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPRKHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP)中的两种肽，肽1：
GRSSGGKPRAFLALP(序列号19)和肽2：DTRPRKHDARGITPR(序列号20)，用这些肽吸收上述单克隆抗体进行Western印迹后，KSG8被肽2吸收，而KSG3、4、5、12和13不能被肽1和2吸收。
4)使用抑制BDNF活性的抗体的神经染色
从大鼠胎儿脑取出大脑皮质和中脑进行原代培养，使用单克隆抗体KSG1和4进行免疫染色。结果如图6A～图6D所示。可知抑制BDNF活性的抗体将神经细胞染色。
实施例10
往大鼠胎儿原代培养大脑皮质中添加用PHN患者血清处理过的BDNF时BDNF mRNA表达量的变动
进行大鼠胎儿的大脑皮质的原代培养，对由于添加用PHN患者血清处理过的BDNF蛋白质而引起的BDNF mRNA表达量的变动进行调查。在妊娠的第17天从10只大鼠的胎儿取出大脑皮质，用胰岛素和DNase处理，在用聚-L-赖氨酸涂布的6孔板中，在含有10％FCS的Dulbecco’s MEM存在下培养。培养3天后，将培养基更换为不含有血清的Dulbecco’s培养基，进一步培养3天。使PHN患者血清(10倍稀释的血清20μl)与BDNF蛋白质10ng(10ng／μl、1μl)在冰中反应4小时后，将反应混合物添加到大鼠胎儿大脑皮质原代培养细胞中，进一步培养3小时。细胞用冰冷却的PBS洗涤2次后，提取RNA。向得到的RNA中加入PolydT(15)和逆转录酶，进行cDNA合成。将所得到的cDNA用由BDNF的外显子3与外显子5的序列设计的引物和作为内标的β-肌动蛋白的引物分别进行实时(real time)PCR，进行BDNF的mRNA的定量。
结果如图7所示。由图7可知，将用PHN患者的血清处理过的BDNF蛋白质添加到大鼠胎儿大脑皮质中时，与单独使用BDNF蛋白质时相比，BDNF mRNA的表达量增大。
实施例11
人型抗体的产生
由于与BDNF免疫交叉的IE62的部位已经被鉴定，使用人抗体文库(AIMS4)和表达该部位的IE62-GST融合蛋白，筛选对于该表位的人型抗体。
将IE62-GST融合蛋白涂布到试管上，与AIMS4噬菌体文库反应，洗涤未反应的噬菌体，向反应的噬菌体中加入大肠杆菌，使该噬菌体增殖。然后，对增殖的噬菌体进一步在涂布IE62-GST融合蛋白的试管中通过洗淘法进行选择，重复此操作。该增殖的噬菌体在用BDNF涂布的试管中选择增殖。通过Western印迹检查所选择的噬菌体产生的CP3-Fab对于IE62-GST融合蛋白和BDNF的反应性。选择表现出与和BDNF交叉反应的抗IE62抗体同样的反应性的抗体克隆。Fab抗体的BDNF活性调节作用用神经培养细胞进行研究。IgG抗体结合到具有活性的克隆上。比较Fab抗体与IgG抗体的调节作用，将适当的一方为了临床应用而用于实验中。
实施例12
对于小脑的浦肯野细胞的神经突的延长和发育的影响
给出生后1天的小鼠或大鼠接种本发明的抗体，3周后对小脑的浦肯野细胞的神经突进行染色，研究对于神经突的延长和发育的影响。由于浦肯野细胞是在小脑内均匀分布的细胞，可以对神经突的延长进行定量化，并且适合作为评价对神经细胞的影响的体系。
由对接种实施例2中得到的抗体后的神经突的平均长度、分枝点进行调查得到的脑的病理数据的评价，来评价实施例2的抗体促进神经突的延长。因此，该抗体与通过BDNF的神经细胞的活化，神经联系的促进、再生等神经疾病的治疗相关。
由对接种实施例9中得到的抑制抗体后的神经突的平均长度、分枝点进行调查得到的脑的病理数据的评价，来评价实施例9的抗体抑制神经突的延长。因此如下评价，1)由于抑制通过BDNF的神经突的延长，在带状疱疹后神经痛时形成的过量的神经联系被限制，因此，可以抑制痛觉过敏的发病；2)慢性疼痛时，同样地通过抑制利用BDNF的作用形成神经联系，可以抑制慢性疼痛的形成。
实施例13
在阿尔茨海默病模型小鼠中抗IE62单克隆抗体对记忆障碍、轴突的萎缩、突触减少的恢复
为了机能性地修复痴呆的神经回路网的障碍，以神经突延长促进作用为指标进行合适的抗IE62单克隆抗体的筛选。有些抗IE62单克隆抗体(例如：IE62B)具有神经突延长活性，为了研究表现出神经突延长活性的单克隆抗体对痴呆的记忆障碍是否具有作用，使用单次脑室内给予作为阿尔茨海默病的原因物质的淀粉样蛋白(amyloid)b(Ab)的活性部分序列25-35肽制备的阿尔茨海默病的模型小鼠。
给予Ab(25-35)的小鼠中，空间记忆的获得和保持与对照组相比，显著减弱。对脑切片进行免疫染色后，在大脑皮质和海马中，观察到轴突和突触显著减少。
给予Ab(25-35)7天后给予抗IE62单克隆抗体(例如：IE62B)的组中，记忆获得、保持能力都维持在对照组的水平，确认轴突和突触保持正常水平、树突的再形成。
接着，对原代培养的大鼠大脑皮质神经细胞中的抗IE62单克隆抗体(例如：IE62B)的作用进行研究。抗IE62单克隆抗体特异性地使大脑皮质神经细胞的轴突延长。即使在通过处置Ab(25-35)，诱发轴突和树突萎缩的状态下使抗IE62单克隆抗体发挥作用时，抗IE62单克隆抗体也特异性地促进轴突延长。由以上的结果暗示了抗IE62单克隆抗体(例如：IE62B)抑制Ab(25-35)诱发的轴突的萎缩、突触减少，有可能由此恢复记忆障碍，对神经回路网的再构建是有效的。
实施例14
脑卒中易发性高血压大鼠(SHRSP)的脑卒中预防效果的研究
使用脑卒中易发性高血压大鼠(Stroke-Prone SpontaneouslyHypertensive Rat，SHRSP)，对脑卒中预防效果进行研究。作为SHRSP的脑卒中发病时的主要症状，可见一侧前肢的抬起运动、步行异常、过敏、自主运动量的减少、立毛、体重减少、摄食量减少等。作为特征性的组织变化，确认有脑软化、脑出血、血管坏死、心脏肥大、肾硬化症、肠系膜动脉的结节性多发性血管炎、睾丸萎缩等。
(方法)
对SHRSP(10周龄)的雄性大鼠给予1％食盐水或自来水，以规定的用量静脉内给予抗IE62单克隆抗体(IE62B)，进行观察。实验期间中，每周测定摄食量、饮水量、体重1次的同时，记录脑卒中发病日和死亡日。血压使用小动物自动血压测定装置(Ueda制作所、UR-5000)，通过tail cuff法进行测定。
(结果)
1.食盐负荷的影响：
可知1％食盐负荷几乎不影响体重而促进血压升高，与自来水饲养相比存活时间缩短至1／2以下。
2.脑卒中预防效果：
可知抗IE62单克隆抗体(IE62B)极其显著地延长存活时间，表现出食盐负荷组的约3.5倍、比自来水饲养组进一步长期存活100天的显著效果。
实施例15
对于Gerbil大鼠脑血管障碍模型的抗IE62抗体的神经细胞死亡抑制作用、再生促进作用
由于Gerbil大鼠为不受桡动脉影响的大鼠，预先给予抗IE62抗体，结扎颈内动脉5分钟，引起血管障碍(由于血脑屏障的破坏使抗体浸渗到脑内)，再次打开。1周后，通过尼氏染色，对神经细胞死亡进行研究。以对缺血敏感性高、BDNF的表达强的海马CA1区域的神经细胞的脱落为指标，对该抗体的影响进行研究。
(结果)
确认通过抗IE62抗体改善CA1区域的细胞死亡。
实施例16
大鼠大脑皮质神经细胞的BDNF和Arc基因的持续性表达的研究
(目的)
有报告指出，脑源性神经营养因子(BDNF)对神经细胞的存活、可塑性的维持是重要的，Arc(Activity-regulated cytoskeleton-associated protein)与突触可塑性相关。对于对大鼠给予抗IE62单克隆抗体(IE62B)后的BDNF以及Arc基因的持续性表达控制系统进行研究。
(方法)
E17大鼠大脑皮质原代培养神经细胞用2.5×106个细胞／35mm皿进行培养。在培养第6天添加BDNF，3小时后更换培养基(BDNF清除(washout))。通过定量的RT-PCR测定BDNF和Arc mRNA表达量。
(结果、考察)
在原代培养神经细胞中，BDNF和Arc mRNA表达量，从BDNF清除后48小时后显著增加。具体研究的结果可知，BDNF mRNA表达的持续性主要依赖于神经活动。
另一方面，暗示了Arc mRNA表达的持续性依赖于BDNF信号。进一步地，BDNF增加与突触密度存在相关性的细胞内钙变动的频率。由以上结果认为，BDNF基因的神经活动依赖且持续性的表达控制机构，通过对Arc基因表达附加持续性，在维持突触机能上发挥基本的作用。
实施例17
大鼠大脑皮质神经细胞的BDNF的自主、持续性的表达控制系统的研究
(目的)
为了明确给予抗IE62单克隆抗体后的BDNF的mRNA表达量持续性增加，进一步地，对于报告与突触可塑性相关的Arc的mRNA表达量进行分析，与BDNF mRNA表达的情况进行比较。
(方法)
将E17大鼠大脑皮质原代培养神经细胞在聚亚乙基亚胺涂布的35mm皿上、以2.5×106个细胞／2mL进行培养。在培养第6天添加BDNF(100ng／mL)，3小时后更换3次培养基(清除BDNF)。通过定量RT-PCR法测定BDNF mRNA和Arc mRNA表达量。
(结果、考察)
在原代培养神经细胞中，BDNF添加组、BDNF清除组的BDNFmRNA表达量在24小时～72小时与对照组相比都持续性增加约2倍。此时，Arc mRNA表达量与对照组相比24小时增加约20倍，在48小时、72小时维持约2倍的表达量。这些mRNA增加在TrkB抑制剂K252a的存在下被抑制。此外，若使用BDNF中和抗体，则BDNF mRNA表达量不变化，但是Arc mRNA表达量显著减少。
进一步地，使用各种抑制剂的结果是，得到表现出实现BDNF mRNA和Arc mRNA的持续性表达的信号传递不同的结果。
由以上结果暗示通过利用BDNF的自主性基因表达而合成、分泌的BDNF活化通过TrkB的多个信号传递路径，由此持续地活化BDNF和Arc基因表达。
以神经细胞中具有的BDNF为中心的自主性、持续性表达控制机理，发挥在维持神经可塑性时发挥基本作用。
实施例18
本发明的抗体在导入有人APP基因的转基因小鼠中的作用
若对强力表达人型APP基因、随着年龄的增加产生脑的老年斑的PD-APP小鼠(Tg2576小鼠)给予抗IE62单克隆抗体，则预防老年斑的形成。
给予抗IE62单克隆抗体(IE62B、KSG1～13)的小鼠的学习机能恢复。
对Tg2576小鼠一次给予抗IE62单克隆抗体(IE62B、KSG1～13)。接种小鼠中老年斑淀粉样蛋白的沉积显著减少，看不到脑炎等副作用。该方法期待可以作为阿尔茨海默病的预防、治疗方法应用于人。
对上述Tg2576小鼠注射本发明的抗体(与BDNF交叉反应的抗IE62抗体)，通过记忆水池的浅位置的“水迷宫”的实验对1个月后的记忆力进行研究。
给予本发明抗体的小鼠，在给药前未能记忆浅滩的位置的记忆力恢复至与野生型小鼠相似的水平。
工业实用性
根据本发明的神经突的延长促进剂、神经性疾病的预防或治疗剂，可以使迄今为止无有效技术方案的神经损伤后的神经再生。此外，根据本发明的神经突的延长抑制剂，期待对迄今为止无有效技术方案的带状疱疹后神经痛或慢性疼痛等发挥效果。进一步地，根据本发明的预防或治疗剂，期待改善经验依赖性社会厌恶、压力等伴随有神经过敏的疾病。
本申请以在日本申请的日本特愿2006-312236(申请日：2006年11月17日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。
Claims (19)
1.神经突的延长促进剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒IE62蛋白质、识别具有序列号2的414-429位的氨基酸序列的肽且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分。
2.如权利要求1所述的促进剂，其中，所述脑源性神经营养因子为二聚物。
3.神经性疾病的预防或治疗剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒IE62蛋白质、识别具有序列号2的414-429位的氨基酸序列的肽且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体作为有效成分。
4.如权利要求3所述的预防或治疗剂，其中，所述脑源性神经营养因子为二聚物。
5.如权利要求3或4所述的预防或治疗剂，其中，所述神经性疾病为伴随有由于选自脑卒中、缺氧症、窒息、身体损伤、暴露于毒素、恶性新生物、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症中的状态引起的损伤的神经细胞的疾病。
6.商业包装，包括权利要求1或2所述的神经突的延长促进剂、以及记载该促进剂可以或应当用于神经突的延长的关于该促进剂的记载物。
7.商业包装，包括权利要求3～5中任意一项所述的神经性疾病的预防或治疗剂、以及记载该预防或治疗剂可以或应该用于神经性疾病的关于该预防或治疗剂的记载物。
8.神经突的延长抑制剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒IE62蛋白质、识别具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽、且与脑源性神经营养因子交叉反应并抑制脑源性神经营养因子的抗体作为有效成分。
9.伴随有由于选自带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶和压力中的状态引起的神经过敏的疾病的预防或治疗剂，含有识别水痘-带状疱疹病毒IE62蛋白质、识别具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽、且与脑源性神经营养因子交叉反应并抑制脑源性神经营养因子的抗体作为有效成分。
10.商业包装，包括权利要求8所述的神经突的延长抑制剂、以及记载该抑制剂可以或应该用于抑制神经突的延长的关于该抑制剂的记载物。
11.商业包装，包括权利要求9所述的预防或治疗剂、以及记载该预防或治疗剂可以或应该用于伴随有由于选自带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶和压力中的状态引起的神经过敏的疾病的关于该预防或治疗剂的记载物。
12.制备权利要求1～5中任意一项所述的抗体的方法，包括使用具有选自序列号2的414-429位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽作为抗原、筛选抗体文库的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述抗体文库为人抗体文库。
14.制备权利要求8或9所述的抗体的方法，包括使用具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽作为抗原、筛选抗体文库的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述抗体文库为人抗体文库。
16.识别水痘-带状疱疹病毒IE62蛋白质、识别具有序列号2的414-429位的氨基酸序列的肽且与脑源性神经营养因子交叉反应的抗体在制备用于预防或治疗神经性疾病的药物中的应用。
17.如权利要求16所述的应用，其中，所述脑源性神经营养因子为二聚物。
18.如权利要求16所述的应用，其中，所述神经性疾病为伴随有由于选自脑卒中、缺氧症、窒息、身体损伤、暴露于毒素、恶性新生物、痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症中的状态引起的损伤的神经细胞的疾病。
19.识别水痘-带状疱疹病毒IE62蛋白质、识别具有选自序列号2的268-341位的氨基酸序列中的至少7个连续氨基酸的肽、且与脑源性神经营养因子交叉反应并抑制脑源性神经营养因子的抗体在制备用于预防或治疗伴随有由于选自带状疱疹后神经痛、慢性疼痛、经验依赖性社会厌恶和压力中的状态引起的神经过敏的疾病的药物中的应用。
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