KR20090078356A - 세포외 매트릭스 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 대한 항체 및 그의 제법과 용도 - Google Patents

세포외 매트릭스 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 대한 항체 및 그의 제법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 및 마우스의 세포외 매트릭스 단백질의 아미노산 서열 RGD를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 RGD 서열을 매개로 하는 접착을 특이적으로 저해함으로써, 염증, 암, 감염증, 자기면역, 골다공증 등의 질환에 효율적인 효과와 동시에 부작용의 경감을 기대할 수 있어, 이들의 질환에 대해 보다 우수한 치료법을 제공할 수 있다.

Description

세포외 매트릭스 단백질의 아미노산 서열 ＲＧＤ에 대한 항체 및 그의 제법과 용도{Antibody against RGD in amino acid sequence of extracellular matrix protein and production method and use of the same}
본 발명은 세포외 매트릭스 단백질의 아미노산 서열 RGD에 대한 항체 및 당해 항체를 사용한 암, 염증성 질환, 자기면역질환, 감염증, 골질환의 예방, 치료방법 및 진단방법에 관한 것이다.
세포접착은 다세포생물의 생명유지에 중요한 역할을 하고 있다. 다세포생물의 세포접착은 세포-세포외 매트릭스간 접착과 세포-세포간 접착으로 분류되고, 세포-세포외 매트릭스간 접착에는 인테그린이, 세포-세포간 접착에는 카드헤린, 클라우딘, 넥틴 등이 세포접착에 관여하고 있는 것이 해명되어 오고 있다. 또한, 이들의 접착분자는 세포접착의 역할 뿐 아니라, 세포 내로의 시그널 전달에도 직접 관여하고 있는 것도 명확해지고 있다.
세포와 세포외 매트릭스를 연결하는 접착은, 인테그린으로 대표되는 막관통 세포접착 단백질에 의해 구성되어 있다. 인테그린은 α사슬과 β사슬의 헤테로 이량체로 구성되고, 상이한 α사슬과 β사슬의 조합으로 적어도 24종류의 인테그린 분자가 존재하여, 각각 특이적인 세포외 매트릭스 분자와 결합한다. 그것에 의해, 인테그린을 포함하는 막관통 세포접착 단백질은 세포와 세포외 매트릭스의 접착 뿐 아니라, 세포외 매트릭스로부터의 정보를 세포 내로 시그널로서 전달하여, 세포의 증식, 운동, 세포사, 분화 등을 조절하고 있다(F. G. Giancotti, et al., Science, 285, 1028-1032, 1999).
세포외 매트릭스 분자의 종류는 콜라겐군(타입 I-XIX 등), 비콜라겐성 당단백질군(오스테오폰틴, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폰빌레브란트인자, 라미닌, 테나신, 피브리노겐, 트롬보스폰딘 등), 엘라스틴군 및 프로테오글리칸군(헤파란 황산 프로테오글리칸 등)으로 분류되고, 많은 단백질이 알려져 있다. 이들의 세포외 매트릭스 분자(리간드)는 대응하는 인테그린에 결합하면, 세포 내의 시그널 전달경로를 활성화하여, 계속해서 세포골격형성, 이동, 증식, 분화 등을 조절한다. 즉, 리간드와 결합한 인테그린은 세포 표면의 리셉터형 티로신키나아제와 협동하여 이들의 시그널 활성경로를 제어하고, 리간드의 종류에 따라 그에 대응하는 인테그린은 각각 상이한 시그널을 전달한다. 많은 세포외 매트릭스 단백질에 공통적으로 존재하는 세포접착영역으로서, RGD(아르기닌-글리신-아스파라긴산) 서열이 있다. 따라서, 세포외 매트릭스 단백질의 RGD 서열은 인테그린과 접착함으로써 다양한 기능을 발휘하는 것으로부터, 의약 표적으로서 주목되어, 많은 저분자 화합물이나 합성 펩티드가 제작되고 있다.
RGD 서열과 결합하는 인테그린으로서, α3β1, α5β1, α8β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8이 존재한다. 인테그린을 매개로 하는 시그널 전달 메커니즘의 연구는, 지금까지 α5β1과 그의 특이적인 리간드인 피브로넥틴의 상호작 용의 해명을 중심으로 진행되어 왔다. 그 결과, α5β1은 세포접착과 세포이동 뿐 아니라, 세포의 분화나 세포사도 제어하는 것이 명확해졌다(S. M. Frisch et al.: Curr. Opin. Cell Biol., 9, 701-706, 1997). 그러나, 리간드에 따라서 인테그린을 매개로 하는 시그널은 상이하여, 피브로넥틴이 접착된 내피세포는 증식인자의 자극에 의해 증식활성을 나타내지만, 동일한 세포가 라미닌-1에 접착하면 증식활성이 없어져 반대로 증식억제를 나타낸다. 또한, 라미닌-10/11로부터 α3β1을 매개로 하는 시그널은 피브로넥틴으로부터 α5β1을 매개로 하는 시그널과 달리, 암세포의 운동을 강하게 촉진하여(J. Gu et al., J. Biol. Chem., 276, 27090-27097, 2001), 혈액 기아에 의한 아포토시스를 강하게 회피한다(J. Gu et al., J. Biol. Chem., 277, 19922-19928, 2002). RGD 서열과 결합하는 인테그린 중, αv 인테그린은 파골세포나 신생혈관에 고발현하고 있어, αv 인테그린은 골다공증이나 암치료제의 표적분자로 되어 있다. 또한, α5β1 인테그린은 종양세포 상에 고발현하고 있어, 암의 악성화에 관여하고 있는 것이 나타내어져 있다. 이들의 사실로부터, 항 α5β1 인테그린 항체(Volocimab), 항α4 인테그린 항체(Natalizumab), 항αvβ3 인테그린 항체(Vitaxin)는, 세포외 매트릭스 단백질이 인테그린에 결합하는 것을 저해하는 안타고니스트로서 인테그린에 대한 항체 의약품으로서 개발되어 있다.
한편, RGD 서열을 함유하는 세포외 매트릭스 단백질로서는, 콜라겐, 오스테오폰틴(OPN), 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폰빌레브란트인자, 라미닌, 테나신, 피브리노겐, 트롬보스폰딘 등이 알려져 있다. 또한, 바이러스나 세균도 RGD 서열을 가져, 세포로의 접착에 관여하고 있다. RGD 서열을 함유하는 OPN은 뼈에 다수 함유되는 칼슘 결합성 산성 당단백질로, 세포접착, 세포유주(細胞遊走), 종양형성, 면역응답 및 보체 개재의 세포용해 등 많은 중요한 기능을 담당하고 있다. 또한, OPN의 결손 마우스나 중화항체를 사용한 해석으로부터, 간염, 관절 류머티즘 등의 자기면역질환이나 암 전이에 관여하는 것이 나타내어져 있다. 이에, RGD를 매개로 하는 세포와 세포외 매트릭스 단백질의 접착을 저해함으로써, 골다공증이나 암의 치료가 기대되기 때문에, 인테그린과는 반대로 세포외 매트릭스 단백질측으로부터도 안타고니스트 의약품이 개발되고 있다.
발명의 개시
지금까지 RGD 서열을 매개로 하는 인테그린과의 상호작용을 저해하는 저분자 화합물이나 합성 펩티드, OPN이나 인테그린에 대한 항체가 제작되어 있으나, RGD 서열에 대한 특이적 항체는 존재하지 않는다. 또한, OPN이나 인테그린에 대한 항체는 RGD 서열 이외에서의 세포외 매트릭스 단백질과 인테그린의 결합 저해에 의해 목적외의 생체 내에서의 작용이 발생하여, 부작용의 발생이 염려된다.
따라서, RGD 서열을 매개로 하는 접착을 특이적으로 저해함으로써, 염증, 암, 감염증, 자기면역, 골다공증 등의 질환에 효율적인 효과와 동시에 부작용의 경감을 기대할 수 있어, 이들의 질환에 대해서 보다 우수한 치료법의 제공이 강하게 요망되고 있다. 또한, 인간의 OPN이나 인테그린에 대한 항체는 병태 모델 동물로 효과를 평가할 때, 그 항체가 그 동물의 표적 단백질 또는 펩티드로 교차 반응하지 않기 때문에, 그 동물의 표적 단백질 또는 펩티드에 대한 이종 동물의 항체로 약효평가하는 것이 일반적으로, 인간에 투여되는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체와 병태 모델 동물로 평가하는 항체와는 전혀 상이하다. 이는 의약품의 개발상에서 커다란 문제점이기 때문에, 인간의 치료에 사용하는 항체를 사용하여 병태 모델 동물로 그 치료효과를 평가할 수 있는 것이 촉망되고 있다.
본 발명자는 RGD 서열을 매개로 하는 세포외 매트릭스 단백질과 인테그린의 결합을 저해할 목적으로, RGD 서열에 대한 항체의 제작에 관해서 각종 연구를 행한 결과, RGD 서열을 포함하는 마우스 OPN의 부분 펩티드로 마우스의 단일클론 항체를 제작할 수 있고, 그 RGD 서열에 대한 항체는 인간의 세포외 매트릭스 단백질의 RGD 서열에도 교차 반응하여, 항염증효과, 항암효과 등을 가지고 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 구체적으로는 본 발명은 이하에 기재된 항 RGD 항체, 그 항 RGD 항체의 제조방법, 그 항 RGD 항체를 유효성으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 진단제 및 치료제, 및 그 항 RGD 항체의 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체의 제조방법 등을 제공하는 것이다.
(1) 서열번호 1~12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
(2) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
(3) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
(4) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
(5) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
(6) 중쇄의 상보성 결정영역(CDRH)에 있어서의 아미노산 서열로서 서열번호 1~6 중 어느 하나의 아미노산 서열을, 경쇄의 상보성 결정영역(CDRL)에 있어서의 아미노산 서열로서 서열번호 7~12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체.
(7) 인간, 마우스, 또는 그 양쪽의 세포외 매트릭스 단백질의 RGD 서열을 특이적으로 인식하는 상기 (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체.
(8) 단일클론 항체인, 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체.
(9) 인간 및 마우스의 세포외 매트릭스 단백질의 RGD 서열을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체.
(10) 인간, 마우스, 또는 그 양쪽의 세포외 매트릭스 단백질과 RGD 수용체의 결합을 저해하는 상기 (1)~(9) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체.
(11) 키메라 항체인 상기 (1)~(10) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체.
(12) 인간화 항체인 상기 (1)~(10) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체.
(13) 인간 항체인 상기 (1)~(10) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체.
(14) 수탁번호 FERM BP-10440, FERM BP-10441로 표시되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항 RGD 단일클론 항체.
(15) 상기 (1)~(14) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 치료제.
(16) 상기 (1)~(14) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 진단제.
(17) CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)을 항원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(14) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체의 제조방법.
(18) 상기 (1)~(14) 중 어느 하나에 기재된 항 RGD 항체의 상보성 결정영역을 인간 항체에 유전자 공학적으로 삽입한 키메라 항체의 제조방법.
(19) 상기 (1)~(14) 중 어느 하나에 기재된 단일클론 항체의 상보성 결정영역을 인간 항체에 유전자 공학적으로 삽입한 인간화 항체의 제조방법.
(20) CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)을 항원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 인간 항체의 제조방법.
본 발명의 단일클론 항체는 마우스와 인간의 세포외 매트릭스 단백질에 존재하는 아미노산 서열 RGD에 특이적으로 반응하고, 일부의 항체는 RGD 구조를 갖는 세포외 매트릭스 단백질인 오스테오폰틴(OPN), 피브로넥틴(FN), 비트로넥틴(VN), 라미닌과 교차 반응성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 인간과 마우스의 세포외 매트릭스 단백질에 반응하는 것으로부터, 병태 모델·마우스로 약효의 평가를 행하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 세포외 매트릭스 단백질이 관여하는 간염 등의 염증성 질환, 암의 증식·전이, 류머티즘 등의 자기면역질환 등의 치료에 사용할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 및 마우스의 OPN의 부분 펩티드를 사용하여, 얻어진 항체(4P11, 11M6, 25H15, 35B6)가 인식하는 에피토프 해석결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 인간 및 마우스의 OPN의 부분 펩티드를 사용하여, 얻어진 항체(29R5, 30C17, 33E10, 38I8)가 인식하는 에피토프 해석결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 마우스의 OPN의 RGD를 포함하는 부분 펩티드를 사용하여, 얻어진 항체(33E10, 35B6)가 인식하는 에피토프 해석결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 마우스의 OPN의 부분 펩티드를 사용하여, 얻어진 항체(33E10, 35B6)가 인식하는 에피토프 해석결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 마우스의 OPN의 부분 펩티드(CGDSLAYGLR(서열번호 19))를 사용하여, 얻어진 항체(33E10, 35B6)가 인식하는 에피토프 해석결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 항 RGD 항체의 중쇄에 있어서의 상보성 결정영역(CDR)을 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 또한, 33E10 및 35B6의 양쪽 중쇄의 서열에 있어서, 1번째의 아미노산은 나타내어져 있지 않다(2번째의 아미노산 잔기부터 나타내어져 있다). 또한, 33E10의 서열 중 99번째의 잔기(F) 및 35B6의 서열 중 98번째의 잔기(F)는 K 또는 R일 수 있다.
도 7은 항 RGD 항체의 경쇄에 있어서의 상보성 결정영역(CDR)을 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 항 RGD 항체와 RGD 서열을 함유하는 각종 세포외 매트릭스 단백질과의 결합을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 항 RGD 항체의 mOPN N-half와 암세포(NIH3T3 세포)에 있어서의 세포접착 저해효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 항 RGD 항체의 각종 세포외 매트릭스 단백질과 암세포(NIH3T3 세포)에 있어서의 세포접착 저해효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 항 RGD 항체의 간염 발증 억제효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 실험적 폐 전이 모델로 항 RGD 항체의 폐 전이 억제효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다(A: 전이세포 수, B: 체중의 추이).
도 13은 자연적 폐 전이 모델로 항 RGD 항체의 폐 전이 억제효과를 조사한 결과를 나타내는 도면이다(A: 종양 사이즈, B: 전이세포 수, C: 체중의 추이).
도 14는 항 RGD 항체의 류머티즘 병태 모델에 있어서의 류머티즘의 치료효과를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명자 등은 이하의 점을 주의 깊게 진행함으로써, 마우스와 인간의 세포외 매트릭스 단백질에 존재하는 아미노산 서열 RGD에 특이적으로 반응하는 마우스·단일클론 항체를 얻을 수 있었다.
먼저, 마우스의 병태 모델로 약효를 평가할 목적도 있어, RGD 서열의 단일클론 항체를 제작함에 있어서, 인간 OPN의 아미노산 서열이 아닌, 마우스 OPN으로부터 설계한 RGD 서열을 포함하는 부분 펩티드로 마우스로의 단일클론 항체 제작을 시도하였다. 그 결과, 일반적으로는 불가능하다고 생각되는 마우스 OPN의 부분 펩티드로 마우스의 단일클론 항체 8 종류를 제작할 수 있었다. 얻어진 단일클론 항체는 RGD 서열을 인식하는 항체인 것을 확인하였다. 또한, 얻어진 단일클론 항체는 항체에 따라 반응성은 상이하지만, RGD 서열을 함유하는 인간의 세포외 매트릭스 단백질과 교차 반응하는 것을 발견하였다. 또한, 이들의 단일클론 항체는 RGD 서열과 인테그린의 결합을 저해하는 것도 확인하였다.
다음으로, 얻어진 단일클론 항체의 생각되는 약효를 병태 모델·마우스로 평가하였다. ConA 투여로 발증하는 극증 간염 모델에 있어서 얻어진 단일클론 항체 투여로 간염의 지표인 AST와 ALT가 명확하게 저하되는 것이 관찰되었다. 또한, 암 전이의 모델인 실험적 암 전이 모델과 자연적 암 전이 모델에서 얻어진 단일클론 항체의 암 전이 억제효과를 검토하였다. 즉, 실험적 암 전이 모델에서는 마우스의 정맥내에 마우스의 암세포 B16-Luc를 투여하고, 마우스의 폐에 있어서의 암 전이의 수를 계측하고, 자연적 암 전이 모델에서는 B16-BL6 세포를 마우스의 발바닥에 투여한 후, 그 폐로의 전이 수를 계측하여, 얻어진 단일클론 항체의 암 전이 억제효과를 조사하였다. 그 결과, 양 모델에 있어서 얻어진 단일클론 항체가 암 전이의 억제효과를 나타내었다. 또한 Type II 콜라겐 항체 칵테일과 LPS 투여에 의한 류머티즘 발증 모델·마우스에서 얻어진 단일클론 항체가 명확한 류머티즘에 치료효과를 나타내는 것도 확인하였다.
1. 본 발명의 항 RGD 항체
본 발명은 RGD 서열에 대한 단일클론 항체를 제공한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 인간 및 마우스의 세포외 매트릭스 단백질의 아미노산 서열 RGD를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 제공한다.
본 명세서 중 「세포외 매트릭스 단백질」이란, 세포외 매트릭스를 구성하는 단백질을 말하는 것으로 하고, 이들에는, 예를 들면 오스테오폰틴, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폰빌레브란트인자, 콜라겐, 라미닌, 테나신, 피브리노겐, 트롬보스폰딘, 안지오스타틴, 플라스민, VCAM-1 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서 중 「세포외 매트릭스」는 당해 분야에서 통상 사용되는 의미에 따라, 조직 중의 세포외의 공간을 채우고 있는 생체 고분자의 복잡한 집합체를 말하는 것으로 한다(예를 들면, 「분자세포생물학 사전」, 323 페이지, 동경화학동인(1997)을 참조). 또한, 본 명세서 중 「세포외 매트릭스 단백질」이라는 용어는 「세포외 매트릭스 분자」와 호환적으로 사용된다.
본 명세서 중, 「항체」란, 항체분자 전체 또는 그의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2 등의 단편)을 의미하고, 다중클론 항체여도 되고 단일클론 항체여도 된다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서는 단일클론 항체를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 「항체」는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 포함한다.
본 명세서 중, 항체가 있는 단백질 또는 그의 단편을 「특이적으로 인식한다」란, 그 항체가 다른 아미노산 서열에 대한 그의 친화성보다도, 이들의 단백질 또는 그의 단편의 특정 아미노산 서열에 대해 실질적으로 높은 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 여기서, 「실질적으로 높은 친화성」이란, 목적하는 측정장치에 의해, 그 특정 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로부터 구별하여 검출하는 것이 가능할 정도로 높은 친화성을 의미하고, 전형적으로는 결합상수(Ka)가 107M-1 이상, 바람직하게는 108M-1 이상, 보다 바람직하게는 109M-1, 더욱 바람직하게는 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1 또는 그보다 높은, 예를 들면 최고 1013M-1 또는 그보다 높은 것인 결합 친화성을 의미한다.
본 명세서 중 「항 RGD 항체」란, 단백질 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 중의 RGD 서열을 특이적으로 인식하는 항체를 의미한다.
본 명세서 중 「단일클론 항체」란, 실질적으로 균질한 항체의 집단, 즉 집단을 구성하는 개개의 항체가 천연에 있어서 일어날 수 있는 소량으로 존재하는 변이체를 제외하고는 균일한 항체집단으로부터 얻어진 항체를 가리킨다. 단일클론 항체는 고도로 특이적으로, 단일 항원부위에 대해 작용하는 것이다. 또한, 상이한 에피토프에 대한 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체와 비교하여, 각 단일클론 항체는 항원상의 단일 에피토프로 향해진다. 그 특이성에 더하여, 단일클론 항체는 다른 면역 글로불린이 혼재하지 않는 하이브리도마의 배양에 의해, 균일한 항체가 항상적으로 합성되어, 보다 간편하게 정제할 수 있는 측면에서 유리하다. 「단일클론」이라는 수식어는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체의 특성을 시사하는 것으로, 항체가 특정의 방법에 의해 제조되는 것을 한정하는 것은 아니다.
본 명세서 중 「항체 단편」이란, 전장 항체의 일부를 가리키고, 항원결합영역 또는 가변영역을 말한다. 예를 들면, 항체 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편이 포함된다. 이들의 항체 단편은 항체의 파파인 소화, 펩신 소화 등 일반적으로 알려져 있는 방법으로 제작할 수 있다.
상기 「키메라 항체」란, 본 발명에서 얻어진 항 RGD 항체의 정상영역(定常領域)을 인간의 항체와 동일한 정상영역을 갖도록 유전자 공학적으로 개변한 인간·마우스·키메라 항체(유럽 특허공개 공보 EP0125023 참조)를 가리킨다. 「인간화 항체」란, 본 발명에서 얻어진 항 RGD 항체의 H 사슬과 L 사슬의 상보성 결정영역 이외의 1차 구조를 인간의 항체에 대응하는 1차 구조로 유전자 공학적으로 개변한 항체를 말한다. 「인간 항체」란, 인간의 항체생산에 관여하는 유전자를 도입한 형질전환 동물을 사용하여 제작한 단일클론 항체(유럽 특허공개 공보 EP0546073 참조)를 의미한다.
본 발명에 있어서 특히 바람직한 항체는, 본 명세서의 실시예에 나타내어지는 수탁번호 FERM BP-10440, FERM BP-10441로 표시되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항 RGD 항체이다.
이하, 항 RGD 단일클론 항체의 제작에 대해서 상세하게 기술하나, 항체의 제작방법은 이것에 한정되는 것은 아니다.
2. RGD 서열 함유 펩티드(항원)
본 발명에 있어서 항원으로서 사용하는 RGD 서열 함유 펩티드에는, 예를 들면 본 실시예에 있어서 사용한 마우스의 세포외 매트릭스 단백질의 세포접착 서열인 RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열 CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)과 같이, 세포접착 서열인 「RGD」 서열을 적어도 포함하고, 면역에 의해 RGD 서열에 대한 항체를 생산하는 것이 가능한 아미노산 서열로 되는 펩티드가 포함된다.
이와 같은 「RGD 서열 함유 펩티드」, 「RGD 서열을 함유하는 펩티드」, 또는 「RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열로 되는 펩티드」의 예로서는, RGD 서열을 함유하는 세포외 매트릭스 단백질로서 알려져 있는 오스테오폰틴(OPN), 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폰빌레브란트인자, 콜라겐, 라미닌, 테나신, 피브리노겐, 트롬보스폰딘 등의 RGD 서열 함유 펩티드가 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서 「RGD 서열 함유 펩티드」, 「RGD 서열을 함유하는 펩티드」, 또는 「RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열로 되는 펩티드」는 약 5개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 5~약 50개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 10개~약 20개의 아미노산으로 되는 아미노산 서열이다. 또한, 본 명세서 중 「RGD 서열 함유 펩티드」라는 용어는, 「RGD 서열을 함유하는 펩티드」 또는 「RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열로 되는 펩티드」와 호환적으로 사용된다.
여기서, 실질적으로 동등한 항원성을 갖는 한, 그 아미노산 서열에 있어서 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 수개(예를 들면, 1 내지 5개)의 아미노산이 치환, 결실, 및/또는 수식되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 변이 폴리펩티드, 또는 그 아미노산 서열 중에 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 수개(예를 들면, 1 내지 5개)의 아미노산이 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 변이 폴리펩티드도 본 발명에 있어서 사용하는 「RGD 서열 함유 펩티드」 또는 「RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열로 되는 펩티드」에 포함된다. 또한, 「RGD 서열 함유 펩티드」 또는 「RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열로 되는 펩티드」는 그와 같은 치환, 결실, 수식, 부가, 및 삽입을 복수 갖는 변이 폴리펩티드여도 된다.
본 발명에 있어서 사용하는 RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열로 되는 펩티드는 화학적 합성법 외에, 유전자 재조합 기술, 세포배양방법 등과 같은 당해 기술분야에서 공지의 방법 또는 그의 수식방법을 적절히 사용함으로써 제조할 수 있다. 단리된 세포외 매트릭스 단백질을 단백 분해효소 등에 의해 적절히 절단함으로써 제조할 수 있다. 또한, RGD 서열을 포함하는 아미노산 서열로 되는 펩티드는 마우스, 랫트, 인간, 돼지, 원숭이, 소, 토끼 등의 포유동물 유래의 것일 수 있으며, RGD 서열에 대한 항체를 생산하는 것이 가능한 RGD 서열 함유 펩티드이면, 그 제법은 특별히 한정되지 않는다.
상기의 RGD 서열을 함유하는 펩티드를, 추가적으로 그 항원성을 높이기 위해 다른 생체 고분자와 결합시켜도 된다. 이와 같은 항원성을 높이는 생체 고분자의 예로서는 티로글로불린, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 난백 알부민(OVA), 소·글로불린 등이 있으나, 티로글로불린이 보다 바람직하다. 또한, RGD 서열을 포함하는 펩티드와 생체 고분자의 결합은 커플링 시약법(활성 에스테르와 말레이미드의 관능기를 갖는 결합시약: 활성 에스테르로 단백질 또는 펩티드의 아미노기와, 말레이미드로 단백질 또는 펩티드의 SH기와 결합한다.)(S. Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399, 1979.), 혼합 산무수물법(B. F. Erlanger et al., J. Biol. Chem., 234, 1090-1094, 1954.), 활성 에스테르법(A. E. Karu et al., J. Agric. Food Chem., 42, 301-309, 1994.) 등이 있고, 바람직한 방법으로서는 커플링 시약법이다.
3. 항체 생산세포의 조제
항원은 면역되는 동물에 대해 투여에 의해 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에 항체 생산능을 높이기 위해, 완전 프로인트 애쥬번트나 불완전 프로인트 애쥬번트를 투여해도 된다. 투여는 통상 1~6주 간격으로 1회씩, 총 2~10회 정도 행해진다. 사용되는 온혈동물로서는, 예를 들면 마우스, 원숭이, 토끼, 개, 기니피그, 랫트, 햄스터, 양, 염소, 닭 등을 들 수 있으나, 본 발명에서는 마우스가 바람직하게 사용된다.
치료의 대상이 인간이고, 항 RGD 항체 생산동물이 마우스인 경우에는 인간·마우스·키메라 항체나 인간화 항체를 사용하는 것이 바람직하고, 더 나아가서는 항체 생산에 관여하는 인간 유전자를 도입한 마우스 등의 트랜스제닉 동물을 사용하여 인간형 단일클론 항체를 제작하여 사용하는 것이 바람직하다.
4. 항체 생산세포와 골수종 세포의 세포융합
골수종 세포로서는 마우스, 랫트, 인간 등에 유래하는 세포가 사용된다. 예를 들면, 마우스 골수종 P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14, P3X63-Ag8-653 등을 들 수 있으나, 항체 생산세포와 골수종 세포는 동종 동물, 특히 동계통의 동물 유래인 것이 바람직하다. 골수종 세포는 동결 보존하거나, 소 태아 혈청을 첨가한 일반적인 배지에서 계대하여 유지할 수 있다. 세포융합에는 대수 증식기의 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 P3X63-Ag8-653이 바람직하게 사용된다.
항체 생산세포와 골수종 세포를 융합시켜서 하이브리도마를 형성시키는 방법으로서는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하는 방법, 센다이 바이러스를 사용하는 방법, 전기융합장치를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 예를 들면, PEG법의 경우, 약 30~60%의 PEG(평균분자량 1000~6000)를 포함하는 적당한 배지 또는 완충액 중에 비장 세포와 골수종 세포를 1~10:1, 바람직하게는 5~10:1의 혼합비로 현탁하고, 온도 약 25~37℃, pH 6~8의 조건하에서 약 30초~5분간 정도 반응시키면 된다. 반응 종료 후, PEG 용액을 제거하여 배지에 재현탁하고, 셀 웰 플레이트 중에 파종하여 배양을 계속한다.
5. 하이브리도마 세포의 선별
단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별은 공지 또는 그에 준하는 방법에 따라서 행할 수 있다. 통상, HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)를 첨가한 동물세포용 배지에서 행할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는 하이브리도마 세포를 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 사용해도 된다. 예를 들면, 1~20%, 바람직하게는 10~20%의 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지, 1~10%의 소 태아 혈청을 포함하는 GIT 배지(와코순약공업(주)) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청배지(SFM-101, 닛스이제약(주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상 20~40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 배양시간은 통상 5일~3주간, 바람직하게는 1주간~2주간이다. 배양은 통상 5% CO2하에서 행할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체의 생산은 림프구 기능 탐색법(야다 준이치, 후지와라 미치오 편저, 중외의학사, 588-592페이지, 1994)에 기재되는 ELISA법을 사용하여 확인 및 스크리닝할 수 있다. ELISA로 양성반응이 얻어진 클론으로부터 한계희석법을 1~5회, 바람직하게는 2~4회 반복함으로써 단일클론 항체를 조제할 수 있다. 세포융합으로 얻어진 각종 하이브리도마로부터 RGD 서열에 반응하는 클론을 얻기 위해, 항원으로서 RGD 서열을 포함하는 펩티드, 예를 들면 CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)을 96 웰 플레이트에 고상화하고, 하이브리도마의 배양상청과 반응시킨 후, 효소 표지 항 마우스 IgG 항체로 검출하는 ELISA법으로 RGD 서열을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다.
6. 항체의 분리정제
얻어진 항체는 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 된다. 예를 들면 겔여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절히 선택, 조합하면 항체를 분리, 정제할 수 있지만(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들에 한정되는 것은 아니다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 담체로서는 항원결합 수지, 프로테인 A 결합 수지, 프로테인 G 결합 수지를 들 수 있다. 항원결합 수지로서, 티올세파로오스비즈(Amersham Biosciences) 등이 있고, 여기에 항원으로서 RGD 서열을 포함하는 펩티드, 예를 들면 CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)을 결합한 담체를 사용한 친화성 크로마토그래피가 바람직하다.
7. 항체의 제제
이와 같이 하여 얻어진 단일클론 항체는 통상의 방법에 따라서 제제화하고, 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 및 골질환 등의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다. 이들의 예방 및/또는 치료제로서의 제형은 주사제, 점적용제 등의 비경구제제로 할 수 있고, 창의 고안에 의해 경구제제로서 사용할 수 있다. 또한, 제제화에 있어서는 약사상 및 약학적으로 허용되는 범위내에서 제형에 적합한 담체, 희석제 또는 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체를 유효성분으로 하는 제제는 암, 예를 들면 암세포의 증식, 전이, 염증성 질환(예를 들면 변형성 관절증, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화, 다발성 경화증, 염증성 장질환(궤양성 대장염, 클론병)), 감염증(예를 들면 간염), 자기면역질환(예를 들면 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 다발성 근염, 자기면역성 갑상선 질환, 요세관 간질성 신염, 중증 근무력증) 및 골질환(예를 들면 골다공증) 등의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다.
투여량은 투여대상, 대상질환, 증상, 투여 루트 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들면 암 환자의 예방 및/또는 치료를 위해 사용하는 경우에는 본 발명의 항체를 1회량으로서 통상 0.01~20 ㎎/㎏ 체중 정도, 바람직하게는 0.1~10 ㎎/㎏ 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1~5 ㎎/㎏ 체중 정도를 한달에 1~10회 정도, 바람직하게는 한달에 1~5회 정도, 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 비경구투여 및 경구투여의 경우도 이에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 심한 경우에는 그 증상에 따라서 증량 또는 투여횟수를 증가시켜도 된다.
본 발명의 항체는 그 자체 또는 적당한 의약 조성물로서 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 의약 조성물은 상기 항체 또는 그의 염과 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것이다. 이와 같은 조성물은 비경구투여 또는 경구에 적합한 제형으로서 제공된다.
즉, 비경구투여를 위한 조성물로서는, 예를 들면 주사제, 점비제, 좌제 등이 사용되고, 주사제는 정맥주사제, 피하주사제, 피내주사제, 근내주사제, 점적주사제 등의 제형을 포함한다. 이와 같은 주사제는 공지의 방법에 따라서, 예를 들면 상기 항체 또는 그의 염을 통상 주사제에 사용되는 무균의 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제한다. 주사용 수성액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당, 자당, 만니톨 등 기타 보조제를 포함하는 등장액 등을 사용할 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올(예, 에탄올), 폴리알코올(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제〔예, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, HCO-50(polyoxyethylene(50 ㏖) adduct of hydrogenated castor oil)〕 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는, 예를 들면 참기름, 대두유 등이 사용되고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알코올 등을 병용해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플, 바이알, 시린지에 충전된다. 점비제나 좌제는 상기 항체를 통상의 점비제용 기제, 좌제용 기제에 혼합함으로써 조제된다. 또한, 일반적으로 항체 등의 단백질의 경구투여는 소화기에 의해 분해되기 때문에 곤란한 것으로 여기어지나, 항체 단편이나 수식한 항체 단편과 제형의 창의 고안에 의해 경구투여의 가능성도 있다.
상기의 비경구용 의약 조성물은 활성성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 조제되는 것이 바람직하다. 이와 같은 투약 단위의 제형으로서는 주사제(앰플, 바이알, 프리필드·시린지), 점비제, 좌제 등이 예시되고, 각각의 투약단위 제형당 통상 5~500 ㎎, 특히 주사제로는 5~100 ㎎, 기타 제형으로는 10~250 ㎎의 상기 항체가 함유되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기한 각 조성물은 상기 항체와의 배합에 의해 바람직하지 않은 상호작용을 발생하지 않는 한 다른 활성성분을 함유해도 된다.
8. 본 발명의 단일클론 항체를 함유하는 진단제
본 발명의 단일클론 항체는 염증성 질환, 예를 들면 류머티즘 관절염, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 암 전이, 동맥경화, 다발성 경화증, 육아종 등의 진단제, 또한 장기 이식 후의 만성 거부반응 억제, 전신성 자기면역질환·에리테마토데스·포도막염·베체트병·다발성근염·사상체 증식성 신염·사르코이도시스 등의 자기면역질환의 진단제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체는 RGD 서열을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 세포외 매트릭스 단백질의 정량을 샌드위치 면역측정법, 경합 면역측정법, 이뮤노메트리법 또는 네프로메트리법 등으로 가능하다. 이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 측정방법에 적용함에 있어서는 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요로 하지 않는다. 각각의 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 더하여 측정 시스템을 구축하면 된다. 이들의 일반적인 기술수단의 상세에 대해서는 총설, 서적 등을 참조할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명의 항체를 사용함으로써, 세포외 매트릭스 단백질을 감도 좋게 정량할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 사용하는 생체내에서의 세포외 매트릭스 단백질의 정량법을 이용함으로써, 세포외 매트릭스 단백질이 관련된 각종 질환의 진단을 할 수 있다. 예를 들면, 세포외 매트릭스 단백질의 농도의 증감이 검출된 경우는 세포외 매트릭스 단백질이 관련된 질환, 예를 들면 염증성 질환일 가능성이 높거나 또는 장래 앓을 가능성이 높다고 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 체액이나 조직 등의 피검체 중에 존재하는 세포외 매트릭스 단백질의 RGD 서열을 특이적으로 검출하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 세포외 매트릭스 단백질을 정제하기 위해 사용하는 항체 칼럼의 제작, 정제시의 각 분획에 포함되는 세포외 매트릭스 단백질의 검출, 피검세포 내에 있어서의 세포외 매트릭스 단백질의 거동의 분석 등에 사용할 수 있다.
이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이것은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 항체 제작방법
세포외 매트릭스 단백질의 세포접착서열인 RGD 서열과 SLAYGLR 서열(서열번호 25)을 포함하는 CVDVPNGRGDSLAYGLR 서열(서열번호 13)을 합성하고, EMCS(Dojin사)를 매개로 티로글로불린(Sigma사)에 결합시켜, 이것을 면역원으로서 애쥬번트와 함께 마우스에 면역하였다. 4회 면역 후, 비장세포를 회수하여, 골수종 세포 X63-Ag8-653과 세포융합하였다. HAT 배지에서 선택한 후, 항원 펩티드를 고상(固相)한 ELISA법으로 배양상청의 스크리닝을 행하여, RGD 서열을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마(8 클론: 4P11, 11M6, 25H15, 29R5, 30C17, 33E10, 35B6, 38I8)를 선택하였다. 티올세파로오스비즈(아마샴 바이오사이언스사)를 사용하여 항원 펩티드 칼럼을 제작하고, 하이브리도마의 배양상청으로부터 항체를 정제하였다.
또한, 여기서 얻어진 하이브리도마 세포 33E10 및 35B6는 각각 수탁번호 FERM BP-10440 및 FERM BP-10441로서 2005년 10월 27일에 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6(우편번호 305-8566), 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁되어 있다.
실시예 2: 에피토프의 해석
[해석에 사용한 펩티드]
합성한 마우스 OPN 유래의 부분 펩티드를 포함하는 mOPN1(CLPVKTDSGSSEEKLY(서열번호 14)), mOPN5(CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)), CVDVPNGRGDS(서열번호 15), CPNGRGD(서열번호 16), CGRGDSLAYGLR(서열번호 17), CGDSLAYG(서열번호 18), CGDSLAYGLR(서열번호 19) 및 CSLAYGLR(서열번호 20), 인간 OPN 유래의 부분 펩티드 hOPN5(CVDTYDGRGDSVVYGLRS(서열번호 21)) 및 CSVVYGLR(서열번호 22), 마우스와 인간 공통의 부분 펩티드를 포함하는 CGRGDS(서열번호 23)를 EMCS(Dojin사)를 매개로 BSA(Sigma사)에 결합시켜 ELISA 해석용 펩티드로서 사용하였다.
[ELISA법]
96 웰 플레이트에 펩티드(10 ㎍/㎖), 또는 단백질(5 ㎍/㎖)을 37℃, 1시간 방치하여 고정화하고, 0.1% BSA/PBS/0.05% NaN3 용액으로 블로킹한 후, 항체를 각종 농도로 37℃, 1시간 반응시켰다. 다음으로 2차 항체로서 HRP 표지 항 마우스 IgG 항체(Jackson사)를 37℃, 30분 반응시킨 후, OPD로 15분간 발색, 1N H2SO4로 반응을 정지시켜, 490 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.
[에피토프 맵핑]
합성한 펩티드의 티로글로불린 결합체를 각각 고정화한 96 웰 플레이트로 ELISA를 행하였다.
그 결과, 도 1, 2, 3, 4 및 5에 나타내는 바와 같이, 4P11, 11M6, 25H5, 35B6 및 33E10은 mOPN5 및 hOPN5와 결합한 것으로부터 마우스와 인간의 양쪽 부분 펩티드를 인식하는 항체였다. 그 중에서, 33E10은 RGD 서열 이후의 서열을 포함하 는 CSLAYGLR(서열번호 20), CSVVYGLR(서열번호 22)에는 반응하지 않고, CGRGDS(서열번호 23), CVDVPNGRGDS(서열번호 15) 및 CPNGRGD(서열번호 16)와 반응한 것으로부터, 이들 펩티드의 공통 서열인 RGD를 인식하는 항체이고, 마우스와 인간의 양쪽에 반응성을 나타내는 항체였다. 또한, 35B6는 CGRGDS(서열번호 23), CVDVPNGRGDS(서열번호 15) 및 CPNGRGD(서열번호 16)에 반응하지 않고, CGRGDSLAYGLR(서열번호 17), CGDSLAYG(서열번호 18), CGDSLAYGLR(서열번호 19)에 반응한 것으로부터, RGD 서열의 GD를 포함하는 RGD 서열 이후의 서열도 인식하는 항체인 것이 시사되었다. 29R5, 30C17 및 38I8은 GRGDS(서열번호 24), SLAYGLR(서열번호 25) 또는 SVVYGLR(서열번호 26)과 약간의 반응성도 보였지만, mOPN5와만 반응하는 것으로부터, 마우스의 OPN의 VDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 27)을 인식하는 항체였다.
실시예 3: 항체의 아미노산 서열 해석
하이브리도마 세포를 RNeasy Mini 키트(Qiagen사)를 사용하여 RNA를 추출하고, First-strand cDNA 합성 키트(아마샴 바이오사이언스사)로 cDNA를 제작하였다. Heavy primer 증폭 키트(아마샴 바이오사이언스사)를 사용하여 PCR을 행하고, 항체의 중쇄(Heavy chain) cDNA를 신장시켜, pCRII-TOPO 벡터(invitrogen사)에 삽입하고, cDNA 서열, 아미노산 서열을 결정하였다. CDR영역은 ABG: Directory of 3D structures of antibodies(http://www. ibt. unam. mx/vir/structure/structures. html)와 blast for Ig sequence(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast)를 이용 하여 결정하였다.
그 결과, 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 CDR영역은 도 6 및 도 7에 나타내는 아미노산 서열로 되었다. 구체적으로는 이하와 같다.
Figure 112009030372817-PCT00001
Figure 112009030372817-PCT00002
또한, 본 실험에서는 ABG를 사용하여 CDR영역을 결정하였는데, 사용하는 소프트웨어에 따라 얻어지는 결과에 다소 차이가 발생할 수 있는 것은 당업자에게 이해될 수 있다.
실시예 4: RGD 를 갖는 세포외 매트릭스 단백질과의 결합
[해석에 사용한 단백질]
인간·오스테오폰틴(hOPN), 마우스·오스테오폰틴(mOPN)은 각각의 유전자를 도입한 CHO-K1 세포의 배양상청으로부터 항 OPN 항체 칼럼을 사용하여 정제하였다. 인간·비트로넥틴(VN)은 아사히 테크노글래스사로부터 인간·피브로넥틴(FN), 인간·트롬보스폰딘, 마우스·라미닌은 Sigma사로부터 입수하였다.
[ELISA법]
96 웰 플레이트에 펩티드(10 ㎍/㎖), 또는 단백질(5 ㎍/㎖)을 37℃, 1시간 방치하여 고정화하고, 0.1% BSA/PBS/0.05% NaN3 용액으로 블로킹한 후, 항체를 각종 농도로 37℃, 1시간 반응시켰다. 다음으로 2차 항체로서 HRP 표지 항 마우스 IgG 항체(Jackson사)를 37℃, 30분 반응시킨 후, OPD로 15분간 발색, 1N H2SO4로 반응을 정지시켜, 490 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.
[세포 매트릭스와의 결합능]
hOPN, mOPN, FN, VN 또는 라미닌을 각각 고정화한 96 웰 플레이트를 사용하여 ELISA를 행하였다.
그 결과를 도 8에 나타낸다. 33E10은 라미닌에서의 반응성은 낮지만, 조사한 모든 세포외 매트릭스 단백질과 교차 반응하는 것이 시사되었다. 35B6는 hOPN과 mOPN에는 반응하지만, FN, VN 및 라미닌에는 반응하지 않는 것을 알 수 있었다.
실시예 5: 세포접착시험
[해석에 사용한 단백질]
인간·오스테오폰틴(hOPN), 마우스·오스테오폰틴(mOPN)은 각각의 유전자를 도입한 CHO-K1 세포의 배양상청으로부터 항 OPN 항체 칼럼을 사용하여 정제하였다. mOPN N-half는 마우스 OPN의 트롬빈 절단부위의 N 말단을 GST 융합 단백질로서 대장균으로부터 정제하였다. 인간·피브로넥틴(FN), 인간·비트로넥틴(VN)은 Sigma사로부터 입수하였다.
[세포접착시험 방법]
단백질을 96 웰 플레이트에 50 ㎕씩 첨가하고, 37도에서 1시간 정치함으로써 고정화하였다. 블로킹액(0.5% BSA/PBS)으로 블로킹한 후, PBS로 1번 세정하고, 0.25% BSA 첨가 D-MEM으로 현탁한 NIH3T3 세포와 단일클론 항체를 혼합시켜, 1.0×105 개/㎖가 되도록 200 ㎕씩 첨가하였다. 37℃, 5% CO2하에서 1시간 반응시킨 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛(WAKO, Osaka, Japan)/20% 메탄올 용액을 50 ㎕씩 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 방치함으로써 세포의 고정과 염색을 행하였다. 증류수로 플레이트를 세정한 후, 20% 초산용액으로 전용(轉溶)하여, 590 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.
[세포접착 저해능]
mOPN N-half를 고정화한 96 웰 플레이트에 NIH3T3 세포와 33E10 또는 35B6를 혼화한 용액을 넣고, NIH3T3 세포의 mOPN N-half와의 접착에 미치는 항체의 영향을 검토하였다(도 9). 또한, mOPN N-half, FN 또는 VN을 각각 고정화한 96 웰 플레이트에 NIH3T3 세포와 33E10을 혼화한 용액을 넣고, 각각의 단백질로의 세포의 접착에 미치는 항체의 영향을 검토하였다(도 10).
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타내는 바와 같이, NIH3T3 세포는 mOPN N-half에 접착하여, 항 RGD 항체에서 세포접착이 저해되어, 33E10은 35B6와 비교하여 RGD 의존성 접착 저해능이 높았다. 또한, NIH3T3 세포는 검토한 모든 세포외 매트릭스 단백질로 접착하는 것이 확인되고, 33E10은 mOPN N-half와의 세포접착을 저해하지만, FN 및 VN과의 세포접착을 저해하지 않아, OPN과 세포의 접착을 특이적으로 저해한다고 시사되었다.
실시예 6: 간염 억제시험
[간염 모델 동물]
간염은 C57BL/6 마우스에 콘카나발린 A(ConA)(200 ㎍/마리)를 꼬리 정맥 투 여하여, 12시간 후에 간염 마커인 ALT, AST를 조사하는 모델을 사용하였다.
[간염 치료효과]
단일클론 항체를 400 ㎍/마리를 꼬리 정맥으로 투여하고, 3시간 후에 ConA를 투여한 후, 그 12시간 후에 ALT, AST를 측정하였다. 또한, 마우스는 1군 5마리로 실시하고, 대조 항체로서 마우스 IgG를 사용하였다.
그 결과를 도 11에 나타내는데, 25H15는 간염발증을 전혀 억제하지 않고, 4P11, 11M6, 29R5, 30C17 및 38I8은 약간의 억제효과를 나타내었지만, 33E10 및 35B6는 ALT, AST의 활성 상승이 전혀 관찰되지 않기 때문에, 간염발증을 억제하는 것이 시사되었다.
실시예 7: 암 전이 억제실험
[암 전이 모델 동물]
실험적 폐 전이 모델은 C57BL/6 마우스에 마우스 흑색종 세포주 B16-Luc 세포(1×105 개/마리)를 꼬리 정맥 투여하고, 14일 후에 폐 전이 수를 조사하는 모델을 사용하였다.
자연적 폐 전이 모델은 C57BL/6 마우스의 오른쪽 뒷발바닥에 B16-BL6 세포(4×105)를 피하 접종하였다. 접종 19일 후에 원발 종양을 외과적으로 절제하였다. 원발 종양 절제 14일 후(B16-BL6 세포 투여 후 33일 후)에 희생사시켜 폐에서의 종양 콜로니 수를 계측하였다.
[암 전이 억제효과]
실험적 폐 전이 모델에서는 단일클론 항체 400 ㎍/마리와 B16-Luc 세포를 혼화하여 동시에 투여하고, 14일 후에 폐 전이 수를 조사하였다. 또한, 대조 항체로서 동일 서브클래스(mIgG1) 항체를 사용하였다.
그 결과, 도 12에 나타내는 바와 같이, 대조에 비해, 33E10과 35B6 모두 폐 전이 수의 평균은 저하되고, 35B6는 유의하게 폐 전이를 억제하였다.
한편, 자연적 폐 전이 모델에 있어서는 단일클론 항체를 종양 이식 후 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 및 17일째에 200 ㎍을 합계 8회 복강내 투여하고, 종양 이식 후 19일째에 원발 종양을 외과적으로 절제하기까지의 원발 종양의 사이즈를 측정하였다. 또한, 원발 종양 절제 후 14일째에 있어서의 폐에서의 종양 콜로니 수를 계측하였다. 또한, 대조 항체로서 동일한 서브클래스(mIgG1) 항체를 사용하였다.
원발 종양 사이즈의 경일적 변화 및 폐 전이된 종양 수를 도 13에 나타낸다. 33E10과 35B6의 투여에 의해, 원발 종양 사이즈는 대조에 비해 유의하게 작아, 33E10과 35B6는 모두 종양의 증식을 억제하는 효과가 확인되었다. 또한, 대조 5마리 중 2마리의 전이 종양 수가 많았기 때문에, 35B6는 통계적으로 유의차가 얻어지지 않았지만, 전이 종양 수의 평균에 있어서 33E10과 35B6는 대조에 비교하여 적은 것으로부터, 33E10과 35B6는 모두 암의 폐 전이를 억제하는 것이 시사되었다.
실시예 8: 관절 류머티즘 억제시험
[관절 류머티즘·모델 동물]
관절 류머티즘은 항 type II collagen에 대한 항체를 투여하는 관절용 칵테일(IBL)을 사용하여 설명서에 따라서 발증시켰다. 즉, BALB/c 마우스에 항 type II collagen 항체 칵테일을 투여하고, 3일 후에 LPS를 투여하여 발증시켰다. 또한, 관절염의 평가는, 사지 각각에 대해서 다음에 나타내는 관절염 스코어(0: 증상 없음. 1: 사지의 손가락·발가락 등 소관절이 하나만 종창(腫脹) 발적. 2: 소관절 2개 이상, 또는 손목이나 발목 등의 비교적 큰 관절이 종창 발적. 3: 하나의 손이나 발 전체가 종창 발적. 4: 또한 하나의 손이나 발의 전체적인 종창이 최대한에 도달해 있다. 사지의 합계 최대 16점이 된다.)로 행하였다.
[관절 류머티즘 발증 억제효과]
단일클론 항체는 관절용 칵테일 투여 전날부터 관절용 칵테일 투여의 6일 후까지 매일 200 ㎍을 전체 8회 복강내에 투여하고, 관절용 칵테일 투여 후 매일 관찰하여 관절염 스코어를 산출하였다.
그 결과, 도 14에 나타내는 바와 같이, 33E10과 35B6는 모두 대조에 비해 관절염 스코어가 작아, 33E10과 35B6는 모두 관절 류머티즘 발증을 억제하는 효과를 갖는다고 할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체는 세포외 매트릭스 단백질의 기능억제에 의해, 암(예를 들면 암세포의 증식, 전이), 염증성 질환(예를 들면 변형성 관절증, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화, 다발성 경화증, 염증성 장질환(궤양성 대장염, 클론병)), 감염증(예를 들면 간염), 자기면역질환(예를 들면 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 다발성 근염, 자기면역성 갑상선 질환, 요세관 간질성 신염, 중증 근무력증) 및 골질환(예를 들면 골다공증) 등에 대한 치료효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는 체액, 세포 또는 조직에 있어서의 세포외 매트릭스 단백질을 검출할 수 있는 것으로부터, 진단제로서도 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Gene Techno Science Co. Ltd. <120> Antibody directed to an amino acid sequence RGD of an extracellular matrix protein, a production method and use thereof <130> PCT07-0037 <150> JP 2006-290737 <151> 2006-10-26 <160> 34 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 fragment <400> 1 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 fragment <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 fragment <400> 3 Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr 1 5 10 15 Ser Ala Ser Val Lys Gly 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> DRH2 fragment <400> 4 Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Arg Asn Gly Asp Ser Asn Tyr Asn Glu 1 5 10 15 Lys Phe Arg Ser 20 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 fragment <400> 5 Gly Ala Tyr 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 fragment <400> 6 Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 fragment <400> 7 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 fragment <400> 8 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 fragment <400> 9 Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 fragment <400> 10 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 fragment <400> 11 Gly Ser Phe Val Pro Trp 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 fragment <400> 12 Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 13 Cys Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu 1 5 10 15 Arg <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 14 Cys Leu Pro Val Lys Thr Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 15 Cys Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 16 Cys Pro Asn Gly Arg Gly Asp 1 5 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 17 Cys Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 18 Cys Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 19 Cys Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 20 Cys Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 21 Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu 1 5 10 15 Arg Ser <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 22 Cys Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 23 Cys Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 24 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 25 Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 26 Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 27 Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 15 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 28 Leu Pro Val Lys Val Thr Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 29 Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 15 Ser <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 30 Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 31 Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 32 Pro Asn Gly Arg Gly Asp 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 33 Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> partial peptide <400> 34 Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5

Claims (20)

  1. 서열번호 1~12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
  2. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
  3. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 및 11의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
  4. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
  5. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 및 12의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄의 상보성 결정영역(CDRH)에 있어서의 아미노산 서열로서 서열번호 1~6 중 어느 하나의 아미노산 서열을, 경쇄의 상보성 결정영역(CDRL)에 있어서의 아미노산 서열로서 서열번호 7~12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항 RGD 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간, 마우스, 또는 그 양쪽의 세포외 매트릭스 단백질의 RGD 서열을 특이적 으로 인식하는 항 RGD 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일클론 항체인 항 RGD 항체.
  9. 인간 및 마우스의 세포외 매트릭스 단백질의 RGD 서열을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간, 마우스, 또는 그 양쪽의 세포외 매트릭스 단백질과 RGD 수용체의 결합을 저해하는 항 RGD 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 항체인 항 RGD 항체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 항체인 항 RGD 항체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체인 항 RGD 항체.
  14. 수탁번호 FERM BP-10440, FERM BP-10441로 표시되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항 RGD 단일클론 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항 RGD 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 치료제.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항 RGD 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 진단제.
  17. CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)을 항원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항 RGD 항체의 제조방법.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항 RGD 항체의 상보성 결정영역을 인간 항체에 유전자 공학적으로 삽입한 키메라 항체의 제조방법.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단일클론 항체의 상보성 결정영역을 인간 항체에 유전자 공학적으로 삽입한 인간화 항체의 제조방법.
  20. CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열번호 13)을 항원으로서 사용하는 것을 특징으로 하 는 인간 항체의 제조방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1968648B1 (en) * 2005-12-16 2015-05-06 Catherine M Shachaf Diagnostic system for the detection and diagnosis of skin cancer
DK2075258T3 (da) 2006-10-26 2012-09-17 Gene Techno Science Co Ltd Antistof mod RGD i en aminosyresekvens i et ekstracellulært matrixprotein samt fremgangsmåde til dets fremstilling og dets anvendelse
KR101746861B1 (ko) * 2008-04-24 2017-06-14 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스 세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 특이적인 인간화된 항체 및 그의 용도
JP5781504B2 (ja) * 2009-09-24 2015-09-24 株式会社ジーンテクノサイエンス 細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列ｒｇｄに特異的なヒト化抗体およびそれらの使用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US7238668B1 (en) 1989-09-01 2007-07-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Inhibition of lymphocyte adherence with CS-1-peptides and fragments thereof
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
GB9519667D0 (en) * 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
BR0009791A (pt) * 1999-04-15 2002-01-08 Childrens Medical Center Métodos para modular, para potencializar e para regular para baixo uma resposta imune de tipo 1 em um paciente, para acentuar a produção de uma citoquina associada com resposta imune de tipo 1, para regular para baixo a produção de uma citoquina associada com resposta imune de tipo 2, para estimular produção de interleucina-12 (il-12) por um macrófago, para inibir a produção de interleucina-10 (il-10) por um macrófago, para a produção de uma molécula, imunomoduladora, e para modular uma resposta imune em uma célula, células de tumor modificadas, e hospedeira, moléculas imunomoduladora biossintética, e de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, e, composição farmacêutica
WO2001071358A1 (en) 2000-03-23 2001-09-27 Glaxo Group Limited Method of screening for inhibitors of osteopontin
BR0208809A (pt) * 2001-04-05 2004-03-09 Immuno Biolog Labiratories Co Anticorpo de anti-osteopontina, agente terapêutico para tratar doenças autoimunes, método e kit de detecção de anormalidades inflamatórias e uso do anticorpo
KR20040048899A (ko) * 2001-09-25 2004-06-10 가부시키가이샤 멘에키세이부츠 켄큐죠 재조합 항-오스테오폰틴 항체 및 그의 용도
EP1637159A4 (en) 2003-05-23 2009-01-21 Immuno Biological Lab Co Ltd IMMUNOMETIMENT CELL ACTIVATION INHIBITOR AND ITS USE
DK2075258T3 (da) 2006-10-26 2012-09-17 Gene Techno Science Co Ltd Antistof mod RGD i en aminosyresekvens i et ekstracellulært matrixprotein samt fremgangsmåde til dets fremstilling og dets anvendelse
KR101746861B1 (ko) * 2008-04-24 2017-06-14 가부시키가이샤 진 테크노 사이언스 세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 특이적인 인간화된 항체 및 그의 용도

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