JP5736176B2 - 細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列rgdに特異的なヒト化抗体およびその使用 - Google Patents
細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列rgdに特異的なヒト化抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Description
本発明は、細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列RGD(Arg−Gly−Asp)を免疫特異的に認識するヒト化抗体、ならびに癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、骨疾患などを含めた種々の疾患または障害に対するその治療および診断的使用に関する。
細胞接着は、多細胞生物の生命維持に重要な役割を果たしている。多細胞生物の細胞接着は、細胞−細胞外マトリックス(以下「ECM」と略記する)間接着と細胞間接着に分類される。細胞−ECM間接着はインテグリンによって媒介され、細胞間接着はカドヘリン、クローディンおよびネクチンによって媒介されることが解明されている。
RGD配列を介したインテグリンとの相互作用を阻害する小分子、OPNに対する抗体、インテグリンに対する抗体などの薬物は報告されているが、RGD配列を特異的に認識する抗体に関する報告はまだない。RGD配列はECMタンパク質の保存配列の1つであるので、RGD配列を特異的に認識する抗体は、ヒトと治療モデル動物の両方で効果を有する可能性があり、したがって治療薬の開発に非常に有用な有効成分とみなすこともできる。したがって、このようなRGD配列を特異的に認識する抗体が必要とされている。
本明細書では、「抗体」という用語は、所望の抗原または所望の配列(RGD配列など)に免疫特異的に結合することができる抗体分子を指し、抗体分子全体または抗原結合性フラグメントを含めたそのフラグメントを包含する。
5.1.RGD配列に対する抗体の調製
RGD配列を免疫特異的に認識する抗体は、当技術分野で知られている任意の適当な方法によって生成することができる。
抗体のヌクレオチド配列は、当技術分野でよく知られている、ヌクレオチド配列を操作するための方法、例えば、組換えDNA技術、部位特異的変異誘発、PCRなど(例えば、両文献ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrookら、前掲;およびAusubelら編、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NYに記載の技法を参照されたい)を使用することによって操作することもできる。抗体のエピトープ結合ドメイン領域に、または生物活性を増強もしくは低減する任意の部分にアミノ酸の置換、欠失および/または挿入などの突然変異を導入することもできる。
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来するV領域およびヒト免疫グロブリンに由来する定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野で知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Morrison、Science、229:1202、1985;Oiら、BioTechniques、4:214 1986;Gilliesら、J.Immunol.Methods、125:191〜202、1989;米国特許第5,807,715号;同第4,816,567号;および同第4,816,397号を参照されたい。
マウスV遺伝子のクローニングおよび配列決定
標的のマウスモノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAのクローニングに様々な方法が利用可能である。例えば、SMART RACE cDNA Amplificationキット(BD Biosciences、CA)またはGeneRacerキット(Invitrogen、CA)を使用した5’RACE(rapid amplification of cDNA ends)法が一般に使用されている。5’RACE用の遺伝子特異的プライマーは、VHおよびVLのすぐ下流に結合するように、標的のモノクローナル抗体のH鎖およびL鎖のアイソタイプに基づいて調製することができる。したがって、5’RACEプライマーは、γ1、γ2a、γ2bまたはγ3など、マウスのそれぞれのサブタイプに特異的であるように設計することもできる。あるいは、すべてのサブタイプ用の一般的なプライマーは、サブタイプの中で共通のまたは高度に相同な領域に基づいて設計することもできる。Tsurushitaでは、以下の5’RACEプライマーを例として開示する。
(i)5’−GCCAGTGGATAGACTGATGG−(配列番号82)(マウスγ1、γ2a、γ2bおよびγ3 H鎖のクローニング用)
(ii)5’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−(配列番号83)(マウスκL鎖のクローニング用)。
まず、VHおよびVLの配列に基づいて、CDRの立体構造の維持において潜在的に重要である標的抗体のフレームワーク残基を、例えば、R.Levyら、1989、Biochemistry28:7168〜7175;およびB.Zilberら、1990、Biochemistry29:10032〜10041に記載されている方法によって同定する。通常、VHおよびVLはそれぞれ、構造的に意味ある14のセグメントに分けられ、それは、免疫グロブリンスーパーファミリーのドメイン構造を構成するβ鎖およびループ様構造である。標的抗体由来のセグメントのそれぞれのアミノ酸配列は、PDBデータベース(H.M.Bermanら、2000、Nucleic Acids Res.28:235〜342参照)における既知の構造を有する抗体の対応するセグメントとアラインメントする。複数の配列アライメントにより、標的セグメントのそれぞれの最高の配列相同性を有する対応するセグメントを選択し、V領域の三次元モデルを構築する。構造を最適化するために、モデルを複数サイクルの共役勾配エネルギー最小化(conjugate gradient energy minimization)に供する(例えば、ENCAD、またはPressら、1990、「Numerical Recipes、Cambridge University Press、Cambridgeに記載;Weinerら、1981、J.Comp.Chem.2:287〜303によるAMBER;BioMolecularModellingで利用可能な3D−JIG−SAW、またはCancer Research UKによって運営される「BMM」ウェブサイト;またはSwiss Institute of Bioinformatics、Genevaによって運営されるExPASy Proteomics Serverウェブサイトで利用可能なSWISS−MODELを使用)。
V領域の構造のモデリングと並行して、マウスVHおよびVLそれぞれのcDNAクローニングから推定されたアミノ酸配列をデータベース、例えば、Kabatデータベース(Johnsonら、2000、Johnsonら、2000、Nucleic Acids Res.28:214〜218を参照されたい)、GenBankなどにおいてヒトV領域配列と比較する。マウス配列と少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも95%の同一性という全体にわたる配列同一性を有するヒトFRは、例えば、Smith−Watermanアルゴリズム(Gusfield、1997、「Algorithms on Strings, Trees, and Sequences」掲載、Cambridge University Press、Cambridgeによる)、またはBLAST(Karlinら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264〜2268による)などを使用して検索ことができる。これらのヒト配列はcDNAベースの配列およびタンパク質由来の配列に基づくものであってもよいが、生殖系列の使用がしばしば好ましく、それは、この生殖系列は、cDNAベースの配列、タンパク質由来の配列の体細胞超変異に関連する潜在的な免疫原性の排除に有用である可能性があるからである。別の方法では、Queenら(1989、前掲)に記載のとおり、コンセンサスフレームワーク配列を使用することにより、cDNAベースの配列またはタンパク質由来の配列から得られたフレームワーク中のこのような超変異残基を同定および除去することもできる。生殖系列VHセグメントをアクセプターフレームワークとして使用する場合、第14染色体上にコードされるVHセグメントだけが機能的VHを産生するので、第15染色体および第16染色体ではなく第14染色体上のものを使用すべきである。
Queenら(1989、前掲)によれば、CDRの約4〜6Å以内にあるフレームワークアミノ酸を同定することが必要であり、それは、これらの残基が正しいCDR構造を支持する潜在的な重要なフレームワーク残基であると考えられるからである。このようなプロセスは、National Science Foundation(NSF)によって支援されるMolecular Visualization Freewareウェブサイトで利用可能な、原子座標から原子間距離を計算するRASMOLなどのコンピュータプログラムを使用して、またはコンピュータモデルのマニュアル検査によって達成することができる。重要なフレームワーク位置のアミノ酸がマウスドナー配列とヒトアクセプター配列の間で異なる場合、通常ヒト残基がマウスドナーの残基によって置き換えられる。しかし、このような残基が、CDR構造の支持への寄与がわずかしかない場合、対応するヒト残基を通常使用する。また、選択されたヒトアクセプターがV領域配列の約10〜20%未満に存在する「非定型的な(atypical)」アミノ酸を含有する場合、これらのアミノ酸は親和性成熟の間の体細胞超変異の結果である可能性があり、ヒトにおける潜在的な免疫原性を回避するためにドナー残基で置き換えるべきである。
ヒト化抗体を医薬品として提供するために、したがって、効率的で一貫した産生系を調製する必要がある。例えば、H鎖およびL鎖配列を挿入することによってヒト化抗体に適切な発現ベクターを調製し、発現ベクターをトランスフェクトした高生産性細胞株をマスターセルバンク(master cell bank)(MCB)の種細胞として得ることができ、それはワーキングセルバンク(working cell bank)(WCB)の安定で半永久的な供給源となる。次いで、WCB由来のワーキングセル(working cell)を培養し、培地を収集することによってヒト化抗体を調製することができる。
本発明は、RGD配列を免疫特異的に認識する上記のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明のヒト化抗体を有効成分として含む医薬組成物は、それだけには限定されないが、癌、例えば、癌細胞の増殖または転移、および炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎およびクローン病)、自己免疫疾患などを含めた、RGDタンパク質に関連する障害または疾患の予防薬および/または治療薬として使用することができる。
本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物は、癌(例えば、癌細胞の増殖または転移)および/または炎症性疾患(例えば、関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫など)の診断用薬として、または臓器移植後の慢性拒否反応、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、増殖性糸球体腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患の診断用薬として使用することができる。本発明のヒト化抗体は、RGD配列を特異的に認識することができ、したがって試験体液中のRGDタンパク質を定量するために、特に、サンドイッチイムノアッセイ、競合的アッセイ、イムノメトリー(immunometry)、比濁分析(nephrometry)など、免疫染色などによる定量に使用することができる。これらの免疫学的方法を本発明のアッセイ法に適用する際は、いかなる特定の条件、手順なども説明する必要はない。当技術分野における通常の技術的考慮事項を従来の条件および手順に付加することによりアッセイ系を構築することが十分である。これらの一般的な技術的手段の詳細については、総説、テキストなどを参照することができる.
以下の実施例では、RGD配列を免疫特異的に認識するモノクローナル抗体の調製、モノクローナル抗体のV領域の配列決定、抗体のエピトープマッピングおよび他の特徴付け、ならびにこのような抗体のキメラ化およびヒト化、ならびに得られたキメラ抗体およびヒト化抗体の特徴付けを例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
RGD配列に対するマウスモノクローナル抗体をサブトラクティブ免疫化法(subtractive immunization method)(Williams C.V.ら、1992、Biotechniques12:842〜847による)に従って調製した。RGD配列を含むアミノ酸配列CVDVPNGRGDSLAYGLR(配列番号71)およびECMタンパク質の細胞接着性配列であるアミノ酸配列SLAYGLR(配列番号72)の合成ペプチドとして抗原を調製した。抗原ペプチドをEMCS(Dojin)を介してサイログロブリンに結合させ、これを抗原としてアジュバントと共にマウスに免疫した。ハイブリドーマを当技術分野でよく知られている方法(例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版1988);Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas掲載、563〜681ページ(Elsevier,N.Y.、1981)を参照されたい)によって調製した。4回免疫した後、脾細胞を収集し、骨髄腫細胞X63−Ag8−653と融合した。次いで、HAT培地を使用し、ELISA(抗原ペプチド固相)を用いて培養上清をスクリーニングすることにより、RGD配列に免疫特異的に反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。RGD配列を免疫特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを単離すると、8つのハイブリドーマクローン4P11、11M6、25H15、29R5、30C17、33E10、35B6および38I8を樹立した。チオールセファロースビーズ(Amasham Bioscience)を使用することによって調製された抗原ペプチドカラムを使用することにより、抗体をハイブリドーマの上清から精製した。
アミノ酸配列CLPVKTDSGSSEEKLY(mOPN1)(配列番号73)、CVDVPNGRGDSLAYGLR(mOPN5)(配列番号71)、CVDVPNGRGDS(配列番号74)、CPNGRGD(配列番号75)、CGRGDSLAYGLR(配列番号76)、CGDSLAYG(配列番号77)、CGDSLAUGLR(配列番号78)およびCSLAYGLR(配列番号72)からなる、マウスOPNに由来する部分ペプチドを含むペプチド、アミノ酸配列CVDTYDGRGDSVVYGLRS(配列番号79)およびCSVVYGLR(配列番号80)からなる、ヒトOPNに由来する部分ペプチドを含むペプチド、ならびにアミノ酸配列CGRGDS(配列番号81)の、ヒトOPNおよびマウスOPNの共通のペプチド配列を含むペプチドを、EMCS(同仁化学研究所)を介してBSA(Sigma corporation)に結合させ、ELISAに使用した。
モノクローナル抗体33E10および35B6のCDRのアミノ酸配列を以下の手順によって決定した。RNeasy Miniキット(Qiagen)を使用して対応するハイブリドーマからRNAを抽出し、First−strand cDNA synthesisキットを使用してcDNAを調製した。抗体のH鎖cDNAを、Heavy primer amplificationキット(Amasham Bioscience)を使用したPCRによって増幅し、pCRII−TOPOベクター(Invitrogen)中にクローニングし、次いでcDNA配列およびアミノ酸配列を決定した。ABG:Directory of 3D structures of antibodies(http://www.ibt.unam.mx/vir/structure/structures.html)によってCDRを決定した。V鎖およびL鎖のCDRは以下のとおりである(図6および図7にも示す)。
(H鎖)
[CDRH1]
33E10:GFTFTDYYMI(配列番号1)
35B6:GYTFTNYWMH(配列番号7)
[CDRH2]
33E10:WLGFIRNKANGYTTEYSASVKG(配列番号2)
35B6:WIGNINPRNGDSNYNEKFRS(配列番号8)
[CDRH3]
33E10:GAY(配列番号3)
35B6:GYFDV(配列番号9)
(L鎖)
[CDRL1]
33E10:RSSQSIVHSNGNTYLE(配列番号4)
35B6:KASQDINSYLS(配列番号10)
[CDRL2]
33E10:RVSNRFS(配列番号5)
35B6:RANRLVD(配列番号11)
[CDRL3]
33E10:GSFVPW(配列番号6)
35B6:YDEFPF(配列番号12)
ヒトOPN(hOPN)遺伝子またはマウスOPN(mOPN)遺伝子をそれぞれ導入したCHO−K1細胞の培養上清から、抗OPN抗体カラムを使用することにより、hOPNまたはmOPNをそれぞれ精製した。ヒトビトロネクチン(以下「VN」と略記する)はAGC TECHNO GLASS Co.,Ltdから得た。ヒトフィブロネクチン(以下「FN」と略記する)、ヒトトロンボスポンジンおよびマウスラミニンはSigma Corporationから得た。
細胞接着にはRGDペプチドとそのリガンド、すなわちインテグリンなどとの結合が関与することが知られているので、単離された抗RGD抗体をその細胞接着阻害活性について検討した。ヒトOPN(hOPN)遺伝子またはマウスOPN(mOPN)遺伝子をそれぞれ導入したCHO−K1細胞の培養上清から、抗OPN抗体カラムを使用することにより、hOPNまたはmOPNをそれぞれ精製した。大腸菌から単離することによる、トロンビン切断型mOPNのN末端部分とのグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質として、mOPNのN半分を精製した。ヒトFNおよびヒトVNはSigma Corporationから得た。
抗RGD抗体の治療効果をマウス系において検討した。抗RGDモノクローナル抗体(4P11、11M6、29R5、30C7、38I8、33E10および35B6)を抗RGD抗体についての記載(セクション6.1、前掲を参照されたい)と実質的に同様に調製した。
WO02/081522は、OPN機能を阻害することによって肝炎を治療できることを開示している。したがって、マウス肝炎モデルにおいてマウス抗RGD抗体(4P11、11M6、29R5、30C7、38I8、33E10および35B6)を使用して抗RGD抗体の治療効果を試験した。マウス(マウス5匹/群)の血中ASTおよびALTレベルを、200μgのコンカナバリンA(ConA)(Vector)の静脈内投与から12時間後、GPT/ALT−PIIIおよびGOT/AST−PIII(富士フイルム)を使用して測定した。ConA注射の3時間前に抗体を200μg投与した。対照抗体としてマウスIgGを使用した。
肺転移のマウス実験モデルおよび自然発症モデルにおいて転移に及ぼす抗RGD抗体の効果を試験した。
II型コラーゲン特異的モノクローナル抗体(IBL、日本)のカクテルを供給元のプロトコールに従って使用して、マウスに関節リウマチを誘発した。すなわち、マウス(Balb/c)にII型コラーゲン特異的モノクローナル抗体のカクテルを注射し、注射の3日後、LPSを注射して関節リウマチを発症させた。抗RGDモノクローナル抗体または正常ハムスターIgG(NHG)をコラーゲン抗体注射の前日からコラーゲン抗体注射の6日後まで全8回200μg/マウス/日で腹腔内に投与した。マウスをコラーゲン抗体注射の日から毎日観察し、各足を関節の紅斑および腫脹に基づいて0から4までに類別することによって関節炎のレベルをスコア付けした(0=紅斑または腫脹なし;1=つま先などの1つの小さい関節に紅斑または腫脹あり;2=小さい関節の2つ以上に紅斑または腫脹あり、または手首または足首などのより大きい関節に紅斑または腫脹あり;3=足全体に紅斑または腫脹あり;4=足全体に完全な紅斑または腫脹あり;マウス(4足)1匹の最大スコア16)。
子宮内膜症の症状は、嚢胞形成、周囲の間質における炎症、子宮内膜腺上皮の異所的な増殖による平滑筋化生、神経新生および血管形成を示す。免疫組織化学的方法により、オステオポンチン(OPN)がヒト子宮内膜症およびラット子宮内膜症モデルにおいて高度に発現されることが報告された。したがって、抗RGD抗体(33E10)による動物モデル対する治療効果を子宮内膜症に対する新たな療法として調べた。
6.7.1.マウス33E10可変領域遺伝子のクローニングおよび配列決定
7.5%CO2インキュベーターにおいて10%ウシ胎児血清(FBS;HyClone、Logan、UT)を含有するTIL培地I(免疫生物研究所、群馬、日本)中、37℃でマウス33E10ハイブリドーマ細胞を増殖させた。TRIzol試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA)を供給元のプロトコールに従って使用して、約3×106ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出した。GeneRacer Kit(Invitrogen)を供給元のプロトコールに従って使用して、オリゴdTプライマーによるcDNAを合成した。35B6重鎖および軽鎖の可変領域cDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、マウスγ−1およびκ鎖定常領域にそれぞれアニーリングする3’プライマー、ならびにGeneRacer Kitにおいて提供されるGeneRacer5’プライマー(5’−CGACTGGAGCACGAGGACACTGA−3’)(配列番号84)を使用して、Phusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、Beverly、MA)を用いて増幅した。VHのPCR増幅については、3’プライマーは配列5’−GCCAGTGGATAGACAGATGG−3’(配列番号85)を有する。VLのPCR増幅については、3’プライマーは配列5’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−3’(配列番号86)を有する。増幅されたVHおよびVL cDNAをpCR4Blunt−TOPOベクター(Invitrogen)中にクローニングして配列を決定した。可変領域のDNA配列決定をTocore(Menlo Park、CA)で実施した。いくつかの重鎖および軽鎖クローンの配列を決定し、典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域に相同である固有の配列を同定した。33E10 VHおよびVLのコンセンサスcDNA配列を推定アミノ酸配列と一緒にそれぞれ図15および16に示す。
33E10 VHをコードする遺伝子は、PCRにより、鋳型として33E10 VH cDNA、5’プライマーとして5’−GGGACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATT−3’(SpeI部位は下線付き)(配列番号87)および3’プライマーとして5’−GGGAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC−3’(HindIII部位は下線付き)(配列番号88)を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した(図17)。同様に、33E10 VLをコードする遺伝子は、PCRにより、鋳型として33E10 VL cDNA、5’プライマーとして5’−GGGGCTAGCACCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG−3’(NheI部位は下線付き)(配列番号89)および3’プライマーとして5’−GGGGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC−3’(EcoRI部位は下線付き)(配列番号90)を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した(図18)。33E10 VHおよびVLエキソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれマウス生殖系列JH3およびJκ1配列に由来するものであった。QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen、Valencia、CA)を使用してPCR増幅断片をゲル精製し、SpeIおよびHindIII(VHについて)またはNheIおよびEcoRI(VLについて)で消化し、ヒトγ−1およびκ定常領域を担う哺乳動物発現ベクター中にクローニングしてキメラ33E10 IgG1/κ抗体を産生した。得られた発現ベクターpCh33E10の概略構造を図19に示す。
33E10可変領域のヒト化をQueenら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029〜10033、1989)に概説されているとおりに実施した。まず、コンピュータプログラムを利用して33E10可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒト可変領域配列に対する相同性検索に基づいて、33E10 VHと高い相同性を有するU03400(GenBankアクセッション番号)のヒトアミノ酸配列を、ヒト化33E10 VHのフレームワークを提供するアクセプターとして選択した。同様に、X72452(GenBankアクセッション番号)のヒトアミノ酸配列を33E10 VLのヒト化用のアクセプターとして選択した。
キメラおよびヒト化33E10 IgG1/κ抗体は、Durocherら(Nucl.Acids Res.30:e9、2002)に従ってポリエチレンイミンを使用してpCh35B6およびpHu35B6プラスミドDNAをそれぞれHEK293細胞にトランスフェクトすることによって一過性に発現させる。一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞を、7.5%CO2インキュベーターにおいて10%FBSを含有するDMEM中、37℃で2日間維持する。培養上清におけるCh33E10およびHu33E10 IgG1/κ抗体のそれぞれの発現レベルをサンドイッチELISAによって測定する。ELISAプレートをPBS中2,000倍希釈したヤギ抗ヒトIgG Fcγ鎖特異的ポリクローナル抗体(SouthernBiotech、Birmingham、AL)を100μl/ウェルで加えて4℃で一晩コーティングし、Wash Buffer(0.05%Tween20を含有するPBS)で洗浄し、Blocking Buffer(2%Skim Milkおよび0.05%Tween20を含有するPBS)を300μl/ウェルで加えて室温で1時間ブロッキングする。Wash Bufferで洗浄した後、ELISA Buffer(1%Skim Milkおよび0.025%Tween20を含有するPBS)中で適切に希釈した試料を100μl/ウェルでELISAプレートにアプライする。ヒト骨髄腫血清(SouthernBiotech)から精製したヒトIgG1/κ抗体を標準物質として使用する。ELISAプレートを室温で2時間インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、2,000倍希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体(SouthernBiotech)を100μl/ウェルで使用して、結合した抗体を検出する。室温で1時間インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、ABTS基質(bioWORLD、Dublin、OH)を100μl/ウェルで添加することによって発色を実施する。2%シュウ酸を100μl/ウェルで添加することによって発色を停止させる。405nmでの吸光度を読み取る。
ELISAにより、ヒト化35B6 IgG1/κの親和性をキメラ33E10 IgG1/κと比較する。抗原として、ウシ血清アルブミンとコンジュゲートした合成オリゴペプチド(Cys−Val−Asp−Thr−Tyr−Asp−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Val−Val−Tyr−Gly−Leu−Arg−Ser)(hOPN5−BSA)を使用する。典型的な実験において、ELISAプレートをPBS中1μg/ml hOPN−BSAを100μl/ウェルで加えて4℃で一晩コーティングし、Wash Bufferで洗浄し、Blocking Bufferを300μl/ウェルで加えて室温で1時間ブロッキングする。Wash Bufferで洗浄した後、ELISA Buffer中で適切に希釈した試料を100μl/ウェルでELISAプレートにアプライする。ELISAプレートを4℃で一晩インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、2,000倍希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトγ鎖ポリクローナル抗体(SouthernBiotech)を100μl/ウェルで使用して、結合した抗体を検出する。室温で1時間インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、ABTS基質を100μl/ウェルで添加することによって発色を実施し、2%シュウ酸を100μl/ウェルで添加することによって停止させる。405nmでの吸光度を読み取る。
7.5%CO2インキュベーターにおいて10%ウシ胎児血清(FBS;HyClone、Logan、UT)を含有するTIL培地I(免疫生物研究所、群馬、日本)中、37℃でマウス35B6ハイブリドーマ細胞を増殖させた。TRIzol試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA)を供給元のプロトコールに従って使用して、約3×106ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出した。GeneRacer Kit(Invitrogen)を供給元のプロトコールに従って使用して、オリゴdTプライマーによるcDNAを合成した。35B6重鎖および軽鎖の可変領域cDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、マウスγ−1およびκ鎖定常領域にそれぞれアニーリングする3’プライマー、ならびにGeneRacer Kitにおいて提供されるGeneRacer5’プライマー(5’−CGACTGGAGCACGAGGACACTGA−3’)(配列番号84)を使用して、Phusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、Beverly、MA)を用いて増幅した。VHのPCR増幅については、3’プライマーは配列5’−GCCAGTGGATAGACAGATGG−3’(配列番号124)を有する。VLのPCR増幅については、3’プライマーは配列5’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−3’(配列番号125)を有する。増幅されたVHおよびVL cDNAをpCR4Blunt−TOPOベクター(Invitrogen)中にクローニングして配列を決定した。可変領域のDNA配列決定をTocore(Menlo Park、CA)で実施した。いくつかの重鎖および軽鎖クローンの配列を決定し、典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域に相同である固有の配列を同定した。35B6 VHおよびVLのコンセンサスcDNA配列を推定アミノ酸配列と一緒にそれぞれ図28および29に示す。
35B6 VHをコードする遺伝子は、PCRにより、鋳型として35B6 VH cDNA、5’プライマーとして5’−GGGACTAGTACCACCATGGGATGGAGCTGTATCCTC−3’(SpeI部位は下線付き)(配列番号126)および3’プライマーとして5’−GGGAAGCTTAAAAAAAGCCAGCTTACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC−3’(HindIII部位は下線付き)(配列番号127)を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した(図30)。同様に、35B6 VLをコードする遺伝子は、PCRにより、鋳型として35B6 VL cDNA、5’プライマーとして5’−GGGGCTAGCACCACCATGAGGACCCCTGCTCAGTTTCTT−3’(NheI部位は下線付き)(配列番号128)および3’プライマーとして5’−GGGGAATTCGCAAAAGTCTACTTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGA−3’(EcoRI部位は下線付き)(配列番号129)を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した(図31)。35B6 VHおよびVLエキソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれマウス生殖系列JH1およびJκ4配列に由来するものであった。QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen、Valencia、CA)を使用してPCR増幅断片をゲル精製し、SpeIおよびHindIII(VHについて)またはNheIおよびEcoRI(VLについて)で消化し、ヒトγ−1およびκ定常領域を担う哺乳動物発現ベクター中にクローニングしてキメラ35B6 IgG1/κ抗体を産生した。得られた発現ベクターpCh35B6の概略構造を図32に示す。
35B6可変領域のヒト化をQueenら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029〜10033、1989)に概説されているとおりに実施した。まず、コンピュータプログラムを利用して35B6可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒト可変領域配列に対する相同性検索に基づいて、35B6 VHと高い相同性を有するZ47230(GenBankアクセッション番号)のヒトアミノ酸配列を、ヒト化35B6 VHのフレームワークを提供するアクセプターとして選択した。同様に、X72479(GenBankアクセッション番号)のヒトアミノ酸配列を35B6 VLのヒト化用のアクセプターとして選択した。
キメラおよびヒト化35B6 IgG1/κ抗体は、Durocherら(Nucl.Acids Res.30:e9、2002)に従ってポリエチレンイミンを使用してpCh35B6およびpHu35B6プラスミドDNAをそれぞれHEK293細胞にトランスフェクトすることによって一過性に発現させた。一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞を、7.5%CO2インキュベーターにおいて10%FBSを含有するDMEM中、37℃で2日間維持した。培養上清におけるCh35B6およびHu35B6 IgG1/κ抗体のそれぞれの発現レベルをサンドイッチELISAによって測定した。ELISAプレートをPBS中2,000倍希釈したヤギ抗ヒトIgG Fcγ鎖特異的ポリクローナル抗体(SouthernBiotech、Birmingham、AL)を100μl/ウェルで加えて4℃で一晩コーティングし、Wash Buffer(0.05%Tween20を含有するPBS)で洗浄し、Blocking Buffer(2%Skim Milkおよび0.05%Tween20を含有するPBS)を300μl/ウェルで加えて室温で1時間ブロッキングした。Wash Bufferで洗浄した後、ELISA Buffer(1%Skim Milkおよび0.025%Tween20を含有するPBS)中で適切に希釈した試料を100μl/ウェルでELISAプレートにアプライした。ヒト骨髄腫血清(SouthernBiotech)から精製したヒトIgG1/κ抗体を標準物質として使用した。ELISAプレートを室温で2時間インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、2,000倍希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体(SouthernBiotech)を100μl/ウェルで使用して、結合した抗体を検出した。室温で1時間インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、ABTS基質(bioWORLD、Dublin、OH)を100μl/ウェルで添加することによって発色を実施した。2%シュウ酸を100μl/ウェルで添加することによって発色を停止させた。405nmでの吸光度を読み取った。
ELISAにより、ヒト化35B6 IgG1/κの親和性をキメラ35B6 IgG1/κと比較した。抗原として、ウシ血清アルブミンとコンジュゲートした合成オリゴペプチ(Cys−Val−Asp−Thr−Tyr−Asp−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Val−Val−Tyr−Gly−Leu−Arg−Ser)(配列番号79)(hOPN5−BSA)を使用した。典型的な実験において、ELISAプレートをPBS中1μg/ml hOPN−BSAを100μl/ウェルで加えて4℃で一晩コーティングし、Wash Bufferで洗浄し、Blocking Bufferを300μl/ウェルで加えて室温で1時間ブロッキングした。Wash Bufferで洗浄した後、ELISA Buffer中で適切に希釈した試料を100μl/ウェルでELISAプレートにアプライした。ELISAプレートを4℃で一晩インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、2,000倍希釈したHRPコンジュゲートヤギ抗ヒトγ鎖ポリクローナル抗体(SouthernBiotech)を100μl/ウェルで使用して、結合した抗体を検出した。室温で1時間インキュベートし、Wash Bufferで洗浄した後、ABTS基質を100μl/ウェルで添加することによって発色を実施し、2%シュウ酸を100μl/ウェルで添加することによって停止させた。405nmでの吸光度を読み取った。図41A、41Bに示すとおり、ヒト化35B6 IgG1/κとhOPN5−BSAの結合は、キメラ35B6 IgG1/κに類似し(図41A)、または識別不可能であった(図41B)。この結果から、マウス35B6抗体のヒト化に成功したことが示される。
本明細書で33E10および35B6と称した、マウス抗RGDモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、2005年10月27日、茨城県つくば市東1−1−1つくばセンター中央第6(郵便番号:305−8566)にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、それぞれアクセッション番号FERM BP−10440およびFERM BP−10441を受けた。すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、RGDタンパク質の機能を阻害して、癌、例えば、癌細胞の増殖または転移、および炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎およびクローン病)、自己免疫疾患などに対して治療効果を発揮する。本発明の抗RGD抗体および抗インテグリン抗体の両方を含む医薬組成物は、癌および炎症性疾患に対してより改善された治療効果を及ぼす。
本明細書を通じて参照される配列を以下に要約する。
Claims (25)
- RGD配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントであ
って、
配列番号24のアミノ酸配列を含むH鎖、および、
配列番号26のアミノ酸配列を含むL鎖、
を含むヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - RGD配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントであ
って、
配列番号28のアミノ酸配列を含むH鎖、および、
配列番号30のアミノ酸配列を含むL鎖、
を含むヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 請求項1または2に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸分子。
- 請求項3に記載の核酸分子であって、配列番号24のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号23のヌクレオチド配列を有する、請求項4に記載の
核酸分子。 - シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項4に記載の核酸
分子。 - 前記シグナルペプチドが配列番号32のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の核酸
分子。 - 請求項3に記載の核酸分子であって、配列番号26のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号25のヌクレオチド配列を有する、請求項8に記載
の核酸分子。 - シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項8に記載の核
酸分子。 - 前記シグナルペプチドが配列番号34のアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の核酸分子。
- 請求項3に記載の核酸分子であって、配列番号28のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号27のヌクレオチド配列を有する、請求項12に記載
の核酸分子。 - シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項12に記載の核
酸分子。 - 前記シグナルペプチドが配列番号36のアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の核酸
分子。 - 請求項3に記載の核酸分子であって、配列番号30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号29のヌクレオチド配列を有する、請求項16に記載
の核酸分子。 - シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項16に記載の核
酸分子。 - 前記シグナルペプチドが配列番号38のアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の核酸
分子。 - 1つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結している、請求項4もしくは19に記載の核酸分子またはその両方を含むベクター。
- 請求項20に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを調製するための方法であって、請求項21に記載の宿主細胞をヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で培養すること、および発現されたヒト化抗体を収集することを含む方法。
- 請求項1または2に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- RGDタンパク質に関連する障害または疾患を予防または治療するための方法(ヒトを除く)であって、有効量の請求項1または2に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを、それを必要とする対象(ヒトを除く)に投与することを含む方法。
- RGDタンパク質に関連する障害または疾患をin vivoで診断するための方法(ヒトを除く)であって、有効量の請求項1または2に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを被検対象(ヒトを除く)に投与することを含む方法。
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