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Bibliotecas de anticuerpos policlonales.
ES2201097T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
Jacqueline Sharon - Current Assignee
- Boston University
Description
translated from
Bibliotecas de anticuerpos policlonales.
La invención se refiere a la creación,
interconversión y uso de bibliotecas de anticuerpos policlonales,
receptores de la superficie celular y otras proteínas con regiones
variables. Estas regiones variables se unen, se clonan en vectores
de expresión que pueden mantenerse, seleccionarse y amplificarse
cuando se desee, y las bibliotecas o
sub-bibliotecas de regiones variables pueden
transferirse a otros vectores de expresión sin que se pierda la
diversidad o complejidad global. Las bibliotecas resultantes de
regiones variables y las bibliotecas de proteínas enteras pueden
usarse para tratar, prevenir o diagnosticar enfermedades y
trastornos específicos incluyendo neoplasias, malignidades,
infecciones y defectos y deficiencias genéticas.
Los linfocitos constituyen aproximadamente el 20%
de los leucocitos sanguíneos y son los componentes principales del
sistema de reconocimiento de antígenos de mamífero que existe
predominantemente en dos formas, células B y células T. Las células
T se diferencian en el timo, y posiblemente en otros tejidos, en
células T citotóxicas (T_{C}), células T adyuvantes (T_{H}) y
células supresoras (T_{S}). Estas células T reconocen antígenos
extraños en asociación con los antígenos del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) a través de un receptor específico de
células T (TcR). Este receptor es muy polimórfico y se distribuye
clonalmente. El TcR típico es un heterodímero unido por enlaces
disulfuro que consta de un polipéptido \alpha y un polipéptido
\beta, que se expresa en la superficie de células T maduras. Las
dos cadenas son de tamaño similar, poseyendo una porción
transmembrana incluida dentro de una región constante y una región
variable polimórfica que posee una homología estructural
considerable con las inmunoglobulinas. Cada región variable se
compone de un segmento variable (V), un segmento de unión (J) y un
segmento de diversidad (D) (sólo en la cadena \beta) que se
ensamblan formando la región polimórfica. Tal diversidad es
necesaria para que las células T respondan a una amplia diversidad
de antígenos.
Las células B se diferencian en la médula ósea de
mamíferos adultos desarrollándose a partir de
pre-células B a células plasmáticas productoras de
anticuerpos. La importancia de las células B en el sistema inmune se
realza por las enfermedades inmunodeficientes raras en las que el
paciente sólo puede sobrevivir por inyecciones repetidas de gamma
globulina. Uno de los aspectos fascinantes de las células B es su
heterogeneidad de expresión de anticuerpos. A partir de las
observaciones, se ha estimado que no más de dos de cada 10^{8}
anticuerpos diferentes pueden ser idénticos. No es sorprendente que
los mecanismos responsables de tal diversidad no se entiendan
completamente. Los anticuerpos y los TcR, teniendo ambos regiones
constantes y variables, se clasifican dentro de lo que se denomina
la superfamilia de las inmunoglobulinas.
El proceso de expresión de las inmunoglobulinas
se inicia con la activación de células B en reposo. En la ruta
independiente de células T, el mitógeno se une a receptores
superficiales de células B estimulando la expresión de monómeros de
IgM con una afinidad bastante baja. Tras el reconocimiento del
antígeno extraño, estos monómeros de IgM experimentan
entrecruzamientos en la superficie celular y se internalizan. La
expresión del anticuerpo después cambia a la transcripción y
traducción de IgG, IgE, IgA o IgM pentamérica de mayor afinidad. En
la ruta dependiente de células T, de nuevo se requiere que el
mitógeno estimule la célula B en reposo, sin embargo, después de la
internalización, el antígeno se procesa dentro de la célula para
volver a aparecer en la superficie celular en asociación con
moléculas del MHC de clase II. Como células presentadoras de
antígenos (APC), los complejos antígeno-MHC se
reconocen por las células T y estimulan su activación y la
producción de varios mediadores solubles de células T y B. La
información recibida a partir de estos complejos superficiales se
transmite al núcleo de las células B a través de segundos mensajeros
que, entre otros efectos, aumentan el metabolismo de nucleótidos
cíclicos y la actividad de la proteína quinasa C. Tanto en la ruta
dependiente de células T como en la ruta independiente de células
T, las células B se desarrollan para dar células productoras de
anticuerpos, funcionalmente maduras.
Los anticuerpos son moléculas bifuncionales que
comprenden dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) unidas
con enlaces disulfuro intercatenarios. Cada cadena contiene
regiones constantes (C) y variables (V), que pueden fragmentarse en
dominios denominados C_{H1}, C_{H2}, C_{H3} y V_{H}, y
C_{L} y V_{L}. La IgM existe como monómeros de la superficie
celular o pentámeros circulantes que se mantienen juntos con un
péptido de 137 aminoácidos denominado cadena J. Las moléculas de IgA
también circulan, pero en pares asociados con la cadena J, y
contienen un componente secretor pequeño (SC) que está implicado en
el transporte a través de membranas epiteliales. El anticuerpo se
une al antígeno a través de dominios de región variable contenidos
en la porción Fab y, después de la unión, interacciona con el resto
del sistema inmune a través de las funciones efectoras del dominio
de la región constante principalmente a través de la porción Fc.
Las funciones efectoras incluyen la activación de la cascada del
complemento, la interacción con células efectoras tales como
linfocitos, y la compartimentalización de inmunoglobulinas. También
se cree que ciertas regiones constantes influyen sobre las
estabilidades de las diferentes inmunoglobulinas. Por ejemplo, la
IgG es relativamente estable, con una vida media circulante de
aproximadamente 23 días. La IgG también es la inmunoglobulina
respondedora asociada con la respuesta inmune secundaria. Esta
inmunoglobulina se fija al complemento a través de la cascada
clásica del complemento y tiene la capacidad de reclutar macrófagos
y neutrófilos. La IgM pentamérica es otro activador muy fuerte de la
cascada clásica del complemento y tiene una vida media en suero de
aproximadamente 5 días. La IgA tiene una vida media en suero de
5-6 días, activa el complemento a través de una
ruta alternativa y es el anticuerpo principal en las secreciones
mucosas.
Los dominios de unión a antígenos, las regiones
variables, se codifican en los genes de la región variable que
están algo dispersos en el genoma y deben agruparse por un proceso
denominado recombinación somática. En este proceso, los segmentos V,
D y J (no relacionados con la cadena J) del genoma del hospedador se
agrupan para formar una región génica. Esta región se une al ARNm
que codifica el dominio de la región constante del anticuerpo para
expresarse conjuntamente como un polipéptido y finalmente como una
molécula de anticuerpo.
Las regiones constantes de los anticuerpos son
las características determinantes principales de la clase de
anticuerpo tanto en el caso de las cadenas pesadas como en el caso
de las cadenas ligeras, y se codifican en aproximadamente 15 genes
diferentes. Las cinco clases de genes de cadena pesada se denominan
alfa (\alpha), gamma (\gamma), delta (\delta), mu (\mu) y
épsilon (\epsilon), y los dos genes de cadena ligera, kappa
(\kappa) y lambda (\lambda). Las regiones variables, que
contienen el sitio de unión al antígeno, se codifican en más de mil
regiones genéticas diferentes. Estas regiones se recombinan
selectivamente para crear la combinación de aminoácidos requerida
para reconocer y unirse al antígeno diana. La variabilidad del
sitio de unión no está distribuida uniformemente, sino que cada
dominio contiene varias porciones muy variables denominadas
regiones hipervariables (HVR), o regiones determinantes de
complementariedad (CDR), y son estas regiones las que interaccionan
realmente con el antígeno.
La generación de diversidad en el sitio de unión
es una combinación de varios factores; (1) la combinación de
diferentes dominios V_{H} y V_{L}, (2) la combinación de
diferentes regiones V, D y J para formar el dominio variable, (3) la
generación de una nueva diversidad en las uniones de dominios,
denominada diversidad de unión, y (4) la diversidad debida a
mutaciones somáticas. La mutación somática, en una gran medida,
también es responsable de la maduración de la respuesta inmune,
teniendo los clones de células B que proliferan durante el
desarrollo de la respuesta humoral una afinidad cada vez mayor por
el antígeno. La combinación de estos procesos, en teoría, permite
que un organismo genere una respuesta inmune específica contra casi
cualquier antígeno.
La estimulación de una respuesta de anticuerpos
es la base de la mayoría de las formas de terapia y profilaxis con
vacunas. Como profilaxis, al paciente se le administra el antígeno
en forma del microorganismo inactivado o atenuado o como una
proteína purificada. Es de esperar que la administración de esta
vacuna prepare al sistema inmune del paciente para el posible
reconocimiento posterior de ese mismo antígeno en forma de una
infección. Si la infección puede cogerse pronto, en otras palabras,
si los anticuerpos anti-antígeno están circulando a
lo largo del cuerpo tras la exposición inicial o precoz al
organismo, el organismo puede eliminarse del cuerpo antes de que
tenga posibilidad de instalarse o de producir una infección sólida.
Este aspecto se reconoce desde hace mucho tiempo, incluso antes de
apreciar la estructura básica del anticuerpo. Los tratamientos con
anticuerpos implican vacunaciones pasivas de suero reunido en forma
de gamma globulinas. Se recoge plasma sanguíneo de individuos o
animales convalecientes que se recuperaron de la enfermedad
particular, y se purifica la fracción proteica o de gamma
globulina, denominada así porque contiene predominantemente
moléculas de IgG. Se administran inyecciones de esta gamma globulina
muchas veces durante un período de horas o días, normalmente
inmediatamente después de la exposición al organismo infeccioso o
sustancia tóxica, para proporcionar al paciente protección a corto
plazo contra la infección. Por ejemplo, a los individuos mordidos
por un animal que se sospecha que es portador del virus de la rabia,
un rabdovirus, se les administra un régimen de tratamientos con
gamma globulina para prevenir la infección del virus, porque una
vez que se ha instalado la infección, el resultado inevitablemente
es bastante malo. Sin embargo, si los tratamientos se inician
precozmente, el pronóstico puede ser bastante optimista.
El uso de anticuerpos para la terapia (o
profilaxis) del cáncer se basa en la premisa de que el perfil
antigénico de una célula cancerígena es diferente del de las
células normales. Como se representa esquemáticamente en la Figura
1, estas diferencias podrían incluir potencialmente (1)
determinantes antigénicos que están presentes exclusivamente en la
superficie de células tumorales, (2) moléculas intracelulares
encontradas exclusivamente en células tumorales que se presentan
como péptidos sobre la superficie celular en asociación con
moléculas del MHC, (3) antígenos que están presente sólo en algunas
células normales, y (4) diferencias cuantitativas en la cantidad de
expresión de ciertos antígenos sobre la superficie de las células
tumorales en comparación con otros tipos de células no tumorales.
Esta premisa se ha sustanciado por el descubrimiento de los
denominados antígenos asociados a tumores, que no se expresan en
cantidades significativas o medibles sobre las superficies de
células normales (M. Herlyn y H. Koprowski, Ann. Rev. Immunol.
6:283-308, 1988). Estos péptidos específicos de
tumores se presentan en la superficie celular en asociación con
antígenos del MHC de clase I.
Los anticuerpos monoclonales, a diferencia de los
anticuerpos policlonales, comprenden una colección de moléculas
idénticas producidas por un clon común de células B que se dirigen
contra un solo determinante antigénico. Los anticuerpos monoclonales
pueden distinguirse de los anticuerpos policlonales en que los
anticuerpos monoclonales deben seleccionarse de forma individual,
mientras que los anticuerpos policlonales se seleccionan en grupos
de más de uno o, en otras palabras, en masa. Pueden producirse
grandes cantidades de anticuerpos monoclonales por inmortalización
de una población de células B policlonales usando la tecnología de
hibridomas. Cada célula B inmortalizada puede dividirse,
presumiblemente de forma indefinida, y dar lugar a una población
clonal de células que expresan moléculas de anticuerpo idénticas.
Los clones de células B inmortalizados individuales, los hibridomas,
se segregan y se cultivan por separado.
La terapia con anticuerpos monoclonales se ha
usado cada vez más en la terapia y el diagnóstico del cáncer, pero
tiene varias limitaciones (H. Thomas y K. Sikora, Rev. Oncol.
4:107-120, 1991). A menudo aparecen variantes de
células tumorales, que carecen del único determinante antigénico
reconocido por el anticuerpo monoclonal, que escapan al
tratamiento. Como cada anticuerpo monoclonal se dirige a un solo
determinante antigénico de la célula cancerígena diana, la densidad
de ese determinante en la superficie celular normalmente no es
suficientemente alta como para permitir la destrucción de la
célula. Además, no se activan los mecanismos efectores mediados por
las regiones Fc de las moléculas de anticuerpo unidas, tales como la
unión al complemento y la producción concomitante de C3b, la
opsonización/fagocitosis y la citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos (ADCC). Sólo a altas densidades de
anticuerpo se activa el complemento, o se ocupan suficientes
receptores Fc como para que las células efectoras se activen para
realizar sus funciones preordenadas. Por consiguiente, los
anticuerpos monoclonales antitumorales normalmente son ineficaces
para la eliminación completa de las células diana.
En un esfuerzo por evitar algunos de estos
problemas, se han desarrollado métodos para probar y reforzar la
eficacia de destrucción de anticuerpos monoclonales con isótopos
radiactivos, toxinas o fármacos. Sin embargo, estas señales a su
vez pueden producir efectos secundarios perjudiciales (T. A.
Waldmann, Sci. 252:1657-62, 1991). Aunque un
anticuerpo monoclonal (con señal o sin señal) sea razonablemente
eficaz para eliminar células cancerosas, y se hayan documentado
remisiones, en la mayoría de los casos se producen recaídas del
cáncer debido a que las variantes de células tumorales que han
perdido el determinante antigénico diana escapan y proliferan (R.A.
Miller et al., N. Engl. J. Med. 306:517-22, 1982).
Este problema podría solucionarse parcialmente con el uso de
colecciones de anticuerpos monoclonales antitumorales que tuvieran
el efecto beneficioso de usar el mismo reactivo preexistente en
muchos pacientes. Aunque esto sería una ventaja, porque los tumores
individuales presentan esta variabilidad, no es de esperar que sea
común el descubrimiento de múltiples antígenos específicos para un
tipo de cáncer presente en todos los cánceres de ese tipo (D. Berd
et al., Cancer Res. 49:6840-44, 1989). Aunque se
encuentre un tratamiento eficaz usando colecciones de anticuerpos
monoclonales para pacientes con algunos tipos de cáncer, es poco
probable que sea un tratamiento eficaz para muchas formas de
neoplasia.
La tecnología de anticuerpos monoclonales, en su
fase actual, se ha centrado en el uso de anticuerpos monoclonales
no humanos. A menudo, esto supone un problema porque los pacientes
desarrollan anticuerpos contra las regiones no humanas de las
proteínas, incluyendo tanto las regiones constantes como las
regiones variables. Los anticuerpos reactivos contra el sitio de
unión a antígenos, las regiones variables, de otro anticuerpo se
denominan anticuerpos anti-idiotípicos. Se ha
demostrado que los anticuerpos monoclonales murinos, los más fáciles
de producir y los más prevalentes, inducen una respuesta humoral en
humanos que se denomina respuesta de anticuerpos humanos
anti-ratón o la respuesta HAMA (D.L. Sawler et al.,
J. Immunol. 135:1530-35, 1985). Las respuestas HAMA
significativas en pacientes que reciben tal terapia, aparte de
destruir cualquier efecto beneficioso posible del tratamiento,
introducen numerosas complicaciones, incluyendo trastornos del
complejo inmune.
En los últimos años, estos problemas se han
solucionado parcialmente por la generación y uso de anticuerpos
quiméricos. Los anticuerpos quiméricos tienen regiones V derivadas
del anticuerpo monoclonal de ratón con especificidad por el tumor,
pero regiones C humanas (S.L. Morrison y V.T. Oi, Adv. Immunol.
44:65-92, 1989). En tales formas, la respuesta HAMA
se reduce significativamente (aunque no se elimina), pero sigue
teniéndose que hacer frente a la respuesta
anti-idiotípica. Los esfuerzos por eliminar la
respuesta anti-idiotípica han implicado la obtención
por ingeniería genética de anticuerpos en los que sólo las CDR
proceden del anticuerpo el ratón y la estructura y las regiones C
son de origen human. Estos son los denominados anticuerpos
humanizados (P.C. Caron et al., Cancer Res.
52:6761-67, 1992). Estos anticuerpos son muy
difíciles de crear, implicando múltiples sucesos de clonación, y
también pueden inducir anticuerpos anti-idiotípicos
(The Third Annual IBC International Conference on Antibody
Engineering, 14-16 de diciembre de 1992, San Diego).
Actualmente se están desarrollando anticuerpos monoclonales
completamente humanos con la esperanza de que no induzcan
anticuerpos anti-idiotípicos (C.J. Fisher et al.,
Critical Care Med. 18:1311-15, 1990). Sin embargo,
como los ratones son perfectamente capaces de generar anticuerpos
anti-idiotípicos contra anticuerpos procedentes de
la misma especie e incluso de la misma cepa endogámica, la
generación de anticuerpos anti-idiotípicos
después de la inyección de grandes cantidades de anticuerpos con
regiones V idénticas seguirá siendo un problema siempre que se usen
anticuerpos monoclonales.
El uso de anticuerpos policlonales solucionaría
algunos de los inconvenientes asociados con la terapia de
anticuerpos monoclonales. A diferencia de los anticuerpos
monoclonales, los anticuerpos policlonales se dirigen a muchos
determinantes antigénicos diferentes presentes en la superficie de
la célula diana y se unirían con suficiente densidad como para
permitir que los mecanismos efectores del sistema inmune
funcionaran eficazmente, posiblemente eliminando la necesidad de
cualquier señal radiactiva o tóxica. Además, la probabilidad de que
aparezcan variantes de células tumorales de escape que han perdido
la reactividad con todos los anticuerpos policlonales es muy
pequeña. No es de esperar que sea un problema la reactividad
anti-idiotípica en los pacientes, porque ninguna
combinación de regiones V debe estar presente en una cantidad
suficiente como para inducir una respuesta significativa.
Hay varios problemas asociados con el uso de
anticuerpos policlonales convencionales. En primer lugar, los
anticuerpos policlonales en forma de gamma globulina están
disponibles en un suministro muy limitado, insuficiente para los
tratamientos generalizados en los seres humanos. En segundo lugar,
cuando se usan en un paciente, muchos de los anticuerpos
policlonales se absorberán por las células y los tejidos normales
del paciente. El número de anticuerpos diferentes que permanecen
después de la absorción sería excepcionalmente pequeño, posiblemente
demasiado pequeño como para tener algún efecto beneficioso. En
tercer lugar, este suministro, además de ser inadecuado, requiere
mucha purificación para retirar los materiales indeseados, tales
como citoquinas u otras proteínas inmunorreguladoras, que pueden
inducir respuestas inmunes indeseables y efectos secundarios.
También existe un riesgo sustancial de contaminación asociada con
organismos infecciosos tales como VIH o toxinas tales como
lipopolisacáridos, que pueden estar presentes en la fuente. Estos
problemas son difíciles de solucionar debido a la variabilidad de la
composición, ya que el material se recoge a partir de muchas
fuentes biológicas diferentes. La producción recombinante de
anticuerpos policlonales solucionaría ciertos de estos asuntos,
pero los genes que codifican estos anticuerpos no se pueden
identificar fácilmente y aún no se ha desarrollado la tecnología
para trabajar eficazmente con colecciones de genes de
anticuerpos.
Recientemente, se han expresado fragmentos de
anticuerpos de unión a antígenos en la superficie de fagos
filamentosos (G.P. Smith, Sci. 228:1315, 1985). Se han obtenido
bibliotecas de ADN_{c} de regiones variables de cadenas H y L a
partir de células B animales y humanas y se han clonado en pares en
combinaciones aleatorias de H-L en vectores de
presentación de fagos para producir bibliotecas combinatorias que
presenten fragmentos Fab o Fv monocatenarios (W.D. Huse et al., Sci,
246:1275-81, 1989). El Fab se forma por la
asociación de la cadena L con los dominios V_{H} y C_{H1} de la
cadena H, la región Fd. En las bibliotecas de presentación de fagos,
el extremo carboxilo terminal de la región Fd o Fv se encadena a un
fragmento de una proteína de recubrimiento del fago, tal como cpIII
o cpVIII, que ancla el fragmento Fab a la superficie del fago.
Tanto en los fragmentos Fab y Fv como en los anticuerpos intactos,
el sitio de unión al antígeno se forma por la combinación de los
dominios V_{H} y V_{L}.
Las bibliotecas de presentación de fagos pueden
seleccionarse para unirse a antígenos específicos por cromatografía
de afinidad (R.E. Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889, 1992) o
presentando el fago sobre superficies recubiertas de antígeno (C.F.
Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363, 1991). Cuando los
segmentos de ADN que codifican los fragmentos de anticuerpo
seleccionados se transportan por partículas de fago, las partículas
de fago seleccionadas que codifican fragmentos de anticuerpo
monoclonal pueden aislarse y propagarse indefinidamente. Los clones
de fagos seleccionados pueden modificarse para producir fragmentos
de anticuerpo que carezcan del resto de la proteína de la cubierta
que también puede secretarse a partir de las células bacterianas.
Se han recuperado fragmentos de anticuerpo específicos para
haptenos, proteínas y varios virus humanos a partir de tales
bibliotecas combinatorias de presentación de fagos (J.D. Marks et
al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991; R.A. Williamson et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:4141, 1993).
Un inconveniente principal de estas bibliotecas
combinatorias es que las regiones V_{H} y V_{L} que forman el
dominio de unión a antígenos están asociadas aleatoriamente. Las
combinaciones originales de cadenas H y L que se seleccionaron de
forma tan eficaz in vivo por el antígeno se pierden (J.
McCafferty et al., Nature 348:552-54, 1990). La
probabilidad de encontrar combinaciones de H y L con alta afinidad
por el antígeno de interés es muy pequeña. El número de clones que
se necesitaría seleccionar con respecto a la presencia de la unión
específica al antígeno se aumenta en órdenes de magnitud.
Hace muy poco se ha informado sobre un método
para amplificar y unir los genes de la región V_{H} y V_{L}
expresados dentro de células individuales en una población de
células (M.J. Embleton et al., Nuc. Acids Res.
20:3831-37, 1992). Este método se ejemplificó con
dos líneas de células de hibridoma de ratón, produciendo cada una un
producto de inmunoglobulina (Ig) conocido y distinto. Las dos
poblaciones de células se mezclaron, se fijaron con formaldehído y
se permeabilizaron con el detergente NP-40. Los
ADNc se sintetizaron usando transcriptasa inversa y cebadores
complementarios a los extremos 3' de los ARNm de V_{H} y V_{L}.
Después, los ADNc se amplificaron por PCR y se unieron a la misma
reacción usando, además de los cebadores de ADNc, un cebador del
extremo 3' del gen de V_{H} y un cebador del extremo 5' del gen de
V_{L}. Estos cebadores también contenían colas complementarias de
secuencia extra para el auto-montaje de los genes
de V_{H} y V_{L}. En una segunda PCR, después de lavar las
células, los genes de las regiones V_{H} y V_{L} unidos se
amplificaron con cebadores anidados terminales produciendo una
población de fragmentos de ADN que codificaban las secuencias
V_{H} y V_{L} en una orientación transcripcional de cabeza a
cola. Estos fragmentos de ADN se recuperaron de los sobrenadantes
celulares.
Aunque este informe afirmó que casi todas las
combinaciones V_{H}-V_{L} examinadas
procedían de una sola de las líneas de células de hibridoma, el
método produce combinaciones mixtas de
V_{H}-V_{L} donde V_{H} y V_{L} pueden
proceder de diferentes células. También es evidente que debe
producirse esta mezcla de V_{H}-V_{L} por
consideraciones teóricas. Como las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas se recuperan del
sobrenadante de las células fijadas/permeabilizadas y los poros
presentes en las membranas de estas células permiten el paso libre
de tales moléculas de ADN unidas, sería de esperar que las
moléculas de ADN de V_{H} y V_{L} más pequeñas salieran de las
células y se unieran y amplificaran adicionalmente fuera de las
células, donde se produciría la mezcla libre de V_{H} y V_{L}
de diferentes células.
La presente invención soluciona los problemas e
inconvenientes asociados con las estrategias y diseños actuales y
proporciona nuevas composiciones y métodos para la profilaxis y
tratamiento de ciertas enfermedades y trastornos.
Las bibliotecas de anticuerpos policlonales
tienen una mayor complejidad que los anticuerpos monoclonales o los
cócteles de anticuerpos, dirigiéndose contra muchos determinantes
antigénicos diferentes, y llevan la opción de usar señales
radiactivas, de toxinas y otras señales tanto para la terapia como
para el diagnóstico. Una realización de la invención se refiere a
métodos para tratar trastornos neoplásicos usando bibliotecas de
anticuerpos policlonales dirigidas específicamente a una enfermedad
o a un trastorno. Se obtiene una muestra de tejido neoplásico a
partir de un paciente. La muestra se introduce en una población
celular capaz de producir anticuerpos, tal como células de bazo de
un mamífero. La población celular se fija, se permeabiliza y las
moléculas de ARNm de V_{H} y V_{L} se transcriben de forma
inversa para dar secuencias de ADNc de V_{H} y V_{L}. Las
secuencias de ADNc se amplifican por PCR y las secuencias
amplificadas se unen, preferiblemente en una orientación
transcripcional de cabeza a cabeza. Las secuencias unidas se
amplifican de nuevo por PCR para crear una población de fragmentos
de ADN que codifican las regiones de anticuerpo V_{H} y V_{L}.
Estos fragmentos de ADN se clonan en vectores de expresión y las
diferentes poblaciones de vectores de expresión se expanden en el
hospedador transfectado. Se seleccionan vectores de expresión que
codifiquen una biblioteca de anticuerpos
anti-neoplásicos recombinantes y se expanden de
nuevo las subpoblaciones o sub-bibliotecas. Los
anticuerpos anti-neoplásicos recombinantes
producidos por estos vectores después se administran al paciente.
Los trastornos neoplásicos que pueden tratarse incluyen leucemias,
linfomas, sarcomas, carcinomas, tumores de células neurales,
carcinomas de células escamosas, tumores de células germinales,
metástasis, tumores indiferenciados, seminomas, melanomas,
neuroblastomas, tumores de células mixtas, neoplasias producidas por
agentes infecciosos y otras malignidades.
Otra realización de la invención se refiere al
diagnóstico in vivo de un trastorno neoplásico por medio de
la obtención de imágenes del tejido enfermo en un paciente. Se crea
una biblioteca de anticuerpos anti-neoplásicos
específicos para el paciente, como se describe en este documento, y
se marcan con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser
anticuerpos enteros o fragmentos de anticuerpos tales como
fragmentos Fab. La biblioteca marcada se administra al paciente y el
marcador se detecta usando, por ejemplo, detectores radiactivos,
inspección visual, detección por resonancia magnética nuclear (RMN)
u otros medios para detectar la aparición de un marcador en un
tejido o residuo corporal, o dentro del propio cuerpo entero. Por
medio de estos métodos pueden percibirse neoplasias no
identificadas hasta ahora, que escapaban a la detección por otros
medios. Además, una vez detectada, la neoplasia puede controlarse
eficazmente durante los regímenes de tratamiento.
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para crear bibliotecas con especificidad de paciente o con
especificidad de antígeno de anticuerpos policlonales. Estas
bibliotecas, creadas como se ha descrito anteriormente, son útiles
para el tratamiento o profilaxis de varias enfermedades incluyendo
neoplasias, malignidades, infecciones, defectos genéticos y
deficiencias genéticas. Las bibliotecas pueden comprender vectores
que contienen ADN que codifica las regiones variables, ADN que
codifica el anticuerpo entero, anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos. Una vez aislada y clonada, la biblioteca puede
expandirse para asegurar la representación de todos los miembros
del perfil antigénico y también puede transferirse fácilmente a
otros vectores.
Otra realización de la invención se refiere a
composiciones que contienen bibliotecas de anticuerpos policlonales
o vectores de expresión genética que codifican estos anticuerpos.
La biblioteca o la sub-biblioteca seleccionada de
anticuerpos pude marcarse con un marcador detectable y/o contener
un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden
administrarse a pacientes para protocolos de diagnóstico o
tratamiento. Como alternativa, pueden administrarse bibliotecas de
vectores a pacientes para la expresión in vivo de anticuerpos
o fragmentos de anticuerpo.
Otra realización de la invención se refiere a
adyuvantes de diagnóstico o kits y a métodos para usar estos kits
para la detección de enfermedades y trastornos. Los adyuvantes de
diagnóstico o kits comprenden una biblioteca de anticuerpos
policlonales que pueden marcarse con un marcador detectable al que
se añade una muestra que se sospecha que contiene el antígeno
diana. La muestra puede ser una muestra de un fluido corporal tal
como sangre, suero, plasma, fluido espinal, linfa u orina. La
presencia o ausencia del antígeno diana indica la presencia de una
enfermedad, trastorno o contaminante particular. Las muestras pueden
ser muestras biológicas de un paciente o muestras biológicas de una
fuente ambiental que se sospecha que lleva un contaminante. La
muestra se mezcla con la biblioteca y la presencia del antígeno se
confirma por la unión de un número significativo de anticuerpos y
la detección del marcador.
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para crear y utilizar bibliotecas de proteínas receptoras
que poseen regiones variables. Las proteínas receptoras que pueden
utilizarse para crear una biblioteca incluyen receptores de células
T, receptores de células B, receptores de células destructoras
naturales y receptores de macrófagos. Una muestra de tejido
biológico se introduce en una población de células capaces de
producir proteínas receptoras. Los ARNm de la proteína receptora de
la región variable se transcriben de forma inversa para dar
secuencias de ADNc que se amplifican por PCR, y los fragmentos de
ADN resultantes se clonan en vectores de expresión. Se seleccionan
los vectores de expresión que codifican las proteínas receptoras
recombinantes y se expande una subpoblación seleccionada para
producir la biblioteca. Estas bibliotecas pueden usarse para
diagnosticar, obtener imágenes o tratar enfermedades y trastornos
incluyendo neoplasias, infecciones y defectos y deficiencias
genéticas. Además, usando los mismos métodos, también pueden crearse
y utilizarse bibliotecas de proteínas quiméricas que contienen
tanto anticuerpos como porciones de proteínas receptoras.
Otra realización de la invención se refiere a
vectores de ácido nucleico que pueden usarse para crear las
bibliotecas de anticuerpo policlonal con especificidad de antígeno.
Estos vectores comprenden sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción convenientes para la clonación de fragmentos de ácido
nucleico y secuencias para amplificar eficazmente por PCR los
fragmentos de ADNc. Los vectores se diseñan para tener uno o más
pares de fragmentos genéticos insertados en una orientación de
transcripción de cabeza a cabeza y, opcionalmente, también
comprenden secuencias controladoras de la transcripción y de la
traducción tales como cajas TATA, cajas CAT, sitios de unión a
ribosomas, sitios de iniciación y terminación de la ARN polimerasa,
secuencias líder, promotores fuertes de la transcripción que pueden
regularse diferencialmente o partes o combinaciones de los
mismos.
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para transferir una biblioteca de fragmentos de ácido
nucleico entre diferentes vectores sin una pérdida significativa de
diversidad de la biblioteca. La biblioteca de fragmentos se inserta
en primeros vectores en una orientación transcripcional de cabeza a
cabeza para formar vectores recombinantes. Los insertos de estos
vectores recombinantes se transfieren a segundos vectores, por
ejemplo, por amplificación por PCR de las secuencias insertadas o
clonación con enzimas de restricción, y los fragmentos se reinsertan
en segundos vectores sin una pérdida significativa de diversidad de
la biblioteca.
Otras realizaciones y ventajas de la invención se
indican, en parte, en la descripción que se presenta a continuación
y, en parte, serán evidentes por esta descripción o pueden
aprenderse por la práctica de la invención.
Figura 1. Comparación esquemática de las
diferencias en densidad y diversidad de antígenos en la superficie
de células normales frente a células tumorales.
Figura 2. Representación esquemática de la
construcción de (a)
pUC19-C_{\kappa}-CH1, (b)
pUC119-C_{\kappa}-CH1, (c)
plPPl2, y (d) pJS.
Figura 3. Mapas parciales de vectores de
expresión de fagémidos (a) pComb3, (b) phh3, (c) plPPl, y
(d) phh3mu o phh3hu, que no se muestran a escala. Los aminoácidos
aportados por los vectores se muestran en el código de una letra
delante de Fd y de los genes de la cadena L. P = promotor; l =
secuencia líder; lmod = secuencia líder con la secuencia de
nucleótidos modificada.
Figura 4. Diagrama esquemático de (a) un vector
doble murino, pMDV, (b) un vector doble quimérico, pCDV; donde: P =
promotor; E = potenciador; 1 = secuencia líder; s = sitio de
empalme; hum = humano; y (c) la transferencia en masa de secuencias
de región variable entre vectores bacterianos y de mamífero.
Figura 5. Representación esquemática de la
síntesis de ADNc y reacciones de PCR.
Figura 6. Análisis en gel de agarosa de productos
de PCR.
Figura 7. Transferencia de combinaciones de
V_{H}-V_{L} unidas dentro de las células a un
vector de expresión murino.
Figura 8. Análisis del sobrenadante celular por
(a) transferencia de Western y (b) ELISA.
Figura 9. Análisis de unión de fagos a
Ars-BSA por (a) ELISA de unión directa y (b) ELISA
de inhibición.
Figura 10. Generación de vectores (a) bacterianos
y (b) de mamífero para la expresión de bibliotecas de presentación
de fagos de Fab o de anticuerpos intactos derivados de
combinaciones de V_{H}-V_{L} unidas cabeza con
cabeza.
Como se realiza y se describe ampliamente en este
documento, la presente invención comprende métodos para la creación
y uso de bibliotecas de proteínas relacionadas tales como
anticuerpos, receptores que incluyen receptores de células T, y
otras proteínas inmunes relacionadas.
Durante una respuesta inmune, se generan y
proliferan muchos miles de clones diferentes de células B,
específicos para cada determinante antigénico, creando una gran
diversidad de anticuerpos. Esta diversidad se aumenta adicionalmente
por mecanismos de hipermutación somáticos que funcionan sobre las
células B estimuladas por antígenos. Estos procesos tan eficaces,
que funcionan durante la maduración de la respuesta inmune,
ocasionan una selección muy grande de anticuerpos con una mayor
afinidad por los antígenos. Sin embargo, la terapia actual con
anticuerpos se ha centrado en el uso de anticuerpos monoclonales, y
cuando los clones de células B se inmortalizan por la formación de
hibridomas, sólo se representa una pequeña fracción de los clones
de células B. Además, como sólo las células que se dividen pueden
participar en la formación de híbridos celulares estables,
probablemente, en la población no están representadas células
plasmáticas diferenciadas terminalmente que producen anticuerpos de
alta afinidad.
Una realización de la invención se refiere a
métodos para tratar trastornos neoplásicos usando bibliotecas
antitumorales de anticuerpos policlonales con especificidad de
paciente o con especificidad de enfermedad. Es de esperar que tales
bibliotecas realicen el espectro entero de una respuesta de
anticuerpo a células tumorales mucho más eficazmente que los
cócteles de anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales
producidos por hibridomas. Estas bibliotecas también se pueden
reproducir más fácilmente y pueden crearse y mantenerse dejando
intacta toda la diversidad asociada con una respuesta inmune
natural. Aunque la complejidad de cada biblioteca de anticuerpo
policlonal no se conoce inmediatamente, es de esperar que sea muy
alta y que lleve asociada la capacidad de activar todas las
funciones efectoras asociadas con una respuesta inmune.
Una biblioteca se crea obteniendo una muestra de
tejido neoplásico de un paciente con un trastorno particular. El
tejido neoplásico puede obtenerse a partir de tejidos tumorales,
sangre y tejidos relacionados con la sangre, tejidos de biopsia,
tejidos cancerosos, tejidos malignos, tejidos con metástasis y
combinaciones de los mismos.
Pueden obtenerse muestras de biopsias de tejidos
enfermos, cultivos de células primarias o inmortalizadas de tipos
celulares relacionados, o células que se estimulan artificialmente
para presentar un perfil antigénico particular. El tejido
neoplásico también puede propagarse primero en un animal
inmunodeficiente, tal como un modelo de ratón, para reforzar la
expresión no impedida del antígeno. Los modelos de ratón útiles
incluyen el ratón desnudo, el ratón SCID y el ratón irradiado. Los
ratones desnudos atímicos congénitos, con deficiencias en la
función de las células T, permiten el crecimiento in vivo de
tumores humanos. También se ha demostrado que los ratones con
inmunodeficiencia combinada severa (SCID), que carecen de células B
y T funcionales, y los ratones irradiados
sub-letalmente, donde las células T y B se han
destruido, permiten el crecimiento de tumores alogénicos y
xenogénicos. Los ratones desnudos y los ratones SCID permiten el
crecimiento de células humanas normales y pueden reconstituirse con
leucocitos de sangre periférica humana (Hu-PBL), por
ejemplo, por inyección intraperitoneal (i.p.) de aproximadamente
1-5 x 10^{7} células.
Como alternativa, el tejido neoplásico puede
someterse a una purificación para obtener un solo antígeno diana,
un grupo de antígenos o un extracto que contiene antígenos. Esta
estrategia es especialmente útil cuando existe riesgo de llevar
componentes indeseados o peligrosos de células vivas o inactivadas
en el procedimiento, o simplemente por consideraciones de
conveniencia o de almacenamiento. Por ejemplo, cuando se utilizan
células sanguíneas humanas, existe riesgo de que éstas leven virus
infecciosos, tales como VIH-1 o el virus de la
hepatitis, y sería deseable eliminar este riesgo. Los extractos se
preparan a partir de las células que tienen una concentración muy
reducida de antígenos normales y/o una mayor concentración de
antígenos neoplásicos. Generalmente se prefieren extractos de la
superficie celular, de la membrana o de células enteras, y pueden
prepararse y almacenarse a 4ºC, a –20ºC, a –80ºC o en
nitrógeno líquido, o liofilizarse y almacenarse a aproximadamente la
temperatura ambiente. Los métodos para la purificación de proteínas
y la preparación de extractos son bien conocidos para los
especialistas habituales. Muchos de estos procedimientos se
describen en Guide to Protein Purification (Methods in
Enzymology, vol. 182, M.P. Deutscher editor, Academic Press, San
Digo, CA, 1990). Finalmente, también pude obtenerse un antígeno de
muestra sintéticamente usando técnicas de química orgánica cuando
sea apropiado o conveniente.
La muestra de tejido neoplásico o antígeno
después se introduce, in vitro o in vivo, en una
población celular capaz de producir anticuerpos. Las poblaciones de
células útiles in vitro incluyen células murinas, células
ovinas, células porcinas, células de primate, células humanas,
células transformadas, fusionadas o inmortalizadas, y combinaciones
de las mismas. Se retiran células productoras de anticuerpos de un
animal o cultivo celular y se exponen a un antígeno. Las células
estimuladas con el antígeno pueden usarse directamente o pueden
fusionarse con una línea celular inmortalizada tal como un mieloma
para generar una población de hibridomas productores de anticuerpos.
Se prefieren las técnicas de cultivo in vivo e implican la
inyección directa de la muestra en un animal que contiene una
población respondedora de células productoras de anticuerpos. El
animal puede ser un ser humano u otro primate, un ratón, cabra,
conejo u otro mamífero. Cuando se usan animales, el procedimiento
preferido son inyecciones múltiples de un adyuvante, ya que esto a
menudo conduce a una alta concentración de células productoras de
anticuerpos con especificidad de antígeno con una afinidad muy
fuerte por el antígeno. Después pueden aislarse fácilmente por un
procedimiento quirúrgico, de forma no quirúrgica o de otra forma,
cuando sea apropiado, las células productoras de anticuerpo,
normalmente obtenidas a partir del bazo, pero posiblemente
procedentes de sangre periférica o linfa.
Las células productoras de anticuerpos
estimuladas con antígeno, obtenidas a partir de fuentes in
vitro o in vivo, tal como después de la fusión con una
línea de células de mieloma o de hibridoma, se fijan con una
solución de fijación tal como Sreck Tissue Fixative (Streck Labs;
Omaha, NE), o una solución que contiene un agente químico tal como
carbohidrazida, glutaraldehído, o tetróxido de osmio, pero
preferiblemente formaldehído o combinaciones de estos agentes
químicos. Por ejemplo, se suspenden entre 10^{4} y 10^{8}
células sedimentadas en 0,1 a 2,0 ml de solución de formaldehído al
10% más NaCl 0,15 M. Las células se mantienen en hielo durante un
período de tiempo, se lavan y se sedimentan. Estas células fijadas
después se permeabilizan con una solución de permeabilización que
comprende agentes químicos tales como Nonidet P-40
(NP-40), Brij, Tween, por ejemplo
tween-20, polisorbato, Triton X-100
(TX-100), CHAPS, sorbitán o combinaciones de los
mismos. Por ejemplo, la solución de permeabilización puede
comprender aproximadamente 0,5% de NP-40 que se
añade al sedimento de células fijadas, y la mezcla se incuba en
hielo durante un período de tiempo, se lava, se sedimenta y el
sedimento se dispersa en PBS que contiene glicina 0,1 M para
mantener la estructura celular global. Como alternativa, la
permeabilización puede comprender el tratamiento de las células
fijadas con enzimas tales como proteinasa K. La fijación y
permeabilización deben proporcionar una porosidad adecuada a las
células para permitir la entrada de enzima sin la destrucción
indebida del compartimento celular o de los ácidos nucleicos
presentes dentro del compartimento. La permeabilización permite que
enzimas, nucleótidos y otros reactivos necesarios entren en las
células individuales, ahora compartimentos celulares fijados, para
realizar la transcripción inversa del ARNm de V_{H} y V_{L} en
secuencias de ADNc de V_{H } y V_{L}. El soporte sólido puede
ser cualquier soporte que sea adecuado y no perjudicial para el
procedimiento, tal como una superficie de vidrio o de plástico, o
un polímero de membrana. Las células deben estar en un espacio tan
concentrado como sea posible para minimizar el volumen total. El
pequeño volumen permite añadir cantidades más pequeñas y soluciones
más concentradas de enzimas.
La transcripción inversa puede realizarse en una
sola etapa o en un procedimiento combinado opcional de
transcripción inversa/PCR. La primera solución enzimática comprende,
por ejemplo, una transcriptasa inversa tal como la transcriptasa
inversa de AMV o MMTV, una solución salina equilibrada incluyendo
Tris-HCl, pH 8-8,5, ditiotreitol
(DTT), cloruro potásico (KCl) y cloruro de magnesio (MgCl_{2}),
cantidades suficientes de los cuatro dNTP, y cebadores que se unen
al ARNm proporcionando un grupo 3'-hidroxilo
para que la transcriptasa inversa inicie la polimerización.
Opcionalmente, puede añadirse un inhibidor de RNasa tal como RNasin
(Promega; Madison, WI) para prevenir la ruptura del ARN. Aunque
puede usarse cualquier secuencia de cebador que sea complementaria
al ARNm para facilitar la selección de mensajeros de región
variable, se prefieren los cebadores complementarios al extremo 3'
de las moléculas de ARNm de V_{H} y V_{L}. La síntesis de la
primera cadena se realiza, por ejemplo, a una temperatura de
aproximadamente 42ºC durante aproximadamente 60 minutos. En
Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al.
editors, John Wiley & Sons, NY, 1989) se describen
procedimientos de biología molecular para optimizar procedimientos
enzimáticos tales como estos y otros descritos en este documento en
la práctica de la invención. Después de terminar la reacción, las
células se sedimentan, se lavan para retirar los reactivos de
reacción y se resuspenden en PBS.
Las secuencias de ADNc resultantes se amplifican
por PCR usando cebadores específicos para genes de inmunoglobulina
y, preferiblemente, para las regiones terminales de los ácidos
nucleicos de V_{H} y V_{L}. En la patente de Estados Unidos
número 4.683.195 se describen métodos para la amplificación por PCR.
Preferiblemente, los ADNc se amplifican por PCR y se unen en la
misma reacción usando, además de los cebadores de ADNc, un cebador
para el extremo 5' del gen de la región V_{H} y otro para el
extremo 5' del gen V_{L}. Estos cebadores también contienen colas
complementarias de secuencia extra, para permitir el automontaje de
los genes de V_{H} y V_{L}. Después de la amplificación por PCR
y de la unión, la probabilidad de conseguir productos mixtos, en
otras palabras, regiones variables mixtas, es mínima, debido a que
las reacciones de amplificación y de unión se realizaron dentro de
cada célula. El riesgo de mezcla puede reducirse adicionalmente
utilizando reactivos voluminosos tales como nucleótidos marcados con
digoxigenina para asegurar adicionalmente que los pares de ADNc de
la región V no dejan el compartimento celular y se mezclan entre
ellos, sino que permanecen dentro de la célula para la amplificación
por PCR y la unión. Las secuencias amplificadas se unen por
hibridación de secuencias terminales complementarias. Después de la
unión, las secuencias pueden recuperarse de las células. Por
ejemplo, después de la unión, las células pueden lavarse en una
solución de dodecilsulfato sódico (SDS). El SDS precipita de las
células después de la incubación en hielo y el sobrenadante puede
someterse a electroforesis en un gel de agarosa o de acrilamida.
Como alternativa, o en combinación con el proceso de SDS, usando un
reactivo tal como nucleótidos unidos a digoxigenina, los productos
de ADN sintetizados permanecerán dentro de la célula y se
amplificarán. El producto unido se recupera tras la electroforesis
del sobrenadante.
Después de la electroforesis del sobrenadante, se
retira el corte de gel correspondiente al peso molecular apropiado
del producto unido y el ADN se aísla, por ejemplo, en perlas de
sílice. El ADN recuperado puede amplificarse por PCR usando
cebadores terminales, si es necesario, y clonarse en vectores que
pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, vectores virales
o combinaciones de los mismos. En las secuencias hibridadas pueden
incorporarse sitios de enzimas de restricción convenientes para
facilitar la clonación. Estos vectores también pueden guardarse como
una biblioteca de regiones variables unidas para un uso
posterior.
Como alternativa, después de recuperar las
secuencias de las células lavadas, los genes de la región V_{H} y
V_{L} unidos se amplifican por PCR una segunda vez usando
cebadores anidados terminales, produciendo una población de
fragmentos de ADN que codifican las regiones genéticas V_{H} y
V_{L} unidas. Estos fragmentos de ADN se recuperan de los
sobrenadantes celulares. El agrupamiento de combinaciones de V_{H}
y V_{L} es una ventaja de este proceso y permite la transferencia
en masa o en lotes de todos los clones y todos los fragmentos de
ADN durante este y todos los procedimientos de clonación.
Preferiblemente, los ADNc de V_{H} y V_{L} se unen en una
orientación transcripcional de cabeza a cabeza (\leftarrow
\rightarrow), en oposición a una orientación de cabeza a cola
(\rightarrow \rightarrow o \leftarrow \leftarrow). Esta
orientación transcripcional facilita la transferencia de pares de
región V entre vectores y la producción de anticuerpos intactos o
fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab sin perder las
combinaciones originales de cadena H y L que estaban presentes en la
población original de anticuerpos policlonales.
Además, esta orientación de clonación permite el
agrupamiento de secuencias de control de la transcripción en una
sola región y la expresión controlada de cada gen. La región de
control única puede crearse como un cassette obtenido por ingeniería
genética con múltiples sitios de enzimas de restricción para
transferirse fácilmente entre diferentes vectores. Además, al tener
las secuencias unidas en una orientación transcripcional de cabeza
a cabeza, se permite la transferencia en masa en una sola etapa de
fragmentos de ADN que incluyen las dos regiones variables en un
vector de expresión. Las orientaciones de cabeza a cola generalmente
requieren múltiples etapas de clonación.
Algunas veces, puede ser deseable tratar las
secuencias génicas de región variable con un agente mutante. Los
agentes mutantes crean mutaciones puntuales, huecos, deleciones o
adiciones en la secuencia genética, que pueden ser generales o
específicas, aleatorias o de localización dirigida. Los agentes
mutantes útiles incluyen luz ultravioleta, irradiación gamma,
agentes químicos tales como bromuro de etidio, psoraleno y análogos
de ácido nucleico, o enzimas modificadoras del ADN tales como
enzimas de restricción, transferasas, quinasas y nucleasas y
polimerasas específicas y no específicas. En particular, pueden
introducirse mutaciones aleatorias en las CDR de los genes de las
regiones V_{H} y V_{L} por mutagénesis dirigida a
oligonucleótidos. Las mutaciones introducidas en la secuencia génica
finalmente aumentarán la complejidad y diversidad de la biblioteca
así como la afinidad por antígenos, lo cual puede aumentar
adicionalmente la utilidad de la biblioteca en el tratamiento.
Además, tal mutagénesis puede usarse en un solo par
V_{H}-V_{L} o en un grupo definido de tales
pares para generar una biblioteca de novo.
La clonación se realiza, por ejemplo, escindiendo
el ADNc y las secuencias del vector con una enzima de restricción,
si es necesario aislando ciertos fragmentos de ácido nucleico,
mezclando los fragmentos entre sí en presencia de ligasa en una
solución salina equilibrada adecuada, e incubando la mezcla en
condiciones enzimáticamente aceptables durante un período de tiempo
prescrito. Usando diferentes sitios de reconocimiento de enzimas en
cada extremo de los ADNc, puede predeterminarse la orientación de la
clonación. Los vectores se usan para transformar cultivos de
células hospedadoras aceptables y los cultivos se amplifican para
expandir las diferentes poblaciones de vectores que constituyen la
biblioteca. Las células hospedadoras para vectores procariotas
pueden ser un cultivo de bacterias tales como Escherichia
coli. Las células hospedadoras para vectores eucariotas pueden
ser un cultivo de células eucariotas tales como cualquier línea
celular de mamífero, insecto o levadura adaptada al cultivo de
tejidos. Las células bacterianas se transforman con vectores por
cloruro cálcico-choque térmico o electroporación.
Las células eucariotas se transfectan con precipitación con fosfato
cálcico o electroporación, aunque también serían aceptables muchos
procedimientos de transformación diferentes. Los fragmentos de ADN
pueden clonarse en vectores de expresión procariotas o eucariotas,
vectores quiméricos o vectores dobles. El vector de expresión puede
ser un plásmido, cósmido, fago, vector viral, fagémido y
combinaciones de los mismos, pero preferiblemente es un vector de
presentación de fagos donde el producto recombinante se expresa en
la superficie del fago para facilitar el examen y la selección. En
el vector de expresión pueden ponerse sitios de transcripción y
traducción útiles que incluyen regiones de reconocimiento de la ARN
polimerasa tales como un sitio de caja TATA, un sitio CAT, un
potenciador, sitios de empalme apropiados, si es necesario, una
región terminal rica en AT y un sitio de inicio de la
transcripción. Los sitios útiles para facilitar la traducción
incluyen sitios de inicio y de detención de la traducción y sitios
de unión a ribosomas. Típicamente, algunos de los sitios más útiles
para una expresión eucariota eficaz, tales como la región
promotora/potenciadora de SV40, CMV, HSV o baculovirus, proceden de
virus. El anticuerpo recombinante resultante puede ser de la clase
murina IgG_{1}, IgG_{2A}, IgG_{2B}, IgM, IgA, IgD o IgE, de
las clases humanas IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM,
IgA_{1}, IgA_{2}, IgD o IgE, o combinaciones o fragmentos de las
mismas. Preferiblemente, la biblioteca de anticuerpo quimérico se
compone principalmente de anticuerpos IgG o de fragmentos de
anticuerpos Fab.
La amplificación de la población de vectores se
realiza por medio de la incubación y expansión de los cultivos de
células recombinantes. Los cultivos de células bacterianas se
desarrollan, por ejemplo, en caldo L a 37ºC, durante una noche. Las
células eucariotas se incuban, por ejemplo, a 37ºC en un incubador
de CO_{2} de alta humedad durante 1-7 días o más
por paso. En este punto, es de esperar que la complejidad de la
biblioteca sea bastante alta, con grandes números de vectores para
cada población de vectores diferente. La población contiene una
secuencia de ácido nucleico representativa para todas o casi todas
las regiones variables que se crearon en respuesta al antígeno
inicial.
Una característica de la invención es la
facilidad con la que los pares de elementos genéticos, que contienen
regiones variables intactas y expresables, pueden transferirse
dentro y entre vectores tales como vectores procariotas, eucariotas
y de mamífero. Pueden transferirse con igual eficacia bibliotecas
enteras o sub-bibliotecas. La transferencia
se realiza abriendo, preferiblemente con enzimas de restricción con
especificidad de sitio, el vector entre las regiones codificantes
para el extremo amino de las proteínas de la región variable. En
este área pueden insertarse cassettes que contienen secuencias
promotoras y líder en una orientación de cabeza a cabeza
(líder-promotor-promotor-líder;
lPPl), que pueden ser procariotas o de mamífero, para
reemplazar la región de control existente o como primera región de
control. Los tramos de ADN que constituyen los genes de la región
variable y el cassette lPPl después se amplifican por PCR
usando cebadores apropiados y se transfieren entre vectores. Cuando
se desee, pueden transferirse rápida y fácilmente lotes de regiones
V unidas con o sin las regiones promotor-líder,
tales como bibliotecas enteras o partes de bibliotecas. Estos
segmentos de ADN pueden incorporarse en el ADN de vectores de
presentación de fagos para un análisis rápido, de cósmidos para el
almacenamiento a largo plazo, o de vectores de expresión de
mamífero para la expresión posterior. La expresión puede realizarse
para la producción de anticuerpos policlonales o para la selección
de bibliotecas de presentación en superficie, que pueden ser
procariotas o eucariotas, para aislar una o más
sub-bibliotecas. Otra característica de la invención
es la capacidad de incorporar secuencias extra en los vectores para
facilitar la manipulación, tal como con sitios de enzimas de
restricción adicionales, o regiones reguladoras de la transcripción
o la traducción adicionales para facilitar o controlar
adicionalmente la expresión de proteínas.
Las bibliotecas de vectores de expresión, de
mamífero o bacterianas que codifican anticuerpos
anti-neoplásicos recombinantes, o fragmentos de
anticuerpos, pueden seleccionarse en sub-bibliotecas
por adsorción de la partícula recombinante, que puede ser una
célula procariota o eucariota o un virus, contra un tejido
neoplásico o no neoplásico. La selección reducirá la complejidad
global de la biblioteca, pero la complejidad específica de antígeno
de la sub-biblioteca no debe verse afectada
significativamente. El tejido puede ser otra muestra del mismo
tejido en el que se expusieron las células productoras de
anticuerpo u otro tejido de un paciente diferente o del mismo
paciente. Por ejemplo, puede ser muy útil un tejido no neoplásico
del mismo paciente para retirar anticuerpos de unión a antígenos no
neoplásicos expresados en la superficie del fago de presentación.
Como alternativa, puede ser muy útil un tejido neoplásico del mismo
paciente o de un paciente diferente con el mismo trastorno para
aislar los anticuerpos anti-neoplásicos específicos.
En cualquier situación, el tejido o el antígeno puede fijarse a un
soporte sólido y los vectores de expresión en masa someterse, por
ejemplo, a técnicas de cromatografía de afinidad, aislando el flujo
de líquido que pasa a su través o los lavados cuando se desee.
Además, la población de vectores puede seleccionarse, por ejemplo,
por transferencia de Western del antígeno expresado, o por
transferencia de Southern o de Northern para identificar el ácido
nucleico. Los vectores seleccionados resultantes, o
sub-bibliotecas, se amplifican por cultivo y
expansión de la población del organismo hospedador. Si es necesario,
los fragmentos de ADN en los vectores de expresión bacterianos
pueden transferirse a vectores de expresión de mamíferos tales como,
por ejemplo, cassettes, porque las regiones unidas creadas están
flanqueadas con sitios de enzimas de restricción. Una
característica de este aspecto de la invención es que más de 99,9%
de la biblioteca puede retirarse durante la selección, pero el
resto de la población de vectores, la subpoblación, aún puede
amplificarse para crear grandes números de vectores o cantidades de
proteína. En efecto, no se pierde nada de la complejidad específica
de la sub-biblioteca seleccionada y, además, esta
sub-biblioteca puede transferirse intacta y en masa
entre vectores tan fácilmente como la biblioteca original.
Las poblaciones expandidas y amplificadas de
vectores de expresión seleccionados pueden almacenarse para un uso
posterior, administrarse a un paciente directamente, si lo permiten
las condiciones de seguridad, o los productos pueden transcribirse
y traducirse y los anticuerpos antineoplásicos expresados pueden
administrarse al paciente. La administración puede realizarse por
vía parenteral, sublingual, rectal o entérica. Normalmente se
prefiere la administración parenteral, que incluye inyección
intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección
intramuscular (i.m.), inyección intra-arterial,
inyección intratecal, inyección intraperitoneal (i.p.) o inyección
directa en un sitio del neoplasma. Pueden administrarse anticuerpos
o vectores, pero se prefiere la administración de anticuerpos
porque una expresión eficaz del vector puede ser una complicación
adicional, o puede haber problemas de seguridad asociados con la
introducción de un ADN de vector recombinante en el animal.
Los trastornos neoplásicos que se pueden tratar
por estos métodos son muchos e incluyen leucemias, linfomas,
sarcomas, carcinomas, tumores de células neurales, carcinomas de
células escamosas, tumores de células germinales, metástasis,
tumores indiferenciados, seminomas, melanomas, neuroblastomas,
tumores de células mixtas, neoplasias causadas por agentes
infecciosos y otras malignidades. La naturaleza ubicua del método
se debe, en parte, a su capacidad de utilizar muestras de casi
cualquier antígeno. Preferiblemente, el paciente tratado es un ser
humano, pero también se puede tratar cualquier mamífero con un
sistema inmune humoral funcional. Los pacientes pueden tratarse
terapéutica o profilácticamente, cuando sea necesario, de acuerdo
con protocolos prescritos. Por ejemplo, ciertos cánceres pasan a
través de ciclos sucesivos de progresión y regresión durante meses
o años. Las bibliotecas pueden prepararse y administrarse poco
antes de la fase progresiva para inhibir el crecimiento del cáncer,
la invasión de otros tejidos o el proceso de metástasis. Las
bibliotecas también pueden administrarse como una inyección en
embolada para eliminar el cáncer en una sola dosis o con varias
dosis.
La biblioteca también puede administrarse junto
con un agente antineoplásico que estimule el propio sistema inmune
del paciente, tal como un factor de crecimiento de células T,
factor de crecimiento de células B, factor de crecimiento de
granulocitos/macrófagos, factor de crecimiento de granulocitos,
factor de crecimiento de macrófagos, factor de crecimiento de
células madre, factor de crecimiento de trasformación,
eritropoyetina, factor de steel, proteína morfogénica de hueso,
agente de diferenciación, interleuquina, interferón, hormona,
componente del sistema de complemento, o una combinación de los
mismos. El protocolo de tratamiento del paciente también puede
implicar otras formas de terapia tales como quimioterapia,
radioterapia, dieta o terapia con inmunotoxinas. Los agentes
quimioterapéuticos útiles incluyen agentes alquilantes, análogos de
purinas y pirimidinas, vinca alcaloides y alcaloides parecidos a
éstos, etopósidos y fármacos parecidos a etopósido, antibióticos,
corticosteroides, nitrosoureas, antimetabolitos, fármacos
citotóxicos basados en platino, antagonistas hormonales,
anti-andrógenos y anti-estrógenos.
Estos tratamientos pueden incorporarse en un protocolo global para
el tratamiento de la neoplasia del paciente.
La terapia inmunotóxica puede facilitarse por los
métodos descritos en este documento. Por ejemplo, pueden clonarse
fragmentos de ADN recombinante que codifican los fragmentos de
anticuerpo tanto V_{H} como V_{L} en vectores de expresión que
codifican la región constante del anticuerpo y una sustancia tóxica.
Por lo tanto, los productos de fusión expresados tendrán un alto
número de anticuerpos diferentes contra la neoplasia diana,
uniéndose cada uno de ellos a una sustancia tóxica tal como una
toxina animal, vegetal, bacteriana, fúngica, viral o parasitaria. La
administración de la biblioteca de anticuerpos al paciente, además
de reclutar las defensas inmunes del hospedador, pondrá a la toxina
en contacto directo con la célula enferma, lo cual puede facilitar
la destrucción de la neoplasia. Las sustancias tóxicas especialmente
útiles incluyen toxinas derivadas de ciertas plantas y bacterias
tales como las toxinas de Pseudomonas, toxinas de
Diphtheria, toxinas de Escherichia y ricina.
Otra realización de la invención se refiere a un
método para obtener imágenes de un trastorno neoplásico en un
paciente. Se crea una biblioteca de anticuerpos
anti-neoplásicos con especificidad de paciente como
se ha descrito anteriormente, y se mezcla con un vehículo
farmacéuticamente aceptable tal como agua, una sal o solución
tamponada, glicerol, aceite, un sacárido o polisacárido, celulosa o
almidón, alcohol o combinaciones de los mismos. Los anticuerpos de
la biblioteca se marcan con un marcador detectable y se administran
al paciente. Los anticuerpos migran a lo largo del cuerpo y se unen
a la diana, que puede ser la neoplasia o metástasis neoplásica, y
se forma una imagen del marcador en el paciente. Los marcadores
detectables que pueden ser útiles para este procedimiento incluyen
radioisótopos, isótopos estables, enzimas, compuestos
fluorescentes, compuestos luminiscentes, compuestos cromáticos,
metales o cargas eléctricas. La neoplasia ahora marcada puede
detectarse por medios adecuados para el marcador, tales como con un
contador de radiaciones iónicas Geiger, un formador de imágenes de
resonancia magnética nuclear (RMN), detectores visuales o a simple
vista, o por autorradiografía.
Otra realización de la invención se refiere a una
composición que comprende una biblioteca con especificidad de
paciente de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
anti-neoplásicos y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. La composición se administra a pacientes con la
neoplasia característica contra la que se dirigieron los
anticuerpos creados. El vehículo farmacéuticamente aceptable es un
compuesto o medio que facilita la administración, aumenta la vida
en almacenamiento de la composición o aumenta la utilidad de la
composición en el paciente, tal como aumentando la vida media
circulante o en suero. Los vehículos útiles incluyen agua, solución
salina, alcohol, glicoles incluyendo polietilenglicol, aceite,
polisacáridos, sales, glicerol, estabilizadores, emulsionantes y
combinaciones de los mismos. La composición puede comprender
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, preferiblemente fragmentos
Fab, seleccionados entre el grupo compuesto por las clases murinas
IgG_{1}, IgG_{2A}, IgG_{2B}, IgM, IgA, IgD e IgE, las clases
humanas IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM, IgA,
IgA_{2}, IgD e IgE, y combinaciones o fragmentos de las mismas. La
composición también puede conservarse durante largos períodos de
tiempo por diálisis o liofilización de las proteínas para retirar
todo el líquido. Los anticuerpos liofilizados pueden ser estables a
temperatura ambiente durante años.
\newpage
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para crear y utilizar una biblioteca de anticuerpos
policlonales o fragmentos de anticuerpos con especificidad de
antígeno o de tejido como se ha descrito anteriormente. Se obtiene
una muestra de tejido biológico o antígeno, aislado de forma
natural, recombinante o sintética, posiblemente a partir del
paciente a tratar o de un paciente con un trastorno relacionado. El
tejido biológico o antígeno usado para estimular las células
productoras de anticuerpo puede obtenerse a partir de tejidos
tumorales, de sangre y de tejidos relacionados con la sangre,
tejidos de biopsia, tejidos infectados, bacterias, virus, hongos,
parásitos, tejidos malignos, tejidos genéticamente anormales o
combinaciones de los mismos, o de una fuente ambiental tal como una
masa de agua, suelo, residuos naturales o hechos por el hombre o
biomasa. La muestra se introduce en una población celular capaz de
producir anticuerpos. El ARNm de V_{H} y V_{L} de la población
celular se transcribe de forma inversa en secuencias de ADNc de
V_{H} y V_{L} que se amplifican por PCR, uniéndose las
secuencias amplificadas resultantes. Las secuencias unidas se
amplifican por PCR para crear una población de fragmentos de ADN
que codifican fragmentos de anticuerpo de V_{H} y V_{L} que se
clonan en vectores de expresión, y la población de vectores de
expresión clonados se expande. Los vectores de expresión que
codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con especificidad
de antígeno o de tejido pueden seleccionarse y la subpoblación
seleccionada puede expandirse para producir la biblioteca. La
biblioteca de fragmentos policlonales puede clonarse en fase en
otros vectores de expresión que codifican secuencias génicas de
región constante de anticuerpo para expresar anticuerpos
policlonales o fragmentos de anticuerpos. Después, estos anticuerpos
pueden inyectarse por vía intravenosa o subcutánea en el caso de
infecciones sistémicas, pueden aplicarse directamente a una herida
para un tratamiento localizado, o pueden administrarse de otra
manera al paciente cuando sea necesario.
Las bibliotecas con especificidad de enfermedad o
con especificidad de antígeno pueden usarse en métodos para tratar
o prevenir trastornos tales como infecciones virales, fúngicas,
parasitarias o bacterianas, anormalidades genéticas e
intoxicaciones. Por ejemplo, pueden crearse bibliotecas de
anticuerpos contra la proteína gp120 del virus
VIH-1, que produce el síndrome de deficiencia
autoinmune (SIDA), y pueden administrarse a pacientes con SIDA para
reducir la muerte celular inducida por el virus, la carga viral o
la infectividad, o como profilaxis para prevenir una posible
infección después de una exposición o cuando existe riesgo de
exposición. Pueden usarse bibliotecas para reemplazar o suplementar
otras formas de inmunoterapia pasiva tales como tratamientos con
gamma globulina en el caso de enfermedades tales como la rabia, la
hepatitis, el virus varicela-zoster, el herpes o la
rubéola. Por ejemplo, puede administrarse periódicamente una
biblioteca anti-rubéola cuando sea necesario a
mujeres embarazadas con riesgo de contraer la rubéola por contagio
de otro miembro de la familia. Esta estrategia carece de efectos
secundarios perjudiciales y es eficaz. Podrían administrarse
anticuerpos anti-herpes a individuos no infectados
con parejas infectadas. La meningitis puede ser una enfermedad
amenazadora para la vida, especialmente en niños, porque no siempre
puede determinarse un tratamiento eficaz y administrarse
rápidamente. Por el contrario, las bibliotecas de anticuerpos
policlonales anti-meningitis pueden almacenarse y
usarse cuando se sospechen casos porque el riesgo de las
complicaciones del tratamiento es muy bajo. Los anticuerpos
policlonales creados por estos métodos pueden suplementar vacunas
de influenza convencionales proporcionando protección contra la
influenza durante un corto período de tiempo hasta que el propio
sistema inmune del hospedador pueda crear una respuesta de
anticuerpos suficiente contra el antígeno.
Las bibliotecas policlonales también pueden ser
útiles como profilaxis o tratamiento en pacientes con quemaduras que
son susceptibles de una amplia diversidad de infecciones adquiridas
en el hospital debidas a, por ejemplo, Staphylococcus,
Streptococcus, Hemophilus, Neisseria,
Pseudomonas y los actinomicetes. Las bibliotecas pueden
usarse para tratar o prevenir, o mejorar los síntomas asociados con
sepsis bacterianas, por medio de la creación y administración de
bibliotecas dirigidas contra lipopolisacáridos (LPS), lípido A,
factor de necrosis tumoral o proteínas de unión a LPS. También
pueden tratarse con bibliotecas de anticuerpos policlonales otras
intoxicaciones tales como trastornos gastrointestinales inducidos
por microorganismos bacterianos o virales, toxicosis producidas por
levaduras u otras infecciones micóticas, o una intoxicación inducida
ambientalmente por metales perjudiciales tales como plomo o
aluminio, pesticidas, residuos industriales, carcinógenos y otros
compuestos orgánicos o inorgánicos perjudiciales.
Otra realización de la invención se refiere a un
kit de diagnóstico para la detección de una enfermedad o trastorno
en un paciente, o de un contaminante en el medio, que comprende una
biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con
especificidad de antígeno, tejido o paciente. El kit de diagnóstico
puede usarse para detectar enfermedades tales como infecciones
bacterianas, virales, parasitarias o micóticas, neoplasias, o
defectos o deficiencias genéticas. La muestra biológica puede ser
sangre, orina, bilis, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático,
fluido amniótico o fluido peritoneal, preferiblemente obtenido a
partir de un ser humano. Las bibliotecas preparadas a partir de
muestras obtenidas del medio pueden usarse para detectar
contaminantes en muestras recogidas en ríos y corrientes, masas de
agua salada o de agua dulce, de suelo o de rocas, o muestras de
biomasa. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero, tal como una
IgG, o un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab. La
biblioteca puede marcarse con un marcador detectable o el kit puede
comprender además un anticuerpo secundario marcado que reconoce y se
une a complejos de antígeno-anticuerpo.
Preferiblemente, el marcador detectable es detectable visualmente,
tal como una enzima, un agente químico fluorescente, un agente
químico luminiscente o un agente químico cromático, lo cual
facilitaría la determinación de los resultados de ensayo al usuario
o al médico. El diagnóstico puede comprender además agentes para
aumentar la estabilidad y la vida media, para inhibir o prevenir la
contaminación del producto y para aumentar la velocidad de
detección. Los agentes estabilizadores útiles incluyen agua,
solución salina, alcohol, glicoles incluyendo polietilenglicol,
aceite, polisacáridos, sales, glicerol, estabilizadores,
emulsionantes y combinaciones de los mismos. Los agentes
antibacterianos útiles incluyen antibióticos, agentes químicos
bacteriostáticos y agentes químicos tóxicos para las bacterias. Los
agentes para optimizar la velocidad de detección pueden aumentar la
velocidad de reacción, tales como sales y tampones.
Otra realización de la invención se refiere a un
método para crear una biblioteca de proteínas receptoras o de
cualquier proteína que muestre variabilidad. Las proteínas
receptoras que pueden utilizarse en este método pueden ser cualquier
proteína eucariota o procariota que tenga regiones variables,
incluyendo receptores de células T tales como los TcR, receptores
de células B incluyendo inmunoglobulinas, receptores de células
destructoras naturales (NK), receptores de macrófagos, y partes y
combinaciones de los mismos. En resumen, una muestra de tejido
biológico, tal como un tejido normal, un tejido neoplásico, un
tejido infectado, tejidos que contienen proteínas de la matriz
extracelular (ECM), o cualquier tejido anormal, se introduce en una
población celular capaz de producir las proteínas receptoras. La
población celular se fija y las células se permeabilizan. Los ARNm
de región variable de las proteínas receptoras se transcriben de
forma inversa en secuencias de ADNc usando una transcriptasa
inversa. Las secuencias de ADNc se amplifican por PCR y se unen,
preferiblemente por hibridación de secuencias complementarias, a
las regiones terminales de estos ADNc. Las secuencias unidas se
amplifican por PCR para crear una población de fragmentos de ADN
que codifican las regiones variables de las proteínas receptoras.
Estos fragmentos de ADN contienen las regiones variables unidas,
preferiblemente, en una orientación de transcripción de cabeza a
cabeza, y se clonan en masa en vectores de expresión. Los vectores
de expresión útiles incluyen fagos tales como fagos de presentación,
cósmidos, vectores virales, fagémidos o combinaciones de los
mismos, y estos vectores se utilizan para transformar organismos
hospedadores, expandiéndose posteriormente las diferentes
poblaciones de organismos. Se seleccionan los vectores de expresión
que codifican las proteínas receptoras recombinantes y la
subpoblación se expande. Si es necesario, la subpoblación puede
subclonarse en vectores de expresión que contienen genes de región
constante de receptores en fase y la biblioteca puede expandirse de
nuevo y expresarse para producir la sub-biblioteca
de proteínas receptoras seleccionadas. Pueden crearse fácilmente
bibliotecas quiméricas por clonación de los genes de región
variable seleccionados en vectores de expresión que contienen genes
de región constante de otras proteínas, tales como genes de región
constante de anticuerpos o genes de receptores de células T. Las
sub-bibliotecas seleccionadas pueden usarse
directamente o transferirse a otros vectores de expresión antes de
utilizarse para transfectar a las células hospedadoras. Las células
hospedadoras pueden ser células T procedentes del paciente que,
cuando se introducen de nuevo en el paciente, expresan la biblioteca
de receptores en su superficie. Este tipo de terapia de células T
puede usarse para estimular una respuesta inmune para tratar las
mismas enfermedades que se han descrito para la terapia con
anticuerpos.
Usando los métodos descritos anteriormente para
la creación de bibliotecas de anticuerpos policlonales y de
bibliotecas de receptores de células T, pueden crearse bibliotecas
de proteínas de fusión quiméricas que contengan las regiones
variable de anticuerpos unidas a las regiones constantes de
receptores de células T. Tales bibliotecas pueden ser útiles para
tratar o prevenir enfermedades y trastornos como los descritos
anteriormente, por medio de la estimulación o potenciación de la
respuesta inmune de un paciente. Por ejemplo, la unión de un
antígeno al receptor de células T es una parte integral de la
respuesta inmune. Al proporcionar una biblioteca de anticuerpo
quimérico/proteína TcR y por medio de la transfección de una
población de células T del paciente con esta biblioteca, se puede
potenciar la propia respuesta inmune del paciente para eliminar una
enfermedad o trastorno que no podría superarse satisfactoriamente
de otra forma.
Otra realización de la invención se refiere a
vectores de ácido nucleico que pueden usarse para crear las
bibliotecas y sub-bibliotecas de anticuerpos
policlonales con especificidad de antígeno. Estos vectores
comprenden sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
convenientes para la clonación y secuencias para amplificar por PCR
de forma eficaz fragmentos de ácido nucleico recombinantes. Los
vectores adecuados incluyen plásmidos, fagos, fagémidos, fagos de
presentación, cósmidos, vectores virales y combinaciones de los
mismos. Se diseñan vectores que tengan uno o más pares de
fragmentos genéticos, tales como fragmentos de ADNc, insertados en
una orientación transcripcional de cabeza a cabeza. Preferiblemente,
los vectores son vectores de expresión y pueden ser procariotas,
eucariotas o combinaciones o partes de los mismos. Estos vectores
también contienen preferiblemente secuencias controladoras de la
transcripción y la traducción tales como cajas TATA, cajas CAT,
sitios de unión a ribosomas, sitios de iniciación y terminación de
la ARN polimerasa, secuencias líder, promotores fuertes de la
transcripción, que pueden regularse, o partes o combinaciones de
los mismos.
A modo de ejemplo, un vector útil puede
construirse como se representa gráficamente en la Figura 2. En
primer lugar, la cadena principal del vector puede obtenerse a
partir de un vector de fagémido disponible en el mercado tal como
pUC119 (United States Biochemical; Cleveland, OH) como se muestra en
la Figura 2B. Se usan dos cebadores para amplificar una cadena
principal de pUC119 comenzando en el extremo de un lacZ' y
terminando al principio de lacI. El cebador de avance es
complementario al extremo del lacZ' y tiene una cola que no hibrida
que contiene un sitio BglII. El cebador inverso es complementario
al principio de lacI y tiene una cola que no hibrida que contiene
un sitio BstEII. Después de la amplificación por PCR, esta cadena
principal se digiere con BglII y BstEII y se une a un inserto BstEII
(Figura 2B). El inserto BstEII se obtiene como se indica a
continuación (Figura 2A): En primer lugar, el polienlazador de pUC19
(New England Biolabs; Beverly, MA) se reemplaza por un polienlazador
que contiene
BglII-EcoRI-HindIII-BstEII,
donde cada sitio de restricción está separado por seis nucleótidos.
El reemplazo se consigue digiriendo pUC19 con EcoRI y HindIII,
retirando los salientes con nucleasa S1 y uniendo la cadena
principal a un enlazador sintético de doble cadena que contiene los
sitios
BglII-EcoRI-HindIII-BstEII
para generar pUC19 modificado (pUC19mod). (Obsérvese que pUC19 sólo
se usa para proporcionar un polienlazador que contiene sitios de
enzimas de restricción. En su lugar podría usarse cualquier otro
vector, existente o creado fácilmente que contenga un polienlazador
con los sitios de restricción apropiados.) Un gen C_{\kappa} se
transcribe de forma inversa a partir de ARN procedente de
leucocitos humanos, y se amplifica por PCR usando un cebador
inverso que comprende una cola 5' que no hibrida que contiene un
sitio de restricción BstEII, un sitio de terminación de la
traducción (sitio stop) y un sitio XbaI, y un cebador de avance que
comprende una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio de
restricción HindIII. Este producto de PCR se digiere con BstEII y
HindIII y se une a una cadena principal de pUC19mod
BstEII-HindIII para generar
pUC19-C_{\kappa}. Se sintetiza un fragmento de ADN
EcoRI-BglII que contiene el gen CH1 de \gamma1
humano encadenado al segmento génico gIII que codifica un fragmento
de la proteína de recubrimiento del fago cpIII (aminoácidos
198-407). En resumen, se amplifica un fragmento
génico de la proteína de recubrimiento de cpIII a partir de un
vector M13 tal como M13mp18 (New England BioLabs; Beverly MA)
usando un cebador inverso complementario a la secuencia terminal del
fragmento de cpIII, pero con una cola 5' que no hibrida que
contiene un sitio BglII, un sitio de terminación de la traducción
(sitio stop) y un sitio NheI. El cebador de avance para la
amplificación del fragmento de cpIII es complementario a cpIII y
tiene una cola 5' que no hibrida que contiene secuencias
complementarias al extremo del gen CH1 y un sitio SpeI. El gen CH1
humano se transcribe de forma inversa a partir de ARN procedente de
leucocitos humanos y se amplifica por PCR usando un cebador inverso
complementario al extremo del gen CH1 de \gamma1 con una cola 5'
que no hibrida que contiene un sitio SpeI. El cebador de avance es
complementario al principio del gen CH1 con una cola 5' que no
hibrida que contiene un sitio EcoRI. Como los cebadores de avance e
inverso contienen extremos complementarios, los productos de PCR de
cpIII y CH1 se encadenan por PCR de extensión solapante usando el
cebador inverso de cpIII y el cebador de avance de CH1. El producto
de PCR resultante se corta con EcoRI y BglII y se une a una cadena
principal EcoRI-BglII derivada de
pUC19-C_{\kappa}, para generar
pUC19-C-{K}-CH1. El inserto
BglII-BstEII se retira y se une a la cadena
principal BglII-BstEII derivada de pUC119 para
generar el vector de tipo phh3hu,
pUC119-C_{\kappa}-CH1 (Figura
2B).
También puede generarse fácilmente un cassette de
tipo lPPl (Figura 2C). Un fragmento
BamHI-XhoI se monta a partir del promotor tac (Ptac)
y secuencias líder pelB. La secuencia líder pelB se obtiene por
amplificación por PCR a partir del vector pET-22b
(Norvagen, Inc.; Madison, WI) usando un cebador de avance, y un
cebador inverso con una cola 5' que no hibrida que contiene un
sitio XhoI y codones para LKVQA. La secuencia Ptac se obtiene por
amplificación por PCR a partir del vector pDR540 (Pharmacia Biotech;
Piscataway, NJ) usando un cebador de avance con una cola 5' que no
hibrida que contiene un sitio BamHI y un cebador inverso con una
cola 5' que no hibrida que es complementaria a la secuencia del
principio del líder pelB en pET-22b. El líder pelB
y los productos de PCR de Ptac pueden hibridar a través de sus
extremos complementarios y se encadenan por PCR de extensión
solapante usando los cebadores que contienen BamHI y XhoI. El
producto de PCR resultante se digiere con XhoI y BamHI y se une a
una cadena principal XhoI-BamHI derivada de pUC19Xho
para generar pPl. (La cadena principal de pUC19Xho se forma
digiriendo pUC19 con HindIII, rellenando los salientes con Klenow y
uniendo la cadena principal con un enlazador XhoI.) Se monta un
fragmento BamHI-SacI a partir del promotor lacZ
(PlacZ) y la secuencia líder de gIII de la proteína de
recubrimiento cpIII de M13. La secuencia líder de gIII se obtiene
por amplificación por PCR a partir de M13mp18 usando un cebador de
avance y un cebador inverso que tiene una cola 5' que no hibrida
que contiene un sitio SacI y los codones para EA. La secuencia
PlacZ se obtiene por amplificación por PCR a partir de pUC119
usando un cebador de avance con una cola 5' que no hibrida que
contiene un sitio BamHI y un cebador inverso con una cola 5' que no
hibrida que es complementaria a la secuencia del principio del
líder de gIII. El líder de gIII y los productos de PCR de PlacZ
pueden hibridar a través de sus extremos complementarios y se
encadenan por PCR de extensión solapante usando los cebadores
terminales que contienen BamHI y SacI. El producto de PCR
resultante se digiere con SacI y BamHI y se une a una cadena
principal SacI-BamHI derivada de pPl para
generar el vector de tipo plPPl plPPl2. Como se
muestra en la Figura 2D, pueden insertarse genes de región
V_{H}-V_{L} unidos cabeza a cabeza en el vector
pUC119-C_{\kappa}-CH1. Los
vectores resultantes pueden abrirse con XhoI y SacI para insertar
un cassette lPPl del vector plPPl2 para generar
pJS.
Otra realización de la invención se refiere a un
método para transferir una biblioteca de fragmentos de ácido
nucleico entre diferentes vectores sin una pérdida significativa de
diversidad de la biblioteca. La biblioteca puede ser una biblioteca
de fragmentos de ADNc, fragmentos de ADN genómico, ácidos nucleicos
recombinantes, ARN o una combinación de los mismos. Los fragmentos
se insertan en primeros vectores en una orientación transcripcional
de cabeza a cabeza. La inserción puede realizarse por unión de los
ácidos nucleicos a vectores abiertos por escisión con enzimas de
restricción. Los fragmentos pueden modificarse antes de la
inserción, tal como por la adición de enlazadores y enzimas de
restricción u otros sitios, o por la unión a secuencias codificantes
adicionales. El primero y el segundo vectores pueden ser vectores
procariotas o eucariotas y preferiblemente son vectores de
expresión. Las secuencias insertadas se obtienen a partir de los
primeros vectores y se reinsertan en segundos vectores sin una
pérdida significativa de la diversidad de biblioteca. Los
fragmentos pueden obtenerse por escisión de los primeros vectores
recombinantes, en masa, con enzimas de restricción apropiadas. Como
alternativa, las secuencias de los fragmentos pueden obtenerse por
amplificación por PCR de las secuencias insertadas. La reinserción
se realiza por unión de las secuencias a los segundos vectores, pero
las secuencias pueden modificarse si se desea antes de la unión
como se ha descrito. La diversidad global de la biblioteca
comprende más de al menos diez fragmentos diferentes,
preferiblemente 100 fragmentos diferentes, más preferiblemente 1000
fragmentos diferentes, incluso más preferiblemente al menos 10.000
fragmentos diferentes y posiblemente muchos más, tal como 10^{5}
10^{6}, 10^{7}, 10^{8} y 10^{9} fragmentos diferentes.
Después de la transferencia, es de esperar que la diversidad de la
biblioteca, como la que puede medirse analizando los recombinantes
resultantes, se reduzca en menos de 90%, preferiblemente en menos
de 50%, más preferiblemente en menos de 10% e incluso más
preferiblemente en menos de 1%, y aún más preferiblemente en menos
de 0,1%, aunque esto puede depender en mayor medida del tipo
particular de biblioteca que se vaya a crear.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de
la invención, pero no deben considerarse limitantes del alcance de
la invención.
Se obtuvieron desechos patológicos de tumores
humanos y tejidos normales del Departamento de Patología Quirúrgica
del Centro Médico de la Universidad de Boston. De los tumores
procesados, tres fueron carcinomas de ovarios, dos fueron
adenocarcinomas de útero, uno fue un mesotelioma del peritoneo, y
uno procedía del suelo oral de un tumor de boca. Se congelaron
rápidamente dos piezas del tejido tumoral y dos piezas de cualquier
tejido normal disponible en OCT (poli(alcohol vinílico),
cloruro de benzalconio, polietilenglicol, todos en H_{2}O
destilada; Miles Laboratories; Kankakee, IL) para la preparación
posterior de secciones congeladas (criostato). Si se disponía de
suficiente tejido normal, algunas muestras se congelaron rápidamente
sin OCT para la preparación posterior de membranas para la
absorción posterior de anticuerpo.
Los tejidos tumorales se trituraron en piezas de
aproximadamente 1 mm^{3} y se digirieron durante 45 minutos a
37ºC con una mezcla de enzimas que constaba de 1 mg/ml de colagenasa
de tipo IA, 1 mg/ml de colagenasa de tipo IV, 200 pg/ml de DNasa, y
100 unidades/ml de hialuronidasa en Medio de Dulbecco Modificado de
Iscove (IMDM). La mezcla se filtró a través de nitex para eliminar
las piezas no digeridas y para recoger suspensiones celulares que
se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en ratones desnudos BALB/c
para desarrollar tumores, para prepararse en cultivos de explantes
en medio suplementado con D-Val, y para congelarse
como alícuotas en 90% de suero humano/10% de dimetilsulfóxido
(DMSO).
Las células suspendidas se lavaron con IMDM y se
introdujeron en gradientes por etapas de Percoll/solución salina
tamponada con fosfato (PBS). Se aislaron células tumorales de la
interfase entre 1,07 g/ml de Percoll y la PBS. Las células
tumorales aisladas se inyectaron en ratones BALB/c i.p. para obtener
anticuerpos anti-tumor, se inyectaron s.c. en
ratones desnudos BALB/c para desarrollar tumores, se prepararon en
cultivo en medio D-Val suplementado con 30% de una
mezcla dializada de partes iguales de suero humano, suero bovino
fetal (FBS) y sobrenadante de células de cultivo de fibroblastos de
rata, para establecer las líneas celulares, y se congelaron en
alícuotas con 90% de suero humano/10% de DMSO para un uso
posterior.
Uno de los tumores de ovarios procesados se
diagnosticó como un adenocarcinoma moderadamente diferenciado. En
el día de la cirugía, se obtuvieron las siguientes muestras a
partir de la paciente; una muestra de tumor del ovario, una
metástasis de ganglio linfático, y miometrio normal, endometrio e
intestino delgado. Las muestras de tejido tumoral y normal se
procesaron como se ha descrito anteriormente. La fracción
enriquecida en células tumorales, aislada en el gradiente de
Percoll, constaba principalmente de pequeños cúmulos de células
grandes y no pudo realizarse un recuento directo de las células. Los
números de células se estimaron después de la centrifugación,
basándose en la experiencia con células de tamaño similar. Se
estimó una recuperación de 2 x 10^{8} células del tumor de ovario.
Se analizó una preparación posterior en citospin de las células y
se determinó que contenía principalmente células tumorales. A cada
uno de cuatro ratones BALB/c se les inyectaron i.p. 0,25 ml de esta
suspensión celular en IMDM (con una estimación de 10^{7} células
por ratón) para producir anticuerpos antitumorales.
A un ratón desnudo se le inyectaron s.c. 0,2 ml
de tumor triturado en IMDM procedente del ovario. A otro ratón
desnudo se le inyectaron s.c. 0,2 ml de tumor triturado procedente
del ganglio linfático. Los dos ratones desnudos desarrollaron
tumores subcutáneos. Los tumores fueron evidentes
15-18 días después de la inyección. El ratón al que
se le inyectó el tumor procedente de ovario fue sacrificado un mes
después de la inyección, momento en el que el tumor tenía unas
dimensiones de aproximadamente 1,5 cm x 1 cm x 0,5 cm. Un análisis
de una preparación en citospin de células aisladas de este tumor
por centrifugación con gradiente de Percoll demostró que era de
origen humano y del mismo tipo que el tumor ovárico original. Este
tumor pudo propagarse adicionalmente tanto en ratones desnudos como
en ratones SCID por inyección s.c. de piezas de tumor recién
trituradas o de piezas de tumor que se habían congelado en 90% de
suero humano/10% de DMSO y descongelado para la inyección.
El tumor que se desarrolló en el ratón desnudo al
que se le habían inyectado piezas de tumor derivadas de la
metástasis de ganglio linfático se procesó adicionalmente. Después
de congelar rápidamente una muestra en nitrógeno líquido, el tumor
se trituró en piezas de 1 cm. La mitad de las piezas trituradas se
congelaron en alícuotas de aproximadamente 0,4 ml (piezas de tumor
empaquetadas) en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se almacenaron
en nitrógeno líquido. La otra mitad se usó para preparar una
suspensión de células tumorales por centrifugación en gradiente de
densidad de Percoll como se ha descrito anteriormente. Las células
recuperadas se congelaron en dos alícuotas de aproximadamente 4 x
10^{7} células, cada una en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se
almacenaron en nitrógeno líquido. Se usaron suspensiones de células
aisladas en Percoll del tumor OC2 para generar tumores i.p. y s.c.
en un ratón desnudo. Los tumores OC2 tanto en los ratones BALB/c
como en los ratones SCID se propagaron por inyección i.p. de piezas
de tumor (0,25 ml). Los tejidos de tumor OC2 pudieron propagarse en
ratones inmunodeficientes y se desarrollaron tanto tumores
subcutáneos como intraperitoneales en un ratón desnudo y un ratón
SCID.
Debido a la propagación satisfactoria del tumor
OC2 tanto en ratones desnudos como en ratones SCID, se obtuvo una
muestra de 10 cc de sangre heparinizada a partir de la paciente
OC2. Se aisló la fracción de leucocitos (1,4 x 10^{7} células),
se congeló en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se almacenó en
nitrógeno líquido. También se obtuvieron muestras de sangre
adicionales a partir de la paciente. La muestra de miometrio normal
obtenida a partir de la paciente en el día de la cirugía y
congelada en nitrógeno líquido se procesó para obtener preparaciones
de membranas. El tejido congelado se trituró con un mortero y su
mano en nitrógeno líquido, se homogeneizó en un tampón que contenía
los inhibidores de proteasa leupeptina, aprotinina, pepstatina y
PMSF, y se centrifugó durante 10 minutos a 1.200 x g para retirar el
desecho celular. Se obtuvieron sedimentos que contenían membrana
por centrifugación a 150.000 x g durante 90 minutos, y se
almacenaron a -80ºC en alícuotas que contenían 10% de glicerol.
El carcinoma OC2 se propagó tanto en ratones
desnudos BALB/c como en ratones SCID, por inyección s.c. o i.p. de
piezas de tumor trituradas recientes o congeladas previamente.
Además de un suministro constante de tumor humano reciente
propagado en el ratón denudo o SCID, se prepararon alícuotas
congeladas de tumor triturado y de células tumorales aisladas en
gradiente de Percoll procedentes del primer paso de la metástasis
de ganglio linfático OC2 a través de un ratón desnudo. Las células
y las piezas de tejido obtenidas directamente de la paciente se
congelaron en 90% de suero humano/10% de DMSO y se almacenaron en
nitrógeno líquido. Esto incluyó catorce alícuotas con una estimación
de 10^{7} células cada una de células tumorales OC2 separadas por
Percoll derivadas del ovario de la paciente, tres alícuotas de
aproximadamente 0,75 ml cada una de metástasis de ganglio linfático
de OC2 triturado de la paciente, cinco alícuotas de 2,8 x 10^{6}
PBL de la paciente cada una y muestras del tumor de ovario. La
metástasis de ganglio linfático, el miometrio, el endometrio y el
intestino delgado se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido con
o sin OCT, y se almacenaron a -80ºC.
Cuatro ratones BALB/c se inmunizaron una vez i.p.
con aproximadamente 10^{7} células OC2 procedentes de ovario. Los
ratones se sometieron a un refuerzo i.p. en el día 30 con
aproximadamente 5 x 10^{6} células tumorales OC2 de la preparación
original que se había congelado en 90% de suero humano/10% de DMSO,
se había almacenado en nitrógeno líquido y se había descongelado y
lavado antes del uso. Se obtuvieron antisueros en los días 12 y 30
después de la inmunización primaria y en el día 11 después de la
inmunización secundaria. Pueden administrarse refuerzos adicionales
a los ratones, tanto i.p. como i.v., hasta que ya no se obtenga
ningún aumento adicional en la respuesta. La reactividad del
antisuero con las células tumorales OC2, en comparación con la
reactividad del suero preinmune, se determina por ELISA en fase
sólida usando placas recubiertas con preparaciones de membrana de
tumor OC2 e inmunoglobulina de cabra anti-ratón
marcada con fosfatasa alcalina y nitro azul tetrazolio (NBT) más
indolil-fosfato (BCIP) como sustrato (Promega;
Madison, WI), como reactivos de revelado.
La reactividad de los antisueros con secciones de
criostato de cuatro micrómetros del tumor OC2 puede determinarse
por inmunohistoquímica. Se tratan muestras fijadas con acetona con
H_{2}O_{2} al 0,3% en metanol para destruir la actividad
peroxidasa endógena y después se rehidratan en PBS/1% de FBS.
Después se incuban con el antisuero durante un periodo de
aproximadamente 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, se aclaran y
se incuban con Ig de conejo anti-ratón biotinilada.
Se desarrollan tinciones con avidina-peroxidasa de
rábano picante y diaminobencidina. Se cuentan las secciones teñidas
con verde de metilo.
Se prepararon vectores de expresión, tanto de
mamífero como bacterianos, en los que podían transferirse
combinaciones unidas de genes de regiones V_{H} y V_{L}, en
masa, desde las células B en las que se expresan en el caso de los
vectores bacterianos, y sin perder las combinaciones, en el caso de
los vectores de expresión de mamífero. Las cadenas H y L, en los
dos tipos de vectores, se disponen en orientaciones
transcripcionales opuestas con promotores de cabeza a cabeza. De
esta manera, la combinación del gen de la región V podía
transferirse como una unidad entre vectores. Además, como todos los
vectores son circulares, los vectores pueden abrirse por enzimas de
restricción entre los genes de la región V_{H} y V_{L} para
insertar fragmentos de ADN de intervención tales como promotores,
sin perder la combinación V_{H}-V_{L}, que
permanece en la misma pieza de ADN.
Pueden expresarse proteínas quiméricas en la
superficie de fagos filamentosos (M13) si se fusionan a una
proteína de la cubierta del fago tal como cpIII o cpVIII. En estos
estudios se usó el vector de expresión de fagémidos circular pComb3,
que contiene un sitio insertable en fase con cpIII, aunque también
pueden usarse otros vectores similares disponibles comúnmente. Se
creó un ADN de vector de fagémido pComb3 que codificaba una porción
Fd (dominios V_{H} y C_{H1}) de un anticuerpo. La región
genética que codificaba la porción de anticuerpo se fusionó al gen
gIII, que codificaba el extremo carboxilo terminal de cpIII (Figura
3). El vector es circular y la digestión con SpeI y NheI, que
produce extremos cohesivos compatibles, ocasiona la eliminación del
fragmento de la proteína de la cubierta gIII, y después de volverse
a unir, permite la producción de Fab libre. Pueden obtenerse
bibliotecas de presentación de fagos de 10^{7} miembros después
de la co-infección de E. Coli
XLI-Blue con el fago adyuvante, y pueden
seleccionarse con respecto a la unión al antígeno por medio de la
presentación en superficies recubiertas con antígeno. Los genes que
codifican los fragmentos Fab seleccionados se transportan en las
partículas de fago y, de esta manera, están inmediatamente
disponibles para la clonación y secuenciación.
\newpage
El vector pComb3 también codifica una cadena L
libre (dominios kappa de V_{L} y C_{L}) que se asocia con la
región Fd fusionada a la proteína de la cubierta para formar
fragmentos Fab presentados en la superficie del fago. La proteína de
fusión Fd-cpIII y la cadena L se expresan a
partir de sus propios promotores (lacZ) en orientaciones
transcripcionales de cabeza a cola. Para obtener una serie de fagos
que expresen anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra una
diversidad de antígenos tales como los presentes en la superficie
de una célula tumoral, es más eficaz tener las combinaciones de
cadenas H y L generadas in vivo en respuesta a la
inmunización.
Para obtener un vector bacteriano en el que
puedan disponerse los genes de región V_{H} y V_{L} en
orientaciones transcripcionales opuestas, se modificó el vector de
presentación de fagos pComb3. Este vector pComb3 modificado (phh3,
Figura 3b), contiene el lacZ y los promotores tac en orientaciones
transcripcionales de cabeza a cabeza, dirigiendo la transcripción
de los genes kappa y Fd de ratón, respectivamente. El dominio
C_{H1} del gen Fd procede de la IgG_{2b}. Aunque las secuencias
líder para las dos cadenas tienen la secuencia de aminoácidos líder
de pelB, las secuencias de nucleótidos difieren en muchas
posiciones. Se tomó esta precaución para proteger contra las
deleciones. La integridad de este vector de fagémido, tanto en forma
bicatenaria como en forma monocatenaria, se verificó por un
análisis de diagnóstico con enzimas de restricción, por
secuenciación y por amplificación por PCR de segmentos
específicos.
El segmento de ADN que contenía el promotor
bacteriano cabeza a cabeza y las secuencias líder de phh3, un
cassette bacteriano lPPl, se generó por subclonación en
pBluescript II KS (Stratagene; La Jolla, CA), para generar
plPPl (Figura 3c). El vector phh3 se modificó reemplazando
los genes de la región variable y las secuencias líder y promotora
por un tramo de ADN irrelevante para producir phh3mu que contenía
los genes C_{\kappa} y C_{H1} de \gamma_{2b} murinos (Figura
3d). Se obtuvo un vector de presentación de fagos bidireccional
adicional que contenía los genes C_{\kappa} y CH1 de
\gamma_{1} humanos (phh3hu; Figura 3d) a partir de phh3mu
reemplazando los genes C murinos por genes C humanos.
Tanto phh3mu como phh3hu son útiles para la
clonación de pares V_{L}-V_{H} unidos en
una orientación transcripcional de cabeza a cabeza. Estos vectores
circulares pueden abrirse entre los extremos amino de los genes de
la región V_{L} y V_{H} para insertar el cassette lPPl
derivado de plPPl y generar una biblioteca de presentación
de fagos bidireccional. Como se representa en la Figura 4c, los
pares V_{L}-V_{H}, unidos en una orientación
transcripcional de cabeza a cabeza, pueden transferirse fácilmente,
en masa, entre un vector de presentación de fagos bidireccional
funcional y un vector de expresión de mamífero circular. La
transferencia requiere la apertura del vector entre los extremos
amino de V_{L} y V_{H} y el intercambio de cassettes que
contienen secuencias líder y promotores procariotas o de mamífero,
los cassettes lPPl. Los pares
V_{L}-V_{H} que incluyen los cassettes
lPPl se expanden en un vector, por PCR, y se insertan en otro
vector. Para la inserción en el vector de mamífero, las colas que
no hibridan de los cebadores de PCR contienen sitios de empalme (ss
= sitio de empalme; Figura 3c).
Se obtuvo por ingeniería genética un vector doble
murino, pMDV (Figura 4a), capaz de expresar una cadena H de
IgG_{2b} de ratón y una cadena L kappa de ratón, y se usó para
expresar anticuerpos IgG2b por transfección en la línea de células
de hibridoma nula sp2/0-Ag14, que no produce
ninguna cadena H o L endógena. El gen de la región C de IgG_{2b}
se reemplaza por el gen de la región C de IgG_{2a} por
manipulaciones enzimáticas como se describe en Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (J. Sambrook et al. editors, Cold Spring
Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY, 1989). El vector doble
murino también puede modificarse reemplazando los genes C_{\gamma
2b} y C_{\kappa} murinos por los genes C_{\gamma 1} y
C_{\kappa} humanos respectivamente, para generar el vector doble
quimérico (pCDV) mostrado en la Figura 4b. El marcador selectivo Eco
gpt confiere a las células de mamífero resistencia al ácido
micofenólico cuando está presente xantina en el medio.
Las células se fijaron básicamente como se
describe por M.J. Embleton et al. (Nuc. Acids Res.
20:3831-37, 1992) con modificaciones minoritarias.
Se lavaron células a una concentración de 3-5 x
10^{7} en un tubo cónico de 50 ml (Costar; Cambridge, MA) tres
veces en 10 ml de PBS, pH 7,2, a temperatura ambiente. El sedimento
celular se resuspendió en 1,0 ml de NaCl 150 mM, seguido de la
adición de 1,0 ml de formaldehído al 20% enfriado con hielo (Sigma
Chemical; St. Louis, MO)/NaCl 150 mM gota a gota con agitación
vorticial suave. Las células se mantuvieron en hielo y se agitaron
con vórtice a intervalos de 10 minutos durante un total de una
hora, y después se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo a
350 x g durante tres minutos a 4ºC. El tubo se golpeó ligeramente
para dispersar el sedimento entre los lavados. El sedimento se
resuspendió en 1,0 ml de NP-40 (Sigma Chemical; St.
Louis, MO) al 0,5% en agua. Las células se mantuvieron en hielo
durante una hora con agitación vorticial ocasional, y después se
transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se centrifugaron a
14.000 rpm a 4ºC durante 3 minutos. A continuación se realizaron
tres lavados con PBS enfriado con hielo y un lavado con PBS
enfriado con hielo/glicina 100 mM. Entre los lavados, el sedimento
se dispersó por agitación vigorosa de la microcentrífuga. Las
células se resuspendieron en PBS/glicina 100 mM con una micropipeta
para dispersar el sedimento celular y retirar los cúmulos de
células visibles. Se congelaron alícuotas de 10^{6} células en
PBS/glicina 100 mM en hielo seco y se almacenaron a -80ºC durante un
período de hasta tres semanas.
Se estableció un procedimiento de PCR dentro de
las células en el que se sintetizaron ADNc de las regiones V_{H} y
V_{L} in situ en una población de células
fijadas/permeabilizadas. Se generaron dos líneas celulares
transfectantes, produciendo una línea celular un anticuerpo
IgG_{2b(\kappa)} de ratón específico para el hapteno
p-azofenilarsonato (Ars; J. Sharon et al., J.
Immunol. 142:596-601, 1989). La otra línea celular
produce un anticuerpo IgG_{2b(\kappa)} quimérico que es idéntico
al anticuerpo anti-Ars tanto a nivel de los
aminoácidos como a nivel de los nucleótidos, con la excepción de
las regiones determinantes de complementariedad (CDR), que proceden
de un anticuerpo anti-dextrano. Se usaron estas dos
líneas celulares porque los cebadores para la síntesis de ADNc y
para la PCR, que no incluyen las CDR, tienen la misma
complementariedad con los genes H y L de las dos líneas celulares,
aunque las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas
resultantes podrían distinguirse por secuenciación en las CDR.
La síntesis de ADNc y las amplificaciones por PCR
en células fijadas/permeabilizadas se realizó básicamente como se
describe por M.J. Embleton et al. (Nuc. Acids Res.
20:3831-37, 1992) con modificaciones minoritarias.
Se lavaron 2 x 10^{6} células fijadas/permeabilizadas una vez con
agua y se usaron en una reacción de 50 \mul para la síntesis de
ADNc. Se usaron cuarenta unidades de transcriptasa inversa
SuperScript (Gibco/BRL; Grand Island, NY), tampón de primera cadena
(Gibco/BRL; Grand Island, NY) y 25 pmoles de cada uno de los
cebadores de avance 3A-CL y 1A-CH1
(Operon Technologies; Alameda, CA). Después de la síntesis de ADNc,
las células se sometieron a una microcentrifugación (14.000 rpm
durante 3 minutos a 4ºC), se lavaron en 200 \mul de PBS/glicina
100 mM y se resuspendieron en 10 \mul del mismo tampón. Las PCR
se realizaron con el kit de ADN polimerasa AmpliTaq
(Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT) en un DNA Thermal
Cycler 480 (Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT)
durante 30 ciclos. Cada ciclo constaba de 30 segundos a 90ºC, 30
segundos a 65ºC y 30 segundos a 72ºC. La concentración final de
MgCl_{2} fue de 2,5 mM. Se incluyó un control de PCR de 20 \mul
que produce un producto de 1,2 kilopares de bases.
En la primera PCR, se usaron 10 pmoles de cada
uno de los cebadores de unión 4L y 2H junto con 25 pmoles de cada
uno de los cebadores de avance 3A-CL y
1A-CH1.
Después de la primera PCR, las células se
sometieron a una microcentrifugación y se recogió el sobrenadante.
Para la segunda PCR, después de dos lavados de 200 \mul de
PBS/glicina 100 mM, se añadieron 25 pmoles de cada uno de los
cebadores anidados 3L y 1H. Después de completar los 30 ciclos como
se ha indicado anteriormente, las células se sometieron a
microcentrifugación y se recogieron los sobrenadantes. Los
productos de reacción obtenidos después de la primera y segunda PCR
se muestran en la Figura 6. Se observó una banda de 777 pb
correspondiente a la combinación V_{H}-V_{L}
unida (indicada por una flecha) después de la segunda PCR. Los
productos obtenidos como primer y segundo producto de PCR se
muestran en las bandas 1 y 2, respectivamente. m y M son una escala
de 123 pb y un producto de digestión Hind III de ADN del fago
kappa, respectivamente, indicándose los tamaños en pares de bases
(pb) de algunas de las bandas. La banda observada tenía el tamaño
correcto esperado para la combinación
V_{H}-V_{L}. Esta banda se purificó en gel y se
clonó, después de la digestión con EcoRI y HindIII, en los sitios
EcoRI-HindIII de M13mp19.
En la Figura 5 se muestra una representación
esquemática de las reacciones de PCR y de transcriptasa inversa
dentro de las células, y de los productos obtenidos. Después de la
síntesis de ADNc usando cebadores 1A-CH1 y
3A-CL (ambos anti-sentido),
complementarios al principio de los genes C_{H1} y C_{\kappa}
para los ARNm de cadena H y L, respectivamente, se usaron los
mismos cebadores más dos cebadores de unión, 2H y 4L (ambos con
sentido), en una primera reacción de PCR. Además de proporcionar
una forma para unir la combinación V_{H}-V_{L}
dentro de las células, los cebadores de unión introducen sitios de
restricción (XhoI y SacI) para la posterior clonación de las
secuencias promotoras entre V_{H} y V_{L}. El cebador 2H hibrida
con el principio de la secuencia V_{H} que incluye parte de la
secuencia líder, tiene un sitio de enzimas de restricción Xho I
correspondiente a las posiciones de aminoácidos 5 y 6 de la región
V_{H}, y contiene una cola de 30 nucleótidos de longitud de
secuencia aleatoria. El cebador 4L hibrida con el principio de la
secuencia V_{\kappa} que incluye parte de la secuencia líder,
tiene un sitio de restricción Sac I correspondiente a los
aminoácidos 1 y 2 de la región V_{\kappa} y contiene una cola de
30 nucleótidos de longitud que es el complemento inverso de la cola
del cebador 2H.
Como las colas de los cebadores 2H y 4L son
complementarias, los fragmentos amplificados de V_{H} y V_{L}
se unieron durante la PCR por extensión solapante. Después de
lavar las células para retirar los cebadores no incorporados
extracelulares y cualquier producto de PCR que pueda haber salido
de las células, se preparó una segunda PCR usando cebadores
anidados 1H y 3L, ambos anti-sentido y no solapantes
con los cebadores 1A-CHI y 3A-CL. El
cebador 1H es complementario al principio del dominio C_{H1} de
IgG_{\gamma 2b} y a parte de JH2. Además, contiene un sitio de
restricción Hind III y un sitio de empalme. El cebador 3L es
complementario al principio del dominio C_{\kappa} y a parte de
J_{\kappa}1. Contiene un sitio de restricción EcoRI y un sitio de
empalme. Los sitios de empalme y los sitios de restricción en los
cebadores 1H y 3L están destinados a facilitar la clonación
posterior de las combinaciones V_{H}-V_{L}
unidas en el vector de expresión de mamífero doble mostrado en la
Figura 4a.
Para determinar si las combinaciones de
V_{H}-V_{L} amplificadas dentro de las células
pueden expresarse como anticuerpos IgG en células de mieloma o
hibridoma, se proporcionaron promotores de mamífero de cabeza a
cabeza (Figura 7). Un clon que contenía una combinación
V_{H}-V_{L} unida, que codificaba las regiones V
de los anticuerpos anti-Ars, se digirió con XhoI y
SacI y se unió a un fragmento de ADN XhoI-SacI que
contenía un promotor de cadena H, un secuencia líder, y un ADN que
codificaba los cuatro primeros aminoácidos de la cadena H madura,
en una orientación de cabeza a cabeza con un promotor de cadena
kappa y una secuencia líder. Se aisló un fragmento de ADN
EcoRI-HindIII de 2,25 kb que incluía los promotores
y los genes de la región V a partir del vector resultante, y se
unió a la cadena principal EcoRI-HindIII derivada
del vector doble murino IgG_{2b}. El vector de expresión
resultante (Figura 7) se utilizó para transfectar células de
hibridoma nulas Sp2/0-Ag14 por electroporación.
Los transfectantes mostraron la producción de
anticuerpos IgG intactos como se determina por análisis de
transferencia de Western de sus sobrenadantes (Figura 8a) realizado
como se describe por H. Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
76:4350-54, 1979). La posición del producto IgG de
150 KDa se indica por una flecha. También se indican las posiciones
de los marcadores de peso molecular en KDa, así como: E = el
transfectante experimental derivado de la combinación
V_{H}-V_{L} unida dentro de las células; -C =
control negativo (línea celular Sp2/0-Ag14
parental); M = marcadores de peso molecular
pre-teñidos; +C, control positivo (transfectante
IgG2b anti-Ars); -A = un transfectante que produce
un anticuerpo IgG_{2b} mutante que ha perdido la unión a Ars.
Los transfectantes unidos a Ars se evalúan por inmunoensayo unido a
enzima en fase sólida (ELISA) usando placas recubiertas con
Ars-BSA e IgG de cabra anti-ratón
marcada con fosfatasa alcalina (específica de Fc, Figura 8b) en el
sistema ProtoBlot (Promega, Madison, WI).
En un experimento adicional, se amplificó un par
V_{H}-V_{L} derivado de un anticuerpo murino
contra p-azofenilarsonato (Ars) junto con el
cassette lPPl de intervención de mamífero por PCR a partir
del vector de expresión de mamífero y se transfirió a phh3mu. El
cassette lPPl de mamífero después se cambió por el cassette
lPPl procariota que contenía los promotores de lacZ y tac
de cabeza a cabeza y las dos secuencias líder de pelB para generar
phh3-Ars. Como se muestra en la Figura 9, el fago
producido a partir del vector phh3-Ars (Figura 9A,
ELISA directo) se unía específicamente a una placa recubierta con
Ars-albúmina de suero bovino
(Ars-BSA). Además, la unión a la placa recubierta
con Ars-BSA pudo inhibirse específicamente por
Ars-BSA soluble, pero no por BSA soluble (Figura
9B).
Estos resultados demuestran que las combinaciones
V_{H}-V_{L} amplificadas y unidas por PCR
dentro de las células pueden transferirse satisfactoriamente a un
vector de expresión. Las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas también pudieron
transferirse primero al vector de presentación de superficie de
fagémido phh3 y a los vectores de expresión dobles murino o
quimérico (Figura 4), y el vector de presentación de fagos
bidireccional puede usarse satisfactoriamente para transferir un par
V_{H}-V_{L} unido cabeza a cabeza para
producir partículas de fago que presenten fragmentos Fab de unión a
antígenos.
Se preparan células de bazo y células de ganglio
linfático de ratones inmunizados después de la lisis de glóbulos
rojos, se combinan, se fijan en formaldehído al 10%, se
permeabilizan con NP-40 al 0,1% y se mantienen
congeladas a -80ºC en alícuotas de 10^{7} células hasta el uso
para la PCR dentro de las células. Otros ratones se inmunizan
posteriormente con células OC2 aisladas con Percoll de un paciente,
procedentes de las alícuotas congeladas. Una alícuota de células de
bazo fijadas/permeabilizadas más células de ganglio linfático
derivadas del ratón inmune OC2 se somete a la síntesis de ADNc y a
la amplificación por PCR y a la unión, pero con grupos de cebadores
para asegurar la amplificación de todos o de la mayoría de los genes
de la región V, y con cebadores anidados. Los cebadores usados para
estas reacciones se diseñan para amplificar el repertorio entero de
inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos contra epítopos proteicos,
epítopos de carbohidrato y epítopos lipídicos.
Para la síntesis de ADNc de regiones V_{H}, se
usa un grupo de cebadores (1A-CH1,
anti-sentido) complementarios al principio de los
dominios CH1 de cada uno de los isotipos de suero de ratón (Figura
5). El grupo consta de siete cebadores 1A-CH1:
1A-CH1-_{\gamma}l,
1A-CH1-_{\gamma}2A,
1A-CH1-_{\gamma}2B,
1A-CH1-_{\gamma}3,
1A-CH1-\mu,
1A-CH1-_{\varepsilon} y
1A-CH1-_{\alpha}. Para la síntesis
de ADNc de regiones V_{L}, se usa un grupo de cebadores
(3A-CL, anti-sentido)
complementarios al principio de los dominios C_{\kappa} y
C\lambda. Los cuatro cebadores 3A-CL son:
3A-CL-_{\kappa},
3A-CL-\lambda1,
3A-CL-\lambda2 y
3A-CL-\lambda3.
Para la primera PCR se usan los mismos grupos de
cebadores (1A-CH1 y
3A-CL) junto con cebadores de unión. Los cebadores
de unión para las regiones V_{H} (2H, con sentido) son
complementarios al principio de la secuencia V_{H} que incluye
parte de la secuencia líder, tienen un sitio de enzima de
restricción XhoI correspondiente a las posiciones de aminoácidos 5
y 6 de la región V_{H}, y contienen además una cola de 30
nucleótidos de longitud de secuencia aleatoria. Los nueve cebadores
2H, basados en los cebadores usados por A.S. Kang et al. (Methods
2:111-18, 1991) se denominan 2H1 a 2H9. Los
cebadores de unión para las regiones V_{L} (4L, con sentido) son
complementarios al comienzo de las secuencias V_{\kappa} o
V\lambda que incluyen parte de la secuencia líder, tienen un
sitio Sac I correspondiente a los aminoácidos 1 y 2 de la región
V_{L}, y contienen además una cola de 30 nucleótidos de longitud
que es el complemento inverso de la cola del cebador 2H. Los
cebadores 4L, que también se basan en los cebadores usados por A.S.
Kang et al. (Methods 2:111-18, 1991) para
V_{\kappa} y en E.A. Kabat et al. (Sequences of Proteins of
Immunological Interest, 5ª edición, National Institutes of
Health, Bethesda, MD, 1991) para V_{\kappa} (sólo hay dos genes
V_{\kappa} en el ratón) son:
4L-V_{\kappa}l a
4L-V_{\kappa}7, 4L-V\lambda1 y
4L-V\lambda2.
Las colas complementarias de los cebadores 2H y
4L se unen a los fragmentos amplificados de la región V_{H} y
V_{L} por PCR de extensión solapante (H.A. Erlich, PCR
Technology: Principles and Applications for DNA Amplification,
W.H. Freeman & Co., NY, NY, 1992). Los sitios XhoI y SacI
introducidos por estos cebadores permiten la clonación posterior de
las secuencias promotoras entre secuencias V_{H} y V_{L}.
Después de lavar las células para retirar los cebadores y cualquier
producto de PCR que pueda haber salido de las células, se prepara
una segunda PCR para amplificar adicionalmente las combinaciones de
región V_{H}-V_{L} unidas usando cebadores
anidados (JH y JL, todos anti-sentido). Estos
cebadores se diseñaron para la posterior clonación de las
combinaciones V_{H}-V_{L} unidas en el vector de
fagémido phh3mu o phh3hu (Figura 3). Los cebadores JH, denominados
JH1-JH4, son complementarios a parte de un gen JH
(hay cuatro genes JH en el ratón), y contienen un sitio de
restricción EcoRI adicional en sus extremos 5'. El otro grupo de
cebadores (JL) son complementarios a parte del gen J_{\kappa} o
J\lambda (hay cuatro genes funcionales J_{\kappa} y tres genes
funcionales J\lambda en el ratón), y contienen un sitio de
restricción HindIII adicional en sus extremos 5'. Estos cebadores
son J_{\kappa}1, J_{\kappa}2, J_{\kappa}4, J_{\kappa}5,
J\lambda1, J\lambda2 y J\lambda3.
El primer y el segundo productos de PCR se
ensayan con respecto a la presencia de fragmentos de ADN por
electroforesis en gel de agarosa. Se espera un fragmento de 0,8 kb
después de la segunda PCR. Esta banda, que contiene las
combinaciones V_{H}-V_{L} amplificadas, se
aísla en gel usando Geneclean II (Bio101; La Jolla, CA).
Las combinaciones V_{H}-V_{L}
aisladas en gel se digieren con EcoRI y HindIII y se unen con la
cadena principal EcoRI-HindIII del vector de
fagémido phh3 (o el vector parecido a phh3hu) para generar una
población de vectores de expresión de fagémido
phh3/VH-VL como se muestra en las Figuras 2D y 10.
La transformación de las bacterias y la generación de la biblioteca
del fago se realiza como se ha descrito (C.F. Barbas y R.A. Lerner,
Methods 2:119-24, 1991). Como estos vectores son
fagémidos, se propagan por transformación y crecimiento de E.
coli XLI-Blue en medio de cultivo que contiene
carbenicilina y tetraciclina. Las colonias que contienen los
fagémidos se cultivan en agar por cultivo de una alícuota de
cultivo. Para obtener fagos, las bacterias se superinfectan con
exceso del fago adyuvante VCSM13, después de lo cual, se obtienen
fagémidos empaquetados que infectan E. coli
XLI-Blue.
La mezcla de unión phh3/VH-VL se
utiliza para transformar por electroporación células bacterianas
XLI-Blue SURE competentes, con una eficacia de
transformación de 5 x 10^{9} unidades formadoras de colonias (cfu)
por \mug de ADN (Stratagene; La Jolla, CA), y se extraen
alícuotas del cultivo celular transformado para cultivarlas y
determinar el tamaño de la biblioteca y el número de miembros
originales. Una buena biblioteca generalmente tiene al menos
10^{7} cfu. Después de expandir el resto del cultivo bacteriano,
se prepara ADN de fagémido bicatenario y se digiere con SacI y XhoI.
El fragmento grande se une a un fragmento SacI-XhoI
que contiene los promotores bacterianos de cabeza a cabeza
derivados de phh3 para generar phh3B/VH-VL (Figura
10).
Se obtienen vectores de tipo
phh3B/VH-VL por transformación de células
electrocompetentes SURE con la mezcla de unión. Se cultivan
alícuotas para asegurar una eficacia de transformación de al menos
10^{7} cfu totales. El resto de las bacterias transformadas se
superinfectan con el fago adyuvante VCSM13 a 10^{12} unidades
formadoras de placas (pfu) para producir fagémidos empaquetados que
presentan fragmentos Fab. Esta última etapa amplifica la biblioteca
aumentando la representación de cada miembro original. Las placas
se precipitan en el sobrenadante celular con polietilenglicol y se
resuspenden en PBS. Ésta es la biblioteca original.
Se prepara Fab soluble a partir de la biblioteca
de fagémido por digestión con las enzimas de restricción SpeI y
NheI para retirar el segmento de ADN de la proteína de la cubierta
gIII, y volviendo a unir los fragmentos (Figura 10). La digestión
con SpeI y NheI produce extremos cohesivos compatibles que se unen.
El fragmento de ADN que carece de la porción de la proteína de
cubierta gIII se purifica en gel, se autoune y se utiliza para
transformar células electrocompetentes SURE. Las titulaciones de la
biblioteca se determinan por el cultivo de alícuotas. Es de esperar
que la biblioteca conste de al menos 10^{7} cfu. Se induce la
expresión de Fab en el cultivo con IPTG (tanto para el promotor de
lacZ como para el promotor de tac) y las células se lisan por tres
ciclos de congelación/descongelación entre -80ºC y 37ºC para
producir lisados que contienen Fab.
Se ensaya la reactividad de la biblioteca de
presentación de fagos de Fab con el tumor OC2 y con tejidos de
paciente normal/humano por inmunohistoquímica. Se preparan secciones
de criostato (de 4 micrómetros de espesor) a partir del tumor OC2
usando tanto el tumor derivado de ovario como la metástasis de
ganglio linfático, y a partir de muestras de miometrio, endometrio
e intestino delgado que se habían obtenido a partir del paciente
OC2. Se ensayan preparaciones de citospin fijadas con acetona de
los PBL del paciente y de PBL de otro ser humano como se describe en
Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al.
editors, John Wiley & Sons, NY, NY, 1992). Se preparan otras
secciones de criostato de tejidos humanos, tales como hígado,
riñón, corazón, pulmón, piel, bazo, esófago y yeyuno, a partir de
muestras quirúrgicas y/o de autopsias realizadas de 6 a 18 horas
después de la muerte. Se realiza una inmunohistoquímica en
preparaciones de criostato y de citospin, con la excepción de que
se usa anti-M13 de oveja seguido de anticuerpos de
burro anti-oveja biotinilados (5 Prime - 3 Prime;
Boulder, CO) como se ha indicado anteriormente, usando
avidina-peroxidasa para detectar las partículas de
fago Fab unidas (M13). Como alternativa, se tratan cortes con Fab
soluble preparado a partir de la biblioteca de presentación de fagos
Fab, seguido de anticuerpo kappa de conejo
anti-ratón biotinilado antes de la adición de
avidina-peroxidasa. En esta fase, las bibliotecas
son reactivas con las células tumorales así como con células
normales.
Selección de la biblioteca de presentación de
fagos de Fab con respecto a la reactividad con las células
tumorales OC2
Cuando se amplifiquen las combinaciones
V_{H}-V_{L} a partir de ratones inmunes a los
tumores OC2, también se representarán anticuerpos no dirigidos
contra las células tumorales o contra cualquier otro tejido humano.
Para eliminar los anticuerpos irrelevantes de la biblioteca, así
como los anticuerpos anti-tumorales
sobrerrepresentados, la biblioteca de presentación de fagos de Fab
se selecciona con respecto a la reactividad con células tumorales
OC2 aisladas por gradiente de Percoll. Se usan células tumorales no
fijadas intactas para conservar la integridad de los determinantes
antigénicos en las membranas celulares.
Una alícuota de 100 \mul de la biblioteca que
contiene 10^{11} cfu se agita con 10^{7} células OC2 lavadas
durante 3 horas a temperatura ambiente. Las células se sedimentan
por centrifugación, el sobrenadante se retira y las células se lavan
3 veces con PBS para retirar el fago no unido. El fago unido se
eluye de las células con glicina 0,1 M/HCl pH 2,2 que contiene 1
mg/ml de BSA. Después de 5 minutos, la suspensión celular se
neutraliza con 6 \mul de base Trizma 2 M y se diluye a 1:10 con
medio SOC. Este tratamiento no ocasiona la lisis de células de
mamífero. La inmensa mayoría permanecen intactas durante el
procedimiento, pero puede observarse algún hinchamiento de las
células. Las células se sedimentan por centrifugación y el
sobrenadante que contiene el fago eluido se usa para infectar
células E. coli XLI-Blue. Se retiran
alícuotas de los cultivos celulares transformados, que se
cultivarán en placas para determinar el número de fagémidos
empaquetados que se eluyeron de la placa. Los cultivos se infectan
con el fago adyuvante VCSM13 para generar más fagémidos
empaquetados. Éstos se agitan con un número limitante de células
tumorales OC2 - el número limitante predeterminado a partir de la
retitulación de las partículas de fago no unidas. La amplificación
del fago eluido y la unión adicional a números limitantes de
células OC2 seguido de elución, se repiten tres o cuatro veces para
asegurar la especificidad de tumor de la biblioteca seleccionada.
En esta biblioteca seleccionada se ensaya la reactividad con el
tumor OC2 y con tejido normal por inmunohistoquímica. Esto muestra
una mayor reactividad, pero con un modelo similar al observado para
la biblioteca original.
La biblioteca seleccionada para el tumor muestra
una fuerte reactividad cruzada con tejido humano normal. La mayor
parte de esta reactividad cruzada podría absorberse por un tejido
normal derivado de cualquier fuente humana, porque la inmensa
mayoría de los antígenos humanos son idénticos cuando se comparan
individuos diferentes (Molecular Biology of the Cell, B.
Alberts et al. editors, Garland Publishing, Inc., NY, NY, 1989).
Sin embargo, los antígenos de histocompatibilidad difieren entre
individuos debido a la existencia de determinantes polimórficos.
Aunque las reactividades contra los determinantes no polimórficos
de antígenos de histocompatibilidad pueden absorberse por tejidos
de cualquier ser humano, es necesario que los tejidos procedentes
del paciente absorban cualquier fago de Fab que reaccione con
determinantes polimórficos de estos antígenos. Los leucocitos de
sangre periférica son especialmente adecuados para este fin porque
expresan colectivamente todos los antígenos de histocompatibilidad,
incluyendo los antígenos del MHC de clase I, que se encuentran en
todas las células nucleadas del cuerpo, y los antígenos del MHC de
clase II, que se encuentran principalmente en células B, monocitos y
células dendríticas.
La biblioteca de presentación de fagos de Fab se
absorbe primero con PBL humanos normales, y después con una mezcla
de preparaciones de tejidos sólidos de origen humano en general y
del paciente OC2 en particular. Por último, la biblioteca se
absorbe con PBL del paciente OC2. Después de cada absorción, la
biblioteca se reamplifica y se ensaya con respecto a la reactividad
contra el tumor OC2 y contra tejidos de humano normal/paciente y
PBL por inmunohistoquímica usando secciones de criostato y
preparaciones de citospin. Las reabsorciones con nuevas
preparaciones de los tejidos sólidos o PBL seguidas de
reamplificaciones de la biblioteca se continúan hasta que la
biblioteca absorbida reacciona con el tumor OC2 con mucha más fuerza
que con cualquier célula o tejido de humano normal/paciente
ensayado.
Para la absorción con PBL humanos normales, se
usan células enteras recién preparadas. Una alícuota de la
biblioteca de presentación de fagos de Fab seleccionada para el
tumor se agita a temperatura ambiente durante 3 horas con 1 x
10^{8} PBL. El exceso de células se retira para asegurar que se
retira la mayoría de las partículas de fago reactivas.
Para la absorción con tejidos sólidos, se usan
membranas. Ya se preparó una fracción de membrana a partir de la
muestra de miometrio obtenida de la paciente OC2, y se mantuvo
congelada a –80ºC. Las muestras de endometrio y de intestino
delgado de la paciente OC2, que se habían congelado rápidamente en
nitrógeno líquido y almacenado a -80ºC, se procesaron de la misma
manera para preparar membranas. Además, se obtienen otras muestras
de tejido humano normal a partir de muestras quirúrgicas y de
autopsias, y las fracciones de membrana se preparan y se almacenan
en alícuotas que contienen un 10% de glicerol a -80ºC. Después de la
descongelación, se combinan alícuotas de membrana aproximadamente
iguales de todos los tejidos y se agitan a temperatura ambiente
durante 3 horas con una alícuota de la biblioteca de presentación
de fagos de Fab absorbida en PBL humanos. El sobrenadante que
contiene el fago no absorbido se recupera después de la
sedimentación de las membranas a 150.000 x g.
La absorción final de la biblioteca de
presentación de fagos de Fab con PBL del paciente OC2 se realiza
como se ha descrito anteriormente para los PBL humanos normales, con
la excepción de que sólo se usan 5 x 10^{6} células por absorción
debido a que el suministro es limitado. Como la biblioteca ya se
habrá absorbido con tejido normal tal como endometrio, miometrio e
intestino delgado derivado del paciente OC2, y el fago de Fab
específico de MHC de clase I/específico de paciente ya se habrá
reducido espectacularmente, la absorción con los PBL del paciente
pretende reducir sólo el fago de Fab con especificidad de paciente
y con especificidad de MHC de clase II.
La biblioteca óptima (absorbida) se dirige a
muchos epítopos (determinantes antigénicos) diferentes. Aunque las
células tumorales usadas para la inmunización de ratones presentan
muchos epítopos contra el sistema inmune, es probable que algunos
sean inmunodominantes, de tal forma que los anticuerpos contra ellos
estén sobrerrepresentados en la biblioteca original. Por lo tanto,
los anticuerpos contra otros epítopos estarán infrarrepresentados
en la biblioteca original. Aunque esto sería un problema importante
en el caso de un antisuero policlonal convencional, la estrategia
de la biblioteca de presentación de fagos de Fab soluciona este
problema. La unión de la biblioteca a concentraciones limitantes de
células tumorales OC2, seguido de la reamplificación de las
partículas de fago de Fab unidas, aumenta la representación de los
epítopos menos inmunogénicos. La posterior absorción de la
biblioteca seleccionada para el tumor con tejidos normales y PBL
reduce espectacularmente la representación de algunos epítopos en
la biblioteca de presentación de fagos de Fab.
La evaluación del número de epítopos diferentes
dirigidos por la biblioteca absorbida por tejido seleccionado para
el tumor/normal se consigue por clonación de algunos de los
miembros de la biblioteca. Se cultivan alícuotas de E. coli
XLI-Blue infectadas con la biblioteca de
presentación de fagos de Fab absorbida y se seleccionan colonias
individuales. Se aíslan los vectores de fagémido bicatenarios y se
determina su secuencia de nucleótidos de la región V. Las secuencias
se analizan por el programa de búsqueda de homología BLAST (S.F.
Atltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 199)
disponibles en el Molecular Biology Computer Research Resource, para
determinar el subgrupo de región V, el uso del gen D y del gen J.
Este análisis produce una primera medición de la complejidad de la
biblioteca, porque indica si los clones analizados procedían de
muchos o de muy pocos clones de células B originales.
Como segunda medida de la complejidad, se
determina la capacidad de los fragmentos Fab de diferentes clones de
competir de forma cruzada por la unión a las células tumorales OC2
por medio de un ELISA, usando placas recubiertas con preparaciones
de membrana OC2 y/o por inmunohistoquímica. Los fragmentos Fab
solubles de diferentes clones compiten con la unión de los
fragmentos Fab unidos al fago de uno de los clones, detectándose la
unión del fago con anticuerpos anti-M13 de oveja
seguidos de anticuerpos de burro anti-oveja
biotinilados y avidina-peroxidasa. Si dos clones no
presentan competición cruzada, se asume que se dirigen a epítopos
diferentes. Basándose en el número de clones con competición cruzada
en una serie dada de clones, y en el número de cfu en la biblioteca,
se estima la complejidad de la biblioteca. Este tipo de análisis
sólo proporciona una indicación del número de epítopos o
determinantes antigénicos que se están dirigiendo por la biblioteca.
No describirá cuántos antígenos diferentes se dirigen. Sin embargo,
puede obtenerse una estimación haciendo reaccionar la biblioteca
con componentes celulares separados por electroforesis
bidimensional.
Para determinar cuál de los isótopos de IgG
murinos es el más eficaz en la mediación de las funciones efectoras
para eliminar las células CD4+, se ensayaron anticuerpos quiméricos
con respecto a su capacidad de mediar la citotoxicidad dependiente
del complemento in vitro, la reducción de células in
vivo y la prolongación de la supervivencia de injertos de piel
alogénicos y la supresión de la producción de
alo-anticuerpos. En general, se descubrió que el
isotipo de ratón más eficaz en estos ensayos era IgG_{2a}. Otros
autores también han demostrado que IgG_{2a} es el mejor isotipo
de ratón en funciones efectoras mediadas por Fc. El isotipo humano
IgG_{1}, que probablemente es el isotipo más análogo a la
IgG_{2a} de ratón, ha demostrado ser uno de los dos mejor
isotipos humanos en las funciones efectoras mediadas por Fc (J.L.
Dangl et al., EMBO J. 7:1989:94, 1988).
Se expresan combinaciones de regiones variables
de H y L a partir de la biblioteca de fagémido como anticuerpos
murinos IgG_{2a}. Antes de la transferencia de las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas al vector doble IgG_{2a}
murino (Figura 4a), el fragmento de ADN SacI-XhoI
que contiene los promotores bacterianos y las secuencias líder de
cabeza a cabeza en el vector de fagémido phh3B/VH-VL
(Figura 10a) se sustituye con un fragmento de ADN
SacI-XhoI que contiene promotores H y L murinos y
secuencias líder en orientaciones transcripcionales de cabeza a
cabeza para generar phh3M/VH-VL (Figura 10b). Las
combinaciones V_{H}-V_{L} unidas, que incluyen
los promotores de mamífero, se extraen del vector
phh3M/VH-VL por amplificación por PCR usando grupos
de cebadores 3L y 1H (Figura 3).
El grupo de cebadores 1H
(anti-sentido) es complementario al principio del
dominio CH1 de IgG_{\gamma 2b} y a parte de un gen JH (cuatro
cebadores, uno para cada uno de los genes JH murinos). Además,
este conjunto de cebadores contiene un sitio de restricción HindIII
y un sitio de empalme y elimina el sitio EcoRI preexistente del
vector phh3B/VH-VL (Figura 10a). Los cebadores 3L
(anti-sentido) son complementarios al principio del
dominio C_{\kappa} y a parte del gen JL (7 cebadores, para los 4
genes J_{\kappa} funcionales y para 3 genes J\lambda
funcionales). Además, este grupo de cebadores contiene un sitio de
restricción EcoRI y un sitio de empalme y elimina el sitio HindIII
preexistente del vector phh3B/VH-VL (Figura
10a).
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se
aíslan en gel, se digieren con EcoRI e HindIII y se unen con la
cadena principal EcoRI-HindIII del vector doble
IgG_{2a} murino (Figura 4a). La mezcla de unión se utiliza para
transformar células DH101B electrocompetentes con una frecuencia de
transformación mayor de 10^{10} por \mug de ADN (Gibco/BRL;
Grand Island, NY) para generar una biblioteca de expresión de
IgG_{2a} (vector IgG_{2a}/lib). Para conservar la complejidad de
la biblioteca durante estas manipulaciones, se usan células
bacterianas de alta eficacia de transformación y células de
mamífero de alta eficacia de transfección.
Después de la linealización por digestión con
enzimas de restricción en el único sitio SalI, el vector
IgG_{2a}/lib se utiliza para transfectar la línea de células de
hibridoma nula Sp2/0Ag14 por electroporación, con la excepción de
que se usan alícuotas de 1 ml que contienen 2 x 10^{7} células
cada una por cubeta. Los transfectantes se recuperan en medio
selectivo que contiene xantina y ácido micofenólico. La frecuencia
de transfección de la línea celular Sp2/0-Ag14 es
de aproximadamente 1 en 10^{4} células, y aproximadamente 50% de
los transfectomas produce cantidades significativas de
inmunoglobulina, como se evalúa por análisis de transferencia de
Western.
Para la transfección de la biblioteca, se usan 5
x 10^{8} células Sp2/0-Ag14 y un total de
500-1.000 \mug de ADN de vector de la biblioteca
IgG_{2a}, con la expectativa de obtener una biblioteca de
aproximadamente 25.000 clones. Las células transfectadas se
cultivan durante 20 horas, después de lo cual se añade un medio
selectivo que contiene xantina y ácido micofenólico. Se retiran
alícuotas y se cultivan en medio selectivo en agarosa blanda para
titular la biblioteca. El resto se cultiva en frascos cilíndricos de
4 litros en medio selectivo para dejar tiempo para que se mueran
todas excepto las células transfectadas de forma estable y conseguir
una densidad celular de 2 x 10^{6} células/ml.
Se purifican anticuerpos a partir del
sobrenadante de cultivo en Proteína A o Proteína G Sepharose
(Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) y la pureza se ensaya por
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Basándose en la
experiencia previa con estos tipos de transfectantes, es de esperar
que la recuperación sea de 5-10 \mug de IgG por
ml de sobrenadante de cultivo, de forma que se prevé la obtención de
60 mg de anticuerpos de biblioteca IgG_{2a} a partir de 8 litros
de sobrenadante de cultivo.
Aunque no hay ninguna estimación de la
complejidad de la biblioteca de presentación de fagos de Fab
absorbida, tiene que ser menor que 10^{7}, el tamaño de la
biblioteca de presentación de fagos de Fab original (no absorbida).
Usando una biblioteca de mamífero 400 veces más pequeña que la
biblioteca de presentación de fagos de Fab original (25.000), es
posible que no se representen todos los miembros únicos de la
biblioteca de presentación de fagos de Fab absorbida en la
biblioteca IgG_{2a} de ratón. Esto no es probable porque se
elimina un porcentaje muy alto de los miembros de la biblioteca
durante la absorción con tejidos de humano normal/paciente y PBL.
Además, la biblioteca de presentación de fagos de Fab original de
10^{7} miembros contiene múltiples miembros derivados del mismo
clon de células B, reduciéndose de esta manera su complejidad real.
Además, como la transfección estable por electroporación ocasiona la
integración de varias copias del vector transfectado por célula, es
probable que el tamaño de la biblioteca de mamífero sea mayor de
25.000. Sin embargo, existe una probabilidad no cero de que las
bibliotecas de mamífero sean menos complejas que la biblioteca de
presentación de fagos de Fab de la que proceden. No obstante, la
complejidad de las bibliotecas de mamífero no puede aumentarse
realmente más de la mitad de un orden de magnitud, antes de que la
magnitud del experimento de transfección haga que esto no sea
técnicamente factible.
Debido a las consideraciones anteriores, y lo que
es más importante, como los transfectantes de células de hibridoma
individuales dentro de una población tienden a crecer a diferentes
velocidades, producen diferentes cantidades de inmunoglobulina y,
algunas veces, pierden la producción de inmunoglobulina, las
bibliotecas de IgG de mamífero ya no se propagan por amplificación
de una alícuota de células pequeña. En su lugar, las bibliotecas se
generan de novo a partir de la biblioteca de presentación de
fagos de Fab absorbida. La expansión inicial de la biblioteca de
mamífero para posibles aplicaciones clínicas futuras tendrá una
mayor escala.
Después de la expansión de las bibliotecas de
mamífero, se obtiene una evaluación de su complejidad a partir de
la secuencia de nucleótidos de los genes de la región V expresados.
Se realiza una síntesis de ADNc dentro de las células y la unión de
los genes de la región V de la cadena H y L expresados, seguido de
amplificación por PCR. Las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas después se transfieren a
phh3, determinándose las secuencias de nucleótidos de 30 a 40
clones de fagémido.
La capacidad de anticuerpos con regiones C
murinas de mediar funciones efectoras en un ratón que conducen a la
eliminación de células diana de un tumor humano particular, es
indicativa de la capacidad de esos mismos anticuerpos, si se
proporcionan con regiones C humanas, de mediar funciones efectoras
en un ser humano que conduzcan a la eliminación de células diana de
ese tumor. Por lo tanto, como modelo para ensayar la capacidad de
la biblioteca anti-tumoral de eliminar células
tumorales diana in vivo, se usa el ratón desnudo. A ratones
BALB/c desnudos se les inyectan 0,25 ml de piezas de tumor OC2 o
10^{7} células de tumor OC2, tanto s.c. como i.p. También se usa
la inyección intravenosa de suspensiones de células tumorales cuando
es demostrable el crecimiento del tumor OC2 en cualquier órgano, por
ejemplo, el bazo o el ovario, después de tales inyecciones. A los
ratones se les inyecta simultáneamente o posteriormente la
biblioteca de anticuerpos IgG_{2a}, o una cantidad equivalente de
IgG_{2a} de ratón para el grupo de control. El efecto del
tratamiento con anticuerpos se determina por inspección visual y
táctil para determinar el desarrollo de un tumor subcutáneo. Sus
dimensiones se miden a diversos tiempos después del tratamiento con
anticuerpos en comparación con el grupo de control. Los ratones con
tumor que han recibido inyecciones por vía intraperitoneal se
sacrifican a un tiempo predeterminado desde el examen de los
ratones de control para producir un tumor visible en la cavidad
peritoneal, aproximadamente 3-5 semanas, y se
comprueba el crecimiento tumoral. Después del sacrificio, se
examinan todos los ratones, incluyendo cualquier ratón al que se le
hayan inyectado i.v. suspensiones de células tumorales, para
determinar la metástasis y la necrosis tumoral.
El crecimiento de los tumores subcutáneos puede
ser más difícil de inhibir que el crecimiento de los tumores
intraperitoneales o los tumores en otros sitios, porque estos
últimos pueden ser más accesibles a los anticuerpos y a las células
efectoras. Se ensayan tanto tumores s.c. como i.p. porque si los
tumores s.c. son más difíciles de inhibir, su inhibición constituye
una medida añadida de la potencia de la biblioteca de
anticuerpos.
Se administran 100 \mug de biblioteca de
anticuerpos anti-tumorales IgG_{2a} por
inyección i.p. 3 días después de la inyección de las piezas
tumorales. Para optimizar el proceso, dependiendo de los
resultados, se inyecta anticuerpo a un tiempo posterior o anterior.
De nuevo, dependiendo de los resultados, se administran diferentes
dosis de biblioteca de anticuerpo IgG_{2a}, mayor o inferior a 100
\mug por ratón, con inyecciones repetidas y con una vía de
inyección i.v. También pueden administrarse diferentes dosis de
piezas tumorales y de células tumorales OC2. Al principio, sólo se
usan dos ratones para cada protocolo experimental y tres ratones
para el control (IgG_{2a} de ratón no específica). Después, si
es eficaz, los protocolos se ensayan en un grupo de 5 ratones con 5
ratones en el grupo de control.
Una porción de la preparación de fragmentos de
ADN EcoRI-HindIII que contiene las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas, incluyendo los promotores de
mamífero y los sitios de empalme, se une a la cadena principal
EcoRI-HindIII del vector doble IgG_{1} quimérico
(Figura 4b) y se utiliza para transformar células electrocompetentes
DH101B para generar una biblioteca de expresión de IgG_{1}
quimérica de ratón/humana. La capacidad de la biblioteca de
IgG_{1} quimérica de ratón/humana para afectar al crecimiento del
tumor OC2 se ensaya tanto en ratones desnudos como en ratones SCID,
sin y con reconstitución del ratón SCID con PBL humanos. Se ha
demostrado que las regiones Fc humanas se unen a receptores Fc
murinos y, por lo tanto, es posible que la biblioteca de IgG_{1}
quimérica inhiba el crecimiento del tumor OC2. Se ensayan tanto
tumores subcutáneos como tumores intraperitoneales.
La capacidad de la biblioteca de anticuerpos
IgG_{1} quiméricos de inhibir el crecimiento del tumor OC2 en
ratones HU-PBL-SCID se ensaya para
determinar si las células efectoras humanas confieren una ventaja
añadida. Para generar ratones
HU-PBL-SCID, a ratones SCID se les
transplantan por vía intraperitoneal 2-5 x 10^{7}
PBL adultos separados de sangre entera por centrifugación con
gradiente de densidad de Ficoll-Paque al mismo
tiempo que se realiza la primera inyección de la biblioteca de
anticuerpos quiméricos IgG_{1}. La mayoría de los PBL humanos
permanecen en la cavidad peritoneal y aparecen en el bazo y en la
sangre (como 1-10% de las células totales después
de la lisis de glóbulos rojos) sólo de 3 a 6 semanas después de la
reconstitución y, por lo tanto, el ensayo sólo es para la
inhibición del crecimiento de tumores intraperitoneales. Las
complicaciones debidas a la aparición de linfomas inducidos por el
virus de Epstein-Barr (EBV) en ratones
reconstituidos con PBL de algunos donantes seropositivos para EBV
se eliminan al terminar las muestras y/o tumores EBV positivos. El
tiempo de aparición de estos linfomas varía entre 6 y 20 semanas
después de la reconstitución, pero es reproducible para un donante
EBV-seropositivo dado. Los PBL de algunos donantes
EBV positivos nunca producen linfomas. Se preensayan los PBL de
algunos donantes y sólo se usan los donantes cuyos PBL no conducen
a un desarrollo prematuro de linfomas en los ratones
reconstituidos. Además, en los experimentos se incluye un grupo de
control al que no se le ha inyectado el tumor OC2. La estrategia
para las dosis de anticuerpo, y el orden y programa de inyección de
la biblioteca de anticuerpos y del tumor OC2, es como se ha
descrito para la biblioteca de IgG_{2a} de ratón.
Otras realizaciones y usos de la invención serán
evidentes para los especialistas en la técnica tras la
consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la
invención descrita en este documento. Se pretende que la memoria
descriptiva y los ejemplos se consideren sólo de forma ilustrativa,
estando indicado el verdadero alcance de la invención por las
siguientes reivindicaciones.
Claims (22)
Hide Dependent
translated from
Claims (22)
Hide Dependent
translated from
1. Un método para obtener una biblioteca de
moléculas de vectores de expresión que codifican una pluralidad de
proteínas receptoras o partes de las mismas, que comprende las
etapas de:
- a)
- obtener una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico donde cada fragmento de ácido nucleico codifica una región variable o una parte de la misma de una proteína receptora,
- b)
- producir una pluralidad de segmentos, donde cada segmento contiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes, a partir de dicha pluralidad de fragmentos de ácido nucleico unidos en orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, denominados en este documento par de fragmentos de ácido nucleico unidos,
- c)
- clonar dicha pluralidad de segmentos en un primer vector circular para producir una biblioteca de moléculas de vectores,
- d)
- insertar un primer cassette entre los dos fragmentos de ácido nucleico de los pares que están contenidos en dicha biblioteca de moléculas de vectores para producir una primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión, donde dicho primer cassette contiene al menos un elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido nucleico en una primera célula hospedadora,
- e)
- introducir dicha primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión en dichas primeras células hospedadoras para producir una primera población de células hospedadoras que, en condiciones apropiadas y en un periodo de tiempo apropiado, expresen una primera biblioteca de secuencias de proteína receptora que contienen, cada una, una secuencia codificada por uno de dichos pares de fragmentos de ácido nucleico unidos,
- f)
- aislar dicha primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión a partir de dichas primeras células hospedadoras, y
- g)
- obtener una pluralidad de segmentos que comprenden dichos pares de fragmentos de ácido nucleico unidos y dicho primer cassette entre dichos fragmentos de ácido nucleico unidos sin aislar segmentos individuales de dicha primera biblioteca de moléculas vectores de expresión, e insertar dichos segmentos o una subfracción de los mismos en un segundo vector sin romper la unión entre los fragmentos de ácido nucleico para producir una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión.
2. El método de la reivindicación 1, donde el
primer cassette codifica además al menos una secuencia líder de
proteínas de membrana o proteínas secretadas unida operativamente a
un miembro de dicho par de fragmentos de ácido nucleico unidos.
3. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende además cambiar dicho primer
cassette por un segundo cassette, donde dicho segundo cassette
contiene al menos un elemento promotor que permite la expresión de
dichos fragmentos de ácido nucleico en una segunda célula
hospedadora.
4. El método de la reivindicación 3, donde el
segundo cassette codifica además secuencias líder de proteínas
secretadas o de membrana.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, donde el primero y/o el segundo cassette
comprende una secuencia
líder-promotor-promotor-líder.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde se transfieren pares de fragmentos de
ácido nucleico unidos desde una subfracción de dicha primera
biblioteca de moléculas de vectores de expresión a un segundo vector
para producir una segunda biblioteca de moléculas de vectores de
expresión, habiéndose seleccionado dicha subfracción para codificar
una subserie de dominios de unión.
7. Un método para producir una composición que
comprende proteínas receptoras o partes de las mismas, donde cada
proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones
variables asociadas entre sí para formar un dominio de unión,
comprendiendo dicho método las etapas de:
- a)
- obtener una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6,
- b)
- introducir dicha segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en una célula hospedadora que puede ser idéntica o diferente de dicha primera célula hospedadora para producir una segunda población de células hospedadoras que, en condiciones apropiadas y en un tiempo apropiado, expresen una segunda biblioteca de secuencias de proteína receptora que contienen, cada una, una secuencia codificada por uno de dichos pares de fragmentos de ácido nucleico unidos,
- c)
- cultivar dicha segunda población de células hospedadoras en condiciones adecuadas, y
- d)
- obtener dicha composición que comprende proteínas receptoras o partes de las mismas, donde cada proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones variables asociadas entre sí para forma un dominio de unión.
8. Un método para transferir una biblioteca de
segmentos, que codifica regiones variables de proteínas receptoras,
desde una primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión
a un segundo vector, que comprende las etapas de:
- a)
- obtener una pluralidad de segmentos a partir de una primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión sin aislar segmentos individuales, donde cada segmento contiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes donde cada uno de los fragmentos codifica una región variable o una parte de la misma de una proteína receptora o una parte de la misma, unidos en orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, y un primer cassette entre los dos fragmentos de ácido nucleico, donde dicho primer cassette comprende al menos un elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido nucleico en una primera célula hospedadora, y
- b)
- insertar dichos fragmentos de ácido nucleico unidos en un segundo vector sin romper la unión entre los fragmentos de ácido nucleico, para producir una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión.
9. El método de la reivindicación 8, que
comprende además intercambiar dicho primer cassette por un segundo
cassette, donde dicho segundo cassette comprende al menos un
elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de
ácido nucleico en una segunda célula hospedadora.
10. El método de la reivindicación 9, donde el
segundo cassette codifica además secuencias líder de proteínas de
membrana o secretadas.
11. El método de la reivindicación 10, donde el
cassette comprende una secuencia
líder-promotor-promotor-líder.
12. Un método para producir una composición que
comprende proteínas receptoras o partes de las mismas, donde cada
proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones
variables asociadas entre sí para formar un dominio de unión,
comprendiendo dicho método las etapas de:
- a)
- obtener una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11,
- b)
- introducir dicha segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en una célula hospedadora que puede ser idéntica o diferente de dicha primera célula hospedadora para producir una segunda población de células hospedadoras que, en condiciones apropiadas y en el tiempo apropiado, expresan una segunda biblioteca de secuencias de proteína receptora, comprendiendo cada una una secuencia codificada por uno de dichos fragmentos de ácido nucleico unidos,
- c)
- cultivar dicha segunda población de células hospedadoras en condiciones adecuadas, y
- d)
- obtener dicha composición que comprende proteínas receptoras o partes de las mismas donde cada proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones variables asociadas entre sí para formar un dominio de unión.
13. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde cada par de fragmentos de ácido
nucleico unidos codifica porciones de las mismas regiones variables
o regiones variables derivadas de dos cadenas diferentes de la misma
proteína.
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dichos fragmentos de ácido
nucleico comprenden una población policlonal que codifica regiones
variable o porciones de las mismas de proteínas receptoras,
incluyendo receptores de células T tales como TcR, receptores de
células B incluyendo inmunoglobulinas, receptores de células
destructoras naturales, receptores de macrófagos y partes y
combinaciones de los mismos.
15. Una biblioteca de moléculas de vectores que
comprende:
una pluralidad de moléculas de vectores
circulares, donde cada vector circular contiene un segmento que
tiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes unidos en
orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, donde cada
fragmento de ácido nucleico codifica una región variable o una
parte de la misma de una proteína receptora, siendo capaces dichas
regiones variables de asociarse entre sí para formar un dominio de
unión.
16. Una biblioteca de moléculas de vectores de
expresión que comprende:
una pluralidad de moléculas de vectores
circulares donde cada vector circular contiene un segmento que
tiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes unidos en
orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, donde se ha
insertado un cassette entre los dos fragmentos de ácido nucleico de
los pares, donde dicho cassette contiene al menos un elemento
promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido
nucleico, y donde cada fragmento de ácido nucleico codifica una
región variable o una parte de la misma de una proteína receptora,
siendo capaces dichas regiones variables de asociarse entre sí para
formar un dominio de unión.
17. Una biblioteca de moléculas de vectores de
expresión de acuerdo con la reivindicación 16, donde el cassette
comprende una secuencia
líder-promotor-promotor-líder.
18. Una biblioteca de moléculas de vectores de
expresión que se puede obtener por el método de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ó 13 ó 14.
19. Una biblioteca de moléculas de vectores de
expresión que se puede obtener por el método de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
20. Una biblioteca de células hospedadoras que
contiene la biblioteca de moléculas de vectores de expresión de
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.
21. La biblioteca de cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, donde dichos fragmentos de ácido nucleico
codifican proteínas no idénticas.
22. La biblioteca de cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, donde dichos fragmentos de ácido nucleico
codifican anticuerpos policlonales.