ES2201097T3 - Bibliotecas de anticuerpos policlonales. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION ESTA RELACIONADA CON LOS METODOS PARA CREAR Y UTILIZAR BIBLIOTECAS DE PROTEINAS QUE INCLUYEN ANTICUERPOS POLICLONALES CONTRA UN ANTIGENO O GRUPOS DE ANTIGENOS COMUNES, PROTEINAS RECEPTORAS CON REGIONES VARIABLES RELACIONADAS U OTRAS PROTEINAS INMUNES RELACIONADAS CON REGIONES VARIABLES. ESTAS BIBLIOTECAS DE ANTICUERPOS POLICLONALES PUEDEN UTILIZARSE PARA TRATAR O PREVENIR ENFERMEDADES Y TRASTORNOS, INCLUIDAS LAS NEOPLASIAS COMO EL CANCER Y OTROS TUMORES, LAS PARASITOSIS, LAS INFECCIONES BACTERIANAS, LAS INFECCIONES BORRICOS Y TRASTORNOS COMO LOS DEFECTOS Y DEFICIENCIAS GENETICAS. LAS BIBLIOTECAS DE PROTEINAS PUEDEN SER ESPECIFICAS PARA UN PACIENTE, UNA ENFERMEDAD O AMBOS. LAS BIBLIOTECAS TAMBIEN PUEDEN UTILIZARSE PARA LA DETECCION DE UNA ENFERMEDAD O UN TRASTORNO EN UN PACIENTE, YA SEA MEDIANTE METODOS DIRECTOS DE DIAGNOSTICO POR IMAGENES O MEDIANTE EL USO DE UN KIT DE DIAGNOSTICO. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYE NUEVOS METODOS DE CLONACION PARA LA CREACION Y TRANSFERENCIA DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN REGIONES VARIABLES DE PROTEINAS Y NUEVOS VECTORES DE CLONACION.

Description

Bibliotecas de anticuerpos policlonales.

Antecedentes de la Invención 1. Campo de la Invención

La invención se refiere a la creación, interconversión y uso de bibliotecas de anticuerpos policlonales, receptores de la superficie celular y otras proteínas con regiones variables. Estas regiones variables se unen, se clonan en vectores de expresión que pueden mantenerse, seleccionarse y amplificarse cuando se desee, y las bibliotecas o sub-bibliotecas de regiones variables pueden transferirse a otros vectores de expresión sin que se pierda la diversidad o complejidad global. Las bibliotecas resultantes de regiones variables y las bibliotecas de proteínas enteras pueden usarse para tratar, prevenir o diagnosticar enfermedades y trastornos específicos incluyendo neoplasias, malignidades, infecciones y defectos y deficiencias genéticas.

2. Descripción de los Antecedentes

Los linfocitos constituyen aproximadamente el 20% de los leucocitos sanguíneos y son los componentes principales del sistema de reconocimiento de antígenos de mamífero que existe predominantemente en dos formas, células B y células T. Las células T se diferencian en el timo, y posiblemente en otros tejidos, en células T citotóxicas (T_{C}), células T adyuvantes (T_{H}) y células supresoras (T_{S}). Estas células T reconocen antígenos extraños en asociación con los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) a través de un receptor específico de células T (TcR). Este receptor es muy polimórfico y se distribuye clonalmente. El TcR típico es un heterodímero unido por enlaces disulfuro que consta de un polipéptido \alpha y un polipéptido \beta, que se expresa en la superficie de células T maduras. Las dos cadenas son de tamaño similar, poseyendo una porción transmembrana incluida dentro de una región constante y una región variable polimórfica que posee una homología estructural considerable con las inmunoglobulinas. Cada región variable se compone de un segmento variable (V), un segmento de unión (J) y un segmento de diversidad (D) (sólo en la cadena \beta) que se ensamblan formando la región polimórfica. Tal diversidad es necesaria para que las células T respondan a una amplia diversidad de antígenos.

Las células B se diferencian en la médula ósea de mamíferos adultos desarrollándose a partir de pre-células B a células plasmáticas productoras de anticuerpos. La importancia de las células B en el sistema inmune se realza por las enfermedades inmunodeficientes raras en las que el paciente sólo puede sobrevivir por inyecciones repetidas de gamma globulina. Uno de los aspectos fascinantes de las células B es su heterogeneidad de expresión de anticuerpos. A partir de las observaciones, se ha estimado que no más de dos de cada 10^{8} anticuerpos diferentes pueden ser idénticos. No es sorprendente que los mecanismos responsables de tal diversidad no se entiendan completamente. Los anticuerpos y los TcR, teniendo ambos regiones constantes y variables, se clasifican dentro de lo que se denomina la superfamilia de las inmunoglobulinas.

El proceso de expresión de las inmunoglobulinas se inicia con la activación de células B en reposo. En la ruta independiente de células T, el mitógeno se une a receptores superficiales de células B estimulando la expresión de monómeros de IgM con una afinidad bastante baja. Tras el reconocimiento del antígeno extraño, estos monómeros de IgM experimentan entrecruzamientos en la superficie celular y se internalizan. La expresión del anticuerpo después cambia a la transcripción y traducción de IgG, IgE, IgA o IgM pentamérica de mayor afinidad. En la ruta dependiente de células T, de nuevo se requiere que el mitógeno estimule la célula B en reposo, sin embargo, después de la internalización, el antígeno se procesa dentro de la célula para volver a aparecer en la superficie celular en asociación con moléculas del MHC de clase II. Como células presentadoras de antígenos (APC), los complejos antígeno-MHC se reconocen por las células T y estimulan su activación y la producción de varios mediadores solubles de células T y B. La información recibida a partir de estos complejos superficiales se transmite al núcleo de las células B a través de segundos mensajeros que, entre otros efectos, aumentan el metabolismo de nucleótidos cíclicos y la actividad de la proteína quinasa C. Tanto en la ruta dependiente de células T como en la ruta independiente de células T, las células B se desarrollan para dar células productoras de anticuerpos, funcionalmente maduras.

Los anticuerpos son moléculas bifuncionales que comprenden dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) unidas con enlaces disulfuro intercatenarios. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V), que pueden fragmentarse en dominios denominados C_{H1}, C_{H2}, C_{H3} y V_{H}, y C_{L} y V_{L}. La IgM existe como monómeros de la superficie celular o pentámeros circulantes que se mantienen juntos con un péptido de 137 aminoácidos denominado cadena J. Las moléculas de IgA también circulan, pero en pares asociados con la cadena J, y contienen un componente secretor pequeño (SC) que está implicado en el transporte a través de membranas epiteliales. El anticuerpo se une al antígeno a través de dominios de región variable contenidos en la porción Fab y, después de la unión, interacciona con el resto del sistema inmune a través de las funciones efectoras del dominio de la región constante principalmente a través de la porción Fc. Las funciones efectoras incluyen la activación de la cascada del complemento, la interacción con células efectoras tales como linfocitos, y la compartimentalización de inmunoglobulinas. También se cree que ciertas regiones constantes influyen sobre las estabilidades de las diferentes inmunoglobulinas. Por ejemplo, la IgG es relativamente estable, con una vida media circulante de aproximadamente 23 días. La IgG también es la inmunoglobulina respondedora asociada con la respuesta inmune secundaria. Esta inmunoglobulina se fija al complemento a través de la cascada clásica del complemento y tiene la capacidad de reclutar macrófagos y neutrófilos. La IgM pentamérica es otro activador muy fuerte de la cascada clásica del complemento y tiene una vida media en suero de aproximadamente 5 días. La IgA tiene una vida media en suero de 5-6 días, activa el complemento a través de una ruta alternativa y es el anticuerpo principal en las secreciones mucosas.

Los dominios de unión a antígenos, las regiones variables, se codifican en los genes de la región variable que están algo dispersos en el genoma y deben agruparse por un proceso denominado recombinación somática. En este proceso, los segmentos V, D y J (no relacionados con la cadena J) del genoma del hospedador se agrupan para formar una región génica. Esta región se une al ARNm que codifica el dominio de la región constante del anticuerpo para expresarse conjuntamente como un polipéptido y finalmente como una molécula de anticuerpo.

Las regiones constantes de los anticuerpos son las características determinantes principales de la clase de anticuerpo tanto en el caso de las cadenas pesadas como en el caso de las cadenas ligeras, y se codifican en aproximadamente 15 genes diferentes. Las cinco clases de genes de cadena pesada se denominan alfa (\alpha), gamma (\gamma), delta (\delta), mu (\mu) y épsilon (\epsilon), y los dos genes de cadena ligera, kappa (\kappa) y lambda (\lambda). Las regiones variables, que contienen el sitio de unión al antígeno, se codifican en más de mil regiones genéticas diferentes. Estas regiones se recombinan selectivamente para crear la combinación de aminoácidos requerida para reconocer y unirse al antígeno diana. La variabilidad del sitio de unión no está distribuida uniformemente, sino que cada dominio contiene varias porciones muy variables denominadas regiones hipervariables (HVR), o regiones determinantes de complementariedad (CDR), y son estas regiones las que interaccionan realmente con el antígeno.

La generación de diversidad en el sitio de unión es una combinación de varios factores; (1) la combinación de diferentes dominios V_{H} y V_{L}, (2) la combinación de diferentes regiones V, D y J para formar el dominio variable, (3) la generación de una nueva diversidad en las uniones de dominios, denominada diversidad de unión, y (4) la diversidad debida a mutaciones somáticas. La mutación somática, en una gran medida, también es responsable de la maduración de la respuesta inmune, teniendo los clones de células B que proliferan durante el desarrollo de la respuesta humoral una afinidad cada vez mayor por el antígeno. La combinación de estos procesos, en teoría, permite que un organismo genere una respuesta inmune específica contra casi cualquier antígeno.

La estimulación de una respuesta de anticuerpos es la base de la mayoría de las formas de terapia y profilaxis con vacunas. Como profilaxis, al paciente se le administra el antígeno en forma del microorganismo inactivado o atenuado o como una proteína purificada. Es de esperar que la administración de esta vacuna prepare al sistema inmune del paciente para el posible reconocimiento posterior de ese mismo antígeno en forma de una infección. Si la infección puede cogerse pronto, en otras palabras, si los anticuerpos anti-antígeno están circulando a lo largo del cuerpo tras la exposición inicial o precoz al organismo, el organismo puede eliminarse del cuerpo antes de que tenga posibilidad de instalarse o de producir una infección sólida. Este aspecto se reconoce desde hace mucho tiempo, incluso antes de apreciar la estructura básica del anticuerpo. Los tratamientos con anticuerpos implican vacunaciones pasivas de suero reunido en forma de gamma globulinas. Se recoge plasma sanguíneo de individuos o animales convalecientes que se recuperaron de la enfermedad particular, y se purifica la fracción proteica o de gamma globulina, denominada así porque contiene predominantemente moléculas de IgG. Se administran inyecciones de esta gamma globulina muchas veces durante un período de horas o días, normalmente inmediatamente después de la exposición al organismo infeccioso o sustancia tóxica, para proporcionar al paciente protección a corto plazo contra la infección. Por ejemplo, a los individuos mordidos por un animal que se sospecha que es portador del virus de la rabia, un rabdovirus, se les administra un régimen de tratamientos con gamma globulina para prevenir la infección del virus, porque una vez que se ha instalado la infección, el resultado inevitablemente es bastante malo. Sin embargo, si los tratamientos se inician precozmente, el pronóstico puede ser bastante optimista.

El uso de anticuerpos para la terapia (o profilaxis) del cáncer se basa en la premisa de que el perfil antigénico de una célula cancerígena es diferente del de las células normales. Como se representa esquemáticamente en la Figura 1, estas diferencias podrían incluir potencialmente (1) determinantes antigénicos que están presentes exclusivamente en la superficie de células tumorales, (2) moléculas intracelulares encontradas exclusivamente en células tumorales que se presentan como péptidos sobre la superficie celular en asociación con moléculas del MHC, (3) antígenos que están presente sólo en algunas células normales, y (4) diferencias cuantitativas en la cantidad de expresión de ciertos antígenos sobre la superficie de las células tumorales en comparación con otros tipos de células no tumorales. Esta premisa se ha sustanciado por el descubrimiento de los denominados antígenos asociados a tumores, que no se expresan en cantidades significativas o medibles sobre las superficies de células normales (M. Herlyn y H. Koprowski, Ann. Rev. Immunol. 6:283-308, 1988). Estos péptidos específicos de tumores se presentan en la superficie celular en asociación con antígenos del MHC de clase I.

Los anticuerpos monoclonales, a diferencia de los anticuerpos policlonales, comprenden una colección de moléculas idénticas producidas por un clon común de células B que se dirigen contra un solo determinante antigénico. Los anticuerpos monoclonales pueden distinguirse de los anticuerpos policlonales en que los anticuerpos monoclonales deben seleccionarse de forma individual, mientras que los anticuerpos policlonales se seleccionan en grupos de más de uno o, en otras palabras, en masa. Pueden producirse grandes cantidades de anticuerpos monoclonales por inmortalización de una población de células B policlonales usando la tecnología de hibridomas. Cada célula B inmortalizada puede dividirse, presumiblemente de forma indefinida, y dar lugar a una población clonal de células que expresan moléculas de anticuerpo idénticas. Los clones de células B inmortalizados individuales, los hibridomas, se segregan y se cultivan por separado.

La terapia con anticuerpos monoclonales se ha usado cada vez más en la terapia y el diagnóstico del cáncer, pero tiene varias limitaciones (H. Thomas y K. Sikora, Rev. Oncol. 4:107-120, 1991). A menudo aparecen variantes de células tumorales, que carecen del único determinante antigénico reconocido por el anticuerpo monoclonal, que escapan al tratamiento. Como cada anticuerpo monoclonal se dirige a un solo determinante antigénico de la célula cancerígena diana, la densidad de ese determinante en la superficie celular normalmente no es suficientemente alta como para permitir la destrucción de la célula. Además, no se activan los mecanismos efectores mediados por las regiones Fc de las moléculas de anticuerpo unidas, tales como la unión al complemento y la producción concomitante de C3b, la opsonización/fagocitosis y la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Sólo a altas densidades de anticuerpo se activa el complemento, o se ocupan suficientes receptores Fc como para que las células efectoras se activen para realizar sus funciones preordenadas. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales antitumorales normalmente son ineficaces para la eliminación completa de las células diana.

En un esfuerzo por evitar algunos de estos problemas, se han desarrollado métodos para probar y reforzar la eficacia de destrucción de anticuerpos monoclonales con isótopos radiactivos, toxinas o fármacos. Sin embargo, estas señales a su vez pueden producir efectos secundarios perjudiciales (T. A. Waldmann, Sci. 252:1657-62, 1991). Aunque un anticuerpo monoclonal (con señal o sin señal) sea razonablemente eficaz para eliminar células cancerosas, y se hayan documentado remisiones, en la mayoría de los casos se producen recaídas del cáncer debido a que las variantes de células tumorales que han perdido el determinante antigénico diana escapan y proliferan (R.A. Miller et al., N. Engl. J. Med. 306:517-22, 1982). Este problema podría solucionarse parcialmente con el uso de colecciones de anticuerpos monoclonales antitumorales que tuvieran el efecto beneficioso de usar el mismo reactivo preexistente en muchos pacientes. Aunque esto sería una ventaja, porque los tumores individuales presentan esta variabilidad, no es de esperar que sea común el descubrimiento de múltiples antígenos específicos para un tipo de cáncer presente en todos los cánceres de ese tipo (D. Berd et al., Cancer Res. 49:6840-44, 1989). Aunque se encuentre un tratamiento eficaz usando colecciones de anticuerpos monoclonales para pacientes con algunos tipos de cáncer, es poco probable que sea un tratamiento eficaz para muchas formas de neoplasia.

La tecnología de anticuerpos monoclonales, en su fase actual, se ha centrado en el uso de anticuerpos monoclonales no humanos. A menudo, esto supone un problema porque los pacientes desarrollan anticuerpos contra las regiones no humanas de las proteínas, incluyendo tanto las regiones constantes como las regiones variables. Los anticuerpos reactivos contra el sitio de unión a antígenos, las regiones variables, de otro anticuerpo se denominan anticuerpos anti-idiotípicos. Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales murinos, los más fáciles de producir y los más prevalentes, inducen una respuesta humoral en humanos que se denomina respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón o la respuesta HAMA (D.L. Sawler et al., J. Immunol. 135:1530-35, 1985). Las respuestas HAMA significativas en pacientes que reciben tal terapia, aparte de destruir cualquier efecto beneficioso posible del tratamiento, introducen numerosas complicaciones, incluyendo trastornos del complejo inmune.

En los últimos años, estos problemas se han solucionado parcialmente por la generación y uso de anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos quiméricos tienen regiones V derivadas del anticuerpo monoclonal de ratón con especificidad por el tumor, pero regiones C humanas (S.L. Morrison y V.T. Oi, Adv. Immunol. 44:65-92, 1989). En tales formas, la respuesta HAMA se reduce significativamente (aunque no se elimina), pero sigue teniéndose que hacer frente a la respuesta anti-idiotípica. Los esfuerzos por eliminar la respuesta anti-idiotípica han implicado la obtención por ingeniería genética de anticuerpos en los que sólo las CDR proceden del anticuerpo el ratón y la estructura y las regiones C son de origen human. Estos son los denominados anticuerpos humanizados (P.C. Caron et al., Cancer Res. 52:6761-67, 1992). Estos anticuerpos son muy difíciles de crear, implicando múltiples sucesos de clonación, y también pueden inducir anticuerpos anti-idiotípicos (The Third Annual IBC International Conference on Antibody Engineering, 14-16 de diciembre de 1992, San Diego). Actualmente se están desarrollando anticuerpos monoclonales completamente humanos con la esperanza de que no induzcan anticuerpos anti-idiotípicos (C.J. Fisher et al., Critical Care Med. 18:1311-15, 1990). Sin embargo, como los ratones son perfectamente capaces de generar anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos procedentes de la misma especie e incluso de la misma cepa endogámica, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos después de la inyección de grandes cantidades de anticuerpos con regiones V idénticas seguirá siendo un problema siempre que se usen anticuerpos monoclonales.

El uso de anticuerpos policlonales solucionaría algunos de los inconvenientes asociados con la terapia de anticuerpos monoclonales. A diferencia de los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales se dirigen a muchos determinantes antigénicos diferentes presentes en la superficie de la célula diana y se unirían con suficiente densidad como para permitir que los mecanismos efectores del sistema inmune funcionaran eficazmente, posiblemente eliminando la necesidad de cualquier señal radiactiva o tóxica. Además, la probabilidad de que aparezcan variantes de células tumorales de escape que han perdido la reactividad con todos los anticuerpos policlonales es muy pequeña. No es de esperar que sea un problema la reactividad anti-idiotípica en los pacientes, porque ninguna combinación de regiones V debe estar presente en una cantidad suficiente como para inducir una respuesta significativa.

Hay varios problemas asociados con el uso de anticuerpos policlonales convencionales. En primer lugar, los anticuerpos policlonales en forma de gamma globulina están disponibles en un suministro muy limitado, insuficiente para los tratamientos generalizados en los seres humanos. En segundo lugar, cuando se usan en un paciente, muchos de los anticuerpos policlonales se absorberán por las células y los tejidos normales del paciente. El número de anticuerpos diferentes que permanecen después de la absorción sería excepcionalmente pequeño, posiblemente demasiado pequeño como para tener algún efecto beneficioso. En tercer lugar, este suministro, además de ser inadecuado, requiere mucha purificación para retirar los materiales indeseados, tales como citoquinas u otras proteínas inmunorreguladoras, que pueden inducir respuestas inmunes indeseables y efectos secundarios. También existe un riesgo sustancial de contaminación asociada con organismos infecciosos tales como VIH o toxinas tales como lipopolisacáridos, que pueden estar presentes en la fuente. Estos problemas son difíciles de solucionar debido a la variabilidad de la composición, ya que el material se recoge a partir de muchas fuentes biológicas diferentes. La producción recombinante de anticuerpos policlonales solucionaría ciertos de estos asuntos, pero los genes que codifican estos anticuerpos no se pueden identificar fácilmente y aún no se ha desarrollado la tecnología para trabajar eficazmente con colecciones de genes de anticuerpos.

Recientemente, se han expresado fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos en la superficie de fagos filamentosos (G.P. Smith, Sci. 228:1315, 1985). Se han obtenido bibliotecas de ADN_{c} de regiones variables de cadenas H y L a partir de células B animales y humanas y se han clonado en pares en combinaciones aleatorias de H-L en vectores de presentación de fagos para producir bibliotecas combinatorias que presenten fragmentos Fab o Fv monocatenarios (W.D. Huse et al., Sci, 246:1275-81, 1989). El Fab se forma por la asociación de la cadena L con los dominios V_{H} y C_{H1} de la cadena H, la región Fd. En las bibliotecas de presentación de fagos, el extremo carboxilo terminal de la región Fd o Fv se encadena a un fragmento de una proteína de recubrimiento del fago, tal como cpIII o cpVIII, que ancla el fragmento Fab a la superficie del fago. Tanto en los fragmentos Fab y Fv como en los anticuerpos intactos, el sitio de unión al antígeno se forma por la combinación de los dominios V_{H} y V_{L}.

Las bibliotecas de presentación de fagos pueden seleccionarse para unirse a antígenos específicos por cromatografía de afinidad (R.E. Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889, 1992) o presentando el fago sobre superficies recubiertas de antígeno (C.F. Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363, 1991). Cuando los segmentos de ADN que codifican los fragmentos de anticuerpo seleccionados se transportan por partículas de fago, las partículas de fago seleccionadas que codifican fragmentos de anticuerpo monoclonal pueden aislarse y propagarse indefinidamente. Los clones de fagos seleccionados pueden modificarse para producir fragmentos de anticuerpo que carezcan del resto de la proteína de la cubierta que también puede secretarse a partir de las células bacterianas. Se han recuperado fragmentos de anticuerpo específicos para haptenos, proteínas y varios virus humanos a partir de tales bibliotecas combinatorias de presentación de fagos (J.D. Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991; R.A. Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4141, 1993).

Un inconveniente principal de estas bibliotecas combinatorias es que las regiones V_{H} y V_{L} que forman el dominio de unión a antígenos están asociadas aleatoriamente. Las combinaciones originales de cadenas H y L que se seleccionaron de forma tan eficaz in vivo por el antígeno se pierden (J. McCafferty et al., Nature 348:552-54, 1990). La probabilidad de encontrar combinaciones de H y L con alta afinidad por el antígeno de interés es muy pequeña. El número de clones que se necesitaría seleccionar con respecto a la presencia de la unión específica al antígeno se aumenta en órdenes de magnitud.

Hace muy poco se ha informado sobre un método para amplificar y unir los genes de la región V_{H} y V_{L} expresados dentro de células individuales en una población de células (M.J. Embleton et al., Nuc. Acids Res. 20:3831-37, 1992). Este método se ejemplificó con dos líneas de células de hibridoma de ratón, produciendo cada una un producto de inmunoglobulina (Ig) conocido y distinto. Las dos poblaciones de células se mezclaron, se fijaron con formaldehído y se permeabilizaron con el detergente NP-40. Los ADNc se sintetizaron usando transcriptasa inversa y cebadores complementarios a los extremos 3' de los ARNm de V_{H} y V_{L}. Después, los ADNc se amplificaron por PCR y se unieron a la misma reacción usando, además de los cebadores de ADNc, un cebador del extremo 3' del gen de V_{H} y un cebador del extremo 5' del gen de V_{L}. Estos cebadores también contenían colas complementarias de secuencia extra para el auto-montaje de los genes de V_{H} y V_{L}. En una segunda PCR, después de lavar las células, los genes de las regiones V_{H} y V_{L} unidos se amplificaron con cebadores anidados terminales produciendo una población de fragmentos de ADN que codificaban las secuencias V_{H} y V_{L} en una orientación transcripcional de cabeza a cola. Estos fragmentos de ADN se recuperaron de los sobrenadantes celulares.

Aunque este informe afirmó que casi todas las combinaciones V_{H}-V_{L} examinadas procedían de una sola de las líneas de células de hibridoma, el método produce combinaciones mixtas de V_{H}-V_{L} donde V_{H} y V_{L} pueden proceder de diferentes células. También es evidente que debe producirse esta mezcla de V_{H}-V_{L} por consideraciones teóricas. Como las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas se recuperan del sobrenadante de las células fijadas/permeabilizadas y los poros presentes en las membranas de estas células permiten el paso libre de tales moléculas de ADN unidas, sería de esperar que las moléculas de ADN de V_{H} y V_{L} más pequeñas salieran de las células y se unieran y amplificaran adicionalmente fuera de las células, donde se produciría la mezcla libre de V_{H} y V_{L} de diferentes células.

Sumario de la Invención

La presente invención soluciona los problemas e inconvenientes asociados con las estrategias y diseños actuales y proporciona nuevas composiciones y métodos para la profilaxis y tratamiento de ciertas enfermedades y trastornos.

Las bibliotecas de anticuerpos policlonales tienen una mayor complejidad que los anticuerpos monoclonales o los cócteles de anticuerpos, dirigiéndose contra muchos determinantes antigénicos diferentes, y llevan la opción de usar señales radiactivas, de toxinas y otras señales tanto para la terapia como para el diagnóstico. Una realización de la invención se refiere a métodos para tratar trastornos neoplásicos usando bibliotecas de anticuerpos policlonales dirigidas específicamente a una enfermedad o a un trastorno. Se obtiene una muestra de tejido neoplásico a partir de un paciente. La muestra se introduce en una población celular capaz de producir anticuerpos, tal como células de bazo de un mamífero. La población celular se fija, se permeabiliza y las moléculas de ARNm de V_{H} y V_{L} se transcriben de forma inversa para dar secuencias de ADNc de V_{H} y V_{L}. Las secuencias de ADNc se amplifican por PCR y las secuencias amplificadas se unen, preferiblemente en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza. Las secuencias unidas se amplifican de nuevo por PCR para crear una población de fragmentos de ADN que codifican las regiones de anticuerpo V_{H} y V_{L}. Estos fragmentos de ADN se clonan en vectores de expresión y las diferentes poblaciones de vectores de expresión se expanden en el hospedador transfectado. Se seleccionan vectores de expresión que codifiquen una biblioteca de anticuerpos anti-neoplásicos recombinantes y se expanden de nuevo las subpoblaciones o sub-bibliotecas. Los anticuerpos anti-neoplásicos recombinantes producidos por estos vectores después se administran al paciente. Los trastornos neoplásicos que pueden tratarse incluyen leucemias, linfomas, sarcomas, carcinomas, tumores de células neurales, carcinomas de células escamosas, tumores de células germinales, metástasis, tumores indiferenciados, seminomas, melanomas, neuroblastomas, tumores de células mixtas, neoplasias producidas por agentes infecciosos y otras malignidades.

Otra realización de la invención se refiere al diagnóstico in vivo de un trastorno neoplásico por medio de la obtención de imágenes del tejido enfermo en un paciente. Se crea una biblioteca de anticuerpos anti-neoplásicos específicos para el paciente, como se describe en este documento, y se marcan con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos enteros o fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab. La biblioteca marcada se administra al paciente y el marcador se detecta usando, por ejemplo, detectores radiactivos, inspección visual, detección por resonancia magnética nuclear (RMN) u otros medios para detectar la aparición de un marcador en un tejido o residuo corporal, o dentro del propio cuerpo entero. Por medio de estos métodos pueden percibirse neoplasias no identificadas hasta ahora, que escapaban a la detección por otros medios. Además, una vez detectada, la neoplasia puede controlarse eficazmente durante los regímenes de tratamiento.

Otra realización de la invención se refiere a métodos para crear bibliotecas con especificidad de paciente o con especificidad de antígeno de anticuerpos policlonales. Estas bibliotecas, creadas como se ha descrito anteriormente, son útiles para el tratamiento o profilaxis de varias enfermedades incluyendo neoplasias, malignidades, infecciones, defectos genéticos y deficiencias genéticas. Las bibliotecas pueden comprender vectores que contienen ADN que codifica las regiones variables, ADN que codifica el anticuerpo entero, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Una vez aislada y clonada, la biblioteca puede expandirse para asegurar la representación de todos los miembros del perfil antigénico y también puede transferirse fácilmente a otros vectores.

Otra realización de la invención se refiere a composiciones que contienen bibliotecas de anticuerpos policlonales o vectores de expresión genética que codifican estos anticuerpos. La biblioteca o la sub-biblioteca seleccionada de anticuerpos pude marcarse con un marcador detectable y/o contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden administrarse a pacientes para protocolos de diagnóstico o tratamiento. Como alternativa, pueden administrarse bibliotecas de vectores a pacientes para la expresión in vivo de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo.

Otra realización de la invención se refiere a adyuvantes de diagnóstico o kits y a métodos para usar estos kits para la detección de enfermedades y trastornos. Los adyuvantes de diagnóstico o kits comprenden una biblioteca de anticuerpos policlonales que pueden marcarse con un marcador detectable al que se añade una muestra que se sospecha que contiene el antígeno diana. La muestra puede ser una muestra de un fluido corporal tal como sangre, suero, plasma, fluido espinal, linfa u orina. La presencia o ausencia del antígeno diana indica la presencia de una enfermedad, trastorno o contaminante particular. Las muestras pueden ser muestras biológicas de un paciente o muestras biológicas de una fuente ambiental que se sospecha que lleva un contaminante. La muestra se mezcla con la biblioteca y la presencia del antígeno se confirma por la unión de un número significativo de anticuerpos y la detección del marcador.

Otra realización de la invención se refiere a métodos para crear y utilizar bibliotecas de proteínas receptoras que poseen regiones variables. Las proteínas receptoras que pueden utilizarse para crear una biblioteca incluyen receptores de células T, receptores de células B, receptores de células destructoras naturales y receptores de macrófagos. Una muestra de tejido biológico se introduce en una población de células capaces de producir proteínas receptoras. Los ARNm de la proteína receptora de la región variable se transcriben de forma inversa para dar secuencias de ADNc que se amplifican por PCR, y los fragmentos de ADN resultantes se clonan en vectores de expresión. Se seleccionan los vectores de expresión que codifican las proteínas receptoras recombinantes y se expande una subpoblación seleccionada para producir la biblioteca. Estas bibliotecas pueden usarse para diagnosticar, obtener imágenes o tratar enfermedades y trastornos incluyendo neoplasias, infecciones y defectos y deficiencias genéticas. Además, usando los mismos métodos, también pueden crearse y utilizarse bibliotecas de proteínas quiméricas que contienen tanto anticuerpos como porciones de proteínas receptoras.

Otra realización de la invención se refiere a vectores de ácido nucleico que pueden usarse para crear las bibliotecas de anticuerpo policlonal con especificidad de antígeno. Estos vectores comprenden sitios de reconocimiento de enzimas de restricción convenientes para la clonación de fragmentos de ácido nucleico y secuencias para amplificar eficazmente por PCR los fragmentos de ADNc. Los vectores se diseñan para tener uno o más pares de fragmentos genéticos insertados en una orientación de transcripción de cabeza a cabeza y, opcionalmente, también comprenden secuencias controladoras de la transcripción y de la traducción tales como cajas TATA, cajas CAT, sitios de unión a ribosomas, sitios de iniciación y terminación de la ARN polimerasa, secuencias líder, promotores fuertes de la transcripción que pueden regularse diferencialmente o partes o combinaciones de los mismos.

Otra realización de la invención se refiere a métodos para transferir una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico entre diferentes vectores sin una pérdida significativa de diversidad de la biblioteca. La biblioteca de fragmentos se inserta en primeros vectores en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza para formar vectores recombinantes. Los insertos de estos vectores recombinantes se transfieren a segundos vectores, por ejemplo, por amplificación por PCR de las secuencias insertadas o clonación con enzimas de restricción, y los fragmentos se reinsertan en segundos vectores sin una pérdida significativa de diversidad de la biblioteca.

Otras realizaciones y ventajas de la invención se indican, en parte, en la descripción que se presenta a continuación y, en parte, serán evidentes por esta descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención.

Descripción de los Dibujos

Figura 1. Comparación esquemática de las diferencias en densidad y diversidad de antígenos en la superficie de células normales frente a células tumorales.

Figura 2. Representación esquemática de la construcción de (a) pUC19-C_{\kappa}-CH1, (b) pUC119-C_{\kappa}-CH1, (c) plPPl2, y (d) pJS.

Figura 3. Mapas parciales de vectores de expresión de fagémidos (a) pComb3, (b) phh3, (c) plPPl, y (d) phh3mu o phh3hu, que no se muestran a escala. Los aminoácidos aportados por los vectores se muestran en el código de una letra delante de Fd y de los genes de la cadena L. P = promotor; l = secuencia líder; lmod = secuencia líder con la secuencia de nucleótidos modificada.

Figura 4. Diagrama esquemático de (a) un vector doble murino, pMDV, (b) un vector doble quimérico, pCDV; donde: P = promotor; E = potenciador; 1 = secuencia líder; s = sitio de empalme; hum = humano; y (c) la transferencia en masa de secuencias de región variable entre vectores bacterianos y de mamífero.

Figura 5. Representación esquemática de la síntesis de ADNc y reacciones de PCR.

Figura 6. Análisis en gel de agarosa de productos de PCR.

Figura 7. Transferencia de combinaciones de V_{H}-V_{L} unidas dentro de las células a un vector de expresión murino.

Figura 8. Análisis del sobrenadante celular por (a) transferencia de Western y (b) ELISA.

Figura 9. Análisis de unión de fagos a Ars-BSA por (a) ELISA de unión directa y (b) ELISA de inhibición.

Figura 10. Generación de vectores (a) bacterianos y (b) de mamífero para la expresión de bibliotecas de presentación de fagos de Fab o de anticuerpos intactos derivados de combinaciones de V_{H}-V_{L} unidas cabeza con cabeza.

Descripción de la Invención

Como se realiza y se describe ampliamente en este documento, la presente invención comprende métodos para la creación y uso de bibliotecas de proteínas relacionadas tales como anticuerpos, receptores que incluyen receptores de células T, y otras proteínas inmunes relacionadas.

Durante una respuesta inmune, se generan y proliferan muchos miles de clones diferentes de células B, específicos para cada determinante antigénico, creando una gran diversidad de anticuerpos. Esta diversidad se aumenta adicionalmente por mecanismos de hipermutación somáticos que funcionan sobre las células B estimuladas por antígenos. Estos procesos tan eficaces, que funcionan durante la maduración de la respuesta inmune, ocasionan una selección muy grande de anticuerpos con una mayor afinidad por los antígenos. Sin embargo, la terapia actual con anticuerpos se ha centrado en el uso de anticuerpos monoclonales, y cuando los clones de células B se inmortalizan por la formación de hibridomas, sólo se representa una pequeña fracción de los clones de células B. Además, como sólo las células que se dividen pueden participar en la formación de híbridos celulares estables, probablemente, en la población no están representadas células plasmáticas diferenciadas terminalmente que producen anticuerpos de alta afinidad.

Una realización de la invención se refiere a métodos para tratar trastornos neoplásicos usando bibliotecas antitumorales de anticuerpos policlonales con especificidad de paciente o con especificidad de enfermedad. Es de esperar que tales bibliotecas realicen el espectro entero de una respuesta de anticuerpo a células tumorales mucho más eficazmente que los cócteles de anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas. Estas bibliotecas también se pueden reproducir más fácilmente y pueden crearse y mantenerse dejando intacta toda la diversidad asociada con una respuesta inmune natural. Aunque la complejidad de cada biblioteca de anticuerpo policlonal no se conoce inmediatamente, es de esperar que sea muy alta y que lleve asociada la capacidad de activar todas las funciones efectoras asociadas con una respuesta inmune.

Una biblioteca se crea obteniendo una muestra de tejido neoplásico de un paciente con un trastorno particular. El tejido neoplásico puede obtenerse a partir de tejidos tumorales, sangre y tejidos relacionados con la sangre, tejidos de biopsia, tejidos cancerosos, tejidos malignos, tejidos con metástasis y combinaciones de los mismos.

Pueden obtenerse muestras de biopsias de tejidos enfermos, cultivos de células primarias o inmortalizadas de tipos celulares relacionados, o células que se estimulan artificialmente para presentar un perfil antigénico particular. El tejido neoplásico también puede propagarse primero en un animal inmunodeficiente, tal como un modelo de ratón, para reforzar la expresión no impedida del antígeno. Los modelos de ratón útiles incluyen el ratón desnudo, el ratón SCID y el ratón irradiado. Los ratones desnudos atímicos congénitos, con deficiencias en la función de las células T, permiten el crecimiento in vivo de tumores humanos. También se ha demostrado que los ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), que carecen de células B y T funcionales, y los ratones irradiados sub-letalmente, donde las células T y B se han destruido, permiten el crecimiento de tumores alogénicos y xenogénicos. Los ratones desnudos y los ratones SCID permiten el crecimiento de células humanas normales y pueden reconstituirse con leucocitos de sangre periférica humana (Hu-PBL), por ejemplo, por inyección intraperitoneal (i.p.) de aproximadamente 1-5 x 10^{7} células.

Como alternativa, el tejido neoplásico puede someterse a una purificación para obtener un solo antígeno diana, un grupo de antígenos o un extracto que contiene antígenos. Esta estrategia es especialmente útil cuando existe riesgo de llevar componentes indeseados o peligrosos de células vivas o inactivadas en el procedimiento, o simplemente por consideraciones de conveniencia o de almacenamiento. Por ejemplo, cuando se utilizan células sanguíneas humanas, existe riesgo de que éstas leven virus infecciosos, tales como VIH-1 o el virus de la hepatitis, y sería deseable eliminar este riesgo. Los extractos se preparan a partir de las células que tienen una concentración muy reducida de antígenos normales y/o una mayor concentración de antígenos neoplásicos. Generalmente se prefieren extractos de la superficie celular, de la membrana o de células enteras, y pueden prepararse y almacenarse a 4ºC, a –20ºC, a –80ºC o en nitrógeno líquido, o liofilizarse y almacenarse a aproximadamente la temperatura ambiente. Los métodos para la purificación de proteínas y la preparación de extractos son bien conocidos para los especialistas habituales. Muchos de estos procedimientos se describen en Guide to Protein Purification (Methods in Enzymology, vol. 182, M.P. Deutscher editor, Academic Press, San Digo, CA, 1990). Finalmente, también pude obtenerse un antígeno de muestra sintéticamente usando técnicas de química orgánica cuando sea apropiado o conveniente.

La muestra de tejido neoplásico o antígeno después se introduce, in vitro o in vivo, en una población celular capaz de producir anticuerpos. Las poblaciones de células útiles in vitro incluyen células murinas, células ovinas, células porcinas, células de primate, células humanas, células transformadas, fusionadas o inmortalizadas, y combinaciones de las mismas. Se retiran células productoras de anticuerpos de un animal o cultivo celular y se exponen a un antígeno. Las células estimuladas con el antígeno pueden usarse directamente o pueden fusionarse con una línea celular inmortalizada tal como un mieloma para generar una población de hibridomas productores de anticuerpos. Se prefieren las técnicas de cultivo in vivo e implican la inyección directa de la muestra en un animal que contiene una población respondedora de células productoras de anticuerpos. El animal puede ser un ser humano u otro primate, un ratón, cabra, conejo u otro mamífero. Cuando se usan animales, el procedimiento preferido son inyecciones múltiples de un adyuvante, ya que esto a menudo conduce a una alta concentración de células productoras de anticuerpos con especificidad de antígeno con una afinidad muy fuerte por el antígeno. Después pueden aislarse fácilmente por un procedimiento quirúrgico, de forma no quirúrgica o de otra forma, cuando sea apropiado, las células productoras de anticuerpo, normalmente obtenidas a partir del bazo, pero posiblemente procedentes de sangre periférica o linfa.

Las células productoras de anticuerpos estimuladas con antígeno, obtenidas a partir de fuentes in vitro o in vivo, tal como después de la fusión con una línea de células de mieloma o de hibridoma, se fijan con una solución de fijación tal como Sreck Tissue Fixative (Streck Labs; Omaha, NE), o una solución que contiene un agente químico tal como carbohidrazida, glutaraldehído, o tetróxido de osmio, pero preferiblemente formaldehído o combinaciones de estos agentes químicos. Por ejemplo, se suspenden entre 10^{4} y 10^{8} células sedimentadas en 0,1 a 2,0 ml de solución de formaldehído al 10% más NaCl 0,15 M. Las células se mantienen en hielo durante un período de tiempo, se lavan y se sedimentan. Estas células fijadas después se permeabilizan con una solución de permeabilización que comprende agentes químicos tales como Nonidet P-40 (NP-40), Brij, Tween, por ejemplo tween-20, polisorbato, Triton X-100 (TX-100), CHAPS, sorbitán o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la solución de permeabilización puede comprender aproximadamente 0,5% de NP-40 que se añade al sedimento de células fijadas, y la mezcla se incuba en hielo durante un período de tiempo, se lava, se sedimenta y el sedimento se dispersa en PBS que contiene glicina 0,1 M para mantener la estructura celular global. Como alternativa, la permeabilización puede comprender el tratamiento de las células fijadas con enzimas tales como proteinasa K. La fijación y permeabilización deben proporcionar una porosidad adecuada a las células para permitir la entrada de enzima sin la destrucción indebida del compartimento celular o de los ácidos nucleicos presentes dentro del compartimento. La permeabilización permite que enzimas, nucleótidos y otros reactivos necesarios entren en las células individuales, ahora compartimentos celulares fijados, para realizar la transcripción inversa del ARNm de V_{H} y V_{L} en secuencias de ADNc de V_{H } y V_{L}. El soporte sólido puede ser cualquier soporte que sea adecuado y no perjudicial para el procedimiento, tal como una superficie de vidrio o de plástico, o un polímero de membrana. Las células deben estar en un espacio tan concentrado como sea posible para minimizar el volumen total. El pequeño volumen permite añadir cantidades más pequeñas y soluciones más concentradas de enzimas.

La transcripción inversa puede realizarse en una sola etapa o en un procedimiento combinado opcional de transcripción inversa/PCR. La primera solución enzimática comprende, por ejemplo, una transcriptasa inversa tal como la transcriptasa inversa de AMV o MMTV, una solución salina equilibrada incluyendo Tris-HCl, pH 8-8,5, ditiotreitol (DTT), cloruro potásico (KCl) y cloruro de magnesio (MgCl_{2}), cantidades suficientes de los cuatro dNTP, y cebadores que se unen al ARNm proporcionando un grupo 3'-hidroxilo para que la transcriptasa inversa inicie la polimerización. Opcionalmente, puede añadirse un inhibidor de RNasa tal como RNasin (Promega; Madison, WI) para prevenir la ruptura del ARN. Aunque puede usarse cualquier secuencia de cebador que sea complementaria al ARNm para facilitar la selección de mensajeros de región variable, se prefieren los cebadores complementarios al extremo 3' de las moléculas de ARNm de V_{H} y V_{L}. La síntesis de la primera cadena se realiza, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 42ºC durante aproximadamente 60 minutos. En Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. editors, John Wiley & Sons, NY, 1989) se describen procedimientos de biología molecular para optimizar procedimientos enzimáticos tales como estos y otros descritos en este documento en la práctica de la invención. Después de terminar la reacción, las células se sedimentan, se lavan para retirar los reactivos de reacción y se resuspenden en PBS.

Las secuencias de ADNc resultantes se amplifican por PCR usando cebadores específicos para genes de inmunoglobulina y, preferiblemente, para las regiones terminales de los ácidos nucleicos de V_{H} y V_{L}. En la patente de Estados Unidos número 4.683.195 se describen métodos para la amplificación por PCR. Preferiblemente, los ADNc se amplifican por PCR y se unen en la misma reacción usando, además de los cebadores de ADNc, un cebador para el extremo 5' del gen de la región V_{H} y otro para el extremo 5' del gen V_{L}. Estos cebadores también contienen colas complementarias de secuencia extra, para permitir el automontaje de los genes de V_{H} y V_{L}. Después de la amplificación por PCR y de la unión, la probabilidad de conseguir productos mixtos, en otras palabras, regiones variables mixtas, es mínima, debido a que las reacciones de amplificación y de unión se realizaron dentro de cada célula. El riesgo de mezcla puede reducirse adicionalmente utilizando reactivos voluminosos tales como nucleótidos marcados con digoxigenina para asegurar adicionalmente que los pares de ADNc de la región V no dejan el compartimento celular y se mezclan entre ellos, sino que permanecen dentro de la célula para la amplificación por PCR y la unión. Las secuencias amplificadas se unen por hibridación de secuencias terminales complementarias. Después de la unión, las secuencias pueden recuperarse de las células. Por ejemplo, después de la unión, las células pueden lavarse en una solución de dodecilsulfato sódico (SDS). El SDS precipita de las células después de la incubación en hielo y el sobrenadante puede someterse a electroforesis en un gel de agarosa o de acrilamida. Como alternativa, o en combinación con el proceso de SDS, usando un reactivo tal como nucleótidos unidos a digoxigenina, los productos de ADN sintetizados permanecerán dentro de la célula y se amplificarán. El producto unido se recupera tras la electroforesis del sobrenadante.

Después de la electroforesis del sobrenadante, se retira el corte de gel correspondiente al peso molecular apropiado del producto unido y el ADN se aísla, por ejemplo, en perlas de sílice. El ADN recuperado puede amplificarse por PCR usando cebadores terminales, si es necesario, y clonarse en vectores que pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, vectores virales o combinaciones de los mismos. En las secuencias hibridadas pueden incorporarse sitios de enzimas de restricción convenientes para facilitar la clonación. Estos vectores también pueden guardarse como una biblioteca de regiones variables unidas para un uso posterior.

Como alternativa, después de recuperar las secuencias de las células lavadas, los genes de la región V_{H} y V_{L} unidos se amplifican por PCR una segunda vez usando cebadores anidados terminales, produciendo una población de fragmentos de ADN que codifican las regiones genéticas V_{H} y V_{L} unidas. Estos fragmentos de ADN se recuperan de los sobrenadantes celulares. El agrupamiento de combinaciones de V_{H} y V_{L} es una ventaja de este proceso y permite la transferencia en masa o en lotes de todos los clones y todos los fragmentos de ADN durante este y todos los procedimientos de clonación. Preferiblemente, los ADNc de V_{H} y V_{L} se unen en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza (\leftarrow \rightarrow), en oposición a una orientación de cabeza a cola (\rightarrow \rightarrow o \leftarrow \leftarrow). Esta orientación transcripcional facilita la transferencia de pares de región V entre vectores y la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab sin perder las combinaciones originales de cadena H y L que estaban presentes en la población original de anticuerpos policlonales.

Además, esta orientación de clonación permite el agrupamiento de secuencias de control de la transcripción en una sola región y la expresión controlada de cada gen. La región de control única puede crearse como un cassette obtenido por ingeniería genética con múltiples sitios de enzimas de restricción para transferirse fácilmente entre diferentes vectores. Además, al tener las secuencias unidas en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza, se permite la transferencia en masa en una sola etapa de fragmentos de ADN que incluyen las dos regiones variables en un vector de expresión. Las orientaciones de cabeza a cola generalmente requieren múltiples etapas de clonación.

Algunas veces, puede ser deseable tratar las secuencias génicas de región variable con un agente mutante. Los agentes mutantes crean mutaciones puntuales, huecos, deleciones o adiciones en la secuencia genética, que pueden ser generales o específicas, aleatorias o de localización dirigida. Los agentes mutantes útiles incluyen luz ultravioleta, irradiación gamma, agentes químicos tales como bromuro de etidio, psoraleno y análogos de ácido nucleico, o enzimas modificadoras del ADN tales como enzimas de restricción, transferasas, quinasas y nucleasas y polimerasas específicas y no específicas. En particular, pueden introducirse mutaciones aleatorias en las CDR de los genes de las regiones V_{H} y V_{L} por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. Las mutaciones introducidas en la secuencia génica finalmente aumentarán la complejidad y diversidad de la biblioteca así como la afinidad por antígenos, lo cual puede aumentar adicionalmente la utilidad de la biblioteca en el tratamiento. Además, tal mutagénesis puede usarse en un solo par V_{H}-V_{L} o en un grupo definido de tales pares para generar una biblioteca de novo.

La clonación se realiza, por ejemplo, escindiendo el ADNc y las secuencias del vector con una enzima de restricción, si es necesario aislando ciertos fragmentos de ácido nucleico, mezclando los fragmentos entre sí en presencia de ligasa en una solución salina equilibrada adecuada, e incubando la mezcla en condiciones enzimáticamente aceptables durante un período de tiempo prescrito. Usando diferentes sitios de reconocimiento de enzimas en cada extremo de los ADNc, puede predeterminarse la orientación de la clonación. Los vectores se usan para transformar cultivos de células hospedadoras aceptables y los cultivos se amplifican para expandir las diferentes poblaciones de vectores que constituyen la biblioteca. Las células hospedadoras para vectores procariotas pueden ser un cultivo de bacterias tales como Escherichia coli. Las células hospedadoras para vectores eucariotas pueden ser un cultivo de células eucariotas tales como cualquier línea celular de mamífero, insecto o levadura adaptada al cultivo de tejidos. Las células bacterianas se transforman con vectores por cloruro cálcico-choque térmico o electroporación. Las células eucariotas se transfectan con precipitación con fosfato cálcico o electroporación, aunque también serían aceptables muchos procedimientos de transformación diferentes. Los fragmentos de ADN pueden clonarse en vectores de expresión procariotas o eucariotas, vectores quiméricos o vectores dobles. El vector de expresión puede ser un plásmido, cósmido, fago, vector viral, fagémido y combinaciones de los mismos, pero preferiblemente es un vector de presentación de fagos donde el producto recombinante se expresa en la superficie del fago para facilitar el examen y la selección. En el vector de expresión pueden ponerse sitios de transcripción y traducción útiles que incluyen regiones de reconocimiento de la ARN polimerasa tales como un sitio de caja TATA, un sitio CAT, un potenciador, sitios de empalme apropiados, si es necesario, una región terminal rica en AT y un sitio de inicio de la transcripción. Los sitios útiles para facilitar la traducción incluyen sitios de inicio y de detención de la traducción y sitios de unión a ribosomas. Típicamente, algunos de los sitios más útiles para una expresión eucariota eficaz, tales como la región promotora/potenciadora de SV40, CMV, HSV o baculovirus, proceden de virus. El anticuerpo recombinante resultante puede ser de la clase murina IgG_{1}, IgG_{2A}, IgG_{2B}, IgM, IgA, IgD o IgE, de las clases humanas IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM, IgA_{1}, IgA_{2}, IgD o IgE, o combinaciones o fragmentos de las mismas. Preferiblemente, la biblioteca de anticuerpo quimérico se compone principalmente de anticuerpos IgG o de fragmentos de anticuerpos Fab.

La amplificación de la población de vectores se realiza por medio de la incubación y expansión de los cultivos de células recombinantes. Los cultivos de células bacterianas se desarrollan, por ejemplo, en caldo L a 37ºC, durante una noche. Las células eucariotas se incuban, por ejemplo, a 37ºC en un incubador de CO_{2} de alta humedad durante 1-7 días o más por paso. En este punto, es de esperar que la complejidad de la biblioteca sea bastante alta, con grandes números de vectores para cada población de vectores diferente. La población contiene una secuencia de ácido nucleico representativa para todas o casi todas las regiones variables que se crearon en respuesta al antígeno inicial.

Una característica de la invención es la facilidad con la que los pares de elementos genéticos, que contienen regiones variables intactas y expresables, pueden transferirse dentro y entre vectores tales como vectores procariotas, eucariotas y de mamífero. Pueden transferirse con igual eficacia bibliotecas enteras o sub-bibliotecas. La transferencia se realiza abriendo, preferiblemente con enzimas de restricción con especificidad de sitio, el vector entre las regiones codificantes para el extremo amino de las proteínas de la región variable. En este área pueden insertarse cassettes que contienen secuencias promotoras y líder en una orientación de cabeza a cabeza (líder-promotor-promotor-líder; lPPl), que pueden ser procariotas o de mamífero, para reemplazar la región de control existente o como primera región de control. Los tramos de ADN que constituyen los genes de la región variable y el cassette lPPl después se amplifican por PCR usando cebadores apropiados y se transfieren entre vectores. Cuando se desee, pueden transferirse rápida y fácilmente lotes de regiones V unidas con o sin las regiones promotor-líder, tales como bibliotecas enteras o partes de bibliotecas. Estos segmentos de ADN pueden incorporarse en el ADN de vectores de presentación de fagos para un análisis rápido, de cósmidos para el almacenamiento a largo plazo, o de vectores de expresión de mamífero para la expresión posterior. La expresión puede realizarse para la producción de anticuerpos policlonales o para la selección de bibliotecas de presentación en superficie, que pueden ser procariotas o eucariotas, para aislar una o más sub-bibliotecas. Otra característica de la invención es la capacidad de incorporar secuencias extra en los vectores para facilitar la manipulación, tal como con sitios de enzimas de restricción adicionales, o regiones reguladoras de la transcripción o la traducción adicionales para facilitar o controlar adicionalmente la expresión de proteínas.

Las bibliotecas de vectores de expresión, de mamífero o bacterianas que codifican anticuerpos anti-neoplásicos recombinantes, o fragmentos de anticuerpos, pueden seleccionarse en sub-bibliotecas por adsorción de la partícula recombinante, que puede ser una célula procariota o eucariota o un virus, contra un tejido neoplásico o no neoplásico. La selección reducirá la complejidad global de la biblioteca, pero la complejidad específica de antígeno de la sub-biblioteca no debe verse afectada significativamente. El tejido puede ser otra muestra del mismo tejido en el que se expusieron las células productoras de anticuerpo u otro tejido de un paciente diferente o del mismo paciente. Por ejemplo, puede ser muy útil un tejido no neoplásico del mismo paciente para retirar anticuerpos de unión a antígenos no neoplásicos expresados en la superficie del fago de presentación. Como alternativa, puede ser muy útil un tejido neoplásico del mismo paciente o de un paciente diferente con el mismo trastorno para aislar los anticuerpos anti-neoplásicos específicos. En cualquier situación, el tejido o el antígeno puede fijarse a un soporte sólido y los vectores de expresión en masa someterse, por ejemplo, a técnicas de cromatografía de afinidad, aislando el flujo de líquido que pasa a su través o los lavados cuando se desee. Además, la población de vectores puede seleccionarse, por ejemplo, por transferencia de Western del antígeno expresado, o por transferencia de Southern o de Northern para identificar el ácido nucleico. Los vectores seleccionados resultantes, o sub-bibliotecas, se amplifican por cultivo y expansión de la población del organismo hospedador. Si es necesario, los fragmentos de ADN en los vectores de expresión bacterianos pueden transferirse a vectores de expresión de mamíferos tales como, por ejemplo, cassettes, porque las regiones unidas creadas están flanqueadas con sitios de enzimas de restricción. Una característica de este aspecto de la invención es que más de 99,9% de la biblioteca puede retirarse durante la selección, pero el resto de la población de vectores, la subpoblación, aún puede amplificarse para crear grandes números de vectores o cantidades de proteína. En efecto, no se pierde nada de la complejidad específica de la sub-biblioteca seleccionada y, además, esta sub-biblioteca puede transferirse intacta y en masa entre vectores tan fácilmente como la biblioteca original.

Las poblaciones expandidas y amplificadas de vectores de expresión seleccionados pueden almacenarse para un uso posterior, administrarse a un paciente directamente, si lo permiten las condiciones de seguridad, o los productos pueden transcribirse y traducirse y los anticuerpos antineoplásicos expresados pueden administrarse al paciente. La administración puede realizarse por vía parenteral, sublingual, rectal o entérica. Normalmente se prefiere la administración parenteral, que incluye inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intramuscular (i.m.), inyección intra-arterial, inyección intratecal, inyección intraperitoneal (i.p.) o inyección directa en un sitio del neoplasma. Pueden administrarse anticuerpos o vectores, pero se prefiere la administración de anticuerpos porque una expresión eficaz del vector puede ser una complicación adicional, o puede haber problemas de seguridad asociados con la introducción de un ADN de vector recombinante en el animal.

Los trastornos neoplásicos que se pueden tratar por estos métodos son muchos e incluyen leucemias, linfomas, sarcomas, carcinomas, tumores de células neurales, carcinomas de células escamosas, tumores de células germinales, metástasis, tumores indiferenciados, seminomas, melanomas, neuroblastomas, tumores de células mixtas, neoplasias causadas por agentes infecciosos y otras malignidades. La naturaleza ubicua del método se debe, en parte, a su capacidad de utilizar muestras de casi cualquier antígeno. Preferiblemente, el paciente tratado es un ser humano, pero también se puede tratar cualquier mamífero con un sistema inmune humoral funcional. Los pacientes pueden tratarse terapéutica o profilácticamente, cuando sea necesario, de acuerdo con protocolos prescritos. Por ejemplo, ciertos cánceres pasan a través de ciclos sucesivos de progresión y regresión durante meses o años. Las bibliotecas pueden prepararse y administrarse poco antes de la fase progresiva para inhibir el crecimiento del cáncer, la invasión de otros tejidos o el proceso de metástasis. Las bibliotecas también pueden administrarse como una inyección en embolada para eliminar el cáncer en una sola dosis o con varias dosis.

La biblioteca también puede administrarse junto con un agente antineoplásico que estimule el propio sistema inmune del paciente, tal como un factor de crecimiento de células T, factor de crecimiento de células B, factor de crecimiento de granulocitos/macrófagos, factor de crecimiento de granulocitos, factor de crecimiento de macrófagos, factor de crecimiento de células madre, factor de crecimiento de trasformación, eritropoyetina, factor de steel, proteína morfogénica de hueso, agente de diferenciación, interleuquina, interferón, hormona, componente del sistema de complemento, o una combinación de los mismos. El protocolo de tratamiento del paciente también puede implicar otras formas de terapia tales como quimioterapia, radioterapia, dieta o terapia con inmunotoxinas. Los agentes quimioterapéuticos útiles incluyen agentes alquilantes, análogos de purinas y pirimidinas, vinca alcaloides y alcaloides parecidos a éstos, etopósidos y fármacos parecidos a etopósido, antibióticos, corticosteroides, nitrosoureas, antimetabolitos, fármacos citotóxicos basados en platino, antagonistas hormonales, anti-andrógenos y anti-estrógenos. Estos tratamientos pueden incorporarse en un protocolo global para el tratamiento de la neoplasia del paciente.

La terapia inmunotóxica puede facilitarse por los métodos descritos en este documento. Por ejemplo, pueden clonarse fragmentos de ADN recombinante que codifican los fragmentos de anticuerpo tanto V_{H} como V_{L} en vectores de expresión que codifican la región constante del anticuerpo y una sustancia tóxica. Por lo tanto, los productos de fusión expresados tendrán un alto número de anticuerpos diferentes contra la neoplasia diana, uniéndose cada uno de ellos a una sustancia tóxica tal como una toxina animal, vegetal, bacteriana, fúngica, viral o parasitaria. La administración de la biblioteca de anticuerpos al paciente, además de reclutar las defensas inmunes del hospedador, pondrá a la toxina en contacto directo con la célula enferma, lo cual puede facilitar la destrucción de la neoplasia. Las sustancias tóxicas especialmente útiles incluyen toxinas derivadas de ciertas plantas y bacterias tales como las toxinas de Pseudomonas, toxinas de Diphtheria, toxinas de Escherichia y ricina.

Otra realización de la invención se refiere a un método para obtener imágenes de un trastorno neoplásico en un paciente. Se crea una biblioteca de anticuerpos anti-neoplásicos con especificidad de paciente como se ha descrito anteriormente, y se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como agua, una sal o solución tamponada, glicerol, aceite, un sacárido o polisacárido, celulosa o almidón, alcohol o combinaciones de los mismos. Los anticuerpos de la biblioteca se marcan con un marcador detectable y se administran al paciente. Los anticuerpos migran a lo largo del cuerpo y se unen a la diana, que puede ser la neoplasia o metástasis neoplásica, y se forma una imagen del marcador en el paciente. Los marcadores detectables que pueden ser útiles para este procedimiento incluyen radioisótopos, isótopos estables, enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos luminiscentes, compuestos cromáticos, metales o cargas eléctricas. La neoplasia ahora marcada puede detectarse por medios adecuados para el marcador, tales como con un contador de radiaciones iónicas Geiger, un formador de imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN), detectores visuales o a simple vista, o por autorradiografía.

Otra realización de la invención se refiere a una composición que comprende una biblioteca con especificidad de paciente de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-neoplásicos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición se administra a pacientes con la neoplasia característica contra la que se dirigieron los anticuerpos creados. El vehículo farmacéuticamente aceptable es un compuesto o medio que facilita la administración, aumenta la vida en almacenamiento de la composición o aumenta la utilidad de la composición en el paciente, tal como aumentando la vida media circulante o en suero. Los vehículos útiles incluyen agua, solución salina, alcohol, glicoles incluyendo polietilenglicol, aceite, polisacáridos, sales, glicerol, estabilizadores, emulsionantes y combinaciones de los mismos. La composición puede comprender anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, preferiblemente fragmentos Fab, seleccionados entre el grupo compuesto por las clases murinas IgG_{1}, IgG_{2A}, IgG_{2B}, IgM, IgA, IgD e IgE, las clases humanas IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM, IgA, IgA_{2}, IgD e IgE, y combinaciones o fragmentos de las mismas. La composición también puede conservarse durante largos períodos de tiempo por diálisis o liofilización de las proteínas para retirar todo el líquido. Los anticuerpos liofilizados pueden ser estables a temperatura ambiente durante años.

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Otra realización de la invención se refiere a métodos para crear y utilizar una biblioteca de anticuerpos policlonales o fragmentos de anticuerpos con especificidad de antígeno o de tejido como se ha descrito anteriormente. Se obtiene una muestra de tejido biológico o antígeno, aislado de forma natural, recombinante o sintética, posiblemente a partir del paciente a tratar o de un paciente con un trastorno relacionado. El tejido biológico o antígeno usado para estimular las células productoras de anticuerpo puede obtenerse a partir de tejidos tumorales, de sangre y de tejidos relacionados con la sangre, tejidos de biopsia, tejidos infectados, bacterias, virus, hongos, parásitos, tejidos malignos, tejidos genéticamente anormales o combinaciones de los mismos, o de una fuente ambiental tal como una masa de agua, suelo, residuos naturales o hechos por el hombre o biomasa. La muestra se introduce en una población celular capaz de producir anticuerpos. El ARNm de V_{H} y V_{L} de la población celular se transcribe de forma inversa en secuencias de ADNc de V_{H} y V_{L} que se amplifican por PCR, uniéndose las secuencias amplificadas resultantes. Las secuencias unidas se amplifican por PCR para crear una población de fragmentos de ADN que codifican fragmentos de anticuerpo de V_{H} y V_{L} que se clonan en vectores de expresión, y la población de vectores de expresión clonados se expande. Los vectores de expresión que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con especificidad de antígeno o de tejido pueden seleccionarse y la subpoblación seleccionada puede expandirse para producir la biblioteca. La biblioteca de fragmentos policlonales puede clonarse en fase en otros vectores de expresión que codifican secuencias génicas de región constante de anticuerpo para expresar anticuerpos policlonales o fragmentos de anticuerpos. Después, estos anticuerpos pueden inyectarse por vía intravenosa o subcutánea en el caso de infecciones sistémicas, pueden aplicarse directamente a una herida para un tratamiento localizado, o pueden administrarse de otra manera al paciente cuando sea necesario.

Las bibliotecas con especificidad de enfermedad o con especificidad de antígeno pueden usarse en métodos para tratar o prevenir trastornos tales como infecciones virales, fúngicas, parasitarias o bacterianas, anormalidades genéticas e intoxicaciones. Por ejemplo, pueden crearse bibliotecas de anticuerpos contra la proteína gp120 del virus VIH-1, que produce el síndrome de deficiencia autoinmune (SIDA), y pueden administrarse a pacientes con SIDA para reducir la muerte celular inducida por el virus, la carga viral o la infectividad, o como profilaxis para prevenir una posible infección después de una exposición o cuando existe riesgo de exposición. Pueden usarse bibliotecas para reemplazar o suplementar otras formas de inmunoterapia pasiva tales como tratamientos con gamma globulina en el caso de enfermedades tales como la rabia, la hepatitis, el virus varicela-zoster, el herpes o la rubéola. Por ejemplo, puede administrarse periódicamente una biblioteca anti-rubéola cuando sea necesario a mujeres embarazadas con riesgo de contraer la rubéola por contagio de otro miembro de la familia. Esta estrategia carece de efectos secundarios perjudiciales y es eficaz. Podrían administrarse anticuerpos anti-herpes a individuos no infectados con parejas infectadas. La meningitis puede ser una enfermedad amenazadora para la vida, especialmente en niños, porque no siempre puede determinarse un tratamiento eficaz y administrarse rápidamente. Por el contrario, las bibliotecas de anticuerpos policlonales anti-meningitis pueden almacenarse y usarse cuando se sospechen casos porque el riesgo de las complicaciones del tratamiento es muy bajo. Los anticuerpos policlonales creados por estos métodos pueden suplementar vacunas de influenza convencionales proporcionando protección contra la influenza durante un corto período de tiempo hasta que el propio sistema inmune del hospedador pueda crear una respuesta de anticuerpos suficiente contra el antígeno.

Las bibliotecas policlonales también pueden ser útiles como profilaxis o tratamiento en pacientes con quemaduras que son susceptibles de una amplia diversidad de infecciones adquiridas en el hospital debidas a, por ejemplo, Staphylococcus, Streptococcus, Hemophilus, Neisseria, Pseudomonas y los actinomicetes. Las bibliotecas pueden usarse para tratar o prevenir, o mejorar los síntomas asociados con sepsis bacterianas, por medio de la creación y administración de bibliotecas dirigidas contra lipopolisacáridos (LPS), lípido A, factor de necrosis tumoral o proteínas de unión a LPS. También pueden tratarse con bibliotecas de anticuerpos policlonales otras intoxicaciones tales como trastornos gastrointestinales inducidos por microorganismos bacterianos o virales, toxicosis producidas por levaduras u otras infecciones micóticas, o una intoxicación inducida ambientalmente por metales perjudiciales tales como plomo o aluminio, pesticidas, residuos industriales, carcinógenos y otros compuestos orgánicos o inorgánicos perjudiciales.

Otra realización de la invención se refiere a un kit de diagnóstico para la detección de una enfermedad o trastorno en un paciente, o de un contaminante en el medio, que comprende una biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con especificidad de antígeno, tejido o paciente. El kit de diagnóstico puede usarse para detectar enfermedades tales como infecciones bacterianas, virales, parasitarias o micóticas, neoplasias, o defectos o deficiencias genéticas. La muestra biológica puede ser sangre, orina, bilis, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, fluido amniótico o fluido peritoneal, preferiblemente obtenido a partir de un ser humano. Las bibliotecas preparadas a partir de muestras obtenidas del medio pueden usarse para detectar contaminantes en muestras recogidas en ríos y corrientes, masas de agua salada o de agua dulce, de suelo o de rocas, o muestras de biomasa. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero, tal como una IgG, o un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fab. La biblioteca puede marcarse con un marcador detectable o el kit puede comprender además un anticuerpo secundario marcado que reconoce y se une a complejos de antígeno-anticuerpo. Preferiblemente, el marcador detectable es detectable visualmente, tal como una enzima, un agente químico fluorescente, un agente químico luminiscente o un agente químico cromático, lo cual facilitaría la determinación de los resultados de ensayo al usuario o al médico. El diagnóstico puede comprender además agentes para aumentar la estabilidad y la vida media, para inhibir o prevenir la contaminación del producto y para aumentar la velocidad de detección. Los agentes estabilizadores útiles incluyen agua, solución salina, alcohol, glicoles incluyendo polietilenglicol, aceite, polisacáridos, sales, glicerol, estabilizadores, emulsionantes y combinaciones de los mismos. Los agentes antibacterianos útiles incluyen antibióticos, agentes químicos bacteriostáticos y agentes químicos tóxicos para las bacterias. Los agentes para optimizar la velocidad de detección pueden aumentar la velocidad de reacción, tales como sales y tampones.

Otra realización de la invención se refiere a un método para crear una biblioteca de proteínas receptoras o de cualquier proteína que muestre variabilidad. Las proteínas receptoras que pueden utilizarse en este método pueden ser cualquier proteína eucariota o procariota que tenga regiones variables, incluyendo receptores de células T tales como los TcR, receptores de células B incluyendo inmunoglobulinas, receptores de células destructoras naturales (NK), receptores de macrófagos, y partes y combinaciones de los mismos. En resumen, una muestra de tejido biológico, tal como un tejido normal, un tejido neoplásico, un tejido infectado, tejidos que contienen proteínas de la matriz extracelular (ECM), o cualquier tejido anormal, se introduce en una población celular capaz de producir las proteínas receptoras. La población celular se fija y las células se permeabilizan. Los ARNm de región variable de las proteínas receptoras se transcriben de forma inversa en secuencias de ADNc usando una transcriptasa inversa. Las secuencias de ADNc se amplifican por PCR y se unen, preferiblemente por hibridación de secuencias complementarias, a las regiones terminales de estos ADNc. Las secuencias unidas se amplifican por PCR para crear una población de fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de las proteínas receptoras. Estos fragmentos de ADN contienen las regiones variables unidas, preferiblemente, en una orientación de transcripción de cabeza a cabeza, y se clonan en masa en vectores de expresión. Los vectores de expresión útiles incluyen fagos tales como fagos de presentación, cósmidos, vectores virales, fagémidos o combinaciones de los mismos, y estos vectores se utilizan para transformar organismos hospedadores, expandiéndose posteriormente las diferentes poblaciones de organismos. Se seleccionan los vectores de expresión que codifican las proteínas receptoras recombinantes y la subpoblación se expande. Si es necesario, la subpoblación puede subclonarse en vectores de expresión que contienen genes de región constante de receptores en fase y la biblioteca puede expandirse de nuevo y expresarse para producir la sub-biblioteca de proteínas receptoras seleccionadas. Pueden crearse fácilmente bibliotecas quiméricas por clonación de los genes de región variable seleccionados en vectores de expresión que contienen genes de región constante de otras proteínas, tales como genes de región constante de anticuerpos o genes de receptores de células T. Las sub-bibliotecas seleccionadas pueden usarse directamente o transferirse a otros vectores de expresión antes de utilizarse para transfectar a las células hospedadoras. Las células hospedadoras pueden ser células T procedentes del paciente que, cuando se introducen de nuevo en el paciente, expresan la biblioteca de receptores en su superficie. Este tipo de terapia de células T puede usarse para estimular una respuesta inmune para tratar las mismas enfermedades que se han descrito para la terapia con anticuerpos.

Usando los métodos descritos anteriormente para la creación de bibliotecas de anticuerpos policlonales y de bibliotecas de receptores de células T, pueden crearse bibliotecas de proteínas de fusión quiméricas que contengan las regiones variable de anticuerpos unidas a las regiones constantes de receptores de células T. Tales bibliotecas pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades y trastornos como los descritos anteriormente, por medio de la estimulación o potenciación de la respuesta inmune de un paciente. Por ejemplo, la unión de un antígeno al receptor de células T es una parte integral de la respuesta inmune. Al proporcionar una biblioteca de anticuerpo quimérico/proteína TcR y por medio de la transfección de una población de células T del paciente con esta biblioteca, se puede potenciar la propia respuesta inmune del paciente para eliminar una enfermedad o trastorno que no podría superarse satisfactoriamente de otra forma.

Otra realización de la invención se refiere a vectores de ácido nucleico que pueden usarse para crear las bibliotecas y sub-bibliotecas de anticuerpos policlonales con especificidad de antígeno. Estos vectores comprenden sitios de reconocimiento de enzimas de restricción convenientes para la clonación y secuencias para amplificar por PCR de forma eficaz fragmentos de ácido nucleico recombinantes. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, fagos, fagémidos, fagos de presentación, cósmidos, vectores virales y combinaciones de los mismos. Se diseñan vectores que tengan uno o más pares de fragmentos genéticos, tales como fragmentos de ADNc, insertados en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza. Preferiblemente, los vectores son vectores de expresión y pueden ser procariotas, eucariotas o combinaciones o partes de los mismos. Estos vectores también contienen preferiblemente secuencias controladoras de la transcripción y la traducción tales como cajas TATA, cajas CAT, sitios de unión a ribosomas, sitios de iniciación y terminación de la ARN polimerasa, secuencias líder, promotores fuertes de la transcripción, que pueden regularse, o partes o combinaciones de los mismos.

A modo de ejemplo, un vector útil puede construirse como se representa gráficamente en la Figura 2. En primer lugar, la cadena principal del vector puede obtenerse a partir de un vector de fagémido disponible en el mercado tal como pUC119 (United States Biochemical; Cleveland, OH) como se muestra en la Figura 2B. Se usan dos cebadores para amplificar una cadena principal de pUC119 comenzando en el extremo de un lacZ' y terminando al principio de lacI. El cebador de avance es complementario al extremo del lacZ' y tiene una cola que no hibrida que contiene un sitio BglII. El cebador inverso es complementario al principio de lacI y tiene una cola que no hibrida que contiene un sitio BstEII. Después de la amplificación por PCR, esta cadena principal se digiere con BglII y BstEII y se une a un inserto BstEII (Figura 2B). El inserto BstEII se obtiene como se indica a continuación (Figura 2A): En primer lugar, el polienlazador de pUC19 (New England Biolabs; Beverly, MA) se reemplaza por un polienlazador que contiene BglII-EcoRI-HindIII-BstEII, donde cada sitio de restricción está separado por seis nucleótidos. El reemplazo se consigue digiriendo pUC19 con EcoRI y HindIII, retirando los salientes con nucleasa S1 y uniendo la cadena principal a un enlazador sintético de doble cadena que contiene los sitios BglII-EcoRI-HindIII-BstEII para generar pUC19 modificado (pUC19mod). (Obsérvese que pUC19 sólo se usa para proporcionar un polienlazador que contiene sitios de enzimas de restricción. En su lugar podría usarse cualquier otro vector, existente o creado fácilmente que contenga un polienlazador con los sitios de restricción apropiados.) Un gen C_{\kappa} se transcribe de forma inversa a partir de ARN procedente de leucocitos humanos, y se amplifica por PCR usando un cebador inverso que comprende una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio de restricción BstEII, un sitio de terminación de la traducción (sitio stop) y un sitio XbaI, y un cebador de avance que comprende una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio de restricción HindIII. Este producto de PCR se digiere con BstEII y HindIII y se une a una cadena principal de pUC19mod BstEII-HindIII para generar pUC19-C_{\kappa}. Se sintetiza un fragmento de ADN EcoRI-BglII que contiene el gen CH1 de \gamma1 humano encadenado al segmento génico gIII que codifica un fragmento de la proteína de recubrimiento del fago cpIII (aminoácidos 198-407). En resumen, se amplifica un fragmento génico de la proteína de recubrimiento de cpIII a partir de un vector M13 tal como M13mp18 (New England BioLabs; Beverly MA) usando un cebador inverso complementario a la secuencia terminal del fragmento de cpIII, pero con una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio BglII, un sitio de terminación de la traducción (sitio stop) y un sitio NheI. El cebador de avance para la amplificación del fragmento de cpIII es complementario a cpIII y tiene una cola 5' que no hibrida que contiene secuencias complementarias al extremo del gen CH1 y un sitio SpeI. El gen CH1 humano se transcribe de forma inversa a partir de ARN procedente de leucocitos humanos y se amplifica por PCR usando un cebador inverso complementario al extremo del gen CH1 de \gamma1 con una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio SpeI. El cebador de avance es complementario al principio del gen CH1 con una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio EcoRI. Como los cebadores de avance e inverso contienen extremos complementarios, los productos de PCR de cpIII y CH1 se encadenan por PCR de extensión solapante usando el cebador inverso de cpIII y el cebador de avance de CH1. El producto de PCR resultante se corta con EcoRI y BglII y se une a una cadena principal EcoRI-BglII derivada de pUC19-C_{\kappa}, para generar pUC19-C-{K}-CH1. El inserto BglII-BstEII se retira y se une a la cadena principal BglII-BstEII derivada de pUC119 para generar el vector de tipo phh3hu, pUC119-C_{\kappa}-CH1 (Figura 2B).

También puede generarse fácilmente un cassette de tipo lPPl (Figura 2C). Un fragmento BamHI-XhoI se monta a partir del promotor tac (Ptac) y secuencias líder pelB. La secuencia líder pelB se obtiene por amplificación por PCR a partir del vector pET-22b (Norvagen, Inc.; Madison, WI) usando un cebador de avance, y un cebador inverso con una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio XhoI y codones para LKVQA. La secuencia Ptac se obtiene por amplificación por PCR a partir del vector pDR540 (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) usando un cebador de avance con una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio BamHI y un cebador inverso con una cola 5' que no hibrida que es complementaria a la secuencia del principio del líder pelB en pET-22b. El líder pelB y los productos de PCR de Ptac pueden hibridar a través de sus extremos complementarios y se encadenan por PCR de extensión solapante usando los cebadores que contienen BamHI y XhoI. El producto de PCR resultante se digiere con XhoI y BamHI y se une a una cadena principal XhoI-BamHI derivada de pUC19Xho para generar pPl. (La cadena principal de pUC19Xho se forma digiriendo pUC19 con HindIII, rellenando los salientes con Klenow y uniendo la cadena principal con un enlazador XhoI.) Se monta un fragmento BamHI-SacI a partir del promotor lacZ (PlacZ) y la secuencia líder de gIII de la proteína de recubrimiento cpIII de M13. La secuencia líder de gIII se obtiene por amplificación por PCR a partir de M13mp18 usando un cebador de avance y un cebador inverso que tiene una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio SacI y los codones para EA. La secuencia PlacZ se obtiene por amplificación por PCR a partir de pUC119 usando un cebador de avance con una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio BamHI y un cebador inverso con una cola 5' que no hibrida que es complementaria a la secuencia del principio del líder de gIII. El líder de gIII y los productos de PCR de PlacZ pueden hibridar a través de sus extremos complementarios y se encadenan por PCR de extensión solapante usando los cebadores terminales que contienen BamHI y SacI. El producto de PCR resultante se digiere con SacI y BamHI y se une a una cadena principal SacI-BamHI derivada de pPl para generar el vector de tipo plPPl plPPl2. Como se muestra en la Figura 2D, pueden insertarse genes de región V_{H}-V_{L} unidos cabeza a cabeza en el vector pUC119-C_{\kappa}-CH1. Los vectores resultantes pueden abrirse con XhoI y SacI para insertar un cassette lPPl del vector plPPl2 para generar pJS.

Otra realización de la invención se refiere a un método para transferir una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico entre diferentes vectores sin una pérdida significativa de diversidad de la biblioteca. La biblioteca puede ser una biblioteca de fragmentos de ADNc, fragmentos de ADN genómico, ácidos nucleicos recombinantes, ARN o una combinación de los mismos. Los fragmentos se insertan en primeros vectores en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza. La inserción puede realizarse por unión de los ácidos nucleicos a vectores abiertos por escisión con enzimas de restricción. Los fragmentos pueden modificarse antes de la inserción, tal como por la adición de enlazadores y enzimas de restricción u otros sitios, o por la unión a secuencias codificantes adicionales. El primero y el segundo vectores pueden ser vectores procariotas o eucariotas y preferiblemente son vectores de expresión. Las secuencias insertadas se obtienen a partir de los primeros vectores y se reinsertan en segundos vectores sin una pérdida significativa de la diversidad de biblioteca. Los fragmentos pueden obtenerse por escisión de los primeros vectores recombinantes, en masa, con enzimas de restricción apropiadas. Como alternativa, las secuencias de los fragmentos pueden obtenerse por amplificación por PCR de las secuencias insertadas. La reinserción se realiza por unión de las secuencias a los segundos vectores, pero las secuencias pueden modificarse si se desea antes de la unión como se ha descrito. La diversidad global de la biblioteca comprende más de al menos diez fragmentos diferentes, preferiblemente 100 fragmentos diferentes, más preferiblemente 1000 fragmentos diferentes, incluso más preferiblemente al menos 10.000 fragmentos diferentes y posiblemente muchos más, tal como 10^{5} 10^{6}, 10^{7}, 10^{8} y 10^{9} fragmentos diferentes. Después de la transferencia, es de esperar que la diversidad de la biblioteca, como la que puede medirse analizando los recombinantes resultantes, se reduzca en menos de 90%, preferiblemente en menos de 50%, más preferiblemente en menos de 10% e incluso más preferiblemente en menos de 1%, y aún más preferiblemente en menos de 0,1%, aunque esto puede depender en mayor medida del tipo particular de biblioteca que se vaya a crear.

Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de la invención, pero no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación in vivo e in vitro de muestras de tumor

Se obtuvieron desechos patológicos de tumores humanos y tejidos normales del Departamento de Patología Quirúrgica del Centro Médico de la Universidad de Boston. De los tumores procesados, tres fueron carcinomas de ovarios, dos fueron adenocarcinomas de útero, uno fue un mesotelioma del peritoneo, y uno procedía del suelo oral de un tumor de boca. Se congelaron rápidamente dos piezas del tejido tumoral y dos piezas de cualquier tejido normal disponible en OCT (poli(alcohol vinílico), cloruro de benzalconio, polietilenglicol, todos en H_{2}O destilada; Miles Laboratories; Kankakee, IL) para la preparación posterior de secciones congeladas (criostato). Si se disponía de suficiente tejido normal, algunas muestras se congelaron rápidamente sin OCT para la preparación posterior de membranas para la absorción posterior de anticuerpo.

Los tejidos tumorales se trituraron en piezas de aproximadamente 1 mm^{3} y se digirieron durante 45 minutos a 37ºC con una mezcla de enzimas que constaba de 1 mg/ml de colagenasa de tipo IA, 1 mg/ml de colagenasa de tipo IV, 200 pg/ml de DNasa, y 100 unidades/ml de hialuronidasa en Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM). La mezcla se filtró a través de nitex para eliminar las piezas no digeridas y para recoger suspensiones celulares que se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en ratones desnudos BALB/c para desarrollar tumores, para prepararse en cultivos de explantes en medio suplementado con D-Val, y para congelarse como alícuotas en 90% de suero humano/10% de dimetilsulfóxido (DMSO).

Las células suspendidas se lavaron con IMDM y se introdujeron en gradientes por etapas de Percoll/solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se aislaron células tumorales de la interfase entre 1,07 g/ml de Percoll y la PBS. Las células tumorales aisladas se inyectaron en ratones BALB/c i.p. para obtener anticuerpos anti-tumor, se inyectaron s.c. en ratones desnudos BALB/c para desarrollar tumores, se prepararon en cultivo en medio D-Val suplementado con 30% de una mezcla dializada de partes iguales de suero humano, suero bovino fetal (FBS) y sobrenadante de células de cultivo de fibroblastos de rata, para establecer las líneas celulares, y se congelaron en alícuotas con 90% de suero humano/10% de DMSO para un uso posterior.

Uno de los tumores de ovarios procesados se diagnosticó como un adenocarcinoma moderadamente diferenciado. En el día de la cirugía, se obtuvieron las siguientes muestras a partir de la paciente; una muestra de tumor del ovario, una metástasis de ganglio linfático, y miometrio normal, endometrio e intestino delgado. Las muestras de tejido tumoral y normal se procesaron como se ha descrito anteriormente. La fracción enriquecida en células tumorales, aislada en el gradiente de Percoll, constaba principalmente de pequeños cúmulos de células grandes y no pudo realizarse un recuento directo de las células. Los números de células se estimaron después de la centrifugación, basándose en la experiencia con células de tamaño similar. Se estimó una recuperación de 2 x 10^{8} células del tumor de ovario. Se analizó una preparación posterior en citospin de las células y se determinó que contenía principalmente células tumorales. A cada uno de cuatro ratones BALB/c se les inyectaron i.p. 0,25 ml de esta suspensión celular en IMDM (con una estimación de 10^{7} células por ratón) para producir anticuerpos antitumorales.

A un ratón desnudo se le inyectaron s.c. 0,2 ml de tumor triturado en IMDM procedente del ovario. A otro ratón desnudo se le inyectaron s.c. 0,2 ml de tumor triturado procedente del ganglio linfático. Los dos ratones desnudos desarrollaron tumores subcutáneos. Los tumores fueron evidentes 15-18 días después de la inyección. El ratón al que se le inyectó el tumor procedente de ovario fue sacrificado un mes después de la inyección, momento en el que el tumor tenía unas dimensiones de aproximadamente 1,5 cm x 1 cm x 0,5 cm. Un análisis de una preparación en citospin de células aisladas de este tumor por centrifugación con gradiente de Percoll demostró que era de origen humano y del mismo tipo que el tumor ovárico original. Este tumor pudo propagarse adicionalmente tanto en ratones desnudos como en ratones SCID por inyección s.c. de piezas de tumor recién trituradas o de piezas de tumor que se habían congelado en 90% de suero humano/10% de DMSO y descongelado para la inyección.

El tumor que se desarrolló en el ratón desnudo al que se le habían inyectado piezas de tumor derivadas de la metástasis de ganglio linfático se procesó adicionalmente. Después de congelar rápidamente una muestra en nitrógeno líquido, el tumor se trituró en piezas de 1 cm. La mitad de las piezas trituradas se congelaron en alícuotas de aproximadamente 0,4 ml (piezas de tumor empaquetadas) en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se almacenaron en nitrógeno líquido. La otra mitad se usó para preparar una suspensión de células tumorales por centrifugación en gradiente de densidad de Percoll como se ha descrito anteriormente. Las células recuperadas se congelaron en dos alícuotas de aproximadamente 4 x 10^{7} células, cada una en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se usaron suspensiones de células aisladas en Percoll del tumor OC2 para generar tumores i.p. y s.c. en un ratón desnudo. Los tumores OC2 tanto en los ratones BALB/c como en los ratones SCID se propagaron por inyección i.p. de piezas de tumor (0,25 ml). Los tejidos de tumor OC2 pudieron propagarse en ratones inmunodeficientes y se desarrollaron tanto tumores subcutáneos como intraperitoneales en un ratón desnudo y un ratón SCID.

Debido a la propagación satisfactoria del tumor OC2 tanto en ratones desnudos como en ratones SCID, se obtuvo una muestra de 10 cc de sangre heparinizada a partir de la paciente OC2. Se aisló la fracción de leucocitos (1,4 x 10^{7} células), se congeló en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se almacenó en nitrógeno líquido. También se obtuvieron muestras de sangre adicionales a partir de la paciente. La muestra de miometrio normal obtenida a partir de la paciente en el día de la cirugía y congelada en nitrógeno líquido se procesó para obtener preparaciones de membranas. El tejido congelado se trituró con un mortero y su mano en nitrógeno líquido, se homogeneizó en un tampón que contenía los inhibidores de proteasa leupeptina, aprotinina, pepstatina y PMSF, y se centrifugó durante 10 minutos a 1.200 x g para retirar el desecho celular. Se obtuvieron sedimentos que contenían membrana por centrifugación a 150.000 x g durante 90 minutos, y se almacenaron a -80ºC en alícuotas que contenían 10% de glicerol.

El carcinoma OC2 se propagó tanto en ratones desnudos BALB/c como en ratones SCID, por inyección s.c. o i.p. de piezas de tumor trituradas recientes o congeladas previamente. Además de un suministro constante de tumor humano reciente propagado en el ratón denudo o SCID, se prepararon alícuotas congeladas de tumor triturado y de células tumorales aisladas en gradiente de Percoll procedentes del primer paso de la metástasis de ganglio linfático OC2 a través de un ratón desnudo. Las células y las piezas de tejido obtenidas directamente de la paciente se congelaron en 90% de suero humano/10% de DMSO y se almacenaron en nitrógeno líquido. Esto incluyó catorce alícuotas con una estimación de 10^{7} células cada una de células tumorales OC2 separadas por Percoll derivadas del ovario de la paciente, tres alícuotas de aproximadamente 0,75 ml cada una de metástasis de ganglio linfático de OC2 triturado de la paciente, cinco alícuotas de 2,8 x 10^{6} PBL de la paciente cada una y muestras del tumor de ovario. La metástasis de ganglio linfático, el miometrio, el endometrio y el intestino delgado se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido con o sin OCT, y se almacenaron a -80ºC.

Ejemplo 2 Generación y ensayo de antisueros de ratones inmunes OC2

Cuatro ratones BALB/c se inmunizaron una vez i.p. con aproximadamente 10^{7} células OC2 procedentes de ovario. Los ratones se sometieron a un refuerzo i.p. en el día 30 con aproximadamente 5 x 10^{6} células tumorales OC2 de la preparación original que se había congelado en 90% de suero humano/10% de DMSO, se había almacenado en nitrógeno líquido y se había descongelado y lavado antes del uso. Se obtuvieron antisueros en los días 12 y 30 después de la inmunización primaria y en el día 11 después de la inmunización secundaria. Pueden administrarse refuerzos adicionales a los ratones, tanto i.p. como i.v., hasta que ya no se obtenga ningún aumento adicional en la respuesta. La reactividad del antisuero con las células tumorales OC2, en comparación con la reactividad del suero preinmune, se determina por ELISA en fase sólida usando placas recubiertas con preparaciones de membrana de tumor OC2 e inmunoglobulina de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina y nitro azul tetrazolio (NBT) más indolil-fosfato (BCIP) como sustrato (Promega; Madison, WI), como reactivos de revelado.

La reactividad de los antisueros con secciones de criostato de cuatro micrómetros del tumor OC2 puede determinarse por inmunohistoquímica. Se tratan muestras fijadas con acetona con H_{2}O_{2} al 0,3% en metanol para destruir la actividad peroxidasa endógena y después se rehidratan en PBS/1% de FBS. Después se incuban con el antisuero durante un periodo de aproximadamente 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, se aclaran y se incuban con Ig de conejo anti-ratón biotinilada. Se desarrollan tinciones con avidina-peroxidasa de rábano picante y diaminobencidina. Se cuentan las secciones teñidas con verde de metilo.

Ejemplo 3 Generación de vectores de expresión bacterianos y de mamífero

Se prepararon vectores de expresión, tanto de mamífero como bacterianos, en los que podían transferirse combinaciones unidas de genes de regiones V_{H} y V_{L}, en masa, desde las células B en las que se expresan en el caso de los vectores bacterianos, y sin perder las combinaciones, en el caso de los vectores de expresión de mamífero. Las cadenas H y L, en los dos tipos de vectores, se disponen en orientaciones transcripcionales opuestas con promotores de cabeza a cabeza. De esta manera, la combinación del gen de la región V podía transferirse como una unidad entre vectores. Además, como todos los vectores son circulares, los vectores pueden abrirse por enzimas de restricción entre los genes de la región V_{H} y V_{L} para insertar fragmentos de ADN de intervención tales como promotores, sin perder la combinación V_{H}-V_{L}, que permanece en la misma pieza de ADN.

Pueden expresarse proteínas quiméricas en la superficie de fagos filamentosos (M13) si se fusionan a una proteína de la cubierta del fago tal como cpIII o cpVIII. En estos estudios se usó el vector de expresión de fagémidos circular pComb3, que contiene un sitio insertable en fase con cpIII, aunque también pueden usarse otros vectores similares disponibles comúnmente. Se creó un ADN de vector de fagémido pComb3 que codificaba una porción Fd (dominios V_{H} y C_{H1}) de un anticuerpo. La región genética que codificaba la porción de anticuerpo se fusionó al gen gIII, que codificaba el extremo carboxilo terminal de cpIII (Figura 3). El vector es circular y la digestión con SpeI y NheI, que produce extremos cohesivos compatibles, ocasiona la eliminación del fragmento de la proteína de la cubierta gIII, y después de volverse a unir, permite la producción de Fab libre. Pueden obtenerse bibliotecas de presentación de fagos de 10^{7} miembros después de la co-infección de E. Coli XLI-Blue con el fago adyuvante, y pueden seleccionarse con respecto a la unión al antígeno por medio de la presentación en superficies recubiertas con antígeno. Los genes que codifican los fragmentos Fab seleccionados se transportan en las partículas de fago y, de esta manera, están inmediatamente disponibles para la clonación y secuenciación.

\newpage

El vector pComb3 también codifica una cadena L libre (dominios kappa de V_{L} y C_{L}) que se asocia con la región Fd fusionada a la proteína de la cubierta para formar fragmentos Fab presentados en la superficie del fago. La proteína de fusión Fd-cpIII y la cadena L se expresan a partir de sus propios promotores (lacZ) en orientaciones transcripcionales de cabeza a cola. Para obtener una serie de fagos que expresen anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra una diversidad de antígenos tales como los presentes en la superficie de una célula tumoral, es más eficaz tener las combinaciones de cadenas H y L generadas in vivo en respuesta a la inmunización.

Para obtener un vector bacteriano en el que puedan disponerse los genes de región V_{H} y V_{L} en orientaciones transcripcionales opuestas, se modificó el vector de presentación de fagos pComb3. Este vector pComb3 modificado (phh3, Figura 3b), contiene el lacZ y los promotores tac en orientaciones transcripcionales de cabeza a cabeza, dirigiendo la transcripción de los genes kappa y Fd de ratón, respectivamente. El dominio C_{H1} del gen Fd procede de la IgG_{2b}. Aunque las secuencias líder para las dos cadenas tienen la secuencia de aminoácidos líder de pelB, las secuencias de nucleótidos difieren en muchas posiciones. Se tomó esta precaución para proteger contra las deleciones. La integridad de este vector de fagémido, tanto en forma bicatenaria como en forma monocatenaria, se verificó por un análisis de diagnóstico con enzimas de restricción, por secuenciación y por amplificación por PCR de segmentos específicos.

El segmento de ADN que contenía el promotor bacteriano cabeza a cabeza y las secuencias líder de phh3, un cassette bacteriano lPPl, se generó por subclonación en pBluescript II KS (Stratagene; La Jolla, CA), para generar plPPl (Figura 3c). El vector phh3 se modificó reemplazando los genes de la región variable y las secuencias líder y promotora por un tramo de ADN irrelevante para producir phh3mu que contenía los genes C_{\kappa} y C_{H1} de \gamma_{2b} murinos (Figura 3d). Se obtuvo un vector de presentación de fagos bidireccional adicional que contenía los genes C_{\kappa} y CH1 de \gamma_{1} humanos (phh3hu; Figura 3d) a partir de phh3mu reemplazando los genes C murinos por genes C humanos.

Tanto phh3mu como phh3hu son útiles para la clonación de pares V_{L}-V_{H} unidos en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza. Estos vectores circulares pueden abrirse entre los extremos amino de los genes de la región V_{L} y V_{H} para insertar el cassette lPPl derivado de plPPl y generar una biblioteca de presentación de fagos bidireccional. Como se representa en la Figura 4c, los pares V_{L}-V_{H}, unidos en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza, pueden transferirse fácilmente, en masa, entre un vector de presentación de fagos bidireccional funcional y un vector de expresión de mamífero circular. La transferencia requiere la apertura del vector entre los extremos amino de V_{L} y V_{H} y el intercambio de cassettes que contienen secuencias líder y promotores procariotas o de mamífero, los cassettes lPPl. Los pares V_{L}-V_{H} que incluyen los cassettes lPPl se expanden en un vector, por PCR, y se insertan en otro vector. Para la inserción en el vector de mamífero, las colas que no hibridan de los cebadores de PCR contienen sitios de empalme (ss = sitio de empalme; Figura 3c).

Se obtuvo por ingeniería genética un vector doble murino, pMDV (Figura 4a), capaz de expresar una cadena H de IgG_{2b} de ratón y una cadena L kappa de ratón, y se usó para expresar anticuerpos IgG2b por transfección en la línea de células de hibridoma nula sp2/0-Ag14, que no produce ninguna cadena H o L endógena. El gen de la región C de IgG_{2b} se reemplaza por el gen de la región C de IgG_{2a} por manipulaciones enzimáticas como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (J. Sambrook et al. editors, Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY, 1989). El vector doble murino también puede modificarse reemplazando los genes C_{\gamma 2b} y C_{\kappa} murinos por los genes C_{\gamma 1} y C_{\kappa} humanos respectivamente, para generar el vector doble quimérico (pCDV) mostrado en la Figura 4b. El marcador selectivo Eco gpt confiere a las células de mamífero resistencia al ácido micofenólico cuando está presente xantina en el medio.

Ejemplo 4 Fijación y permeabilización de las células

Las células se fijaron básicamente como se describe por M.J. Embleton et al. (Nuc. Acids Res. 20:3831-37, 1992) con modificaciones minoritarias. Se lavaron células a una concentración de 3-5 x 10^{7} en un tubo cónico de 50 ml (Costar; Cambridge, MA) tres veces en 10 ml de PBS, pH 7,2, a temperatura ambiente. El sedimento celular se resuspendió en 1,0 ml de NaCl 150 mM, seguido de la adición de 1,0 ml de formaldehído al 20% enfriado con hielo (Sigma Chemical; St. Louis, MO)/NaCl 150 mM gota a gota con agitación vorticial suave. Las células se mantuvieron en hielo y se agitaron con vórtice a intervalos de 10 minutos durante un total de una hora, y después se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo a 350 x g durante tres minutos a 4ºC. El tubo se golpeó ligeramente para dispersar el sedimento entre los lavados. El sedimento se resuspendió en 1,0 ml de NP-40 (Sigma Chemical; St. Louis, MO) al 0,5% en agua. Las células se mantuvieron en hielo durante una hora con agitación vorticial ocasional, y después se transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se centrifugaron a 14.000 rpm a 4ºC durante 3 minutos. A continuación se realizaron tres lavados con PBS enfriado con hielo y un lavado con PBS enfriado con hielo/glicina 100 mM. Entre los lavados, el sedimento se dispersó por agitación vigorosa de la microcentrífuga. Las células se resuspendieron en PBS/glicina 100 mM con una micropipeta para dispersar el sedimento celular y retirar los cúmulos de células visibles. Se congelaron alícuotas de 10^{6} células en PBS/glicina 100 mM en hielo seco y se almacenaron a -80ºC durante un período de hasta tres semanas.

Ejemplo 5 Unión de genes de la región V de cadenas H y L dentro de las células

Se estableció un procedimiento de PCR dentro de las células en el que se sintetizaron ADNc de las regiones V_{H} y V_{L} in situ en una población de células fijadas/permeabilizadas. Se generaron dos líneas celulares transfectantes, produciendo una línea celular un anticuerpo IgG_{2b(\kappa)} de ratón específico para el hapteno p-azofenilarsonato (Ars; J. Sharon et al., J. Immunol. 142:596-601, 1989). La otra línea celular produce un anticuerpo IgG_{2b(\kappa)} quimérico que es idéntico al anticuerpo anti-Ars tanto a nivel de los aminoácidos como a nivel de los nucleótidos, con la excepción de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), que proceden de un anticuerpo anti-dextrano. Se usaron estas dos líneas celulares porque los cebadores para la síntesis de ADNc y para la PCR, que no incluyen las CDR, tienen la misma complementariedad con los genes H y L de las dos líneas celulares, aunque las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas resultantes podrían distinguirse por secuenciación en las CDR.

La síntesis de ADNc y las amplificaciones por PCR en células fijadas/permeabilizadas se realizó básicamente como se describe por M.J. Embleton et al. (Nuc. Acids Res. 20:3831-37, 1992) con modificaciones minoritarias. Se lavaron 2 x 10^{6} células fijadas/permeabilizadas una vez con agua y se usaron en una reacción de 50 \mul para la síntesis de ADNc. Se usaron cuarenta unidades de transcriptasa inversa SuperScript (Gibco/BRL; Grand Island, NY), tampón de primera cadena (Gibco/BRL; Grand Island, NY) y 25 pmoles de cada uno de los cebadores de avance 3A-CL y 1A-CH1 (Operon Technologies; Alameda, CA). Después de la síntesis de ADNc, las células se sometieron a una microcentrifugación (14.000 rpm durante 3 minutos a 4ºC), se lavaron en 200 \mul de PBS/glicina 100 mM y se resuspendieron en 10 \mul del mismo tampón. Las PCR se realizaron con el kit de ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT) en un DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT) durante 30 ciclos. Cada ciclo constaba de 30 segundos a 90ºC, 30 segundos a 65ºC y 30 segundos a 72ºC. La concentración final de MgCl_{2} fue de 2,5 mM. Se incluyó un control de PCR de 20 \mul que produce un producto de 1,2 kilopares de bases.

En la primera PCR, se usaron 10 pmoles de cada uno de los cebadores de unión 4L y 2H junto con 25 pmoles de cada uno de los cebadores de avance 3A-CL y 1A-CH1.

1

2

3

Después de la primera PCR, las células se sometieron a una microcentrifugación y se recogió el sobrenadante. Para la segunda PCR, después de dos lavados de 200 \mul de PBS/glicina 100 mM, se añadieron 25 pmoles de cada uno de los cebadores anidados 3L y 1H. Después de completar los 30 ciclos como se ha indicado anteriormente, las células se sometieron a microcentrifugación y se recogieron los sobrenadantes. Los productos de reacción obtenidos después de la primera y segunda PCR se muestran en la Figura 6. Se observó una banda de 777 pb correspondiente a la combinación V_{H}-V_{L} unida (indicada por una flecha) después de la segunda PCR. Los productos obtenidos como primer y segundo producto de PCR se muestran en las bandas 1 y 2, respectivamente. m y M son una escala de 123 pb y un producto de digestión Hind III de ADN del fago kappa, respectivamente, indicándose los tamaños en pares de bases (pb) de algunas de las bandas. La banda observada tenía el tamaño correcto esperado para la combinación V_{H}-V_{L}. Esta banda se purificó en gel y se clonó, después de la digestión con EcoRI y HindIII, en los sitios EcoRI-HindIII de M13mp19.

En la Figura 5 se muestra una representación esquemática de las reacciones de PCR y de transcriptasa inversa dentro de las células, y de los productos obtenidos. Después de la síntesis de ADNc usando cebadores 1A-CH1 y 3A-CL (ambos anti-sentido), complementarios al principio de los genes C_{H1} y C_{\kappa} para los ARNm de cadena H y L, respectivamente, se usaron los mismos cebadores más dos cebadores de unión, 2H y 4L (ambos con sentido), en una primera reacción de PCR. Además de proporcionar una forma para unir la combinación V_{H}-V_{L} dentro de las células, los cebadores de unión introducen sitios de restricción (XhoI y SacI) para la posterior clonación de las secuencias promotoras entre V_{H} y V_{L}. El cebador 2H hibrida con el principio de la secuencia V_{H} que incluye parte de la secuencia líder, tiene un sitio de enzimas de restricción Xho I correspondiente a las posiciones de aminoácidos 5 y 6 de la región V_{H}, y contiene una cola de 30 nucleótidos de longitud de secuencia aleatoria. El cebador 4L hibrida con el principio de la secuencia V_{\kappa} que incluye parte de la secuencia líder, tiene un sitio de restricción Sac I correspondiente a los aminoácidos 1 y 2 de la región V_{\kappa} y contiene una cola de 30 nucleótidos de longitud que es el complemento inverso de la cola del cebador 2H.

Como las colas de los cebadores 2H y 4L son complementarias, los fragmentos amplificados de V_{H} y V_{L} se unieron durante la PCR por extensión solapante. Después de lavar las células para retirar los cebadores no incorporados extracelulares y cualquier producto de PCR que pueda haber salido de las células, se preparó una segunda PCR usando cebadores anidados 1H y 3L, ambos anti-sentido y no solapantes con los cebadores 1A-CHI y 3A-CL. El cebador 1H es complementario al principio del dominio C_{H1} de IgG_{\gamma 2b} y a parte de JH2. Además, contiene un sitio de restricción Hind III y un sitio de empalme. El cebador 3L es complementario al principio del dominio C_{\kappa} y a parte de J_{\kappa}1. Contiene un sitio de restricción EcoRI y un sitio de empalme. Los sitios de empalme y los sitios de restricción en los cebadores 1H y 3L están destinados a facilitar la clonación posterior de las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas en el vector de expresión de mamífero doble mostrado en la Figura 4a.

Ejemplo 6 Generación de anticuerpos IgG intactos después de la síntesis de ADNc dentro de las células y la amplificación por PCR

Para determinar si las combinaciones de V_{H}-V_{L} amplificadas dentro de las células pueden expresarse como anticuerpos IgG en células de mieloma o hibridoma, se proporcionaron promotores de mamífero de cabeza a cabeza (Figura 7). Un clon que contenía una combinación V_{H}-V_{L} unida, que codificaba las regiones V de los anticuerpos anti-Ars, se digirió con XhoI y SacI y se unió a un fragmento de ADN XhoI-SacI que contenía un promotor de cadena H, un secuencia líder, y un ADN que codificaba los cuatro primeros aminoácidos de la cadena H madura, en una orientación de cabeza a cabeza con un promotor de cadena kappa y una secuencia líder. Se aisló un fragmento de ADN EcoRI-HindIII de 2,25 kb que incluía los promotores y los genes de la región V a partir del vector resultante, y se unió a la cadena principal EcoRI-HindIII derivada del vector doble murino IgG_{2b}. El vector de expresión resultante (Figura 7) se utilizó para transfectar células de hibridoma nulas Sp2/0-Ag14 por electroporación.

Los transfectantes mostraron la producción de anticuerpos IgG intactos como se determina por análisis de transferencia de Western de sus sobrenadantes (Figura 8a) realizado como se describe por H. Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-54, 1979). La posición del producto IgG de 150 KDa se indica por una flecha. También se indican las posiciones de los marcadores de peso molecular en KDa, así como: E = el transfectante experimental derivado de la combinación V_{H}-V_{L} unida dentro de las células; -C = control negativo (línea celular Sp2/0-Ag14 parental); M = marcadores de peso molecular pre-teñidos; +C, control positivo (transfectante IgG2b anti-Ars); -A = un transfectante que produce un anticuerpo IgG_{2b} mutante que ha perdido la unión a Ars. Los transfectantes unidos a Ars se evalúan por inmunoensayo unido a enzima en fase sólida (ELISA) usando placas recubiertas con Ars-BSA e IgG de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (específica de Fc, Figura 8b) en el sistema ProtoBlot (Promega, Madison, WI).

En un experimento adicional, se amplificó un par V_{H}-V_{L} derivado de un anticuerpo murino contra p-azofenilarsonato (Ars) junto con el cassette lPPl de intervención de mamífero por PCR a partir del vector de expresión de mamífero y se transfirió a phh3mu. El cassette lPPl de mamífero después se cambió por el cassette lPPl procariota que contenía los promotores de lacZ y tac de cabeza a cabeza y las dos secuencias líder de pelB para generar phh3-Ars. Como se muestra en la Figura 9, el fago producido a partir del vector phh3-Ars (Figura 9A, ELISA directo) se unía específicamente a una placa recubierta con Ars-albúmina de suero bovino (Ars-BSA). Además, la unión a la placa recubierta con Ars-BSA pudo inhibirse específicamente por Ars-BSA soluble, pero no por BSA soluble (Figura 9B).

Estos resultados demuestran que las combinaciones V_{H}-V_{L} amplificadas y unidas por PCR dentro de las células pueden transferirse satisfactoriamente a un vector de expresión. Las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas también pudieron transferirse primero al vector de presentación de superficie de fagémido phh3 y a los vectores de expresión dobles murino o quimérico (Figura 4), y el vector de presentación de fagos bidireccional puede usarse satisfactoriamente para transferir un par V_{H}-V_{L} unido cabeza a cabeza para producir partículas de fago que presenten fragmentos Fab de unión a antígenos.

Ejemplo 7 Amplificación por PCR dentro de las células y unión de las combinaciones de regiones V_{H} y V_{L} procedentes de células no transformadas

Se preparan células de bazo y células de ganglio linfático de ratones inmunizados después de la lisis de glóbulos rojos, se combinan, se fijan en formaldehído al 10%, se permeabilizan con NP-40 al 0,1% y se mantienen congeladas a -80ºC en alícuotas de 10^{7} células hasta el uso para la PCR dentro de las células. Otros ratones se inmunizan posteriormente con células OC2 aisladas con Percoll de un paciente, procedentes de las alícuotas congeladas. Una alícuota de células de bazo fijadas/permeabilizadas más células de ganglio linfático derivadas del ratón inmune OC2 se somete a la síntesis de ADNc y a la amplificación por PCR y a la unión, pero con grupos de cebadores para asegurar la amplificación de todos o de la mayoría de los genes de la región V, y con cebadores anidados. Los cebadores usados para estas reacciones se diseñan para amplificar el repertorio entero de inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos contra epítopos proteicos, epítopos de carbohidrato y epítopos lipídicos.

Para la síntesis de ADNc de regiones V_{H}, se usa un grupo de cebadores (1A-CH1, anti-sentido) complementarios al principio de los dominios CH1 de cada uno de los isotipos de suero de ratón (Figura 5). El grupo consta de siete cebadores 1A-CH1: 1A-CH1-_{\gamma}l, 1A-CH1-_{\gamma}2A, 1A-CH1-_{\gamma}2B, 1A-CH1-_{\gamma}3, 1A-CH1-\mu, 1A-CH1-_{\varepsilon} y 1A-CH1-_{\alpha}. Para la síntesis de ADNc de regiones V_{L}, se usa un grupo de cebadores (3A-CL, anti-sentido) complementarios al principio de los dominios C_{\kappa} y C\lambda. Los cuatro cebadores 3A-CL son: 3A-CL-_{\kappa}, 3A-CL-\lambda1, 3A-CL-\lambda2 y 3A-CL-\lambda3.

Para la primera PCR se usan los mismos grupos de cebadores (1A-CH1 y 3A-CL) junto con cebadores de unión. Los cebadores de unión para las regiones V_{H} (2H, con sentido) son complementarios al principio de la secuencia V_{H} que incluye parte de la secuencia líder, tienen un sitio de enzima de restricción XhoI correspondiente a las posiciones de aminoácidos 5 y 6 de la región V_{H}, y contienen además una cola de 30 nucleótidos de longitud de secuencia aleatoria. Los nueve cebadores 2H, basados en los cebadores usados por A.S. Kang et al. (Methods 2:111-18, 1991) se denominan 2H1 a 2H9. Los cebadores de unión para las regiones V_{L} (4L, con sentido) son complementarios al comienzo de las secuencias V_{\kappa} o V\lambda que incluyen parte de la secuencia líder, tienen un sitio Sac I correspondiente a los aminoácidos 1 y 2 de la región V_{L}, y contienen además una cola de 30 nucleótidos de longitud que es el complemento inverso de la cola del cebador 2H. Los cebadores 4L, que también se basan en los cebadores usados por A.S. Kang et al. (Methods 2:111-18, 1991) para V_{\kappa} y en E.A. Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) para V_{\kappa} (sólo hay dos genes V_{\kappa} en el ratón) son: 4L-V_{\kappa}l a 4L-V_{\kappa}7, 4L-V\lambda1 y 4L-V\lambda2.

Las colas complementarias de los cebadores 2H y 4L se unen a los fragmentos amplificados de la región V_{H} y V_{L} por PCR de extensión solapante (H.A. Erlich, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman & Co., NY, NY, 1992). Los sitios XhoI y SacI introducidos por estos cebadores permiten la clonación posterior de las secuencias promotoras entre secuencias V_{H} y V_{L}. Después de lavar las células para retirar los cebadores y cualquier producto de PCR que pueda haber salido de las células, se prepara una segunda PCR para amplificar adicionalmente las combinaciones de región V_{H}-V_{L} unidas usando cebadores anidados (JH y JL, todos anti-sentido). Estos cebadores se diseñaron para la posterior clonación de las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas en el vector de fagémido phh3mu o phh3hu (Figura 3). Los cebadores JH, denominados JH1-JH4, son complementarios a parte de un gen JH (hay cuatro genes JH en el ratón), y contienen un sitio de restricción EcoRI adicional en sus extremos 5'. El otro grupo de cebadores (JL) son complementarios a parte del gen J_{\kappa} o J\lambda (hay cuatro genes funcionales J_{\kappa} y tres genes funcionales J\lambda en el ratón), y contienen un sitio de restricción HindIII adicional en sus extremos 5'. Estos cebadores son J_{\kappa}1, J_{\kappa}2, J_{\kappa}4, J_{\kappa}5, J\lambda1, J\lambda2 y J\lambda3.

El primer y el segundo productos de PCR se ensayan con respecto a la presencia de fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa. Se espera un fragmento de 0,8 kb después de la segunda PCR. Esta banda, que contiene las combinaciones V_{H}-V_{L} amplificadas, se aísla en gel usando Geneclean II (Bio101; La Jolla, CA).

Ejemplo 8 Generación de una biblioteca de presentación de fagos de Fab y una biblioteca de Fab soluble a partir de combinaciones V_{H}-V_{L} unidas

Las combinaciones V_{H}-V_{L} aisladas en gel se digieren con EcoRI y HindIII y se unen con la cadena principal EcoRI-HindIII del vector de fagémido phh3 (o el vector parecido a phh3hu) para generar una población de vectores de expresión de fagémido phh3/VH-VL como se muestra en las Figuras 2D y 10. La transformación de las bacterias y la generación de la biblioteca del fago se realiza como se ha descrito (C.F. Barbas y R.A. Lerner, Methods 2:119-24, 1991). Como estos vectores son fagémidos, se propagan por transformación y crecimiento de E. coli XLI-Blue en medio de cultivo que contiene carbenicilina y tetraciclina. Las colonias que contienen los fagémidos se cultivan en agar por cultivo de una alícuota de cultivo. Para obtener fagos, las bacterias se superinfectan con exceso del fago adyuvante VCSM13, después de lo cual, se obtienen fagémidos empaquetados que infectan E. coli XLI-Blue.

La mezcla de unión phh3/VH-VL se utiliza para transformar por electroporación células bacterianas XLI-Blue SURE competentes, con una eficacia de transformación de 5 x 10^{9} unidades formadoras de colonias (cfu) por \mug de ADN (Stratagene; La Jolla, CA), y se extraen alícuotas del cultivo celular transformado para cultivarlas y determinar el tamaño de la biblioteca y el número de miembros originales. Una buena biblioteca generalmente tiene al menos 10^{7} cfu. Después de expandir el resto del cultivo bacteriano, se prepara ADN de fagémido bicatenario y se digiere con SacI y XhoI. El fragmento grande se une a un fragmento SacI-XhoI que contiene los promotores bacterianos de cabeza a cabeza derivados de phh3 para generar phh3B/VH-VL (Figura 10).

Se obtienen vectores de tipo phh3B/VH-VL por transformación de células electrocompetentes SURE con la mezcla de unión. Se cultivan alícuotas para asegurar una eficacia de transformación de al menos 10^{7} cfu totales. El resto de las bacterias transformadas se superinfectan con el fago adyuvante VCSM13 a 10^{12} unidades formadoras de placas (pfu) para producir fagémidos empaquetados que presentan fragmentos Fab. Esta última etapa amplifica la biblioteca aumentando la representación de cada miembro original. Las placas se precipitan en el sobrenadante celular con polietilenglicol y se resuspenden en PBS. Ésta es la biblioteca original.

Se prepara Fab soluble a partir de la biblioteca de fagémido por digestión con las enzimas de restricción SpeI y NheI para retirar el segmento de ADN de la proteína de la cubierta gIII, y volviendo a unir los fragmentos (Figura 10). La digestión con SpeI y NheI produce extremos cohesivos compatibles que se unen. El fragmento de ADN que carece de la porción de la proteína de cubierta gIII se purifica en gel, se autoune y se utiliza para transformar células electrocompetentes SURE. Las titulaciones de la biblioteca se determinan por el cultivo de alícuotas. Es de esperar que la biblioteca conste de al menos 10^{7} cfu. Se induce la expresión de Fab en el cultivo con IPTG (tanto para el promotor de lacZ como para el promotor de tac) y las células se lisan por tres ciclos de congelación/descongelación entre -80ºC y 37ºC para producir lisados que contienen Fab.

Ejemplo 9 Ensayo de la reactividad de la biblioteca de presentación de fagos de Fab original

Se ensaya la reactividad de la biblioteca de presentación de fagos de Fab con el tumor OC2 y con tejidos de paciente normal/humano por inmunohistoquímica. Se preparan secciones de criostato (de 4 micrómetros de espesor) a partir del tumor OC2 usando tanto el tumor derivado de ovario como la metástasis de ganglio linfático, y a partir de muestras de miometrio, endometrio e intestino delgado que se habían obtenido a partir del paciente OC2. Se ensayan preparaciones de citospin fijadas con acetona de los PBL del paciente y de PBL de otro ser humano como se describe en Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al. editors, John Wiley & Sons, NY, NY, 1992). Se preparan otras secciones de criostato de tejidos humanos, tales como hígado, riñón, corazón, pulmón, piel, bazo, esófago y yeyuno, a partir de muestras quirúrgicas y/o de autopsias realizadas de 6 a 18 horas después de la muerte. Se realiza una inmunohistoquímica en preparaciones de criostato y de citospin, con la excepción de que se usa anti-M13 de oveja seguido de anticuerpos de burro anti-oveja biotinilados (5 Prime - 3 Prime; Boulder, CO) como se ha indicado anteriormente, usando avidina-peroxidasa para detectar las partículas de fago Fab unidas (M13). Como alternativa, se tratan cortes con Fab soluble preparado a partir de la biblioteca de presentación de fagos Fab, seguido de anticuerpo kappa de conejo anti-ratón biotinilado antes de la adición de avidina-peroxidasa. En esta fase, las bibliotecas son reactivas con las células tumorales así como con células normales.

Ejemplo 10

Selección de la biblioteca de presentación de fagos de Fab con respecto a la reactividad con las células tumorales OC2

Cuando se amplifiquen las combinaciones V_{H}-V_{L} a partir de ratones inmunes a los tumores OC2, también se representarán anticuerpos no dirigidos contra las células tumorales o contra cualquier otro tejido humano. Para eliminar los anticuerpos irrelevantes de la biblioteca, así como los anticuerpos anti-tumorales sobrerrepresentados, la biblioteca de presentación de fagos de Fab se selecciona con respecto a la reactividad con células tumorales OC2 aisladas por gradiente de Percoll. Se usan células tumorales no fijadas intactas para conservar la integridad de los determinantes antigénicos en las membranas celulares.

Una alícuota de 100 \mul de la biblioteca que contiene 10^{11} cfu se agita con 10^{7} células OC2 lavadas durante 3 horas a temperatura ambiente. Las células se sedimentan por centrifugación, el sobrenadante se retira y las células se lavan 3 veces con PBS para retirar el fago no unido. El fago unido se eluye de las células con glicina 0,1 M/HCl pH 2,2 que contiene 1 mg/ml de BSA. Después de 5 minutos, la suspensión celular se neutraliza con 6 \mul de base Trizma 2 M y se diluye a 1:10 con medio SOC. Este tratamiento no ocasiona la lisis de células de mamífero. La inmensa mayoría permanecen intactas durante el procedimiento, pero puede observarse algún hinchamiento de las células. Las células se sedimentan por centrifugación y el sobrenadante que contiene el fago eluido se usa para infectar células E. coli XLI-Blue. Se retiran alícuotas de los cultivos celulares transformados, que se cultivarán en placas para determinar el número de fagémidos empaquetados que se eluyeron de la placa. Los cultivos se infectan con el fago adyuvante VCSM13 para generar más fagémidos empaquetados. Éstos se agitan con un número limitante de células tumorales OC2 - el número limitante predeterminado a partir de la retitulación de las partículas de fago no unidas. La amplificación del fago eluido y la unión adicional a números limitantes de células OC2 seguido de elución, se repiten tres o cuatro veces para asegurar la especificidad de tumor de la biblioteca seleccionada. En esta biblioteca seleccionada se ensaya la reactividad con el tumor OC2 y con tejido normal por inmunohistoquímica. Esto muestra una mayor reactividad, pero con un modelo similar al observado para la biblioteca original.

Ejemplo 11 Absorción de la biblioteca seleccionada para el tumor con tejidos humanos normales/de paciente y PBL

La biblioteca seleccionada para el tumor muestra una fuerte reactividad cruzada con tejido humano normal. La mayor parte de esta reactividad cruzada podría absorberse por un tejido normal derivado de cualquier fuente humana, porque la inmensa mayoría de los antígenos humanos son idénticos cuando se comparan individuos diferentes (Molecular Biology of the Cell, B. Alberts et al. editors, Garland Publishing, Inc., NY, NY, 1989). Sin embargo, los antígenos de histocompatibilidad difieren entre individuos debido a la existencia de determinantes polimórficos. Aunque las reactividades contra los determinantes no polimórficos de antígenos de histocompatibilidad pueden absorberse por tejidos de cualquier ser humano, es necesario que los tejidos procedentes del paciente absorban cualquier fago de Fab que reaccione con determinantes polimórficos de estos antígenos. Los leucocitos de sangre periférica son especialmente adecuados para este fin porque expresan colectivamente todos los antígenos de histocompatibilidad, incluyendo los antígenos del MHC de clase I, que se encuentran en todas las células nucleadas del cuerpo, y los antígenos del MHC de clase II, que se encuentran principalmente en células B, monocitos y células dendríticas.

La biblioteca de presentación de fagos de Fab se absorbe primero con PBL humanos normales, y después con una mezcla de preparaciones de tejidos sólidos de origen humano en general y del paciente OC2 en particular. Por último, la biblioteca se absorbe con PBL del paciente OC2. Después de cada absorción, la biblioteca se reamplifica y se ensaya con respecto a la reactividad contra el tumor OC2 y contra tejidos de humano normal/paciente y PBL por inmunohistoquímica usando secciones de criostato y preparaciones de citospin. Las reabsorciones con nuevas preparaciones de los tejidos sólidos o PBL seguidas de reamplificaciones de la biblioteca se continúan hasta que la biblioteca absorbida reacciona con el tumor OC2 con mucha más fuerza que con cualquier célula o tejido de humano normal/paciente ensayado.

Para la absorción con PBL humanos normales, se usan células enteras recién preparadas. Una alícuota de la biblioteca de presentación de fagos de Fab seleccionada para el tumor se agita a temperatura ambiente durante 3 horas con 1 x 10^{8} PBL. El exceso de células se retira para asegurar que se retira la mayoría de las partículas de fago reactivas.

Para la absorción con tejidos sólidos, se usan membranas. Ya se preparó una fracción de membrana a partir de la muestra de miometrio obtenida de la paciente OC2, y se mantuvo congelada a –80ºC. Las muestras de endometrio y de intestino delgado de la paciente OC2, que se habían congelado rápidamente en nitrógeno líquido y almacenado a -80ºC, se procesaron de la misma manera para preparar membranas. Además, se obtienen otras muestras de tejido humano normal a partir de muestras quirúrgicas y de autopsias, y las fracciones de membrana se preparan y se almacenan en alícuotas que contienen un 10% de glicerol a -80ºC. Después de la descongelación, se combinan alícuotas de membrana aproximadamente iguales de todos los tejidos y se agitan a temperatura ambiente durante 3 horas con una alícuota de la biblioteca de presentación de fagos de Fab absorbida en PBL humanos. El sobrenadante que contiene el fago no absorbido se recupera después de la sedimentación de las membranas a 150.000 x g.

La absorción final de la biblioteca de presentación de fagos de Fab con PBL del paciente OC2 se realiza como se ha descrito anteriormente para los PBL humanos normales, con la excepción de que sólo se usan 5 x 10^{6} células por absorción debido a que el suministro es limitado. Como la biblioteca ya se habrá absorbido con tejido normal tal como endometrio, miometrio e intestino delgado derivado del paciente OC2, y el fago de Fab específico de MHC de clase I/específico de paciente ya se habrá reducido espectacularmente, la absorción con los PBL del paciente pretende reducir sólo el fago de Fab con especificidad de paciente y con especificidad de MHC de clase II.

Ejemplo 12 Evaluación de la complejidad de la biblioteca

La biblioteca óptima (absorbida) se dirige a muchos epítopos (determinantes antigénicos) diferentes. Aunque las células tumorales usadas para la inmunización de ratones presentan muchos epítopos contra el sistema inmune, es probable que algunos sean inmunodominantes, de tal forma que los anticuerpos contra ellos estén sobrerrepresentados en la biblioteca original. Por lo tanto, los anticuerpos contra otros epítopos estarán infrarrepresentados en la biblioteca original. Aunque esto sería un problema importante en el caso de un antisuero policlonal convencional, la estrategia de la biblioteca de presentación de fagos de Fab soluciona este problema. La unión de la biblioteca a concentraciones limitantes de células tumorales OC2, seguido de la reamplificación de las partículas de fago de Fab unidas, aumenta la representación de los epítopos menos inmunogénicos. La posterior absorción de la biblioteca seleccionada para el tumor con tejidos normales y PBL reduce espectacularmente la representación de algunos epítopos en la biblioteca de presentación de fagos de Fab.

La evaluación del número de epítopos diferentes dirigidos por la biblioteca absorbida por tejido seleccionado para el tumor/normal se consigue por clonación de algunos de los miembros de la biblioteca. Se cultivan alícuotas de E. coli XLI-Blue infectadas con la biblioteca de presentación de fagos de Fab absorbida y se seleccionan colonias individuales. Se aíslan los vectores de fagémido bicatenarios y se determina su secuencia de nucleótidos de la región V. Las secuencias se analizan por el programa de búsqueda de homología BLAST (S.F. Atltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 199) disponibles en el Molecular Biology Computer Research Resource, para determinar el subgrupo de región V, el uso del gen D y del gen J. Este análisis produce una primera medición de la complejidad de la biblioteca, porque indica si los clones analizados procedían de muchos o de muy pocos clones de células B originales.

Como segunda medida de la complejidad, se determina la capacidad de los fragmentos Fab de diferentes clones de competir de forma cruzada por la unión a las células tumorales OC2 por medio de un ELISA, usando placas recubiertas con preparaciones de membrana OC2 y/o por inmunohistoquímica. Los fragmentos Fab solubles de diferentes clones compiten con la unión de los fragmentos Fab unidos al fago de uno de los clones, detectándose la unión del fago con anticuerpos anti-M13 de oveja seguidos de anticuerpos de burro anti-oveja biotinilados y avidina-peroxidasa. Si dos clones no presentan competición cruzada, se asume que se dirigen a epítopos diferentes. Basándose en el número de clones con competición cruzada en una serie dada de clones, y en el número de cfu en la biblioteca, se estima la complejidad de la biblioteca. Este tipo de análisis sólo proporciona una indicación del número de epítopos o determinantes antigénicos que se están dirigiendo por la biblioteca. No describirá cuántos antígenos diferentes se dirigen. Sin embargo, puede obtenerse una estimación haciendo reaccionar la biblioteca con componentes celulares separados por electroforesis bidimensional.

Ejemplo 13 Generación de bibliotecas de IgG_{2a} de ratón anti-tumorales

Para determinar cuál de los isótopos de IgG murinos es el más eficaz en la mediación de las funciones efectoras para eliminar las células CD4+, se ensayaron anticuerpos quiméricos con respecto a su capacidad de mediar la citotoxicidad dependiente del complemento in vitro, la reducción de células in vivo y la prolongación de la supervivencia de injertos de piel alogénicos y la supresión de la producción de alo-anticuerpos. En general, se descubrió que el isotipo de ratón más eficaz en estos ensayos era IgG_{2a}. Otros autores también han demostrado que IgG_{2a} es el mejor isotipo de ratón en funciones efectoras mediadas por Fc. El isotipo humano IgG_{1}, que probablemente es el isotipo más análogo a la IgG_{2a} de ratón, ha demostrado ser uno de los dos mejor isotipos humanos en las funciones efectoras mediadas por Fc (J.L. Dangl et al., EMBO J. 7:1989:94, 1988).

Se expresan combinaciones de regiones variables de H y L a partir de la biblioteca de fagémido como anticuerpos murinos IgG_{2a}. Antes de la transferencia de las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas al vector doble IgG_{2a} murino (Figura 4a), el fragmento de ADN SacI-XhoI que contiene los promotores bacterianos y las secuencias líder de cabeza a cabeza en el vector de fagémido phh3B/VH-VL (Figura 10a) se sustituye con un fragmento de ADN SacI-XhoI que contiene promotores H y L murinos y secuencias líder en orientaciones transcripcionales de cabeza a cabeza para generar phh3M/VH-VL (Figura 10b). Las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas, que incluyen los promotores de mamífero, se extraen del vector phh3M/VH-VL por amplificación por PCR usando grupos de cebadores 3L y 1H (Figura 3).

El grupo de cebadores 1H (anti-sentido) es complementario al principio del dominio CH1 de IgG_{\gamma 2b} y a parte de un gen JH (cuatro cebadores, uno para cada uno de los genes JH murinos). Además, este conjunto de cebadores contiene un sitio de restricción HindIII y un sitio de empalme y elimina el sitio EcoRI preexistente del vector phh3B/VH-VL (Figura 10a). Los cebadores 3L (anti-sentido) son complementarios al principio del dominio C_{\kappa} y a parte del gen JL (7 cebadores, para los 4 genes J_{\kappa} funcionales y para 3 genes J\lambda funcionales). Además, este grupo de cebadores contiene un sitio de restricción EcoRI y un sitio de empalme y elimina el sitio HindIII preexistente del vector phh3B/VH-VL (Figura 10a).

Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se aíslan en gel, se digieren con EcoRI e HindIII y se unen con la cadena principal EcoRI-HindIII del vector doble IgG_{2a} murino (Figura 4a). La mezcla de unión se utiliza para transformar células DH101B electrocompetentes con una frecuencia de transformación mayor de 10^{10} por \mug de ADN (Gibco/BRL; Grand Island, NY) para generar una biblioteca de expresión de IgG_{2a} (vector IgG_{2a}/lib). Para conservar la complejidad de la biblioteca durante estas manipulaciones, se usan células bacterianas de alta eficacia de transformación y células de mamífero de alta eficacia de transfección.

Ejemplo 14 Expresión de la biblioteca de IgG_{2a} de ratón en células de hibridoma, purificación de anticuerpos y evaluación de la complejidad de la biblioteca

Después de la linealización por digestión con enzimas de restricción en el único sitio SalI, el vector IgG_{2a}/lib se utiliza para transfectar la línea de células de hibridoma nula Sp2/0Ag14 por electroporación, con la excepción de que se usan alícuotas de 1 ml que contienen 2 x 10^{7} células cada una por cubeta. Los transfectantes se recuperan en medio selectivo que contiene xantina y ácido micofenólico. La frecuencia de transfección de la línea celular Sp2/0-Ag14 es de aproximadamente 1 en 10^{4} células, y aproximadamente 50% de los transfectomas produce cantidades significativas de inmunoglobulina, como se evalúa por análisis de transferencia de Western.

Para la transfección de la biblioteca, se usan 5 x 10^{8} células Sp2/0-Ag14 y un total de 500-1.000 \mug de ADN de vector de la biblioteca IgG_{2a}, con la expectativa de obtener una biblioteca de aproximadamente 25.000 clones. Las células transfectadas se cultivan durante 20 horas, después de lo cual se añade un medio selectivo que contiene xantina y ácido micofenólico. Se retiran alícuotas y se cultivan en medio selectivo en agarosa blanda para titular la biblioteca. El resto se cultiva en frascos cilíndricos de 4 litros en medio selectivo para dejar tiempo para que se mueran todas excepto las células transfectadas de forma estable y conseguir una densidad celular de 2 x 10^{6} células/ml.

Se purifican anticuerpos a partir del sobrenadante de cultivo en Proteína A o Proteína G Sepharose (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) y la pureza se ensaya por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Basándose en la experiencia previa con estos tipos de transfectantes, es de esperar que la recuperación sea de 5-10 \mug de IgG por ml de sobrenadante de cultivo, de forma que se prevé la obtención de 60 mg de anticuerpos de biblioteca IgG_{2a} a partir de 8 litros de sobrenadante de cultivo.

Aunque no hay ninguna estimación de la complejidad de la biblioteca de presentación de fagos de Fab absorbida, tiene que ser menor que 10^{7}, el tamaño de la biblioteca de presentación de fagos de Fab original (no absorbida). Usando una biblioteca de mamífero 400 veces más pequeña que la biblioteca de presentación de fagos de Fab original (25.000), es posible que no se representen todos los miembros únicos de la biblioteca de presentación de fagos de Fab absorbida en la biblioteca IgG_{2a} de ratón. Esto no es probable porque se elimina un porcentaje muy alto de los miembros de la biblioteca durante la absorción con tejidos de humano normal/paciente y PBL. Además, la biblioteca de presentación de fagos de Fab original de 10^{7} miembros contiene múltiples miembros derivados del mismo clon de células B, reduciéndose de esta manera su complejidad real. Además, como la transfección estable por electroporación ocasiona la integración de varias copias del vector transfectado por célula, es probable que el tamaño de la biblioteca de mamífero sea mayor de 25.000. Sin embargo, existe una probabilidad no cero de que las bibliotecas de mamífero sean menos complejas que la biblioteca de presentación de fagos de Fab de la que proceden. No obstante, la complejidad de las bibliotecas de mamífero no puede aumentarse realmente más de la mitad de un orden de magnitud, antes de que la magnitud del experimento de transfección haga que esto no sea técnicamente factible.

Debido a las consideraciones anteriores, y lo que es más importante, como los transfectantes de células de hibridoma individuales dentro de una población tienden a crecer a diferentes velocidades, producen diferentes cantidades de inmunoglobulina y, algunas veces, pierden la producción de inmunoglobulina, las bibliotecas de IgG de mamífero ya no se propagan por amplificación de una alícuota de células pequeña. En su lugar, las bibliotecas se generan de novo a partir de la biblioteca de presentación de fagos de Fab absorbida. La expansión inicial de la biblioteca de mamífero para posibles aplicaciones clínicas futuras tendrá una mayor escala.

Después de la expansión de las bibliotecas de mamífero, se obtiene una evaluación de su complejidad a partir de la secuencia de nucleótidos de los genes de la región V expresados. Se realiza una síntesis de ADNc dentro de las células y la unión de los genes de la región V de la cadena H y L expresados, seguido de amplificación por PCR. Las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas después se transfieren a phh3, determinándose las secuencias de nucleótidos de 30 a 40 clones de fagémido.

Ejemplo 15 Efecto de la biblioteca de IgG_{2a} de ratón sobre el crecimiento de tumores OC2 en ratones desnudos

La capacidad de anticuerpos con regiones C murinas de mediar funciones efectoras en un ratón que conducen a la eliminación de células diana de un tumor humano particular, es indicativa de la capacidad de esos mismos anticuerpos, si se proporcionan con regiones C humanas, de mediar funciones efectoras en un ser humano que conduzcan a la eliminación de células diana de ese tumor. Por lo tanto, como modelo para ensayar la capacidad de la biblioteca anti-tumoral de eliminar células tumorales diana in vivo, se usa el ratón desnudo. A ratones BALB/c desnudos se les inyectan 0,25 ml de piezas de tumor OC2 o 10^{7} células de tumor OC2, tanto s.c. como i.p. También se usa la inyección intravenosa de suspensiones de células tumorales cuando es demostrable el crecimiento del tumor OC2 en cualquier órgano, por ejemplo, el bazo o el ovario, después de tales inyecciones. A los ratones se les inyecta simultáneamente o posteriormente la biblioteca de anticuerpos IgG_{2a}, o una cantidad equivalente de IgG_{2a} de ratón para el grupo de control. El efecto del tratamiento con anticuerpos se determina por inspección visual y táctil para determinar el desarrollo de un tumor subcutáneo. Sus dimensiones se miden a diversos tiempos después del tratamiento con anticuerpos en comparación con el grupo de control. Los ratones con tumor que han recibido inyecciones por vía intraperitoneal se sacrifican a un tiempo predeterminado desde el examen de los ratones de control para producir un tumor visible en la cavidad peritoneal, aproximadamente 3-5 semanas, y se comprueba el crecimiento tumoral. Después del sacrificio, se examinan todos los ratones, incluyendo cualquier ratón al que se le hayan inyectado i.v. suspensiones de células tumorales, para determinar la metástasis y la necrosis tumoral.

El crecimiento de los tumores subcutáneos puede ser más difícil de inhibir que el crecimiento de los tumores intraperitoneales o los tumores en otros sitios, porque estos últimos pueden ser más accesibles a los anticuerpos y a las células efectoras. Se ensayan tanto tumores s.c. como i.p. porque si los tumores s.c. son más difíciles de inhibir, su inhibición constituye una medida añadida de la potencia de la biblioteca de anticuerpos.

Se administran 100 \mug de biblioteca de anticuerpos anti-tumorales IgG_{2a} por inyección i.p. 3 días después de la inyección de las piezas tumorales. Para optimizar el proceso, dependiendo de los resultados, se inyecta anticuerpo a un tiempo posterior o anterior. De nuevo, dependiendo de los resultados, se administran diferentes dosis de biblioteca de anticuerpo IgG_{2a}, mayor o inferior a 100 \mug por ratón, con inyecciones repetidas y con una vía de inyección i.v. También pueden administrarse diferentes dosis de piezas tumorales y de células tumorales OC2. Al principio, sólo se usan dos ratones para cada protocolo experimental y tres ratones para el control (IgG_{2a} de ratón no específica). Después, si es eficaz, los protocolos se ensayan en un grupo de 5 ratones con 5 ratones en el grupo de control.

Ejemplo 16 Generación de una biblioteca de IgG_{1} quimérica de ratón/humana y efectos de la biblioteca de IgG_{1} quimérica de ratón/humana sobre el crecimiento del tumor OC2 en ratones HU-PBL-SCID.

Una porción de la preparación de fragmentos de ADN EcoRI-HindIII que contiene las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas, incluyendo los promotores de mamífero y los sitios de empalme, se une a la cadena principal EcoRI-HindIII del vector doble IgG_{1} quimérico (Figura 4b) y se utiliza para transformar células electrocompetentes DH101B para generar una biblioteca de expresión de IgG_{1} quimérica de ratón/humana. La capacidad de la biblioteca de IgG_{1} quimérica de ratón/humana para afectar al crecimiento del tumor OC2 se ensaya tanto en ratones desnudos como en ratones SCID, sin y con reconstitución del ratón SCID con PBL humanos. Se ha demostrado que las regiones Fc humanas se unen a receptores Fc murinos y, por lo tanto, es posible que la biblioteca de IgG_{1} quimérica inhiba el crecimiento del tumor OC2. Se ensayan tanto tumores subcutáneos como tumores intraperitoneales.

La capacidad de la biblioteca de anticuerpos IgG_{1} quiméricos de inhibir el crecimiento del tumor OC2 en ratones HU-PBL-SCID se ensaya para determinar si las células efectoras humanas confieren una ventaja añadida. Para generar ratones HU-PBL-SCID, a ratones SCID se les transplantan por vía intraperitoneal 2-5 x 10^{7} PBL adultos separados de sangre entera por centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll-Paque al mismo tiempo que se realiza la primera inyección de la biblioteca de anticuerpos quiméricos IgG_{1}. La mayoría de los PBL humanos permanecen en la cavidad peritoneal y aparecen en el bazo y en la sangre (como 1-10% de las células totales después de la lisis de glóbulos rojos) sólo de 3 a 6 semanas después de la reconstitución y, por lo tanto, el ensayo sólo es para la inhibición del crecimiento de tumores intraperitoneales. Las complicaciones debidas a la aparición de linfomas inducidos por el virus de Epstein-Barr (EBV) en ratones reconstituidos con PBL de algunos donantes seropositivos para EBV se eliminan al terminar las muestras y/o tumores EBV positivos. El tiempo de aparición de estos linfomas varía entre 6 y 20 semanas después de la reconstitución, pero es reproducible para un donante EBV-seropositivo dado. Los PBL de algunos donantes EBV positivos nunca producen linfomas. Se preensayan los PBL de algunos donantes y sólo se usan los donantes cuyos PBL no conducen a un desarrollo prematuro de linfomas en los ratones reconstituidos. Además, en los experimentos se incluye un grupo de control al que no se le ha inyectado el tumor OC2. La estrategia para las dosis de anticuerpo, y el orden y programa de inyección de la biblioteca de anticuerpos y del tumor OC2, es como se ha descrito para la biblioteca de IgG_{2a} de ratón.

Otras realizaciones y usos de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica tras la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención descrita en este documento. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren sólo de forma ilustrativa, estando indicado el verdadero alcance de la invención por las siguientes reivindicaciones.

Claims (22)

1. Un método para obtener una biblioteca de moléculas de vectores de expresión que codifican una pluralidad de proteínas receptoras o partes de las mismas, que comprende las etapas de:

a)

obtener una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico donde cada fragmento de ácido nucleico codifica una región variable o una parte de la misma de una proteína receptora,

b)

producir una pluralidad de segmentos, donde cada segmento contiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes, a partir de dicha pluralidad de fragmentos de ácido nucleico unidos en orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, denominados en este documento par de fragmentos de ácido nucleico unidos,

c)

clonar dicha pluralidad de segmentos en un primer vector circular para producir una biblioteca de moléculas de vectores,

d)

insertar un primer cassette entre los dos fragmentos de ácido nucleico de los pares que están contenidos en dicha biblioteca de moléculas de vectores para producir una primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión, donde dicho primer cassette contiene al menos un elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido nucleico en una primera célula hospedadora,

e)

introducir dicha primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión en dichas primeras células hospedadoras para producir una primera población de células hospedadoras que, en condiciones apropiadas y en un periodo de tiempo apropiado, expresen una primera biblioteca de secuencias de proteína receptora que contienen, cada una, una secuencia codificada por uno de dichos pares de fragmentos de ácido nucleico unidos,

f)

aislar dicha primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión a partir de dichas primeras células hospedadoras, y

g)

obtener una pluralidad de segmentos que comprenden dichos pares de fragmentos de ácido nucleico unidos y dicho primer cassette entre dichos fragmentos de ácido nucleico unidos sin aislar segmentos individuales de dicha primera biblioteca de moléculas vectores de expresión, e insertar dichos segmentos o una subfracción de los mismos en un segundo vector sin romper la unión entre los fragmentos de ácido nucleico para producir una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión.

2. El método de la reivindicación 1, donde el primer cassette codifica además al menos una secuencia líder de proteínas de membrana o proteínas secretadas unida operativamente a un miembro de dicho par de fragmentos de ácido nucleico unidos.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además cambiar dicho primer cassette por un segundo cassette, donde dicho segundo cassette contiene al menos un elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido nucleico en una segunda célula hospedadora.

4. El método de la reivindicación 3, donde el segundo cassette codifica además secuencias líder de proteínas secretadas o de membrana.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el primero y/o el segundo cassette comprende una secuencia líder-promotor-promotor-líder.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde se transfieren pares de fragmentos de ácido nucleico unidos desde una subfracción de dicha primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión a un segundo vector para producir una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión, habiéndose seleccionado dicha subfracción para codificar una subserie de dominios de unión.

7. Un método para producir una composición que comprende proteínas receptoras o partes de las mismas, donde cada proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones variables asociadas entre sí para formar un dominio de unión, comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

obtener una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6,

b)

introducir dicha segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en una célula hospedadora que puede ser idéntica o diferente de dicha primera célula hospedadora para producir una segunda población de células hospedadoras que, en condiciones apropiadas y en un tiempo apropiado, expresen una segunda biblioteca de secuencias de proteína receptora que contienen, cada una, una secuencia codificada por uno de dichos pares de fragmentos de ácido nucleico unidos,

c)

cultivar dicha segunda población de células hospedadoras en condiciones adecuadas, y

d)

obtener dicha composición que comprende proteínas receptoras o partes de las mismas, donde cada proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones variables asociadas entre sí para forma un dominio de unión.

8. Un método para transferir una biblioteca de segmentos, que codifica regiones variables de proteínas receptoras, desde una primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión a un segundo vector, que comprende las etapas de:

a)

obtener una pluralidad de segmentos a partir de una primera biblioteca de moléculas de vectores de expresión sin aislar segmentos individuales, donde cada segmento contiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes donde cada uno de los fragmentos codifica una región variable o una parte de la misma de una proteína receptora o una parte de la misma, unidos en orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, y un primer cassette entre los dos fragmentos de ácido nucleico, donde dicho primer cassette comprende al menos un elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido nucleico en una primera célula hospedadora, y

b)

insertar dichos fragmentos de ácido nucleico unidos en un segundo vector sin romper la unión entre los fragmentos de ácido nucleico, para producir una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además intercambiar dicho primer cassette por un segundo cassette, donde dicho segundo cassette comprende al menos un elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido nucleico en una segunda célula hospedadora.

10. El método de la reivindicación 9, donde el segundo cassette codifica además secuencias líder de proteínas de membrana o secretadas.

11. El método de la reivindicación 10, donde el cassette comprende una secuencia líder-promotor-promotor-líder.

12. Un método para producir una composición que comprende proteínas receptoras o partes de las mismas, donde cada proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones variables asociadas entre sí para formar un dominio de unión, comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

obtener una segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11,

b)

introducir dicha segunda biblioteca de moléculas de vectores de expresión en una célula hospedadora que puede ser idéntica o diferente de dicha primera célula hospedadora para producir una segunda población de células hospedadoras que, en condiciones apropiadas y en el tiempo apropiado, expresan una segunda biblioteca de secuencias de proteína receptora, comprendiendo cada una una secuencia codificada por uno de dichos fragmentos de ácido nucleico unidos,

c)

cultivar dicha segunda población de células hospedadoras en condiciones adecuadas, y

d)

obtener dicha composición que comprende proteínas receptoras o partes de las mismas donde cada proteína o una parte de la misma contiene un par de regiones variables asociadas entre sí para formar un dominio de unión.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cada par de fragmentos de ácido nucleico unidos codifica porciones de las mismas regiones variables o regiones variables derivadas de dos cadenas diferentes de la misma proteína.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichos fragmentos de ácido nucleico comprenden una población policlonal que codifica regiones variable o porciones de las mismas de proteínas receptoras, incluyendo receptores de células T tales como TcR, receptores de células B incluyendo inmunoglobulinas, receptores de células destructoras naturales, receptores de macrófagos y partes y combinaciones de los mismos.

15. Una biblioteca de moléculas de vectores que comprende:

una pluralidad de moléculas de vectores circulares, donde cada vector circular contiene un segmento que tiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes unidos en orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, donde cada fragmento de ácido nucleico codifica una región variable o una parte de la misma de una proteína receptora, siendo capaces dichas regiones variables de asociarse entre sí para formar un dominio de unión.

16. Una biblioteca de moléculas de vectores de expresión que comprende:

una pluralidad de moléculas de vectores circulares donde cada vector circular contiene un segmento que tiene dos fragmentos de ácido nucleico diferentes unidos en orientaciones transcripcionales opuestas y divergentes, donde se ha insertado un cassette entre los dos fragmentos de ácido nucleico de los pares, donde dicho cassette contiene al menos un elemento promotor que permite la expresión de dichos fragmentos de ácido nucleico, y donde cada fragmento de ácido nucleico codifica una región variable o una parte de la misma de una proteína receptora, siendo capaces dichas regiones variables de asociarse entre sí para formar un dominio de unión.

17. Una biblioteca de moléculas de vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 16, donde el cassette comprende una secuencia líder-promotor-promotor-líder.

18. Una biblioteca de moléculas de vectores de expresión que se puede obtener por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ó 13 ó 14.

19. Una biblioteca de moléculas de vectores de expresión que se puede obtener por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

20. Una biblioteca de células hospedadoras que contiene la biblioteca de moléculas de vectores de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.

21. La biblioteca de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, donde dichos fragmentos de ácido nucleico codifican proteínas no idénticas.

22. La biblioteca de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, donde dichos fragmentos de ácido nucleico codifican anticuerpos policlonales.