WO2004103403A1 - 免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途 - Google Patents

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immunocompetent
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immunocompetent cell
antibody
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Shigeyuki Kon
Toshimitsu Uede
Hongyan Diao
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Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an immunocompetent cell activation inhibitor containing an antibody against genius pontin or a fragment peptide portion thereof, and use thereof.
  • Immunocompetent cells such as B cells, macrophages, dendritic cells, T cells, NKT cells, and neutrophils are involved in the immune system in the body.
  • liver damage Kaneko Y., et al., J. Exp. Med., 2000, Jan 3; 191 (1): 105-14, Nakamura K., et a, J. Hepatol., 2001, Aug; 35 (2): 217-24, Tiegs G., et a, J. Cl in .. Invest. 1992 Jul; 90 (1): 196-203
  • asthma Akbari 0., et al., Nat. Med., 2003, May; 9 (5): 582-8, Linden A., Int. Arch.
  • an object of the present invention is to provide a drug capable of treating the above-mentioned diseases.
  • Inhibitory antibody J is used for the treatment of autoimmune diseases, rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis (W 00 2/08 152 2 pamphlet and WO 03/0 2 7 15 1 pamphlet), tuberculosis diagnosis Agent (JP-A-2003-294735), an agent for preventing tendon and ligament deterioration (Japanese Patent Application No. 2003-389543), a diagnostic agent for interstitial pneumonia (Japanese Patent Application No. 2003-194977), etc. He has filed a patent application first.
  • OPN-inhibiting antibody can be used as a therapeutic agent for diseases caused by activation of immunocompetent cells, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • An immunocompetent cell activation inhibitor containing an antibody against a genius pontin or a fragment peptide portion thereof.
  • a therapeutic agent for a disease caused by activation of immunocompetent cells comprising the immunocompetent cell activation inhibitor according to any one of (1) to (14) as an active ingredient.
  • immunocompetent cell is one or more of immunocompetent cells selected from NKT cells, neutrophils, and T cells.
  • the disease caused by activation of immunocompetent cells is a disease selected from hepatitis, asthma, arthritis, diabetes, lupus, multiple sclerosis, arteriosclerosis, pulmonary fibrosis (15) or (16) The therapeutic agent for the disease described in (16).
  • a therapeutic agent for liver damage comprising the immunocompetent cell activation inhibitor according to any one of (1) to (14) as an active ingredient.
  • liver disorder The therapeutic agent for liver disorder according to (18), wherein the liver disorder is viral hepatitis or drug-induced hepatitis.
  • liver damage The therapeutic agent for liver damage according to (18), wherein the liver damage is autoimmune hepatitis.
  • (22) A method for treating a disease caused by activation of immunocompetent cells, comprising administering the therapeutic agent according to any one of (15) to (17) to a patient having the disease caused by activation of immunocompetent cells.
  • FIG. 1 is a drawing showing ALT values in serum.
  • FIG. 2 is a drawing of hepatitis tissue stained with HE.
  • FIG. 3 is a drawing showing the ratio of the number of necrotic cells in the microscopic field of hepatitis tissue.
  • FIG. 4 is a drawing showing the expression level of OPN in the liver in a hepatitis model mouse.
  • FIG. 5 is a drawing showing the results of a Western plot of the hepatitis model mouse. Arrows indicate trombin-cleaved OPN.
  • FIG. 6 is a drawing showing ALT values in serum of wild-type mice and 0PN-deficient mice after ConA administration.
  • FIG. 7 is a drawing showing the survival rates of wild-type mice and 0PN-deficient mice after administration of ConA.
  • Fig. 8 is a drawing showing the results of intracellular cytoplasmic staining of hepatitis model mice.
  • the left figure shows the results of staining lymphocytes in leukocytes in liver with anti-NK1.1 antibody and TCR antibody.
  • the middle figure (R 1) shows the NKT cell population fraction of NK1.1 + TCR +
  • the right figure (R 2) shows the OPN generation in the T cell population fraction of NK1.1-TCR +.
  • the result of FACS analysis is shown below.
  • Fig. 9 is a drawing showing the results of ELISA for measuring the OPN levels in cell culture supernatants of NKT cells and T cells isolated from the liver of a hepatitis model mouse.
  • Fig. 10 shows the liver of a hepatitis model mouse.
  • 3 is a drawing showing the results obtained by amplifying mRNA extracted from NKT cells and T cells isolated from the inside by RT-PCR, and detecting the OPN receptor and MIP-2 possessed by each cell.
  • FIG. 11 is a drawing showing the results of a cell migration test on trombin-cleaved OPN of liver-infiltrating leukocytes obtained from a hepatitis model mouse and a wild-type mouse.
  • FIG. 12 is a drawing showing the results of a cell migration inhibition test on thrombin-cleaved OPN of liver-infiltrating leukocytes obtained from a hepatitis model mouse.
  • Figure 1 3 is a diagram surface showing the in the liver of hepatitis model mice, the percentage of CD 6 9 + CD 4 + T cells during M 5 antibody and control antibody administration results of the FACS analysis.
  • Fig. 14 shows the number of activated CD4 + T cells calculated from the results of analysis of the number of CD69 + 004 + cells after administration of the M5 antibody and control antibody in the liver of a hepatitis model mouse.
  • Figure 15 shows FACS analysis of neutrophils, CD4 + T cells, and macrophages in liver infiltrating cells 6 hours after administration of ConA to wild-type mice and 0 PN-deficient mice, respectively. 6 is a drawing showing the results calculated in FIG.
  • Figure 16 shows the results of staining liver tissue 24 hours after administration of C0 ⁇ A to wild-type mice.
  • the left figure shows the results of immunostaining using the MP0 antibody.
  • the right figure shows the result of HE staining.
  • Figure 17 shows MPO activity in the culture supernatant of wild-type mice in which full-length OPN, N-half OPN, and C-half PN were added to neutrophils separated by intraperitoneal administration of sodium caseinate. is there.
  • FIG. 18 is a drawing showing the result of calculating the neutrophil count in liver 6 hours after administration of ConA to wild-type mice by FACS analysis.
  • FIG. 19 is a drawing showing the time course of MIP-2 concentration after administration of C0nA to wild-type mice.
  • FIG. 20 is a drawing showing the results of quantifying the expression levels of Nana, a9 integu and J mRNA in the liver after administration of ConA to wild-type mice by real-time PCR (black circles). Is a graph of control antibody administration, and a white circle is a graph after administration of M5 antibody.)
  • FIG. 21 is a drawing showing the result of measuring the amount of IFN in the culture supernatant of NKT cells and T cells of mouse liver by the ELISA method.
  • Figure 22 shows the IFN- ⁇ expression levels in the liver of C on A hepatitis mice to which the M5 antibody was administered and C 0 n A hepatitis mice to which the control antibody was administered.
  • 3 is a drawing showing the results of quantification using the method described in US Pat.
  • FIG. 23 is a drawing comparing the ALT values obtained when 400 Atg of the M5 antibody was administered to each mouse 3 hours before administration of ConA and simultaneously with the administration of C0nA.
  • the immunocompetent cell activation inhibitor of the present invention (hereinafter referred to as “the inhibitor of the present invention”) is an antibody against OPN or a fragment peptide portion thereof (hereinafter referred to as “ ⁇ ⁇ , etc.”) (OPN inhibitory antibody). It is prepared by combining the active ingredient with an appropriate pharmaceutically acceptable carrier ingredient.
  • the 0 PN inhibitory antibody used in the present invention can be used without particular limitation as long as it recognizes 0 P N and the like.
  • Such 0 PN inhibitory antibodies include an integrin that recognizes the RGD sequence and an integrin that recognizes the SVVYGLR sequence while inhibiting the binding between 0 PN and the like.
  • integrins that recognize the RGD sequence such as Q! V j81, av i83, ⁇ ; or inhibit the binding of their N-terminal fragment, and recognizes the SVVYGLR sequence integrin, for example ⁇ 9 ⁇ 4 ⁇ ⁇ , ⁇ 4 ⁇ 7 or the like and OPN- a, OPN- b, OPN- c or their Those that inhibit binding to the N-terminal fragment are preferred.
  • the N-terminal fragment refers to a fragment on the N-terminal side among fragments obtained by degrading OPN by a protease.
  • An example of the proteolytic enzyme is trombin.
  • the above 3 ⁇ ⁇ 0 sequence is a sequence from serine 162 to arginine 168 of human OPN (accession number: J04765).
  • the production method of the OPN-inhibiting antibody in the present invention is not particularly limited as long as it retains the above properties.
  • OPN-a, OPN-b, OPN-c, N-terminal fragment thereof, or Those prepared by using, as an antigen, a peptide containing the amino acid sequence represented by the following (A) or a corresponding sequence thereof (hereinafter, these are collectively referred to as "related peptides”) can be used.
  • the above-mentioned equivalent sequence refers to a sequence corresponding to the sequence (SVVYGLR) from serine No. 16 to arginine No. 168 of human OPN at 0 PN of an animal other than human, for example, Pigs have the same SVVYGLR as the humans, monkeys have the SVAYGLR, monkeys have the SLAYGLR, males have a stomach of 500 to 1, and males have the SVAYRLK.
  • Preferred OPN-inhibiting antibodies for humans are produced, for example, by using a peptide containing the sequence of the above (A) as an antigen. More preferably, for example, the sequence from the valine residue at position 15 to the serine residue at position 169 of 0PN-a (accession number: J04765) having both of these sequences consecutively is preferable. It can be obtained by using peptide (B) as an antigen and treating it according to a conventional method.
  • V DT YDGRGDSVVYGLRS (SEQ ID NO: 2)
  • B a conjugate of the peptide and a biopolymer compound as the antigen.
  • the biopolymer compound to be bound to the 0PN-related peptide include squash shell hemocyanin (hereinafter referred to as “KLH”), ovalbumin (hereinafter referred to as “roVAj”), and ⁇ serum albumin (hereinafter referred to as “BS AJ”).
  • KLH squash shell hemocyanin
  • roVAj ovalbumin
  • BS AJ ⁇ serum albumin
  • RSA Egret serum albumin
  • thyroglobulin thyroglobulin
  • the binding between the OPN-related peptide and the biopolymer compound can be performed, for example, by the mixed anhydride method (BF Erlanger et al., (1954): J. Biol. Chem., 234, 1090-1094) or an activated ester. (AE Karu et a, (1994): J. Agric. Food Chem., 42, 301-309).
  • the mixed acid anhydride used in the mixed acid anhydride method is obtained by subjecting an OPN-related peptide to a usual Schotten-Baumann reaction, and reacting this with a biopolymer compound to obtain the desired peptide.
  • a polymer compound conjugate is produced.
  • the haloformate used in the mixed acid anhydride method include methyl chloroformate, methyl bromoformate, ethyl ethyl chloroformate, ethyl ethyl bromoformate, isobutyl chloroformate and the like.
  • the ratio of the peptide, the haloformate and the polymer compound used in the method can be appropriately selected from a wide range.
  • the Schotten-Baumann reaction is performed in the presence of a basic compound.
  • the basic compound used in the reaction include compounds commonly used in the Schotten-Baumann reaction, such as triethylamine, trimethylamine, pyridine, and the like.
  • Organic bases such as dimethylaniline, N-methylmorpholine, diazabicyclononene (DBN), diazabicycloundecene (DBU), diazabicyclooctane (DABCO), potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydrogen carbonate, carbonate
  • An inorganic base such as sodium hydrogen can be used.
  • the above reaction is usually carried out at a temperature of from 20 ° C. to 100 ° C., preferably from 0 ° C. to 50 ° C., and the reaction time is about 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 2 hours. It is.
  • the reaction between the obtained mixed acid anhydride and the biopolymer compound is usually performed at minus 20 ° C.
  • the reaction is carried out at 150 ° C., preferably at 0 ° C. to 100 ° C., and the reaction time is about 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 5 hours.
  • the mixed acid anhydride method is generally carried out in a solvent, but any solvent commonly used in the mixed acid anhydride method can be used as the solvent, and specifically, dichloromethane, chloroform, dichloroethane, etc.
  • Halogenated hydrocarbons aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, etc., ethers such as getyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, and dimethoxetane; esters such as methyl acetate, ethyl acetate; Aprotic polar solvents such as N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, and hexamethylphosphoric triamide;
  • the activated ester method can be generally performed as follows. First, an OPN-related peptide is dissolved in an organic solvent and reacted with N-hydroxysuccinimide in the presence of a coupling agent to form an N-hydroxysuccinimide-activated ester.
  • the force coupling agent a usual force coupling agent commonly used in a condensation reaction can be used, and examples thereof include dicyclohexylcarpoimide, carbonyldiimidazole, and water-soluble carpoimide.
  • the organic solvent for example, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide, dioxane and the like can be used.
  • the molar ratio of the peptide used for the reaction to the coupling agent such as N-hydroxysuccinimide is preferably 1:10 to 10: 1, most preferably 1: 1.
  • the reaction temperature is 0 to 50 ° C, preferably 22 to 27 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1-2 hours.
  • the reaction can be carried out at a temperature from the melting point to the boiling point.
  • reaction temperature is 0 to 60 ° C, preferably 5 to 40 ° C, more preferably 22 to 27 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1 to 16 hours. The time is more preferably 1-2 hours.
  • the reaction product of the OPN-related peptide and the biopolymer compound By purifying the reaction product of the OPN-related peptide and the biopolymer compound by the above method using a dialysis, desalting column or the like, the 0 PN-related peptide and the biopolymer can be purified.
  • conjugate with the compound (hereinafter sometimes simply referred to as a “conjugate”) can be obtained.
  • an animal in order to prepare the polyclonal antibody of the present invention using the above conjugate, an animal may be immunized with the conjugate and the antibody may be collected from the animal.
  • a conjugate such as an OPN-related peptide-thyroglobulin conjugate is dissolved in sodium phosphate buffer (hereinafter referred to as “PBS”), and this is combined with Freund's complete adjuvant or Freund's incomplete adjuvant.
  • PBS sodium phosphate buffer
  • a mammal is immunized using a mixture of a mouse or an adjuvant such as alum as an immunogen.
  • any animal commonly used in the art can be used, and examples thereof include a mouse, a rat, a rabbit, a goat, and a rabbit.
  • the method of administering the immunogen upon immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or multiple times at appropriate intervals, preferably multiple times at intervals of 1 to 5 weeks.
  • OPN inhibitory antibodies can be obtained by collecting blood from the immunized animal, separating serum, and purifying the polyclonal antibody fraction according to a conventional method.
  • An OPN inhibitory antibody can also be obtained as a monoclonal antibody by obtaining a hybridoma by fusing immunocytes obtained by immunizing an animal with the product and myeloma cells, and collecting an antibody from a culture of the hybridoma.
  • the above-mentioned OPN inhibitory antibody is genetically modified by a conventional method so that the constant region of the antibody has the same constant region as that of the human antibody to be treated, and the chimeric antibody (European Patent Publication EP 0 1 ⁇ As a humanized antibody (see European Patent Publication EP 0 239 400 or EP 0 415 126, International Publication WO 03 027 151) Is also good.
  • the OPN inhibitory antibody thus obtained can be used in the form of Fv, & 13 & (ab ') 2 in which the antigen-recognition region has been cut out with a protease or the like.
  • an OPN inhibitory antibody corresponding to the mouse OPN is preferably an RGDSLAYGLR sequence. It is produced by using a peptide containing as an antigen.
  • the inhibitor of the present invention described above contains the above 0PN inhibitory antibody as an active ingredient. By combining this with a pharmaceutically acceptable carrier and formulating it in a conventional manner, the immunocompetent cell A therapeutic agent for a disease caused by activation (hereinafter referred to as "the therapeutic agent of the present invention”) is obtained.
  • the dose of the 0 PN inhibitory antibody to the patient in the therapeutic agent of the present invention varies depending on the severity of the patient's condition, age, dosage form of the preparation to be used, or the binding titer of the antibody. 1 to "! About 0. 0 mg / kg, preferably about 0.5 to 80 mg Z kg. Therefore, it is preferable to formulate the drug in an amount suitable for this.
  • the mold include parenteral preparations such as injections and ophthalmic preparations, to which other optional ingredients usually used in the production of pharmaceutical compositions are added as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • Such optional components include, for example, adsorbents, preservatives, antioxidants, buffers, chelating agents, coloring agents, emulsifiers, flavoring / flavoring agents, curing agents, surfactants, and suspensions. Agents, sweeteners, lubricants, excipients, coating agents, fluidization , Brightening agents, tonicity agents, binders, bulking agents, etc.
  • the immunocompetent cells whose activation is inhibited by the inhibitor of the present invention thus obtained include macrophages, T cells, NKT cells, Among these immunocompetent cells, it preferably inhibits the activation of T cells, NKT cells, and neutrophils, and the inhibitor of the present invention is caused by the activation of the immunocompetent cells. Inhibition of Fas / FasL cell damage and neutrophil-mediated cell damage.
  • the disease treated or improved by the therapeutic agent of the present invention is not particularly limited.
  • examples include liver injury, asthma, arthritis, diabetes, lupus, multiple sclerosis, arterial sclerosis, pulmonary fibrosis, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention can suitably suppress liver cell necrosis among these diseases, so that it is an effective treatment for liver damage such as viral hepatitis and drug-resistant hepatitis, especially for acute liver damage such as autoimmune hepatitis.
  • Be a medicine Although the mechanism of action of the inhibitor or therapeutic agent of the present invention is unknown, it is believed that activation of immunocompetent cells directly or indirectly caused by 0PN degraded by OPN or proteolytic enzymes, etc.
  • Antibodies to OPN, OPN, etc. are considered to be inhibited.
  • liver injury As a specific example.
  • ConA concanapalin A
  • NKT cells in the liver produce OPN as shown in the Examples below.
  • the OPN produced here is decomposed by a proteolytic enzyme or the like to become a 0PN fragment peptide.
  • 0PN or the like activates NKT cells in an autocrine manner, 1 ⁇ 1 cells produce 1FN- ⁇ . It is known that this IFN-a has the following effects (Hong F., et al., J. Clin. Invest. 2002 Nov; 110 (10): 1503-13).
  • NKT cells produce IL-14 when activated (Kaneko ⁇ ⁇ , et al., J. Exp. Med., 2000, Jan 3; 191 (1): 105 -14), then I One-
  • N4 acts on NK T cells in a highly selective manner, and as a result, NK T cells express the F a s ligand. And NKT cells will cause FasZFasL-mediated cytotoxicity to hepatocytes.
  • NK T cells by the activation of NK T cells by the above-described OPN or the like, NK T cells produce MIP-2 (Macrophageinef Iammato.ryprotine-2). This MIP-2 is known to promote neutrophil migration and accumulation (Xiao YQ., Et al., Biochim. Biophys. Acta. 1997 Aug 22: 1361 (2): 138-46.) As a result, active oxygen produced by neutrophils causes damage to hepatocytes (neutrophil-mediated cytotoxicity).
  • an OPN-inhibiting antibody which is an active ingredient of the inhibitor or therapeutic agent of the present invention, binds to OPN or a fragment peptide portion thereof, and is activated by OPN or the like. It can inhibit the activation of immunocompetent cells such as neutrophils.
  • the OPN inhibitory antibody can also inhibit IFN-cell production, MIP-2 production, and I-IV production of NKT cells by inactivating immunocompetent cells as described above. .
  • the 0 [ ⁇ inhibitory antibody inhibits the production of 1 ⁇ 1 IP-2, thereby inhibiting neutrophil migration and MPO production, and subsequent neutrophil-mediated cytotoxicity. Can be.
  • VDTYDGRGDSVVYGLRS SEQ ID NO: 2
  • This 2 peptide has an RGD and SVVYGL sequence that recognizes avj83 and ⁇ 9) 81 integrin receptor.
  • the 2-1 peptide was bound to thyroglobulin, which was used to immunize mice according to a conventional method.
  • the method selected eightybri dorma. Selection was performed by selecting a hybridoma that responded to immobilized GST / 0PNa and 0PNa—a derived from CHO cells, but did not appear to respond to GST.
  • OPN inhibitory antibody was administered to a hepatitis model mouse artificially prepared by administering ConA to a wild-type mouse, and the effect was confirmed.
  • the 2K1 antibody against human OPN cannot be used as it is. Therefore, it corresponds to the internal sequence (C + V138 to R153) of the following mouse genius bontin having the SLAYGLR sequence of mouse OPN corresponding to the SV VY GLR sequence of human OPN and the RGD sequence.
  • a synthetic peptide (M5 peptide) was prepared, and an M5 antibody was produced and used in the same manner as in Example 1.
  • M5 peptide C V D V P N G R G D S L A Y G L R (SEQ ID NO: 3)
  • M5 antibody was intravenously administered to BAL BZc mice (6 weeks old, female), which had been fasted overnight, at 400 At mice 3 hours before administration of ConA.
  • the control group received the same volume of Egret IgG. C on A was then administered intravenously in 300 animals.
  • Serum was collected 2, 6, 12 and 24 hours after M5 antibody administration, and the ALT value in the serum was measured.
  • the results are shown in FIG.
  • the ratio of the number of necrotic cells in the microscopic field of hepatitis tissue was about 10% for the liver to which the M5 antibody was administered, while 50% for the liver to which the heron IgG was administered. ( Figure 3).
  • the ALT value was about 1,500 when the M5 antibody was administered, which was lower than that of the control, which was about 5,000 (Fig. 1).
  • the M5 antibody was found to suppress hepatitis necrosis due to hepatitis.
  • the M5 antibody against mouse OPN suppressed hepatocyte necrosis, indicating that the 2K1 antibody against human 0 PN can also suppress hepatocyte necrosis due to human hepatitis. did.
  • the hepatitis mouse model was prepared by administering 15 mgZ kg of ConA to wild-type mice to the tail vein.
  • the expression of 0 PN in the liver of the hepatitis model mouse was determined by ELISA using mO PNELISA kit (manufactured by Immune Biology Laboratories) and an anti-genius steobontin antibody (manufactured by Immune Biology Laboratories). Analysis was performed using the Western blot method.
  • Figure 4 shows the results of the ELISA method.
  • Figure 5 shows the results of the Western plot.
  • ALT levels in serum were measured in the same manner as in 2.
  • survival rates after administration of 400 ⁇ g Z of C on ⁇ were compared.
  • Figure 6 shows the results of the ALT value measurement. did.
  • Figure 7 shows the results of the survival rate.
  • liver of a hepatitis model mouse prepared by injecting 300 g of Con A into the tail vein was removed (6 hours), homogenized, and passed through a mesh. Then, after washing with PBS, the cells were added to 33% Percol I containing heparin (1OO UZml) to remove hepatocytes, and treated at 2,000 rpm for 15 minutes to remove the cell pellet. Was prepared. The obtained cell pellet was treated with a red blood cell hemolysis buffer (hereinafter referred to as “HLB solution J”) (manufactured by Immune Biology Laboratories) to lyse the red blood cells, and these were further washed with PBS three times. After washing, liver-infiltrating leukocytes were prepared in addition to D-ME / 10% FCS.
  • HLB solution J red blood cell hemolysis buffer
  • the liver-infiltrating leukocytes prepared in (1) above were cultured for 90 minutes in the presence of monensin, and cell surface molecules were detected with an anti-NK1.1 antibody and an anti-TCR jS antibody (both from PharMingen). Stained. Then, fixed for 10 minutes in 4% paraformaldehyde, saponin buffer permeabilized with (1% FCS, 0. 1% saponin, PBS solution containing 0. 1% N a N 3) was performed. Furthermore, a bitinylated OPN inhibitory antibody (manufactured by Immune Biology Laboratories, Inc.) was added, and streptavidin-APC (manufactured by Jackson) was used as a secondary antibody. iber: BD).
  • FIG. 8 shows the results of intracellular cytoplasmic staining of hepatitis model mice.
  • FIG. 9 shows the measurement results of the cell culture supernatant by ELISA.
  • Intracellular cytoplasmic staining confirmed that OPN was expressed in the cells of the NKT cell population, which is NK1.1 + TCR +.
  • OPN expression was detected in the NKT cell population of NK1.1 + TCR + by ELISA measurement of the amount of 0 PN in the cell culture supernatant, but in the T cell population of NK1.1-TCR + No OPN expression was detected.
  • OPN-producing cells in the liver were mainly NKT cells.
  • a cell migration test was carried out on a thrombin digest of liver infiltrating leukocytes.
  • 1 OgZmI of hepatitis-infiltrating leukocytes of the hepatitis model mouse prepared in Example 5 was supplemented with lO ig / ml and trombin (T hr), respectively, with 0 PN (r0PN: uncleaved OPN).
  • T hr lO ig / ml and trombin
  • 0PN r0PN: uncleaved OPN
  • the cell migration effect of cells obtained from a hepatitis model mouse on the thrombin digest of OPN (T hr — OPN) 10 / g / mI was measured using the M5 antibody obtained in Example 2, 1 ⁇ 11 Antibody (0—17) (manufactured by Institute of Immunology), anti-integrin / 31 (HM ⁇ ⁇ ) antibody, anti-) 83 (HMj83) antibody, anti- ⁇ (R ⁇ V-7) )
  • the antibody and anti- ⁇ 4 (R ⁇ -2) antibody both manufactured by PharMingen) were inhibited by 100 ⁇ g gZml. The results are shown in FIG.
  • FIG. 14 shows the number of activated CD 4 + T cells calculated from the analysis results.
  • FIG. 15 shows the calculated numbers of neutrophils, CD 4 + T cells, and macrophages in each mouse.
  • Liver tissue obtained from a hepatitis model mouse was embedded in paraffin, sliced into 5 m sections, and treated with endogenous peroxidase. Then, an anti-MPO antibody (manufactured by DAKO) was reacted with the slice as a primary antibody overnight at 4 ° C. Next, immunostaining was performed by reacting ENVISON (made by DAKO) as a secondary antibody.
  • Full-length mouse OPN (L17-N294) is cleaved by trombin at R154 and S155, and N-terminal OPN (L17-R154) at the N-terminal end C half-terminal OPN (S155-N294) on the C-terminal side was prepared by the following method to obtain a GST fusion protein.
  • the N half OPN and C half OPN were recloned from mouse kidney cDNA by PCR using the following primers (SEQ ID NOS: 12 to 15).
  • Full length mouse O P N
  • the PCR product obtained using the above primers was digested with restriction enzymes BamHI and XhoI, then introduced into pGEX6P-1 vector-1 (Amersham), and ABI31 The sequence was confirmed using 0 Genetic Analyzer automatic sequencer (Applied Biosystems). Next, this sequence was introduced into Escherichia coli JMl09 to transform Escherichia coli, and the GST-fused 0PN protein was purified by a conventional method.
  • MPO myelin peroxidase activity was measured from the culture supernatant in which neutrophils were stimulated with 20 / X g / ml of the GST-fused OPN protein for 36 hours.
  • IFN-T in the culture supernatant of NKT cells and T cells isolated from the ConA-administered mice was measured using an IFN- ⁇ EIA kit (Pharmingen). The results are shown in FIG. As a result of analysis of IFN- ⁇ -expressing cells in the liver, it was confirmed that IFN-I was mainly produced from NKT cells.
  • NKT cells were the main OPN-producing cells in the hepatitis of mice generated by administering ConA.
  • the administration of 0PN inhibitory antibody was found to inhibit the production of IFN- ⁇ and MIP-2, and as a result, it was possible to inhibit the activation of NKT cells.
  • NKT cells since activation of NKT cells can be inhibited, it is considered that production of IL-4 can also be inhibited. In addition, it inhibits the activation of CD4 + T cells and neutrophils associated with the activation, It was found that FasZFasL-mediated cytotoxicity and neutrophil-mediated cytotoxicity associated with their activation could also be inhibited.
  • mouse OPN-inhibiting antibodies show inhibitory effects on NKT cell activation, CD4 + T cell activation, neutrophil activity, etc., and are caused by the activation of immunocompetent cells. Therefore, it was suggested that a human OPN inhibitory antibody (2K1 antibody) could similarly treat a disease.
  • the immunocompetent cell activation inhibitor of the present invention inhibits the activation of immunocompetent cells.

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Abstract

本発明はＯＰＮまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤および前記阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬ならびにそれを用いた治療法に関する。本発明によれば免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患、例えば肝障害、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症等を治療しうる薬剤等を提供することができる。

Description

一 一
免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途 技術分野
本発明は、 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメン卜べプチド部分に対する抗 体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途に関する。
明 背景技術
B細胞、 マクロファージ、 樹状細胞、 T細書胞、 N KT細胞、 好中球等の免疫担 当細胞は、 体内の免疫系等に関与するものである。
しかし、 これら免疫担当細胞が異常に活性化することにより、 種々の疾患、 例 えば、 肝障害 (Kaneko Y.， et al.， J. Exp. Med. , 2000, Jan 3 ; 191 (1) : 105 - 14 、 Nakamura K. , et aに， J. Hepatol. , 2001, Aug;35 (2) :217-24, Tiegs G. , et aに， J. Cl in.. Invest. 1992 Jul ;90 (1) :196-203) 、 喘息 (Akbari 0.， et al.， Nat. Med. , 2003， May ; 9 (5) : 582- 8、 Linden A.， Int. Arch. Al lergy Immunol. , 2001， Nov;126(3) :179-84, Corrigan CJ. , Chem. Immunol. , 2000;78:39-49) 、 関節炎 (Chiba A. , et aに， Infect. Immun. , 2003， Oct ;71 (10) :5447- 55、 Nurieva Rに， J. CI in. Invest. , 2003, ar;111 (5) :701-6 Taylor PC. , Curr. Opin. Pharmacol. , 2003， Jun ; 3 (3) : 323-8. ) 、 糖尿病 (Hong S. , et aに， Nat. Med. 2001, Sep;7 (9) : 1052- 6 、 Hahn HJ. , Diabetes Metab. Rev. , 1993， Dec;9 (4) :323-8) 、 狼瘡 (Zeng D， J Clin invest. 2003 0c t ; 112 (8) : 1211— 22、 Olive D.， et aし， Crit. Rev. Ther Drug Carrier Syst.. 1993;10 (1) :29-63) 、 多発性硬化症 (Singh AK. , J. Exp. Med. , 2001, Dec 17 ; 194 (12) : 1801-1 K Maatta JA. , et aに， J. Neuro i mmuno I . , 1998, Oct 1 ;90 (2) :162-75 , Mi I ici AJ.， wt aに， Lab. Invest. , 1998, 0ct;78(10) :1239-44) 、 動脈硬化 (Tupin E.， et aに， J. Exp. Med. , 2004, Feb 2; 199 (3) :417- 22) 、 肺線維症 (Keane MP. , et al. , J. Immunol. , 1999, May 1 ;162 (9) :5511-8 , Hu H.， et al. , J Leukoc. Biol. , 1993, Nov; 54(5) :414-22) 等の疾患が引き起こされることが示 唆されている。
上記のような免疫担当細胞の活性化等によリ引き起こされる疾患は、 発症のメ 力二ズ厶が複雑であるため治療が困難であることが多かった。
従って、 本発明は上記疾患を治療しうる薬剤を提供することをその課題とする
発明の開示
本出願人らは、 先に、 骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖蛋白質で ある才ステオボンチン （以下、 Γθ Ρ Ν」 という） またはそのフラグメントぺプ チド部分に対する抗体 （以下、 ΓΟ Ρ Ν阻害抗体 J という） が、 自己免疫疾患、 リゥマチおよびリゥマチ性関節炎の治療 （W 00 2/08 1 5 2 2号パンフレ ッ 卜および WO 0 3/0 2 7 1 5 1号パンフレツ卜） 、 結核診断剤 （特開 20 03 - 294735号公報） 、 腱 ·靱帯の劣化予防剤 （特願 2003— 389 5 43号） 、 間質性肺炎診断剤 （特願 2003 - 1 94977号） 等として利用し うることを見出し、 先に特許出願をしている。
更に本出願人らは、 O P N阻害抗体の利用を拡大すべく、 鋭意研究を行ってい たところ、 0 P Nまたはそのフラグメントべプチド部分が前記の免疫担当細胞の 活性化に関与していることを見出した。 そして、 0 P N阻害抗体で 0 P Nまたは そのフラグメントべプチド部分を阻害することによリ免疫担当細胞の活性化を抑 制することを見出した。
また、 この O P N阻害抗体を利用することで、 免疫担当細胞の活性化を原因と する疾患等の治療薬となることを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメントぺプチド部分に対する抗体を 含有する免疫担当細胞活性化阻害剤。
(2) 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメントぺプチド部分に対する抗体が 、 R G D配列を認識するインテグリンとォステ才ボンチンまたはそのフラグメン 卜との結合を阻害し、 かつ S V V Y G L R配列を認識するインテグリンと才ステ 才ポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である （1 ) 記載の 一
免疫担当細胞活性化阻害剤。
(3) 才ステオボンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、 才ステ才ポ ンチンの N末端フラグメン卜である （ Ί ) 記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(4) 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、 次の （A) で示されるペプチドを含むペプチドである （ 1 ) 記載の免疫担当細胞活性化阻害 剤。
(A) R G D S VVYG L R
(5) 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、 次の （B) で示されるペプチドを含むペプチドである （ 1 ) 記載の免疫担当細胞活性化阻害 剤。
( B ) V DTY DG R G DS VVYG L R S
(6) 免疫担当細胞が、 N KT細胞である （1 ) ないし （5) の何れかに記載 の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(7) 1\11 丁細胞の 1 F N—ァ産生を阻害するものである （6) 記載の免疫担 当細胞活性化阻害剤。
(8) N KT細胞の M l P— 2産生を阻害するものである （6) 記載の免疫担 当細胞活性化阻害剤。
(9) N KT細胞の I L— 4産生を阻害するものである （6) 記載の免疫担当 細胞活性化阻害剤。
(1 0) 免疫担当細胞が、 好中球である （ 1 ) ないし （5) の何れかに記載の免 疫担当細胞活性化阻害剤。
(1 1 ) 免疫担当細胞が、 T細胞である （ 1 ) ないし （5) の何れかの項記載の 免疫担当細胞活性化阻害剤。
(1 2) T細胞が、 C D 4+T細胞である （ 1 1 ) 記載の免疫担当細胞活性化阻 害剤。
(1 3) F a s / F a s L媒介細胞障害を阻害するものである （ 1 ) ないし （ 1 2 ) の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(1 4) 好中球媒介細胞障害を阻害するものである （ 1 ) ないし （ 1 2) の何れ かに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。 (1 5) (1 ) ないし （ 1 4) の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有 効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬。
(1 6) 免疫担当細胞が、 N KT細胞、 好中球、 T細胞から選ばれる免疫担当細 胞の 1種以上である （ 1 5) 記載の疾患の治療薬。
( 1 7) 免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患が、 肝炎、 喘息、 関節炎、 糖尿 病、 狼瘡、 多発性硬化症、 動脈硬化、 肺線維症から選ばれる疾患である （1 5) または （ 1 6) 記載の疾患の治療薬。
( 1 8) ( 1 ) ないし （ 1 4) の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有 効成分とする肝障害の治療薬。
(1 9) 肝障害が、 ウィルス性肝炎または薬物性肝炎である （1 8) 記載の肝障 害の治療薬。
(20) 肝障害が、 自己免疫性肝炎である （1 8) 記載の肝障害の治療薬。
(2 1 ) 肝細胞の壊死を抑制するものである （ 1 8) ないし （20) の何れかに 記載の肝障害の治療薬。
(2 2) 免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の患者に、 （1 5) ないし （ 1 7) の何れかに記載の治療薬を投与することを特徴とする当該疾患の治療方法。
(2 3) 肝障害患者に、 （1 8) ないし （2 1 ) の何れかに記載の肝障害の治療 薬を投与することを特徴とする肝障害の治療方法。 図面の簡単な説明
図 1 は、 血清中の A L T値を示す図面である。
図 2は、 H E染色した肝炎組織の図面である。
図 3は、 肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死の細胞数の比率を示す図面である。 図 4は、 肝炎モデルマウスにおける肝臓内の O P Nの発現量を示す図面である 図 5は、 肝炎モデルマウスのウェスタンプロットの結果を示す図面である。 矢 印は、 卜ロンビン切断型 O P Nを示している。
図 6は、 野生型マウスおよび 0 P N欠損マウスの C o n A投与後の血清中の A L T値を示す図面である。 一
図 7は、 野生型マウスおよび 0 P N欠損マウスの C o n A投与後の生存率を示 す図面である。
図 8は、 肝炎モデルマウスの細胞内サイ卜力イン染色の結果を示す図面である (左図は肝臓内白血球中のリンパ球を抗 N K 1 . 1抗体と T C R抗体とで染色し た結果を示す。 中央図 （R 1 ) は N K 1 · 1 +T C R+である N KT細胞集団画分 、 右図 （R 2) は、 N K 1 . 1— TC R+である T細胞集団画分における O P N発 現を F AC S解析した結果を示す。 ） 。
図 9は、 肝炎モデルマウスの肝臓内から分離した N K T細胞および T細胞の細 胞培養上清中における O P N量を E L I S A法で測定した結果を示す図面である 図 1 0は、 肝炎モデルマウスの肝臓内から分離した N K T細胞および T細胞か ら抽出した mR NAを RT— P C R法にて増幅させ、 各々の細胞が有する O P N 受容体および M I P— 2を検出した結果を示す図面である。
図 1 1 は、 肝炎モデルマウスおよび野生型マウスから得られた肝浸潤白血球の 卜ロンビン切断型 O P Nに対する細胞遊走試験の結果を示す図面である。
図 1 2は、 肝炎モデルマウスから得られた肝浸潤白血球の卜ロンビン切断型 O P Nに対する細胞遊走阻害試験の結果を示す図面である。
図 1 3は、 肝炎モデルマウスの肝臓内における、 M 5抗体およびコントロール 抗体投与時の C D 6 9 + C D 4 + T細胞の割合を F A C S解析した結果を示す図 面である。
図 1 4は、 肝炎モデルマウスの肝臓内における、 M 5抗体およびコントロール 抗体投与時の C D 6 9 + 004+丁細胞数をド八05解析した結果から、 活性化 C D 4 + T細胞数を算出した結果を示す図面である。
図 1 5は、 野生型マウスと 0 P N欠損マウスにそれぞれ C o n Aを投与してか ら 6時間後の肝臓内浸潤細胞中の好中球、 C D 4+T細胞、 マクロファージ数を 、 F A C S解析にて算出した結果を示す図面である。
図 1 6は、 野生型マウスに C 0 π Aを投与してから 24時間後の肝臓組織を染 色した結果を示す図面である （左図は、 M P 0抗体を用いて免疫染色した結果を 示し、 右図は H E染色した結果を示す。 ） 。 図 1 7は、 野生型マウスの腹腔内にカゼインナトリウムを投与して分離した好 中球に全長 O P N、 Nハーフ O P N、 および Cハーフ 0 P Nを添加した培養上清 中の M P O活性を示す図面である。
図 1 8は、 野生型マウスに C o n Aを投与してから 6時間後の肝臓内好中球数 を F AC S解析にて算出した結果を示す図面である。
図 1 9は、 野生型マウスへの C 0 n A投与後の M I P— 2濃度の経時変化を示 す図面である。
図 20は、 野生型マウスへの C o n A投与後の肝臓内におけるな 4、 a 9イン テグ、 Jン m R N Aの発現量をリアルタイ厶 P C Rで定量した結果を示す図面であ る （黒丸はコントロール抗体投与のグラフ、 白丸は M 5抗体投与後のグラフであ る。 ） 。
図 2 1 は、 マウス肝臓の N K T細胞および T細胞の培養上清中における I F N 一ァ量を E L I S A法で測定した結果を示す図面である。
図 2 2は、 M 5抗体を投与した C o n A肝炎マウスと、 コントロール抗体を投 与した C 0 n A肝炎マウスにおける肝臓中の I F N— τ発現量を I F Ν—ァ Ε I A K i t (P h a r m i n g e n製） を用いて定量した結果を示す図面であ る。
図 23は、 400 At gの M 5抗体を、 C o n Aを投与する 3時間前と C 0 n A の投与と同時に各マウスに投与した場合の A L T値を比較した図面である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の免疫担当細胞活性化阻害剤 （以下、 「本発明阻害剤」 という） は、 O P Nまたはそのフラグメン卜ペプチド部分 （以下、 ΓΟ Ρ Ν等」 という） に対す る抗体 （O P N阻害抗体） を有効成分とし、 これを適当な薬学的に許容される担 体成分と組み合わされることにより調製される。
本発明において用いられる 0 P N阻害抗体は、 0 P N等を認識するものであれ ば特に制限無く使用することができる。
このような 0 P N阻害抗体としては、 R G D配列を認識するインテグリンと 0 P N等との結合を阻害し、 かつ、 S V V Y G L R配列を認識するインテグリンと O P N等との結合を阻害するものが好ましく、 特に R G D配列を認識するインテ グリン、 例えば Q! V j8 1 、 a v i8 3、 α ν ;8 5等と O P N— a、 O P N— b、 O P N— cまたはそれらの N末端フラグメントとの結合を阻害し、 かつ、 S V V Y G L R配列を認識するインテグリン、 例えば α 9 β 4 β ^ , α 4 β 7等と O P N— a、 O P N— b、 O P N— cまたはそれらの N末端フラグメントとの結 合を阻害するものが好ましい。
ここで N末端フラグメン卜とは、 0 P Nがタンパク質分解酵素等により分解さ れたフラグメントのうち N末端側のフラグメントをいう。 上記タンパク質分解酵 素としては、 例えば卜ロンビンが挙げられる。 また、 上記の3 ^丫0し [¾配列 は、 ヒ卜 O P N (ァクセッションナンバー： J 04 7 6 5) の 1 6 2番目のセリ ンから 1 6 8番目のアルギニンまでの配列である。
本発明における O P N阻害抗体は、 上記のような性質を保持する抗体であれば 、 その製法は特に限定されず、 例えば O P N— a、 O P N— b、 O P N— cや、 これらの N末端フラグメント、 あるいは次の （A) で示されるアミノ酸配列また はその相当配列を含んでいるペプチド （以下、 これらを ΓΟ Ρ Ν関連ペプチド」 と総称する） を抗原として用いることにより作製されたものが使用できる。
R G D S V V Y G L R (配列番号 1 ) (A)
なお、 上記の相当配列とは、 ヒ卜以外の動物の 0 P Nにおける、 ヒ卜 O P Nの 1 6 2番目のセリンから 1 6 8番目のアルギニンまでの配列 （S V V Y G L R) に相当する配列をいい、 例えばブタではヒ卜と同じく S V V Y G L R、 サルでは S V AY G L R、 マウスゃラッ卜では S L A Y G L R、 ゥシでは5 丫0し 1 、 ゥサギでは S V A Y R L Kである。
ヒ卜についての好ましい O P N阻害抗体は、 例えば、 上記 （A) の配列を含ん でいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。 より好ましくは、 例 えばこの両配列を連続して有する 0 P N— a (ァクセッションナンバー： J 0 4 7 6 5 ) の 1 5 3番目バリン残基から 1 6 9番目セリン残基までのぺプチド （B ) を抗原として用い、 以下常法に従って処理することによって得ることができる
V DT Y D G R G D S V V Y G L R S (配列番号 2 ) (B) また、 O P N阻害抗体の作製にあたり、 O P N関連ペプチドの抗原性を高める ためには、 当該べプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いること が好ましい。 この 0 P N関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例として は、 スカシ貝のへモシァニン （以下 「K L H」 という） 、 卵白アルブミン （以下 、 roVAj という） 、 ゥシ血清アルブミン （以下 「B S AJ という） 、 ゥサギ 血清アルブミン （以下 「R S A」 という） およびサイログロブリン等が挙げられ 、 このうち K L Hおよびサイログリブリンがより好ましい。
上記 O P N関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、 例えば、 混合酸無水 物法 （B. F. Erlanger et al.， (1954)： J. Biol. Chem. , 234, 1090- 1094)また は活性化エステル法 （A. E. Karu et aに， (1994)： J. Agric. Food Chem., 42, 301-309) 等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、 O P N関連べプチドを通 常のショッテン一バウマン反応に付すことにより得られ、 これを生体高分子化合 物と反応させることにより目的とするぺプチドー高分子化合物結合体が作製され る。 この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、 例えば クロ口蟻酸メチル、 ブロモ蟻酸メチル、 クロ口蟻酸ェチル、 ブロモ蟻酸ェチル、 クロ口蟻酸イソブチル等が挙げられる。 当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸ェ ステルと高分子化合物の使用割合は、 広い範囲から適宜選択され得る。
なお、 ショッテン一バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、 当該 反応に用いられる塩基性化合物としては、 ショッテン一バウマン反応に慣用の化 合物、 例えば、 卜リエチルァミン、 卜リメチルァミン、 ピリジン、 ジメチルァニ リン、 N—メチルモルホリン、 ジァザビシクロノネン （D B N) 、 ジァザビシク ロウンデセン （D B U) 、 ジァザビシクロオクタン （D A B C O) 等の有機塩基 、 炭酸カリウム、 炭酸ナ卜リウ厶、 炭酸水素カリウム、 炭酸水素ナトリウム等の 無機塩基等を使用することができる。
また、 上記反応は、 通常、 — 2 0°Cから 1 0 0°C、 好ましくは 0 °Cから 5 0 °C において行われ、 反応時間は 5分から 1 0時間程度、 好ましくは 5分から 2時間 である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、 通常マイナス 2 0 °Cか 一 一
ら 1 5 0 °C、 好ましくは 0 °Cから 1 0 0 °Cにおいて行われ、 反応時間は 5分から 1 0時間程度、 好ましくは 5分から 5時間である。 混合酸無水物法は一般に溶媒 中で行われるが、 溶媒としては、 混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒 も使用可能であり、 具体的にはジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジクロロエタン 等のハロゲン化炭化水素、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等の芳香族炭化水素類 、 ジェチルエーテル、 ジ才キサン、 テ卜ラヒドロフラン、 ジメ卜キシェタン等の エーテル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチル等のエステル類、 N， N—ジメチルホルム アミド、 ジメチルスルホキシド、 へキサメチルリン酸卜リアミド等の非プロトン 性極性溶媒等が挙げられる。
—方、 活性化エステル法は、 一般に以下のように行うことができる。 まず、 O P N関連べプチドを有機溶媒に溶解し、 カツプリング剤の存在下にて N—ヒドロ キシコハク酸イミドと反応させ、 N—ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステル を生成する。
力ップリング剤としては、 縮合反応に慣用されている通常の力ップリング剤を 使用でき、 例えば、 ジシクロへキシルカルポジイミド、 カルボニルジイミダゾー ル、 水溶性カルポジイミド等が挙げられる。 また、 有機溶媒としては、 例えば N , N—ジメチルホルムアミド （D M F ) 、 ジメチルスルホキシド、 ジ才キサン等 が使用できる。 反応に使用するペプチドと N—ヒドロキシコハク酸イミド等の力 ップリング剤のモル比は好ましくは 1 ： 1 0 ~ 1 0 ： 1、 最も好ましくは 1 ： 1 である。 反応温度は、 0〜 5 0 °C、 好ましくは 2 2〜2 7 °Cで、 反応時間は 5分 〜 2 4時間、 好ましくは 1 〜 2時間である。 反応温度は各々の融点以上沸点以下 の温度で行うことができる。
カツプリング反応後、 反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応さ せると、 例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、 当該アミノ基 とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。 反応温度は、 0 〜 6 0 °C、 好ましくは 5 ~ 4 0 °C、 よリ好ましくは 2 2〜 2 7 °Cで、 反応時間は 5分〜 2 4時間、 好ましくは 1 ~ 1 6時間、 より好ましくは 1 ~ 2時間である。 上記の方法による O P N関連ペプチドと生体高分子化合物との反応物を、 透析 、 脱塩カラム等によって精製することにより、 0 P N関連ペプチドと生体高分子 一 -
化合物との結合物 （以下、 単に 「結合物」 ということがある） を得ることができ る。
次に、 上のようにして得られた結合物を抗原とする抗体の調製にあたっては、 公知の方法、 例えば続生化学実験講座、 免疫生化学研究法 （日本生化学会編） 等 に記載の方法を適宜利用することができる。
すなわち、 上記結合体を使用して、 本発明のポリクローナル抗体を作製するに は、 当該結合物で動物を免疫し、 当該動物から抗体を採取すれば良い。
例えば、 まず、 O P N関連ペプチド—サイログロブリン結合物等の結合物をリ ン酸ナ卜リウ厶緩衝液 （以下、 「P B S」 という） に溶解し、 これとフロイン卜 完全アジュバン卜またはフロイン卜不完全アジュバン卜、 あるいはミョゥバン等 の補助剤とを混合したものを、 免疫原として用いて、 哺乳動物を免疫する。 免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用でき るが、 例えば、 マウス、 ラッ卜、 ゥサギ、 ャギ、 ゥマ等を挙げることができる。 また、 免疫の際の免疫原の投与法は、 皮下注射、 腹腔内注射、 静脈内注射および 筋肉内注射のいずれでもよいが、 皮下注射または腹腔内注射が好ましい。 免疫は 、 1回または適当な間隔で複数回、 好ましくは 1週間ないし 5週間の間隔で複数 回、 行うことができる。
次いで、 常法に従い、 免疫した動物から血液を採取して、 血清を分離し、 ポリ クローナル抗体画分を精製することによリ、 O P N阻害抗体を得ることができる また、 常法に従い、 前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、 ミエローマ 細胞とを融合させてハイプリ ドーマを得、 当該ハイプリ ドーマの培養物から抗体 を採取することによってモノクローナル抗体として O P N阻害抗体を得ることも できる。
更に、 上記した O P N阻害抗体は常法により上記抗体の定常領域を治療対象と するヒ卜の抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変してキメラ抗体 (欧州特許公開公報 E P 0 1 2 5 0 2 3参照） ゃヒ卜化抗体 （欧州特許公開公 報 E P 0 2 3 9 4 0 0または E P 0 4 5 1 2 6、 国際公開公報 W O 0 3 0 2 7 1 5 1参照） としてもよい。 更にまた、 このようにして得られた O P N阻害抗体については、 さらに抗原認 識領域をプロ一テアーゼ等で切り出した F v、 & 13ゃ ( a b ' ) 2のかたち で用いることもできる。
一方、 実験動物としてマウスを用い、 0 P Nに関連する疾患等の研究を行う場 合は、 マウスの O P Nに対応する O P N阻害抗体を用いることが望ましく、 その ような抗体は、 好ましくは、 R G D S L A Y G L R配列を含んでいるペプチドを 抗原として用いることにより作製される。 以上説明した本発明阻害剤は、 上記 0 P N阻害抗体を有効成分とするものであ るが、 これを薬学的に許容される担体と組み合わせ、 常法に従って製剤化するこ とにより免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬 （以下、 「本発明治療 薬」 という） が得られる。
本発明治療薬における、 0 P N阻害抗体の患者への投与量としては、 患者の症 状の程度、 年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが 、 通常一日当り 0 . 1〜"！ 0 0 m g / k g程度、 好ましくは 0 . 5〜8 0 m g Z k g程度であるから、 これに適合した量を用いて製剤化することが好ましい。 また、 本発明治療薬の剤型の例としては、 注射剤、 点眼用剤などの非経口剤が 挙げられ、 これらには本発明の効果を損なわない範囲で、 通常医薬組成物の製造 に使用される他の任意成分を加えることができる。 このような任意成分としては 、 例えば、 吸着剤、 保存剤、 抗酸化剤、 緩衝剤、 キレー卜剤、 着色剤、 乳化剤、 矯味 ·香剤、 硬化剤、 界面活性剤、 懸濁化剤、 甘味剤、 滑沢剤、 賦形剤、 コーテ イング剤、 流動化剤、 光沢化剤、 等張化剤、 結合剤、 増量剤等が挙げられる。 かくして得られる本発明阻害剤により、 活性化が阻害される免疫担当細胞とし ては、 マクロファージ、 T細胞、 N K T細胞、 好中球等が挙げられる。 これらの 免疫担当細胞の中でも T細胞、 N K T細胞、 好中球の活性化を好適に阻害する。 また、 本発明阻害剤は、 上記免疫担当細胞の活性化により引き起こされる F a s / F a s L細胞障害や好中球媒介細胞障害を好適に阻害する。
更に、 本発明治療薬により治療ないし改善される疾患としては、 特に限定され ないが、 例えば、 肝障害、 喘息、 関節炎、 糖尿病、 狼瘡、 多発性硬化症、 動脈硬 化、 肺線維症等が挙げられる。 また、 本発明治療薬はこれらの疾患の中でも肝細 胞の壊死を好適に抑制できるのでウィルス性肝炎や薬物耐性肝炎等の肝障害、 特 に自己免疫性肝炎等の急性肝障害に有効な治療薬となる。 本発明阻害剤ないし治療薬の作用機序については、 不明な部分があるが、 O P Nまたはタンパク質分解酵素等にょリ分解された 0 P Nにより直接的または間接 的に引き起こされる免疫担当細胞の活性化を、 O P N等に対する抗体 （O P N阻 害抗体） が阻害すると考えられる。
以下、 肝障害を具体例として作用機序を説明する。
まず、 コンカナパリン A (以下 「C o n A」 という） 誘導性肝炎においては、 以下の実施例で示すように、 肝臓内の N K T細胞が O P Nを産生していると考え られる。 ここで産生された 0 P Nは、 タンパク質分解酵素等により分解され 0 P Nのフラグメントペプチドとなる。 そして、 0 P N等がオートクライン的に N K T細胞を活性化させると、 1\1 «丁細胞は 1 F N—ァを産生する。 この I F N—ァ については以下のような作用を有することが知られている （Hong F.， et aし， J. Clin. Invest. 2002 Nov; 110(10) : 1503-13) 。 産生された I F Ni— τは細胞 膜に存在するサイ卜力インレセプターに結合すると、 J ΑΚ— S T ATシグナル 経路 ( J a n u s K i n a s e— s i g n a l t r a n s d u c e r a n d a c t i v a t o r o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i g n a I i n g p a t h w a y) が動く。 すなわち、 チロシンキナーゼである J A Kキナーゼ （J a n u s K i n a s e) が活性化し、 活性化した」 AKキナー ゼは、 レセプ夕一細胞内領域のチロシン残基をリン酸化し、 それに続いてサイ卜 力イン誘導性転写活性化因子である S T A T 1 (S i g n a l T r a n s d u c e r a n d A c t i v a t o r o f T r a n s c r i p t i o n f a c t o r 1 ) を活性化させる。 さらにこの活性化 S T AT 1は、 ！^ 丁細胞ゃじ D 4 + T細胞を活性化させる。
また、 N KT細胞は活性化されると I L一 4を産生することが知られており （ Kaneko Υ·， et al.， J. Exp. Med. , 2000, Jan 3;191 (1) :105-14) 、 このとき I 一 -
し一 4は才一卜クライン的に N K T細胞に作用し、 その結果 N K T細胞は F a s リガンドを発現する。 そして N K T細胞は肝細胞に対して F a s ZF a s L媒介 細胞障害を引き起こすこととなる。
—方、 上記 0 P N等による N K T細胞の活性化によって、 N K T細胞は M l P — 2 (M a c r o p h a g e i n f I amm a t o .r y p r o t e i n— 2 ) を産生する。 この M I P— 2は好中球の遊走 ·集積を促すことが知られており （ Xiao YQ. , et al. , Biochim. Biophys. Acta. 1997 Aug 22:1361 (2) :138-46. ) 、 その結果好中球が産生する活性酸素は肝細胞に対して障害を引き起こすことと なる （好中球媒介細胞障害） 。
これに対し、 本発明阻害剤ないし治療薬の有効成分である O P N阻害抗体は、 O P Nまたはそのフラグメントべプチド部分に結合することにより、 O P N等に より活性化するマクロファージ、 T細胞、 N K T細胞、 好中球等の免疫担当細胞 の活性化を阻害することができる。
また、 O P N阻害抗体が、 上記のように免疫担当細胞を不活性化することに伴 い、 N KT細胞の I F N—ァ産生、 M I P— 2産生、 I し一 4産生も阻害するこ とができる。
そして、 I F N—アの産生が阻害される結果、 これにより活性化される S T A T 1や、 この S T AT 1 により活性化される N K T細胞や C D 4 +T細胞の活性 化も阻害することができる。
また、 I L— 4の産生が阻害される結果、 これにより活性化される N K T細胞 の活性化を阻害し、 それに続く F a s リガンドの発現も阻害することができる。 従って、 これらの活性化を阻害することにより、 F a s ZF a s L媒介細胞障 害を阻害することができる。
更に、 0 [^阻害抗体は1^1 I P— 2の産生を阻害する結果、 好中球の遊走や M P Oの産生を阻害することができ、 それに続く好中球媒介細胞障害も阻害するこ とができる。
そしてひいては F a s ZF a s L媒介細胞障害および好中球媒介細胞障害に よる肝細胞の壊死を抑制し、 肝障害を軽減、 治療することができる。
同様、 喘息、 関節炎、 糖尿病、 狼瘡、 多発性硬化症、 動脈硬化、 肺線維症にお 一
いても、 0 P N阻害抗体で関連する免疫担当細胞の活性化を阻害することにより 、 これら疾患を治療することができるのである。 実施例
以下に、 本発明の具体的な態様を実施例として示すが、 本願は何らこれらに限 定されるものではない。 実 施 例 1
0 P N阻害抗体の作製：
下に示すような、 ヒ卜 0 P Nの内部配列 （V I 5 3から S 1 6 9 ) に対応する 合成ペプチド （2 K 1ペプチド） を用意し、 免疫化に使用した。
2 K 1ぺプチド ： V DTY D G R G D S V V Y G L R S (配列番号 2 ) この 2 Κ Ίぺプチドは、 a v j8 3と α 9 )8 1 ィンテグリンレセプターを認識す る R G Dと S V V Y G L配列を有する。
この 2 Κ 1 ペプチドを、 サイログロブリンと結合し、 これを用い常法に従って マウスを免疫化した。 免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、 Χ 6 3 -A g 8 - 6 5 3をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、 文献 （J. Immunol. 146 :3721-3728) に述べた方法により八イブリ ドーマを選択した。 選択 は、 固定化された G S T/0 P N aと C H 0細胞から導いた 0 P N— aには反応 するが、 G S Tには反応しないように見えるハイプリ ドーマを選ぶことによリ行 つた。
2 K 1 ペプチドで免疫したマウスから、 2 K 1 と名付けたモノクローナル抗体 を得た。 なお、 モノクローナル抗体 2 K 1 を産生するハイプリ ドーマを H u m a n O s t e o p o n t i n h y b r i d o m a 2 K 1 と名付けて 2 0 0 1年 6月 2 0日付で、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （〒 305-8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に F E R M B P — 7 8 8 3として寄託した。 試 験 例 1 O P Nおよびその卜ロンビン消化物 （卜ロンビン切断型 0 P N) と O P N 阻害抗体の反応性：
上記で得られた 2 K 1抗体の 0 P Nおよびその卜ロンビン消化物に対する結合 能をウェスタンプロッ卜法を用いて試験した。 2 « 1抗体は0卩！^ー 3、 O P N 一 b、 O P N— cおよび O P N— aの卜ロンビン消化物である Nハーフ 0 P Nと 反応することがわかった。 更に、 この 2 K 1抗体は、 大腸菌から生産した非ダリ コシル化フォームの組換え 0 P Nと結合するばかりでなく、 C H O細胞から生産 されたグリコシル化フォームの組換え 0 P N (J. Cel l. Biochem. 77: 487-498, 2002) とも反応した。 実 施 例 2
肝炎モデルマウスへの 0 P N阻害抗体の投与：
肝炎における 0 P N阻害抗体の働きを明らかにするため、 野生型マウスに C o n Aを投与して人工的に作製した肝炎モデルマウスに O P N阻害抗体を投与し、 その作用を確認した。
なお、 本実施例はマウスの系で行うため、 ヒ卜 O P Nに対する 2 K 1抗体をそ のまま用いることができない。 そこでヒ卜 O P Nの S V VY G L R配列に相当す るマウス O P Nの S L A Y G L R配列と、 R G D配列とを有する下記のマウス才 ステ才ボンチンの内部配列 （C + V 1 3 8から R 1 5 3) に対応する合成ぺプチ ド （M 5ペプチド） を用意し、 実施例 1 と同様にして M 5抗体を作製し、 これを 用いた。
M 5ぺプチド ： C V D V P N G R G D S L A Y G L R (配列番号 3 )
一晩絶食させた B A L BZcマウス （6週齢、 雌） に、 M 5抗体を C o n A投 与 3時間前に 4 0 0 At 匹で静脈内投与した。 コントロール群にはゥサギ I g Gを同容量投与した。 次いで、 C o n Aを 3 0 0 匹で静脈内投与した。 M 5抗体投与 2、 6、 1 2および 2 4時間後に血清を採取し当該血清中の A L T値 の測定を行った。 その結果を図 Ί に示す。 また、 M 5抗体あるいはコントロール 抗体を投与した後、 C o n A投与後 24時間のそれぞれの肝臓を採取し、 H E染 色を行った。 その結果を図 2に示した。 H E染色の結果はN I H I m a g eで 定量解析し、 肝炎組織の顕微鏡視野中 （40倍） の壊死の細胞数の比率を算出し た。 その結果を図 3に示した。
肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死細胞数の比率 （壊死率） は、 M 5抗体を投与し た肝臓が 1 0 %程度であつたのに対して、 ゥサギ I g Gを投与した肝臓は 50 % 程度であった （図 3) 。 一方、 A L T値は M 5抗体を投与した場合には 1 500 程度であり、 5000程度であったコントロールよりも低い値となった （図 Ί ) 。 この結果、 M 5抗体は肝炎による肝細胞の壊死を抑制することが判明した。 上記の通り、 マウス O P Nに対する M 5抗体が肝細胞の壊死を抑制したことか ら、 ヒ卜 0 P Nに対する 2 K 1抗体についても、 ヒ卜の肝炎による肝細胞の壊死 を抑制しうることが判明した。 実 施 例 3
肝炎モデルマウスにおける 0 P Nの発現：
肝炎マウスモデルは、 野生型マウスに C o n Aを 1 5 mgZ kgで尾静脈に投 与することにより作製した。 この肝炎モデルマウスの肝臓内での 0 P N発現を、 mO P N E L I S A k i t ( (株） 免疫生物研究所製）を用いた E L I S A法 および抗才ステオボンチン抗体（ （株） 免疫生物研究所製）を用いたウェスタンブ ロット法を用いて解析した。 E L I S A法の結果を図 4に示した。 また、 ウェス タンプロッ卜の結果を図 5に示した。
E L I S A法の結果よリ、 マウスに C o n Aを投与することで肝臓中の O P N 濃度が時間と共に増加していた。 また、 ウエスタンプロッ卜の結果よリ、 肝臓 中に卜ロンビン切断型 O P Nの上昇が確認された。 実 施 例 4
肝炎における O P Nの機能の解析：
野生型マウスと O P N欠損マウス （O P N—/— ) (Rittling SR. , et aに， Exp Nephrol, 1999， 7: 103-113) にそれぞれ C o n Aを 200 g /匹で投与 した後、 実施例 2と同様に血清中の A L T値測定を行った。 また、 C o n Αを 4 00 μ gZ匹投与してからの生存率を比較した。 A L T値測定の結果を図 6に示 した。 また、 生存率の結果を図 7に示した。
A LT値測定の結果より、 O P N欠損マウスでは、 野生型マウスと比べて A L T値が減少していた。 また、 0 P N欠損マウスでは生存率も上昇していた。 実 施 例 5
肝臓内における O P Nとその受容体の産生細胞の解析：
( 1 ) 肝浸潤白血球の調製
300 g の C o n Aを尾静脈内投与し作製した肝炎モデルマウスの肝臓を （ 6時間） 取りだした後、 ホモジナイズし、 メッシュを通した。 次いでこれを、 P B Sにて洗浄後、 肝細胞を取り除くため、 へパリン （ 1 O O UZm l ) を含む 3 3 %の P e r c o l I に加え、 2， 000回転で 1 5分間処理して細胞ペレツ卜 を調製した。 得られた細胞ペレットを赤血球溶血用緩衝液 （以下、 「H L B液 J という） （ （株） 免疫生物研究所製） で処理することにより、 赤血球を溶血させ た。 更に、 これらを P B Sで 3回洗浄した後、 D - M E / 1 0 % F C Sに加え て肝浸潤白血球を調製した。
(2) 肝浸潤白血球を用いた細胞内 O P Nの検出
肝臓内において 0 P Nが、 N K T細胞または T細胞のどちらの細胞から産生し ているのかを確認するため、 細胞内サイ卜力イン染色および細胞培養上清からの E L I S A法による測定をそれぞれ以下の手順で行った。
まず、 上記 （1 ) で調製した肝浸潤白血球は、 モネンシン （m o n e n s i n ) 存在下で 90分培養し、 抗 N K 1. 1抗体と抗 T C R jS抗体 （ともに P h a r M i n g e n製） で細胞表面分子を染色した。 次に、 4 %のパラホルムアルデヒ ドで 1 0分間固定し、 サポニンバッファー （ 1 % F C S、 0. 1 %サポニン、 0. 1 % N a N 3を含む P B S溶液） で膜透過処理を行った。 更に、 ビ才チン化した O PN阻害抗体 （ （株） 免疫生物研究所製） を加え、 ストレプトアビジン一 A P C (ジャクソン製） を二次抗体として使用し、 F AC Sキヤリバ一 （FAC S c a I i b e r ： BD製） にて解析した。
また、 細胞培養上清からの E L I SAは mO P N E I A k i t ( (株） 免疫 生物研究所製） を用いて行った。 肝炎モデルマウスの細胞内サイ卜力イン染色の結果を図 8に示した。 また、 細 胞培養上清の E L I S A法による測定結果を図 9に示した。
細胞内サイ卜力イン染色により、 N K 1. 1 +TC R+である N KT細胞集団の 細胞内に O P Nの発現が確認された。 また、 細胞培養上清中における 0 P N量の E L I S A測定により、 N K 1. 1 +T C R+である N K T細胞集団において O P N発現は検出されたが、 N K 1. 1 — T C R+である T細胞集団において O P N発 現は検出されなかった。
従って、 肝臓内における O P N産生細胞は主に N K T細胞であることが示唆さ れた。
(3) 肝炎発症に関わる 0 P N受容体および M I P— 2の解析
肝炎モデルマウスの肝臓内の N K T細胞および T細胞から、 α 4ィンテグリン 、 α 9インテグリンおよび M I Ρ— 2が発現されているかどうかを、 Ν ΚΤ細胞 および Τ細胞からそれぞれ抽出した R Ν Αを用いた R Τ— P C Rで確認した。 そ の結果を図 1 0に示した。 G 3 P DHはコントロールとして使用した。 以下に R T一 P C Rに利用したプライマーとその配列を示した （配列番号 4〜1 1 ) 。
G 3 P D H ：
5 '— A C C A C A G T C C A T G C C A T C A C— 3 ' (センス）
5'— TC CACCACCCCTGTTGCTGTA— 3' (アンチセンス） α 4ィンテグリン：
5 '— T G G A A G C T A C T T A G G C T A C Τ— 3 ' (センス）
5'— TC CCACGACTTCGG TAGTAT— 3' (アンチセンス） α 9ィンテグリン：
5' -AAAGGCTGCAGCTGTCCCACATGGACGAAG- 3' (センス）
5' -TTTAGAGAGATATT CTTCACAGCCCCCAAA- 3' (アンチセンス）
M I P - 2 ：
5'— GAACAAAGG CAAGG CTAACTGA— 3' (センス）
5'— AACATAACAACATCTGGGCAAT— 3' (アンチセンス） 図 1 0より、 α 9ィンテグリンおよび M I Ρ— 2は Ν Κ Τ細胞に発現している が、 Τ細胞には発現していなかった。 一方、 α 4インテグリンは Ν Κ Τ細胞およ び Τ細胞の両方に発現していた。 実 施 例 6
Ο Ρ Νのトロンビン消化物に対する細胞遊走試験：
( Ί ) 細胞遊走試験
肝浸潤白血球の Ο Ρ Νの卜ロンビン消化物に対する細胞遊走試験を行った。 ま ず、 実施例 5で調製した肝炎モデルマウスの肝浸潤白血球の 1 O gZm I に、 それぞれ全長 0 P N ( r 0 P N ：非切断型 O P N) を l O i g/m l , 卜ロンビ ン （T h r ) を l UZm l , O P Nの卜ロンビン消化物 （ T h r— 0 P N ) を 1 0 i g/m I を添加し、 3 7 °Cで 2時間培養した後、 細胞遊走効果をケモタキ シスチャンバ一 （ポアサイズ 5 At mの 2 4穴 T r a n s w e I I t i s s u e c u l t u r e p l a t e (C o s t a r製） ） を用いて行った。 また、 野生 型マウスから得られた肝浸潤白血球についても同様の細胞遊走試験を行った。 そ れらの結果を図 1 1 に示した。
細胞遊走試験の結果、 肝炎モデルマウスから得られた細胞は、 O P Nの卜ロン ビン消化物に対する遊走効果が認められたが、 全長 O P N (非切断型 O P N) に 対する遊走効果はほとんど認められなかった。 一方、 野生型マウスから採取した 細胞は、 いずれの O P Nにも反応性を示さなかった。 次に、 どの受容体が細胞遊 走に関わっているかを、 抗体を用いた阻害試験によって同定した。
( 2 ) 細胞遊走阻害試験
肝炎モデルマウスから得られた細胞の、 O P Nの卜ロンビン消化物 （T h r — O P N) 1 0 / g/m I に対する細胞遊走効果を、 実施例 2で得られた M 5抗体 、 1^1 1抗体 （0— 1 7 ) ( (株） 免疫生物研究所製） 、 抗インテグリン /3 1 (H M β ^ ) 抗体、 抗) 8 3 (H M j8 3 ) 抗体、 抗 α ν ( R Μ V - 7 ) 抗体および抗 α 4 ( R Ί - 2 ) 抗体 （何れも P h a r M i n g e n製） の 1 O O z gZm lで阻 害した。 その結果を図 1 2に示した。 阻害試験の結果、 肝炎モデルマウスから得られた細胞の 0 P Nの卜ロンビン消 化物 （T h r - 0 P N ) に対する細胞遊走は M 5抗体により阻害された。 また、 抗インテグリン )8 1抗体と抗 α 4インテグリン抗体も細胞遊走を阻害した。 実 施 例 7
C D 4 + Τ細胞活性化阻害試験：
実施例 2で得られた Μ 5抗体を用いて C D 4 +Τ細胞活性化阻害試験を行った 。 肝浸潤活性化 C D 4 + Τ細胞の数を、 Ρ Ε標識 C D 4 (L 3 T 4 ： P h a r M i n g e n製） 抗体と F I TC標識 C D 6 9抗体 （P h a r M i n g e n製） を 用い、 F AC Sキヤリバ一 （FAC S c a l i b e r : B D製） にて解析した （ 以下、 「FAC S解析」 という） 。 また、 比較としてコントロール抗体 （正常ゥ サギ I g G) を用いて同様に試験を行った。 それらの結果を図 1 3に示した。 ま た、 それらの解析結果から活性化 C D 4 +T細胞数を算出したものを図 1 4に示 した。
肝浸潤活性化 C D 4 + T細胞の数を解析した結果、 M 5抗体投与により肝臓中 の活性化 C D 4 + T細胞の割合の減少および細胞数の減少が認められた。 実 施 例 8
C o n A投与後の肝臓内浸潤細胞の解析：
(1 ) 好中球、 C D4 + T細胞、 マクロファージ数の算出
野生型マウスと O P N欠損マウスにそれぞれ C 0 n Aを投与'してから 6時間後 の肝臓内浸潤細胞中の好中球、 C D 4+T細胞、 マクロファージ数を、 FAC S 解析にて算出した。 G r 1 +C D 1 1 b+、 C D 4+、 F 4/80 +画分をそれぞ れ好中球、 C D 4 +T細胞、 マクロファージ画分とした。 G r 1 +CD 1 1 b+お よび C D 4 +、 F 4ノ 80+の染色は以下のようにして行った。 C o n A投与後 、 6時間の肝臓から浸潤白血球を精製し、 ビ才チン化 C D 4 (L 3 T4) 抗体、 G r Ί (R B 6— 8 C 5) 抗体 （共に P h a r M i n g e n製） 、 ビ才チン化 F 4/80抗体 （C a l t a g l a b o r a t o r i e s製） で反応させ、 ス卜 レブ卜アビジン一 F I TC (DAKO製） で検出した。 FAC S解析の結果から 算出された各マウスにおけるそれぞれの好中球、 C D 4 +T細胞、 マクロファー ジ数を図 1 5に示した。
F A C S解析の結果、 野生型マウスにおいて好中球が他の細胞と比較して非常 に多いことが確認された。 また、 O P N欠損マウスでは好中球の欠損が確認され た。
(2 ) M P O (ミエ口ペル才キシダーゼ） 抗体による肝炎組織における好中球 の発現の解析
肝炎モデルマウスから得られた肝組織をパラフィン包埋した後、 5 mに薄切 し、 内因性ペル才キシダーゼ処理を行った。 次いでこの薄片に 1次抗体として抗 M PO抗体 （DA K O製） を 4 °C一晩反応させた。 次に、 二次抗体として E N V I S I O N (DA K O製） を反応させ、 免疫染色を行った。
この免疫染色の結果を図 1 6に示した。
その結果、 壊死した肝細胞内に好中球の集積がみられ、 肝炎発症と好中球遊走 の関与が確認された。 実 施 例 9
肝炎モデルマウスにおける O P Nの卜ロンビン消化物の機能の解析： ( 1 ) 好中球の M P O活性に種々の O P Nが与える影響
1 2 %カゼインナ卜リウ厶溶液をマウス腹腔内投与し 6時間後に腹腔内から採 取した好中球を種々の G S T融合 O P N蛋白質 2 0 g/m Iで刺激した。
全長マウス O P N ( L 1 7 - N 2 9 4 ) は卜ロンビンによって R 1 5 4と S 1 5 5で切断され、 N末端側の N八一フ O P N ( L 1 7— R 1 5 4 ) と C末端側の Cハーフ O P N (S 1 5 5 - N 2 9 4 ) となるので、 これらを G S T融合タンパ ク質となるように次に示す方法にて作製した。 なお、 Nハーフ O P Nと Cハーフ O P Nは、 マウス腎臓 c D N Aから次のプライマー （配列番号 1 2~ 1 5 ) を用 いて P C Rによリクローニングした。 全長マウス O P N ：
5' -TA G G G AT C C CT C C C G G T GAAA G T G AC T G AT- 3 ' 一 -
(センス）
5' -GTCT CGAGTTAGTTGACCT CAGAAGATGA- 3' (アンチセンス）
N八ーフ 0 P N ：
全長 O P Nフォワードプライマー
(センス）
5' -AACCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAGC CAA- 3' (アンチセンス）
C八ーフ O P N
5'— CAGGGATCCTCAAAGTCTAGGAGTTTCCAG - 3' (センス）
全長マウス O P Nリバースプライマー
(アンチセンス） 上記のプライマーを用いて得られる P C R産物は、 B a m H I と X h o Iで制 限酵素消化後、 p G E X 6 P— 1ベクタ一 （Ame r s h a m製） に導入し、 A B I 3 1 0 G e n e t i c A n a l y z e r a u t o m a t i c s e q u e n c e r ( A p p I i e d B i o s y s t e m s製） を用いて配列を確認し た。 次に、 この配列を大腸菌 J M l 09に導入して大腸菌を形質転換後、 G S T 融合 0 P N蛋白質を常法により精製した。
20 /X g/m Iの上記 G S T融合 O P N蛋白質で好中球を 3 6時間刺激した培 養上清から M P O (ミエ口ペル才キシダーゼ） 活性を測定した。 M PO活性は、 50 Iの培養上清と 1 00 μ Iの 3， 3 '， 5， 5'— t e t r am e t h y I b e n z i d i n e l i q u i d s u b s t r a t e s y s t em ( S i g m a製）とを混和し、 3 7 °Cで 30分加温し、 450 n mの吸光度を測定すること により定量化した。 その結果を図 1 7に示した。 図中の全ての値はコントロール G S Tで測定された M PO活性で差し引いた値である。
本結果から、 Nハーフ 0 P Nが M P 0活性を上昇させることが確認された。 (2) 好中球の肝臓内への浸潤の F A C S解析 M 5抗体投与の有無での C o n A投与 6時間後の肝臓内浸潤好中球を測定した 。 C o n A投与肝臓から白血球を採取し、 G r 1 +C D 1 1 b+細胞を F A C S 解析した。 また、 比較としてコントロール抗体 （正常ゥサギ I g G) を用いて同 様に解析を行った。 それらの結果を図 1 8に示した。
F AC S解析の結果、 M 5抗体投与により、 好中球の肝臓内への浸潤が抑制さ れることが確認された。
(3 ) 肝臓中 M I P - 2値の測定
野生型マウスに C o n Aを投与した後、 6、 1 2、 2 4時間後の肝臓中におけ る M I P— 2値を M I P - 2 E I A k i t ((株）免疫生物研究所製）を用いて 測定した。 また、 比較としてコントロール抗体 （正常ゥサギ I g G) を用いて同 様に測定を行った。 それらの結果を図 1 9に示した。
肝臓中 M I P— 2値の測定の結果、 M 5抗体投与により M I P— 2の発現が減 少していることが確認された。
(4) 肝臓内における 0 P N受容体 α 4、 α 9インテグリンの発現の解析 4インテグリンと α 9インテグリンの発現を実施例 5と同様のプライマーを 用いたリアルタイ厶 P C Rで測定した。 測定した値は G 3 P D Ηにて補正するこ とにより定量化した。 また、 比較としてコントロール抗体 （正常ゥサギ I g G) を用いて同様に解析を行った。 それらの結果を図 2 0に示した。
肝臓内における 0 P N受容体 α 4、 α 9インテグリンの発現解析の結果、 α 4 、 α 9インテグリン m R Ν Αは、 M 5抗体投与により減少していることが確認さ れた。 これは肝臓内に α 4、 α 9インテグリンを発現する細胞の浸潤が抑制され ていることを示唆する結果であった。 実 施 例 1 0
肝臓中のサイ卜力イン濃度の測定：
( 1 ) 肝臓中 I F N— τ発現細胞の解析
C o n A投与マウスから分離した N K T細胞と T細胞の培養上清中の I F N— Tを I F N— τ E I A k i t ( P h a r m i n g e n製）を用いて測定した。 その結果を図 2 1 に示した。 肝臓中 I F N—ァ発現細胞の解析の結果、 I F N—アは、 主に N KT細胞から 産生していることが確認された。
(2 ) 肝臓中 I F N一ァ量の測定
M 5抗体を投与した C 0 n A肝炎マウスと、 コントロール抗体を投与した C o n A肝炎マウスにおける肝臓中の I F N—ァ発現量を I F N—ァ E l A k i t ( P h a r m i n g e n製）を用いて定量した。 それらの結果を図 22に示した。 肝臓中 I F N—ァ量の測定の結果、 M 5抗体の投与にょリ、 コントロールの抗 体を投与した場合よりも、 I F N—ァ量が有意に減少していることが確認された 以上のことから N KT細胞が産生する O P Nが才ー卜クラインで N K T細胞に 働いて N K T細胞を活性化させていることが考えられた。 0 P Nを抗体にて阻害 することで I F N— τ産生が低下したことから、 0 P Nが N K T細胞活性化に重 要な役割をしていることが示唆された。 実 施 例 1 1
O P N阻害抗体の投与時期の検討：
O P N阻害抗体の投与時期を検討するために、 M 5抗体の 4 O O gを C o n Aを投与する 3時間前と C o n Aの投与と同時に各マウスに投与し、 A L T値を 測定した。 その結果を図 23に示した。
A L T値の測定の結果、 C o n Aの投与 3時間前に M 5抗体を投与した場合に は特に優れた肝炎抑制効果が認められた。 一方、 C 0 n Aの投与と同時に M 5抗 体を投与した場合であっても、 肝炎抑制効果が認められた。 上記の通り、 C o n Aを投与して発生するマウスの肝炎において N K T細胞が 主要な O P N産生細胞であることが判明した。 そして 0 P N阻害抗体を投与する ことにより、 I F N—ァおよび M I P— 2の産生が阻害され、 その結果、 N KT 細胞の活性化を阻害できることが判明した。 また、 N KT細胞の活性化を阻害で きることから、 I L— 4の産生も阻害することができると考えられる。 更に、 前 記活性化に関連する C D 4 +T細胞および好中球の活性化の阻害や、 また更にこ れらの活性化に関連する F a sZF a s L媒介細胞障害および好中球媒介細胞障 害も阻害できることが判明した。
従って、 上記の活性化を阻害することにより、 これら免疫担当細胞の活性化を 原因とする疾患の治療できることが判明した。
このようにマウスの O P N阻害抗体 （M 5抗体） が N KT細胞活性化、 CD 4 + T細胞活性化、 好中球活性等の阻害効果を示し、 免疫担当細胞の活性化を原因 とする疾患を治療できることから、 ヒ卜 O P N阻害抗体 （2 K 1抗体） について も、 同様に疾患を治療しうることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明の免疫担当細胞活性化阻害剤は、 免疫担当細胞の活性化を阻害するもの である。
従って、 上記阻害剤を有効成分とすることで免疫担当細胞の活性化を原因とす る疾患の治療薬として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメン卜べプチド部分に対する抗体を含有 する免疫担当細胞活性化阻害剤。
2. 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメン卜ペプチド部分に対する抗体が、 R G D配列を認識するインテグリンと才ステ才ボンチンまたはそのフラグメントと の結合を阻害し、 かつ S V V Y G L R配列を認識するインテグリンと才ステ才ポ ンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である請求項第 1項記載 の免疫担当細胞活性化阻害剤。
3. 才ステ才ポンチンまたはそのフラグメン卜ペプチド部分が、 才ステオポンチ ンの N末端フラグメントである請求項第 1項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
4. 才ステオボンチンまたはそのフラグメン卜ペプチド部分が、 次の （A) で示 されるぺプチドを含むぺプチドである請求項第 1項記載の免疫担当細胞活性化阻 害剤。
( A) RG D S VVYG L R
5. 才ステオボンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、 次の （B) で示 されるペプチドを含むペプチドである請求項第 1項記載の免疫担当細胞活性化阻 害剤。
( B) V DTY DG R G D S VVYGし R S
6. 免疫担当細胞が、 N K T細胞である請求項第 1項ないし第 5項の何れかの項 記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
7. !^11 丁細胞の 1 F Ν— τ産生を阻害するものである請求項第 6項記載の免疫 担当細胞活性化阻害剤。
8. N KT細胞の M l P— 2産生を阻害するものである請求項第 6項記載の免疫 担当細胞活性化阻害剤。
9. 1\11 丁細胞の 1 L一 4産生を阻害するものである請求項第 6項記載の免疫担 当細胞活性化阻害剤。
1 0. 免疫担当細胞が、 好中球である請求項第 1項ないし第 5項の何れかの項記 載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
1 1 . 免疫担当細胞が、 T細胞である請求項第 1項ないし第 5項の何れかの項記 載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
1 2. T細胞が、 C D 4 + T細胞である請求項第 1 1項記載の免疫担当細胞活性 化阻害剤。
1 3. F a s ZF a s L媒介細胞障害を阻害するものである請求項第 1項ないし 第 1 2項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
1 4. 好中球媒介細胞障害を阻害するものである請求項第 1項ないし第 1 2項の 何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
1 5. 請求項第 1項ないし第 1 4項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害 剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬。
1 6. 免疫担当細胞が、 N K T細胞、 好中球、 T細胞から選ばれる免疫担当細胞 の 1種以上である請求項第 1 5項記載の疾患の治療薬。
1 7. 免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患が、 肝炎、 喘息、 関節炎、 糖尿病 、 狼瘡、 多発性硬化症、 動脈硬化、 肺線維症から選ばれる疾患である請求項第 1 5項または第 1 6項記載の疾患の治療薬。
1 8 . 請求項第 1項ないし第 1 4項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害 剤を有効成分とする肝障害の治療薬。
1 9 . 肝障害が、 ウィルス性肝炎または薬物性肝炎である請求項第 1 8項記載の 肝障害の治療薬。
2 0 . 肝障害が、 自己免疫性肝炎である請求項第 1 8項記載の肝障害の治療薬。
2 1 - 肝細胞の壊死を抑制するものである請求項第 1 8項ないし第 2 0項の何れ かの項記載の肝障害の治療薬。
2 2 . 免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の患者に、 請求項第 1 5項ないし 第 1 7項の何れかの項記載の治療薬を投与することを特徴とする当該疾患の治療 方法。
2 3 . 肝障害患者に、 請求項第 1 8項ないし第 2 1項の何れかの項記載の肝障害 の治療薬を投与することを特徴とする肝障害の治療方法。
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