JPWO2004103403A1 - 免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明はOPNまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤および前記阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬ならびにそれを用いた治療法に関する。本発明によれば免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患、例えば肝障害、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症等を治療しうる薬剤等を提供することができる。
Description
本発明は、オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途に関する。
B細胞、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、NKT細胞、好中球等の免疫担当細胞は、体内の免疫系等に関与するものである。
しかし、これら免疫担当細胞が異常に活性化することにより、種々の疾患、例えば、肝障害(Kaneko Y.,et al.,J.Exp.Med.,2000,Jan 3;191(1):105−14、Nakamura K.,et al.,J.Hepatol.,2001,Aug;35(2):217−24、Tiegs G.,et al.,J.Clin.Invest.1992 Jul;90(1):196−203)、喘息(Akbari O.,et al.,Nat.Med.,2003,May;9(5):582−8、Linden A.,Int.Arch.Allergy Immunol.,2001,Nov;126(3):179−84、Corrigan CJ.,Chem.Immunol.,2000;78:39−49)、関節炎(Chiba A.,et al.,Infect.Immun.,2003,Oct;71(10):5447−55、Nurieva RI.,J.Clin.Invest.,2003,Mar;111(5):701−6、Taylor PC.,Curr.Opin.Pharmacol.,2003,Jun;3(3):323−8.)、糖尿病(Hong S.,et al.,Nat.Med.2001,Sep;7(9):1052−6、Hahn HJ.,Diabetes Metab.Rev.,1993,Dec;9(4):323−8)、狼瘡(Zeng D,J Clin Invest.2003 Oct;112(8):1211−22、Olive D.,et al.,Crit.Rev.Ther Drug Carrier Syst..1993;10(1):29−63)、多発性硬化症(Singh AK.,J.Exp.Med.,2001,Dec 17;194(12):1801−11、Maatta JA.,et al.,J.Neuroimmunol.,1998,Oct 1;90(2):162−75、Milici AJ.,wt al.,Lab.Invest.,1998,Oct;78(10):1239−44)、動脈硬化(Tupin E.,et al.,J.Exp.Med.,2004,Feb 2;199(3):417−22)、肺線維症(Keane MP.,et al.,J.Immunol.,1999,May 1;162(9):5511−8、Hu H.,et al.,J Leukoc.Biol.,1993,Nov;54(5):414−22)等の疾患が引き起こされることが示唆されている。
上記のような免疫担当細胞の活性化等により引き起こされる疾患は、発症のメカニズムが複雑であるため治療が困難であることが多かった。
従って、本発明は上記疾患を治療しうる薬剤を提供することをその課題とする。
しかし、これら免疫担当細胞が異常に活性化することにより、種々の疾患、例えば、肝障害(Kaneko Y.,et al.,J.Exp.Med.,2000,Jan 3;191(1):105−14、Nakamura K.,et al.,J.Hepatol.,2001,Aug;35(2):217−24、Tiegs G.,et al.,J.Clin.Invest.1992 Jul;90(1):196−203)、喘息(Akbari O.,et al.,Nat.Med.,2003,May;9(5):582−8、Linden A.,Int.Arch.Allergy Immunol.,2001,Nov;126(3):179−84、Corrigan CJ.,Chem.Immunol.,2000;78:39−49)、関節炎(Chiba A.,et al.,Infect.Immun.,2003,Oct;71(10):5447−55、Nurieva RI.,J.Clin.Invest.,2003,Mar;111(5):701−6、Taylor PC.,Curr.Opin.Pharmacol.,2003,Jun;3(3):323−8.)、糖尿病(Hong S.,et al.,Nat.Med.2001,Sep;7(9):1052−6、Hahn HJ.,Diabetes Metab.Rev.,1993,Dec;9(4):323−8)、狼瘡(Zeng D,J Clin Invest.2003 Oct;112(8):1211−22、Olive D.,et al.,Crit.Rev.Ther Drug Carrier Syst..1993;10(1):29−63)、多発性硬化症(Singh AK.,J.Exp.Med.,2001,Dec 17;194(12):1801−11、Maatta JA.,et al.,J.Neuroimmunol.,1998,Oct 1;90(2):162−75、Milici AJ.,wt al.,Lab.Invest.,1998,Oct;78(10):1239−44)、動脈硬化(Tupin E.,et al.,J.Exp.Med.,2004,Feb 2;199(3):417−22)、肺線維症(Keane MP.,et al.,J.Immunol.,1999,May 1;162(9):5511−8、Hu H.,et al.,J Leukoc.Biol.,1993,Nov;54(5):414−22)等の疾患が引き起こされることが示唆されている。
上記のような免疫担当細胞の活性化等により引き起こされる疾患は、発症のメカニズムが複雑であるため治療が困難であることが多かった。
従って、本発明は上記疾患を治療しうる薬剤を提供することをその課題とする。
本出願人らは、先に、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖蛋白質であるオステオポンチン(以下、「OPN」という)またはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体(以下、「OPN阻害抗体」という)が、自己免疫疾患、リウマチおよびリウマチ性関節炎の治療(WO02/081522号パンフレットおよびWO03/027151号パンフレット)、結核診断剤(特開2003−294735号公報)、腱・靱帯の劣化予防剤(特願2003−389543号)、間質性肺炎診断剤(特願2003−194977号)等として利用しうることを見出し、先に特許出願をしている。
更に本出願人らは、OPN阻害抗体の利用を拡大すべく、鋭意研究を行っていたところ、OPNまたはそのフラグメントペプチド部分が前記の免疫担当細胞の活性化に関与していることを見出した。そして、OPN阻害抗体でOPNまたはそのフラグメントペプチド部分を阻害することにより免疫担当細胞の活性化を抑制することを見出した。
また、このOPN阻害抗体を利用することで、免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患等の治療薬となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤。
(2)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体が、RGD配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつSVVYGLR配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(3)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、オステオポンチンのN末端フラグメントである(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(4)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の(A)で示されるペプチドを含むペプチドである(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(A)RGDSVVYGLR
(5)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の(B)で示されるペプチドを含むペプチドである(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(B)VDTYDGRGDSVVYGLRS
(6)免疫担当細胞が、NKT細胞である(1)ないし(5)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(7)NKT細胞のIFN−γ産生を阻害するものである(6)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(8)NKT細胞のMIP−2産生を阻害するものである(6)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(9)NKT細胞のIL−4産生を阻害するものである(6)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(10)免疫担当細胞が、好中球である(1)ないし(5)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(11)免疫担当細胞が、T細胞である(1)ないし(5)の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(12)T細胞が、CD4+T細胞である(11)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(13)Fas/FasL媒介細胞障害を阻害するものである(1)ないし(12)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(14)好中球媒介細胞障害を阻害するものである(1)ないし(12)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(15)(1)ないし(14)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬。
(16)免疫担当細胞が、NKT細胞、好中球、T細胞から選ばれる免疫担当細胞の1種以上である(15)記載の疾患の治療薬。
(17)免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患が、肝炎、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症から選ばれる疾患である(15)または(16)記載の疾患の治療薬。
(18)(1)ないし(14)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする肝障害の治療薬。
(19)肝障害が、ウイルス性肝炎または薬物性肝炎である(18)記載の肝障害の治療薬。
(20)肝障害が、自己免疫性肝炎である(18)記載の肝障害の治療薬。
(21)肝細胞の壊死を抑制するものである(18)ないし(20)の何れかに記載の肝障害の治療薬。
(22)免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の患者に、(15)ないし(17)の何れかに記載の治療薬を投与することを特徴とする当該疾患の治療方法。
(23)肝障害患者に、(18)ないし(21)の何れかに記載の肝障害の治療薬を投与することを特徴とする肝障害の治療方法。
更に本出願人らは、OPN阻害抗体の利用を拡大すべく、鋭意研究を行っていたところ、OPNまたはそのフラグメントペプチド部分が前記の免疫担当細胞の活性化に関与していることを見出した。そして、OPN阻害抗体でOPNまたはそのフラグメントペプチド部分を阻害することにより免疫担当細胞の活性化を抑制することを見出した。
また、このOPN阻害抗体を利用することで、免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患等の治療薬となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤。
(2)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体が、RGD配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつSVVYGLR配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(3)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、オステオポンチンのN末端フラグメントである(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(4)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の(A)で示されるペプチドを含むペプチドである(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(A)RGDSVVYGLR
(5)オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の(B)で示されるペプチドを含むペプチドである(1)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(B)VDTYDGRGDSVVYGLRS
(6)免疫担当細胞が、NKT細胞である(1)ないし(5)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(7)NKT細胞のIFN−γ産生を阻害するものである(6)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(8)NKT細胞のMIP−2産生を阻害するものである(6)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(9)NKT細胞のIL−4産生を阻害するものである(6)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(10)免疫担当細胞が、好中球である(1)ないし(5)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(11)免疫担当細胞が、T細胞である(1)ないし(5)の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(12)T細胞が、CD4+T細胞である(11)記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(13)Fas/FasL媒介細胞障害を阻害するものである(1)ないし(12)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(14)好中球媒介細胞障害を阻害するものである(1)ないし(12)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(15)(1)ないし(14)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬。
(16)免疫担当細胞が、NKT細胞、好中球、T細胞から選ばれる免疫担当細胞の1種以上である(15)記載の疾患の治療薬。
(17)免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患が、肝炎、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症から選ばれる疾患である(15)または(16)記載の疾患の治療薬。
(18)(1)ないし(14)の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする肝障害の治療薬。
(19)肝障害が、ウイルス性肝炎または薬物性肝炎である(18)記載の肝障害の治療薬。
(20)肝障害が、自己免疫性肝炎である(18)記載の肝障害の治療薬。
(21)肝細胞の壊死を抑制するものである(18)ないし(20)の何れかに記載の肝障害の治療薬。
(22)免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の患者に、(15)ないし(17)の何れかに記載の治療薬を投与することを特徴とする当該疾患の治療方法。
(23)肝障害患者に、(18)ないし(21)の何れかに記載の肝障害の治療薬を投与することを特徴とする肝障害の治療方法。
図1は、血清中のALT値を示す図面である。
図2は、HE染色した肝炎組織の図面である。
図3は、肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死の細胞数の比率を示す図面である。
図4は、肝炎モデルマウスにおける肝臓内のOPNの発現量を示す図面である。
図5は、肝炎モデルマウスのウエスタンブロットの結果を示す図面である。矢印は、トロンビン切断型OPNを示している。
図6は、野生型マウスおよびOPN欠損マウスのConA投与後の血清中のALT値を示す図面である。
図7は、野生型マウスおよびOPN欠損マウスのConA投与後の生存率を示す図面である。
図8は、肝炎モデルマウスの細胞内サイトカイン染色の結果を示す図面である(左図は肝臓内白血球中のリンパ球を抗NK1.1抗体とTCR抗体とで染色した結果を示す。中央図(R1)はNK1.1+TCR+であるNKT細胞集団画分、右図(R2)は、NK1.1−TCR+であるT細胞集団画分におけるOPN発現をFACS解析した結果を示す。)。
図9は、肝炎モデルマウスの肝臓内から分離したNKT細胞およびT細胞の細胞培養上清中におけるOPN量をELISA法で測定した結果を示す図面である。
図10は、肝炎モデルマウスの肝臓内から分離したNKT細胞およびT細胞から抽出したmRNAをRT−PCR法にて増幅させ、各々の細胞が有するOPN受容体およびMIP−2を検出した結果を示す図面である。
図11は、肝炎モデルマウスおよび野生型マウスから得られた肝浸潤白血球のトロンビン切断型OPNに対する細胞遊走試験の結果を示す図面である。
図12は、肝炎モデルマウスから得られた肝浸潤白血球のトロンビン切断型OPNに対する細胞遊走阻害試験の結果を示す図面である。
図13は、肝炎モデルマウスの肝臓内における、M5抗体およびコントロール抗体投与時のCD69+CD4+T細胞の割合をFACS解析した結果を示す図面である。
図14は、肝炎モデルマウスの肝臓内における、M5抗体およびコントロール抗体投与時のCD69+CD4+T細胞数をFACS解析した結果から、活性化CD4+T細胞数を算出した結果を示す図面である。
図15は、野生型マウスとOPN欠損マウスにそれぞれConAを投与してから6時間後の肝臓内浸潤細胞中の好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数を、FACS解析にて算出した結果を示す図面である。
図16は、野生型マウスにConAを投与してから24時間後の肝臓組織を染色した結果を示す図面である(左図は、MPO抗体を用いて免疫染色した結果を示し、右図はHE染色した結果を示す。)。
図17は、野生型マウスの腹腔内にカゼインナトリウムを投与して分離した好中球に全長OPN、NハーフOPN、およびCハーフOPNを添加した培養上清中のMPO活性を示す図面である。
図18は、野生型マウスにConAを投与してから6時間後の肝臓内好中球数をFACS解析にて算出した結果を示す図面である。
図19は、野生型マウスへのConA投与後のMIP−2濃度の経時変化を示す図面である。
図20は、野生型マウスへのConA投与後の肝臓内におけるα4、α9インテグリンmRNAの発現量をリアルタイムPCRで定量した結果を示す図面である(黒丸はコントロール抗体投与のグラフ、白丸はM5抗体投与後のグラフである。)。
図21は、マウス肝臓のNKT細胞およびT細胞の培養上清中におけるIFN−γ量をELISA法で測定した結果を示す図面である。
図22は、M5抗体を投与したConA肝炎マウスと、コントロール抗体を投与したConA肝炎マウスにおける肝臓中のIFN−γ発現量をIFN−γ EIA Kit(Pharmingen製)を用いて定量した結果を示す図面である。
図23は、400μgのM5抗体を、ConAを投与する3時間前とConAの投与と同時に各マウスに投与した場合のALT値を比較した図面である。
図2は、HE染色した肝炎組織の図面である。
図3は、肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死の細胞数の比率を示す図面である。
図4は、肝炎モデルマウスにおける肝臓内のOPNの発現量を示す図面である。
図5は、肝炎モデルマウスのウエスタンブロットの結果を示す図面である。矢印は、トロンビン切断型OPNを示している。
図6は、野生型マウスおよびOPN欠損マウスのConA投与後の血清中のALT値を示す図面である。
図7は、野生型マウスおよびOPN欠損マウスのConA投与後の生存率を示す図面である。
図8は、肝炎モデルマウスの細胞内サイトカイン染色の結果を示す図面である(左図は肝臓内白血球中のリンパ球を抗NK1.1抗体とTCR抗体とで染色した結果を示す。中央図(R1)はNK1.1+TCR+であるNKT細胞集団画分、右図(R2)は、NK1.1−TCR+であるT細胞集団画分におけるOPN発現をFACS解析した結果を示す。)。
図9は、肝炎モデルマウスの肝臓内から分離したNKT細胞およびT細胞の細胞培養上清中におけるOPN量をELISA法で測定した結果を示す図面である。
図10は、肝炎モデルマウスの肝臓内から分離したNKT細胞およびT細胞から抽出したmRNAをRT−PCR法にて増幅させ、各々の細胞が有するOPN受容体およびMIP−2を検出した結果を示す図面である。
図11は、肝炎モデルマウスおよび野生型マウスから得られた肝浸潤白血球のトロンビン切断型OPNに対する細胞遊走試験の結果を示す図面である。
図12は、肝炎モデルマウスから得られた肝浸潤白血球のトロンビン切断型OPNに対する細胞遊走阻害試験の結果を示す図面である。
図13は、肝炎モデルマウスの肝臓内における、M5抗体およびコントロール抗体投与時のCD69+CD4+T細胞の割合をFACS解析した結果を示す図面である。
図14は、肝炎モデルマウスの肝臓内における、M5抗体およびコントロール抗体投与時のCD69+CD4+T細胞数をFACS解析した結果から、活性化CD4+T細胞数を算出した結果を示す図面である。
図15は、野生型マウスとOPN欠損マウスにそれぞれConAを投与してから6時間後の肝臓内浸潤細胞中の好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数を、FACS解析にて算出した結果を示す図面である。
図16は、野生型マウスにConAを投与してから24時間後の肝臓組織を染色した結果を示す図面である(左図は、MPO抗体を用いて免疫染色した結果を示し、右図はHE染色した結果を示す。)。
図17は、野生型マウスの腹腔内にカゼインナトリウムを投与して分離した好中球に全長OPN、NハーフOPN、およびCハーフOPNを添加した培養上清中のMPO活性を示す図面である。
図18は、野生型マウスにConAを投与してから6時間後の肝臓内好中球数をFACS解析にて算出した結果を示す図面である。
図19は、野生型マウスへのConA投与後のMIP−2濃度の経時変化を示す図面である。
図20は、野生型マウスへのConA投与後の肝臓内におけるα4、α9インテグリンmRNAの発現量をリアルタイムPCRで定量した結果を示す図面である(黒丸はコントロール抗体投与のグラフ、白丸はM5抗体投与後のグラフである。)。
図21は、マウス肝臓のNKT細胞およびT細胞の培養上清中におけるIFN−γ量をELISA法で測定した結果を示す図面である。
図22は、M5抗体を投与したConA肝炎マウスと、コントロール抗体を投与したConA肝炎マウスにおける肝臓中のIFN−γ発現量をIFN−γ EIA Kit(Pharmingen製)を用いて定量した結果を示す図面である。
図23は、400μgのM5抗体を、ConAを投与する3時間前とConAの投与と同時に各マウスに投与した場合のALT値を比較した図面である。
本発明の免疫担当細胞活性化阻害剤(以下、「本発明阻害剤」という)は、OPNまたはそのフラグメントペプチド部分(以下、「OPN等」という)に対する抗体(OPN阻害抗体)を有効成分とし、これを適当な薬学的に許容される担体成分と組み合わされることにより調製される。
本発明において用いられるOPN阻害抗体は、OPN等を認識するものであれば特に制限無く使用することができる。
このようなOPN阻害抗体としては、RGD配列を認識するインテグリンとOPN等との結合を阻害し、かつ、SVVYGLR配列を認識するインテグリンとOPN等との結合を阻害するものが好ましく、特にRGD配列を認識するインテグリン、例えばαvβ1、αvβ3、αvβ5等とOPN−a、OPN−b、OPN−cまたはそれらのN末端フラグメントとの結合を阻害し、かつ、SVVYGLR配列を認識するインテグリン、例えばα9β1、α4β1、α4β7等とOPN−a、OPN−b、OPN−cまたはそれらのN末端フラグメントとの結合を阻害するものが好ましい。
ここでN末端フラグメントとは、OPNがタンパク質分解酵素等により分解されたフラグメントのうちN末端側のフラグメントをいう。上記タンパク質分解酵素としては、例えばトロンビンが挙げられる。また、上記のSVVYGLR配列は、ヒトOPN(アクセッションナンバー:J04765)の162番目のセリンから168番目のアルギニンまでの配列である。
本発明におけるOPN阻害抗体は、上記のような性質を保持する抗体であれば、その製法は特に限定されず、例えばOPN−a、OPN−b、OPN−cや、これらのN末端フラグメント、あるいは次の(A)で示されるアミノ酸配列またはその相当配列を含んでいるペプチド(以下、これらを「OPN関連ペプチド」と総称する)を抗原として用いることにより作製されたものが使用できる。
なお、上記の相当配列とは、ヒト以外の動物のOPNにおける、ヒトOPNの162番目のセリンから168番目のアルギニンまでの配列(SVVYGLR)に相当する配列をいい、例えばブタではヒトと同じくSVVYGLR、サルではSVAYGLR、マウスやラットではSLAYGLR、ウシではSVAYGLK、ウサギではSVAYRLKである。
ヒトについての好ましいOPN阻害抗体は、例えば、上記(A)の配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。より好ましくは、例えばこの両配列を連続して有するOPN−a(アクセッションナンバー:J04765)の153番目バリン残基から169番目セリン残基までのペプチド(B)を抗原として用い、以下常法に従って処理することによって得ることができる。
また、OPN阻害抗体の作製にあたり、OPN関連ペプチドの抗原性を高めるためには、当該ペプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いることが好ましい。このOPN関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン(以下「KLH」という)、卵白アルブミン(以下、「OVA」という)、ウシ血清アルブミン(以下「BSA」という)、ウサギ血清アルブミン(以下「RSA」という)およびサイログロブリン等が挙げられ、このうちKLHおよびサイログリブリンがより好ましい。
上記OPN関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法(B.F.Erlanger et al.,(1954):J.Biol.Chem.,234,1090−1094)または活性化エステル法(A.E.Karu et al.,(1994):J.Agric.Food Chem.,42,301−309)等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、OPN関連ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−高分子化合物結合体が作製される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、N−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン(DBN)、ジアザビシクロウンデセン(DBU)、ジアザビシクロオクタン(DABCO)等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
また、上記反応は、通常、−20℃から100℃、好ましくは0℃から50℃において行われ、反応時間は5分から10時間程度、好ましくは5分から2時間である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス20℃から150℃、好ましくは0℃から100℃において行われ、反応時間は5分から10時間程度、好ましくは5分から5時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、OPN関連ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてN−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、N−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとN−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは1:10〜10:1、最も好ましくは1:1である。反応温度は、0〜50℃、好ましくは22〜27℃で、反応時間は5分〜24時間、好ましくは1〜2時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、0〜60℃、好ましくは5〜40℃、より好ましくは22〜27℃で、反応時間は5分〜24時間、好ましくは1〜16時間、より好ましくは1〜2時間である。
上記の方法によるOPN関連ペプチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、OPN関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物(以下、単に「結合物」ということがある)を得ることができる。
次に、上のようにして得られた結合物を抗原とする抗体の調製にあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法(日本生化学会編)等に記載の方法を適宜利用することができる。
すなわち、上記結合体を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。
例えば、まず、OPN関連ペプチド−サイログロブリン結合物等の結合物をリン酸ナトリウム緩衝液(以下、「PBS」という)に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤とを混合したものを、免疫原として用いて、哺乳動物を免疫する。
免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射および筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、1回または適当な間隔で複数回、好ましくは1週間ないし5週間の間隔で複数回、行うことができる。
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して、血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより、OPN阻害抗体を得ることができる。
また、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてOPN阻害抗体を得ることもできる。
更に、上記したOPN阻害抗体は常法により上記抗体の定常領域を治療対象とするヒトの抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変してキメラ抗体(欧州特許公開公報 EP0125023参照)やヒト化抗体(欧州特許公開公報 EP0239400またはEP045126、国際公開公報 WO03/027151参照)としてもよい。
更にまた、このようにして得られたOPN阻害抗体については、さらに抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出したFv、FabやF(ab’)2のかたちで用いることもできる。
一方、実験動物としてマウスを用い、OPNに関連する疾患等の研究を行う場合は、マウスのOPNに対応するOPN阻害抗体を用いることが望ましく、そのような抗体は、好ましくは、RGDSLAYGLR配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。
以上説明した本発明阻害剤は、上記OPN阻害抗体を有効成分とするものであるが、これを薬学的に許容される担体と組み合わせ、常法に従って製剤化することにより免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬(以下、「本発明治療薬」という)が得られる。
本発明治療薬における、OPN阻害抗体の患者への投与量としては、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが、通常一日当り0.1〜100mg/kg程度、好ましくは0.5〜80mg/kg程度であるから、これに適合した量を用いて製剤化することが好ましい。
また、本発明治療薬の剤型の例としては、注射剤、点眼用剤などの非経口剤が挙げられ、これらには本発明の効果を損なわない範囲で、通常医薬組成物の製造に使用される他の任意成分を加えることができる。このような任意成分としては、例えば、吸着剤、保存剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、矯味・香剤、硬化剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味剤、滑沢剤、賦形剤、コーティング剤、流動化剤、光沢化剤、等張化剤、結合剤、増量剤等が挙げられる。
かくして得られる本発明阻害剤により、活性化が阻害される免疫担当細胞としては、マクロファージ、T細胞、NKT細胞、好中球等が挙げられる。これらの免疫担当細胞の中でもT細胞、NKT細胞、好中球の活性化を好適に阻害する。
また、本発明阻害剤は、上記免疫担当細胞の活性化により引き起こされるFas/FasL細胞障害や好中球媒介細胞障害を好適に阻害する。
更に、本発明治療薬により治療ないし改善される疾患としては、特に限定されないが、例えば、肝障害、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症等が挙げられる。また、本発明治療薬はこれらの疾患の中でも肝細胞の壊死を好適に抑制できるのでウイルス性肝炎や薬物耐性肝炎等の肝障害、特に自己免疫性肝炎等の急性肝障害に有効な治療薬となる。
本発明阻害剤ないし治療薬の作用機序については、不明な部分があるが、OPNまたはタンパク質分解酵素等により分解されたOPNにより直接的または間接的に引き起こされる免疫担当細胞の活性化を、OPN等に対する抗体(OPN阻害抗体)が阻害すると考えられる。
以下、肝障害を具体例として作用機序を説明する。
まず、コンカナバリンA(以下「ConA」という)誘導性肝炎においては、以下の実施例で示すように、肝臓内のNKT細胞がOPNを産生していると考えられる。ここで産生されたOPNは、タンパク質分解酵素等により分解されOPNのフラグメントペプチドとなる。そして、OPN等がオートクライン的にNKT細胞を活性化させると、NKT細胞はIFN−γを産生する。このIFN−γについては以下のような作用を有することが知られている(Hong F.,et al.,J.Clin.Invest.2002 Nov;110(10):1503−13)。産生されたIFN−γは細胞膜に存在するサイトカインレセプターに結合すると、JAK−STATシグナル経路(Janus Kinase−signal transducer and activator of transcription factor signaling pathway)が動く。すなわち、チロシンキナーゼであるJAKキナーゼ(Janus Kinase)が活性化し、活性化したJAKキナーゼは、レセプター細胞内領域のチロシン残基をリン酸化し、それに続いてサイトカイン誘導性転写活性化因子であるSTAT1(Signal Transducer and Activator of Transcription factor 1)を活性化させる。さらにこの活性化STAT1は、NKT細胞やCD4+T細胞を活性化させる。
また、NKT細胞は活性化されるとIL−4を産生することが知られており(Kaneko Y.,et al.,J.Exp.Med.,2000,Jan 3;191(1):105−14)、このときIL−4はオートクライン的にNKT細胞に作用し、その結果NKT細胞はFasリガンドを発現する。そしてNKT細胞は肝細胞に対してFas/FasL媒介細胞障害を引き起こすこととなる。
一方、上記OPN等によるNKT細胞の活性化によって、NKT細胞はMIP−2(Macrophage inflammatory protein−2)を産生する。このMIP−2は好中球の遊走・集積を促すことが知られており(Xiao YQ.,et al.,Biochim.Biophys.Acta.1997 Aug 22:1361(2):138−46.)、その結果好中球が産生する活性酸素は肝細胞に対して障害を引き起こすこととなる(好中球媒介細胞障害)。
これに対し、本発明阻害剤ないし治療薬の有効成分であるOPN阻害抗体は、OPNまたはそのフラグメントペプチド部分に結合することにより、OPN等により活性化するマクロファージ、T細胞、NKT細胞、好中球等の免疫担当細胞の活性化を阻害することができる。
また、OPN阻害抗体が、上記のように免疫担当細胞を不活性化することに伴い、NKT細胞のIFN−γ産生、MIP−2産生、IL−4産生も阻害することができる。
そして、IFN−γの産生が阻害される結果、これにより活性化されるSTAT1や、このSTAT1により活性化されるNKT細胞やCD4+T細胞の活性化も阻害することができる。
また、IL−4の産生が阻害される結果、これにより活性化されるNKT細胞の活性化を阻害し、それに続くFasリガンドの発現も阻害することができる。
従って、これらの活性化を阻害することにより、Fas/FasL媒介細胞障害を阻害することができる。
更に、OPN阻害抗体はMIP−2の産生を阻害する結果、好中球の遊走やMPOの産生を阻害することができ、それに続く好中球媒介細胞障害も阻害することができる。
そしてひいてはFas/Fas L媒介細胞障害および好中球媒介細胞障害による肝細胞の壊死を抑制し、肝障害を軽減、治療することができる。
同様、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症においても、OPN阻害抗体で関連する免疫担当細胞の活性化を阻害することにより、これら疾患を治療することができるのである。
本発明において用いられるOPN阻害抗体は、OPN等を認識するものであれば特に制限無く使用することができる。
このようなOPN阻害抗体としては、RGD配列を認識するインテグリンとOPN等との結合を阻害し、かつ、SVVYGLR配列を認識するインテグリンとOPN等との結合を阻害するものが好ましく、特にRGD配列を認識するインテグリン、例えばαvβ1、αvβ3、αvβ5等とOPN−a、OPN−b、OPN−cまたはそれらのN末端フラグメントとの結合を阻害し、かつ、SVVYGLR配列を認識するインテグリン、例えばα9β1、α4β1、α4β7等とOPN−a、OPN−b、OPN−cまたはそれらのN末端フラグメントとの結合を阻害するものが好ましい。
ここでN末端フラグメントとは、OPNがタンパク質分解酵素等により分解されたフラグメントのうちN末端側のフラグメントをいう。上記タンパク質分解酵素としては、例えばトロンビンが挙げられる。また、上記のSVVYGLR配列は、ヒトOPN(アクセッションナンバー:J04765)の162番目のセリンから168番目のアルギニンまでの配列である。
本発明におけるOPN阻害抗体は、上記のような性質を保持する抗体であれば、その製法は特に限定されず、例えばOPN−a、OPN−b、OPN−cや、これらのN末端フラグメント、あるいは次の(A)で示されるアミノ酸配列またはその相当配列を含んでいるペプチド(以下、これらを「OPN関連ペプチド」と総称する)を抗原として用いることにより作製されたものが使用できる。
なお、上記の相当配列とは、ヒト以外の動物のOPNにおける、ヒトOPNの162番目のセリンから168番目のアルギニンまでの配列(SVVYGLR)に相当する配列をいい、例えばブタではヒトと同じくSVVYGLR、サルではSVAYGLR、マウスやラットではSLAYGLR、ウシではSVAYGLK、ウサギではSVAYRLKである。
ヒトについての好ましいOPN阻害抗体は、例えば、上記(A)の配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。より好ましくは、例えばこの両配列を連続して有するOPN−a(アクセッションナンバー:J04765)の153番目バリン残基から169番目セリン残基までのペプチド(B)を抗原として用い、以下常法に従って処理することによって得ることができる。
また、OPN阻害抗体の作製にあたり、OPN関連ペプチドの抗原性を高めるためには、当該ペプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いることが好ましい。このOPN関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン(以下「KLH」という)、卵白アルブミン(以下、「OVA」という)、ウシ血清アルブミン(以下「BSA」という)、ウサギ血清アルブミン(以下「RSA」という)およびサイログロブリン等が挙げられ、このうちKLHおよびサイログリブリンがより好ましい。
上記OPN関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法(B.F.Erlanger et al.,(1954):J.Biol.Chem.,234,1090−1094)または活性化エステル法(A.E.Karu et al.,(1994):J.Agric.Food Chem.,42,301−309)等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、OPN関連ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−高分子化合物結合体が作製される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、N−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン(DBN)、ジアザビシクロウンデセン(DBU)、ジアザビシクロオクタン(DABCO)等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
また、上記反応は、通常、−20℃から100℃、好ましくは0℃から50℃において行われ、反応時間は5分から10時間程度、好ましくは5分から2時間である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス20℃から150℃、好ましくは0℃から100℃において行われ、反応時間は5分から10時間程度、好ましくは5分から5時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、OPN関連ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてN−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、N−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとN−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは1:10〜10:1、最も好ましくは1:1である。反応温度は、0〜50℃、好ましくは22〜27℃で、反応時間は5分〜24時間、好ましくは1〜2時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、0〜60℃、好ましくは5〜40℃、より好ましくは22〜27℃で、反応時間は5分〜24時間、好ましくは1〜16時間、より好ましくは1〜2時間である。
上記の方法によるOPN関連ペプチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、OPN関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物(以下、単に「結合物」ということがある)を得ることができる。
次に、上のようにして得られた結合物を抗原とする抗体の調製にあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法(日本生化学会編)等に記載の方法を適宜利用することができる。
すなわち、上記結合体を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。
例えば、まず、OPN関連ペプチド−サイログロブリン結合物等の結合物をリン酸ナトリウム緩衝液(以下、「PBS」という)に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤とを混合したものを、免疫原として用いて、哺乳動物を免疫する。
免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射および筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、1回または適当な間隔で複数回、好ましくは1週間ないし5週間の間隔で複数回、行うことができる。
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して、血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより、OPN阻害抗体を得ることができる。
また、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてOPN阻害抗体を得ることもできる。
更に、上記したOPN阻害抗体は常法により上記抗体の定常領域を治療対象とするヒトの抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変してキメラ抗体(欧州特許公開公報 EP0125023参照)やヒト化抗体(欧州特許公開公報 EP0239400またはEP045126、国際公開公報 WO03/027151参照)としてもよい。
更にまた、このようにして得られたOPN阻害抗体については、さらに抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出したFv、FabやF(ab’)2のかたちで用いることもできる。
一方、実験動物としてマウスを用い、OPNに関連する疾患等の研究を行う場合は、マウスのOPNに対応するOPN阻害抗体を用いることが望ましく、そのような抗体は、好ましくは、RGDSLAYGLR配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。
以上説明した本発明阻害剤は、上記OPN阻害抗体を有効成分とするものであるが、これを薬学的に許容される担体と組み合わせ、常法に従って製剤化することにより免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬(以下、「本発明治療薬」という)が得られる。
本発明治療薬における、OPN阻害抗体の患者への投与量としては、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが、通常一日当り0.1〜100mg/kg程度、好ましくは0.5〜80mg/kg程度であるから、これに適合した量を用いて製剤化することが好ましい。
また、本発明治療薬の剤型の例としては、注射剤、点眼用剤などの非経口剤が挙げられ、これらには本発明の効果を損なわない範囲で、通常医薬組成物の製造に使用される他の任意成分を加えることができる。このような任意成分としては、例えば、吸着剤、保存剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、矯味・香剤、硬化剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味剤、滑沢剤、賦形剤、コーティング剤、流動化剤、光沢化剤、等張化剤、結合剤、増量剤等が挙げられる。
かくして得られる本発明阻害剤により、活性化が阻害される免疫担当細胞としては、マクロファージ、T細胞、NKT細胞、好中球等が挙げられる。これらの免疫担当細胞の中でもT細胞、NKT細胞、好中球の活性化を好適に阻害する。
また、本発明阻害剤は、上記免疫担当細胞の活性化により引き起こされるFas/FasL細胞障害や好中球媒介細胞障害を好適に阻害する。
更に、本発明治療薬により治療ないし改善される疾患としては、特に限定されないが、例えば、肝障害、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症等が挙げられる。また、本発明治療薬はこれらの疾患の中でも肝細胞の壊死を好適に抑制できるのでウイルス性肝炎や薬物耐性肝炎等の肝障害、特に自己免疫性肝炎等の急性肝障害に有効な治療薬となる。
本発明阻害剤ないし治療薬の作用機序については、不明な部分があるが、OPNまたはタンパク質分解酵素等により分解されたOPNにより直接的または間接的に引き起こされる免疫担当細胞の活性化を、OPN等に対する抗体(OPN阻害抗体)が阻害すると考えられる。
以下、肝障害を具体例として作用機序を説明する。
まず、コンカナバリンA(以下「ConA」という)誘導性肝炎においては、以下の実施例で示すように、肝臓内のNKT細胞がOPNを産生していると考えられる。ここで産生されたOPNは、タンパク質分解酵素等により分解されOPNのフラグメントペプチドとなる。そして、OPN等がオートクライン的にNKT細胞を活性化させると、NKT細胞はIFN−γを産生する。このIFN−γについては以下のような作用を有することが知られている(Hong F.,et al.,J.Clin.Invest.2002 Nov;110(10):1503−13)。産生されたIFN−γは細胞膜に存在するサイトカインレセプターに結合すると、JAK−STATシグナル経路(Janus Kinase−signal transducer and activator of transcription factor signaling pathway)が動く。すなわち、チロシンキナーゼであるJAKキナーゼ(Janus Kinase)が活性化し、活性化したJAKキナーゼは、レセプター細胞内領域のチロシン残基をリン酸化し、それに続いてサイトカイン誘導性転写活性化因子であるSTAT1(Signal Transducer and Activator of Transcription factor 1)を活性化させる。さらにこの活性化STAT1は、NKT細胞やCD4+T細胞を活性化させる。
また、NKT細胞は活性化されるとIL−4を産生することが知られており(Kaneko Y.,et al.,J.Exp.Med.,2000,Jan 3;191(1):105−14)、このときIL−4はオートクライン的にNKT細胞に作用し、その結果NKT細胞はFasリガンドを発現する。そしてNKT細胞は肝細胞に対してFas/FasL媒介細胞障害を引き起こすこととなる。
一方、上記OPN等によるNKT細胞の活性化によって、NKT細胞はMIP−2(Macrophage inflammatory protein−2)を産生する。このMIP−2は好中球の遊走・集積を促すことが知られており(Xiao YQ.,et al.,Biochim.Biophys.Acta.1997 Aug 22:1361(2):138−46.)、その結果好中球が産生する活性酸素は肝細胞に対して障害を引き起こすこととなる(好中球媒介細胞障害)。
これに対し、本発明阻害剤ないし治療薬の有効成分であるOPN阻害抗体は、OPNまたはそのフラグメントペプチド部分に結合することにより、OPN等により活性化するマクロファージ、T細胞、NKT細胞、好中球等の免疫担当細胞の活性化を阻害することができる。
また、OPN阻害抗体が、上記のように免疫担当細胞を不活性化することに伴い、NKT細胞のIFN−γ産生、MIP−2産生、IL−4産生も阻害することができる。
そして、IFN−γの産生が阻害される結果、これにより活性化されるSTAT1や、このSTAT1により活性化されるNKT細胞やCD4+T細胞の活性化も阻害することができる。
また、IL−4の産生が阻害される結果、これにより活性化されるNKT細胞の活性化を阻害し、それに続くFasリガンドの発現も阻害することができる。
従って、これらの活性化を阻害することにより、Fas/FasL媒介細胞障害を阻害することができる。
更に、OPN阻害抗体はMIP−2の産生を阻害する結果、好中球の遊走やMPOの産生を阻害することができ、それに続く好中球媒介細胞障害も阻害することができる。
そしてひいてはFas/Fas L媒介細胞障害および好中球媒介細胞障害による肝細胞の壊死を抑制し、肝障害を軽減、治療することができる。
同様、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症においても、OPN阻害抗体で関連する免疫担当細胞の活性化を阻害することにより、これら疾患を治療することができるのである。
以下に、本発明の具体的な態様を実施例として示すが、本願は何らこれらに限定されるものではない。
OPN阻害抗体の作製:
下に示すような、ヒトOPNの内部配列(V153からS169)に対応する合成ペプチド(2K1ペプチド)を用意し、免疫化に使用した。
この2K1ペプチドは、αvβ3とα9β1インテグリンレセプターを認識するRGDとSVVYGL配列を有する。
この2K1ペプチドを、サイログロブリンと結合し、これを用い常法に従ってマウスを免疫化した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、X63−Ag8−653をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献(J.Immunol.146:3721−3728)に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたGST/OPNaとCHO細胞から導いたOPN−aには反応するが、GSTには反応しないように見えるハイブリドーマを選ぶことにより行った。
2K1ペプチドで免疫したマウスから、2K1と名付けたモノクローナル抗体を得た。なお、モノクローナル抗体2K1を産生するハイブリドーマをHuman Osteopontin hybridoma 2K1と名付けて2001年6月20日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にFERM BP−7883として寄託した。
試験例 1
OPNおよびそのトロンビン消化物(トロンビン切断型OPN)とOPN阻害抗体の反応性:
上記で得られた2K1抗体のOPNおよびそのトロンビン消化物に対する結合能をウエスタンブロット法を用いて試験した。2K1抗体はOPN−a、OPN−b、OPN−cおよびOPN−aのトロンビン消化物であるNハーフOPNと反応することがわかった。更に、この2K1抗体は、大腸菌から生産した非グリコシル化フォームの組換えOPNと結合するばかりでなく、CHO細胞から生産されたグリコシル化フォームの組換えOPN(J.Cell.Biochem.77:487−498,2002)とも反応した。
下に示すような、ヒトOPNの内部配列(V153からS169)に対応する合成ペプチド(2K1ペプチド)を用意し、免疫化に使用した。
この2K1ペプチドは、αvβ3とα9β1インテグリンレセプターを認識するRGDとSVVYGL配列を有する。
この2K1ペプチドを、サイログロブリンと結合し、これを用い常法に従ってマウスを免疫化した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、X63−Ag8−653をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献(J.Immunol.146:3721−3728)に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたGST/OPNaとCHO細胞から導いたOPN−aには反応するが、GSTには反応しないように見えるハイブリドーマを選ぶことにより行った。
2K1ペプチドで免疫したマウスから、2K1と名付けたモノクローナル抗体を得た。なお、モノクローナル抗体2K1を産生するハイブリドーマをHuman Osteopontin hybridoma 2K1と名付けて2001年6月20日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にFERM BP−7883として寄託した。
試験例 1
OPNおよびそのトロンビン消化物(トロンビン切断型OPN)とOPN阻害抗体の反応性:
上記で得られた2K1抗体のOPNおよびそのトロンビン消化物に対する結合能をウエスタンブロット法を用いて試験した。2K1抗体はOPN−a、OPN−b、OPN−cおよびOPN−aのトロンビン消化物であるNハーフOPNと反応することがわかった。更に、この2K1抗体は、大腸菌から生産した非グリコシル化フォームの組換えOPNと結合するばかりでなく、CHO細胞から生産されたグリコシル化フォームの組換えOPN(J.Cell.Biochem.77:487−498,2002)とも反応した。
肝炎モデルマウスへのOPN阻害抗体の投与:
肝炎におけるOPN阻害抗体の働きを明らかにするため、野生型マウスにConAを投与して人工的に作製した肝炎モデルマウスにOPN阻害抗体を投与し、その作用を確認した。
なお、本実施例はマウスの系で行うため、ヒトOPNに対する2K1抗体をそのまま用いることができない。そこでヒトOPNのSVVYGLR配列に相当するマウスOPNのSLAYGLR配列と、RGD配列とを有する下記のマウスオステオポンチンの内部配列(C+V138からR153)に対応する合成ペプチド(M5ペプチド)を用意し、実施例1と同様にしてM5抗体を作製し、これを用いた。
一晩絶食させたBALB/cマウス(6週齢、雌)に、M5抗体をConA投与3時間前に400μg/匹で静脈内投与した。コントロール群にはウサギIgGを同容量投与した。次いで、ConAを300μg/匹で静脈内投与した。M5抗体投与2、6、12および24時間後に血清を採取し当該血清中のALT値の測定を行った。その結果を図1に示す。また、M5抗体あるいはコントロール抗体を投与した後、ConA投与後24時間のそれぞれの肝臓を採取し、HE染色を行った。その結果を図2に示した。HE染色の結果はNIH Imageで定量解析し、肝炎組織の顕微鏡視野中(40倍)の壊死の細胞数の比率を算出した。その結果を図3に示した。
肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死細胞数の比率(壊死率)は、M5抗体を投与した肝臓が10%程度であったのに対して、ウサギIgGを投与した肝臓は50%程度であった(図3)。一方、ALT値はM5抗体を投与した場合には1500程度であり、5000程度であったコントロールよりも低い値となった(図1)。この結果、M5抗体は肝炎による肝細胞の壊死を抑制することが判明した。
上記の通り、マウスOPNに対するM5抗体が肝細胞の壊死を抑制したことから、ヒトOPNに対する2K1抗体についても、ヒトの肝炎による肝細胞の壊死を抑制しうることが判明した。
肝炎におけるOPN阻害抗体の働きを明らかにするため、野生型マウスにConAを投与して人工的に作製した肝炎モデルマウスにOPN阻害抗体を投与し、その作用を確認した。
なお、本実施例はマウスの系で行うため、ヒトOPNに対する2K1抗体をそのまま用いることができない。そこでヒトOPNのSVVYGLR配列に相当するマウスOPNのSLAYGLR配列と、RGD配列とを有する下記のマウスオステオポンチンの内部配列(C+V138からR153)に対応する合成ペプチド(M5ペプチド)を用意し、実施例1と同様にしてM5抗体を作製し、これを用いた。
一晩絶食させたBALB/cマウス(6週齢、雌)に、M5抗体をConA投与3時間前に400μg/匹で静脈内投与した。コントロール群にはウサギIgGを同容量投与した。次いで、ConAを300μg/匹で静脈内投与した。M5抗体投与2、6、12および24時間後に血清を採取し当該血清中のALT値の測定を行った。その結果を図1に示す。また、M5抗体あるいはコントロール抗体を投与した後、ConA投与後24時間のそれぞれの肝臓を採取し、HE染色を行った。その結果を図2に示した。HE染色の結果はNIH Imageで定量解析し、肝炎組織の顕微鏡視野中(40倍)の壊死の細胞数の比率を算出した。その結果を図3に示した。
肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死細胞数の比率(壊死率)は、M5抗体を投与した肝臓が10%程度であったのに対して、ウサギIgGを投与した肝臓は50%程度であった(図3)。一方、ALT値はM5抗体を投与した場合には1500程度であり、5000程度であったコントロールよりも低い値となった(図1)。この結果、M5抗体は肝炎による肝細胞の壊死を抑制することが判明した。
上記の通り、マウスOPNに対するM5抗体が肝細胞の壊死を抑制したことから、ヒトOPNに対する2K1抗体についても、ヒトの肝炎による肝細胞の壊死を抑制しうることが判明した。
肝炎モデルマウスにおけるOPNの発現:
肝炎マウスモデルは、野生型マウスにConAを15mg/kgで尾静脈に投与することにより作製した。この肝炎モデルマウスの肝臓内でのOPN発現を、mOPN ELISA kit((株)免疫生物研究所製)を用いたELISA法および抗オステオポンチン抗体((株)免疫生物研究所製)を用いたウエスタンブロット法を用いて解析した。ELISA法の結果を図4に示した。また、ウエスタンブロットの結果を図5に示した。
ELISA法の結果より、マウスにConAを投与することで肝臓中のOPN濃度が時間と共に増加していた。また、ウエスタンブロットの結果より、肝臓中にトロンビン切断型OPNの上昇が確認された。
肝炎マウスモデルは、野生型マウスにConAを15mg/kgで尾静脈に投与することにより作製した。この肝炎モデルマウスの肝臓内でのOPN発現を、mOPN ELISA kit((株)免疫生物研究所製)を用いたELISA法および抗オステオポンチン抗体((株)免疫生物研究所製)を用いたウエスタンブロット法を用いて解析した。ELISA法の結果を図4に示した。また、ウエスタンブロットの結果を図5に示した。
ELISA法の結果より、マウスにConAを投与することで肝臓中のOPN濃度が時間と共に増加していた。また、ウエスタンブロットの結果より、肝臓中にトロンビン切断型OPNの上昇が確認された。
肝炎におけるOPNの機能の解析:
野生型マウスとOPN欠損マウス(OPN−/−)(Rittling SR.,et al.,Exp Nephrol,1999,7:103−113)にそれぞれConAを200μg/匹で投与した後、実施例2と同様に血清中のALT値測定を行った。また、ConAを400μg/匹投与してからの生存率を比較した。ALT値測定の結果を図6に示した。また、生存率の結果を図7に示した。
ALT値測定の結果より、OPN欠損マウスでは、野生型マウスと比べてALT値が減少していた。また、OPN欠損マウスでは生存率も上昇していた。
野生型マウスとOPN欠損マウス(OPN−/−)(Rittling SR.,et al.,Exp Nephrol,1999,7:103−113)にそれぞれConAを200μg/匹で投与した後、実施例2と同様に血清中のALT値測定を行った。また、ConAを400μg/匹投与してからの生存率を比較した。ALT値測定の結果を図6に示した。また、生存率の結果を図7に示した。
ALT値測定の結果より、OPN欠損マウスでは、野生型マウスと比べてALT値が減少していた。また、OPN欠損マウスでは生存率も上昇していた。
肝臓内におけるOPNとその受容体の産生細胞の解析:
(1)肝浸潤白血球の調製
300μgのConAを尾静脈内投与し作製した肝炎モデルマウスの肝臓を(6時間)取りだした後、ホモジナイズし、メッシュを通した。次いでこれを、PBSにて洗浄後、肝細胞を取り除くため、ヘパリン(100U/ml)を含む33%のPercollに加え、2,000回転で15分間処理して細胞ペレットを調製した。得られた細胞ペレットを赤血球溶血用緩衝液(以下、「HLB液」という)((株)免疫生物研究所製)で処理することにより、赤血球を溶血させた。更に、これらをPBSで3回洗浄した後、D−MEM/10%FCSに加えて肝浸潤白血球を調製した。
(2)肝浸潤白血球を用いた細胞内OPNの検出
肝臓内においてOPNが、NKT細胞またはT細胞のどちらの細胞から産生しているのかを確認するため、細胞内サイトカイン染色および細胞培養上清からのELISA法による測定をそれぞれ以下の手順で行った。
まず、上記(1)で調製した肝浸潤白血球は、モネンシン(monensin)存在下で90分培養し、抗NK1.1抗体と抗TCRβ抗体(ともにPhar Mingen製)で細胞表面分子を染色した。次に、4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定し、サポニンバッファー(1%FCS、0.1%サポニン、0.1%NaN3を含むPBS溶液)で膜透過処理を行った。更に、ビオチン化したOPN阻害抗体((株)免疫生物研究所製)を加え、ストレプトアビジン−APC(ジャクソン製)を二次抗体として使用し、FACSキャリバー(FACScaliber:BD製)にて解析した。
また、細胞培養上清からのELISAはmOPN EIA kit((株)免疫生物研究所製)を用いて行った。
肝炎モデルマウスの細胞内サイトカイン染色の結果を図8に示した。また、細胞培養上清のELISA法による測定結果を図9に示した。
細胞内サイトカイン染色により、NK1.1+TCR+であるNKT細胞集団の細胞内にOPNの発現が確認された。また、細胞培養上清中におけるOPN量のELISA測定により、NK1.1+TCR+であるNKT細胞集団においてOPN発現は検出されたが、NK1.1−TCR+であるT細胞集団においてOPN発現は検出されなかった。
従って、肝臓内におけるOPN産生細胞は主にNKT細胞であることが示唆された。
(3)肝炎発症に関わるOPN受容体およびMIP−2の解析
肝炎モデルマウスの肝臓内のNKT細胞およびT細胞から、α4インテグリン、α9インテグリンおよびMIP−2が発現されているかどうかを、NKT細胞およびT細胞からそれぞれ抽出したRNAを用いたRT−PCRで確認した。その結果を図10に示した。G3PDHはコントロールとして使用した。以下にRT−PCRに利用したプライマーとその配列を示した(配列番号4〜11)。
G3PDH:
α4インテグリン:
α9インテグリン:
(センス)
(アンチセンス)
MIP−2:
図10より、α9インテグリンおよびMIP−2はNKT細胞に発現しているが、T細胞には発現していなかった。一方、α4インテグリンはNKT細胞およびT細胞の両方に発現していた。
(1)肝浸潤白血球の調製
300μgのConAを尾静脈内投与し作製した肝炎モデルマウスの肝臓を(6時間)取りだした後、ホモジナイズし、メッシュを通した。次いでこれを、PBSにて洗浄後、肝細胞を取り除くため、ヘパリン(100U/ml)を含む33%のPercollに加え、2,000回転で15分間処理して細胞ペレットを調製した。得られた細胞ペレットを赤血球溶血用緩衝液(以下、「HLB液」という)((株)免疫生物研究所製)で処理することにより、赤血球を溶血させた。更に、これらをPBSで3回洗浄した後、D−MEM/10%FCSに加えて肝浸潤白血球を調製した。
(2)肝浸潤白血球を用いた細胞内OPNの検出
肝臓内においてOPNが、NKT細胞またはT細胞のどちらの細胞から産生しているのかを確認するため、細胞内サイトカイン染色および細胞培養上清からのELISA法による測定をそれぞれ以下の手順で行った。
まず、上記(1)で調製した肝浸潤白血球は、モネンシン(monensin)存在下で90分培養し、抗NK1.1抗体と抗TCRβ抗体(ともにPhar Mingen製)で細胞表面分子を染色した。次に、4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定し、サポニンバッファー(1%FCS、0.1%サポニン、0.1%NaN3を含むPBS溶液)で膜透過処理を行った。更に、ビオチン化したOPN阻害抗体((株)免疫生物研究所製)を加え、ストレプトアビジン−APC(ジャクソン製)を二次抗体として使用し、FACSキャリバー(FACScaliber:BD製)にて解析した。
また、細胞培養上清からのELISAはmOPN EIA kit((株)免疫生物研究所製)を用いて行った。
肝炎モデルマウスの細胞内サイトカイン染色の結果を図8に示した。また、細胞培養上清のELISA法による測定結果を図9に示した。
細胞内サイトカイン染色により、NK1.1+TCR+であるNKT細胞集団の細胞内にOPNの発現が確認された。また、細胞培養上清中におけるOPN量のELISA測定により、NK1.1+TCR+であるNKT細胞集団においてOPN発現は検出されたが、NK1.1−TCR+であるT細胞集団においてOPN発現は検出されなかった。
従って、肝臓内におけるOPN産生細胞は主にNKT細胞であることが示唆された。
(3)肝炎発症に関わるOPN受容体およびMIP−2の解析
肝炎モデルマウスの肝臓内のNKT細胞およびT細胞から、α4インテグリン、α9インテグリンおよびMIP−2が発現されているかどうかを、NKT細胞およびT細胞からそれぞれ抽出したRNAを用いたRT−PCRで確認した。その結果を図10に示した。G3PDHはコントロールとして使用した。以下にRT−PCRに利用したプライマーとその配列を示した(配列番号4〜11)。
G3PDH:
α4インテグリン:
α9インテグリン:
(センス)
(アンチセンス)
MIP−2:
図10より、α9インテグリンおよびMIP−2はNKT細胞に発現しているが、T細胞には発現していなかった。一方、α4インテグリンはNKT細胞およびT細胞の両方に発現していた。
OPNのトロンビン消化物に対する細胞遊走試験:
(1)細胞遊走試験
肝浸潤白血球のOPNのトロンビン消化物に対する細胞遊走試験を行った。まず、実施例5で調製した肝炎モデルマウスの肝浸潤白血球の10μg/mlに、それぞれ全長OPN(rOPN:非切断型OPN)を10μg/ml、トロンビン(Thr)を1U/ml、OPNのトロンビン消化物(Thr−OPN)を10μg/mlを添加し、37℃で2時間培養した後、細胞遊走効果をケモタキシスチャンバー(ポアサイズ5μmの24穴Transwell tissue culture plate(Costar製))を用いて行った。また、野生型マウスから得られた肝浸潤白血球についても同様の細胞遊走試験を行った。それらの結果を図11に示した。
細胞遊走試験の結果、肝炎モデルマウスから得られた細胞は、OPNのトロンビン消化物に対する遊走効果が認められたが、全長OPN(非切断型OPN)に対する遊走効果はほとんど認められなかった。一方、野生型マウスから採取した細胞は、いずれのOPNにも反応性を示さなかった。次に、どの受容体が細胞遊走に関わっているかを、抗体を用いた阻害試験によって同定した。
(2)細胞遊走阻害試験
肝炎モデルマウスから得られた細胞の、OPNのトロンビン消化物(Thr−OPN)10μg/mlに対する細胞遊走効果を、実施例2で得られたM5抗体、M1抗体(O−17)((株)免疫生物研究所製)、抗インテグリンβ1(HMβ1)抗体、抗β3(HMβ3)抗体、抗αv(RMV−7)抗体および抗α4(R1−2)抗体(何れもPharMingen製)の100μg/mlで阻害した。その結果を図12に示した。
阻害試験の結果、肝炎モデルマウスから得られた細胞のOPNのトロンビン消化物(Thr−OPN)に対する細胞遊走はM5抗体により阻害された。また、抗インテグリンβ1抗体と抗α4インテグリン抗体も細胞遊走を阻害した。
(1)細胞遊走試験
肝浸潤白血球のOPNのトロンビン消化物に対する細胞遊走試験を行った。まず、実施例5で調製した肝炎モデルマウスの肝浸潤白血球の10μg/mlに、それぞれ全長OPN(rOPN:非切断型OPN)を10μg/ml、トロンビン(Thr)を1U/ml、OPNのトロンビン消化物(Thr−OPN)を10μg/mlを添加し、37℃で2時間培養した後、細胞遊走効果をケモタキシスチャンバー(ポアサイズ5μmの24穴Transwell tissue culture plate(Costar製))を用いて行った。また、野生型マウスから得られた肝浸潤白血球についても同様の細胞遊走試験を行った。それらの結果を図11に示した。
細胞遊走試験の結果、肝炎モデルマウスから得られた細胞は、OPNのトロンビン消化物に対する遊走効果が認められたが、全長OPN(非切断型OPN)に対する遊走効果はほとんど認められなかった。一方、野生型マウスから採取した細胞は、いずれのOPNにも反応性を示さなかった。次に、どの受容体が細胞遊走に関わっているかを、抗体を用いた阻害試験によって同定した。
(2)細胞遊走阻害試験
肝炎モデルマウスから得られた細胞の、OPNのトロンビン消化物(Thr−OPN)10μg/mlに対する細胞遊走効果を、実施例2で得られたM5抗体、M1抗体(O−17)((株)免疫生物研究所製)、抗インテグリンβ1(HMβ1)抗体、抗β3(HMβ3)抗体、抗αv(RMV−7)抗体および抗α4(R1−2)抗体(何れもPharMingen製)の100μg/mlで阻害した。その結果を図12に示した。
阻害試験の結果、肝炎モデルマウスから得られた細胞のOPNのトロンビン消化物(Thr−OPN)に対する細胞遊走はM5抗体により阻害された。また、抗インテグリンβ1抗体と抗α4インテグリン抗体も細胞遊走を阻害した。
CD4+T細胞活性化阻害試験:
実施例2で得られたM5抗体を用いてCD4+T細胞活性化阻害試験を行った。肝浸潤活性化CD4+T細胞の数を、PE標識CD4(L3T4:PharMingen製)抗体とFITC標識CD69抗体(PharMingen製)を用い、FACSキャリバー(FACScaliber:BD製)にて解析した(以下、「FACS解析」という)。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に試験を行った。それらの結果を図13に示した。また、それらの解析結果から活性化CD4+T細胞数を算出したものを図14に示した。
肝浸潤活性化CD4+T細胞の数を解析した結果、M5抗体投与により肝臓中の活性化CD4+T細胞の割合の減少および細胞数の減少が認められた。
実施例2で得られたM5抗体を用いてCD4+T細胞活性化阻害試験を行った。肝浸潤活性化CD4+T細胞の数を、PE標識CD4(L3T4:PharMingen製)抗体とFITC標識CD69抗体(PharMingen製)を用い、FACSキャリバー(FACScaliber:BD製)にて解析した(以下、「FACS解析」という)。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に試験を行った。それらの結果を図13に示した。また、それらの解析結果から活性化CD4+T細胞数を算出したものを図14に示した。
肝浸潤活性化CD4+T細胞の数を解析した結果、M5抗体投与により肝臓中の活性化CD4+T細胞の割合の減少および細胞数の減少が認められた。
ConA投与後の肝臓内浸潤細胞の解析:
(1)好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数の算出
野生型マウスとOPN欠損マウスにそれぞれConAを投与してから6時間後の肝臓内浸潤細胞中の好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数を、FACS解析にて算出した。Gr1+CD11b+、CD4+、F4/80+画分をそれぞれ好中球、CD4+T細胞、マクロファージ画分とした。Gr1+CD11b+およびCD4+、F4/80+の染色は以下のようにして行った。ConA投与後、6時間の肝臓から浸潤白血球を精製し、ビオチン化CD4(L3T4)抗体、Gr1(RB6−8C5)抗体(共にPharMingen製)、ビオチン化F4/80抗体(Caltag laboratories製)で反応させ、ストレプトアビジン−FITC(DAKO製)で検出した。FACS解析の結果から算出された各マウスにおけるそれぞれの好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数を図15に示した。
FACS解析の結果、野生型マウスにおいて好中球が他の細胞と比較して非常に多いことが確認された。また、OPN欠損マウスでは好中球の欠損が確認された。
(2)MPO(ミエロペルオキシダーゼ)抗体による肝炎組織における好中球の発現の解析
肝炎モデルマウスから得られた肝組織をパラフィン包埋した後、5μmに薄切し、内因性ペルオキシダーゼ処理を行った。次いでこの薄片に1次抗体として抗MPO抗体(DAKO製)を4℃一晩反応させた。次に、二次抗体としてENVISION(DAKO製)を反応させ、免疫染色を行った。
この免疫染色の結果を図16に示した。
その結果、壊死した肝細胞内に好中球の集積がみられ、肝炎発症と好中球遊走の関与が確認された。
(1)好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数の算出
野生型マウスとOPN欠損マウスにそれぞれConAを投与してから6時間後の肝臓内浸潤細胞中の好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数を、FACS解析にて算出した。Gr1+CD11b+、CD4+、F4/80+画分をそれぞれ好中球、CD4+T細胞、マクロファージ画分とした。Gr1+CD11b+およびCD4+、F4/80+の染色は以下のようにして行った。ConA投与後、6時間の肝臓から浸潤白血球を精製し、ビオチン化CD4(L3T4)抗体、Gr1(RB6−8C5)抗体(共にPharMingen製)、ビオチン化F4/80抗体(Caltag laboratories製)で反応させ、ストレプトアビジン−FITC(DAKO製)で検出した。FACS解析の結果から算出された各マウスにおけるそれぞれの好中球、CD4+T細胞、マクロファージ数を図15に示した。
FACS解析の結果、野生型マウスにおいて好中球が他の細胞と比較して非常に多いことが確認された。また、OPN欠損マウスでは好中球の欠損が確認された。
(2)MPO(ミエロペルオキシダーゼ)抗体による肝炎組織における好中球の発現の解析
肝炎モデルマウスから得られた肝組織をパラフィン包埋した後、5μmに薄切し、内因性ペルオキシダーゼ処理を行った。次いでこの薄片に1次抗体として抗MPO抗体(DAKO製)を4℃一晩反応させた。次に、二次抗体としてENVISION(DAKO製)を反応させ、免疫染色を行った。
この免疫染色の結果を図16に示した。
その結果、壊死した肝細胞内に好中球の集積がみられ、肝炎発症と好中球遊走の関与が確認された。
肝炎モデルマウスにおけるOPNのトロンビン消化物の機能の解析:
(1)好中球のMPO活性に種々のOPNが与える影響
12%カゼインナトリウム溶液をマウス腹腔内投与し6時間後に腹腔内から採取した好中球を種々のGST融合OPN蛋白質20μg/mlで刺激した。
全長マウスOPN(L17−N294)はトロンビンによってR154とS155で切断され、N末端側のNハーフOPN(L17−R154)とC末端側のCハーフOPN(S155−N294)となるので、これらをGST融合タンパク質となるように次に示す方法にて作製した。なお、NハーフOPNとCハーフOPNは、マウス腎臓cDNAから次のプライマー(配列番号12〜15)を用いてPCRによりクローニングした。
全長マウスOPN:
(センス)
(アンチセンス)
NハーフOPN:
全長OPNフォワードプライマー
(センス)
(アンチセンス)
CハーフOPN
(センス)
全長マウスOPNリバースプライマー
(アンチセンス)
上記のプライマーを用いて得られるPCR産物は、BamHIとXhoIで制限酵素消化後、pGEX6P−1ベクター(Amersham製)に導入し、ABI 310 Genetic Analyzer automatic sequencer(Applied Biosystems製)を用いて配列を確認した。次に、この配列を大腸菌JM109に導入して大腸菌を形質転換後、GST融合OPN蛋白質を常法により精製した。
20μg/mlの上記GST融合OPN蛋白質で好中球を36時間刺激した培養上清からMPO(ミエロペルオキシダーゼ)活性を測定した。MPO活性は、50μlの培養上清と100μlの3,3’,5,5’−tetramethylbenzidine liquid substrate system(Sigma製)とを混和し、37℃で30分加温し、450nmの吸光度を測定することにより定量化した。その結果を図17に示した。図中の全ての値はコントロールGSTで測定されたMPO活性で差し引いた値である。
本結果から、NハーフOPNがMPO活性を上昇させることが確認された。
(2)好中球の肝臓内への浸潤のFACS解析
M5抗体投与の有無でのConA投与6時間後の肝臓内浸潤好中球を測定した。ConA投与肝臓から白血球を採取し、Gr1+CD11b+細胞をFACS解析した。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に解析を行った。それらの結果を図18に示した。
FACS解析の結果、M5抗体投与により、好中球の肝臓内への浸潤が抑制されることが確認された。
(3)肝臓中MIP−2値の測定
野生型マウスにConAを投与した後、6、12、24時間後の肝臓中におけるMIP−2値をMIP−2 EIA kit((株)免疫生物研究所製)を用いて測定した。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に測定を行った。それらの結果を図19に示した。
肝臓中MIP−2値の測定の結果、M5抗体投与によりMIP−2の発現が減少していることが確認された。
(4)肝臓内におけるOPN受容体α4、α9インテグリンの発現の解析
α4インテグリンとα9インテグリンの発現を実施例5と同様のプライマーを用いたリアルタイムPCRで測定した。測定した値はG3PDHにて補正することにより定量化した。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に解析を行った。それらの結果を図20に示した。
肝臓内におけるOPN受容体α4、α9インテグリンの発現解析の結果、α4、α9インテグリンmRNAは、M5抗体投与により減少していることが確認された。これは肝臓内にα4、α9インテグリンを発現する細胞の浸潤が抑制されていることを示唆する結果であった。
(1)好中球のMPO活性に種々のOPNが与える影響
12%カゼインナトリウム溶液をマウス腹腔内投与し6時間後に腹腔内から採取した好中球を種々のGST融合OPN蛋白質20μg/mlで刺激した。
全長マウスOPN(L17−N294)はトロンビンによってR154とS155で切断され、N末端側のNハーフOPN(L17−R154)とC末端側のCハーフOPN(S155−N294)となるので、これらをGST融合タンパク質となるように次に示す方法にて作製した。なお、NハーフOPNとCハーフOPNは、マウス腎臓cDNAから次のプライマー(配列番号12〜15)を用いてPCRによりクローニングした。
全長マウスOPN:
(センス)
(アンチセンス)
NハーフOPN:
全長OPNフォワードプライマー
(センス)
(アンチセンス)
CハーフOPN
(センス)
全長マウスOPNリバースプライマー
(アンチセンス)
上記のプライマーを用いて得られるPCR産物は、BamHIとXhoIで制限酵素消化後、pGEX6P−1ベクター(Amersham製)に導入し、ABI 310 Genetic Analyzer automatic sequencer(Applied Biosystems製)を用いて配列を確認した。次に、この配列を大腸菌JM109に導入して大腸菌を形質転換後、GST融合OPN蛋白質を常法により精製した。
20μg/mlの上記GST融合OPN蛋白質で好中球を36時間刺激した培養上清からMPO(ミエロペルオキシダーゼ)活性を測定した。MPO活性は、50μlの培養上清と100μlの3,3’,5,5’−tetramethylbenzidine liquid substrate system(Sigma製)とを混和し、37℃で30分加温し、450nmの吸光度を測定することにより定量化した。その結果を図17に示した。図中の全ての値はコントロールGSTで測定されたMPO活性で差し引いた値である。
本結果から、NハーフOPNがMPO活性を上昇させることが確認された。
(2)好中球の肝臓内への浸潤のFACS解析
M5抗体投与の有無でのConA投与6時間後の肝臓内浸潤好中球を測定した。ConA投与肝臓から白血球を採取し、Gr1+CD11b+細胞をFACS解析した。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に解析を行った。それらの結果を図18に示した。
FACS解析の結果、M5抗体投与により、好中球の肝臓内への浸潤が抑制されることが確認された。
(3)肝臓中MIP−2値の測定
野生型マウスにConAを投与した後、6、12、24時間後の肝臓中におけるMIP−2値をMIP−2 EIA kit((株)免疫生物研究所製)を用いて測定した。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に測定を行った。それらの結果を図19に示した。
肝臓中MIP−2値の測定の結果、M5抗体投与によりMIP−2の発現が減少していることが確認された。
(4)肝臓内におけるOPN受容体α4、α9インテグリンの発現の解析
α4インテグリンとα9インテグリンの発現を実施例5と同様のプライマーを用いたリアルタイムPCRで測定した。測定した値はG3PDHにて補正することにより定量化した。また、比較としてコントロール抗体(正常ウサギIgG)を用いて同様に解析を行った。それらの結果を図20に示した。
肝臓内におけるOPN受容体α4、α9インテグリンの発現解析の結果、α4、α9インテグリンmRNAは、M5抗体投与により減少していることが確認された。これは肝臓内にα4、α9インテグリンを発現する細胞の浸潤が抑制されていることを示唆する結果であった。
肝臓中のサイトカイン濃度の測定:
(1)肝臓中IFN−γ発現細胞の解析
ConA投与マウスから分離したNKT細胞とT細胞の培養上清中のIFN−γをIFN−γ EIA kit(Pharmingen製)を用いて測定した。その結果を図21に示した。
肝臓中IFN−γ発現細胞の解析の結果、IFN−γは、主にNKT細胞から産生していることが確認された。
(2)肝臓中IFN−γ量の測定
M5抗体を投与したConA肝炎マウスと、コントロール抗体を投与したConA肝炎マウスにおける肝臓中のIFN−γ発現量をIFN−γ EIA kit(Pharmingen製)を用いて定量した。それらの結果を図22に示した。
肝臓中IFN−γ量の測定の結果、M5抗体の投与により、コントロールの抗体を投与した場合よりも、IFN−γ量が有意に減少していることが確認された。
以上のことからNKT細胞が産生するOPNがオートクラインでNKT細胞に働いてNKT細胞を活性化させていることが考えられた。OPNを抗体にて阻害することでIFN−γ産生が低下したことから、OPNがNKT細胞活性化に重要な役割をしていることが示唆された。
(1)肝臓中IFN−γ発現細胞の解析
ConA投与マウスから分離したNKT細胞とT細胞の培養上清中のIFN−γをIFN−γ EIA kit(Pharmingen製)を用いて測定した。その結果を図21に示した。
肝臓中IFN−γ発現細胞の解析の結果、IFN−γは、主にNKT細胞から産生していることが確認された。
(2)肝臓中IFN−γ量の測定
M5抗体を投与したConA肝炎マウスと、コントロール抗体を投与したConA肝炎マウスにおける肝臓中のIFN−γ発現量をIFN−γ EIA kit(Pharmingen製)を用いて定量した。それらの結果を図22に示した。
肝臓中IFN−γ量の測定の結果、M5抗体の投与により、コントロールの抗体を投与した場合よりも、IFN−γ量が有意に減少していることが確認された。
以上のことからNKT細胞が産生するOPNがオートクラインでNKT細胞に働いてNKT細胞を活性化させていることが考えられた。OPNを抗体にて阻害することでIFN−γ産生が低下したことから、OPNがNKT細胞活性化に重要な役割をしていることが示唆された。
OPN阻害抗体の投与時期の検討:
OPN阻害抗体の投与時期を検討するために、M5抗体の400μgをConAを投与する3時間前とConAの投与と同時に各マウスに投与し、ALT値を測定した。その結果を図23に示した。
ALT値の測定の結果、ConAの投与3時間前にM5抗体を投与した場合には特に優れた肝炎抑制効果が認められた。一方、ConAの投与と同時にM5抗体を投与した場合であっても、肝炎抑制効果が認められた。
上記の通り、ConAを投与して発生するマウスの肝炎においてNKT細胞が主要なOPN産生細胞であることが判明した。そしてOPN阻害抗体を投与することにより、IFN−γおよびMIP−2の産生が阻害され、その結果、NKT細胞の活性化を阻害できることが判明した。また、NKT細胞の活性化を阻害できることから、IL−4の産生も阻害することができると考えられる。更に、前記活性化に関連するCD4+T細胞および好中球の活性化の阻害や、また更にこれらの活性化に関連するFas/FasL媒介細胞障害および好中球媒介細胞障害も阻害できることが判明した。
従って、上記の活性化を阻害することにより、これら免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療できることが判明した。
このようにマウスのOPN阻害抗体(M5抗体)がNKT細胞活性化、CD4+T細胞活性化、好中球活性等の阻害効果を示し、免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患を治療できることから、ヒトOPN阻害抗体(2K1抗体)についても、同様に疾患を治療しうることが示唆された。
OPN阻害抗体の投与時期を検討するために、M5抗体の400μgをConAを投与する3時間前とConAの投与と同時に各マウスに投与し、ALT値を測定した。その結果を図23に示した。
ALT値の測定の結果、ConAの投与3時間前にM5抗体を投与した場合には特に優れた肝炎抑制効果が認められた。一方、ConAの投与と同時にM5抗体を投与した場合であっても、肝炎抑制効果が認められた。
上記の通り、ConAを投与して発生するマウスの肝炎においてNKT細胞が主要なOPN産生細胞であることが判明した。そしてOPN阻害抗体を投与することにより、IFN−γおよびMIP−2の産生が阻害され、その結果、NKT細胞の活性化を阻害できることが判明した。また、NKT細胞の活性化を阻害できることから、IL−4の産生も阻害することができると考えられる。更に、前記活性化に関連するCD4+T細胞および好中球の活性化の阻害や、また更にこれらの活性化に関連するFas/FasL媒介細胞障害および好中球媒介細胞障害も阻害できることが判明した。
従って、上記の活性化を阻害することにより、これら免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療できることが判明した。
このようにマウスのOPN阻害抗体(M5抗体)がNKT細胞活性化、CD4+T細胞活性化、好中球活性等の阻害効果を示し、免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患を治療できることから、ヒトOPN阻害抗体(2K1抗体)についても、同様に疾患を治療しうることが示唆された。
本発明の免疫担当細胞活性化阻害剤は、免疫担当細胞の活性化を阻害するものである。
従って、上記阻害剤を有効成分とすることで免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬として有用である。
従って、上記阻害剤を有効成分とすることで免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬として有用である。
Claims (23)
- オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤。
- オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体が、RGD配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつSVVYGLR配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である請求項第1項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、オステオポンチンのN末端フラグメントである請求項第1項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の(A)で示されるペプチドを含むペプチドである請求項第1項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(A)RGDSVVYGLR - オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の(B)で示されるペプチドを含むペプチドである請求項第1項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
(B)VDTYDGRGDSVVYGLRS - 免疫担当細胞が、NKT細胞である請求項第1項ないし第5項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- NKT細胞のIFN−γ産生を阻害するものである請求項第6項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- NKT細胞のMIP−2産生を阻害するものである請求項第6項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- NKT細胞のIL−4産生を阻害するものである請求項第6項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- 免疫担当細胞が、好中球である請求項第1項ないし第5項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- 免疫担当細胞が、T細胞である請求項第1項ないし第5項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- T細胞が、CD4+T細胞である請求項第11項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- Fas/FasL媒介細胞障害を阻害するものである請求項第1項ないし第12項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- 好中球媒介細胞障害を阻害するものである請求項第1項ないし第12項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
- 請求項第1項ないし第14項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬。
- 免疫担当細胞が、NKT細胞、好中球、T細胞から選ばれる免疫担当細胞の1種以上である請求項第15項記載の疾患の治療薬。
- 免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患が、肝炎、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症から選ばれる疾患である請求項第15項または第16項記載の疾患の治療薬。
- 請求項第1項ないし第14項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする肝障害の治療薬。
- 肝障害が、ウイルス性肝炎または薬物性肝炎である請求項第18項記載の肝障害の治療薬。
- 肝障害が、自己免疫性肝炎である請求項第18項記載の肝障害の治療薬。
- 肝細胞の壊死を抑制するものである請求項第18項ないし第20項の何れかの項記載の肝障害の治療薬。
- 免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の患者に、請求項第15項ないし第17項の何れかの項記載の治療薬を投与することを特徴とする当該疾患の治療方法。
- 肝障害患者に、請求項第18項ないし第21項の何れかの項記載の肝障害の治療薬を投与することを特徴とする肝障害の治療方法。
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