CN101293916A

CN101293916A - 骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及用途

Info

Publication number: CN101293916A
Application number: CNA2007100398786A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 戴建新; 王皓; 寇庚; 侯盛; 钱卫珠; 樊克兴
Original assignee: SHANGHAI GUOJIAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY INSTITUTE
Current assignee: SHANGHAI GUOJIAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2007-04-24
Filing date: 2007-04-24
Publication date: 2008-10-29
Also published as: JP2010524475A; EP2143734A1; EP2143734A4; BRPI0810664A2; CN101679518B; WO2008128456A1; US20100239588A1; CN101679518A; CA2685185A1

Abstract

本发明公开了骨桥蛋白的功能表位QLYXXYP或WLXPDP(其中X可以为任何氨基酸)，本发明还公开了与这些功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体，这些单克隆抗体可以为23C3或F8E11。本发明还公开了这些抗体在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病药物中的应用，这些自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、克隆氏病。

Description

骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及用途

技术领域

本发明属于免疫学领域，更具体地，本发明公开了一种蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体和这些抗体的用途。

背景技术

自身免疫是指机体免疫系统针对自身组织成分产生了抗体和致敏淋巴细胞，引起免疫应答的现象。当自身免疫引起自身组织器官功能障碍并出现临床症状者，称为自身免疫病(autoimmune disease，AID)。目前发现的自身免疫病有30余种，大多为原发性，少数为继发性。原发性自身免疫病原因不明，与遗传因素密切相关，分为器官特异性和非器官特异性。器官特异性AID的靶抗原和病变常局限于某一特定器官，非器官特异性AID的靶抗原和病变常呈全身性或系统性。近年来，自身免疫及其引起的疾病越来越受到人们的关注，全球约有几亿人正遭受着该病带来的痛苦。该病病程长，可致残，严重的可致死，由于此问题的广泛性及严重性掀起了全球的自身免疫病的研究热潮。

自身免疫病发病机制十分复杂，目前对其确切的致病机理尚不完全清楚。暂且认为，具有某种遗传特征(由AID相关基因多态性决定)的个体，由于某些内外致病因素刺激(自身抗原释放、变构及超抗原分子模拟等)或自身免疫反应细胞基因突变、修饰等原因，导致抗原提呈细胞(APC)或树突状细胞异常活化、免疫调节网络失衡(TH1/TH2平衡破坏)、自身免疫细胞多克隆活化或凋亡延迟等改变，从而可能发生自身免疫病。自身免疫性疾病发病涉及包括遗传、感染、免疫功能异常等在内的众多因素。尽管发病机制仍不明确，但是大量的研究发现各种炎症因子，如TNF-a、IL-1b及IL-6等在自身免疫性疾病的患者中水平大大高于正常者，而且抗TNF-a单抗、IL-1受体拮抗剂具有明显的治疗效果，大大改善了患者的病情，尤其是对于某些自身免疫性疾病，如：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克隆氏病等(The therapeutic effects of an engineered humananti-tumour necrosis factor alpha antibody(CDP571)in rheumatoidarthritis.1995.Br.J.Rheumatol.34：334-342；Infliximab(chimericantitumour necrosis factor alpha monoclonal antibody)versus placebo inrheumatoid arthritis patients receiving concomitant methotrexate：arandomised phase III trial.ATTRACT Study Group.Lancet.1999.354：1932-1939；Infliximab and methotrexate in the treatment ofrheumatoid arthritis.N.Engl.J.Med.2000.343：1594-1602)。虽然这些生物治疗疗效显著，但仍不能完全的缓解和治疗这些疾病。近年来的大量研究发现，趋化因子在自身免疫性疾病中也起到重要的作用，它们能够精确的调节和控制白细胞向炎症组织的迁移，并且减低凋亡活性、延长B、T细胞寿命，从而攻击靶组织。

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)，又称为早期T淋巴细胞活化因子I(Eta-1)或分泌型磷蛋白I，含有Arg-Gly-Asp(RGD，精氨酸一甘氨酸一天门冬氨酸)三肽序列，分子量根据去磷酸化及糖基化形式的不同大约为44-66KD之间，是一种重要的多功能细胞外基质蛋白(Eta-1(osteopontin)：an early component oftype-1(cell-mediated)immunity.Science.2000.287：860-864)。OPN在骨组织细胞、巨噬细胞、活化的T细胞及上皮细胞等多种细胞上表达，在介导细胞的趋化、粘附、增殖和迁移，肿瘤转移，骨组织的矿化与重建，免疫调节，信号转导，以及对感染性疾病的免疫能力等方面有着重要的作用(Osteoprotegerin Ligand Is a Cytokine that Regulates OsteoclastDifferentiation and Activation.Cell，1998.93：65-176.Osteopontin：rolein cell signaling and cancer progression.TRENDS in Cell Biology2006.16：79-87.)。OPN主要是通过RGD及非RGD两个途径与细胞表面的受体相结合而实现其功能(Inhibition of Arg-Gly-Asp(RGD)-mediated Cell Adhesionto osteopontin by a Monoclonal Antibody against osteopontin.J.Bio.Chem.1994.269：23280-23285)，RGD途径主要是与细胞表面的整合素受体(αγβ3、αγβ1、αγβ5)结合，而非RGD途径主要是与某些CD44的变异体(V6、V7)结合，从而介导细胞的多种生理功能(Intracellular Osteopontin Is an IntegralComponent of the CD44-ERM Complex Involved in Cell Migration.JOURNALOF CELLULAR PHYSIOLOGY.2000：184：118-130)。总的说来，细胞所分泌的OPN经过磷酸化、糖基化，然后再经过凝血酶的剪切等一系列表达后修饰作用，以多种形式存在于机体中，每种形式可能有其独特的功能，但目前的研究还不能充分说明，有待进一步的研究与探讨。

大量研究表明在自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、多发性硬化症，自身免疫性肝炎、克隆氏病等)中，组织及血浆中OPN的水平明显上调(Expressionof osteopontin at sites of bone erosion in a murine experimental arthritismodel of collagen-induced arthritis：possible involvement of osteopontinin bone destruction in arthritis.Arthritis Rheum.2002.46：1094-1101；Role of osteopontin in amplification and perpetuation of rheumatoidsynovitis.J.Clin.Invest.2005.115：1060-1067.Osteopontin/Eta-1upregulated in Crohn’s disease regulates the Th1 immune response.Gut.2005.54：1254-1262.Osteopontin as a Mediator of NKT Cell Function in TCell-Mediated Liver Diseases.Immunity，2004.21：539-550)。OPN通过与淋巴细胞，巨噬细胞表面的CD44及其他整合素受体结合，招募炎症细胞在靶器官集聚，同时进一步的促进各种炎症细胞的活化，分泌大量的促炎因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)(Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR withinosteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis.J.Clin.Invest.2003.112：181-188)。此外，在类风湿性关节炎(RA)中，OPN还可通过与破骨细胞表面的αγβ3和αγβ5受体介导骨的破坏吸收，加重RA的发病(Osteopontin.Crit Rev Oral Biol Med.2000；11(3)：279-303)。研究表明，在OPN基因缺失的小鼠中，关节炎的发病率及严重程度明显降低(Osteopontindeficiency protects joints against destruction in anti-type II collagenantibodyinduced arthritis in mice.PNAS.2002.99(7)：4556-4561)，ConA诱导的自身免疫性肝炎的发病率及肝脏破坏程度也明显减轻(Osteopontin as aMediator of NKT Cell Function in T Cell-Mediated Liver Diseases.Immunity，2004.21：539-550.)，而且对DSS诱导的小鼠克隆氏病也有保护作用(Osteopontin deficiency protects mice from Dextran sodiumsulfate induced colitis.Inflamm Bowel Dis.2006.12(8)：790-6)。在上述的模型中，抗OPN的多克隆抗体也可以明显的降低类风湿性关节炎模型小鼠的发病，减轻关节肿胀、畸形的程度(essential role of the cryptic epitopeSLAYGLR within osteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis.J.Clin.Invest.2003.112：181-188)；对肝脏的炎症也能明显减轻(Osteopontin as a Mediator of NKT Cell Function in T Cell-Mediated LiverDiseases.Immunity，2004.21：539-550)。由此可见，OPN是自身免疫性疾病的重要发病因素，OPN将是一个治疗自身免疫性疾病的有效药物靶点。

发明内容

本发明公开了骨桥蛋白的功能表位，更具体地，为QLYXXYP或WLXPDP，其中X可以为任何氨基酸。

本发明还公开了与上述功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。这些单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列可以为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8之一，轻链可变区氨基酸序列可以为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10之一。

更具体的，本发明公开了抗骨桥蛋白的单克隆抗体23C3，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.6，恒定区为小鼠IgG恒定区。

本发明还公开了抗骨桥蛋白的单克隆抗体F8E11，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.8，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.10，恒定区为小鼠IgG恒定区。

本发明公开了一种DNA分子，编码与上述功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。具体地，其编码重链可变区的核苷酸序列可以为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7之一，编码轻链可变区的核苷酸序列可以为SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.9之一。

本发明还公开了编码抗骨桥蛋白的单克隆抗体23C3的重链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.3，编码其轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

本发明更进一步公开了编码抗骨桥蛋白的单克隆抗体F8E11的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，编码其轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。

本发明还公开了上述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病药物中的应用。这些自身免疫性疾病可以为类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、克隆氏病。

本发明所述的与本发明中公开的上述骨桥蛋白功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体，包括但不限于重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.8之一与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10之一利用现有的分子生物学技术得到的单克隆抗体，还包括与本发明中公开的上述骨桥蛋白功能表位特异性相结合的利用现有的分子生物学技术可以得到的嵌合的单克隆抗体、人源化及全人源的单克隆抗体。

具体地，本发明的申请人首先利用分子生物技术克隆人和鼠OPN基因，利用真核细胞表达了人和鼠的OPN蛋白，并通过细胞融合-杂交瘤的方法制备了两株抗人的OPN单克隆抗体23C3和F8E11，还对这两株单抗的基因进行了克隆并测定了其序列。

本发明的申请人还建立了胶原诱导的DBA/1J小鼠关节炎模型、ConA诱导的自身免疫性肝炎模型、DSS诱导的小鼠克隆氏病模型，利用上述两株单克隆抗体在这三种自身免疫性疾病模型中进行实验，观察其保护作用。利用关节炎模型进行实验的实验结果显示，本发明公开的上述单克隆抗体可以显著降低关节炎的发病指数、延迟发病时间，抑制破骨细胞的功能、降低关节炎的骨质破坏和吸收，还可以很好地保护骨吸收、有效地阻断淋巴细胞的迁移，从而减轻或缓解关节炎疾病的症状。利用自身免疫性肝炎模型进行实验的结果显示，这些单克隆抗体通过中和肝脏组织中OPN蛋白、调控OPN的mRNA水平，降低促炎因子的水平、下调Th1型免疫反应NF-κB水平从而达到保护肝脏、降低死亡率的目的。利用克隆氏病模型进行实验的实验结果显示，这些单克隆抗体可以中和组织中OPN蛋白，调控OPN的mRNA水平，降低MPO的活性、减少淋巴细胞和中性粒细胞的浸润、降低促炎因子的水平，从而减轻炎症及溃疡程度，保护肠或/和结肠组织，缓解克隆氏病的症状，从而达到预防和/或治疗的目的。

本发明中所述的预防和/或治疗，包括但不限于缓解或/和减轻疾病的各种症状。

本发明的申请人还利用噬菌体展示技术鉴定了23C3与F8E11单抗作用的OPN不同的功能表位，这些功能表位为QLYXXYP或WLXPDP，其中X可以为任何氨基酸，从而进一步的阐明OPN分子的作用靶点。更具体地，本发明的申请人通过单克隆抗体抗原表位的淘选、噬菌体ELISA和蛋白质印迹鉴定、测序及序列分析推测出OPN不同的功能表位，进一步通过噬菌体与抗体结合能力分析选择结合力最强的克隆合成了系列短肽，通过这些短肽与特异性抗体的结合实验对这些功能性表位进行了鉴定。

附图说明

图1：人、鼠OPN真核表达纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中M代表蛋白质标准分子量。

图2：23C3和F8E11为一抗的Western blotting结果。

图3：23C3和F8E11单抗治疗对CIA小鼠关节炎发病指数、发病时间及发病率的影响结果；图3-1为各治疗组CIA小鼠的关节炎发病指数；图3-2为各治疗组CIA小鼠的发病关节照片；图3-3为各治疗组CIA小鼠的发病率曲线；control Ig为对照抗体小鼠IgG(以下同)。

图4：23C3和F8E11单抗治疗对CIA小鼠关节骨吸收的保护作用结果。

图5：23C3和F8E11单抗体外对淋巴细胞的迁移抑制作用结果。

图6：不同治疗组CIA小鼠血浆及关节组织中OPN水平的变化结果；图6-1血浆中OPN水平的变化实验结果；图6-2关节组织中OPN水平的变化实验结果。

图7：不同治疗组CIA小鼠关节组织中OPN受体水平的变化结果(

为未处理的正常小鼠，以下同)。

图8：不同治疗组CIA小鼠关节组织中各种细胞因子水平的变化结果。

图9：不同治疗组体外淋巴细胞回忆应答反应的变化结果；图9-1为不同治疗组体外淋巴细胞回忆应答反应的变化结果；图9-2为23C3和F8E11单抗体外对淋巴细胞回忆应答反应的抑制功能实验结果。

图10：不同治疗组CIA小鼠血清中自身抗体水平的变化结果。

图11：不同治疗组CIA小鼠关节组织中RANKL/RANK/OPG水平的变化结果。

图12：不同治疗组CIA小鼠尿液中D-pyr水平的变化结果。

图13：应用23C3和F8E11单抗对肝炎模型小鼠的死亡率影响结果。

图14：应用23C3和F8E11单抗对肝炎模型小鼠的肝脏保护作用结果；图14-1为不同治疗组血浆中ALT和AST水平；图14-2为不同治疗组肝脏HE及TUNEL染色结果，A，C，E，G:HE染色，B，D，F，H:TUNEL染色；I：各组TUNEL染色阳性细胞比例。

图15：不同治疗组肝炎模型小鼠血浆及肝脏组织中OPN水平的变化结果；

图15-1为血浆中OPN水平变化结果；图15-2为肝脏组织中OPN水平变化结果。

图16：不同治疗组肝炎模型小鼠血浆及肝脏组织中各细胞因子水平的变化结果；图16-1为不同治疗组血清中TNF-α、IFN-γ的水平变化结果；

图16-2不同治疗组肝组织中各类细胞因子的mRNA水平变化结果。

图17：不同治疗组肝炎模型小鼠肝脏组织中NF-kB水平的变化结果(1为无肝炎小鼠组，2为对照抗体治疗组，3为抗体23C3治疗组，4为F8E11抗体治疗组)。

图18：应用23C3和F8E11单抗对Crohn’s病模型小鼠体重、疾病活动指数(DAI)及脾指数的影响结果；图18-1为不同治疗组小鼠的体重变化；图18-2为不同治疗组的疾病活动指数(DAI)；图18-3为不同治疗组的脾脏指数。

图19：不同治疗组Crohn’s病模型小鼠结肠病理组织变化结果(A.正常组，B.23C3治疗组，C.F8E11治疗组，D.control Ig组)。

图20：应用23C3和F8E11单抗对Crohn’s病模型小鼠肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的影响结果。

图21：不同治疗组Crohn’s病模型小鼠肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平的变化结果。

图22：不同治疗组Crohn’s病模型小鼠肠组织及血浆中OPN水平的变化结果；图22-1为血浆中OPN水平的变化结果；图22-2为肠组织中OPN水平的变化结果。

图23：用23C3淘选三轮后的产出效率比较图。

图24：23C3阳性噬菌体ELISA和WESTERN鉴定图；图24-1为阳性噬菌体ELISA鉴定图；图24-2为阳性噬菌体western blot鉴定，其中图24-2左图为23C3抗体杂交结果图，右图为无关抗体SM5-1杂交结果图。

图25：Align X软件序列分析23C3的结合表位结果。

图26：各种序列表位与抗体23C3结合力的比较结果。

图27：F8E11淘选效率比较图。

图28：F8E11阳性噬菌体ELISA和western blot鉴定图；图28-1为F8E11阳性噬菌体ELISA鉴定图；图28-2为F8E11阳性噬菌体westernblot鉴定图，其中图28-2左图为F8E11抗体杂交结果图，右图为无关抗体SM5-1杂交结果图。

图29：Align XA软件序列分析F8E11的结合表位结果。

图30：各种序列表位与抗体F8E11结合力的比较结果。

图31：合成短肽与相应抗体的特异结合以及阻断抗体与抗原结合的实验结果；图31-1为dot-blot检测短肽与抗体的结合实验结果；图31-2为短肽阻断试验结果。

图32.23C3和F8E11特异识别表位在OPN分子上的相对部位。

具体实施方式

以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选、分离和纯化等方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

本发明实施例或实验例中未标明来源的原、辅料均为市售。

实施例鼠抗人OPN单克隆抗体的制备

实施例1.人OPN cDNA片段的克隆

参照GENEBANK提供的人OPN的资料及序列，合成引物：OPN引物有义(引物1)：GGG AAGCTT ACCATGAGAATTGCAGTGATTTG(Hind III)和OPN反义(引物2)：GCC GGTACC ATTGACCTCAGAAGATGCAC(Kpn I)。扩增人肝癌细胞株LM3(购自上海中山医院)，用TRISOL试剂盒(INVITROGEN)提取RNA，通过RT-PCR(PROMEGA)，反应条件：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，58℃ 30秒，72℃ 45秒，30个循环；72℃ 10分钟。获得963bp的DNA片段。通过凝胶回收试剂盒(上海生工)回收片段后，用限制型内切酶Hind III和Kpn I酶切，凝胶电泳回收后，与经Hind III和Kpn I双酶切的质粒载体连接，转化大肠杆菌DH10B后，筛选获得有插入片段的阳性克隆。DNA序列测定确认。OPN基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

实施例2鼠OPN cDNA片段的克隆

参照GENEBANK提供的鼠OPN的资料及序列，合成引物：鼠OPN引物有义(引物3)：ATAAGCTTGGATGACGACGACAAGATGAGAATTGCAGTGATT(Hind III)和鼠OPN反义(引物4)：ATCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGA(Kpn I)。分离鼠脾脏T淋巴细胞，用ConA激活30小时后，用TRISOL试剂盒(INVITROGEN)提取RNA，通过RT-PCR(PROMEGA)PCR反应采用热启动，反应条件：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，30个循环；72℃ 10分钟。获得985bp的DNA片段。通过凝胶回收试剂盒(上海生工)回收片段后，用限制型内切酶HindIII和KpnI酶切，凝胶电泳回收后，与经Hind III和Kpn I双酶切的质粒载体连接，转化大肠杆菌DH10B后，筛选获得有插入片段的阳性克隆。DNA序列测定确认。鼠OPN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3.人、鼠OPN的真核细胞表达纯化

将实施例1、实施例2所得的序列正确的人、鼠OPN基因片段用相应的限制性内切酶酶切回收后，装入pPICZα质粒中。转染毕式酵母细胞，挑取单个克隆酵母，诱导表达出人、鼠OPN蛋白，收集酵母细胞表达上清，经阴离子交换、分子筛纯化，SDS-PAGE证实得到人、鼠OPN纯蛋白。纯化后经SDS-PAGE电泳，结果见图1。

实施例4.鼠抗人OPN单克隆抗体的筛选与制备

100ug人OPN和等体积弗氏佐剂乳化后，腹腔注射BALB/C小鼠免疫接种，每二周后加强免疫一次，剂量同前。共免疫3次后，选取血清中抗OPN抗体滴度较高小鼠，分离其脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG法，将小鼠脾脏淋巴细胞与NS-1细胞进行细胞融合。用10ug/ml OPN包被96孔板，采用ELISA法反复筛选获得可稳定表达抗人OPN抗体的杂交瘤细胞株——23C3和F8E11。大量扩增单克隆细胞株23C3和F8E11，腹腔注射BALB/C小鼠5X10⁶/只，10天左右开始收集小鼠腹水，利用Protein A柱，亲和层析纯化抗人OPN的单克隆抗体。Westernblotting试验结果显示，小鼠抗入OPN单克隆抗体23C3和F8E11不但与人OPN蛋白特异结合，同时与鼠OPN蛋白也有交叉反应。结果见图2。市售抗OPN抗体(R&D公司)

实施例23C3和F8E11的可变区基因克隆和序列测定

收集23C3和F8E115×10⁶～1×10⁷杂交瘤细胞，用TRIzol(InvitrogenCat.No.15596-026)抽提其总RNA，根据小鼠抗体恒定区序列，设计引物如下：

HGSP1：5’-GATACTGTGATCTGTTTG-3’

HGSP2：5’-TCGCAGATGAGTCTGGAC-3’

HGSP3：5’-ATGAACACACTCACATTG-3’

LGSP1：5’-GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3’

LGSP2：5’-AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3’

LGSP3：5’-TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3’

采用Invitrogen 5’RACE kit(Cat.No.18374-058)，分别以HGSP1，LGSP1为引物，合成第一链cDNA；在TdT和dCTP作用下，给第一链cDNA 3’端加polyC尾；分别以HGSP2，HGSP3、LGSP2，LGSP3为5’引物，通过巢式PCR得到VH、VL的PCR产物；将PCR产物装入pGEM-T载体中；挑取克隆抽提质粒，限制性内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。23C3重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，23C3轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；F8E11重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，F8E11轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

实验例23C3和F8E11单抗对CIA关节炎模型小鼠的影响实验

实验例123C3和F8E11单抗治疗对CIA小鼠关节炎发病指数、发病时间及发病率的影响实验

100ug鸡II型胶原(Condrex)和等体积的弗氏完全佐剂乳化后，经DBA/1J小鼠(32只)(雄性，8-10周)尾部皮下初次免疫；21天后进行再次免疫，即将100ug鸡II型胶原和等体积的弗氏不完全佐剂乳化后，尾部皮下再次免疫。将2次免疫后的小鼠分成4组，分别给予对照抗体(小鼠IgG，200ug/body，Sigma)、23C3单抗(200ug/body、100ug/body、50ug/body)、F8E11单抗(200ug/body、100ug/body、50ug/body)；所有治疗组均腹腔给药，从第二次免疫当天开始给药，隔天给药，连续六次。从第二次免疫当天开始观察关节炎发病指数、发病时间及发病率，共观察30天。小鼠关节炎严重程度参照文献(A Role for theLymphotoxin/LIGHT Axis in the Pathogenesis of Murine Collagen-InducedArthritis.Roy A.Fava，Evangelia Notidis，Jane Hunt，Veronika Szanya，Nora Ratcliffe，Apinya Ngam-ek，Antonin R.de Fougerolles，Andrew Sprague，and Jeffrey L.Browning.The Journal of Immunology，2003，171：115-126.)进行评分。具体如下：每只腿根据炎症程度计分为0-4分，0分-无红肿；1分-一个趾或指肿胀，或者轻微水肿；2分-多个趾或指肿胀，或者中度水肿；3分-大多数趾或指肿胀，或者严重水肿；4分-所有趾或指肿胀，或者畸形。小鼠关节炎的疾病指数为前后肢炎症分数的和。

实验结果见图3-1，图3-2，图3-3。与对照治疗组相比，23C3和F8E11单抗都可以显著的降低关节炎发病指数，延迟发病时间，但对发病率无明显影响，其中23C3单抗的治疗效果好于F8E11。

实验例223C3和F8E11单抗治疗对CIA小鼠关节骨吸收的保护作用实验

23C3单抗200ug组和对照治疗组CIA小鼠(同实验例1)，于二次免疫后30天进行X-ray检测，观察各发病关节的骨质破坏情况。结果见图4，与治疗组相比，23C3和F8E11单抗治疗组小鼠各趾间关节骨吸收不明显。提示23C3单抗对骨吸收具有良好的保护作用。

实验例323C3和F8E11单抗体外对淋巴细胞的迁移抑制作用实验

无菌分离CIA小鼠(实验例1)的脾脏，过100目钢网，PBS洗涤2次，用淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，2000rpm×20分钟，吸取淋巴细胞层，PBS洗涤2次，记数，并调整淋巴细胞浓度为5×10⁶/ml。24孔组织培养板，上层含有5um孔径的滤膜，用10ug的OPN预包被下层。上层每孔加入5×10⁵淋巴细胞，同时加入不同的抗体：23C3、F8E11(抗OPN单抗)、Her-2抗体(无关抗体对照)、抗OPN多抗(购自CHEMICON)；每种抗体两种浓度：100ug/ml、200ug/ml。在另一组中加入不同的肽段：23C3肽(对应23C3的表位肽)、F8E11肽(对应F8E11的表位肽)、GRGDS肽，SM5-1肽(无关对照肽：INPNNAPEVFAH)(上海业力公司合成)；每种肽段两种浓度：50Mm、100Mm。37℃、5％CO₂孵育2小时，PBS洗涤两次，计数下层孔中细胞数目，取5个高倍镜视眼，获得平均值，然后乘以50。

实验结果如图5。23C3和F8E11单抗都可以有效的阻断淋巴细胞的迁移，而用23C3单抗阻断淋巴细胞迁移效果最好，且具有剂量依赖性；同时23C3和F8E11单抗对应的23C3和F8E11表位肽段能有效的阻断淋巴细胞迁移。

实验例4不同治疗组CIA小鼠血浆及关节组织中OPN水平的变化实验

取不同时间点(0，7，14，28天)不同治疗组DBA/1J小鼠(实验例1)的血浆，鼠OPN的ELISA试剂盒(R&D公司)检测OPN的蛋白浓度。具体的说，小鼠外眦静脉取血，即刻离心4000rpm，10分钟，分离血浆。以1∶200稀释加入至ELISA检测试剂盒的96孔板中，常温孵育1小时，PBST洗涤5次，加入生物素标记的抗OPN一抗，常温孵育1小时，洗涤5次，加入亲和素标记的二抗，常温孵育1小时，洗涤6次后，底物TMB显色，OD450检测吸光度。根据标准曲线，计算血浆样品中OPN的浓度。

结果见图6-1。对照组OPN水平大大高于23C3和F8E11治疗组，在第14天OPN水平最高，为23C3和F8E11治疗组的10倍，提示OPN蛋白水平可能与疾病发生及严重程度相关，而且降低OPN的水平，可降低关节炎的严重程度。

取14天实验例1中不同治疗组CIA小鼠的关节组织，去除皮肤及肌肉组织，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-time PCR要求，设计OPN引物，见表1。SYBR GreenMaster Mix(Applied Biosystems)做Real-time PCR检测OPN的mRNA水平。反应步骤为：50℃，2分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒和60℃，60秒，40个循环。GAPDH基因作为内参。实验数据使用ABI PRISM 7900 sequencedetection system(Applied Biosystems)进行分析。

实验结果见图6-2，23C3和F8E11单抗治疗组关节组织OPN的水平大大低于对照组的OPN的水平，而且23C3组OPN水平更低。提示可能23C3和F8E11通过中和组织中OPN蛋白，调控OPN的mRNA水平。

实验例5不同治疗组CIA小鼠关节组织中OPN受体水平的变化实验

取14天实验例1中不同治疗组CIA小鼠的关节组织，去除皮肤及肌肉组织，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-time PCR要求，设计OPN各受体的引物。具体如表1。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)做Real-time PCR检测OPN受体的组织mRNA水平。反应步骤同实施例4。实验数据使用ABI PRISM 7900sequence detection system(Applied Biosystems)进行分析。

实验结果见图7，CD44、β1、α8在对照组及治疗与正常小鼠比较无明显变化；而αv、β3、β5、α4、α9在对照组中明显高于正常小鼠，经23C3和F8E11单抗治疗后，其mRNA水平明显降低。提示αv、β3、β5、α4、α9这五种OPN受体可能参与关节炎的发病；而且23C3和F8E11可能通过中和组织中OPN蛋白，调控OPN受体的mRNA水平。

表1OPN各受体的引物

real-time PCR实验所检测分子的特异性引物

FW，forward；RV，reverse.

实验例6不同治疗组CIA小鼠关节组织中各种细胞因子的变化实验

取实验例1中14天不同治疗组CIA小鼠的关节组织，去除皮肤及肌肉组织，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-time PCR要求，设计各种细胞因子的引物。具体如上表1。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)做Real-time PCR检测细胞因子的组织mRNA水平。反应步骤同实施例4。实验数据使用ABI PRISM7900 sequence detection system(Applied Biosystems)进行分析。

实验结果见图8，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平在对照组中明显高于正常小鼠，经23C3和F8E11单抗治疗后，其mRNA水平明显降低。同时Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-10的mRNA水平经23C3和F8E11单抗治疗后也明显降低。提示23C3和F8E11可能通过降低促炎因子的水平，从而降低关节炎的炎症程度；而且不但可下调Th1型免疫反应，还可同时下调Th2型免疫反应。

实验例7.不同治疗组体外淋巴细胞回忆应答反应的变化实验

无菌分离实验例1中不同治疗组CIA小鼠的脾脏和淋巴结，过100目钢网，PBS洗涤2次，用淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，2000rpm×20分钟，吸取淋巴细胞层，PBS洗涤2次，记数，并调整淋巴细胞浓度为5×10⁶/ml。每孔加入5×10⁵淋巴细胞，同时加入不同浓度的鸡II型胶原刺激。37℃、5％CO₂孵育72小时，在第56小时收取上清，用于细胞因子IFN-γ和IL-10的检测；同时每孔加入100ul含³H(0.5uCi)的培养液，继续培养16小时后，细胞收集器收集细胞，γ液闪仪检测。在对照小鼠脾淋巴细胞回忆应答实验的30ug胶原刺激组中，同时加入不同浓度的23C3单克隆抗体，检测其对淋巴细胞回忆应答的抑制能力。

实验结果如图9。23C3和F8E11单抗治疗组淋巴细胞对鸡II型胶原的应答能力明显低于对照组小鼠，而且在应答过程中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-10的水平也明显的低于对照组。而且23C3和F8E11单抗在体外能有效的抑制淋巴细胞对鸡II型胶原的应答反应。在所有实验组中，23C3组的抑制能力均大于F8E11。

实验例8不同治疗组CIA小鼠血清中自身抗体水平的变化实验

取不同时间点(0，7，14，28天)实验例1中的不同治疗组DBA/1J小鼠的血清，ELISA法检测抗II型胶原自身抗体IgG1、IgG2a和总Ig的血清滴度。具体的说，小鼠外眦静脉取血，室温静置2小时，离心4000rpm，10分钟，分离血清。鸡II型胶原100ng/孔包被96孔板，4℃过夜，PBS洗涤后10％脱脂奶粉封闭2小时，PBST洗涤3次，从1∶2000开始倍比稀释血清样本，加入96孔板中，常温孵育1小时，PBST洗涤5次，加入HRP标记的兔抗小鼠IgG1、IgG2a和总Ig的抗体，37℃孵育2小时，洗涤5次，底物o-phenylenediamine显色，OD450检测吸光度。根据标准曲线，计算血清样品中自身抗体的滴度。

结果见图10，对照组IgG1、IgG2a和总Ig的血清滴度均大大高于23C3和F8E11治疗组，在第14天IgG1、IgG2a和总Ig的血清滴度最高。提示自身抗体水平可能与疾病发生及严重程度相关，而且23C3和F8E11单抗可通过降低IgG1、IgG2a和总Ig的水平，从而降低关节炎的严重程度。

实验例9.不同治疗组CIA小鼠关节组织中RANKL/RANK/OPG水平的变化实验

取第28天实施例1中不同治疗组小鼠(实验例1)的关节组织，去除皮肤及肌肉组织，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-time PCR要求，设计RANKL、RANK和OPG的引物。具体同上表1。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)Real-time PCR检测RANKL、RANK和OPG的组织mRNA水平。反应步骤同实施例中人、鼠OPN的真核细胞表达纯化步骤。实验数据使用ABI PRISM 7900 sequencedetection system(Applied Biosystems)进行分析。

实验结果见图11，促破骨细胞分化和增殖的调节因子RANKL和RANK mRNA水平在对照组中明显高于正常小鼠，经23C3和F8E11单抗治疗后，其mRNA水平明显降低。OPG水平在对照组和治疗组则无明显变化。提示23C3和F8E11可能通过下调RANKL和RANK的水平，从而抑制破骨细胞的功能，降低关节炎的骨质破坏和吸收。

实验例10不同治疗组CIA小鼠尿液中D-pyr水平的变化实验

收集不同治疗组DBA/1J小鼠(实验例1)二次免疫后第30天的尿液，小鼠D-pyrELISA试剂盒检测D-pyr(R&D公司)的水平。结果如图12所示，23C3和F8E11单抗治疗组尿液中D-pyr明显低于对照组，而且23C3单抗治疗组中D-pyr的水平最低。

实验例23C3和F8E11单抗对肝炎模型小鼠的影响实验

实验例1.应用23C3和F8E11单抗对肝炎模型小鼠的死亡率影响实验

C57BL/6(雄性，8-10周)小鼠(购自第二军医大学实验动物中心)腹腔给予无关对照抗体Ig(Sigma)、23C3及F8E11单克隆抗体，每组10只，每只小鼠200ug，2小时后，每只尾静脉注射200ul的ConA(30mg/ml)，诱导急性爆发型肝炎，24小时连续观察23C3和F8E11单抗对肝炎小鼠的死亡率影响。

实验结果见图13。与对照治疗组相比，23C3和F8E11单抗组可以显著地降低小鼠的死亡率，其中23C3单抗的保护作用更强。

实验例2应用23C3和F8E11单抗对肝炎模型小鼠的肝脏保护作用实验

C57BL/6(雄性，8-10周)小鼠腹腔给予无关对照抗体Ig(Sigma)、23C3及F8E11单克隆抗体，每组10只，每只小鼠200ug，2小时后每只尾静脉注射200ul的ConA(30mg/ml)，诱导急性爆发型肝炎。取注射ConA后各治疗组小鼠0、3、6、12、24和48小时的血清，检测ALT和AST水平的变化；同时取12小时各组小鼠的肝脏，作HE和TUNEL染色，观察肝脏的坏死、炎症浸润及细胞凋亡情况。

实验结果见图14，图14-1结果表明与对照治疗组相比，23C3和F8E11单抗组都可以显著的降低血清中ALT和AST的水平，其中23C3单抗组ALT和AST在各个时间点水平都低于其它组；从图14-2中可见，23C3和F8E11单抗组肝坏死程度轻，炎症细胞浸润程度明显低于对照组；TUNEL染色可见，对照组肝细胞凋亡严重，有近60％的肝细胞凋亡，而23C3和F8E11治疗组分别约为20％和30％。因此，上述的肝损伤指标和病理指标都提示23C3和F8E11单抗都具有明显的肝脏保护作用，而且23C3的效果优于F8E11。

实验例3不同治疗组肝炎模型小鼠血浆及肝脏组织中OPN水平的变化实验

取不同时间点(0，3，6，12，24小时)不同治疗组C57BL/6小鼠(实验例2)的血浆，鼠OPN ELISA试剂盒检测OPN的蛋白浓度。具体的说，小鼠外眦静脉取血，即刻离心4000rpm，10分钟，分离血浆。以1∶200稀释加入至ELISA检测试剂盒的96孔板中，常温孵育1小时，PBST洗涤5次，加入生物素标记的抗OPN一抗，常温孵育1小时，洗涤5次，加入亲和素标记的二抗，常温孵育1小时，洗涤6次后，底物TMB显色，OD450检测吸光度。根据标准曲线，计算血浆样品中OPN的浓度。

结果见图15-1。对照组OPN水平大大高于23C3和F8E11治疗组，23C3治疗组OPN水平在各个时间均最低。

取6小时不同治疗组小鼠(实验例2)的肝脏组织，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-time PCR要求，设计OPN引物，见表1。SYBR Green Master Mix(AppliedBiosystems)做Real-time PCR检测OPN的mRNA水平。反应步骤为：50℃，2分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒和60℃，60秒，40个循环。GAPDH基因作为内参。实验数据使用ABI PRISM 7900 sequence detection system(AppliedBiosystems)进行分析。

实验结果见图15-2，23C3和F8E11单抗治疗组肝脏组织OPN的水平均大大低于对照组的OPN水平，提示OPN单抗可能通过中和组织中OPN蛋白，调控OPN的mRNA水平。

实验例4.不同治疗组肝炎模型小鼠血浆及肝脏组织中细胞因子水平的变化实验

取不同时间点(0，3，6，12，24小时)不同治疗组C57BL/6小鼠(实验例2)的血浆，鼠TNF-α、IFN-γELISA试剂盒(R&D)检测TNF-α、IFN-γ的蛋白浓度。具体的说，小鼠外眦静脉取血，室温静置2小时，分离血清。以1∶100稀释加入至ELISA检测试剂盒的96孔板中，常温孵育1小时，PBST洗涤5次，加入生物素标记的抗TNF-α、IFN-γ一抗，常温孵育1小时，洗涤5次，加入亲和素标记的二抗，常温孵育1小时，洗涤6次后，底物TMB显色，OD450检测吸光度。根据标准曲线，计算血浆样品中TNF-α、IFN-γ的浓度。

实验结果见图16-1，细胞因子TNF-α、IFN-γ的水平在对照组中明显高于23C3和F8E11单抗治疗组，其中在3小时TNF-α、IFN-γ水平最高，23C3单抗治疗组水平最低。

取6小时不同治疗组小鼠的肝脏组织，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-timePCR要求，设计各种细胞因子的引物。具体如表1。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)做Real-time PCR检测细胞因子的组织mRNA水平。反应步骤同实施例3。实验数据使用ABI PRISM 7900 sequence detection system(Applied Biosystems)进行分析。

实验结果见图16-2，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平在对照组中明显高于正常小鼠，经23C3和F8E11单抗治疗后，其mRNA水平明显降低；同时Th1型细胞因子IFN-γ的mRNA水平在23C3和F8E11单抗治疗组也明显降低，其中23C3作用效果好于F8E11。提示23C3和F8E11可能通过降低促炎因子的水平，从而降低肝脏的炎症程度；而且23C3和F8E11还可下调Th1型免疫反应。

实验例5不同治疗组肝炎模型小鼠肝脏组织中NF-κB活性的变化实验

采用电泳迁移率变动分析(EMSA)，检测肝脏组织中NF-kB活性。NE-PER核与胞浆抽提试剂盒(Pierce Biotechnology公司)提取不同治疗组6小时的肝脏组织(实施例2)核蛋白。以考马斯亮蓝法检测核提取物蛋白浓度，分装置于-80℃冰箱中保存备用。EMSA探针采用NF-κB互补的双链寡核苷酸序列(5′AGTTGAGGGGA CTTTCCCAGGC-3′)，3′端生物素标记(3′端标记试剂盒，Pierce Biotechnology公司)。组织核蛋白提取物用5％的非变性凝胶电泳，转膜，然后和探针紫外交联，LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒(PierceBiotechnology公司)显影。

结果如图17。对照治疗组(control Ig)的NF-κB水平显著高于小鼠，而经23C3和F8E11单抗治疗后，NF-κB水平明显下降。

实验例23C3和F8E11单抗对Crohn’s病模型小鼠的影响实验

实验例123C3和F8E11单抗对Crohn’s病模型小鼠体重、疾病活动指数(DAI)及脾指数的影响实验

以葡聚糖硫酸钠(DSS)饮水法复制小鼠实验性结肠炎30只，即以30g/L DSS代替饮用水给予小鼠饮用，连续7天。将上述小鼠随机平均分为3组：controlIg对照治疗组、23C3单抗治疗组、F8E11单抗治疗组。腹腔给药，制模当天开始给药，连续3天，每次200ug/body。每天记录实验小鼠的体重，根据每天小鼠大便的性状，潜血试验及体重变化评价小鼠的疾病活动指数(评分标准见表2)；

表2.疾病活动指数(DAI)评分标准

DAI＝(体质量下降分数+大便性状分数+便血分数)/3

第7天取小鼠脾脏，称重，计算脾指数(脾脏重量/体重)。

实验结果如图18-1、图18-2、图18-3。对照治疗组的所有动物均可观察到大便松软或腹泻、血便及体重减轻，而两个单抗治疗组的小鼠大便较成形、血便及体重减轻较不明显。各组的疾病活动指数，两各单抗治疗较对照治疗组明显降低，而且23C3组好于F8E11治疗组。对照治疗组小鼠的脾脏指数相对于正常小鼠明显升高，而两个单抗治疗组脾脏指数升高不明显。

实验例2不同治疗组Crohn’s病模型小鼠结肠病理组织变化实验

取第7天的不同治疗组的病变结肠组织(实验例1)，PBS洗涤后，用10％甲醛固定，常规石蜡包埋，连续2um组织切片，HE染色。光镜下观察不同治疗组的组织学改变。具体评分标准见表3。

表3.病理组织损害评分标准

记分	炎症程度	炎症范围	溃疡深度	溃疡范围
记分	炎症程度	炎症范围	溃疡深度	溃疡范围	0	无	无	无	1-25％
1	轻	黏膜层	基底部1/3	26-50％	0	无	无	无	1-25％
1	轻	黏膜层	基底部1/3	26-50％	2	中	黏膜层和黏膜下层	基底部2/3	51-75％
3	重	全层	仅仅表面上皮完整	76-100％	2	中	黏膜层和黏膜下层	基底部2/3	51-75％
3	重	全层	仅仅表面上皮完整	76-100％	4			全层溃疡

结果如图19所示。光镜下可见对照治疗组结肠组织结构不完整，溃疡深，范围大及炎性渗出物，有大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，并可见数量不等的单个核细胞和嗜酸性粒细胞；与对照组相比，23C3和F8E11单抗治疗组，组织结构较完整，炎症及溃疡程度轻，淋巴细胞和中性粒细胞浸润少，组织评分明显低于对照治疗组。

实验例3应用23C3和F8E11单抗对Crohn’s病模型小鼠肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的影响实验

肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的检测用商品化的试剂检测。取各个治疗组0、3、7天的结肠组织(实验例1)，称取相同的重量后，剪碎，冰浴匀浆(在含0.5％HTAB缓冲液中)30秒，匀浆液超声10秒钟，反复冻融3次，15000g×15分钟。0.1ml匀浆上清加入2.9ml0.167mg/ml的O-dianisidine hydrochloride，并加入0.0005％的H₂O₂，，检测OD460。根据公式换算MPO的活性，1个单位的MPO活性等于1分钟1μmol的过氧化物酶降解。

结果如图20所示。各组MPO的活性具有时间依赖性，随着炎症进展，MPO的活性也逐渐增加。其中对照治疗组MPO水平在第3和7天明显高于23C3和F8E11单抗治疗组，而且23C3组对MPO活性水平最低。

实验例4不同治疗组Crohn’s病模型小鼠肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平的变化实验

取第3天和第7天不同治疗组小鼠的肠组织(实验例1)，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-time PCR要求，设计各种细胞因子的引物。具体如表1。SYBR GreenMaster Mix(Applied Biosystems)做Real-time PCR检测细胞因子的组织mRNA水平。反应步骤同实施例3。实验数据使用ABI PRISM 7900 sequence detectionsystem(Applied Biosystems)进行分析。

实验结果见图21，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平在对照组中明显高于正常小鼠，经23C3和F8E11单抗治疗后，其mRNA水平明显降低；其中23C3作用更强。提示23C3和F8E11可能通过降低促炎因子的水平，从而降低结肠的炎症程度。

实施例5不同治疗组Crohn’s病模型小鼠肠组织及血浆中OPN水平的变化实验

取不同时间点(0，3，7天)不同治疗组C57BL/6小鼠(实验例1)的血浆，鼠OPN ELISA试剂盒检测OPN的蛋白浓度。具体的说，小鼠外眦静脉取血，即刻离心4000rpm，10分钟，分离血浆。以1∶200稀释加入至ELISA检测试剂盒的96孔板中，常温孵育1小时，PBST洗涤5次，加入生物素标记的抗OPN一抗，常温孵育1小时，洗涤5次，加入亲和素标记的二抗，常温孵育1小时，洗涤6次后，底物TMB显色，OD450检测吸光度。根据标准曲线，计算血浆样品中OPN的浓度。

结果见图22-1。对照组OPN水平大大高于23C3和F8E11治疗组，23C3治疗组OPN水平在各个时间均最低。

取第7天不同治疗组小鼠(实验例1)的结肠病变组织，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)抽取组织总RNA，用Sensiscript RT Kit(QIAGEN)反转录RNA为cDNA。根据Real-time PCR要求，设计OPN引物，见表1。SYBR Green Master Mix(AppliedBiosystems)做Real-time PCR检测OPN的mRNA水平。反应步骤为：50℃，2分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒和60℃，60秒，40个循环。GAPDH基因作为内参。实验数据使用ABI PRISM 7900 sequence detection system(AppliedBiosystems)进行分析。

实验结果见图22-2，23C3和F8E11单抗治疗组结肠组织OPN的水平均大大低于对照组的OPN水平，提示OPN单抗可能通过中和组织中OPN蛋白，调控OPN的mRNA水平。

实验例m anti-hOPN(23C3、F8E11)单克隆抗体抗原表位的鉴定实验

实验例1m anti hOPN(23C3)单克隆抗体抗原表位的淘选实验

采用随机肽库免疫淘选法，整个过程在96-孔板上进行。23C3单克隆抗体100ug/ml，100ul/孔4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TMPhageDisplay Peptide Library Kit)4×10¹⁰pfu+100ul正常小鼠血清，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween-200.1％)、1×PBS PH5.0、1×PBS PH3.5分别洗涤5次；用含1mg/ml BSA的Glycine-Cl PH 2.2洗脱，室温轻摇15分钟，15ulTris-Cl PH 9.1中和。10ul用于测滴度，其余扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。每次加入噬菌体数相同(4×10¹⁰pfu)，三轮淘选output噬菌体数分别为2.76x10³pfu、3.45x10⁵pfu、3.08x10⁶pfu；淘选效率分别是第一轮的125和1116倍，结果表明：淘选富集效果明显。见图23。

实验例2phage clones ELISA和western blot鉴定实验

ELISA过程在96孔板进行，23C3单克隆抗体100ug/ml，50ul/孔4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)37℃封闭2小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次；各单克隆噬菌体扩增上清用1×TBS稀释后，均以5×108pfu/50ul，对照抗体为鼠单抗SM5-1(申请人自己制备，制备过程参照文献：SM5-1：a newmonoclonal antibody which is highly sensitive and specific for melanocytic lesions.Arch Dermatol Res.2000 Dec；292(12)：583-9.以下均同)，阴形对照噬菌体为4E4(该克隆为SM5-1的阳性克隆申请人筛选获得筛选过程同上。以下均同)。室温结合1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次后，每孔加入200ul 1∶5000稀释的HRP标记的抗-M13抗体(Pharmacia#27-9411-01)，室温震荡作用1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次，晶美公司ELISA检测试剂盒A∶B＝1∶1新鲜配置的反应底物50ul/孔，室温1-5分钟。2N H₂SO₄终止反应。每个克隆对23C3和对照抗体SM5-1均设3复孔平行检测。OD450记录结果表明，阳性克隆与抗体的反应是特异的。见图24-1.

Western blot过程：扩增后的噬菌体单克隆上清经20％PEG/NaCl沉淀纯化后，1×1010pfu/lane 10％SDS-PAGE电泳，360mA恒流1小时转至硝酸纤维素膜，10％脱脂奶粉4℃封闭过夜或者室温封闭2小时；1×TBST(Tween-200.1％)洗涤3次，每次10分钟；与10ug/ml一抗室温反应1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次，每次10分钟；1∶1000稀释HRP标记的兔抗鼠IgG(北京中山公司)室温反应1小时，ECL kit(Tiangen公司)反应1-2分钟，医用X射线感蓝胶片压片曝光。结果见图24-2。图24-2左图为23C3抗体杂交结果，图24-2右图为无关抗体SM5-1杂交结果；这些结果显示：阳性克隆与抗体的反应是特异的(对照抗体为鼠单抗SM5-1，阴形对照噬菌体为4E4(该克隆为SM5-1的阳性克隆)。

实验例3测序及序列分析

单链DNA提取试剂盒(上海捷瑞公司)制备模版，-96引物测序，Chromas读取序列，25个阳性克隆有15个独立序列；AlignX分析，结果见图25，可以看出，23C3的可能抗原表位为：WLXPDP。

实验例4Phage克隆与抗体结合能力分析

实验例3得到的各个克隆均以5×107pfu投入到包被有抗体的96-孔板，经过相同条件的淘选。(对照抗体：SM5-1；无关对照噬菌体：4E4)，对洗脱后的噬菌体进行滴度测定。(参见blood 2006-04-014639)

结果显示：hOPN序列中，表位W43LNP46DP48，其中W43，P46，48在介导23C3-hOPN的结合中起重要作用。选择结合力最强的克隆之一5F12：DVYWLMPDPPTS合成短肽。结果见图26。

实验例5对m anti-hOPN(F8E11)单克隆抗体抗原表位的淘选

随机肽库淘选整个过程在96孔板上进行。100ug/ml，100ul/孔F8E11抗体4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12TM Phage Display PeptideLibrary Kit)4×1010pfu+100ul正常小鼠血清，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween-200.1％)、1×PBS PH5.0、1×PBS PH3.5分别洗涤5次；用含1mg/ml BSA的Glycine-Cl PH 2.2洗脱，室温轻摇15分钟，15ul Tris-Cl PH9.1中和。10ul用于测滴度，其余扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。每次加入噬菌体数相同(4×1010pfu)，三轮淘选output噬菌体数分别为2.38x103pfu、9.2x105pfu、1.86x107pfu；淘选效率分别是第一轮的386和7803倍，结果表明：淘选富集效果明显。见图27。

实验例6phage clones ELISA和western blot鉴定

ELISA过程在96-well plate进行，F8E11单克隆抗体100ug/ml，50ul/孔4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)37℃封闭2小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次；各单克隆噬菌体扩增上清用1×TBS稀释后，均以5×108pfu/50ul，对照抗体为鼠单抗SM5-1，阴形对照噬菌体为4E4(该克隆为SM5-1的阳性克隆)。室温结合1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次后，每孔加入200ul 1∶5000稀释的HRP标记的抗M13抗体(Pharmacia#27-9411-01)，室温震荡作用1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次，晶美公司ELISA检测试剂盒A∶B＝1∶1新鲜配置的反应底物50ul/孔，室温1-5分钟。2N H₂SO₄终止反应。每个克隆对F8E11和对照抗体SM5-1均设3复孔平行检测。OD450记录结果表明，阳性克隆与抗体的反应是特异的。如图28-1。

Western blot过程：扩增后的噬菌体单克隆上清经20％PEG/NaCl沉淀纯化后，1×1010pfu/lane 10％SDS-PAGE电泳，360mA恒流1小时转至硝酸纤维素膜，10％脱脂奶粉4℃封闭过夜或者室温封闭2小时；1×TBST(Tween-200.1％)洗涤3次，每次10分钟；与10ug/ml一抗室温反应1小时，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤5次，每次10分钟；1∶1000稀释HRP标记的兔抗鼠IgG(北京中山公司)室温反应1小时，ECL kit(Tiangen公司)反应1-2分钟，医用X射线感蓝胶片压片曝光。结果见图28-2，图28-2左图为F8E11抗体杂交，图28-2右图为无关抗体SM5-1杂交；箭头所示为目标条带；结果显示：阳性克隆与抗体的反应是特异的(对照抗体为鼠单抗SM5-1，阴形对照噬菌体为4E4(该克隆为SM5-1的阳性克隆))。

实验例7测序及序列分析

单链DNA提取试剂盒(上海捷瑞公司)制备模版，-96引物测序，Chromas读取序列，32个阳性克隆有18个独立序列；AlignX分析，结果如图29，可以看出，F8E11的可能抗原表位为：QLYXXYP。

实验例8Phage克隆与抗体结合能力分析

各个克隆均以5×107pfu投入到包被有抗体的96孔板，经过相同条件的淘选。(对照抗体：SM5-1；无关对照噬菌体：4E4)，对洗脱后的噬菌体进行滴度测定。(参见blood 2006-04-014639)

结果显示：hOPN序列中，表位QLYXXYP，其中QLY和YP在介导F8E11-hOPN的结合中起重要作用，单独的LY或YP不足以介导两者的结合，不过Q在结合中不是至关重要的。结果见图30。根据以上实验结果，选择结合力最强的克隆6A8：TVKQLYTLYPAA合成短肽。

实验例9合成短肽与抗体的特异性结合实验

Dot-blot实验分别取3X10ng KLH-4B5(无关对照)、KLH-5F12、KLH-6A8，各点三个点，实验例4和实验例8得到的每种短肽均与三种不同的抗体杂交，经过封闭、洗膜、一抗室温反应1小时、洗膜、HRP标记抗鼠二抗室温反应1小时，洗膜、压片曝光。无关短肽与23C3和F8E11均不反应，KLH-5F12、KLH-6A8均能与相应的抗体有特异的反应，同时可以看出OPN的两个单抗没有交叉反应，结果如图31-1。

短肽对噬菌体-抗体结合的阻断实验100ug/ml 50ul/孔抗体包被96-孔板，4℃过夜，10％脱脂奶粉封闭，1×PBST洗3次，备用.100ug/ml短肽与噬菌体混匀后，加入抗体包被的板，室温，轻摇，1小时，1×TBST(Tween-200.1％)、1×PBS PH5.0、1×PBS PH3.5各洗5次；Glycine-Cl PH 2.21mg/ml BSA洗脱15分钟，Tris-Cl PH 9.1，中和，测滴度。每个短肽均分三组：①phage②phage+peptide③phage+irrelative peptide。该浓度的短肽5F12的阻断效率为71％，6A8的阻断效率为89％。结果如图31-2。

结果表明F8E11和23C3两个抗体的表位均位于OPN第四外显子处，两者之间相隔约10个氨基酸，但两者没有交叉反应。两表位的位置和序列如图32所示，序列见SQE ID NO.11。

SEQUENCE LISTING

<110>上海国健生物技术研究院

<120>骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及用途

<130>Eta-1(osteopontin)：an early component of type-1(cell-mediated)immunity.Science.2000.287：860-864

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>935

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgagaattg cagtgatttg cttttgcctc ctaggcatca cctgtgccat accagttaaa 60

caggctgatt ctggaagttc tgaggaaaag cagctttaca acaaataccc agatgctgtg 120

gccacatggc taaaccctga cccatctcag aagcagaatc tcctagcccc acagaatgct 180

gtgtcctctg aagaaaccaa tgactttaaa caagagaccc ttccaagtaa gtccaacgaa 240

agccatgacc acatggatga tatggatgat gaagatgatg atgaccatgt ggacagccag 300

gactccattg actcgaacga ctctgatgat gtagatgaca ctgatgattc tcaccagtct 360

gatgagtctc accattctga tgaatctgat gaactggtca ctgattttcc cacggacctg 420

ccagcaaccg aagttttcac tccagttgtc cccacagtag acacatatga tggccgaggt 480

gatagtgtgg tttatggact gaggtcaaaa tctaagaagt ttcgcagacc tgacatccag 540

taccctgatg ctacagacga ggacatcacc tcacacatgg aaagcgagga gttgaatggt 600

gcatacaagg ccatccccgt tgcccaggac ctgaacgcgc cttctgattg ggacagccgt 660

gggaaggaca gttatgaaac gagtcagctg gatgaccaga gtgctgaaac ccacagccac 720

aagcagtcca gattatataa gcggaaagcc aatgatgaga gcaatgagca ttccgatgtg 780

attgatagtc aggaactttc caaagtcagc cgtgaattcc acagccatga atttcacagc 840

catgaagata tgctggttgt agaccccaaa agtaaggaag aagataaaca cctgaaattt 900

cgtatttctc atgaattaga tagtgcatct tctga 935

<210>2

<211>985

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgagattgg cagtgatttg cttttgcctg tttggcattg cctcctccct cccggtgaaa 60

gtgactgatt ctggcagctc agaggagaag ctttacagcc tgcacccaga tcctatagcc 120

acatggccgg tgcctgaccc atctcagaag cagaatctcc ttgcgccaca gaatgctgtg 180

tcctctgaag aaaaggatga ctttaagcaa gaaactcttc caagcaattc caatgaaagc 240

catgaccaca tggacgacga tgatgacgat gatgatgacg atggagacca tgcagagagc 300

gaggattctg tggactcgga tgaatctgac gaatctcacc attcggatga gtctgatgag 360

accgtcactg ctagtacaca agcagacact ttcactccaa tcgtccctac agtcgatgtc 420

cccaacggcc gaggtgatag cttggcttat ggactgaggt caaagtctag gagtttccag 480

gtttctgatg aacagtatcc tgatgccaca gatgaggacc tcacctctca catgaagagc 540

ggtgagtcta aggagtccct cgatgtcatc cctgttgccc agcttctgag catgccctct 600

gatcaggaca acaacggaaa gggcagccat gagtcaagtc agctggatga accaagtctg 660

gaaacacaca gacttgagca ttccaaagag agccaggaga gtgccgatca gtcggatgtg 720

atcgatagtc aagcaagttc caaagccagc ctggaacatc agagccacaa gtttcacagc 780

cacaaggaca agctagtcct agaccctaag agtaaggaag atgataggta tctgaaattc 840

cgaatttctc atgaattaga gagttcatct tctgaggtca actaaagaag aggcaaaaac 900

acagttcctt actttgcatt tagtaaaaac aagaaaaagt gttagtgagg gttaagcagg 960

aatactaact gctcatttct cagtt 985

<210>3

<211>354

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atggcccagc cggccatggc cgaggtgcag cgggtggagt ctggtggagg attggtgcag 60

cctaaagggt cattgaaaat ttcatgtgca gcctctggat tcaccttcaa tatctacgcc 120

atgaactggg tccgccaggc tccaggaaag ggtttggaat gggttgctcg cataagaagt 180

caaagtaata attatacaac atattatgcc gattcagtga aagacaggtt caccatctcc 240

agagatgatt cacaaagcat gctctatctg caaatgaaca acttgaaaac tgaggacaca 300

gccatgtatt actgtgtgag acaaatggga gactactggg gccaaggcac cact 354

<210>4

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Met Ala Glu Val Gln Arg Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Lys Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn

20 25 30

Ile Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Gln Ser Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln

65 70 75 80

Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Met Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Met Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210>5

<211>324

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gacattgtga tgacccagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttttttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagctgatgg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 240

gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa acgt 324

<210>6

<211>108

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>7

<211>354

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atggccgacg tgatgctggt ggagtctgga ggaggcttgg tacagcctgg gggttctctg 60

agactctcct gtgcaacttc tgggttcacc ttcactgatt actacatgag ttgggtccgc 120

cagcctccag gaaagggact tgaatttttg ggttttatta caaataaagc taaaggttac 180

acaacagagt tcattccatc tgtgaagggt cggttcacca tttccagaga tagttcccaa 240

agcatcctct atcttcaaat gaacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 300

gcaagatatg cgatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcg 354

<210>8

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Met Ala Asp Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30

Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Phe Leu Gly Phe Ile Thr Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Phe

50 55 60

Ile Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Gln

65 70 75 80

Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala

85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210>9

<211>339

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gatattgtaa tgacccagtc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagcattgaa catagcaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acattttcct 300

cggacgttcg gtggaggcac taagctggaa atcaaacgt 339

<210>10

<211>113

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Glu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210>11

<211>314

<212>PRT

<213>人工序列

<400>11

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

35 40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg

165 170 175

Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His

180 185 190

Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala

195 200 205

Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser

210 215 220

Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His

225 230 235 240

Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu

245 250 255

His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu

260 265 270

Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp

275 280 285

Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His

290 295 300

Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn

305 310

Claims

1.骨桥蛋白的功能表位QLYXXYP或WLXPDP，其中X可以为任何氨基酸。

2.与权利要求1所述的功能表位特异性结合的抗骨桥蛋白的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体，其重链可变区氨基酸序列可以为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8之一，其轻链可变区氨基酸序列可以为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10之一。

4.抗骨桥蛋白的单克隆抗体23C3，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.6，恒定区为小鼠IgG恒定区。

5.抗骨桥蛋白的单克隆抗体F8E11，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.8，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.10，恒定区为小鼠IgG恒定区。

6.一种DNA分子，编码权利要求3所述的单克隆抗体。

7.权利要求6所述的DNA分子，其编码重链可变区的核苷酸序列可以为SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.7之一，编码轻链可变区的核苷酸序列可以为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.9之一。

8.权利要求4所述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体23C3，编码其重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，编码其轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

9.权利要求5所述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体F8E11，编码其重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，编码其轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。

10.权利要求2-5及8-9任一所述的抗骨桥蛋白的单克隆抗体在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病药物中的应用。

11.权利要求10所述的应用，其中自身免疫性疾病为类风湿性关节炎。

12.权利要求10所述的应用，其中自身免疫性疾病为自身免疫性肝炎。

13.权利要求10所述的应用，其中自身免疫性疾病为强直性脊柱炎。

14.权利要求10所述的应用，其中自身免疫性疾病为克隆氏病。