JP2010524475A - オステオポンチンの機能エピトープ、それと特異的に結合するモノクローナル抗体及び用途 - Google Patents
オステオポンチンの機能エピトープ、それと特異的に結合するモノクローナル抗体及び用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010524475A JP2010524475A JP2010504426A JP2010504426A JP2010524475A JP 2010524475 A JP2010524475 A JP 2010524475A JP 2010504426 A JP2010504426 A JP 2010504426A JP 2010504426 A JP2010504426 A JP 2010504426A JP 2010524475 A JP2010524475 A JP 2010524475A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- antibody
- osteopontin
- opn
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、免疫学分野に属し、より具体的に、一種のタンパク質の機能エピトープ、それと特異的に結合するモノクローナル抗体およびこれらの抗体の用途を公開する。
自己免疫とは、生体の免疫系が自身の組織に対して抗体と感作リンパ球を生成させ、免疫応答を引起す現象のことを指す。自己免疫で自身の組織・臓器の機能障害が生じ、且つ臨床症状が現れる場合、自己免疫疾患( autoimmune disease、AID)と呼ばれる。現在、発見された自己免疫疾患が三十数種あり、原発性のものが多数で、続発性のものが少数である。原発性自己免疫疾患は、病因が不明で、遺伝要素と密接に関わり、臓器特異性のものと全身性のものに分かれる。臓器特異性AIDは、通常、標的抗原と病変がある特定の臓器に限るが、全身性AIDは、通常、標的抗原と病変が全身性又は系統性となっている。近年、自己免疫及びそれによる疾患が注目されつつあり、全世界で数億人がこの疾患によって苦しんでいる。この疾患は、病気経過が長く、身体障害を招き、重篤な場合、死亡の可能性があるため、この問題の広範性及び重大性によって全世界の自己免疫疾患の研究が盛んに行われている。
本発明の目的は、オステオポンチンを治療標的とし、自己免疫疾患を治療するモノクローナル抗体を提供することである。
本発明者は、長期にわたって深く研究したところ、オステオポンチンの特定の機能エピトープに対抗するモノクローナル抗体を獲得し、さらにキメラのモノクローナル抗体及びヒト化抗体を製造し、且つそのコード配列を解明した。研究によって、本発明者は、さらに、本発明のモノクローナル抗体がオステオポンチンを阻害することによって、関節リウマチ、自己免疫性肝炎、クローン病のような自己免疫疾患に対して、疾患の症状を軽減・緩和し、関連組織を保護するなど積極的な作用を持つため、自己免疫疾患の治療に有用であることを証明した。これに基づき、本発明者が本発明を完成した。
ここで用いられる用語の「モノクローナル抗体」とは、一類のほぼ均一なコロニーから得られた抗体で、すなわち、少数のあり得る自然発生の突然変異以外、このコロニーに含まれる単独の抗体が同様である。モノクローナル抗体は、高度特異的に単一の抗原部位に対するものである。そして、通常のポリクローナル抗体製剤(通常は異なる抗原決定基に対する異なる抗体である)と違い、各モノクローナル抗体は、抗原における単一の抗原決定基に対するものである。それらの特異性以外、モノクローナル抗体の利点は、ハイブリドーマの培養によって合成されるので、他の免疫グロブリンに汚染される恐れがないことにある。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の特性を表し、ほぼ均一な抗体コロニーから得られることで、何らかの特殊な方法で抗体を生産する必要があると理解されるべきではない。
さらに、本発明は、前述の抗hOPNモノクローナル抗体又はその断片をコードするDNA分子を提供する。これらのDNA分子の配列は、通常の技術で、例えば、PCR増幅 或いはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖及び重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。例えば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、或いは体外結合試験(例えば放射免疫測定(RIA)又は酵素結合免疫吸着測定(ELISA))で測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えばMunson等, Anal. Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析で測定することができる。
さらに、本発明は、自己免疫疾患を治療する薬物組成物であって、薬学的に有効量の本発明のモノクローナル抗体或いはその免疫抱合体と、薬学的に允許される担体と、を含む薬物組成物を提供する。
さらに、本発明は、前述の抗hOPNモノクローナル抗体或いはその活性断片、免疫抱合体を含むhOPN検出用キットを提供する。本発明のキットで生物標本におけるhOPNの存在の有無或いはその含有量を検出することができるが、この検出方法は、(a)標本を本発明のキットにおける抗hOPNモノクローナル抗体或いはその免疫抱合体と接触させることと、(b)抗原-抗体複合体が形成すると、標本におけるオステオポンチンの存在が示されるように、抗原-抗体複合体の形成の有無を検出すること、或いは、標本におけるhOPNの含有量を表すように、形成された抗原-抗体複合体の量を定量的に検出することと、を含む。前述標本は、前処理されたものでも、前処理されていないものでもよく、例えば抽出、精製又は濃縮などを経たものである。
以下、実施例、実験例によって、さらに本発明を説明するが、これらの実施例、実験例は本発明の制限にはならないと理解されるものである。実施例には、伝統的な方法、例えば、ベクターやプラスミドを構築する方法、タンパク質をコードする遺伝子をこのようなベクターやプラスミドに挿入する方法、或いはプラスミドを宿主細胞に導入する方法並びにクラシックな細胞融合とモノクローナル抗体のスクリーニング及び精製の方法などの詳細な記述が含まれていない。このような方法は、本分野における普通の技術者には周知で、且つSambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiais,T.(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold spring Harbor Laboratory Press(「モレキュラー・クローニング:研究室マニュアル」第2版、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社)を含む多くの出版物に記述されている。特に断らない限り、%と部は、重量で計算される。本発明の実施例或いは実施例において、由来が表記されていない原料・補助材はすべて市販品である。
実施例1.ヒトOPNのcDNA断片のクローニング
GENEBANKに提供されたヒトOPNの資料及び配列を参照し、プライマーとして、OPNセンスプライマー(プライマー1):GGG AAGCTT ACCATGAGAATTGCAGTGATTTG (Hind III) (配列番号16)及びOPNアンチセンスプライマー(プライマー2):GCC GGTACC ATTGACCTCAGAAGATGCAC(Kpn I) (配列番号17)を合成し、ヒト肝臓癌細胞株LM3(上海中山病院から購入)を増幅し、TRISOLキット(INVITROGEN)でRNAを抽出し、RT-PCR(PROMEGA)によって94℃で5分間、そして94℃で45秒、58℃で30秒、72℃で45秒を一つのサイクルとして30サイクル、さらに72℃で10分間という反応条件で処理した。963bpのDNA断片を得た。ゲル回収キット(上海生工)で断片を回収した後、制限酵素のHind III及びKpn Iで切断し、ゲル電気泳動で回収した後、Hind III及びKpn Iで二重酵素切断されたプラスミドベクターと連結し、大腸菌DH10Bを形質転換した後、スクリーニングし、断片が挿入された陽性クローンを得た。DNA配列決定によって、OPN遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号1に示されたものであることが確認された。
GENEBANKに提供されたマウスOPNの資料及び配列を参照し、プライマーとして、マウスOPNセンスプライマー(プライマー3):ATAAGCTTGGATGACGACGACAAGATGAGAATTGCAGTGATT (Hind III) (配列番号18)及びマウスOPNアンチセンスプライマー(プライマー4):ATCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGA (Kpn I) (配列番号19)を合成した。マウス脾臓のTリンパ細胞を分離し、ConAで30時間活性化させた後、TRISOLキット(INVITROGEN)でRNAを抽出し、RT-PCR(PROMEGA)によって、94℃で5分間、そして94℃で45秒、55℃で30秒、72℃で45秒を一つのサイクルとして30サイクル、さらに72℃で10分間という反応条件でホットスタートPCRを行った。目標DNA断片を得た。ゲル回収キット(上海生工)で断片を回収した後、制限酵素のHind III及びKpn Iで切断し、ゲル電気泳動で回収した後、Hind III及びKpn Iで二重酵素切断されたプラスミドベクターと連結し、大腸菌DH10Bを形質転換した後、スクリーニングし、断片が挿入された陽性クローンを得た。DNA配列決定によって、マウスOPN遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号2に示されたものであることが確認された。
実施例2で得られた正確な配列のヒト・マウスOPN遺伝子断片を相応の制限酵素で酵素切断して回収した後、pPICZαプラスミドに組込んだ。ピキア酵母細胞にトランスフェクションし、単独のクローン酵母を選び、ヒト・マウスOPNタンパクの発現を誘導し、酵母細胞の発現上清を収集し、アニオン交換、分子篩精製を経て、SDS-PAGEによって純ヒト・マウスOPNタンパクを得たことが実証された。精製後、SDS-PAGE電気泳動をし、結果は図1に示された。
100μgのヒトOPNと同体積のフロインドアジュバントを乳化した後、腹腔内注射でBALB/Cマウスに免疫接種し、二週間おきに一回目と同じ投与量で免疫強化接種を行った。合計3回の免疫接種後、血清における抗OPN抗体価の高いマウスを選び、その脾臓リンパ細胞を分離し、クラシックなPEG法によって、マウス脾臓リンパ細胞をNS-1細胞と細胞融合させた。10μg/mlのOPNで96ウェルプレートを被覆し、ELISA法でスクリーニングを繰り返し、安定して抗ヒトOPN抗体を発現できるハイブリドーマ細胞株23C3を得た。モノクローナル細胞株23C3を大量に増殖させ、5×106個細胞/匹でBALB/Cマウスに腹腔内注射を行い、10日程度でマウスの腹水の収集を始め、プロテインAカラムを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって抗ヒトOPNモノクローナル抗体を精製した。ウェスタンブロット試験の結果から、マウス抗ヒトOPNモノクローナル抗体23C3は、人OPNタンパクと特異的に結合すると同時に、マウスOPNタンパクとも交差反応が生じることが示された。結果が図2に示された。市販抗OPN抗体(R&D社)。
23C3のハイブリドーマ細胞を5×106〜1×107個収集し、TRIzol(Invitrogen、カタログ番号:15596-026)でその全RNAを抽出し、マウス定常領域の配列に基づき、以下のプライマーを設計した。
HGSP2: 5’-TCGCAGATGAGTCTGGAC-3’ (配列番号21)
HGSP3: 5’-ATGAACACACTCACATTG-3’ (配列番号22)
LGSP1: 5’-GAGGTTATGACTTTCATAGTCAGC-3’ (配列番号23)
LGSP2: 5’-AACACTGTCCAGGACACCATCTCG-3’ (配列番号24)
LGSP3: 5’-TCTGGGATAGAAGTTGTTCATGAG-3’ (配列番号25)
Invitrogen 5’RACEキット(カタログ番号:18374-058)を使用し、それぞれHGSP1、LGSP1をプライマーとし、第一鎖cDNAを合成した。TdTとdCTPの作用で、第一鎖cDNAの3’末端にポリCテールを加えた。それぞれHGSP2、HGSP3、LGSP2、LGSP3を5’プライマーとし、ネステッドPCRによってVH、VLのPCR産物を得た。PCR産物をpGEM-Tベクターに組込んだ。クローンを選んでプラスミドを抽出し、制限酵素によって陽性クローンと同定され、配列決定によってその配列が決定された。23C3の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号3で、アミノ酸配列は配列番号4で、23C3の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号5で、アミノ酸配列は配列番号6である。
リンパ細胞分離液(鼎国生物技術発展会社製)で健康なヒトリンパ細胞を分離し、Trizolキット(Invitrogen社製)で全RNAを抽出し、文献(Cell,1980,22:197-207)及び文献(Nucleic Acids Research,1982,10:4071-4079)に報告された配列に従ってそれぞれプライマーを設計し、RT-PCR反応で抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域の遺伝子を増幅した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製して回収し、pGEM-Tベクターに組込み、配列決定で検証したところ、正確なクローンを得たことが確認された。配列番号12と配列番号13は、それぞれ重鎖定常領域(CH)のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。配列番号14と配列番号15は、それぞれ軽鎖定常領域(CL)のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。本実施例における正確なクローンをpGEM-T/CH及びpGEM-T/CLと表記する。
23C3の重鎖可変領域の遺伝子23C3VHとpGEM-T/CHベクターを鋳型とし、94℃で15分間、そして94℃で50秒、58℃で50秒、72℃で50秒を一つのサイクルとして30サイクル、さらに72℃で10分間という反応条件でオーバーラップPCRによってキメラ抗体の重鎖の遺伝子を合成した。そして、このキメラ重鎖の遺伝子の5’末端に制限酵素切断部位HindIIIとシグナルペプチドの遺伝子配列を、3’末端に翻訳終止コドンTAAと制限酵素切断部位EcoRIを含有するようにした。シグナルペプチドの遺伝子配列はATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA(配列番号 52)である。最後に、アガロースゲル電気泳動でPCR増幅産物を分離し、目的バンドを回収してpGEM-Tベクターに組込み、陽性クローンをスクリーニングし、配列決定を行った。配列決定で正確なクローンを選んでHindIII及びEcoRIで酵素切断し、アガロースゲル電気泳動でキメラ抗体の重鎖断片c23C3VHCHを精製して回収し、HindIII及びEcoRIで二重酵素切断されたプラスミドpcDNA3.1(+)(米国Invitrogen社製)と連結し、キメラ重鎖の真核発現ベクターpcDNA3.1(+)(c23C3VHCH)を構築した。
Accelrys社のInsight IIプログラムパッケージで23C3マウス由来モノクローナル抗体の可変領域の三次元構造をシミュレーションした。まず、BLASTプログラムでタンパク質構造データベース(Protein Data Bank、PDB)からそれぞれ23C3の重鎖及び軽鎖の可変領域のタンパク質の鋳型タンパク質を見つけた。一番高い相同性を持つ抗体1cbvと1F6Lを23C3のモデリング鋳型に選択し、Insight IIプログラムで23C3の三次元構造をモデリングした(図28)。
BLASTプログラムでGenbankのデータベースからそれぞれ23C3の軽鎖及び重鎖の可変領域と最も類似のヒト由来鋳型を見つけた。23C3の重鎖の可変領域と一番高い相同性を持つヒト由来抗体は、ヒト抗体のAAT51715.1抗体(gb|AAT51715.1|)で、類似度が72%で、23C3の軽鎖の可変領域と一番高い相同性を持つヒト由来抗体は、BAC01726.1( dbj|BAC01726.1|)で、類似度が72%である。それで、それぞれAAT51715.1及びBAC01726.1をそれぞれ23C3の重鎖及び軽鎖のヒト化の鋳型として使用した。
上述構築されたc23C3又はh23C3の軽・重鎖のプラスミドをリポフェクション法でCHO-K1細胞(ATCC CRL-9618)にコトランスフェクションし、トランスフェクションから24h後、細胞を600μg/mlのG418及び250μg/mlのZeocinを含有する選択培地に移して耐性クローンをスクリーニングした。細胞の培養上清を取ってELISA検出で高発現クローンをスクリーニングし、スクリーニングで得られた高発現クローンを無血清培地で増殖培養し、プロテインAアフィニティーカラム(GE社製)でキメラ抗体c23C3又はヒト化抗体h23C3を分離・精製し、最後に紫外線吸収法で定量した。
hOPNを5μg/レーンで10% SDS-PAGE電気泳動を行い、360mAの一定電流で1時間電気泳動した後ニトロセルロース膜に移し、10%脱脂粉乳で4℃で一晩或いは室温で2時間ブロックし、1×TBST(Tween-20 0.1%)で毎回10分間で3回洗浄し、それぞれ10μg/mlのc23C3及びh23C3と室温で1時間反応させ、1×TBST(Tween-20 0.1%)で毎回10分間で5回洗浄し、1:1000で希釈したHRP標識のマウス抗マウスIgG(北京中山社)と室温で1時間反応させ、ECLキット(Tiangen社)で1-2分間反応させ、医療用青感光性X線フィルムで押して露光した。結果が図31に示された。結果から、c23C3及びh23C3はいずれもhOPNと特異的に結合することが示された。
実験例I-1.23C3モノクローナル抗体による治療のCIAマウスの関節炎発病指数、発病時間及び発病率に対する影響の実験
100μgのニワトリII型コラーゲン(Condrex)と同体積の完全フロインドアジュバントを乳化した後、尾部皮下でDBA/1Jマウス(32匹)(雄、8-10週)に初の免疫を行い、21日後再び免疫し、すなわち、100μgのニワトリII型コラーゲンと同体積の不完全フロインドアジュバントを乳化した後、尾部皮下で再び免疫した。2回免疫したマウスを4群に分け、それぞれ対照抗体(マウスIgG、200μg/匹、Sigma)、23C3モノクローナル抗体(200μg/匹、100μg/匹、50μg/匹)を投与し、ずべての治療群は腹腔内投与で、2回目の免疫の当日から1日おきに継続的に6回投与した。2回目の免疫の当日から、関節炎発病指数、発病時間及び発病率を合計30日観察した。マウスの関節炎の重篤度は、文献(A Role for the Lymphotoxin/LIGHT Axis in the Pathogenesis of Murine Collagen-Induced Arthritis.「コラーゲンに誘導されたマウス関節炎の発病機構におけるリンホトキシン/LIGHT Axisの作用」 Roy A. Fava, Evangelia Notidis, Jane Hunt, Veronika Szanya, Nora Ratcliffe, Apinya Ngam-ek, Antonin R. de Fougerolles, Andrew Sprague和Jeffrey L. Browning. The Journal of Immunology, 2003, 171: 115‐126.)を参照して採点した。具体的に、各足に対して、それぞれ炎症の具合によって、腫れがない場合を0点と、1つの指が腫れ、或いは僅かの水腫の場合を1点と、複数の指が腫れ、或いは中度の水腫の場合を2点と、多数の指が腫れ、或いは重度の水腫の場合を3点と、すべての指が腫れ、或いは奇形の場合を4点と採点した。マウス関節炎の疾患指数は、前肢及び後肢の炎症点数の合計である。
23C3モノクローナル抗体200μg群と対照治療群のCIAマウス(実験例I-1と同様)について、2回目の免疫から30日の時点で、X線検出を行い、各発病の関節の骨破壊の様子を観察した。結果は、図4に示されるように、治療群と比べ、23C3モノクローナル抗体治療群では、マウスの各指間で関節の骨吸収が顕著ではなかった。23C3モノクローナル抗体の骨吸収対する良好な保護作用が示唆された。
無菌でCIAマウス(実験例I-1)の脾臓を分離し、100メッシュのスチール網を通し、PBSで2回洗浄し、リンパ球分離液で脾臓リンパ球を分離し、2000rpm×20分間で遠心し、リンパ球層を引出し、PBSで2回洗浄し、計数し、且つリンパ球の濃度を5×106個細胞/mlに調整した。24ウェル組織培養プレートにおいて、上層は、径5μmのろ膜を有し、10μgのOPNで下層を被覆しておいた。上層の各ウェルに、異なる抗体、すなわち23C3(抗OPNモノクローナル抗体)、Her-2抗体(無関連抗体対照)、抗OPNポリクローナル抗体(CHEMICONから購入)と同時にリンパ球を5×105加えた。37℃、5%CO2で2時間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、下層のウェルにおける細胞数を計数し、5つの高倍率の視野で平均値を得て、さらに50をかけた。
異なる時点(0、7、14或いは28日)で異なる治療群のDBA/1Jマウス(実験例I-1)の血漿を採取し、マウスOPNのELISAキット(R&D社)でOPNのタンパク質濃度を検出した。具体的に、マウスの外眼角静脈から採血し、すぐ4000rpmで10分間遠心し、血漿を分離した。1:200で希釈してELISA検出キットの96ウェルプレートに加え、常温で1時間インキュベートし、PBSTで5回洗浄し、ビオチン標識抗OPN第一抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、5回洗浄し、アビジン標識第二抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、6回洗浄した後、基質のTMBで着色させ、OD450で吸光度を検出した。標準曲線によって、血漿標本におけるOPNの濃度を算出した。
14日の実験例I-1における異なる治療群のCIAマウスの関節組織を取り、皮膚及び筋肉組織を除き、RNeasy Miniキット(QIAGEN)で組織の全RNAを抽出し、Sensiscript RT Kit (QIAGEN)でRNAをcDNAに逆転写した。リアルタイムPCRの要求に応じて、OPNの各受容体のプライマーを設計した。具体的に表1に示された。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)でリアルタイムPCRを行い、OPN受容体の組織mRNAレベルを検出した。反応工程は実施例4と同様であった。実験データは、ABI PRISM 7900シーケンシングシステム(Applied Biosystems)で分析した。
実験例I-1における14日の異なる治療群のCIAマウスの関節組織を取り、皮膚及び筋肉組織を除き、RNeasy Miniキット(QIAGEN)で組織の全RNAを抽出し、Sensiscript RT Kit (QIAGEN)でRNAをcDNAに逆転写した。リアルタイムPCRの要求に応じて、各種のサイトカインのプライマーを設計した。具体的に上述表1に示された。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)でリアルタイムPCRを行い、サイトカインの組織mRNAレベルを検出した。反応工程は実施例4と同様であった。実験データは、ABI PRISM 7900シーケンシングシステム(Applied Biosystems)で分析した。
無菌で実験例I-1における異なる治療群のCIAマウスの脾臓とリンパ節を分離し、100メッシュのスチール網を通し、PBSで2回洗浄し、リンパ球分離液で脾臓リンパ球を分離し、2000rpm×20分間で遠心し、リンパ球層を引出し、PBSで2回洗浄し、計数し、且つリンパ球の濃度を5×106個細胞/mlに調整した。各ウェルにリンパ球を5×105個ずつ加えると同時に、異なる濃度のニワトリII型コラーゲンを加えて刺激した。37℃、5%CO2で72時間インキュベートし、56時間目にサイトカインのIFN-γ及びIL-10の検出のため上清を回収し、同時に各ウェルに3H(0.5uCi)を含有する培養液を100μlずつ加え、続いて16時間培養した後、細胞収集器で細胞を収集し、γ液体シンチレーション検出器で検出した。
異なる時点(0、7、14或いは28日)の実験例I-1における異なる治療群のDBA/1Jマウスの血清を採取し、ELISA法で抗II型コラーゲン自己抗体のIgG1、IgG2a及び全Igの血清抗体価を検出した。具体的に、マウスの外眼角静脈から採血し、室温で2時間静置し、4000rpmで10分間遠心し、血清を分離した。100ng/ウェルのニワトリII型コラーゲンで96ウェルプレートを被覆し、4℃で一晩置き、PBSで洗浄した後、10%脱脂粉乳で2時間ブロックし、PBSTで3回洗浄し、1:2000から血清標本を2倍階段希釈して96ウェルプレートに加え、常温で1時間インキュベートし、PBSTで5回洗浄し、HRP標識のウサギ抗マウスIgG1、IgG2a及び全Igの抗体を加え、37℃で2時間インキュベートし、5回洗浄し、基質のo-フェニレンジアミンで着色させ、OD450で吸光度を検出した。標準曲線によって、標本における自己抗体の抗体価を算出した。
28日目の実施例1における異なる治療群のマウス(実験例I-1)の関節組織を取り、皮膚及び筋肉組織を除き、RNeasy Miniキット(QIAGEN)で組織の全RNAを抽出し、Sensiscript RT Kit (QIAGEN)でRNAをcDNAに逆転写した。リアルタイムPCRの要求に応じて、RANKL、RANK及びOPGのプライマーを設計した。具体的に上述表1と同様である。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)でリアルタイムPCRを行い、RANKL、RANK及びOPG の組織mRNAレベルを検出した。反応工程は、実施例におけるヒト・マウスOPNの真核細胞発現及び精製の工程と同様である。実験データは、ABI PRISM 7900シーケンシングシステム(Applied Biosystems)で分析した。
異なる治療群のDBA/1Jマウス(実験例I-1)の2回目の免疫から30日目の尿液を収集し、マウスD-pyr ELISAキット(R&D社)でD-pyrのレベルを検出した。結果は、図12に示されるように、23C3モノクローナル抗体治療群では尿液におけるD-pyrが顕著に対照群よりも低かった。
実験例II-1.23C3モノクローナル抗体による肝炎モデルのマウスの死亡率に対する影響の実験
C57BL/6(雄、8-10週)マウス(第二軍医大学実験動物センターから購入)に対して無関連の対照抗体Ig(Sigma)、23C3モノクローナル抗体を各群に10匹ずつ、1匹に200μgずつ、腹腔内に投与し、2時間後、尾静脈にConA (30mg/ml)を200μlずつ注射し、急性劇症肝炎を誘導し、24時間継続に23C3モノクローナル抗体の肝炎マウスの死亡率に対する影響を観察した。
C57BL/6(雄、8-10週)マウスに対して無関連の対照抗体Ig(Sigma)、23C3モノクローナル抗体を各群に10匹ずつ、1匹に200μgずつ、腹腔内に投与し、2時間後、尾静脈にConA (30mg/ml)を200μlずつ注射し、急性劇症肝炎を誘導した。ConAの注射後、0、3、6、12、24及び48時間の時点で各治療群のマウスの血清を採取し、ALT及びASTのレベルの変化を検出し、同時に12時間の時点で各群のマウスの肝臓を採取し、HE及びTUNELの染色を行い、肝臓の壊死、炎症浸潤及びアポトーシスの様子を観察した。
異なる時点(0、3、6、12、24時間)で異なる治療群のC57BL/6マウス(実験例II-2)の血漿を採取し、マウスOPN ELISAキットでOPNのタンパク質濃度を検出した。具体的に、マウスの外眼角静脈から採血し、すぐ4000rpmで10分間遠心し、血漿を分離した。1:200で希釈してELISA検出キットの96ウェルプレートに加え、常温で1時間インキュベートし、PBSTで5回洗浄し、ビオチン標識抗OPN第一抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、5回洗浄し、アビジン標識第二抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、6回洗浄した後、基質のTMBで着色させ、OD450で吸光度を検出した。標準曲線によって、血漿標本におけるOPNの濃度を算出した。
異なる時点(0、3、6、12或いは24時間)で異なる治療群のC57BL/6マウス(実験例II-2)の血漿を採取し、マウスTNF-α・IFN-γ ELISAキット(R&D)でTNF-α・IFN-γのタンパク質濃度を検出した。具体的に、マウスの外眼角静脈から採血し、室温で2時間静置し、血清を分離した。1:100で希釈してELISA検出キットの96ウェルプレートに加え、常温で1時間インキュベートし、PBSTで5回洗浄し、ビオチン標識の抗TNF-α・IFN-γ第一抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、5回洗浄し、アビジン標識第二抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、6回洗浄した後、基質のTMBで着色させ、OD450で吸光度を検出した。標準曲線によって、血漿標本におけるTNF-α・IFN-γの濃度を算出した。
実験例III-1.23C3モノクローナル抗体のクローン病モデルのマウスの体重、疾患活動性指数(DAI)及び脾臓指数に対する影響の実験
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)飲水法で実験性大腸炎マウスを30匹再現し、すなわち、水の代わりに30g/L DSSをマウスに継続に7日間飲ませた。上述マウスを平均に対照Ig対照治療群、23C3モノクローナル抗体治療群の3群にわけた。モデル構築の当日から継続に3日間、毎回200μg/匹腹腔内投与した。毎日実験マウスの体重を記録し、毎日のマウスの大便の性状、潜血試験及び体重の変化によってマウスの疾患活動性指数(採点基準が表2に示された)を評価した。
7日目の異なる治療群の病変大腸組織(実験例III-1)を採取し、PBSで洗浄した後、10%ホルムアルデヒドで固定し、通常のパラフィン包埋を行い、連続に2μmの組織切片とし、HE染色を行った。光学顕微鏡で異なる治療群の組織学的変化を観察した。具体的な採点基準は表3に示された。
腸組織ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性の検出は、商品化された試薬で行った。各治療群の0、3、7日の大腸組織(実験例III-1)を取り、同様な重量を秤量した後、細かく切り、氷浴で30秒ホモジネートし(0.5%HTAB含有緩衝液中)、ホモジネート液を超音波で10秒処理し、3回凍結・溶解を繰り返し、15000g×15分間で遠心した。ホモジネート上清0.1mlに0.167mg/mlのo-ジアニシジン塩酸塩(O-dianisidine hydrochloride)を2.9ml加え、そして0.0005%のH2O2を加え、OD460を検出した。公式でMPOの活性を換算し、1単位のMPO活性は、1分間でペルオキシダーゼを1μmol分解することに相当する。
3日目と7日目の時点で異なる治療群のマウスの腸組織(実験例III-1)を取り、RNeasy Miniキット(QIAGEN)で組織の全RNAを抽出し、Sensiscript RT Kit (QIAGEN)でRNAをcDNAに逆転写した。リアルタイムPCRの要求に応じて、各種のサイトカインのプライマーを設計した。具体的に表1に示された。SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)でリアルタイムPCRを行い、サイトカインの組織mRNAレベルを検出した。反応工程は実施例3と同様であった。実験データは、ABI PRISM 7900シーケンシングシステム(Applied Biosystems)で分析した。
異なる時点(0、3、7日)で異なる治療群のC57BL/6マウス(実験例III-1)の血漿を採取し、マウスOPN ELISAキットでOPNのタンパク質濃度を検出した。具体的に、マウスの外眼角静脈から採血し、すぐ4000rpmで10分間遠心し、血漿を分離した。1:200で希釈してELISA検出キットの96ウェルプレートに加え、常温で1時間インキュベートし、PBSTで5回洗浄し、ビオチン標識抗OPN第一抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、5回洗浄し、アビジン標識第二抗体を加え、常温で1時間インキュベートし、6回洗浄した後、基質のTMBで着色させ、OD450で吸光度を検出した。標準曲線によって、血漿標本におけるOPNの濃度を算出した。
実験例IV-1.c23C3とh23C3抗体の体外におけるリンパ球の移動に対する阻害作用の実験
無菌でCIAマウスの脾臓を分離し、100メッシュのスチール網を通し、PBSで2回洗浄し、リンパ球分離液で脾臓リンパ球を分離し、2000rpm×20分間で遠心し、リンパ球層を引出し、PBSで2回洗浄し、計数し、且つリンパ球の濃度を5×106個細胞/mlに調整した。24ウェル組織培養プレートで、上層は、径5μmのろ膜を有し、10μgのOPNで下層を被覆しておいた。上層の各ウェルに、異なる濃度の抗体、すなわち23C3、Her-2抗体(無関連抗体対照)、c23C3及びh23C3と同時にリンパ球を5×105加えた。37℃、5%CO2で2時間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、下層のウェルにおける細胞数を計数し、5つの高倍率の視野で平均値を得て、さらに50をかけた。
無菌でCIAマウスの脾臓を分離し、100メッシュのスチール網を通し、PBSで2回洗浄し、リンパ球分離液で脾臓リンパ球を分離し、2000rpm×20分間で遠心し、リンパ球層を引出し、PBSで2回洗浄し、計数し、且つリンパ球の濃度を5×106個細胞/mlに調整した。各ウェルに、30μg/mlのニワトリII型コラーゲン及び異なる濃度の23C3、対照Ig、c23C3及びh23C3と同時にリンパ球を5×105個加えた。37℃、5%CO2で72時間インキュベートし、各ウェルに3H(0.5uCi)を含有する培養液を100μlずつ加え、続いて16時間培養した後、細胞収集器で細胞を収集し、γ液体シンチレーション検出器で検出した。
無菌でCIAマウスの脾臓を分離し、100メッシュのスチール網を通し、PBSで2回洗浄し、リンパ球分離液で脾臓リンパ球を分離し、2000rpm×20分間で遠心し、リンパ球層を引出し、PBSで2回洗浄し、計数し、且つリンパ球の濃度を5×106個細胞/mlに調整した。各ウェルに、100μg/mlのニワトリII型コラーゲン及び異なる濃度の23C3、対照Ig、c23C3及びh23C3と同時にリンパ球を5×105個加えた。37℃、5%CO2で72時間インキュベートし、細胞を収集し、Annexin V-FITCを加え、フローサイトメトリーでアポトーシスの様子を検出した。
実験齢V-1.抗hOPN(23C3)モノクローナル抗体の抗原エピトープのスクリーニング実験
ランダムペプチドライブラリー免疫スクリーニング法を使用し、全過程は96ウェルプレートで行った。23C3モノクローナル抗体を100μg/ml、100μl/ウェルで4℃で一晩被覆し、10%脱脂粉乳(TBST希釈)で一晩ブロックし、1×TBST(Tween-20 0.1%)で6回洗浄し、ファージランダムペプチドライブラリー(NEB,Ph.D.-12TM ファージディスプレイペプチド実験室キット Phage Display Peptide Library Kit)4×1010 pfu + 正常マウス血清100μlを室温で1時間緩く振蕩した。1×TBST(Tween-20 0.1%)、1×PBS (pH5.0)、 1×PBS (pH3.5)でそれぞれ5回洗浄し、1mg/ml BSA含有グリシン-Cl(pH 2.2)で溶出させ、室温で15分間緩く振蕩し、Tris-Cl(pH 9.1) 15μlで中和した。10μlを抗体価の測定に、残りは増幅に供した。増幅産物はPEG/NaClで沈殿させ、抗体価を測定し、同時に2回目のスクリーニングを行い、同様に3回目のスクリーニングを行った。毎回インプットされたファージ数は同一で(4×1010 pfu)、3回のスクリーニングでアウトプット(output)されたファージ数はそれぞれ2.76×103 pfu、3.45×105 pfu、3.08×106 pfuで、スクリーニング効率は、それぞれ1回目の125倍と1116倍で、結果から、図22に示されたように、スクリーニングによる蓄積効果が顕著であることが明らかになった。
ELISAは96ウェルプレートで行い、100μg/ml、50μl/ウェルの23C3モノクローナル抗体で4℃で一晩被覆し、10%脱脂粉乳(TBSTで希釈)で37℃で2時間ブロックし、1×TBST(Tween-20 0.1%)で5回洗浄し、各モノクローナルファージの増殖上清をいずれも5×108pfu/50μl になるように1×TBSで希釈し、マウスモノクローナル抗体SM5-1(中国人民解放軍第二軍医大学腫瘍研究所によって調製され、調製過程は文献:SM5-1: a new monoclonal antibody which is highly sensitive and specific for melanocytic lesions.「SM5-1:メラニン細胞の損傷に対して高度敏感で且つ特異的である新規なモノクローナル抗体」Arch Dermatol Res. 2000年12月;292(12):583-9.を参照し、以下も同様)を対照抗体とし、4E4(このクローンはSM5-1の陽性クローンで、同上。以下も同様)を陰性対照ファージとした。室温で1時間結合させ、1×TBST(Tween-20 0.1%)で5回洗浄した後、各ウェルに1:5000で希釈したHRP標識の抗-M13抗体(Pharmacia #27-9411-01)を200μlずつ加え、室温で1時間振蕩して作用させ、1×TBST(Tween-20 0.1%)で5回洗浄し、晶美社のELISA検出キットのA:B=1:1の新制の反応基質を50μl/ウェル加え、室温で1-5分間作用させた。2N H2SO4で反応を終止させた。各クローンは、いずれも23C3及び対照抗体SM5-1に対して平行重複ウェルを3つ設けて検出した。OD450の記録結果から、図23Aに示されたように、陽性クローンと抗体の反応が特異的であることが明らかになった。
一本鎖DNA抽出キット(上海捷瑞社)で鋳型を調製し、-96プライマーで配列決定を行い、クロム酸塩(Chromas)で配列を読み出し、25個の陽性クローンのうち独立の配列が15個あった。AlignXで分析したところ、結果は図24に示されたように、23C3の可能な抗原エピトープはWLXPDPであることがわかった。
実験例V-3で得られた各クローンをそれぞれ5×107pfuで抗体で被覆された96ウェルプレートに投入し、同様な条件のスクリーニング(対照抗体:SM5-1、無関連の対照抗体:4E4)後、溶出されたファージに対して抗体価を測定した(blood 2006-04-014639を参照)。
ドットブロット実験:3×10ngのKLH-4B5(無関連対照)、KLH-5F12でそれぞれ3つのドットをつけ、実験例V-4で得られた各種のオリゴペプチドをそれぞれ三つの異なる抗体とハイブリドさせ、ブロック、メンブレンの洗浄、第一抗体の室温での1時間の反応、メンブレンの洗浄、HRP標識抗マウス第二抗体の室温での1時間の反応を経て、メンブレンを洗浄し、フィルムで押して露光した。無関連のオリゴペプチドは23C3と反応しなかったが、KLH-5F12は相応の抗体と特異的に反応することができ、結果は図26Aに示された。
Claims (13)
- WLXPDPである(ただし、Xは任意のアミノ酸である。)オステオポンチンの機能エピトープ。
- 請求項1に記載の機能エピトープと特異的に結合する抗オステオポンチンのモノクローナル抗体。
- 前述モノクローナル抗体の重鎖可変領域のCDRアミノ酸配列は、それぞれIYAMD、RIRSQSNNYTTYYADSVKD或いはQMGDY QMGDYから、軽鎖可変領域のCDRアミノ酸配列は、それぞれRASENIYSFLA、AATNLAD或いはQHFWGTPFTから選ばれる、ことを特徴とする請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- 前述モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号4或いは配列番号8から、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号6或いは配列番号10から選ばれる、ことを特徴とする請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- 前述モノクローナル抗体の定常領域は、マウス抗体の定常領域或いはヒト抗体の定常領域から選ばれる、ことを特徴とする請求項2に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項2-5のいずれかに記載のモノクローナル抗体をコードするDNA分子。
- 請求項6に記載のDNA分子を含有するベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含む、或いはゲノムに請求項6に記載のDNA分子が組み込まれている宿主細胞。
- (a) 請求項2に記載のモノクローナル抗体と、
(b) 薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる群から選ばれる抱合部分と、
を含むことを特徴とする免疫抱合体。 - 請求項2に記載の抗オステオポンチンのモノクローナル抗体或いは請求項9に記載の免疫抱合体の自己免疫疾患を治療する薬物の製造のための使用。
- 請求項2に記載の抗オステオポンチンのモノクローナル抗体或いは請求項9に記載の免疫抱合体と、薬学的に允許される担体と、を含む薬物組成物。
- 請求項2に記載の抗オステオポンチンのモノクローナル抗体或いは請求項9に記載の免疫抱合体を含むオステオポンチン検出用キット。
- 生物標本におけるオステオポンチンの存在の有無或いはその含有量を検出する方法であって、
(i)検出される標本を請求項2に記載の抗オステオポンチンのモノクローナル抗体或いは請求項9に記載の免疫抱合体と接触させることと、
(ii)抗原-抗体複合体が形成すると、標本におけるオステオポンチンの存在が示されるように、抗原-抗体複合体の形成の有無を検出すること、或いは、標本におけるオステオポンチンの含有量を表すように、形成された抗原-抗体複合体の量を検出することと、
を含む検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2007100398786A CN101293916A (zh) | 2007-04-24 | 2007-04-24 | 骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及用途 |
PCT/CN2008/070582 WO2008128456A1 (fr) | 2007-04-24 | 2008-03-25 | Épitope fonctionnel d'ostéopontine, anticorps monoclonal anti-ostéopontine et leur utilisation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010524475A true JP2010524475A (ja) | 2010-07-22 |
JP2010524475A5 JP2010524475A5 (ja) | 2011-11-04 |
Family
ID=39875089
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010504426A Pending JP2010524475A (ja) | 2007-04-24 | 2008-03-25 | オステオポンチンの機能エピトープ、それと特異的に結合するモノクローナル抗体及び用途 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100239588A1 (ja) |
EP (1) | EP2143734A4 (ja) |
JP (1) | JP2010524475A (ja) |
CN (2) | CN101293916A (ja) |
BR (1) | BRPI0810664A2 (ja) |
CA (1) | CA2685185A1 (ja) |
WO (1) | WO2008128456A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101891814B (zh) * | 2009-05-21 | 2012-11-07 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 抗骨桥蛋白opn单克隆抗体及其应用 |
CN102942630A (zh) * | 2012-10-17 | 2013-02-27 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗骨桥蛋白抗体 |
CN104327166B (zh) * | 2013-03-06 | 2018-02-23 | 南昌大学 | 赭曲霉毒素a的十二肽抗原模拟表位及其应用 |
PL3618845T3 (pl) | 2017-05-04 | 2021-08-02 | Follicum Ab | Peptydy do leczenia cukrzycy |
CN112480250B (zh) * | 2020-12-23 | 2022-03-15 | 上海交通大学 | 一种抗人骨桥蛋白的抗体及其应用 |
CN113567573B (zh) * | 2021-07-09 | 2023-06-02 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 骨桥蛋白的分离方法和分析方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPH09191886A (ja) * | 1996-01-19 | 1997-07-29 | Asahi Breweries Ltd | ヒト高親和性IgE受容体に対するヒト型化抗体、半キメラ抗体およびキメラ抗体 |
WO2000063241A2 (en) * | 1999-04-15 | 2000-10-26 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for modulating an immune response |
MXPA03009052A (es) * | 2001-04-05 | 2004-10-15 | Immuno Biological Lab Co Ltd | Anticuerpo anti-osteopontina y uso del mismo. |
CN1351888A (zh) * | 2001-11-10 | 2002-06-05 | 河北医科大学 | 抗骨桥蛋白抗体类药物生产方法及用途 |
WO2004103403A1 (ja) * | 2003-05-23 | 2004-12-02 | Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. | 免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途 |
-
2007
- 2007-04-24 CN CNA2007100398786A patent/CN101293916A/zh active Pending
-
2008
- 2008-03-25 JP JP2010504426A patent/JP2010524475A/ja active Pending
- 2008-03-25 BR BRPI0810664A patent/BRPI0810664A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-03-25 CA CA002685185A patent/CA2685185A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-25 EP EP08715318A patent/EP2143734A4/en not_active Withdrawn
- 2008-03-25 CN CN2008800136201A patent/CN101679518B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-03-25 US US12/597,391 patent/US20100239588A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-25 WO PCT/CN2008/070582 patent/WO2008128456A1/zh active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6012034298; Journal of Cellular Biochemistry Vol.77, No.3, 2001, p.487-498 * |
JPN6012034299; Journal of Cellular Biochemistry Vol.84, No.2, 2002, p.420-432 * |
JPN6012034300; The Journal of Biological Chemistry Vol.269, No.37, 1994, p.23280-23285 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101293916A (zh) | 2008-10-29 |
CN101679518A (zh) | 2010-03-24 |
CN101679518B (zh) | 2012-11-14 |
EP2143734A4 (en) | 2010-05-19 |
WO2008128456A1 (fr) | 2008-10-30 |
US20100239588A1 (en) | 2010-09-23 |
EP2143734A1 (en) | 2010-01-13 |
CA2685185A1 (en) | 2008-10-30 |
BRPI0810664A2 (pt) | 2017-06-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6883591B2 (ja) | 抗ヒトインターロイキン−17aモノクローナル抗体、その製造方法及び使用 | |
CA2790013C (en) | Fully human anti-tnf-.alpha. monoclonal antibody, preparation method and use thereof | |
JP3925663B2 (ja) | 抗Fasリガンド抗体および該抗体を用いた測定法 | |
JP6006404B2 (ja) | 抗BLyS抗体 | |
US20210122815A1 (en) | Anti-interleukin-17a antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
JP2007054079A (ja) | ヒトmcp−1に対する抗体 | |
TWI635097B (zh) | 新穎抗人類tslp受體抗體 | |
CN110914304A (zh) | Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
KR100496335B1 (ko) | 항-Fas 리간드항체 및 이 항체를 이용한 측정법 | |
CN112513090A (zh) | 结合人il-4r的抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
AU2024200493A1 (en) | ANTI-IL-23p19 ANTIBODY AND USE THEREOF | |
JP2010524475A (ja) | オステオポンチンの機能エピトープ、それと特異的に結合するモノクローナル抗体及び用途 | |
US7935793B2 (en) | Treatment of inflammatory bowel diseases with anti-IP-10 antibodies | |
US20190112367A1 (en) | Human anti-il-32 antibodies | |
JP2010525795A (ja) | オステオポンチンの機能エピトープ、それと特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗腫瘍薬の製造のための用途 | |
CN116554323B (zh) | 人源化抗il21抗体的开发和应用 | |
RU2741802C2 (ru) | АНТИТЕЛО К Myl9 | |
EP1708961A2 (en) | Treatment of inflammatory bowel diseases with anti-ip-10 antibodies | |
WO2004101511A2 (en) | Anti-ip-10 antibodies and methods of using thereof for the treatment of inflamatory bowel diseases | |
EA046350B1 (ru) | Анти-интерлейкин-17а антитело, фармацевтическая композиция и их применение |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100511 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110915 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120703 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20121003 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20121011 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121102 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121127 |