JP2003514031A - Ｔｒ３特異的結合剤およびその使用のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本出願において、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤、およびその生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を使用するための方法が、開示される。本発明の生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤は、ＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害するために有用であることが、示される。これらの生物学的に活性な薬剤は、対宿主性移植片病、器官拒絶、腫瘍増殖、自己免疫、および炎症のような、Ｔ細胞媒介性疾患を処置するために有用であることが、示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願に対する相互参照） 本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとで、１９９９年１１月１９日付け
で出願された米国仮特許出願番号６０／１６６，５８３に対する優先権を主張す
る。この米国仮特許出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、一般的に、生物学的な細胞表面抗原およびこのような抗原に結合す
る薬剤に関する。より詳細には、本発明は、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合
剤、およびこのようなＴＲ３特異的結合剤を使用する方法に関する。

【０００３】 （発明の背景） （ＴＲ３の構造的特徴） ＴＲ３（Ａｐｏ−３，ＤＲ３，ＬＡＲＤ，Ｔｒａｍｐ，およびＷＳＬ−１とし
ても公知）は、細胞表面抗原の腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーフ
ァミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのいくつかのメンバー（例
えば、ＮＧＦＲ（神経発育因子レセプター）およびＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１））は、広範な組織分布を有するが、このスーパーファミリーの他のメンバー
（例えば、ＣＤ２７，ＣＤ３０，ＣＤ４０，ＣＤ１３４，４−１ＢＢ，およびＴ
Ｒ３）は、リンパ系／造血系の細胞に限定される。ＴＲ３を除いて、この後者の
群のレセプターは、細胞増殖のアップレギュレーションと関連付けられている。
ＴＲ３は、ＴＮＦＲおよびＣＤ９５に対して相同な細胞質死ドメイン（ｄｅａｔ
ｈ ｄｏｍａｉｎ）を有し、プログラム細胞死（アポトーシス）に関与すると考
えられている。

【０００４】 これらのレセプターの各々は、細胞表面リガンドと相互作用する。このスーパ
ーファミリーのリンパ系メンバーの場合、リガンドは通常、相補性の細胞型にお
いて発現される。すなわち、レセプターがＴ細胞上である場合、そのリガンドは
、抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、または樹状細胞）
において見出され、そして逆もまた同様である。これらのレセプター／リガンド
対の間の相互作用は、レセプター保有細胞に活性化または死についてのシグナル
を送達すると考えられる。現在まで、ＴＲ３に対するリガンドは発見されていな
い。

【０００５】 （疾患における活性化Ｔ細胞の役割） Ｔリンパ球は、対宿主性移植片（ＧＶＨＤ）の主要な原因である。ＧＶＨＤの
予防は、１つ以上の汎（ｐａｎ）Ｔ細胞免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、
コルチコステロイド、またはメトトレキサート）を投与することによって達成さ
れる。これらの免疫抑制剤は、「汎」免疫抑制剤と呼ばれる。なぜなら、これら
は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および前駆体Ｔリンパ球を抑制するからである。被験体で
１％未満の正常レベルの循環Ｔ細胞を維持しつつも、このような免疫抑制剤を受
容している被験体が、３ヶ月以上免疫無防備状態であることは珍しいことではな
い。従って、このような薬剤は、結果として生じる機能的免疫系の不在から生じ
る二次感染に起因して、被験体の有意な罹病率および死亡率と関連付けられる。
従って、活性化Ｔ細胞の増殖を選択的に制限し得る治療剤の開発が所望される。

【０００６】 このような治療剤はまた、Ｔ細胞増殖に関連した他の疾患（例えば、急性およ
び慢性の移植拒絶疾患（対宿主性移植片および器官拒絶）、自己免疫疾患（重症
筋無力症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症
、サルコイドーシス、心筋炎、甲状腺炎、および他の器官特異的自己免疫疾患）
、炎症性疾患（トキシックショック症候群、炎症性腸疾患、および遅延型過敏症
）、および癌（白血病およびリンパ腫））の進行を停止させるか、または少なく
とも緩徐化させるにおいて顕著な価値を有する。

【０００７】 （Ｆａｓに対する抗体の潜在的用途） Ｔ細胞免疫応答をダウンレギュレーションするために提案された１つの治療剤
は、Ｆａｓ（Ａｐｏ−１およびＣＤ９５としてもまた公知）、ＴＮＦＲ細胞表面
タンパク質に対して指向された抗体の使用である。Ｆａｓは、活性化された正常
なヒトリンパ系細胞およびリンパ腫瘍細胞（Ｂ細胞およびＴ細胞を含む）、なら
びに他の正常細胞において発現される。Ｆａｓへの抗Ｆａｓ抗体の結合によって
、Ｆａｓを発現する細胞の増殖阻害および／またはアポトーシスが引き起こされ
る。従って、Ｆａｓに対するモノクローナル抗体は、自己免疫疾患を制御するた
めに、ならびにＦａｓを発現する腫瘍を制御するために、潜在的に治療的に有用
であると考えられた（米国特許第５，８９１，４３４号、Ｋｒａｍｍｅｒら，１
９９５年３月２３日付け出願）。

【０００８】 不幸なことに、Ｋｒａｍｍｅｒらの特許出願の出願後、Ｆａｓが広範な組織分
布を有し、このことが、ＦａｓをＴ細胞免疫応答の選択的制御のための見込みの
薄い候補にすることが見出された。野生型マウスへの抗Ｆａｓ抗体の注射は、マ
ウスの急速な死を引き起こした。剖検によって、アポトーシスによる肝臓への重
篤な損傷が明らかにされた。Ｏｇａｓａｗａｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：８
０６−８０９、１９９３。

【０００９】 （発明の開示） 本発明は、ＴＲ３が、活性化Ｔ細胞およびいくつかの腫瘍細胞において選択的
に発現されるという発見に由来する。この発見は、特に、選択的免疫抑制剤とし
ての、ＴＲ３に対するモノクローナル抗体（ＭｃＡｂ）および他の生物学的に活
性なＴＲ３特異的結合剤の使用のために重要である。ＭｃＡｂを産生する伝統的
方法は、動物における活性化Ｔ細胞の存在を必要とする。しかし、ＴＲ３特異的
ＭｃＡｂは、活性化Ｔ細胞に結合し、そしてその増殖を阻害するので、活性化Ｔ
細胞は、ＭｃＡｂの産生に必要なＢ細胞に補助を提供するために利用可能ではな
い。従って、ＴＲ３が活性化Ｔ細胞において発現されるという発見は、生物学的
に活性なＴＲ３特異的結合剤（例えば、ＭｃＡｂ）を作製する代替的方法の開発
を必要とした。

【００１０】 さらに、ＴＲ３が、活性化Ｔ細胞において選択的に発現されるという発見、お
よび生物学的に活性なＴＲ３特異的ＭｃＡｂの作製は、上記の抗Ｆａｓ抗体のよ
うな抗体を使用する実行可能な代替案を提供する。これらの生物学的に活性なＴ
Ｒ３特異的ＭｃＡｂは、活性化Ｔ細胞ならびにリンパ組織由来の腫瘍細胞に選択
的に結合し、そしてＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害する。これにより、活性
化Ｔ細胞およびＴ細胞腫瘍の選択的排除が可能となる。これは、残りの免疫系を
無害なままにし、それによって、固有様式の処置を提供する。

【００１１】 従って、本発明の１つの局面は、ＴＲ３に選択的に結合し、そしてＴＲ３を発
現する細胞の増殖を阻害する、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を提供する
。このような生物学的に活性な特異的結合剤の例としては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：ＴＲ３に対するＭｃＡｂ（このようなＭｃＡｂの種々
のアイソタイプを含む）、ＴＲ３に対するポリクローナル抗体、これらの抗体の
模倣物、ＴＲ３特異的結合剤の天然のリガンド、ならびにＴＲ３特異的結合剤の
種々のフラグメントおよび誘導体。

【００１２】 本発明の別の局面は、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を作製する方法を
提供する。これらの方法は、免疫Ｂ細胞ドナー以外の供給源由来のＴ細胞補助を
利用する工程を包含する。Ｔ細胞補助は、直接的な接触によるか、またはＴ細胞
によるサイトカインの分泌を通した、Ｔ細胞との相互作用をいう；このような相
互作用は、抗体を分泌するようにＢ細胞を刺激する。例示的な方法は、ＴＲ３で
初回免疫したドナー由来のＢ細胞にＴ細胞補助を供給するために、ＴＲ３特異的
Ｔ細胞株を使用する工程、次いで、生じた活性化Ｂ細胞を、リンパ系細胞と融合
して、生物学的に活性なＴＲ３特異的ＭｃＡｂを産生するハイブリドーマを作製
する工程を包含する。

【００１３】 本発明のさらに別の局面は、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を検出する
方法を提供する。この方法は、少なくとも１つのＴＲ３特異的結合剤を、少なく
とも１つの活性化Ｔ細胞またはＴ細胞腫瘍と接触させる工程、および結果として
生じるＴ細胞増殖レベルを決定する工程を包含する。Ｔ細胞増殖の減少は、ＴＲ
３特異的結合剤が生物学的に活性であることを示す。この方法は、インビボおよ
びインビトロで実施され得る。従って、本発明の別の局面は、この方法によって
同定される生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤の産生である。

【００１４】 本発明の別の局面は、ＴＲ３を発現する細胞の好ましくない増殖と関連した疾
患（例えば、Ｔ細胞媒介性疾患）を有することが疑われる被験体を処置する方法
を提供する。例示的な方法は、少なくとも１つの生物学的に活性なＴＲ３特異的
結合剤を被験体に投与する工程を包含する。この方法は、特に、同種異系骨髄移
植を受けようとしているかまたは同種異系骨髄移植を受けた直後であり、かつＧ
ＶＨＤに罹患する可能性のある被験体を処置するために有用である。この方法は
また、腫瘍、器官移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギー、トキシックショック症
候群、および炎症性疾患を処置するために有用である。

【００１５】 （配列表） 配列番号１は、ヒトＴＲ３遺伝子の核酸配列である。

【００１６】 配列番号２は、ヒトＴＲ３のアミノ酸配列である。

【００１７】 配列番号３は、ヒトＴＲ３（１−１３）ペプチドのアミノ酸配列である。

【００１８】 配列番号４は、ヒトＴＲ３（１−３２）ペプチドのアミノ酸配列である。

【００１９】 配列番号５は、ＬｅｗｉｓラットＭＨＣクラスＩＩ結合間隙によって認識され
たアミノ酸配列である。

【００２０】 配列番号６は、マウスＰＬＰペプチドのアミノ酸配列である。

【００２１】 配列番号７は、ＴＲ３（１４−３２）ペプチドのアミノ酸配列である。

【００２２】 （本発明を実施するための方法） 本発明は、ＴＲ３に結合しそしてＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害する生物
学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を含む組成物を提供する。１つの局面において
、特異的結合剤は、モノクローナル抗体またはＴＲ３特異的モノクローナルの模
倣物である。本発明はまた、モノクローナル抗体ＴＲ３μｋ−１を産生するハイ
ブリドーマ細胞株（例えば、ＡＴＣＣ番号 のもと寄託されたハイブリドーマ
細胞株）を提供する。モノクローナル抗体は、以下からなる群から選択される：
少なくとも１つのＩｇＧ、少なくとも１つのＩｇＭ、少なくとも１つのＩｇＡ₁
、少なくとも１つのＩｇＡ₂、少なくとも１つのＩｇＥ、少なくとも１つのＩｇ
Ｄ、少なくとも１つのＩｇＧ₁、少なくとも１つのＩｇＧ₂、少なくとも１つのＩ
ｇＧ₃、および少なくとも１つのＩｇＧ₄。

【００２３】 本発明はさらに、ＴＲ３に結合しそしてＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害す
る生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を含む組成物を提供し、ここで、生物学
的に活性なＴＲ３特異的結合剤は、ＴＲ３を発現する細胞の増殖を少なくとも３
０％阻害する。

【００２４】 本発明はまた、以下の工程によって、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を
作製するための方法を提供する：少なくとも１つのＴＲ３に特異的なエピトープ
を注射された動物由来のリンパ系細胞を提供する工程；リンパ系細胞とＴＲ３特
異的Ｔ細胞株とを接触させる工程；少なくとも１つの骨髄腫細胞と少なくとも１
つのリンパ系細胞とを融合し、ＴＲ３モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを産生する工程；得られたモノクローナル抗体を、関連ＴＲ３ペプチドに結
合する能力についてスクリーニングする工程；およびモノクローナル抗体をアッ
セイして、ＴＲ３を発現する細胞の阻害を評価する工程。

【００２５】 本発明はさらに、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を検出するための方法
を提供する。この方法は、以下の工程を必要とする；少なくとも１つのＴＲ３特
異的結合剤と少なくとも１つの活性化されたＴ細胞またはＴ細胞腫瘍とを接触さ
せる工程；および活性化されたＴ細胞または腫瘍の増殖のレベルを決定する工程
（ここで、増殖の減少はＴＲ３特異的結合剤が生物学的に活性であることを示す
）。１つの局面において、ＴＲ３特異的結合剤と活性化Ｔ細胞またはＴ細胞腫瘍
とを接触させる工程は、インビボで起こる。別の局面において、ＴＲ３特異的結
合剤と活性化されたＴ細胞またはＴ細胞腫瘍とを接触させる工程は、インビトロ
で起こる。

【００２６】 上記の方法により同定される結合剤はまた、本明細書中で提供される。

【００２７】 本発明はまた、ＴＲ３を発現する細胞の増殖に関連する疾患を有する疑いのあ
る被験体を処置するための方法を提供する。少なくとも１つの生物学的に活性な
ＴＲ３特異的結合剤が、被験体に送達されるかまたは投与される。１つの実施形
態において、被験体は、以下からなる群から選択される（しかし、これらに限定
されない）Ｔ細胞媒介疾患を有する疑いがある：自己免疫疾患（例えば、重症筋
無力症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症、
サルコイドーシス、心筋炎、甲状腺炎、および腫瘍。別の局面において、被験体
は、移植された器官（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、皮膚または付
属器）の拒絶の疑いがある。代替の実施形態において、ＴＲ３を発現する細胞は
、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫である。

【００２８】 （Ｉ．定義および略語） ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害。

【００２９】 ＡＰ：アルカリホスファターゼ。比色ＥＬＩＳＡ検出系および蛍光ＥＬＩＳＡ
検出系において用いられる酵素。

【００３０】 ＡＰＣ：抗原提示細胞。これらは、クラスＩＩ分子を発現する、Ｂ細胞、マク
ロファージ、樹状細胞、およびいくらかのＴ細胞であり、そして抗原をプロセシ
ングし得、そしてこれらのプロセシングしたフラグメントを提示して、Ｔ細胞を
活性化し得る。

【００３１】 アポトーシス：細胞核の凝縮および引き続く断片化により特徴付けられる正常
または病的細胞の細胞死の任意の形態。細胞核の凝縮および引き続く断片化の間
は、形質膜はインタクトなままである。

【００３２】 生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤：「生物学的に活性なＴＲ３特異的結合
剤」は、前出に記載の特異的結合剤のサブセットである。生物学的に活性なＴＲ
３特異的結合剤は、それらがＴＲ３に特異的に結合する能力およびＴＲ３を発現
する細胞の増殖を阻害する能力によりさらに特徴付けられる。さらに、阻害のレ
ベルは、種々の異なる生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤の間で変動し得る。
一般に、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤は、ネガティブコントロール（Ｔ
Ｒ３特異的結合剤なしの同様のサンプル）と比較した場合、ＴＲ３を発現する細
胞の増殖を阻害する。当然のことながら、いくつかの、生物学的に活性なＴＲ３
特異的結合剤は、用量依存様式においてより大きな阻害、例えば、少なくとも３
０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の阻害を示し得る。

【００３３】 ＢＭＴ：骨髄移植。

【００３４】 ＣＡＤＤ：コンピューター補助薬物設計。

【００３５】 ＣＤ２８：ＣＤ２８は、Ｔ細胞サブセット上で発現される細胞表面抗原である
。ＣＤ２８は、未処理（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞の活性化を担う。

【００３６】 ＣＤ３：ＣＤ３は、Ｔ細胞上で発現される細胞表面抗原である。ＣＤ３は、Ｔ
細胞抗原レセプターに会合しており、そしてシグナル伝達を促進する。

【００３７】 ＣＤ４⁺：ＣＤ４⁺は、ヘルパーＴ細胞上で発現される細胞表面抗原であり、そ
してより少ない程度には、マクロファージおよび単球において発現される。ＣＤ
４⁺は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する補助レセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ）として働く。

【００３８】 ＣＤ８⁺：ＣＤ８⁺は、細胞傷害性Ｔ細胞上で見出される細胞表面抗原である。
ＣＤ８⁺は、ＭＨＣクラスＩ分子に対する補助レセプターとして働く。

【００３９】 ＣＦＡ：完全フロイントアジュバント。免疫応答を増強するために用いられる
。

【００４０】 ＣｏｎＡ：コンカナバリンＡ。Ｔ細胞の活性化および増殖を誘導するＴ細胞マ
イトジェン。

【００４１】 ＣＰＭ：個数／分。

【００４２】 ＥＡＥ：実験的アレルギー性脳脊髄炎。多発性硬化症および他のＴ細胞媒介性
自己免疫疾患のモデル。

【００４３】 ＥＢＶ：エプスタイン−バーウイルス。長期間細胞株のためにＢ細胞を形質転
換するために用いられる。

【００４４】 ＥＬＩＳＡ：酵素結合イムノソルベントアッセイ。特定の抗原に結合する抗体
を検出するために用いられる比色アッセイまたは蛍光アッセイ。

【００４５】 ＦＡＣＳ（登録商標）：蛍光活性化細胞選別器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎ
ｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。

【００４６】 ＦＡＣＳｃａｎ^TM：ＦＡＣＳ細胞分析器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ
）。

【００４７】 ＦＣＳ：ウシ胎仔血清。リンパ球をインビトロ培養するための補充物。

【００４８】 ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート。ＦＡＣＳ装置を用いてフロー
サイトメトリーによりＴ細胞表面抗原を検出するために抗体にしばしば結合体化
される蛍光色素。

【００４９】 ＧＰＢＰ：モルモットのミエリン塩基性タンパク質 ＧＶＨＤ：対宿主性移植片病。致死的Ｔ細胞媒介性疾患であり、この疾患では
、提供されたＴ細胞がレシピエント組織を攻撃する。

【００５０】 ＨＡＴ：ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ハイブリドーマ生成に
おいて融合していない骨髄腫細胞を排除するために用いられる培地）。

【００５１】 ＬＰＳ：リポポリサッカリド。Ｂ細胞マイトジェン。

【００５２】 ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質。ミエリンの成分。

【００５３】 ＭｃＡｂ：モノクローナル抗体。単一のクローンまたは供給源に由来する抗体
。

【００５４】 ＭＨＣクラスＩＩ：細胞内小胞において分解するために細胞外マトリクスから
インターナライズされ、続いてＴ細胞に提示するために表面で再発現される、抗
原提示を担う主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質。

【００５５】 模倣物：タンパク質（例えば、ＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害し得るモノ
クローナル抗体）の活性を模倣する分子（例えば、有機化合物）。ペプチド模倣
物および有機性模倣物の実施形態は、この用語の範囲内であり、それによりこの
ようなペプチド模倣物および有機性模倣物の化学的構成要素の三次元配置が、ペ
プチド骨格および成分であるペプチド中のアミノ酸側鎖の三次元配置を模倣する
。結果として、実質的に特異的な阻害活性を有するペプチドのこのようなペプチ
ド模倣物および有機性模倣物を生じる。コンピューターモデリング適用に関して
は、「ファルマコフォア」（生物学的活性についての構造的要件の三次元的定義
）が理想化される。ペプチド模倣物および有機性模倣物が設計されて、各ファル
マコフォアが現在のコンピューターモデリングソフトウェアにあてはめられ得る
（コンピューター補助薬物設計（ＣＡＤＤ）を用いる）。コンピューター補助薬
物設計において使用される技術の説明に関しては、Ｗａｌｔｅｒｓ、Ｋｌｅｇｅ
ｒｍａｎ＆Ｇｒｏｖｅｓ編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ
，ＩＬ，１９９３、１６５−１７４頁；およびＭｕｎｓｏｎ、Ｍｕｎｓｏｎ編、
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９５、第１０２
章を参照のこと。

【００５６】 ＭＬＲ：混合リンパ球反応。ＧＶＨＤのインビトロ相関。

【００５７】 ＭＯＧ：ミエリン稀突起膠細胞糖タンパク質。

【００５８】 ＭＳ：多発性硬化症。ヒト自己免疫疾患。

【００５９】 ＭＵＰ：メチルウンベリフェリルリン酸。ＥＬＩＳＡにおいて、リン酸をホス
ファターゼ酵素により除去した後に蛍光原（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）を残す。

【００６０】 マウスＰＬＰ（１３９−１５１）：ＳＪＬマウス系統におけるプロテオリピド
タンパク質の主要Ｔ細胞エピトープ（アミノ酸配列ＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ
（配列番号６）：ＰＬＰに会合しているシグナル配列は存在しない）。

【００６１】 ＮＰＰ：ニトロフェニルリン酸。ＥＬＩＳＡにおいて用いられるホスファター
ゼの色素原性基質。

【００６２】 オルソログ：「オルソログ」は、異なる種に由来する遺伝子に類似の機能を示
すタンパク質をコードする遺伝子である。

【００６３】 ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動。分子量サイズに基づいて分子を
分離する方法。

【００６４】 ＰＢＬ：末梢血リンパ球。血液中を循環するリンパ球。

【００６５】 ＰＢＳＡＥ：アジ化ナトリウムおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含
有リン酸緩衝化生理食塩水。

【００６６】 ＰＥ：フィコエリトリン。ＦＩＴＣのような蛍光色素。

【００６７】 ＰＬＰ：プロテオリピドタンパク質。中枢神経系のミエリン鞘の主要成分。

【００６８】 ＲＡ：慢性関節リウマチ。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患。

【００６９】 ＲＰＭＩ １６４０：Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ ＃１６４０。

【００７０】 ＲＴ：室温。

【００７１】 ＲＴＩＢ¹：ＬｅｗｉｓラットＭＨＣクラスＩＩ分子の名称。

【００７２】 ＳＦＭ：無血清培地。

【００７３】 特異的結合剤：「特異的結合剤」は、ＴＲ３に特異的に結合し得る薬剤である
。このような薬剤としては、天然のＴＲ３リガンド、およびＴ３特異的免疫グロ
ブリンが挙げられる。後者の群（ＴＲ３特異的免疫グロブリン）としては、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒト化モノクローナル抗体を含む）、モ
ノクローナル抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）²、およびＦ
ｖフラグメント）、ＴＲ３特異的抗体の模倣物、ならびにＴＲ３もしくはそのフ
ラグメントに特異的に結合し得る任意の他の薬剤が挙げられるが、これらに限定
されない。

【００７４】 被験体：用語「被験体」とは、生存している多細胞脊椎生物をいう。ヒトおよ
び非ヒト哺乳動物の両方を含む分類。

【００７５】 ＴＮＦＲ：腫瘍壊死因子レセプター。ＴＮＲスーパーファミリーのレセプター
／リガンド対の基本型レセプター。

【００７６】 ＴＲ３（１−１３）：ヒトＴＲ３のアミノ酸ｇｌｎ１−ｇｌｙ１３のペプチド
（アミノ酸配列ＱＧＧＴＲＳＰＲＣＤＣＡＧ（配列番号３））。アミノ酸は、Ｔ
Ｒ３のプロセシングされた形態（すなわち、２４アミノ酸リーダー配列が除去さ
れた後）に従って番号付けされる。

【００７７】 ＴＲ３（１−３２）：ヒトＴＲ３のアミノ酸ｇｌｎ１−ｔｙｒ３２のペプチド
（アミノ酸配列ＱＧＧＴＲＳＰＲＣＤＣＡＧＤＦＨＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡ
ＧＨＹ（配列番号７））。アミノ酸は、ＴＲ３のプロセシングされた形態（すな
わち、２４アミノ酸リーダー配列が除去された後）に従って番号付けされる。

【００７８】 ＴＲ３（１４−３２）：ヒトＴＲ３のアミノ酸ａｓｐ１４−ｔｙｒ３２のペプ
チド（アミノ酸配列ＤＦＨＫＫＩＧＬＦＣＣＲＧＣＰＡＧＨＹ）。アミノ酸は、
ＴＲ３のプロセシングされた形態（すなわち、２４アミノ酸リーダー配列が除去
された後）に従って番号付けされる。

【００７９】 （ＩＩ．実験モデルの概観） 以下の節は、以下に示される実験の背景にある理論を説明するために提供され
る。理論の理解と共に、示される結果の重要性は、より容易に明らかである。

【００８０】 （Ａ．Ｌｅｗｉｓラット主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合
間隙に適応する抗原の使用） ペプチド特異的免疫応答を誘発する不可欠な部分は、免疫原性であるために、
ペプチドは最初にＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得なければならないことである
。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、およびいくつ
かのＴ細胞を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現される。ＭＨＣクラス
ＩＩ分子は、細胞内小胞にプロセスされたタンパク質に由来するペプチドの提示
を主に担うと考えられている。外因性ペプチドはまた、Ｔ細胞を活性化するため
に表面ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され得る。Ｂ細胞は、そのレセプター
を介して、外来タンパク質抗原を認識し、そしてこのタンパク質をインターナラ
イズする。Ｂ細胞上のこの抗原結合および複数の抗原レセプターの架橋は、最初
の活性化シグナルを送達する。次いで、インターナライズされたタンパク質は、
ペプチドに分解され、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する細胞の表面に移動
される。一旦プロセスされると、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合し得るペプチドの
みが、ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞に対する提示のために細胞表面に導かれ得ること
に留意することが重要である。ペプチドの特異的Ｔ細胞への提示の際、Ｔ細胞は
、活性化されるようになる。次いで、活性化Ｔ細胞は、次に抗体産生のためにＢ
細胞を活性化するサイトカインを産生し得る。Ｂ細胞活性化は、２つのシグナル
プロセスである。第１のシグナルは、上記のように特定の抗原を結合する際に送
達される。第２のシグナルは、Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するペプチ
ドを認識する場合に送達される。第２の活性化シグナルの送達後、Ｂ細胞は、特
異的抗体を産生する。

【００８１】 抗体を産生するために使用される従来方法は、動物を全長タンパク質で免疫す
ることである。大きなタンパク質は、おそらくＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エ
ピトープの両方を含む。しかし、ペプチド（タンパク質のより小さな部分）を用
いた免疫は、抗体産生をあまり生成しそうにない。この原因は、２つの部分を有
する。最初に、ほとんどのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を
有さず、従って、Ｔ細胞に提示され得ない。第２に、ほとんどの合成ペプチドは
、モノマーであり、最初の活性化シグナルをＢ細胞に送達し得ない。ペプチドは
抗体産生を誘導するために使用されているが、この方法を取り巻く通則は、詳述
されておらず、そしてペプチドは、最も頻繁に、Ｂ細胞に対するマルチマーの提
示のためにより大きなタンパク質と結合体化される。ＭＨＣクラスＩＩ分子によ
って提示され得るペプチドを選択することは、Ｔ細胞補助が、Ｂ細胞に対して提
供されることを確実にする。本明細書中に記載された研究において、この選択は
、Ｌｅｗｉｓラットの使用によって容易にされる。

【００８２】 ＬｅｗｉｓラットＲＴＩＢ¹クラスＩＩ分子によるペプチドの効率的な提示の
ために必要なものは、研究され、特徴付けられている（Ｗｅｇｍａｎｎら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：８９２−９００、１９９４）。これらの研究は、ＭＨ
ＣクラスＩＩ分子（ＲＴＩＢ¹）に対するペプチド結合を推定する配列モチーフ
の同定を導く。ＲＴＩＢ¹クラスＩＩ分子は、配列Ｓ／ＴｘｘｘｘｘＥ／Ｄ（配
列番号５）を有するペプチドを示す。これらの配列要件の同定は、Ｔ細胞抗原と
しての使用が推定される特定のペプチドの選択を可能にする。Ｂ細胞は、活性化
されるようになるために多価の抗原提示を必要とするので、公知のクラスＩＩ結
合モチーフを用いてペプチドの長さを伸長することが、抗体応答を誘導するため
の最適な条件を提供するということは、理にかなっている。Ｌｅｗｉｓラットへ
の注射のためのこれらの長いペプチドの使用は、所望の抗原（これは、本発明の
場合、ＴＲ３である）に特異的な抗体を開発する可能性を増加させる。この推定
およびその結果の詳細は、以下の第ＩＩＩＡ節に記載される。

【００８３】 ＬｅｗｉｓラットのＭＨＣクラスＩＩ結合間隙（ＲＴＩＢ¹）へ特異的に適応
するＴＲ３ペプチドフラグメントの使用は、ＴＲ３抗原に対する抗体の効率的な
産生を可能にする。一旦産生されると、これらの抗体は、ＴＲ３が活性化Ｔ細胞
およびいくつかの腫瘍細胞上で選択的に発現され、それによって治療的な効果を
提供するという発見を導く。この発見はまた、ＴＲ３アミノ酸配列内の他の領域
を標的化するＴＲ３特異的結合剤を作製する代替方法の使用を導く。

【００８４】 （Ｂ．ＴＲ３特異的モノクローナル抗体の作製） いくつかの場合、モノクローナル抗体を作製する従来方法は、通常、免疫応答
に不可欠な役割を果たす分子を標的化する抗体の作製を可能にするために、改変
されなければならない。これは、ＴＲ３レセプターに対する抗体を惹起すること
を試みる場合である。

【００８５】 通常、ハイブリドーマは、Ｂ細胞（これは、所望の抗体を活発に産生している
）および骨髄腫細胞の融合を通じて形成される。Ｂ細胞は、通常、実際的な観点
から、免疫されたマウスまたはラットの脾臓に由来する。動物は、一次免疫応答
を生じるために抗原を用いて注射される。脾臓を回収する３日前に、動物は、抗
原を用いて再注射される。この第２の追加免疫は、抗原特異的Ｂ細胞およびＴ細
胞を活性化させる。活性化Ｂ細胞は、より簡単に誘導されて、骨髄腫と融合され
る。

【００８６】 正常な既往性応答または記憶応答において、抗原を経験したＢ細胞は、抗原を
経験したＴ細胞と相互作用する。両集団は、一次応答の間に数が増加され、二次
チャレンジ後の有益な相互作用の可能性が増加されている。Ｔ細胞活性化と関連
するタンパク質（特に、死ドメインと関連するタンパク質）に対する抗体の産生
は、特有な事例である。

【００８７】 本発明の場合、抗原は、活性化Ｔ細胞表面上で見出されたＴＲ３レセプターの
一部である。従って、一次刺激の間にＢ細胞が活性化されるようになり、ＴＲ３
に対する抗体を産生し始めた場合、このＢ細胞に隣接する活性化Ｔ細胞は、破壊
の標的になる。一次応答の間の循環しているペプチド特異的記憶Ｔ細胞に生じる
減少は、二次応答に必要な記憶Ｔ細胞のアベイラビリティを減少する。これは、
次には、引続くチャレンジにおける利用可能な記憶Ｂ細胞プールを活性化する可
能性を減少する。従って、骨髄腫細胞と融合する前に記憶Ｂ細胞のプールを活性
化する従来方法は、この場合には機能しない。この記憶応答の欠損は、以下に示
される。

【００８８】 この問題が確認された後、いくつかの代替手段が、ＴＲ３に対するモノクロー
ナル抗体を産生するために考慮された。例えば、免疫動物由来の脾臓は、一次免
疫後、１０、１４、または２１日目に取り出され得、次いで、脾細胞は、骨髄腫
細胞と融合され得る。あるいは、動物は、一次免疫後、４〜６週間放置され得、
次いで、脾臓が取り出され、そしてインビトロでさらに刺激され得る。このよう
な刺激は、脾細胞に対してリポポリサッカリド（ＬＰＳ）および／またはＴＲ３
特異的Ｔ細胞株（以下に記載されるような）を添加することによって達成され得
る。この様式で使用されることによって、ＬＰＳまたはＴＲ３特異的Ｔ細胞株は
、Ｂ細胞に対する刺激の所望の過剰の追加免疫を提供し、抗体分泌ハイブリドー
マを得る可能性を増加し得る。

【００８９】 （Ｃ．完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いた免疫） 代表的に、特定の抗原に対して指向される抗血清は、アジュバントと組合わせ
た、抗原の適切な動物被験体への注射によって惹起される。アジュバントは、抗
原に対する動物中の免疫応答を増強する任意の物質である。完全フロイントアジ
ュバント（ＣＦＡ）は、熱で殺傷されたミコバクテリアを有する水中油エマルジ
ョンを含む組成物である。ＣＦＡおよび抗原の注射に続いて、注射視域周辺の組
織は、炎症を起こすようになる。炎症は、一部分、Ｔ細胞の活性化に帰する。従
って、Ｔ細胞応答を検出する１つの方法は、注射部位における腫脹のレベルを評
価することである。

【００９０】 （Ｄ．実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）） 実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、特定の感受性系統のマウスおよび
ラットにおいて、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパ
ク質（ＰＬＰ）、またはミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）の投
与によって誘導され得る実験的自己免疫疾患状態である。げっ歯類において、Ｅ
ＡＥは、ＭＢＰ、ＭＯＧ、またはＰＬＰに特異的なＴ_H１細胞の活性化によって
引き起こされる。通常、ＣＦＡ中に乳化された抗原の注射の約１〜３週間後に、
この動物は、脳脊髄炎（麻痺によって特徴付けられる）を発症する。この徴候は
、軽度かつ自己限定性であり得るか、または慢性かつ再発性であり得る。

【００９１】 ＭＢＰ、ＰＬＰ、またはＭＯＧをＴ細胞に導入することによってインビトロで
抗原特異的Ｔ細胞を活性化することもまた、可能である。次いで、これらのイン
ビトロ活性化されたＴ細胞は、レシピエント動物に対してＥＡＥを「養子移入す
る」ためにラットまたはマウスに注射され得る。

【００９２】 ＥＡＥモデルは、活性化Ｔ細胞の活性を阻害すると考えられる組成物を試験す
るために使用される。この方法で使用されることによって、試験組成物は、動物
に送達され得る。この動物における引続く疾患徴候の顕在化（ｅｖｉｄｅｎｔ）
の欠如は、この組成物が動物においてＴ細胞免疫応答を阻害することの指標であ
る。

【００９３】 （Ｅ．対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）） ＧＶＨＤは、公知の同種異系の骨髄移植の合併症である。提供された骨髄由来
の成熟Ｔ細胞は、レシピエントの組織を外来と認識し、そしてそれを拒絶する。
この疾患は、１つの器官を拒絶する代わりに、レシピエントの全身（皮膚、肝臓
、腸管、肺などを含む）が攻撃される点を除いて、器官移植拒絶において観察さ
れるものと類似している。ＧＶＨＤは、親の骨髄をＦ１レシピエントに注射する
ことによってげっ歯類において誘発され得る。この場合、１体の親の提供された
Ｔ細胞は、他の親のＭＨＣを認識し、そしてＧＶＨＤを引き起こす。ヒトにおけ
る場合、この疾患は、介入の非存在下では致死的である。以下に記載されるモデ
ルにおいて、全ての未処置レシピエントは、移植後２８日までに死亡する。モデ
ルで使用される動物に発現した疾患は、活性化Ｔ細胞によって引き起こされ、そ
してこのモデルは、ＴＲ３特異的結合剤の組成物についての別の有用な試験を提
示する。このモデルの使用によって、ＴＲ３特異的結合剤で処置された動物は、
寿命の延長（４週間を超える）およびドナー由来の免疫系によるレシピエントの
免疫系の再構築を示すことが証明された。

【００９４】 （ＩＩＩ．初期の結果） 下記のデータは、ＴＲ３特異的ポリクローナル抗血清を使用する実験からの結
果、およびＴＲ３特異的モノクローナル抗体（ＭｃＡｂ）を使用する実験からの
結果に関する。ポリクローナル抗血清の生成および使用に関するデータは、その
抗血清が、インビトロおよびインビボで、Ｔ細胞増殖を阻害し得ることを示す。
ＴＲ３特異的モノクローナル抗体の使用に関するデータは、ＴＲ３に対するモノ
クローナル抗体を開発することが可能であること、およびそのモノクローナル抗
体が、活性化Ｔ細胞の増殖をインビトロおよびインビボで阻害し得ることを示す
。これらの結論についての基礎は、下記に詳細に記載される。

【００９５】 （Ａ．モノクローナル抗体生成およびポリクローナル抗体生成の両方における
使用のための、ヒトＴＲ３からのペプチドフラグメントの選択） ヒトＴＲ３遺伝子のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７２７６３）を
、セリンもしくはスレオニンとアスパラギンもしくはグルタミン酸とが５つの介
在アミノ酸により隔てられたＬｅｗｉｓ ＲＴＩＢ¹クラスＩＩ結合モチーフ（
Ｓ／ＴｘｘｘｘｘＥ／Ｄ）について目で精査した。このような４つのモチーフを
見出した。これらのうち、２つが推定細胞外ドメイン中に存在した。第１のモチ
ーフは、「プロセシングされた」ＴＲ３（すなわち、リーダーアミノ酸１〜２４
が切断されているＴＲ３）のアミノ末端から４アミノ酸に位置した。第２のモチ
ーフは、膜貫通領域付近にあった。

【００９６】 抗原としての使用について選択した第１のモチーフは、ＴＲ３のアミノ末端付
近に位置した。なぜなら、ネイティブの分子上のこの領域は、容易に接近可能で
あり、そしてシグナルを伝達する可能性があるからである。さらに、合成ペプチ
ドをこの抗原として使用した。合成ペプチド合成はそのペプチドのカルボキシ末
端からアミノ末端へ生じるから、全長合成ペプチドのみが、ＭＨＣクラスＩＩ複
合体によって認識され、それにより全長合成ペプチドがＢ細胞分泌に関与するこ
とが可能であり、それにより最大のＴ細胞補助を生じる。

【００９７】 １３マーペプチドおよび３２マーペプチドを合成した（ｇｌｎ１〜ｇｌｙ１３
およびｇｌｎ１〜ｔｙｒ３２（アミノ酸を、ＴＲ３のプロセシングされた形態（
すなわち、２４アミノ酸リーダー配列が除去された後）に従って番号付けする）
。ＬｅｗｉｓラットＲＴＩＢ¹クラスＩＩ結合間隙（ｃｌｅｆｔ）に結合した場
合、この１−１３ペプチドは、このペプチド結合間隙内に含まれると推定され、
この１−３２ペプチドがこのペプチド結合間隙の外側に４〜５αへリックスター
ンを含むペプチドを示すことが推定される。

【００９８】 Ｂｏｄｍｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：７９〜８８、１９９７は、ＴＲ３（
１−２３）ペプチド（すなわち、ＴＲ３（１−３２）ペプチドの最初の２３アミ
ノ酸）のオリゴマーという、不十分にしか規定されていない「多重抗原ペプチド
」でウサギを免疫することによって作製された、ポリクローナル抗ＴＲ３抗体を
記載する。この抗体をウェスタンブロットにおいて使用して、種々の細胞集団の
膜抽出物におけるＴＲ３タンパク質の存在を示した。この研究は、ポリクローナ
ル抗体のペプチド特異性という問題には言及せず、そしてこの研究は、Ｔ細胞機
能の阻害に対する防止としてのＴＲ３結合の問題には取り組まなかった。

【００９９】 ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含むＴＲ３（１−１３）ペプチド（ｇｌｎ１
〜ｇｌｙ１３）の免疫原性をＴＲ３（１−３２）ペプチド（ｇｌｎ１〜ｔｙｒ３
２）の免疫原性と比較するための実験を設計した。Ｌｅｗｉｓラット（ｎ＝３）
から採血し、そしてＣＦＡ中の短いペプチド（ＴＲ３（１−１３））４００μｇ
を用いて足蹠において免疫することによって「初回刺激（ｐｒｉｍｅ）」した。
次いで、動物を試験した。一旦動物（ラット４）を、ＴＲ３（１−３２）ペプチ
ドをコントロールとして用いて免疫した。初回刺激の６週間後、血液を各動物の
尾静脈から得、そしてＴＲ３（１−１３）ペプチドまたはＴＲ３（１−３２）ペ
プチドのいずれかでコートしたＩｍｍｕｌｏｎプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌ
ａｂｓ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）を使用する蛍光ＥＬＩＳＡによる分析のた
めに、血清を調製した。

【０１００】 これらの結果を図１に示す。ＴＲ３（１−１３）ペプチドで免疫した動物（ラ
ット１〜３）のいずれも、ＴＲ３（１−１３）ペプチドまたはＴＲ３（１−３２
）ペプチドのいずれかに対する明らかな抗体を全く生成しなかった。ＴＲ３（１
−３２）ペプチドで免疫したコントロール動物（ラット４）は、ＴＲ３（１−３
２）ペプチドを認識しそしてＴＲ３（１−１３）ペプチドをより弱い程度に認識
する、高力価の抗体を示した。

【０１０１】 体液性応答の欠如とは対照的に、ＴＲ３（１−１３）ペプチドで免疫した３匹
のラットは、非常に良好なＴ細胞応答を示した（図２）。リンパ節Ｔ細胞をこれ
らのラットから収集し、そして標準的Ｔ細胞増殖アッセイ中のＴＲ３（１−１３
）ペプチドを用いてインビトロで刺激した。³Ｈ−チミジンを２日目に添加し、
そしてこの細胞を３日目に収集して増殖を決定した。ＴＲ３（１−１３）ペプチ
ドで初回刺激した３匹のラット由来のＴ細胞は、１３マーに対する用量依存性増
殖応答を示した。これは予測された。なぜなら、ＴＲ３（１−１３）ペプチドは
、ＬｅｗｉｓラットのＲＴＩＢ ＭＨＣクラスＩＩ分子についての既知の結合モ
チーフを含むからである。これらの同じＴ細胞は、５０μｇ／ｍＬ ＴＲ３（１
４−３２）（ヒトＴＲ３のプロセシングされた形態のアミノ酸１４〜３２を含む
ペプチド）に対して、何の応答も示さなかった。このデータは、１３マーペプチ
ドおよび３２マーペプチドの両方がＴ細胞について免疫原性であるが、３２マー
ペプチドのみが、Ｂ細胞エピトープを提示する際に有効であることを、示唆した
。

【０１０２】 第２のヒトＴＲ３ペプチド（アミノ酸１５９〜１６５）の周囲の領域は免疫原
性について分析されていないが、このペプチドはＲＴＩＢ¹クラスＩＩ結合モチ
ーフを含むので、この領域は免疫原性であると予期される。このモチーフは、Ｌ
ｅｗｉｓラットＲＴＩＢ¹クラスＩＩ分子により効率的に提示され得るペプチド
を推測するために使用された。このペプチドがＴ細胞について免疫原性である場
合、適切な長さのペプチドが生成されるならば、Ｂ細胞を誘導する可能性がある
。さらに、ＴＲ３分子の他の配列または他のタンパク質の配列をＲＴＩＢ¹結合
モチーフの隣に並べること、およびこの結合モチーフに隣接する領域に対して特
異的抗体を惹起することが、可能であり得る。

【０１０３】 （Ｂ．生物学的に活性なＴＲ３ポリクローナル抗血清の首尾よい生成） （１．免疫） Ｌｅｗｉｓラット（ｎ＝６）を採血し、４００μｇのＴＲ３（１−３２）ペプ
チドを含有するＣＦＡで足蹠に免疫し、そして１ヶ月放置した。１ヶ月で、血液
を各動物の尾静脈から得た。ＴＲ３（１−３２）ペプチドコート化プレートを用
いた蛍光ＥＬＩＳＡによる分析のために血清を調製した（この手順の詳細につい
ては以下を参照のこと）。各動物由来の免疫前の血清をコントロールとして用い
た。この最初のスクリーニングの結果を図３に示す。免疫前の血清の全てが、バ
ックグランドレベルの抗体を示した（すなわち、５０〜５５ミリユニットの蛍光
）。プライミング後、２匹の動物（ラット１および２）は、ＴＲ３に対する抗体
の緩やかな増大（＜３倍）を示したが、一方４匹の動物（ラット３〜６）は、Ｔ
Ｒ３に結合した抗体の６倍〜１５倍の増大を示した。これらのデータは、ＴＲ３
（１−３２）ペプチドが、免疫原性であり、そして少なくとも１つのＢ細胞エピ
トープを効率的に示すことを示唆する。

【０１０４】 （２．ＴＲ３特異的ポリクローナル抗血清を用いるＴ細胞増殖の阻害） ＴＲ３（１−３２）ペプチドで免疫した６匹のラット由来の血清を、血清中の
抗体がＴＲ３（１−３２）ペプチドに結合する能力についてＥＬＩＳＡアッセイ
において試験した。このような抗血清が、ラットミエリン塩基性タンパク質（Ｍ
ＢＰ）特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株の増殖反応を阻害する能力を、インビトロで引き
続き試験した。２０，０００のＭＢＰ特異的Ｔ細胞を、ＡＰＣの供給源として、
照射（６０００Ｒａｄ）された、そして５μｇ／ｍＬのＭＢＰペプチドで刺激さ
れた、５倍過剰のＬｅｗｉｓ脾臓細胞とともに培養した。開始時、この培養物に
、ＴＲ３免疫ラットまたは正常Ｌｅｗｉｓ血清のいずれか由来の、２０％または
１０％のいずれかの血清を補充した。全ての血清を、使用前に熱不活化して補体
を破壊した。２日後、この培養物に１μＣｉの³Ｈチミジンを供給し、そしてさ
らに１８〜２４時間培養した。次いで、この培養物を収集し、そしてシンチレー
ションカウントによって³Ｈ取り込みを確認した。

【０１０５】 上記のように、ＡＰＣの存在下でのＭＢＰの誘導により、Ｔ細胞は、その細胞
表面膜上でＴＲ３を発現し始めるように活性化されることが予期された。細胞表
面上でのＴＲ３に対するＴＲ３抗血清の特異的結合は、Ｔ細胞の増殖速度を実質
的に減少することが予期された。（増殖速度の低下は、コントロールと比較した
場合の、³Ｈチミジンの取り込みの低下によって印される）。

【０１０６】 この結果を、コントロール（このコントロールは正常な血清培養に適切である
）の反応の相対パーセントとして、図４に示す。６つの血清全て（ラット２〜７
）が、Ｔ細胞株の増殖に阻害性効果を示した。４つの血清（ラット２、３、５、
および７）は、緩やかな阻害（５０〜６０％）を示したが、他の２匹（ラット４
および６）では、実質的な阻害が注目された。図４におけるラット４（図３のラ
ット４と同じ）由来の抗血清は、１０％血清で＞９５％阻害を示した。従って、
引き続く実験における使用のために、このラットを選択した。

【０１０７】 ラット４由来の血清を階段希釈（１：５、１：１０、１：２０、および１：４
０）して、培養の０日目、１日目、２日目、および３日目にＴ細胞培養物に添加
した。ここでも上記のＭＢＰ特異的ラットＴ細胞増殖アッセイを用いた。³Ｈチ
ミジンを０日目、１日目および２日目について、７２時間で添加したが、３日目
については、³Ｈチミジン添加は、血清添加後、２４時間遅れた。正常なＬｅｗ
ｉｓラット血清をコントロールとして再度用いた。

【０１０８】 本実験の結果を、コントロール対希釈逆数のパーセント（すなわち、１：１０
＝１０％、１：４０＝２．５％など）として図５に示す。０日目の血清の添加で
は、１：５、１：１０および１：２０の血清希釈で増殖を完全にブロックした。
上記の結果から予想されるように、１日目の血清の添加は、１：１０および１：
２０の希釈で９０％阻害を示し、そして１：４０希釈は、＞６０％阻害を示した
。一般に、この培養物に対する血清の添加が遅れるほど、この培養物によって示
される阻害は小さくなる。

【０１０９】 これらのデータは、ＴＲ３のｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）が、ＣＤ４ ⁺ 細胞で誘導されるという観察、およびこのようなｍＲＮＡが、Ｔ細胞刺激のす
ぐ後に誘導され、その後にｍＲＮＡの生成が減少するという観察と一致している
。これらのデータはさらに、観察された、Ｔ細胞増殖の阻害が、生物学的に重要
であり、そして非特異的毒性に起因しないことを意味する。さらに、補体は、事
前の加熱によって破壊されるので、抗ＴＲ３抗体は、抗原反応性Ｔ細胞上に阻害
性シグナルを直接伝達するようである。さらに、阻害性効果の機構にかかわらず
、ＴＲ３抗体は、Ｔ細胞の望ましくない活性化および増殖に関連する状態を処置
するために有用であり得るようである。

【０１１０】 （３．ポリクローナル抗血清を用いるマウスＣＤ８⁺Ｔ細胞の染色） これらのラット免疫血清を用いてラットＴ細胞を染色する予備的な試行により
、細胞染色を行ったが、これは非常に高いバックグランドを伴った。このような
バックグラウンドを減じるため、マウス脾臓細胞を染色に用いた。マウス由来の
脾臓をコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）（ＣｏｎＡ）の存在
下で４８時間培養した。この細胞を、収集し、洗浄し、そして免疫動物またはコ
ントロール動物由来の１０％血清とともにインキュベートした。次いで、この細
胞を洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と結合体化した抗ラットＩｇ抗
体を用いて染色した。次いで、この細胞をフィコエリトリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙ
ｔｈｒｉｎ）（ＰＥ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と結
合体化した抗マウスＣＤ８＋Ｔ細胞抗体で対比染色した。次いで、この細胞を洗
浄し、そして蛍光発色細胞選別器（ＦＡＣＳａｎ）を用いて分析した。

【０１１１】 上記の阻害データは、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を用いて得たので、抗血清の特異性は、
ＣＤ８：ＰＥ（ＣＤ８＋細胞に特異的な染料）を用いて試験した。従って、抗血
清がＣＤ８＋細胞を染色した場合、阻害アッセイおよび染色アッセイの両方から
の結果は、総合して、抗ＴＲ３抗血清が、ＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺の両方のＴ細胞
サブセットに結合したことを示す。３つの染色実験のうちの１つの結果を図６に
示す。図６は、ラット４の免疫血清で観察された結果と比較した、コントロール
の非免疫ラット血清を用いた染色の不足を示す。図６は、染色の指標である集団
変移を示す。ここでは、ＣＤ８⁺Ｔ細胞（右ヒストグラム）の４１％が、コント
ロール染色（左ヒストグラム）を示す領域の外側に位置している。ＣＤ８⁺Ｔ細
胞集団の全体が変移しているのは驚くことではない、なぜなら、この集団は、Ｃ
Ｄ２５（活性の指標である、ＩＬ−２レセプター）に対して＞９９％が陽性であ
るからである。このように、ほとんどの細胞が活性化され、そしてＴＲ３を発現
する。従って、ヒトＴＲ３ペプチドに対する抗血清では、高い比率のマウスＣＤ
８⁺Ｔ細胞が染色されるが、正常ラット血清では染色されない。

【０１１２】 （４．Ｔ細胞のインビトロ阻害） 抗ＴＲ３抗体は、Ｔ細胞機能の抑制において、インビボで活性であるようであ
る。例えば、免疫した動物の第１群の採血の時点で、ＴＲ３（１−３２）ペプチ
ド含有ＣＦＡで免疫した６匹の動物のうち４匹が、足蹠でのＣＦＡ免疫に代表的
に関連する、足蹠膨張または遅延型過敏（ＤＴＨ）を示さなかった。この膨張の
欠如は、炎症組織に通常存在する活性化Ｔ細胞の非存在と関連している。またＥ
ＬＩＳＡ実験によって、足蹠膨張を示さなかった４匹の動物は、最高のＴＲ３抗
体力価を有したことが実証された。これらの結果さらに、抗ＴＲ３抗体がインビ
ボで活性化Ｔ細胞を排除することを示唆する。

【０１１３】 上記を考慮して、８匹の未処理のラットが前足蹠に免疫された。４匹の動物は
ＣＦＡのみを受け、そして残りの４匹は、ＣＦＡ中のＴＲ３（１−３２）ペプチ
ドを受けた。２週間で、両群は、同様の足蹠の膨潤を示した。１ヶ月後、ＣＦＡ
のみを受けた動物はすべて依然として膨潤した足蹠を有した。対照的に、ＣＦＡ
中のＴＲ３（１−３２）ペプチドを受けた動物はいずれも、膨潤した足蹠を有さ
なかった。さらに、ＣＦＡのみを受けた３匹の動物は、少なくとも一方の後足蹠
にアジュバンド誘導関節炎を有した。一方、ＴＲ−３免疫動物は、いずれも明ら
かな関節炎を示さなかった。足蹠の膨潤の加速した減少は、抗−ＴＲ３抗体力価
を発生した８匹の動物のうち８匹で観察された。これらの結果は、Ｔ細胞媒介炎
症性疾患を処置において、ＴＲ３特異的結合剤が示すようである有利な効果を説
明する。

【０１１４】 本発明者らはまた、ＴＲ３（１−３２）ペプチドで初回免疫刺激した動物にお
いて既往性応答または記憶体液性応答の明らかな欠如を観察した。代表的には、
抗原で免疫され、続いて同一の抗原で追加免疫された動物は、抗体力価の急速な
増加および増加したまたは増強された追加免疫後の応答によって特徴付けられる
既往性応答を有する。これは、ＴＲ３（１−３２）ペプチドで免疫された動物に
おける事例ではない。高いＴＲ３力価を有する４匹の動物が採血され、次いでフ
ロイント不完全アジュバンドにおけるＴＲ３（１−３２）ペプチドで追加免疫さ
れ、そして１０日後に既往性の体液性免疫応答について試験された。これらの動
物からの追加免疫前力価と追加免疫後力価との比較が、図７に示される。３匹の
動物（ラット３〜５）は、ＴＲ３に対して力価の増加を示さなかったが、１匹（
ラット６）は、中程度（２倍未満）の増加を示した。これらのデータは、循環す
る抗ＴＲ３抗体が、ＴＲ３に対するＢ細胞既往性応答のための補助を提供するこ
とを可能にし、そしてこれらの補助を提供するために必要なＴＲ３ペプチド特異
的Ｔ細胞を除外したことを示唆する。

【０１１５】 上記された結果は、４つの理由のために重要である。第１に、これらはＴＲ３
特異的結合剤の複数回の注射が、被験体による薬剤への免疫応答の発生に関連す
る合併症なしで被験体に必要に応じて投与され得ることを示唆する。このことは
、ＴＲ３特異的結合剤に対して応答し得る任意のＴ細胞が、循環するＴＲ３特異
的結合剤により機能的に除去されることによる。

【０１１６】 ２番目に重要な意味は、本質的により技術的で、ＴＲ３モノクローナル抗体の
産生に関する。上記のように、ＴＲ３に対するモノクローナル抗体の伝統的な作
製方法は、ハイブリドーマの使用によるものである。しかし、ハイブリドーマの
産生は、ＴＲ３に特異的なヘルパーＴ細胞活性化Ｂ細胞の存在を必要とする。し
かし、この場合、ＴＲ３特異的Ｔ細胞補助は、インビボでの抗体発現Ｂ細胞の集
団を通常活性化する二次免疫応答について存在しない。従って、ハイブリドーマ
の調製は、非伝統的方法を使用して行わなければならない。

【０１１７】 第３に、ヒトＴＲ３ペプチド配列での免疫は、マウスＴ細胞とラットＴ細胞と
の交差反応する抗体を誘導することが示されている。このことは、ＴＲ３に対す
る抗体が、現れない理由を説明する。これは、種特異的抗体が得られる他の死ド
メインレセプターについての事例ではなかった。以下に示されるように、ＴＲ３
に対する一次モノクローナル抗体は、３つの種全てを認識する。

【０１１８】 第４に、被験体動物が、インビトロおよびインビボの両方で阻害性である自己
ＴＲ３に対する高い抗体力価を産生したことは、同等に重要である。それにもか
かわらず、この動物は、上記背景の節に記載される致死的な抗Ｆａｓ抗体処理と
ともに観察された有害な副作用を示さなかった。

【０１１９】 （ＩＶ．生物学的に活性なＴＲ３モノクローナル抗体の首尾の良い産生） （Ａ．モノクローナル抗体の産生） 上記に言及されたように、ハイブリドーマを産生するためには、脾臓において
抗体を産生するＢ細胞集団が、Ｂ細胞と骨髄腫細胞との融合前に増加するように
被験体動物に抗原の第２の追加免疫を投与する必要がある。しかし、２回目のＴ
Ｒ３（１−３２）ペプチドを注射された動物は、適切な追加免疫を示すことに失
敗する。

【０１２０】 従って、モノクローナル抗体を産生する２つの非伝統的方法が使用された。第
１の方法は、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）を利用して、融合前にＴＲ３特異的
Ｂ細胞をインビトロで有糸分裂促進的に刺激した。ＧｉｌｌｉｓおよびＨｅｎｎ
ｅｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２６：１９７８〜１９８４、１９８１。第
２のアプローチは、ＴＲ３（１−１３）ペプチド特異的Ｔ細胞株を使用してＴＲ
３免疫Ｂ細胞をインビトロで刺激することであった。最終的に、この後者の方法
が、ＴＲ３特異的モノクローナル抗体の首尾の良い産生を達成した。

【０１２１】 動物をＴＲ３（１−３２）ペプチドで初回免疫刺激した１０日後であるが、こ
の動物においてＴＲ３（１−３２）ペプチドに対する抗体が検出可能である前に
ＴＲ３特異的Ｔ細胞をＴＲ３（１−３２）ペプチドに対する免疫動物のリンパ節
から得た。次に、Ｔ細胞は、ＴＲ３（１−３２）ペプチド刺激の回数を変化する
ことによりインビトロで拡大させ（分裂させ）、次いでＩＬ−２（インターロイ
キン−２、２０ユニット／ｍＬ）およびＣｏｎＡ刺激（４８時間）ラット脾臓細
胞からの上清１０％を含む組織培養培地で増殖させた。３週間前にＴＲ３（１−
３２）ペプチドで免疫した動物から脾臓を取り出し、これらから単一細胞の懸濁
液を調製した。ＴＲ３（１−３２）ペプチド免疫脾臓細胞（１×１０⁸細胞）お
よびＴＲ３特異的Ｔ細胞（３×１０⁷細胞）の混合物をＴＲ３（１−３２）ペプ
チド（５μｇ／ｍＬ）の存在下で共存培養した。２日後、この細胞を洗浄し、マ
ウス骨髄腫パートナー、ＦＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）を細胞の数的
比率１：１で融合した。融合細胞は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン
−チミジン）培地で選択した。培養物上清を蛍光ＥＬＩＳＡを使用してＴＲ３（
１−３２）ペプチドでコートしたプレート上でアッセイした。２３の陽性ウェル
が最初のスクリーニングの間に見出された。懸滴培養で繰り返されたクローニン
グ（６回）は、１つの安定なハイブリドーマを産生し、ＥＬＩＳＡによりＩｇＭ
抗体を産生することが決定された。本明細書中以降では、この抗体をＴＲ３μｋ
−１と言及する。

【０１２２】 モノクローナル株を無血清培地（ＨＬ−１、Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｅｒ（Ｗａｌ
ｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびＨｙＱ ＰＦＭａｂ、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏ
ｇａｎ，ＵＴ）は同じくらい十分に作用した）に適用し、そしてＴＲ３μｋ−１
抗体を３００，０００ダルトン排除限外フィルターを備えたＡｍｉｃｏｎ Ｍｏ
ｄｅｌ ４０２ Ｕｎｉｔ（Ｂｅｒｖｅｒｌｙ，ＭＡ）そ使用した濃縮、続くリ
ン酸緩衝化生理食塩水に対する透析により精製した。抗体の産生を、１．４を減
衰係数として使用して吸光光度的にアッセイし、そしてクマシーブルーで染色す
ることにより１０％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。重鎖のバンドが約８
０ｋＤで観察され、これはＩｇＭ重鎖の大きさと一致する。全体として過量のＩ
ｇＭ（５および１０μｇ）でさえ、微量の混入物しか観察されなかった。簡単な
この方法は、治療等級の抗ＴＲ３ ＩｇＭ ＭｃＡｂを精製するために使用され
得る。

【０１２３】 モノクローナル抗体（ＴＲ３を特異的に認識し、ＴＲ３と結合する）を産生す
る１つのハイブリドーマ細胞株は、 に、ブダペスト条約の条項下で、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託さ
れた。このハイブリドーマ細胞株は、ＴＲ３μｋ−１と命名された。

【０１２４】 （Ｂ．アイソタイプスイッチ） 抗体の種々のアイソタイプがいくつかの理由のために有用である。ＩｇＭは、
インビトロで比較的短い半減期（５〜７日間）を有し、これは、ＩｇＭによりも
たらされる免疫抑制の持続時間を制限する。にもかかわらず、ＩｇＭ抗体は、補
体とともに骨髄移植前にエキソビボで骨髄を処置するために有効に使用されてお
り、これは良好な結果を併っている。例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ−１は、ラットＩ
ｇＭ抗体であり、この融合に使用されてきた（Ｗａｌｄｍａｎｎら、Ｌａｎｃｅ
ｔ、２：４８３〜４８６、１９８４）。ＣＡＭＰＡＴＨ−１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞
、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で見出される共通の抗原（ＣＤ５２）を
標的とするため、汎免疫抑制剤である。対照的に、ＩｇＭ抗ＴＲ３抗体は、無傷
の免疫系の他の構成成分を残して、活性化されたＴ細胞のみを標的とする。免疫
抑制の短い期間の後（抗体の半減期に基く）、残っている成熟Ｔ細胞は、エフェ
クター細胞になり利用可能である。これは、被験体の日課的な免疫抑制薬物治療
から開放後に、免疫系が自身を再構成する長い期間の免疫抑制が続く従来の実践
とは対照的である。

【０１２５】 Ｊｏ２抗マウスＦａｓ抗体（Ｏｇａｓａｗａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、３６４：
８０６〜８０９（１９９３））は、「アメリカンハムスター」と名づけられたハ
ムスター系統から得られたＩｇＧ抗体であり、抗ヒトＦａｓ抗体（ＰｈａｒＭｉ
ｎｇｅｎ（Ｃｉｆｏｎｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：１５４７〜５２）
、１９９３）は、マウスＩｇＧ１である。これらの両抗体は、死シグナルを変換
することにおいて非常に有効である。それゆえ、ＴＲ３に対するＩｇＧ ＭｃＡ
ｂは、おそらく活性化Ｔ細胞を阻害し得る。

【０１２６】 抗体のＩｇＧサブクラスは、ＩｇＭより長い半減期（２３日間）を有する。従
って、ＴｇＧの使用は、より長期の免疫抑制を可能にする。ＩｇＧアイソタイプ
での処置がＩｇＭの使用に対して好ましい状況がある。ＩｇＧは、ＩｇＭよりも
良好に組織を浸透し、そしてより良好な組織浸透性は、皮膚、肺、肝臓および腸
が標的器官であるＧＶＨＤにおいて有用であり得る。ＩｇＭからＩｇＧへのスイ
ッチはまた、体細胞性変異（抗体の特異性を上昇させるＤＮＡ再編成プロセス）
、親和性成熟（抗原と高い親和性で結合する抗体を発現するＢ細胞の優先的な選
択のプロセス）に関する。高親和性抗体（例えば、ＩｇＧ）は、通常処置のため
により少ない用量を必要とし、より低い親和性抗体（例えば、ＩｇＭ）よりＦＡ
ＣＳｃａｎ分析における使用のための良好な染色剤であり得る。ＩｇＧ₂ｂ抗体
（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇ）は、これらがＦｃレセプターと結合し、抗体
依存性の細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を容易にするので、インビボで非常に
有効な免疫抑制剤である（しかし、最近の研究は、ＣＡＭＰＡＴＨもまた、依然
として未知の機構によりアポトーシスを誘導し得ることを示唆する）。インビボ
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇは、十分に耐性であり、そして強力な免疫抑制剤である。

【０１２７】 ＴＲ３（１−３２）ペプチドで免疫したＬｅｗｉｓラットがアイソタイプスイ
ッチを起こすか否かを決定するために、ＴＲ３（１−３２）ペプチド免疫動物由
来の血清を、この動物の初回免疫の１２週間後に蛍光ＥＬＩＳＡを使用してアイ
ソタイプ特異的抗体について試験した。代表的なアッセイ結果を図８に示す。連
続的に希釈した血清を、ＴＲ３（１−３２）ペプチドでコートしたプレートへ結
合させた。プレートを洗浄後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識化した、
ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇに対する抗体を添加した
。５０ミリ蛍光単位未満の免疫前血清値を各アイソタイプについて得た（示さな
い）。ＩｇＧ１（菱形）およびＩｇＧ２ａ（丸）抗体がバックグラウンドを超え
て明確に検出された。このことは、両Ｔ_H１型Ｔ細胞およびＴ_H２型Ｔ細胞が、ア
イソタイプスイッチ応答に関連することを示唆する。ＩｇＧ２ｂ（三角）はまた
、１：１０００希釈で少量存在し、このことは、ＴＲ３（１−３２）ペプチドで
の初回免疫によりアイソタイプスイッチがインビボで起こることを示唆する。こ
れらの結果は、ＭＨＣクラスＩＩ関連ペプチド認識から予測される高レベルのＴ
細胞補助と一致する。おそらく、アイソタイプスイッチは、ＴＲ３（１−３２）
ペプチド特異的ヘルパーＴ細胞が除去される前に起こる。あるいは、アイソタイ
プスイッチは、環境抗原に対して応答する内因性Ｔ細胞がＴＲ３を発現した後に
生じ得、そして抗ＴＲ３記憶Ｂ細胞刺激物として役に立ち得る。機構に関係なく
、これらの定性的データは、アイソタイプスイッチが生じず、そしてモノクロー
ナルＩｇＧ抗体およびこれらのアイソタイプのモノクローナル抗体（例えば、Ｉ
ｇＡ₁、ＩｇＡ₂、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、およびＩｇＧ₄ ）を産生し得ることを示す。これらのアイソタイプのＭｃＡｂは、ＴＲ３に対す
る体液性応答をより正確に定量化する標準として役立ち得る。

【０１２８】 （Ｃ．モノクローナル抗体を用いたＴ細胞の特異的染色） モノクローナル抗体であるＴＲ３μｋ−１は、３つの種（マウス、ラットおよ
びヒト）由来の３つの異なるＴ細胞株を特異的に染色した。精製したＴＲ３μｋ
−１ ＭｃＡｂは、直接染色試薬として使用するためにフルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）と結合体化された。以下に記載の染色アッセイについて
、Ｌｅｗｉｓラット抗マウスＩＬ−２Ｒ：ＦＩＴＣ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎクロ
ーン７Ｄ４）またはＦｉｓｃｈｅｒラット抗マウスＶβ１４：ＦＩＴＣ（Ｐｈａ
ｒＭｉｎｇｅｎ クローン １４−２）を、ラットＩｇＭアイソタイプコントロ
ール抗体として用いた。いくつかの実験において、抗ＴＲ３：ＦＩＴＣで染色さ
れた刺激されていないＴ細胞は、コントロールとして働き、本質的に同じ結果を
有した。

【０１２９】 最初のＴ細胞株は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）−１−形質転換Ｂ
細胞株（ＥＢＶ−１）での反復サイクルの刺激により、続いて１０％ＦＣＳ（ウ
シ胎仔血清）、３日目ヒトＭＬＲ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ，ＭＤ）上清由来の１０％上清、および２０ユニット／ｍｌのヒトＩＬ−２
を含有する増殖培地での増殖によって、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から産生され
たヒトアロ反応性Ｔ細胞株（Ａｌｌｏ−１）であった。Ａｌｌｏ−１細胞株は、
ＣＤ４およびＣＤ８アロ反応性Ｔ細胞の両方をほぼ同じパーセンテージで含み、
そして１００％の細胞がＣＤ１３４発現（ＣＤ１３４は、活性化Ｔ細胞で発現さ
れる細胞表面抗原である）で決定した場合、ＥＢＶ−１での刺激後に活性化され
た。Ａｌｌｏ−１細胞株は、使用前に補体を破壊するために熱不活化された、２
％のヒト血清を含有する、ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ），Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中でＥＢＶ
−１と１：１の比に慣用的に刺激された。

【０１３０】 第２のＴ細胞株は、マウスＰＬＰ（１３９〜１５１）−特異的Ｔ細胞株（Ｗｈ
ｉｔｈａｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４５：１０４〜１６，１９９６
）であった。この株は、主にＣＤ４⁺Ｔ細胞からなる。この株の刺激は、２μｇ
／ｍｌ ＰＬＰ（１３９−１５１）を含有する、ＲＰＭＩ（１％熱不活化正常マ
ウス血清を補充した）の存在下で、同系の胸腺細胞（ＰＬＰに対して曝露されて
いない遺伝子的に同一の胸腺細胞）と１０：１の数の比率で、この細胞を培養す
ることにより達成された。

【０１３１】 第３のＴ細胞株は、主にＣＤ４⁺であるＭＢＰ特異的ラットＴ細胞株であった
。この株の刺激は、２μｇ／ｍＬウシＭＢＰを含有するＲＰＭＩ（１％熱不活化
正常ラット血清を補充した）の存在下で、同系胸腺と１０：１の数の比率で、こ
の細胞を培養することにより達成された。

【０１３２】 ＴＲ３発現の動態を、マウスおよびラットＣＤ４⁺Ｔ細胞株を用いて分析した
。ラットウシＭＢＰ−特異的Ｔ細胞株を、５×１０⁶胸腺細胞プラス１μｇ／ｍ
ｌＭＢＰの存在下で、５×１０⁵細胞／ｍＬで培養した。マウスＰＬＰ特異的Ｔ
細胞株を同様に、ただし２μｇ／ｍＬ ＰＬＰ（１３９〜１５１）ペプチドを用
いて刺激した。この細胞を所定の時点で回収し、洗浄し、そしてＴＲ３を発現し
たＣＤ４⁺Ｔ細胞について染色した。これらの結果は、ラットおよびマウスの細
胞株について、それぞれ、図９（Ａ）および９（Ｂ）に示される。各細胞株を用
いて、刺激後２４時間、４８時間および７２時間で、Ｔ細胞のほぼ等価の染色が
観察された。これは、時間増加のＦＬ１軸上で右側への進行性集団変移として観
察された。

【０１３３】 ＴＲ３の発現レベルは、７２時間にわたって一定に維持された。これは、ＴＲ
３免疫ポリクローナル抗血清を用いるＴ細胞阻害データの観点から驚くべきこと
である。従って、ＴＲ３媒介阻害に対する感受性の低下は、ＴＲ３発現のレベル
の低下に起因せず、むしろ、ＴＲ３レセプターを通じた阻害性シグナルが、下流
の事象によって調節され得るようである。

【０１３４】 次の染色実験において、１０⁶のヒトＡｌｌｏ−１細胞を単独か、または同数
のＥＢＶ−１刺激細胞とともにのいずれかで培養した。この細胞を回収し、そし
て染色して、ＴＲ３を発現するＣＤ４⁺細胞またはＣＤ８⁺細胞を明らかにした。
刺激していないＡｌｌｏ−１細胞は、ネガティブコントロールとして働いた（図
１０（Ａ）および１０（Ｂ））。刺激後１２時間で得たデータ（「活性化（Ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ）」）を、ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞について、それぞれ図１
０（Ａ）および１０（Ｂ）に示す。マウスおよびラットのＴ細胞の両方について
観察されたように、アロ反応性のヒトＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の１００％が
、７２時間後に、この細胞による表面ＴＲ３発現を示した抗体で染色された。２
４時間および４８時間、細胞を培養した後、同様の結果が得られた。コントロー
ル細胞は、ＴＲ３について陽性に染色しなかった。これは、再度、活性化がＴＲ
３アップレギュレーション（上方制御）に必要であることを実証する。

【０１３５】 ラットＣＤ８＋Ｔ細胞の染色は、４８時間、抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）およ
び抗ＣＤ２８（１０μｇ／ｍＬ）で刺激した（「活性化」）ラットリンパ節Ｔ細
胞の培養において表された。これらの結果は、ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞につ
いて、それぞれ図１１（Ａ）および１１（Ｂ）に示される。ヒトＡｌｌｏ−１株
で観察されるように、Ｔ細胞のほとんどが抗ＴＲ３試薬で染色されるが、ただし
刺激後のみである。抗ＣＤ３抗体刺激も抗ＣＤ２８抗体刺激も単独では、これら
の細胞においてＴＲ３発現を誘導し得なかった。

【０１３６】 全体として、これらのデータは、ＴＲ３が、少なくとも７２時間、ヒト、ラッ
トおよびマウス由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞上での染色により検出可能であることを示
す。さらに、ヒトおよびラットのＣＤ８⁺Ｔ細胞はまた、７２時間および４８時
間の時点で、それぞれ、ＴＲ３発現について陽性である（マウスは試験していな
いが、上記図６を参照のこと）。従って、インビボの条件では、ＴＲ３特異的結
合剤は、細胞が刺激された後少なくとも７２時間、標的Ｔ細胞に結合し得る。さ
らに、ＴＲ３特異的結合剤が、補体（すなわち、ＩｇＭまたはＩｇＧ）を結合し
得る場合、これは、標的Ｔ細胞に結合し、そして補体カスケードを開始し得る。
補体カスケードが開始した後、標的Ｔ細胞は溶解されそして殺傷される可能性が
最も高い。

【０１３７】 養子移入されたＥＡＥを与えられたマウスおよびラットの脳由来の、または活
性に誘導したＥＡＥを有するマウスおよびラットの脳由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞の染
色を、図１２（Ａ）〜１２（Ｄ）に示す。マウスおよびラットは、活性なＥＡＥ
（プロットＡおよびＣ）を誘導するように免疫されるか、または養子性疾患の誘
導について５×１０⁶（プロットＢ）もしくは２×１０⁶（プロットＤ）の脳炎誘
発性のＴ細胞を与えられるかのいずれかである。このデータは、各事例での疾患
の発現の１日目からのものである。白抜きの棒グラフは、細胞のアイソタイプコ
ントロール（ラット抗マウスＶβ１４）染色を示す。マウス細胞の染色について
、コントロール抗体は、このマウスＶβ遺伝子の用法と一致して、Ｔ細胞の２〜
３％を強力に染色した；これらのデータは、選択的に除かれ、従って棒グラフに
は示されていない。ラットおよびマウスの両方の細胞は、ＴＲ３発現の染色特徴
を示す。ＣＤ１３４で同時染色されたＴ細胞はまた活性化細胞の指標である。こ
れらのデータは、ＥＡＥを有するげっ歯類の脳由来のＴ細胞のほとんどでのＣＤ
１３４の発現を示す上記のデータと一致する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１６２：１８１８〜１８２６，１９９９）。

【０１３８】 （Ｄ．ＧＶＨＤモデルにおける活性化Ｔ細胞の検出） 本発明者らは、ＴＲ３を発現するＴ細胞が、同種異系の（非自己ドナー由来の
）骨髄移植物を受容した後に、動物の末梢循環において検出され得るか否かを決
定した。これらの結果は、ＣＤ１３４ Ｔ細胞活性化マーカーについて実証され
たように、ＴＲ３が、疾患発現の前に検出可能であることを示唆する。これらの
データは、ＧＶＨＤモデルにおける抗ＴＲ３処理の開始に関連する時点を正確に
示すために有用である。

【０１３９】 これらの実験において、２０×１０⁶骨髄および５０×１０⁶リンパ節細胞を、
Ｂｕｆｆａｌｏラットから各々４つ（Ｌｅｗｉｓ×Ｂｕｆｆａｌｏ）Ｆ１レシピ
エント（致死量以下に照射（６００Ｒ）された）に移植した。末梢血リンパ球を
、移植後７日、１０日および１４日目に回収し、ＴＲ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞について
染色した。正常Ｆ１動物由来の末梢血リンパ球は、コントロールとして役立った
。

【０１４０】 コントロールラットからおよび１匹の移植されたラットから、ＧＶＨＤの兆候
の７日前に得た、二重に陽性のＴ細胞（ＴＲ３およびＣＤ４の両方について陽性
に染色された）のパーセンテージを図１３（Ａ）および１３（Ｂ）にそれぞれ示
す。この記載（サイトグラムと呼ぶ）において、各点（ドット）が、単一の細胞
を示す。縦軸は、ＣＤ４：ＰＥで染色した細胞の蛍光強度を意味し、この染色は
、ＣＤ４⁺を発現する全ての細胞を同定するはずである。横軸は、ＴＲ３μｋ−
１で染色した細胞の蛍光強度を意味し、この染色は、ＴＲ３を発現する細胞を同
定する。正常なコントロールラットにおいて、＜３％のＣＤ４⁺Ｔ細胞がＴＲ３
を発現した。これは、本質的にバックグラウンドであり、そしてＣＤ１３４（活
性化Ｔ細胞のマーカー）が、正常な動物の末梢Ｔ細胞でまれに見出されるという
観察と一致している。対照的に、７日前に同種異系の骨髄移植物を与えられたラ
ットは、１２％ ＴＲ３⁺細胞を有し、これはバックグラウンドを４〜５倍上回
る。図１３（Ｃ）は、移植後７日、１０日および１４日目で、３つの正常コント
ロールラット、ならびに４匹の移植されたラット全ての類似のサイトグラムから
得たデータからの平均および標準偏差（バー）を示す。正常なコントロールラッ
ト（ｎ＝３）は、２．４±０．５二重陽性Ｔ細胞の平均バックグラウンドレベル
を示した。これは、ＣＤ１３４活性化マーカーを発現する循環中のＴ細胞の低い
パーセンテージと一致している。同種異系骨髄移植を有するラットは、７日目程
度の速さで、二重陽性細胞のパーセンテージの増大（１６．６±４．５）を示し
た。このパーセンテージは、１０日目に２７．１±６．０まで増大し；１４日目
にこのパーセンテージは、４４．０±５．３に上昇した。このＴＲ３⁺Ｔ細胞の
迅速な増殖は、ＣＤ１３４について報告されたのと同様である。

【０１４１】 前述の実験はまた、ＴＲ３⁺Ｔ細胞がこのドナーから誘導されないことを示す
ために用いられ得る。ＧＶＨＤモデルの以前の使用は、移植後に回収されたＣＤ
１３４⁺Ｔ細胞がアロ反応性であることを示していた（Ｔｉｔｔｌｅら、Ｂｌｏ
ｏｄ ８９：４６５２〜８、１９９７）。従って、上記の実験由来のＴＲ３＋細
胞の集団がまた、ＣＤ１３４を発現する場合、ＴＲ３＋細胞がドナー起源である
ことが結論付けられ得る。これらのデータは、ＧＶＨＤが、インビボでＴＲ３効
果の分析に適切なモデルであることを実証する。さらに、残りのＴ細胞の＞９０
％を未接触のままにするのに十分速く、ＴＲ３⁺Ｔ細胞を排除することが可能で
あるようである。

【０１４２】 （Ｅ．ＴＲ３特異的モノクローナル抗体を用いるインビトロにおけるＴ細胞増
殖の阻害） ＴＲ３μｋ−１による活性化Ｔ細胞特異的殺傷のインビトロ分析を、２０，０
００ Ｔ細胞／ウェルのヒトＡｌｌｏ−１細胞、または２０，０００ Ｔ細胞／
ウェルのマウスＰＬＰ（１３９〜１５１）ペプチド特異的Ｔ細胞を用いて、実施
した。１条件あたり、６つの複製ウェルを調製した。ＴＲ３μｋ−１の異なる用
量を各ウェルに最初に添加した。２日後、各ウェルに１μＣｉの³Ｈチミジンを
供給し、そしてさらに１８〜２４時間培養した。次いでこの培養物を回収し、そ
して³Ｈチミジンの取り込みをシンチレーションカウントによって決定した。代
表的な実験の結果を、ＴＲ３μｋ−１抗体の濃度の関数である１分あたりの平均
カウント（ＣＰＭ）として、図１４に示す。未処理培養物は、２９，０００ Ｃ
ＰＭ（マウス）および３８，０００ＣＰＭ（ヒト）を表した。ＴＲ３μｋ−１の
添加は、用量依存性の様式（各種について＜２．０μｇ／ｍＬの５０％阻害（Ｉ ₅₀ ）値を有する）で増殖を阻害した。増殖反応の完全な阻害は５．０μｇ／ｍＬ
で達成された。（観察された阻害は、トリパンブルー染色によって決定した場合
、Ｔ細胞の殺傷に起因していた。殺傷は、アポトーシスから生じた可能性がある
）。いずれにせよ、これらのデータは、ＴＲ３μｋ−１が活性化されたマウスお
よびヒトのＴ細胞を認識し、そして阻害シグナルを変換したことを実証した。類
似の阻害がまた、ラットＴ細胞を用いて抗原特異的Ｔ細胞応答において観察され
た。

【０１４３】 ＴＲ３μｋ−１に対するラットＭＢＰ特異的Ｔ細胞株の一時的感受性を、上記
のように評価した。ＭＢＰ特異的Ｔ細胞（２０，０００細胞／ウェル）を、１μ
ｇ ＭＢＰ／ｍＬおよび１０倍過剰の照射された同系の胸腺細胞（ＡＰＣとして
）を用いて再刺激した。ＴＲ３μｋ−１の異なる用量を培養の最初に、１日目ま
たは２日目に添加した。³Ｈチミジン添加は、７２時間で添加し、そしてこの細
胞をさらに１８〜２４時間培養した。結果を図１５に示す。免疫血清を用いて実
証されるように、抗ＴＲ３が培養の最初に添加された場合（四角）、最大の細胞
殺傷が観察された。抗ＴＲ３抗体の添加の前に２４時間遅れで、より少ない細胞
殺傷が観察された（ひし形）。抗体の添加前、４８時間刺激した細胞を殺傷する
のはなおさらに難しかった（丸）。これらの３つの処理についてのＩ₅₀（５０％
阻害）は、それぞれ、およそ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、および２０μｇ
／ｍＬであった。これらのデータは、ポリクローナル抗血清（図５）を用いた実
験から得たデータと一致する。このデータは、抗原刺激後（刺激後２４時間、４
８時間、７２時間）に添加された抗血清は、抗原と同時に添加した抗血清よりも
Ｔ細胞増殖の阻害において効果が乏しかったことを示した。しかし、本結果は、
本結果が、この細胞は、殺傷に対して抵抗性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）になるが
、精製したＴＲ３μｋ−１の十分な量が添加される限り、感受性のままであるこ
とを実証するという点で、ポリクローナル抗血清とは異なる。

【０１４４】 ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）での再刺激の効果を、また１セットのＴ
細胞培養物上で試験した。このセットの培養は、インビボの状況を模倣するよう
に働いた。この状況では抗原刺激は、ＧＶＨＤまたは自己免疫疾患で生じ得るよ
うに、慢性である。図１５（三角）に示すように、ＭＢＰ再刺激は、ＴＲ３抗体
の効果に対して細胞を明らかに感作し、これにより殺傷曲線は左に偏向し、この
ことはより大きい感受性を示す。ＭＢＰ（黒三角）で再刺激した培養物のＩ₅₀値
は、約７．５μｇ／ｍＬであった。

【０１４５】 これらのデータは、観察される細胞殺傷が細胞に対する非特異的毒性効果に起
因しないことを実証する。むしろ、この効果は生物学的であり、そして活性化さ
れたＴ細胞上のＴＲ３レセプターを通じて媒介される。このデータはまた、十分
な抗体が送達された場合、細胞が感受性のままであるが、この細胞は不応性（ｒ
ｅｆｒａｃｔｏｒｙ）になることを示す。予想されなかったことに、この抵抗性
の期間は、Ｔ細胞の表面上のＴＲ３発現の損失に起因しない。これは、重要であ
るかもしれない。なぜなら、このインビトロの状況と異なり、細胞はまた、イン
ビボでの補体の存在下での抗体による殺傷に感受性であり得るからである。不応
性期間（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｅｒｉｏｄ）の理由は不明だが、これは、最
近発見された死ドメイン（ＳＯＤＤ）のサイレンサー（ＴＲ３細胞内ドメインに
関連することが示されている）から生じ得る（Ｊｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５３：５４３〜５４６，１９９９）。

【０１４６】 このデータはまた、慢性の刺激の場合、活性化Ｔ細胞は、非補体結合抗体が用
いられる場合でさえ、ＴＲ３媒介殺傷に感受性のままであることを示唆する。従
って、処置は、予防にのみ限定されないようである。

【０１４７】 全体として、この節で示されるデータは、ＴＲ３μｋ−１抗体が、補体の非存
在下で、活性化したヒト、マウスおよびラットのＴ細胞を認識し、そして殺傷す
る（３つの種全てについてほぼ同じＩ₅₀値で）ことを実証する。

【０１４８】 （Ｖ．ＴＲ３ ＭｃＡｂは、ＥＡＥモデルにおいて、臨床的症状および準臨床
的症状を減弱する） モノクローナル抗体である抗ＴＲ３抗体がＴ細胞媒介疾患を変更する能力を、
養子移入ＥＡＥモデル系で試験した。モルモットＭＢＰに特異的なＬｅｗｉｓラ
ットＴ細胞株を、ＭＢＰおよび抗原提示細胞の供給源として照射した胸腺細胞を
用いてインビトロで刺激した（１０：１の比のＡＰＣ：Ｔ）。７２時間後、この
細胞を洗浄し、そして４匹のＬｅｗｉｓラットに、１×１０⁶のＭＢＰ特異的な
同系Ｔ細胞（コントロール）、または１×１０⁶のＭＢＰ特異的な同系Ｔ細胞お
よび３００μｇ ＴＲ３μｋ−１抗体のいずれかを注射した。この用量は、１５
０ｇの平均体重に基づいてインビトロで観察された３μｇ／ｍＬのおおよそのＩ ₅₀ 値（２ｍｇ／ｋｇ）である。

【０１４９】 注射後、この動物を準臨床的（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ）体重減少について評
価し、そして毎日、麻痺の臨床兆候についてスコア付けした。準臨床的疾患に対
する抗ＴＲ３抗体の効果を図１６（Ａ）に示す。ここのデータは、Ｔ細胞の移入
後の日数に対する体重の低下のパーセントとして示している。抗ＴＲ３μｋ−１
を投与されなかった２匹の動物は、それぞれ４日目および５日目に有意な体重減
少の開始を示した（丸）。それらは、それぞれ実験終了の９日目までに、総体重
の１７％および２０％を失った。対照的に、ＴＲ３μｋ−１抗体を投与された２
匹の動物のうち１匹（四角）は、９日目までにその体重の４％を緩徐に減少した
が、他の動物ではこの時期の間に体重の減少はなかった。

【０１５０】 臨床上の疾患に対するＴＲ３μｋ−１の効果を図１６（Ｂ）に示す。ＴＲ３μ
ｋ−１を投与されなかった動物の両方は、６日目に明らかに罹患し（四角）、７
日目には悪化し、そして８日目に回復した。ＴＲ３μｋ−１を投与された動物（
丸）のいずれも、臨床的には疾患の兆候をなんら示さず、これは準臨床的体重減
少のないことと、一致していた。抗ＴＲ３処理の単一用量を用いる、臨床的およ
び準臨床的ＥＡＥの両方に影響する能力により、ＴＲ３抗体が有用な処置様式で
あり得ることが示される。

【０１５１】 （ＶＩ．ＴＲ３特異的結合剤は、インビボＧＶＨＤモデルにおいて、自然回復
を生じる） 上記（図１３）の、先行試験は、ＴＲ３が急性のＧＶＨＤの間に発現されたこ
とを示した。このような試験はまた、ＧＶＨＤが生物学的に活性なＴＲ３特異的
結合剤（例えば、上記のＭｃＡｂ）で処置され得ることを示した。この仮説を試
験するため、４匹の（Ｌｅｗｉｓ×Ｂｕｆｆａｌｏ）Ｆ１ラットのレシピエント
を致死量以下に照射して、他の組織は保持しながら、リンパ系細胞を排除した。
レシピエントのリンパ系細胞をこのように排除すると同時に、ドナーラット由来
の２０×１０⁶のＢｕｆｆａｌｏ骨髄細胞および５０×１０⁶のＢｕｆｆａｌｏリ
ンパ節細胞を、各レシピエントに移植してＧＶＨＤを誘導した。

【０１５２】 ２匹の動物の各々はまた、活性化Ｔ細胞が末梢循環中で見出された（ＣＤ１３
４⁺Ｔ細胞およびＴＲ３陽性Ｔ細胞の存在により決定される）後、移植後７日目
、１０日目、および１２日目にＴＲ３μｋ−１の３回の注射をうけた。体重１Ｋ
ｇあたり総量４ｍｇのＴＲ３μｋ−１を、各ラットに注射した。体重減少、体毛
減少および他の皮膚兆候によって決定されるように、４匹の動物全てがＧＶＨＤ
の兆候を示した。両方のコントロール動物（ＴＲ３μｋ−１抗体を投与されてい
ない動物）は、移植後、重篤な急性ＧＶＨＤを発症し、そして４週間で安楽死さ
せられた。ＴＲ３μｋ−１で処理した２匹の動物は、体重の増加および皮膚異常
の改善によって示されるように、約２０日で自然な回復を開始した。ＴＲ３μｋ
−１処置動物は、移植後１６週間で成長を続けた。それ故、ＴＲ３μｋ−１での
ラットの処置は、急性のＧＶＨＤ死亡率に顕著に有益な効果を有する。

【０１５３】 移植後１０週間で、２匹の明らかに健常な動物（ＴＲ３μｋ−１を投与された
）由来の血液の表現型を、試験して、活性化Ｔ細胞が循環しているか否か、およ
び循環しているＴ細胞がドナーに由来するかまたはレシピエントに由来するかを
確認した。この分析を、活性化Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ１３４、およびＴＲ
３μｋ−１を用いて循環Ｔ細胞を二重染色することによって、続いてＦＡＣＳｃ
ａｎによって行った。活性化マーカーＣＤ１３４を発現するＴ細胞もＴＲ３も検
出できなかった。これは、正常とみなされる（図１５ｃ、コントロールを参照の
こと）。この動物を、ＲＴ７．１（レシピエントＴ細胞上で発現されるが、Ｂｕ
ｆｆａｌｏドナーＴ細胞では発現されない、白血球共通抗原の多様型アロタイプ
マーカー）について陽性に染色するＴ細胞の存在または非存在を決定することに
より、キメリズム（ドナーおよび／またはレシピエントのＴ細胞の存在）につい
て評価した。

【０１５４】 実験結果を図１７に示す。ＢＭＴを投与されていないコントロール動物Ｆ１を
、点線で示す；この動物は、レシピエントのＬｅｗｉｓ親由来の細胞について予
想される曲線を生じた。すなわち、この細胞は陽性である。Ｂｕｆｆａｌｏラッ
ト由来細胞は、陰性であり、そしてドナー細胞がレシピエントを再構成した場合
、Ｆ１細胞の左側になるはずである。２匹の試験動物からの結果を、それぞれ、
実線および破線で示す。この結果は、これらの２匹のＴＲ３μｋ−１処理動物の
免疫系が、ＲＴ７．１マーカーを欠くＴ細胞で再構成された（すなわち、これら
の動物におけるＴ細胞はドナー由来であった）ことを示す。従って、抗ＴＲ３抗
体での同種異系のＢＭＴレシピエントの処置は、動物に、ドナー由来の正常な静
止期Ｔ細胞を生じ、このＴ細胞は、いかなるＧＶＨＤ症状をも排除する。

【０１５５】 （ＶＩＩ．生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤は、ＴＲ３を発現するヒト腫
瘍を殺傷する） ５つのＴ細胞腫瘍（３つはマウスＴリンパ腫：ＥＭＧ２、ＥＦＫ１、およびＳ
ＬＩ、そして２つはヒトＴリンパ腫：ＨｕＴ７８およびＪｕｒｋａｔ）を、ＴＲ
３ ＴＲ３μｋ−１：ＦＩＴＣで染色した。試験した５つの腫瘍株のうち４つが
ＴＲ３を発現した（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株はＴＲ３発現については陰性であっ
た）。染色から得た結果の例を図１８（Ａ）に提供する。ＥＦＫ１は、アイソタ
イプコントロール（ラットＩｇＭ：抗マウス−Ｖβ１４）（白棒グラフ）に対し
て、ＴＲ３発現について陽性に染色した（黒棒グラフ）。

【０１５６】 次いで、４つの細胞株を、抗ＴＲ３媒介殺傷についての感受性について試験し
た。ＴＲ３陽性腫瘍の全てが、図１８（Ｂ）に示されるマウスＥＦＫ１ Ｔ−細
胞腫瘍についての代表的用量依存性阻害によって実証されるように、ＴＲ３誘導
細胞死について感受性であった。これらのデータは、ＴＲ３を発現するヒトＴ細
胞癌が、生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤の注射によって処置可能であるこ
とを示唆する。

【０１５７】 （ＶＩＩＩ．抗ＴＲ３抗体は、アポトーシスの誘導によってＴ細胞増殖を阻害
する） ラットリンパ節細胞（１×１０⁶／ｍｌ）をＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ）の存在
下または非存在下で培養して、活性化を誘導した。１セットの活性化細胞をまた
、抗ＴＲ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）で処理した。２４時間後、細胞を回収して、
臭化エチジウムの存在下でのアガロースゲルでの分析用にＤＮＡを抽出した。同
じ量のＤＮＡを各レーンに添加した。ＣｏｎＡの非存在下で培養した細胞由来の
ＤＮＡ、またはＣｏｎＡの存在下で、ただし抗ＴＲ３抗体はなしで培養した細胞
由来のＤＮＡは、高分子量の均一なＤＮＡサイズを示す。対照的に、抗ＴＲ３抗
体の存在下で増殖したＣｏｎＡ活性化細胞由来のＤＮＡは、ＤＮＡラダーリング
効果（典型的なアポトーシス）を示す。これらの結果は、抗ＴＲ３抗体が、アポ
トーシス機構によって、活性化Ｔ細胞を殺傷することを初めて実証するものであ
る。

【０１５８】 （ＩＸ．材料および方法） （ペプチド合成）ＴＲ３（１−１３）、ＴＲ３（１４−３２）、およびＴＲ（
１−３２）のペプチド、ＰＬＰ（１３９−１５１）ペプチド、およびＧＰＢＰ（
７０−８８）ペプチドを、製造業者の指示に従って、４３２Ａモデルのペプチド
シンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で、標準的Ｆ−ｍｏｃ化学（Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１８１８〜１８２６，１９９９）
を用いて、合成した。ペプチド抽出後、このペプチドを凍結乾燥し、−２０℃に
保管した。ペプチドの純度を、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で評価した。

【０１５９】 （蛍光ＥＬＩＳＡ）。ＥＬＩＳＡのプロトコールは、基質（メチルウンベリフ
ェリルリン酸（ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
、ＭＵＰ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が、ＮＰＰ
（ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ））と同様に、比色定量的でなく、蛍光定量的に読み取られることを除いて、
以前に（題名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３４３〜３５０，
１９８９）に記載されている。Ｉｍｍｕｌｏｎ４^TMプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ
Ｌａｂｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を、１ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水
（ＰＢＳ）あたり１〜２μｇの指定されたＴＲ３ペプチドでコート（被覆）した
。このプレートを水で洗浄し、次に、非特異的結合を防止するため、２００μＬ
の１％ゼラチン含有ＰＢＳ（１ｍＭアジ化ナトリウム含有）、および１ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＰＢＳＡＥ）でブロックした。次いでこのプレートをＰＢ
ＳＡＥで３回洗浄し、そして５０μＬ容量の血清またはハイブリドーマ培養上清
のアッセイに用いた。２時間のインキュベーション後、このプレートを再度ＰＢ
ＳＡＥ（抗ラットＩｇおよびアルカリホスファターゼの適切な結合体を、１：１
０，０００希釈で含有する）で洗浄した。抗ラットＩｇを含有するウェルを、０
．２ｍＭ濃度のＭＵＰを含有する炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて検出した
。１時間後、このプレートをＣｙｔｏｆｌｕｏｒ ＩＩ装置（ＰｅｒＳｅｐｔｉ
ｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を用いて読み取っ
た。

【０１６０】 （Ｔ細胞増殖の阻害） これらのアッセイのために使用したラットＴ細胞は、
Ｌｅｗｉｓ ＭＢＰ特異的Ｔ細胞株、Ｂｕｆｆａｌｏアロ反応性（ａｌｌｏｒｅ
ａｃｔｉｖｅ）Ｔ細胞株、ヒトアロ−１（ａｌｌｏ−１）Ｔ細胞株、マウスＰＬ
Ｐ（１３９−１５１）ペプチド特異的Ｔ細胞、または正常なリンパ節細胞であっ
た。２０，０００のＴ細胞を９６ウェルプレートのウェルに添加し、そしてこれ
らの細胞株を、抗原、ならびに照射した（６０００Ｒａｄ）刺激細胞、アロ刺激
剤、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ８で刺激した。４８時間後、³Ｈ−チミジンを
添加し、そしてこれらのプレートをさらに１８〜２４時間インキュベートした。
次いで、これらのプレートを採取し、そして１２０５Ｂｅｔａプレートカウンタ
ー（Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、³Ｈ−チミ
ジン取り込みについて評価した。ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を、正常なド
ナーから静脈穿刺によって、またはアメリカ赤十字から得、そしてフィコール上
で処理した。ＰＢＬ細胞を、１つのウェルあたり５０，０００〜１００，０００
の細胞で、９６ウェルプレート中で培養し、１〜５μｇ／ｍＬの植物性赤血球凝
集素でインビトロで刺激し、そして抗ＴＲ３ ＭｃＡｂによる³Ｈ−チミジン取
り込みの阻害について、上記のように評価した。

【０１６１】 （Ｔ細胞リンパ腫、またはＴ細胞白血病の増殖阻害） ヒトＴ細胞腫瘍株（Ｈ
ｕＴ７８およびＪｕｒｋａｔ）ならびにマウスＴ細胞腫瘍株（ＥＦＫ１、ＥＭＧ
２、およびＳＬ１）を、ＴＲ３レセプターを介する殺傷に対する感受性について
、スクリーニングした。腫瘍細胞（２，０００〜４，０００細胞／ウェル）を、
９６ウェルプレートのウェルに、ＴＲ３μｋ−１ ＭｃＡｂの段階希釈物の存在
下で添加した。２４時間後、³Ｈ−チミジンを添加し、そしてこれらのプレート
をさらに１８〜２４時間インキュベートした。次いで、これらのプレートを採取
し、そして³Ｈ−チミジン取り込みについて評価した。

【０１６２】 （ＦＡＣＳｃａｎ分析） ＴＲ３（１−３２）ペプチドに対するＭｃＡｂを、
ラット、マウス、またはヒト供給源由来の活性化Ｔ細胞を染色する能力について
評価した。Ｔ細胞を、増殖実験のために、上記のように活性化した。いくつかの
実験に対しては、げっ歯類リンパ節細胞を、５μｇのＣｏｎＡで刺激して、２４
〜４８時間後に活性化Ｔ細胞を得た。ＦＡＣＳｃａｎ分析を、以前に記載された
ように実施した（Ｔｉｔｔｌｅら、Ｂｌｏｏｄ ８９：４６５２−４６５８、１
９９７）。結合体化していないＭｃＡｂを、ヤギ抗ラットＩｇ ＦＩＴＣ（ＫＰ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、ラットリンパ球の細胞表面
において検出した。他の全ての抗体を、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）から購入した。簡単に言えば、１×１０⁶の細胞を、１００μＬの総
容量での最適な量（予め滴定した）の抗体（通常０．１〜１μｇ）で３０分間染
色した。次いで、これらの細胞を培地中で３回洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎで
の分析のために、３００〜４００μＬの培地中に希釈した。大部分の実験に関し
て、活性化Ｔ細胞を含むように、選択を、高い前方向散乱の領域を含むリンパ球
領域にわたって設定した。

【０１６３】 （細胞融合物） 融合プロトコルは、以前に記載された（Ｔｉｔｔｌｅ，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３４３−３５０，１９８９）、Ｆａｚ
ｅｋａ ｄｅ Ｓｔ．ＧｒｏｔｈおよびＳｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１、１９８０）のプロトコ
ルに基づいた。第一のプロトコルにおいて、ＴＲ３で免疫した、高力価の抗ＴＲ
３抗体を有する動物由来の脾臓およびリンパ節を、一次応答の１０日目、１４日
目、および１７日目に除去した。単一細胞の懸濁液を作製し、そしてこれらの細
胞を直接、急速に増殖する骨髄腫細胞と融合させた。第二のプロトコルにおいて
、免疫動物の脾臓およびリンパ節を、ＴＲ３（１−１３）ペプチド特異的Ｔ細胞
株とともにインビトロで培養し、そして５μｇ／ｍＬのＴＲ３（１−３２）ペプ
チドで２日間刺激し、その後、Ｔ細胞を骨髄腫細胞と融合させた。全ての融合物
を、１０個の９６ウェルプレートに、ＨＡＴ培地中でプレートした。４日目の後
に、これらのウェルに３日ごとに新鮮なＨＡＴ培地を供給した。２回の供給の後
に、上清を維持し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＴＲ３反応性について分析し
た。ポジティブなウェルを同定した。次いで、ハイブリドーマを、以前に記載さ
れたように（Ｔｉｔｔｌｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３４
３−３５０，１９８９）、懸滴培養によって２回クローニングした。

【０１６４】 （抗体精製） ＩｇＭ抗体を、無血清培地（ＳＦＭ）から、Ａｍｉｃｏｎ濃縮
器および３００ｋＤ排除限界セルロースフィルターを使用する濃縮によって、精
製した。保持された抗体を、リン酸生理食塩水に対して透析し、０．２ミクロン
のフィルターを使用して滅菌し、そして４℃で貯蔵した。ＴＲ３ μｋ−１抗体
は、約５μｇ／ｍＬのＳＦＭで産生される。ＩｇＧ抗体は、プロテインＧ（Ｈｙ
Ｔｒａｐ，Ｔｈａｒｍａｃｉａ）がより急速でない限り、類似のプロトコルを使
用して精製され得る。抗体（１ｍｇ）を、標準的な方法によって、２％重炭酸塩
中のフルオレセインイソチオシアネート異性体ＩＩを使用して、フルオレセイン
でタグ化した。室温（ＲＴ）で一晩暗所でインキュベートした後に、次いで、結
合体化していないＦＩＴＣを透析によって除去した。

【０１６５】 （Ｔ細胞株） ＭＢＰまたはＴＲ３に対して特異的なＴ細胞を、１０日目に、
ＣＦＡにおける対応する抗原で免疫したラットの排液リンパ節から得た。これら
のリンパ節細胞を、インビトロで１：５の比での抗原および刺激細胞とともに培
養し、そして３日間培養した。次いで、これらの細胞を採取し、そして１０％
ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）および１０％ ＣｏｎＡ上清を含む培地中で再培養した
。４日後、これらの細胞の凍結または再刺激のいずれかを行った。マウスＰＬＰ
（１３９−１５１）ペプチド特異的Ｔ細胞を、類似の様式で得た。ヒト細胞株を
、１：１の比で、ＥＢＶで形質転換したＢ細胞刺激物質株のパネルに対して生成
した。３日後、Ｔ細胞を洗浄し、そしてヒトＭＬＲの４８時間の培養から誘導し
た、２０単位のＩＬ−２および１０％の上清を含む培地中で、再培養した。

【０１６６】 （ＥＡＥの養子移入） モルモットミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプ
チド（アミノ酸７２〜８４）に特異的であり、かつＥＡＥを移入し得るＬｅｗｉ
ｓラットＴ細胞株を、樹立し、そして将来の使用のために液体窒素中で凍結させ
た。ＥＡＥを移入するために、Ｔ細胞を解凍し、洗浄し、そして１：５の比で、
照射した正常な同種の胸腺細胞（抗原提示細胞の供給源として）と混合した。次
いで、これらの細胞を刺激培地（ＲＰＭＩ １６４０、２％正常ラット血清、２
ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５×１０^-5Ｍ ２−メル
カプトエタノール）に入れ、そして１μｇ／ｍＬのＭＢＰ（７２−８４）で刺激
した。７２時間後、これらの細胞を洗浄し、計数し、そして正常なＬｅｗｉｓレ
シピエントに注射した。Ｌｅｗｉｓラットに１〜５×１０⁶のＭＢＰ特異的Ｔ細
胞芽を注射した。次いで、これらの動物を、移入後の毎日、ＥＡＥについてモニ
タリングし、そしてこれらのラットに対する臨床スコアを、以下のように割り当
てた：１、跛行尾（ｌｉｍｐ ｔａｉｌ）；２、運動失調；３、片側麻痺；４、
四肢麻痺／瀕死。各実験において、臨床的ＥＡＥスコアを、群における個体のス
コアの平均として報告した。

【０１６７】 （ＥＡＥの誘導） 活性ＥＡＥを、Ｌｅｗｉｓラットにおいて、１００μｇの
モルモットＭＢＰペプチド（アミノ酸７２−８４）（ＣＦＡ中に乳化し、各前肢
パッドに等しく分割した）の注射によって誘導する。疾患の最初の臨床的兆候は
、代表的に、注射の１０〜１２日後に起こり、その後、これらの動物は完全に回
復する。活性な再発性ＥＡＥを誘導するために、雌性ＳＪＬ／Ｊマウス（Ｊａｃ
ｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、フラ
スコ内で４つの部位で合計０．２ｍＬの生理食塩水のエマルジョン（１５０μｇ
のＰＬＰ（１３９−１５１）を含む）および等量のＣＦＡ（２００μｇのＭ．ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲＡを含む）を、皮下接種した。マウスは、神
経学的欠損の発生に関して、治験担当医（処置に関してブラインド）によって毎
日試験された。後肢の弱さおよび前肢の弱さの程度を、記載されたように評価す
る（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｂｙ １６２：１８１８−１８
２６、１９９９）。

【０１６８】 （Ｘ．ＧＶＨＤ） ＧＶＨＤを、Ｂｕｆｆａｌｏドナーラット由来の２０×１０⁶の骨髄細胞およ
び５０×１０⁶のリンパ節細胞のラットへの注射によって、致死量以下の照射（
６００Ｒａｄ）の後に、（Ｌｅｗｉｓ×Ｂｕｆｆａｌｏ）Ｆ１ラットにおいて誘
導した。動物を、移植（１００μｇ／静脈内注射）の後７日目、１０日目および
１２日目に、抗ＴＲ３抗体で処置した。全ての動物が、体重の損失、毛の損失お
よび他の皮膚症状発症によって決定した場合に、ＧＶＨＤの兆候を示す。このよ
うな移植を与えられた全ての未処置ラットは、移植の４週間以内に、急性ＧＶＨ
Ｄによって死ぬ。

【０１６９】 （ＸＩ．ＴＲ３特異的結合剤の生成および使用） ＴＲ３に対する抗体は、活性化Ｔ細胞の所望でない増殖に関連する疾患の処置
において、重要な役割を果たし得る。このようなものの例としては、多発性硬化
症、糖尿病、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、心筋炎、ギヤン−バレー症候群
、全身性エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎、乾癬、シェーグレン症
候群、円形脱毛症、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、円錐核膜炎、
潰瘍性大腸炎、アレルギー、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬
疹、らい病逆行反応（ｌｅｐｒｏｓｙ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性
出血性脳障害、特発性両側性進行性感音聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう
、特発性血小板減少、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、ス
ティーヴンズ−ジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症
、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎後、および間隙性肺線維
症が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＲ３を標的するために開発された
抗体は、インビボでレセプターに結合し得、そしてＴ細胞増殖を阻害し得る。Ｔ
Ｒ３に対する抗体はまた、レセプター発現を定量するため、およびＴ細胞応答の
相対強度の決定を補助するために、使用され得る。このスクリーニングは、投薬
量および治療方法を決定する際に、有用であり得る。

【０１７０】 （Ａ．ＴＲ３に対する抗体の産生） ＴＲ３、ＴＲ３の部分、またはその改変体に対する、モノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体が、産生され得る。最適には、これらの抗原のエピトープ
に対して惹起された抗体は、タンパク質を特異的に検出する。このような特異的
検出は、ＴＲ３、ＴＲ３の部分、またはその改変体に対して惹起された抗体が、
ＴＲ３を認識および結合し、そして他のタンパク質を実質的に認識も結合もしな
いことを必要とする。抗体が抗原を特異的に検出するという決定は、種々の標準
的な免疫アッセイ方法のいずれか１つによってなされる；例えば、ウェスタンブ
ロッティング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。

【０１７１】 所定の抗体調製物（例えば、ヒトＴＲ３に対してラットにおいて産生されたも
の）がウェスタンブロッティングによってＴＲ３を特異的に検出することを決定
するために、細胞タンパク質全体が、ヒト細胞（例えば、骨髄間質線維芽細胞）
から抽出され、そしてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動される。次いで、これらのタンパク質は、ウェスタンブロッティングによっ
て膜（例えば、ニトロセルロース）に移され、そして抗体調製物をこの膜ととも
にインキュベートする。この膜を洗浄して、非特異的に結合した抗体を除去した
後に、特異的に結合した抗体の存在を、アルカリホスファターゼのような酵素と
結合体化した抗ラット抗体を用いて検出する。基質５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムの適用は、免疫学的に
局在決定されたアルカリホスファターゼによって、深青色化合物を生成する。

【０１７２】 ＴＲ３を特異的に検出する抗体は、この技術によって、実質的にＴＲ３バンド
（これは、ＴＲ３の分子量によって決定される、ゲル上の所定の位置に局在化す
る）のみを結合することが示される。他のタンパク質に対するこの抗体の非特異
的結合が起こり得、そしてウェスタンブロットにおいて、より弱いシグナルとし
て、検出され得る（これは、自動化Ｘ線撮影によって定量され得る）。この結合
の非特異的性質は、特異的抗ＴＲ３結合から生じる強い主要なシグナルに対して
弱いシグナルが、ウェスタンブロットにおいて得られることによって、当業者に
よって認識される。

【０１７３】 ＴＲ３に特異的に結合する抗体は、本明細書中において「特異的結合剤」と称
される分子のクラスに属する。ＴＲ３に特異的に結合し得る特異的結合剤として
は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒト化モノクローナル抗体を含
む）、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントのような、モ
ノクローナル抗体のフラグメント、ならびにタンパク質上のエピトープに特異的
に結合し得る他の任意の薬剤（例えば、推定ＴＲ３リガンドの可溶性構築物）が
挙げられる。

【０１７４】 免疫原として使用するために適した、実質的に純粋なＴＲ３は、適切な細胞培
養物から単離され得るか、または上記のように合成され得る。最終調製物におけ
るＴＲ３タンパク質の濃度は、例えば、Ａｍｉｃｏｎフィルターデバイスを使用
して、１ミリリットルあたり数マイクログラムまで濃縮することによって、調整
される。あるいは、ＴＲ３のペプチドフラグメントは、免疫原として利用され得
る。このようなフラグメントは、標準的なペプチド合成方法を使用して化学的に
合成され得るか、またはＴＲ３分子全体を切断し、続いて所望のペプチドフラグ
メントを精製することによって、得られ得る。長さが３アミノ酸または４アミノ
酸程度に短いペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、
ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ）の状況において免疫系に提示される場
合に、免疫原性である。従って、開示されるＴＲ３アミノ酸配列の少なくとも３
つ（好ましくは、少なくとも４つ、５つ、６つ、またはそれより多く）の連続し
たアミノ酸を含むペプチドが、抗体を惹起するための免疫原として使用され得る
。

【０１７５】 タンパク質上の天然に存在するエピトープは、ペプチド配列が直鎖状分子とし
て見られる場合にそのペプチドにおいて隣接せずに配置されるアミノ酸残基から
頻繁に構成されるので、抗体を惹起するために、ＴＲ３アミノ酸配列由来のより
長いペプチドフラグメントを利用することが、有利であり得る。従って、例えば
、アミノ酸配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、または３０の連続するア
ミノ酸残基を含むペプチドが、使用され得る。インタクトなＴＲ３、またはその
ペプチドフラグメントに対する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
は、以下に記載されるように調製され得る。

【０１７６】 （Ｂ．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生） ＴＲ３のエピトープに対するモノクローナル抗体（これは、上記のように同定
および単離される）を、マウスハイブリドーマから、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、１９７５の古典的な方法、または
その誘導物もしくは改変物によって、調製し得る。上記のように、利用可能なＴ
細胞の補助の欠乏に適合するよう調節しない、古典的方法の使用は、ハイブリド
ーマの形成を効率的には可能にしない。しかし、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔ
ｅｉｎの方法を使用する試みを繰り返した後に、ＴＲ３モノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマが作製され得ることは、可能である。簡単にいえば、マウ
スに、数マイクログラムの分泌タンパク質を、数週間の期間にわたって反復的に
接種する。次いで、これらのマウスを屠殺し、そして脾臓の抗体産生細胞を単離
する。次いで、これらの脾細胞を、ポリエチレングリコールによって、マウス骨
髄腫細胞と融合し、そして融合していない過剰の細胞を、アミノプテリンを含む
選択培地（ＨＡＴ培地）上でのこの系の増殖によって、破壊する。首尾よく融合
した細胞を希釈し、そしてこの希釈物のアリコートを、マイクロタイタープレー
トのウェルに入れ、ここで、この培養物の増殖を続ける。抗体産生クローンを、
Ｅｎｇｖａｌｌ（Ｅｎｚｙｍｏｌ ７０：４１９、１９８０）によって最初に記
載されたように、そしてその誘導的方法のように、免疫アッセイ手順（例えば、
ＥＬＩＳＡ）によって、ウェルの上清流体中の抗体の検出によって同定する。選
択されたポジティブクローンを培養し得、そしてこれらのモノクローナル抗体産
物を使用のために採取し得る。モノクローナル抗体産生のための詳細な手順は、
ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８に記載されている。さらに、（治療用途のた
めの）モノクローナル抗体のヒト化形態、およびモノクローナル抗体のフラグメ
ントを産生するためのプロトコルは、当該分野において公知である。

【０１７７】 （Ｃ．ＴＲ３ ｃＤＮＡの注射によって惹起される抗体） 抗体は、ＴＲ３またはそのフラグメントに対して、ＴＲ３またはそのフラグメ
ントを発現するＤＮＡベクターを実験室動物（例えば、マウス）に皮下注射する
ことによって、惹起され得る。動物への組換えベクターの送達は、携帯型のＢｉ
ｏｌｉｓｔｉｃシステムを使用して、達成され得る（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ）３５６：１５３−１５４，１９９２に記載されるように、Ｓａ
ｎｆｏｒｄら、Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｏｌ．５：２７−３
７，１９８７）。この目的に適した発現ベクターとしては、ヒトβ−アクチンプ
ロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかの転
写制御下で、ＴＲ３またはそのフラグメントを発現するベクターが挙げられ得る
。動物の体内でＤＮＡの発現を引き起こす様式で、裸のＤＮＡを動物に投与する
方法は、周知であり、そして例えば、米国特許第５，６２０，８９６号（「ＤＮ
Ａ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉ
ｏｎｓ」）、同第５，６４３，５７８号（「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｕｎｉ
ｔ」）、および同第５，５９３，９７２号（「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚ
ａｔｉｏｎ」）、ならびにそれらに引用される参考文献に記載されている。

【０１７８】 （Ｄ．抗体フラグメント） 抗体フラグメントは、抗体全体の代わりに使用され得、そして原核生物宿主細
胞において、容易に発現され得る。モノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分
（抗体フラグメントともまた呼ばれる）を作製および使用する方法は、周知であ
り、そしてＢｅｔｔｅｒおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ １７８：４７６−４９６，１９８９；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ
ら編、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ＆
ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＩＣＳＵ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ），１０：１０５、１９９０；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２９：１３６２−１３６７，１９９０；ならびに米国特許第５，
６４８，２３７号（「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」）、同第４，９４６，７７８号（「Ｓｉ
ｎｇｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｍ
ｕｌｅｓ」）、および同第５，４５５，０３０号（「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐ
ｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎ
ｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」）、ならびにそれらに引用される参考文献に記
載されるものを含む。

【０１７９】 （Ｅ．ヒト化抗体） ヒト化モノクローナル抗体は、臨床適用において好ましくあり得る。ヒト化モ
ノクローナル抗体の作製方法は周知であり、この方法としては、米国特許５，５
８５，０８９号（「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」）
、同第５，５６５，３３２号（「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉ
ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ」）、同第５，２２５，５３９号（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｌｔｅｒｅ
ｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ Ａ
ｌｔｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）、同第５，６９３，７６１号（「Ｐｏ
ｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｈｕｍａ
ｎｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」）、同第５，６９３，７６２（
「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」）、同第５，５８５
，０８９号（「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」）、お
よび同第５，５３０，１０１号（「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂ
ｕｌｉｎｓ」）、ならびにこれらにおいて列挙される参考文献において記載され
る方法が挙げられる。

【０１８０】 （Ｆ．ヒト抗体） 最近、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の大部分が、遺伝子組換え的に、
ノックアウトされたマウスＩｇ遺伝子座を有するマウスに配置された（Ｍｅｎｄ
ｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６、１９９７）
。これらの動物のＨ−２ｂ背景について公知のクラスＩＩ結合モチーフを使用す
ることによって、ヒト抗ＴＲ３抗体を惹起することが可能であり得る。これらの
動物を精製されたヒトＴＲ３ペプチドまたはそのフラグメントで免疫することに
よって、ヒト抗ＴＲ３抗体を産生することもまた可能であり得る。このような抗
体は、ヒトの臨床使用のために好ましい試薬である。

【０１８１】 （ＸＩＩ．生物学的に活性なＴＲ３特異的抗体因子の送達） 動物への投与のために、精製された生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を、
一般に、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせる。薬学的調製物は、唯一の
生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤、またはいくつかの生物学的に活性なＴＲ
３特異的結合剤の混合物を含み得る。この薬学的調製物はまた、ＴＲ３特異的結
合剤のフラグメント、またはＴＲ３特異的結合剤の複数の異なるフラグメントを
含み得る。一般に、このキャリアの性質は、使用される投与の特定の型に依存す
る。例えば、非経口処方物は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性ブド
ウ糖、グリセロール、ヒトアルブミンなどのような薬学的かつ生理学的に受容可
能な流体をビヒクルとして含む、注入可能な流体を含む。固体組成物（例えば、
散剤、丸剤、錠剤またはカプセル形態）について、従来の非毒性固体キャリアと
しては、例えば、薬学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、または
ステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に天然なキャリアに加えて
、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤
などのような少量の非毒性補助物質（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタン
モノラウレート）を含み得る。

【０１８２】 当該分野で公知のように、特定のタンパク質ベースの製薬は、経口摂取によっ
て非能率的に送達される。しかし、その代わりに、薬学的タンパク質の丸剤ベー
スの形態は、特に徐放性組成物に処方される場合、皮下投与され得る。徐放性処
方物は、標的タンパク質を、コレステロールのような生体適合性マトリックスと
組み合わせることによって作製され得る。タンパク質製薬の別の可能な投与方法
は、微小浸透圧ポンプの使用を介する。生体適合性キャリアはまた、この送達方
法と共に使用され得る。

【０１８３】 核酸形態で細胞へと送達され、続いて宿主細胞によって翻訳される生物学的に
活性なＴＲ３特異的結合剤およびそのフラグメントもまた、意図される。これは
、例えば、ウイルスベクターまたはリポソームの使用によってなされ得る。リポ
ソームはまた、このタンパク質自体の送達のためにも使用され得る。

【０１８４】 本発明の薬学的組成物は、その意図される目的を達成する任意の手段によって
投与され得る。生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤の投与のための量およびレ
ジメンは、不必要なＴ細胞の活性化に関連する疾患を処置する臨床分野の当業者
によって容易に決定され得る。これらの状態の処置における使用について、この
記載される生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤は、Ｔ細胞増殖を阻害するのに
有効な量で投与される。この抗体および／またはそのフラグメントは、例えば、
静脈内投与または腹腔内投与のような全身投与を通して、インビボで宿主に投与
され得る。また、この抗体および／またはそのフラグメントは、病巣内投与され
得る（すなわち、この抗体は、罹患した領域（例えば、器官移植の場合は移植片
部位）へと直接注入され得る）。

【０１８５】 生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤の有効用量は、処置される状態の性質お
よび重症度、被験体の年齢および状態、ならびに他の臨床的要因に依存して変化
する。従って、適切な処置レジメンの最終的な決定は、担当臨床医によってなさ
れ得る。代表的に、用量範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ
体重である。他の適切な範囲としては、約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の
用量が挙げられる。用量計画は、このタンパク質に対する被験体の感度のような
多くの臨床的要因に依存して、週に１回〜毎日まで変化し得る。用量計画の例は
、週に２回、週に３回、または毎日の３μｇ／ｋｇの投与；週に２回、週に３回
または毎日の７μｇ／ｋｇの用量；週に２回、週に３回または毎日の１０μｇ／
ｋｇの用量；あるいは週に２回、週に３回または毎日の３０μｇ／ｋｇの用量で
ある。より攻撃的な疾患の場合において、静脈内経路またはくも膜下腔内経路を
含む交代性経路によって、上記のような用量を投与することが好ましくあり得る
。連続的な注入もまた、適切であり得る。

【０１８６】 上記のように、本発明に従う抗ＴＲ３抗体および他の結合剤は、不必要なＴ細
胞の活性化に関連する疾患の処置のために有用である。このような疾患の例は、
多発性硬化症、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、心筋炎、急性および慢性
の拒絶疾患（ＧＶＨＤ、器官移植拒絶）、重症筋無力症、糖尿病、遅延型過敏症
、アレルギー、トキシックショック症候群および癌（リンパ腫または白血病）で
ある。

【０１８７】 本発明の原理を、複数の実施形態および実施例において例示および記載したが
、本発明は、このような原理から逸脱することなく、構成および詳細において改
変され得ることが当業者に明らかであるはずである。本発明者らは、上記の特許
請求の範囲の精神および範囲内で起こる全ての改変を特許請求する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ヒトＴＲ３のプロセスされた形態からの最初の１３個のＮ末端アミノ
酸であるＴＲ３（１−１３）ペプチドが、貧弱なＢ細胞エピトープであることを
示す。Ｌｅｗｉｓラット１〜３を、ＴＲ３（１−１３）ペプチドで免疫した。Ｌ
ｅｗｉｓラット４を、ヒトＴＲ３のプロセスされた形態からの最初の３２個のＮ
末端アミノ酸であるＴＲ３（１−３２）ペプチドで免疫した。血清を、６週間後
にこのラットから回収し、そして蛍光ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検
定法）を使用して、ＴＲ３（１−１３）ペプチドまたはＴＲ３（１−３２）ペプ
チドでコーティングしたプレートへの結合について１：５０００希釈でアッセイ
した。ラット１〜３は、ＴＲ３（１−１３）ペプチドに対する検出可能な抗体を
ほとんど示さず、そしてＴＲ３（１−３２）ペプチドに対する検出可能な抗体を
まったく示さなかった。ラット４は、ＴＲ３（１−１３）ペプチドに対していく
らかの反応性を示したが、ＴＲ３（１−３２）ペプチドに対してはより強力な応
答を示した。ＴＲ３（１−３２）ペプチドのＢ細胞エピトープは、ＴＲ３（１４
−３２）に関連したペプチドの部分であるが、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合
体）クラスＩＩ結合部位を除く部分であると考えられる。

【図２】 図２は、ＴＲ３（１−１３）ペプチドが、Ｔ細胞に対して免疫原性であること
を示す。ＴＲ３（１−１３）ペプチドで免疫されたＬｅｗｉｓラット由来のリン
パ節Ｔ細胞を、インビトロにおいて、示されるＴＲ３ペプチドの個々の量でチャ
レンジした。³Ｈチミジンの取り込みによって測定される、ＴＲ３（１−１３）
ペプチドに対する用量依存性応答を示す。しかし、Ｔ細胞は、ヒトＴＲ３のプロ
セスされた形態のＮ末端アミノ酸１４〜３２を含むペプチドであるＴＲ３（１４
−３２）ペプチドの引き続く高用量に応答しなかった。従って、ＴＲ３（１−１
３）ペプチドは、Ｂ細胞に対してではなくＴ細胞に対して免疫原性である。

【図３】 図３は、ＴＲ３（１−３２）ペプチドでラットを「初回免疫すること」（すな
わち、ラットに、最初の免疫原性チャレンジを投与すること）によって、ラット
において、ＴＲ３に対する免疫応答が誘導されることを示す。ラットに、ＴＲ３
（１−３２）ペプチドを用いて免疫し、そして４週間放置した。ラット由来の免
疫血清を、ＴＲ３（１−３２）ペプチドコーティングプレートを用いる蛍光ＥＬ
ＩＳＡによって、ＴＲ３（１−３２）特異的抗体についてアッセイし、そして同
じ動物由来の血清中の免疫前力価と比較した。

【図４】 図４は、完全フロイントアジュバントおよびＴＲ３（１−３２）ペプチドを用
いてラットを免疫することによって得られた免疫血清が、インビトロにおいて、
ラットミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞株の増殖応答
を阻害したことを示す。６匹のラット由来の血清を試験した。この血清を熱不活
化し（補体活性の可能性を排除するため）、そして抗原提示細胞および抗原の存
在下で２０，０００個の（ＭＢＰ）特異的Ｔ細胞（すなわち、ミエリン塩基性タ
ンパク質に特異的なＴ細胞）を含むマイクロタイタープレートのウェルに添加し
た。増殖応答を、免疫していないＬｅｗｉｓラット由来の血清コントロールの増
殖応答と比較した。

【図５】 図５は、ＴＲ３特異的免疫血清が、用量依存性の様式でＴ細胞増殖を阻害する
ことを示す。抗原特異的Ｔ細胞増殖は、ＴＲ３免疫血清によって最大限に阻害さ
れた（０日目に添加された場合）。以後のＴＲ３免疫血清の添加は、血清の阻害
性効力を減少させる。

【図６】 図６は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌ
ｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用するフローサイトメトリー分析を示す。この分
析は、抗体に結合体化された蛍光色素の使用を通して、細胞表面への特異的抗体
の結合を測定する。レーザーを使用して、色素中のこれらの蛍光色素を励起する
。図６に示されるヒストグラムは、抗ＴＲ３免疫血清が、活性化マウスＣＤ８⁺
Ｔ細胞を染色することを示す。マウスＴ細胞を、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）
の存在下で４８時間培養してそれらを活性化させ、洗浄し、そしてコントロール
またはラット４由来の免疫血清（図４）と共にインキュベートした。次いで、こ
れらの細胞を、抗ラットＩｇ：ＦＩＴＣ（ＦＬ１）で染色した。これにより、抗
ＴＲ３免疫血清においてラット由来の抗体によって結合されたマウス細胞の染色
を生じさせた。次いで、マウス細胞を、ＣＤ８：ＰＥを用いて対比染色した。こ
れにより、ＣＤ８⁺を発現したすべてのマウス細胞の染色を生じさせた。次いで
、ＣＤ８⁺について陽性に染色された細胞（このうちのいくつかは、ＣＤ８⁺およ
び抗ラットＩｇ（すなわち、抗ＴＲ３免疫血清）について二重染色された）のみ
を計数するように細胞選別器を設定した。左側のヒストグラム（正常ラット血清
で染色されたコントロールマウス細胞を表す）は、９９％の細胞がマーカー−１
（Ｍ１）領域内に存在することを示す。右側のヒストグラムは、抗ＴＲ３で染色
されたマウス細胞の集団から得られ、そしてこれらの細胞の４１％がマーカー−
２（Ｍ２）領域へとシフトした。このことは、Ｍ２領域内の細胞が、抗ラットＩ
ｇ（すなわち、抗ＴＲ３免疫血清）およびＣＤ８：ＰＥで二重染色されたことを
示す。

【図７】 図７は、ＴＲ３初回免疫ラットが、ＴＲ３（１−３２）ペプチドに対する既往
性応答を産生できないことを示す。ラットを、ＴＲ３（１−３２）ペプチドで初
回免疫し、そして６週間後に再度、ＴＲ３（１−３２）ペプチドで追加免疫した
。二次免疫血清を、チャレンジ後１０日目にラットから回収した。追加免疫の日
に回収された一次（１゜）血清は、追加免疫直前の力価を示す。 ラットは、ＴＲ３ペプチドに対して良好な一次応答を示したが、これらは、二
次チャレンジに対して応答できなかった。このことは、免疫されたラットによっ
て産生された抗体が、ＴＲ３ペプチドについてのＴ細胞補助を排除したことを示
唆する。

【図８】 図８は、抗ＴＲ３免疫応答を示すラットが、アイソタイプスイッチを示し得る
ことを示す。ラットを、ＴＲ３（１−３２）ペプチドで免疫し、そして放置した
。１２週間後、血清をこれらのラットから回収し、そして指示された希釈率で、
種々の免疫グロブリンアイソタイプについて分析した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２
ａ、ならびにより少ない程度でＩｇＧ２ｂがすべて存在した。このことは、アイ
ソタイプスイッチが生じたことを示す。

【図９】 図９は、ＴＲ３発現が、抗原刺激後に、ラットおよびマウスのＣＤ４⁺Ｔ細胞
の表面上で誘導されることを示す。ラット（Ａ）およびマウス（Ｂ）に対して、
それぞれ、１μｇ／ｍＬのウシＭＢＰ、または２μｇ／ｍＬのマウスＰＬＰ（プ
ロテオリピドタンパク質）アミノ酸１３９〜１５１を用いて、インビトロにおい
て、Ｔ細胞株を刺激した。ＴＲ３の発現を、非染色ＣＤ４⁺Ｔ細胞と比較して、
刺激後２４時間で検出し、等価な染色を４８時間および７２時間で検出した。

【図１０】 図１０は、ＴＲ３が、エプスタイン−バーウイルス−１（ＥＢＶ−１）刺激細
胞でのアロ刺激（ａｌｌｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）後７２時間目に、ヒトＣＤ
４⁺Ｔ細胞およびヒトＣＤ８⁺Ｔ細胞において発現されることを示す。ヒトＡｌｌ
ｏ−１細胞株を、単独（「コントロール」）でか、または刺激物としてＥＢＶ−
１細胞と共に（「活性化」）培養した。７２時間後、細胞を収集し、そして抗Ｃ
Ｄ４：ＰＥ（プロットＡ）または抗ＣＤ８：ＰＥ（プロットＢ）で染色し、そし
て抗ＴＲ３：ＦＩＴＣで対比染色した。いくつかのＣＤ４⁺染色細胞を、抗ＴＲ
３で二重染色する（プロットＡ）か、またはいくつかのＣＤ８⁺染色細胞を、抗
ＴＲ３で二重染色した（プロットＢ）。ヒストグラムを、ＣＤ４⁺（プロットＡ
）Ｔ細胞またはＣＤ８⁺（プロットＢ）Ｔ細胞のいずれかを選択することによっ
て作成した。

【図１１】 図１１は、ＴＲ３が、抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３は、Ｔ細胞において発現され、Ｔ
細胞抗原レセプターと関連し、そしてシグナル伝達を促進する）および抗ＣＤ２
８抗体（ＣＤ２８は、Ｔ細胞において発現され、そして未処理Ｔ細胞の同時刺激
を担う）で活性化された、ＣＤ４⁺ラットリンパ節Ｔ細胞およびＣＤ８⁺ラットリ
ンパ節Ｔ細胞において発現されることを示す。ラットリンパ節Ｔ細胞を、単独（
「コントロール」）でか、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で
（「活性化」）培養した。４８時間後、細胞を収集し、そして抗ＣＤ４：ＰＥ（
プロットＡ）または抗ＣＤ８：ＰＥ（プロットＢ）で染色し、そして抗ＴＲ３：
ＦＩＴＣで対比染色した。ヒストグラムを、ＣＤ４⁺Ｔ細胞（プロットＡ）また
はＣＤ８⁺Ｔ細胞（プロットＢ）のいずれかを選択することによって作成した。

【図１２】 図１２は、ＴＲ３が、能動および養子ＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）
を有するラットおよびマウスの脳由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞において発現されること
を示す。マウスおよびラットに、能動ＥＡＥを誘導するために免疫する（プロッ
トＡおよびＣ）か、または養子ＥＡＥの誘導のために、５×１０⁶個（プロット
Ｂ）もしくは２×１０⁶個（プロットＤ）の脳炎誘発性Ｔ細胞を与えるかのいず
れかをした。疾患発症の日に、Ｔ細胞を脳から単離し、そしてラット抗マウスＶ
β１４（白抜きのプロット、アイソタイプコントロール）または抗ＴＲ３（塗り
つぶしプロット）で染色した。

【図１３】 図１３は、ＴＲ３が、同種異系骨髄移植を受けたラットにおけるＣＤ４⁺Ｔ細
胞において発現されることを示す。同種異系骨髄移植の７日後、正常コントロー
ル（Ｌｅｗｉｓ×Ｂｕｆｆａｌｏ）Ｆ１ラット（プロットＡ）または同種異系Ｂ
ｕｆｆａｌｏラット骨髄のレシピエント（プロットＢ）由来の末梢血リンパ球を
回収し、そして抗ＴＲ３：ＦＩＴＣ（ＦＬ１）および抗ＣＤ４：ＰＥ（ＦＬ２）
で染色した。代表的な染色を、プロット（Ａ）および（Ｂ）に示す。時間に対す
るＴＲ３発現ＣＤ４⁺Ｔ細胞の百分率を、プロット（Ｃ）に示す。ＴＲ３発現の
速度論を、３匹のコントロールラットおよび同種異系ＢＭＴ（骨髄移植）を伴う
４匹のラットの平均±ｓｄとして表す。同種異系ＢＭＴを有するすべてのラット
が、急性ＧＶＨＤを発症した。

【図１４】 図１４は、ヒトおよびマウスのＴ細胞増殖応答が、抗ＴＲ３ ＭｃＡｂによっ
て阻害されることを示す。ヒトＡｌｌｏ−１またはマウスＰＬＰ（１３９−１５
１）細胞株由来の２０，０００個のＴ細胞を、種々の量の抗ＴＲ３ ＭｃＡｂの
存在下または不在下において、その個々の抗原と共に培養した。３日後、取り込
まれた³Ｈチミジンの量を決定した。両方のＴ細胞株が、ＭｃＡｂの作用に対し
て感受性であった。データは、６つの培養物の平均±ｓｄを表す。

【図１５】 図１５は、ラットの活性化Ｔ細胞が、時間と伴に抗ＴＲ３ ＭｃＡｂの阻害性
作用に対する感受性を損失するが、７２時間目での抗原による再活性化に際して
、感受性を回復することを示す。２０，０００個のＭＢＰ特異的ラットＴ細胞（
ミエリン塩基性タンパク質を認識するＴ細胞）を、抗原で刺激し、そして培養し
た。抗ＴＲ３ ＭｃＡｂを、示される時間に添加し、そして７２時間目に³Ｈチ
ミジンの取り込みについて評価した。１つの群の培養物を、抗原で再刺激し、そ
して抗ＴＲ３もまた添加した。この後者の群を、１２０時間目に、³Ｈチミジン
の取り込みについて評価した。データは、三連の培養物の平均を表す。抗体の添
加を、刺激後２４時間および４８時間遅らせた場合、活性化Ｔ細胞は、抗ＴＲ３
抗体に対する感受性を損失した。しかし、これらの細胞は、７２時間目での再刺
激に際して、感受性を回復した。

【図１６】 図１６は、抗ＴＲ３抗体が、ラットにおけるＥＡＥの準臨床的および臨床的な
養子移入を妨げることを示す。４匹のＬｅｗｉｓラットに、２×１０⁶個のＭＢ
Ｐ特異的Ｔ細胞を注射して、ＥＡＥを養子移入した。これらのラットのうちの２
匹を、移入と同じ日に、３００μｇの抗ＴＲ３抗体で処理した。これらの動物を
、準臨床的な体重減少について毎日評価した（プロットＡ）。未処理ラットは、
９日目までに、総体重の１７〜２０％を損失した。抗ＴＲ３で処理したラットの
うちの１匹のみが、体重を損失した（４％体重減少）。これらの動物をまた、臨
床的ＥＡＥについて観察した（プロットＢ）。未処理の両方の動物は、６日目に
跛行尾（ｌｉｍｐ ｔａｉｌ）、そして７日目に後肢麻痺を発生した（ＥＡＥの
指標）。抗ＴＲ３免疫療法を与えられたラットはいずれも、いかなるＥＡＥの臨
床的徴候も発生しなかった。これらのデータは、抗ＴＲ３が、インビボにおいて
、さもなくばＥＡＥを誘導するＴ細胞を排除するように作用していることを示唆
する。

【図１７】 図１７は、抗ＲＴ７．１で染色されたＣＤ４⁺Ｔ細胞を選択するように設定さ
れたフローサイトメトリー分析から得られたヒストグラムプロットを示す。この
データは、抗ＴＲ３処理（Ｌｅｗｉｓ×Ｂｕｆｆａｌｏ）Ｆ１動物が、首尾良く
、ＲＴ７．１^-であるドナー由来Ｂｕｆｆａｌｏ ＣＤ４⁺Ｔ細胞で再構築された
ことを示す。破線および実線は、ＴＲ３処理によるＧＶＨＤの治療を受けた２匹
のＢｕｆｆａｌｏ骨髄移植動物からの個々のヒストグラムである。一方の動物は
、ドナーＲＴ７．１^-細胞で完全に再構築されたが、他方は、８６％のドナーＴ
細胞および１４％のレシピエントＴ細胞を有した。

【図１８】 図１８（Ａ）および１８（Ｂ）は、ＴＲ３が、いくつかの腫瘍細胞において発
現されること、およびＴＲ３に対するＭｃＡｂが、腫瘍増殖を阻害し得ることを
示す。５つのＴ細胞腫瘍株を、抗ＴＲ３抗体で染色した。３つのマウスＴリンパ
腫（ＥＭＧ２，ＥＦＫ１，およびＳＬＩ）を、Ｗ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ氏（Ｄｅｐｔ
．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓ
ｃｈｏｏｌ，Ｌｅｂａｎｏｎ ＮＨ）から得た。２つのヒトＴリンパ腫（ＨｕＴ
７８およびＪｕｒｋａｔ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ（それぞれ、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１７６およびＴＩＢ−１５２
）から得た。試験された５つの腫瘍株のうちの４つが、ＴＲ３を発現した。この
染色の例を、図１８（Ａ）に示す。次いで、これらの４つの腫瘍株を、抗ＴＲ３
媒介性殺傷に対する感受性について試験した。図１８（Ｂ）に示される、代表的
な用量依存性阻害曲線によって実証されたように、すべてＴＲ３誘導性細胞死に
対して感受性であった。これらのデータは、ＴＲ３を発現するＴ細胞腫瘍が、抗
ＴＲ３抗体の注射によって処置可能であることを示唆する。

【図１９】 図１９は、抗ＴＲ３特異的モノクローナル抗体による阻害機構が、活性化細胞
においてアポトーシスを誘導することによることを示す。ラットリンパ節細胞を
、１×１０⁶細胞／ｍｌで培養し、そして抗ＴＲ３モノクローナル抗体（２０μ
ｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、コンカナバリンＡで刺激した。２
４時間後に細胞を収集し、そして標準的方法に従って、ＤＮＡを抽出した。次い
で、コントロール細胞および処理細胞由来のＤＮＡを、エチジウムブロミドの存
在下で１％アガロースゲルにおいて泳動し、ＤＮＡサイズを可視化した。抗ＴＲ
３抗体処理培養物において観察された特徴的なＤＮＡラダーは、抗ＴＲ３抗体で
の正常Ｔ細胞におけるアポトーシスの最初の証明である。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年５月２９日（２００２．５．２９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００２２】 （本発明を実施するための方法） 本発明は、ＴＲ３に結合しそしてＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害する生物
学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を含む組成物を提供する。１つの局面において
、特異的結合剤は、モノクローナル抗体またはＴＲ３特異的モノクローナルの模
倣物である。本発明はまた、モノクローナル抗体ＴＲ３μｋ−１を産生するハイ
ブリドーマ細胞株（例えば、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２６５９のもと寄託されたハ
イブリドーマ細胞株）を提供する。モノクローナル抗体は、以下からなる群から
選択される：少なくとも１つのＩｇＧ、少なくとも１つのＩｇＭ、少なくとも１
つのＩｇＡ₁、少なくとも１つのＩｇＡ₂、少なくとも１つのＩｇＥ、少なくとも
１つのＩｇＤ、少なくとも１つのＩｇＧ₁、少なくとも１つのＩｇＧ₂、少なくと
も１つのＩｇＧ₃、および少なくとも１つのＩｇＧ₄。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図９】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１０】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１１】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 21/04 Ａ６１Ｐ 21/04 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウェグマン， ケイス ダブリュー． アメリカ合衆国 ワシントン 98682， バンクーバー， エヌ．イー． 40ティー エイチ ストリート 15916 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA53 GA03 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA44 4C084 AA17 DA53 MA52 MA55 MA66 NA14 ZA941 ZA961 ZB071 ZB111 ZB151 ZB261 ZC351 ZC781 4C085 AA14 BB33 BB35 BB36 BB37 CC05 DD22 DD23 EE01

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を含む組成物であって
   、該特異的結合剤は、ＴＲ３に結合しかつＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害す
   る、組成物。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の組成物であって、前記特異的結合剤がモノ
   クローナル抗体である、組成物。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリ
   ドーマ細胞株。
4. 【請求項４】 前記細胞株がＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２６５９である、請求項
   ３に記載のハイブリドーマ細胞株。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の組成物であって、前記特異的結合剤が、Ｔ
   Ｒ３特異的モノクローナル抗体の模倣物である、組成物。
6. 【請求項６】 請求項２に記載の組成物であって、前記モノクローナル抗体
   が、少なくとも１つのＩｇＧ、少なくとも１つのＩｇＭ、少なくとも１つのＩｇ
   Ａ₁、少なくとも１つのＩｇＡ₂、少なくとも１つのＩｇＥ、少なくとも１つのＩ
   ｇＤ、少なくとも１つのＩｇＧ₁、少なくとも１つのＩｇＧ₂、少なくとも１つの
   ＩｇＧ₃、および少なくとも１つのＩｇＧ₄からなる群より選択される、組成物。
7. 【請求項７】 生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を生成および同定する
   ための方法であって、以下： 少なくとも１つのＴＲ３特異的エピトープを注射された動物から、リンパ系細
   胞を提供する工程； 該リンパ系細胞をＴＲ３特異的Ｔ細胞株と接触させる工程； 少なくとも１つの該リンパ系細胞を少なくとも１つの骨髄腫細胞と融合して、
   ＴＲ３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成する工程； 得られたモノクローナル抗体を、関連するＴＲ３ペプチドに結合する能力につ
   いてスクリーニングする工程；ならびに 該モノクローナル抗体をアッセイして、ＴＲ３を発現する細胞の阻害を評価す
   る工程、 を包含する、方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法によって生成および同定される、生物
   学的に活性なＴＲ３特異的結合剤。
9. 【請求項９】 生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を検出および同定する
   ための方法であって、以下： （ａ）少なくとも１つのＴＲ３特異的結合剤を少なくとも１つの活性化Ｔ細胞
   またはＴ細胞腫瘍と接触させる工程；ならびに （ｂ）活性化Ｔ細胞または腫瘍の増殖のレベルを決定する工程であって、増殖
   の欠如は、該ＴＲ３特異的結合剤が生物学的に活性であることを示す、工程、 を包含する、方法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法によって同定される、生物学的に活
    性なＴＲ３特異的結合剤。
11. 【請求項１１】 請求項９に記載の方法であって、前記ＴＲ３特異的結合剤
    を前記活性化Ｔ細胞またはＴ細胞腫瘍と接触させる工程がインビボで生じる、方
    法。
12. 【請求項１２】 請求項９に記載の方法であって、前記ＴＲ３特異的結合剤
    を前記活性化Ｔ細胞またはＴ細胞腫瘍と接触させる工程がインビトロで生じる、
    方法。
13. 【請求項１３】 ＴＲ３を発現する細胞の増殖に関連する疾患を有すると疑
    われる被験体を処置するための方法であって、少なくとも１つの生物学的に活性
    なＴＲ３特異的結合剤を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法であって、前記被験体が、以下の
    ような自己免疫疾患： 重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬
    化症、サルコイドーシス、心筋炎、甲状腺炎、および腫瘍、 からなるがこれらに限定されない群より選択されるＴ細胞媒介性疾患を有すると
    疑われる、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１３に記載の方法であって、前記ＴＲ３を発現する
    細胞が、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫である、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１３に記載の方法であって、前記被験体が、対宿主
    性移植片病を有すると疑われる、方法。
17. 【請求項１７】 請求項１３の記載の方法であって、前記被験体が、心臓、
    肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、皮膚、または付属器のような、移植器官に対する拒
    絶を有すると疑われる、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１３に記載の方法であって、前記被験体が、炎症性
    疾患、アレルギーおよび接触皮膚炎を有すると疑われる、方法。
19. 【請求項１９】 生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤を含む組成物であっ
    て、該特異的結合剤は、ＴＲ３に結合しかつＴＲ３を発現する細胞の増殖を阻害
    し、該生物学的に活性なＴＲ３特異的結合剤は、ＴＲ３を発現する細胞の増殖を
    少なくとも３０％阻害する、組成物。