JP2014509325A - 拮抗性dr3リガンド - Google Patents
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Abstract
Description
「炎症」とは、有害な刺激、例えば、病原体、損傷を受けた細胞、または刺激薬などに対する血管組織の複雑な生物学的応答である。炎症は、生物体による、傷害性の刺激を取り除くため、ならびに組織に対する治癒プロセスを開始するための保護的な試みである。炎症は、感染症のシノニムではなく、感染症は外因性の病原体によって引き起こされるが、炎症は、病原体に対する生物体の免疫系の応答である。
以下は、本発明による実施形態の一覧である。この実施形態の一覧は、限定的なものではなく、本発明は、以下の実施形態の任意の組合せを包含することが理解される。
(実施例1)
免疫化およびハイブリドーマの生成
以下の実施例に記載の通り、高い品質の可溶性型の全長DR3を作製することは、このタンパク質の性質がシステインリッチであるので難しい。可溶性型のDR3は、高度に凝集する傾向があり、それにより重要なリガンド結合領域が遮蔽され、免疫化した際に所望の抗体応答を生じることが難しくなる。頑強な抗DR3抗体(Ab)血清力価を得るために、広範にわたる免疫化レジメンを、可溶性全長DR3タンパク質、DR3のECDの一部のみを含有するDR3タンパク質誘導体(例えば、CRD1ドメインのみを用いた免疫化のような)、およびDR3を発現している細胞(実施例3に記載の通り)いずれも免疫化のために使用して実施した。抗体レパートリーの多様性および中和性抗DR3Abの生成の尤度を増加させるために、異なるマウス系統(BALB/C、RBFおよびNMRCF1)において免疫化を実施した。一例では、BALB/Cマウスを、DR3を発現しているCHO細胞5×106個を用いて、不完全フロイントアジュバント(IFA)を伴い、または伴わずに、腹腔内に(IP)8回免疫化した後、IFAにおいて、精製したhDR3-Fc(実施例3参照)を用いて6回IP免疫化した。マウス血清を、DR3/hTL1A遮断抗体について、実施例4に記載の通りFACSによってスクリーニングした。DR3/hTL1A遮断Ab価を有するマウスに、DR3-mFcを用いた尾静脈への単回静脈内注射(i.v.)からなる最終的な追加免疫を受けさせた。追加免疫の3日後にマウスを屠殺し、脾細胞を、標準の電気融合手順によってX63Ag8653骨髄腫細胞と融合した。融合細胞を、96ウェルプレート中に播種し、DMEM(Invitrogen)およびFCS(Hyclone)を補充したHAT選択培地中で1週間培養した後、DR3/hTL1A遮断mAbについてスクリーニングした。
スクリーニングおよび免疫化のための細胞
膜貫通(TM)DR3を過剰発現している細胞が、細胞に基づくスクリーニングアッセイにおいて使用するため、およびマウスを免疫化するための必須のツールとして開発されてきた。
可溶性DR3の発現および精製
ヒトDR3は、細胞外ドメイン(ECD、残基25〜199)内に4つのシステインリッチドメイン(CRD1、CRD2、CRD3およびCRD4)を含み、細胞質ドメイン内に「デスドメイン」(DD)を含む、非常にシステインリッチなタンパク質である。Bannerら、Cell(73)431〜445頁、(1993)によると、各CRDは、典型的には、3つのジスルフィド結合を形成する6つのシステイン残基を含有する。さらに各CRDは、典型的には、TNFRスーパーファミリーの従来のメンバーにおいて観察されるモジュールA1およびB2に細分することができる(J.H.Naismithら、Trends Biochem. Sci.(23)74〜79頁、1998)。予測CRDおよびモジュールA1およびB2を有するDR3の配列が図4に示されている。
DR3(CRD1)-Fc(配列番号2)
DR3(CRD1+A1)-Fc(配列番号3)
DR3(CRD1+CRD2)-Fc(配列番号4)
DR3(CRD1+CRD2+A1)-Fc(配列番号5)
ベクター:
DR3タンパク質の変異体の全てを、CMVプロモーターに基づく発現ベクター(pTTベクター)を使用することによって発現させた。pTTベクターを、Yves Durocher(DurocherらNucleic Acid Research、2002)により開発されたHEK293-6E EBNAに基づく発現系において一過性に発現させるために生成する。
HEK293-6E細胞を、25μg/mlのGeneticin(Gibco)、1%v/vの界面活性物質プルロニックF-68(Gibco)および1%v/vのペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を補充したFreeStyle(商標)293発現培地(Gibco)中、浮遊液で成長させた。細胞を、Erlenmeyer振とうフラスコに入れ、37℃、8%CO2、125rpmの振とうインキュベーターで培養し、1ml当たり細胞0.1〜1.5×106個の細胞密度で維持した。
・トランスフェクトするために使用した培養物の細胞密度は1ml当たり細胞0.9〜1.1×106個であった。
・細胞培養物1ml当たり1μgのDNAを使用した。
・DNAを、1μgのDNA当たり30μlのOpti-MEM培地(Gibco)に希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートした。
・293Fectin(商標)(Invitrogen)をトランスフェクション試薬として、1μgのDNA当たり1μlの濃度で使用した。
・293Fectin(商標)を、Opti-MEM培地(Gibco)中に30倍希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートした。
・DNAと293Fectin溶液を混合し、室温(23〜25℃)で25分間インキュベートしておいた。
・次いで、DNA-293Fectin混合物を細胞培養物に直接加えた。
・トランスフェクトされた細胞培養物を、37℃、8%CO2、125rpmの振とうインキュベーターに移した。
・トランスフェクトした5〜6日後に、細胞培養物の上清を遠心分離によって回収し、その後、0.22μmのPESフィルター(Corning)を通して濾過した。
・可能であれば、タンパク質産生の定量分析を、ForteBio OctetシステムおよびプロテインAバイオセンサーを使用してバイオレイヤー干渉法(Biolayer Interferometry)によって実施した。
細胞の上清を、プロテインA親和性ビーズ(MabSelect Sure;GE Healthcare)を伴うカラムに、20mMのトリス/HCl、pH8.5をバッファーとして用いて直接ローディングした。結合したタンパク質を、10mM、50mMおよび100mMのギ酸ナトリウム、pH3.5を用いて段階的に溶出させた。溶出画分を濃縮し、限外濾過によってPBSバッファーに移した。Superdex200カラム(GE Healthcare)で、PBSをバッファーとして用いてゲル濾過を行った。二量体タンパク質を含有する画分をプールし、限外濾過によって濃縮した。クロマトグラフィーのステップは全て、Akta Explorer FPLC計器(GE Healthcare)を用いて実施した。
TL1A:DR3相互作用を遮断する抗体についてのスクリーニング
マウス血清のプレスクリーニング
マウスの血清における遮断作用の程度に非常に大きな差異があったので、融合を実施する前にマウス血清を遮断作用についてプレスクリーニングすることが必須であることが分かった。
TL1Aの結合を遮断する能力を有するDR3に対する抗体を選択するために、スクリーニング計画は以下の通りであった:
DR3レポーター遺伝子アッセイ
Chinnaiyanら1996(Science 1996年、274巻、5289号、990〜992頁)により、DR3はNFカッパBを介してシグナル伝達し、MCF7細胞においてDR3が異所性に発現されると、アポトーシスを誘導することが報告された。我々は、NFカッパBシグナル伝達をレポーターとして利用すること、およびDR3発現の減少を、アポトーシス性の細胞を回避するために使用することを望んだ。
TL1A:DR3相互作用を遮断する抗体およびFab
DR3に対する特異性を有し、TL1AとDR3の相互作用の遮断について試験陽性であるモノクローナル抗体(mAb)を同定した。DR3を発現している細胞を用いて一次的に免疫化したマウスから、少なくとも50回の融合後に合計数百の特異的なDR3 mAbが選択された。DR3特異的クローンのTL1A阻害/遮断についてのさらなる試験により74クローンが得られた。図6は、DR3抗体を遮断する陽性抗体のいくつかを示す。そのような遮断作用を有さない2つの陽性のDR3特異的クローンも包含される。
DR3抗体およびそれに由来するFabの機能的作用
DR3に対して生じ、TL1AとDR3の相互作用の遮断について試験陽性であるモノクローナル抗体(mAb)はDR3シグナル伝達の潜在的な中和剤であった。
フローサイトメトリーによる、活性化されたヒト細胞との結合
Copenhagen University Hospitalからの正常な健康なボランティアからバフィーコートを得た。CD4+T細胞を磁気ビーズ分離によって単離した。細胞を、2ng/mlのIL-12、50ng/mlのIL-18および100ng/mlのTL1A(Novo Nordisk A/Sで作製されたFlag-HIS-TEV-TL1A)を用いて活性化し、5日間培養した。5日目に、細胞を10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/mlまたは0.0001μg/mlの抗DR3 mAbクローン0072、0073もしくは0077、またはFab断片クローン0087、0088および0091で染色した。二次PEコンジュゲートヤギ抗マウス(H+L)を検出のために使用した。
CD4+T細胞を、CD4 Rosettesep(Stem cell technologies)およびHistopaque(Sigma)を使用して、磁気ビーズ分離によってバフィーコートから単離した。T細胞(96ウェルプレート中、ウェル当たり細胞2×105個)を、2ng/mlのIL-12、50ng/mlのIL-18および100ng/mlのTL1A(Flag-HIS-TEV-TL1A;Novo Nordisk)を用いて、抗TL1A(1000ng/ml;MAB7441;RnDSystems)およびDR3 mAbまたはDR3 Fab(5μg/mlまたは10μg/ml)を伴った状態および伴わない状態で、5日間活性化した。使用したDR3 mAbは、0072、0073および0077であった。使用したDR3 Fabは、0087、0088および0091であった。細胞を、5日間活性化した後に[3H]チミジンでパルスし、16時間後に回収した。あるいは、細胞を3日間活性化し、その後のサイトカイン産生を測定した(実施例6、15、18を参照されたい)。
マウス27F16A1 mAb、27F44A2 mAbおよび28F26A3 mAbのクローニングおよび配列決定
マウスの抗DR3抗体の重鎖配列および軽鎖配列を、ハイブリドーマ:27F16A1、27F44A2および28F26A3からクローニングした。QiagenからのRNeasy-Mini Kitを使用してハイブリドーマ細胞から抽出した全RNAを、cDNAを合成するための鋳型として使用した。ClontechからのSMARTer(商標) RACE cDNA増幅キットを使用して、5'-RACE反応でcDNAを合成した。その後のHC配列およびLC配列の標的増幅を、Phusion High-Fidelity PCR Master mix(Finnzymes)およびフォワードプライマーとしてSMARTer(商標) RACEキットに含まれるuniversal primer mix(UPM)を使用してPCRによって実施した。
翻訳された抗DR3 27F16A1、27F44A2および28F26A3のVLおよびVHのアミノ酸配列をクエリ配列として使用した。BLASTpプログラムを使用して、GeneSeqP特許データベース(外部データベースからインポートした配列を伴うが、外部パーティーへのアクセスは伴わない内部データベース)内の配列に対してBLAST検索を実施した。最高の同一性スコア100の中で、VHについての最高の同一性スコアは87.4(28F26A3)であり、VLについての最高の同一性スコアは97.3(27F44A2)であった。結論として、抗DR3のVH配列およびVL配列は新規の配列である。
フローサイトメトリーによる、抗体結合の評価
ヒトCD4陽性T細胞を、CD4 Rosettesep(Stem cell technologies)およびHistopaque(Sigma)を使用してバフィーコートから精製した。T細胞を、T75フラスコ中1:1比率のCD3/CD28 Dynabeads(Invitrogen)を用いて、10%のfcsを補充したRPMI中1ml当たりCD4 T細胞2mioで4日間刺激した。磁石を使用してビーズを除去し、細胞を2回洗浄した後、500000細胞/染色に対して抗体の力価を決定した。ヤギ抗マウスフィコエリトリン(Jackson ImmunoResearch)と一緒にインキュベートした後に結合飽和を測定し、その後、細胞を、BD LSRIIでフローサイトメトリーによって分析した。全ての抗体が3μg/mlで飽和に達した。蛍光強度中央値がTable 11(表11)に示されており、染色指数(MFI Ab/MFIアイソタイプ)がTable 12(表12)に示されている。Ab 0070、0072、0073および0076は、0071および0077よりも強力な結合が実証された。
抗体およびFab断片のSPR分析
DR3の異なるドメインへの結合
DR3の細胞外部分は、DR3のアミノ末端部分に位置し、4つのTNF受容体システインリッチドメインで構成される。ヒトIgG4のFcドメインと融合した長さが増加したDR3の細胞外ドメインの一部を含有するいくつかの融合タンパク質を発現させ、精製した。SPR分析のために使用したDR3タンパク質は、オリゴマー形成した材料を排除するために精製しておいた。これらのタンパク質を、アミンカップリング化学を用いてCM5センサーチップに固定化した。0070、0072、0073および0076と称される抗DR3抗体の、異なるDR3-Fc融合タンパク質との結合を、Biacore T100計器(GE Healthcare)でプラズモン表面結合測定によって試験した。これらの抗体の全てが、FACSアッセイにおいて、TL1AとDR3の結合を阻害する。これらの4種の抗体は、DR3のアミノ酸25〜71で構成されるアミノ末端CRD(配列番号2)のみを含有する組換えDR3(CRD1)-Fcタンパク質に結合した。TL1AとDR3の結合を阻害しなかった別の抗体0077は、DR3(CRD1)-Fc(配列番号2)には結合しなかったが、DR3のアミノ酸25〜90を含有するDR3(CRD1+A1)-Fc(配列番号3)には結合し、これは、そのエピトープまたはそのエピトープの少なくとも一部が、アミノ酸77から90の間に位置することを示している。
Biacore T200計器(GE Healhtcare)で実験を実施し、Biacore T200 Evaluation Softwareを使用して解析した。抗ヒトIgG抗体(GE HealthcareからのヒトIgG捕捉キット)を、製造者の説明書に従ってCM5センサーチップの全てのフローセル上に固定化した。0.1%のヒト血清アルブミンを伴うHBS-EP(GE Healthcare)をランニングバッファーとして使用した。DR3(CRD1)-Fc(配列番号2)を14RUおよび45RUの間の低表面密度でチップ上に捕捉した。Fab断片を90nMから0.037nMの間の濃度まで希釈し、その後、360秒にわたって注入した。標準の解離時間は900秒であったが、親和性が高いので、正確なkd値を決定するために、最高濃度に対して最大13000秒まで延長した解離時間を適用した。25℃、30μL/分から60μL/分の間の流速で結合曲線を測定した。
Biacore T200計器(GE Healthcare)で実験を実施した。抗ヒトIgG抗体(GE HealthcareからのヒトIgG捕捉キット)を、製造者の説明書に従ってCM5センサーチップの全てのフローセル上に固定化した。0.1%のヒト血清アルブミンを伴うHBS-EP(GE Healthcare)をランニングバッファーとして使用した。DR3(ECD)-Fc(配列番号7)を、700RUから1200RUの間の表面密度で捕捉した。Fab断片を20μg/mLの濃度で使用した。2つのFab断片の二重注入を、それぞれ300秒および150秒にわたって実施し、その後、3MのCaCl2を2×20秒用いて再生した。Fab断片の結合応答を、Scrubber(BioLogic Software)を用いて解析した。
Table 16(表16)に示されている通り、Fab断片228、231、230および148を、0107(0228のMab)および0121(148のMab)の、Mabの、DR3を発現している細胞との結合を遮断する能力についてFACSで試験した。Fab断片230および231は、Mabのいずれとも競合することができず、Mab 017およびMab 0121と同時に結合することができる。
DR3の突然変異誘発によるFab-0228のエピトープマッピング
ヒトDR3のCRD1内のどのアミノ酸が-0123 Fabとの相互作用に関与するかを決定するために、数種のDR3突然変異体を生成した。3つの突然変異、R29Q、I43NおよびL45Vを部位特異的突然変異誘発(Quikchange、Stratagene)によって作出した。突然変異したDR3発現プラスミドおよびNFカッパB-Lucレポータープラスミドを、HEK293細胞に一過性にトランスフェクトし、細胞を抗DR3抗Fab-0228と一緒に短時間プレインキュベートし、その後、ヒトTL1Aを用いて4時間にわたって刺激した。ルシフェラーゼ活性を、Steady-GLO(Promega)を使用することによってアッセイし、TopCount NXT(Perkin Elmer)でモニターした。R29Qは、ヒト野生型よりもわずかによく中和したが、I43N、L45Vの両方および複合突然変異体I43N/L45Vは、はるかに低い効率で中和した(Table 17(表17)を参照されたい)。
抗DR3のヒト化
0072の配列を、ハイブリドーマ27F44A2のクローニングから得た。本実施例で使用される番号付けは全て、Kabat番号付けスキームを指す。
>0072VH(CDRが太字で示されている)(配列番号10)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCSASGFAFSNYDMSWVRQTPEKRLEWVAAFSSDGYTFYPDSLKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLGSEDTALYCCARHADYANYPVMDYWGQGTSVTVSS
>0072VL(CDRが太字で示されている)(配列番号11)
DIVLAQSPASLLVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTMLELKR
- 遮蔽の外側の残基はヒトとみなす。
- 遮蔽の内側およびKabat CDRの内側の残基はマウスとみなす。
- マウス/生殖系列コンセンサスを有する遮蔽の内側およびKabat CDRの外側の残基は、コンセンサス配列とみなす。
- マウス/生殖系列差異を有する遮蔽の内側およびKabat CDRの外側の残基は、潜在的な復帰突然変異に共する。
1. >hz0072VH(配列番号28)
2. EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQATGKGLEWVSAFSSDGYTFYP
3. GSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARHADYANYPVMDYWGQGTLVTVSS
4.
5. >hz0072VL(配列番号29)
6. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLES
7. GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK
hz0072VH:T28A、S49A、Y91C
hz0072VL:Q3V、M4L、T5M、S60A
復帰突然変異を挿入することの潜在的な利点を、発現、効力および親和性スクリーニングに基づいて、ならびに生物物理学的な特徴付けによって評価した。
LC:T5AおよびS60A
HC:T28AおよびS49A
ヒト化Fabの熱安定性を、示差走査型蛍光定量法(DSF)を使用して測定した。DSFはMyiQ Real-Time PCR検出システム(Biorad Laboratories, Inc)を使用して実施した。pH7.4、最終濃度0.3mg/mlのPBS中の試料を密閉した96ウェルPCRプレートに入れ、色素Sypro Orangeの2000倍希釈した原液を用いてタンパク質アンフォールディング転移をモニターした。蛍光強度を励起/発光波長:480/575nmで測定した。Table 20(表20)は、ヒト化Fabの熱安定性を示す。結果は、復帰突然変異を有する2つのFab(228および229)が71℃において同じ熱安定性(Tm)を有したが、復帰突然変異を有さないヒト化Fab(227)は66℃で熱安定性が低下したことを示す。
ヒト化FabのIgG1アイソタイプおよびIgG4アイソタイプを、pH7.4、PBS中3mg/mlでBioanalyserを使用して測定して、断片化パターンを調べた。断片化パターンを調べるためにAgilent 2100 Bioanalyzerを用いた。キットはAgilent Protein 230であり、使用したマーカーは7つのピークを伴うProtein 230 Ladderであった。試料2μl、Mill-Q水2μl、試料バッファー2μlおよび0.5MのN-エチルマレイミド(NEMをCH3CNに溶解させた)1μlを用いて非還元試料を調製した。全ての試料を最大5分間100℃まで加熱した。
8. >hz0072VH_S49A(配列番号16)
9. EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYDMSWVRQATGKGLEWVAAFSSDGYTFYP
10. GSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARHADYANYPVMDYWGQGTLVTVSS
11. >hz0072VL(配列番号17)
12. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLES
13. GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK
組換えFab断片の精製:
組換えFab断片を、Akta Explorer FPLCシステム(GE Healthcare)を使用して、クロマトグラフィーのステップによって精製した。組換えマウスFabを含有する細胞培養物の上清を、伝導率を2mS未満に低下させるために希釈した。Fab断片の理論的なpHに応じて、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを、MonoQカラムまたはMonoSカラム(GE Healthcare)を使用して実施した。Fab断片を、5から8.5の間のpH値、低イオン強度のバッファー中、カラムに結合させ、最大1MのNaClの塩勾配を用いて溶出した。Superdex200カラム(GE Healthcare)、およびバッファーとしてPBSを用いてゲル濾過を実施して、オリゴマーFab複合体を除去した。
Fab断片を、Pierce Fab Preparation Kit(Thermo Scientific)を製造者の説明書に従って使用してmAbを切断することによって生成した。いくつかの場合には、Superdex200カラム(GE Healthcare)、およびバッファーとしてPBSを用いたゲル濾過を実施して、高分子量形態を除去した。
一次ヒトT細胞からのサイトカインの放出または一次ヒトT細胞の増殖
CD4 Rosettesep(Stem cell technologies)およびHistopaque(Sigma)を使用して、磁気ビーズ分離によってバフィーコートから単離されたCD4+T細胞を、TCR活性化の不在下で、サイトカインIL-12(2ng/ml)、IL-18(50ng/ml)を用いて、100ng/mlのTL1A(Flag-His-TEV-TL1A;Novo Nordisk)を伴った状態および伴わない状態で刺激した。T細胞の増殖およびサイトカインの放出を測定した。48時間にわたって刺激したCD4+T細胞(ウェル当たり細胞2×105個)からの上清を回収し、サイトカインの放出について、Bioplexによって分析した。5日後にT細胞の増殖を測定した。
脂質部分とFabのコンジュゲート
NAP-25カラム、cat番号17-0852-02、GE Healthcare製
Hitrap Q-sepharose FFカラム(コード:17-5156-01)、GE Healthcare製
TSPP:トリフェニルホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸三ナトリウム塩水和物、cat番号39538、Alfa Aesar製
TDSPP:ビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩、cat番号151888-20-9、Strem Chemicals製
TEA:トリエタノールアミン、製品番号:90279、Sigma製
エチレングリコール、cat番号1.00949.1000、MERCK製
NaCl:コード:207790010、Acros Organics製
EDTA、二ナトリウム塩、二水和物、cat番号SC-29092、ChemCruz製
PBSタブレット、cat番号18912-014、GIBCO製
Vivaspin 20、10000 MWCO、PES膜、cat番号VS2001、Sartorius製
PD10 G-25カラム、cat番号17-0851-01、GE Healthcare製
CV:カラム体積
FLD:蛍光検出
MQ:MilliQ水(高度に精製された水)
m/z:質量電荷比
MS:質量分析
M+H:単独でプロトン化された種の質量
HPLC:高圧液体クロマトグラフィー
RP:逆相
LC-MS:液体クロマトグラフィー-質量分析
NMR:核磁気共鳴分光法
rtまたはRT:室温
Boc:tert-ブチルオキシカルボニル
O-t-Bu:tert-ブチルエステル
t-Bu:tert-ブチル
DCM:ジクロロメタン、CH2Cl2、塩化メチレン
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
Fmoc:9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Lys(Mtt)-OH:(S)-6-[(ジフェニル-p-トリル-メチル)-アミノ]-2-アミノ-ヘキサン酸
Thx:トランス-4-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
NMP:N-メチルピロリジン-2-オン
OEG:(2[2-(アミノ)エトキシ]エトキシ)酢酸
TFA:トリフルオロ酢酸
THF:テトラヒドロフラン
TIS:トリイソプロピルシラン
TNBS:トリニトロベンゼンスルホン酸
HC:重鎖
LC:軽鎖
wt:野生型
アミノ酸の略語はIUPAC慣用名に従う。
バッファーの略語は、Stoll, V. S.およびBlanchard, J. S.、Methods of Enzymology、182、1990、Academic Press、24-38に従う。
重鎖(HC)のC末端のまたはその近くの不対のシステインを有する、疎水性延伸性基とコンジュゲートするためのFabを構築した。このシステインは、例えば、マレイミドまたはハロ-アセチル基を担持する硫黄親和性アルキル化試薬とコンジュゲートするためのものであった。Fabを、突然変異したCysとジスルフィド結合したシステイニル化(cysteinylation)を伴う分子として発現させた。突然変異したCysを、アルキル化試薬との反応のために遊離させるために、ホスフィン試薬を使用して還元した。還元した後、タンパク質を還元試薬から分離し、アルキル化試薬を加えることによってアルキル化に供した。最後に、コンジュゲートを、標準の低圧クロマトグラフィーによって精製した。
PBSバッファー中Fab 0120(25mg、0.53μmol、4.2mg/ml)を、20mMのトリエタノールアミン、2mMのEDTA、pH8.5中トリフェニルホスフィン-3,3',3''トリスルホン酸三ナトリウム塩水和物(TSPP、40mg/ml、350μl、最終濃度3.7mM)の溶液と混合した。反応混合物を、r.t.で150分にわたってインキュベートした。次いで、平衡化した3つのNAP-25カラムでバッファーを交換することによって小分子量物質を除去し、20mMのトリエタノールアミン、2mMのEDTA、400mMのNaCl、pH8.5を用いて溶出した。次いで、バッファーを交換した還元Fab溶液を、20mMのトリエタノールアミン、2mMのEDTA、400mMのNaCl、pH8.5中アルブミン結合剤I(490μl、16mM、最終濃度:0.8mM)の溶液と混合した。反応混合物(およそ9.5ml)をr.t.で20時間にわたってインキュベートし、次いで、20mMのトリエタノールアミン、10%エチレングリコール、pH8.0のバッファー10mlで希釈した。その後、混合物について、20mMのトリエタノールアミン、10%エチレングリコール、pH8.0で平衡化した4つのNAP25カラムでバッファーを交換した。バッファーを交換した材料を、Akta Puifier 100システム(GE Healthcare)を使用して、20mMのトリエタノールアミン、10%エチレングリコール、pH8.0で平衡化した5mlのHitrap Q-セファロースFFカラムにローディングした。結合していない材料(コンジュゲートしていないFabを含む)を、このバッファーを用いて洗い落とし、生成物を、20mMのトリエタノールアミン、10%エチレングリコール、1MのNaCl、pH8.0の直線勾配を用いて1.5時間にわたって溶出した。生成物はおよそ380mMのNaClで溶出し、ピークプロファイルは対称であった。関連性のある画分をプールし、Vivaspin 20デバイスを3500g(10000 MWCO、Sartorius)で使用して限外濾過によって濃縮し、最終的にバッファーをPBSバッファーに交換した。最終的な単離された生成物は、A280測定によって決定したところ11.9mg(48%)、濃度1.7mg/mlであった。SDS-PAGEおよびMS分析により、生成物の同一性が確認された(実測m/z 49919(M+H)、算出 49917(M+H))。
アルブミン結合剤II〜VIは、以下に示される構造を有する。
以下のFabをコンジュゲートした:0118、0119、0127、および0147(Table 25(表25)参照)。これらのFabは、C末端に、または0157の場合ではC末端の近くに不対のシステイン残基を含有した。FabはIgG1またはIgG4に由来し、全てDR3受容体に結合する異なるクローンに対応した。上記の方法に従って反応させたところ、LC-MSデータによるとコンジュゲートが好収量で形成された。以下のMSデータを得た(Table 24(表24))。
主要な目的は、DBA/1マウスにiv投与した後およびsc投与した後の薬物動態パラメータを特徴付けることであり、主要な焦点は、Fab断片を改変した後の延長の程度を評価するために、終末相半減期に当てられた。
2つの試験からの結果が本概要に含まれる(DKPF111105およびDKPF110703)。どちらの試験も、雄のDBA/1マウスにおいて実施し、マウスに、尾静脈内への静脈内(i.v.)投薬または鼠径部に皮下(s.c.)投薬した。投薬はFabについては5mg/kgであり、改変されたFabについては1mg/kgであった。スパースサンプリングデザインを使用し、各試料採取時点で3つの血液試料を採取し、試料を投薬前から、化合物に応じて投薬の7日後まで採取した(例えば、Fabを試験する場合は投薬の7時間後までのみ試料を採取したが、コンジュゲートしたFabを試験する場合には投薬の7日後まで試料を採取した)。
Fabの終末相半減期を延長するために、アルブミン結合技術に基づいていくつかの異なるリンカーを評価し、分子のいくつかについてFabの終末相半減期を20時間超まで増加させることが可能であった(Table 26(表26))。Fabの半減期は1時間未満であると推定され、これは、Fabと、全てがはるかに長い半減期を示しているコンジュゲートしたFabとを比較した差異を例示している(Table 26(表26))。
抗DR3活性の決定の仕方としてのインターフェロン-ガンマ放出の読取り
新鮮なヒト末梢血単核球(PBMC)を、血液バフィーコート(307 Hospital Blood Center of PLA;Beijing、PRC)から、Ficoll(GE Healthcare、Cat番号17-5442-02)において2000rpmで20分間遠心分離することによって分離した。DPBS中で洗浄した後、細胞ペレットを吸引し、予め温めたアッセイ培地(RPMI1640、10%熱失活させたFBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)に、1ml当たり1×106個で再懸濁させ、フラスコ内で一晩培養した。次いで非接着性リンパ球を取り出し、T細胞同時刺激アッセイに使用した。
抗DR3抗体Fabは、関節リウマチ患者の滑液中のエフェクターT細胞のTL1Aによる同時刺激を遮断する
ヒト化抗DR3 Fabは、前の実施例において健康な個体の末梢血から単離された一次T細胞の活性を阻害することが示された。さらに、一部のFabについても、関節リウマチ(RA)患者に由来する滑液T細胞のエフェクター機能を遮断するそれらの能力について評価した。T細胞のエフェクター機能としては、これらに限定されないが、本実施例において分析したIFN-γ分泌が挙げられる。分泌されるIFN-γのレベルを、実施例18に記載のものと同じELISAキットによって測定した。
抗DR3 FabのHX-MSによるエピトープマッピング
HX-MS技術は、タンパク質の水素交換(HX)が質量分析(MS)によって容易に追跡することができることを活用する。水素を含有する水性溶媒と重水素を含有する水性溶媒を交換することにより、タンパク質の所与の部位に重水素原子が組み込まれることによって1Daの質量が増加する。この質量増加を、交換反応のクエンチした試料において、質量分析によって時間に応じてモニターすることができる。重水素標識情報は、クエンチ条件下、生じたペプチドの質量が増加した後にペプシン消化することによってタンパク質内の領域に亜局在させることができる。
hDR3:Fcと融合したhDR3の完全な細胞外ドメイン(配列番号7)。この分子は、Fcの二量体形成に起因して、hDR3に関して二量体である。発現バッチはタンパク質のオリゴマー形成型も含有するが、精製された二量体の画分のみをHX-MS実験に使用した。
HX実験を、nanoACQUITY UPLC Systemで、HDX Technology(Waters Inc.)をSynapt G2質量分光計(Waters Inc.)と合わせて用いて実施した。Waters HDXシステムは、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc/Waters Inc.)により操作されるLeap robot(H/D-x PAL;Waters Inc.)を含有し、これにより、重水素交換反応の開始、反応時間の制御、クエンチ反応、UPLCシステムへの注入および消化時間の制御を実施した。Leap robotは2つの温度制御スタックを備えており、それぞれ、バッファー貯蔵およびHX反応のために20℃に維持され、タンパク質およびクエンチ溶液の貯蔵のために2℃に維持される。Waters HDXシステムは、プレカラムおよび分析用カラム、ならびにLC管材料および切り換え弁を1℃で保持する温度制御チャンバーをさらに含有した。別々に温度制御されたチャンバーにはペプシンカラムが25℃で保持される。インラインペプシン消化物のために、200pmolのhDR3を含有するクエンチした試料100μLをローディングし、25℃に置いたPoroszyme(登録商標) Immobilized Pepsin Cartridge(2.1×30mm(Applied Biosystems))を、100μL/分の定組成流速(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)を用いて通過させた。生じたペプチドを捕捉し、VanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))で脱塩した。その後、弁を切り換えて、プレカラムを分析用カラムUPLC-BEH C18 1.7μm(1×100mm(Waters Inc.))とインラインに置き、nanoAQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から200μl/分で送達される10〜40%のBの9分勾配を用いてペプチドを分離した。移動相は、A:0.1%ギ酸およびB:CH3CN中0.1%ギ酸からなった。ESI MSデータ、および別々の上昇エネルギー(MSE)実験を、Synapt G2質量分光計(Waters Inc.)を使用して陽イオンモードで獲得した。ロイシン-エンケファリンをロックマス([M+H]+イオン、m/z 556.2771)として使用し、データを連続モードで収集した(さらなる説明については、AndersenおよびFaber、Int. J. Mass Spec.、302、139-148(2011)を参照されたい)。
消化性ペプチドを、別々の実験において、ペプチドおよび断片を、Synapt G2(Waters Inc.)のイオン移動性を利用してさらにアラインメントする標準のMSE方法を用いて同定した。MSEデータを、ProteinLynx Global Server version version 2.5(Waters Inc.)を使用して処理した。HX-MSの生のデータファイルをDynamXソフトウェア(Waters Inc.)で処理した。DynamXでは、ロックマス補正および重水素の組込み決定、すなわち、重水素化されたペプチドの質量中心決定が自動的に実施される。さらに、全てのペプチドを手動で検査して、ソフトウェアによる正確なピークおよび重水素化の割当てを確実にした。
アミドの水素/重水素交換(HX)を、hDR3をFab 0120、0130、0143、0148、0163、0228、0230または0231の存在下または不在下で、対応する重水素化されたバッファー(すなわち、D2O中、最終的に96% D2O、pH7.4(未補正の値)に調製したPBS)に7倍希釈することによって開始した。HX反応は全て20℃で行い、2μMのhDR3を10μMのFabの不在下または存在下で含有し、したがって、Fabを5倍モル過剰にした。10秒〜3000秒の範囲の適切な時間間隔で、HX反応物のアリコート50μlを、氷冷したクエンチングバッファー(1.35M TCEP)50μlでクエンチし、最終的にpH2.5(未補正の値)にした。
hDR3細胞外ドメインの一次構造の75%を包含する20種の消化性ペプチドのHX時間経過を、0120 Fab、0130 Fab、0143 Fab、0148 Fab、0163 Fab、0228 Fab、0230 Fabまたは0231 Fabの不在下または存在下で、10〜3000秒モニターした。hDR3は、N67位およびN106位に2つのN-グリコシル化部位を含有し、したがって、ペプチドマップはこれらの領域にギャップを有する。
Fab 0148および0163は、hDR3に結合するが、TL1Aの結合を遮断しないFab分子である。これらのFab分子を対照として試験に含めた。エピトープシグナルはFab 0148のCRD3の領域P140〜L153において観察された(Table 29(表29))。この実験は5倍余剰のFabを用いて実施したが、0148とhDR3の等モルの配分を用いたHX-MS実験では、このFabを標準の等モル条件下でマッピングすることができることが確認される。
Fab 0228は、いくつかの実験において、3〜5倍余剰のFab分子を使用してマッピングされた。エピトープシグナルはCRD1の領域R32〜G54、G37〜L45およびF46〜A59で観察された。しかし、消化性ペプチドの交換保護の相対的なレベル、および領域F46〜Y56における交換保護が弱いことまたは存在しないことに基づいて、0228に対するエピトープは領域G37〜L45およびL57〜A59において最も強力であると結論づけられる。領域G37〜L45は、突然変異誘発によって0228/0123とhDR3との結合に重要であることが見いだされた残基も包含し、したがって、これらの実験からのデータは完全に一致する(実施例12、Table 16(表16))。驚いたことに、hDR3と比較して非常に余剰な0228 Fabを使用することが必要であった。通常は、HX-MSによってエピトープマッピングを実施する場合には等モル比のmAbまたはFabを使用することで十分である。0228とhDR3の等モルの配分を用いると、0228が非常に高い親和性を有するにもかかわらず(実施例11、Table 14(表14))、エピトープシグナルは観察されなかった(データは示していない)。これらの知見は、0228エピトープが、実験条件下で完全には溶媒を利用できない領域にあることを示す。したがって、0228の親和性が高いにもかかわらず交換保護が低いことは、Fab分子がhDR3自己相互作用の優位に現れるか、またはそれと競合している結果であり得る。hDR3自己相互作用は、例えばTNFRスーパーファミリーの他のメンバーについて記載されている通り(Mukaiら(2010)Sci. Signal.3、ra83)、細胞外ドメインの非特異的な凝集の帰結またはクラスター化の帰結であり得る。さらに、C末端領域において弱い作用を観察することができた。0228および0120は、CRD1のみを含有するタンパク質と結合する場合には完全な親和性を有するので(実施例11、Table 14(表14))、C末端の作用は、大概、Fabが結合した際のコンフォメーション再配置の結果であり、DR3とFcを融合しているヒンジ領域内の移動の結果であってよい。
Fab 0230および0231(WO2011106707からの11H08)に対するエピトープマッピングでは、いかなるエピトープも示されなかった。hDR3に対するエピトープマッピングを上首尾にするためには良好な親和性が必要であるという上記の知見を考慮すると、これらのFab(WO2011106707)の親和性が比較的弱いことがHX-MSによる上首尾のエピトープマッピングを妨げると推測することができる。
本明細書に記載の抗体の概要
Table 30(表30)は、本明細書に記載の抗体の概説および使用した異なるmAb/Fab形式に応じたそれらの名称を提供している。命名法の注釈:Table 30(表30)では4桁の識別(例えば、0228)が使用される。しかし、同じ化合物について異なる命名法が見られる場合がある。例えば、化合物0228は、0227-0000-0228、0227-0228、00228、または228とも称される。これらの命名法は全て同じ化合物を示す。この規則は全ての化合物に適用される。
結合実験
材料および方法:Copenhagen Hospitalからの正常な健康なボランティアからバフィーコートを得た。CD4+T細胞を磁気ビーズ分離によって単離した。細胞を、2ng/mlのIL-12、50ng/mlのIL-18および100ng/mlのTL1A(Novo Nordisk A/Sで作製されたFlag-HIS-TEV-TL1A)を用いて活性化し、5日間培養した。5日目に、細胞を10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/mlまたは0.0001μg/mlの抗DR3 mAbクローン0072、0073、もしくは0077を用いて、またはFab断片クローン0087、0088もしくは0091を用いて染色した。二次PEコンジュゲートヤギ抗マウス(H+L)を検出のために使用した。試料は2連であった。染色強度をFACSによって評価した。
T細胞の増殖:
CD4+T細胞を、CD4 Rosettesep(Stem cell technologies)およびHistopaque(Sigma)を使用して、磁気ビーズ分離によってバフィーコートから単離した。T細胞(96ウェルプレート中ウェル当たり細胞2*105個)を、2ng/mlのIL-12、50ng/mlのIL-18および100ng/mlのTL1A(Flag-HIS-TEV-TL1A;Novo Nordisk)を用いて、抗TL1A(1000ng/ml;MAB7441;RnDSystems)またはDR3 mAbまたはDR3 Fab(5または10μg/ml)を伴った状態および伴わない状態で、5日間活性化した。使用したDR3 mAbは、0072、0073および0077であった。使用したDR3 Fabは、0087、0088および0091であった。全ての試料を3連で行った。細胞増殖をチミジンの組込みによって測定した。細胞を、5日間活性化した後に[3H]チミジンでパルスし、16時間後に回収した。組み込まれたチミジンを、Top計数器によって1分当たりの数(cpm)として検出した。
CD4 Rosettesep(Stem cell technologies)およびHistopaque(Sigma)を使用して、磁気ビーズ分離によってバフィーコートから単離されたCD4+T細胞を、TCR活性化の不在下でサイトカインIL-12(2ng/ml)、IL-18(50ng/ml)を用いて、100ng/mlのTL1A(Flag-His-TEV-TL1A;Novo Nordisk)を伴った状態および伴わない状態で刺激した。活性化されたCD4+T細胞(ウェル当たり細胞2×105個)由来の上清を48時間後に回収し、サイトカインの放出について、Bioplexによって分析した。
クローン病患者からの腸生検材料から単離された粘膜固有層単核球を使用した機能的試験
Claims (25)
- DR3とTL1Aの結合を遮断し、その二価の形態がDR3とTL1Aの結合を遮断する作動性抗体である、一価の拮抗性DR3抗体。
- WO2011106707に記載の11H08抗体のCDR配列(配列番号14+15)を有する抗体ではない、請求項1に記載の一価抗体。
- 親油性部分とコンジュゲートした、請求項1または2に記載の一価抗体。
- 前記親油性部分が、-(CH2)n-CO-脂肪族アシル基を含み、nが16〜18である、請求項3に記載の一価抗体。
- 前記親油性部分が、-(CH2)n-CO-脂肪族アシル基を含み、nが15である、請求項3に記載の一価抗体。
- 式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、および(VI):
- 前記親油性部分が、抗体の重鎖の天然に存在するC239(Kabat番号付け)システイン残基に親水性スペーサーを介して結合している、請求項3から6のいずれか一項に記載の一価抗体。
- 配列番号1のI43および/またはL45を含むDR3上のエピトープに結合する、請求項1から7のいずれか一項に記載の一価抗体。
- 配列番号1に記載のアミノ酸G37〜L45の少なくとも1つおよびアミノ酸L57〜A59の少なくとも1つを含むDR3上のエピトープに結合する、請求項1から8のいずれか一項に記載の一価抗体。
- 前記エピトープが、配列番号1に記載のアミノ酸G37〜L45およびアミノ酸L57〜A59を含む、請求項9に記載の一価抗体。
- 前記リガンドがFab断片である、請求項1から10のいずれか一項に記載の一価抗体。
- DR3に1nM未満の解離定数で結合する、請求項1から11のいずれか一項に記載の一価抗体。
- ヒトDR3のCRD1ドメインに結合する、請求項1から12のいずれか一項に記載の一価抗体。
- 配列番号10に記載の3つのCDR配列および配列番号11に記載の3つのCDR配列を含む一価抗体。
- ヒトフレームワーク、配列番号16に記載のCDR3配列および配列番号17に記載のCDR3配列ならびに重鎖における「S49A」復帰突然変異を含む一価抗体。
- 配列番号16に記載の3つのCDR配列および配列番号17に記載の3つのCDR配列を含む、請求項15に記載の一価抗体。
- ヒトDR3との結合について「0228」一価抗体と競合し、0228の重鎖のアミノ酸配列が配列番号16に記載のものであり、0228の軽鎖のアミノ酸配列が配列番号17に記載のものである、請求項1から16のいずれか一項に記載の一価抗体。
- RA患者由来の滑液細胞におけるIFN-ガンマ(IFN-γ)の放出を減少させ、前記滑液細胞がTL1Aで同時刺激される、請求項1から17のいずれか一項に記載の一価抗体。
- CD患者からの腸生検材料由来の粘膜固有層単核球(LPMC)における1種または複数種のサイトカインの放出を減少させ、前記サイトカインが、TNF-α、IL-6、GM-CSF、およびIFN-ガンマ(IFN-γ)からなる一覧から選択され、前記LPMCがTL1A、IL-12、およびIL-18で同時刺激される、請求項1から18のいずれか一項に記載の一価抗体。
- CD4+T細胞における1種または複数種のサイトカインの放出を減少させ、前記サイトカインが、TNF-α、IL-6、GM-CSF、およびIFN-ガンマ(IFN-γ)からなる一覧から選択され、前記T細胞がTL1Aにより同時刺激される、請求項1から19のいずれか一項に記載の一価抗体。
- IgG4型抗体である、請求項1から20のいずれか一項に記載の一価抗体。
- 請求項1から21のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
- 炎症性疾患を治療するための、請求項1から21のいずれか一項に記載の一価抗体、または請求項22に記載の医薬組成物の使用。
- クローン病(CD)を治療するための、請求項1から21のいずれか一項に記載の一価抗体、または請求項22に記載の医薬組成物の使用。
- 関節リウマチ(RA)を治療するための、請求項1から21のいずれか一項に記載の一価抗体、または請求項22に記載の医薬組成物の使用。
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