MX2010014364A - Anticuerpos anti-gd2 y metodos y usos relacionados con los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente describe anticuerpos que específicamente unen gangliósido GD2. También se describen nucleótidos que codifican dichos anticuerpos, células que expresan dichos anticuerpos, métodos de uso para dichos anticuerpos, y métodos para utilizar los anticuerpos para tratar enfermedades asociadas con gangliósido GD2. Además, se describen suplementos de medio de cultivo de tejido así como métodos de uso para los suplementos. La presente describe conjugados de albúmina-gangliósido y métodos correspondientes para producir dichos conjugados. También se describen métodos para purificar o aislar anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS ANTI-GD2 Y MÉTODOS Y USOS RELACIONADOS CON LOS MISMOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/077,041, presentada el 30 de Junio de 2008, y la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/097,034, presentada el 15 de Septiembre de 2008, las cuales, ambas, están incorporadas a la presente invención como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general al campo de los agentes inmunoterapéuticos. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que enlazan gangliósidos y métodos para utilizar dichos anticuerpos para tratar a sujetos que necesitan de dicho tratamiento. También se proporcionan métodos para utilizar los anticuerpos descritos para propósitos de diagnóstico y terapéuticos. Además, también se proporcionan anticuerpos, así como métodos para purificar o aislar los anticuerpos descritos.

Antecedentes de la Invención El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. El Instituto Nacional de Cáncer (NCI) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos, estiman que aproximadamente 50,000 individuos morirán de cáncer y aproximadamente 1.4 millones de individuos serán diagnosticados con cáncer en el 2008. En países como el Reino Unido, los Estados Unidos, y otros que hacen la investigación relacionada con el cáncer como una prioridad superior, existe un esfuerzo de investigación global para desarrollar métodos de tratamiento contra cáncer y para aumentar la comprensión general de cómo prevenir el mismo. Por ejemplo, el NIH ha destinado alrededor de 5 billones de dólares en fomentar la investigación relacionada con cáncer durante el año fiscal del 2008, casi dos veces la cantidad de financiarniento proporcionada para otras enfermedades severas, tal como HIV y enfermedad cardíaca.

Existen aproximadamente 100 diferentes tipos de cáncer. A pesar de la amplia variedad de cánceres, la mayor parte de las muertes relacionadas con cáncer son originadas por unos cuantos cánceres comunes, tal como cáncer de pulmón, cáncer colorrectal y cáncer de mama. El NCI estima que estas tres formas de cáncer originarán aproximadamente 250,000 muertes en el 2008. Aunque no tan mortal como los cánceres mencionados anteriormente, el cáncer de piel representa aproximadamente la mitad de los cánceres diagnosticados recientemente en los Estados Unidos, haciéndolo el tipo de cáncer más común. De los diversos tipos de cáncer de piel, el melanoma es el más raro y el más mortal. La Sociedad Americana de Cáncer, estima que aunque el melanoma abarca únicamente el 4% de todos los cánceres de piel diagnosticados en los Estados Unidos, origina el 79% de todas las muertes relacionadas con cáncer de piel.

Con frecuencia el tratamiento de cáncer exitoso es atribuido a un diagnóstico y tratamiento temprano. Un método poderoso para diagnosticar cáncer, es detectar marcadores de tumor conocidos como asociados con cáncer. Los marcadores de tumor son sustancias, con frecuencia proteínas, que son producidas por células de tumor, u otras células en el cuerpo en respuesta al cáncer. Los marcadores de tumor pueden encontrarse en la sangre, orina, en la superficie de las células de tumor o en otros tejidos y células no cancerígenas. Los gangliósidos han sido identificados como un tipo de marcador asociado con muchos tumores (Hakomori, 99 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 10718 (2002)).

Los gangliósidos son glucoesfingolípidos con al menos un ácido siálico enlazado por azúcar. Estos compuestos son componentes de las membranas de plasma celular y se considera que desempeñan un papel central en una variedad de funciones biológicas, tal como crecimiento celular, diferenciación celular, señalización celular y sirven como receptores para toxinas microbianas (Jacques, y asociados. 4 Org. Biomol. Chem. 142 (2006)). Se han identificado aproximadamente 40 diferentes gangliósidos, sin embargo, un cierto subgrupo de éstos, GM3, GM2, GD3 y GD2, son comúnmente sobreexpresados por células de tumor (Id). Además, se reportan a los gangliósidos como altamente inmunogénicos en humanos. La combinación de la alta inmunogenicidad y sobreexpresión mediante células de tumor hace a los gangliósidos, un objetivo potencial para terapias de cáncer.

Los anticuerpos monoclonales específicos de gangliósidos han sido desarrollados en algunos casos, revisados con respecto a la eficacia en humanos (ver de manera general las Publicaciones de Azuma y asociados, 13 Clin. Cáncer Res. 2745 (2007); Me, y asociados, 53 Cáncer Immunol. Immunother.' 110 (2004); Irie y Morton, 83 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 8694 (1986)). Uno de los reportes más tempranos con respecto a un anticuerpo específico de GD2, humano, fue elaborado por Cahan, y asociados. (79 Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 7629 (1982)). Los estudios de inmunoterapia han mostrado que los altos rangos de supervivencia se correlacionan con IgM específico de gangliósidos, en lugar de IgG, para pacientes vacunados con una vacuna de melanoma (Jones y asociados, 66 J. Nati. Cáncer Inst. 249 (1981 )). En forma consistente con este descubrimiento, los estudios en humanos que implican anticuerpo IgM para gangliósidos GD2 y GD3, han proporcionado resultados estimulantes para el uso de dichos anticuerpos como un posible tratamiento para (Irie, y asociados, 53 Cáncer Immunol. Immunother. 110; Irie y Morton, 83 Proc.

Nati. Acad. Sci. U.S. A. 8694 (1986)).

IgM es uno de los cinco isotipos de anticuerpo humano; IgG, IgA, IgE y IgD son los otros. IgM normalmente es el primer anticuerpo producido en la respuesta inmune humoral debido a que la posición de los genes constantes de cadena pesada IgM, permite que sea producido sin cambio de isotipo (Charles A. Janeway, y asociados. I mmunobiology 9-12 (5° edición 2001 )). Debido a que IgM con frecuencia se produce antes de que ocurra la maduración genética, esta clase de isotipo de anticuerpo normalmente tiene menor afinidad para un antígeno determinado de otros isotipos (Id). IgM compensa la baja afinidad formando polímeros, lo cual incrementa la avidez de la molécula de anticuerpo (Id). IgM polimérico normalmente se forma como un pentámero asociado con la cadena-J (una molécula -15 kD que promueve la polimerización del anticuerpo); sin embargo, también puede polimerizarse como un pentámero o hexámero en la ausencia de la cadena J (Id. en 4-19). En algunos casos, el estado polimérico de IgM le permite transmitir la activación altamente efectiva de la trayectoria de complemento en la presencia de patógenos. Por ejemplo, el IgM pentamérico que contiene la cadena-J normalmente no es efectivo para activar complementos a menos que pase por un cambio estructural cuando se vincula a un antígeno (Id. en 9-17). En contraste, el IgM hexamérico o libre de cadena-J ha mostrado activar el complemento hasta 100 veces mejor que IgM pentamérico (Weirsma y asociados, 160 J. Immunol. 5979 (1998)).

El cáncer es un problema de salud global. Aunque ha habido progreso en el tratamiento de diversas formas de esta enfermedad, se necesitan terapéuticos mejorados. Los inmunoterapéuticos se considera que tienen gran potencial para la terapia de cáncer. Un anticuerpo IgM específico para un antígeno expresado mediante células de cáncer, puede probarse en un terapéutico para cáncer efectivo.

Breve Descripción de la Invención Aquí se describen anticuerpos aislados y fragmentos de enlace de antígenos que enlazan específicamente al gangliósido GD2. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos son IgMs. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos son pentaméricos o hexaméricos. Aunque los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden ser humanos, humanizados o quiméricos, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos son preferentemente humanos. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido sustanciálmente igual o idéntica a la SEQ ID NO: 40, y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido sustanciálmente igual o idéntica a SEC ID NO: 42. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, y también tienen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido F\A/R1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14; y una secuencia de FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 15; y la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31.

En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12; una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28; una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos tienen una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12; una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 14; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15; y la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28; una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. Las distribuciones de enlace de antígeno de CDRs y FWRs también pueden construirse utilizando proteínas tipo anticuerpo como andamiaje CDR. Dichas proteínas de enlace de antígenos construidas están dentro del alcance de la presente descripción.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos descritos pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 40. En algunas modalidades, un polinucleótido sustancialmente igual o idéntico a SEC ID NO: 39 puede codificar esta secuencia de aminoácido de cadena pesada. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos descritos pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 42. En algunas modalidades, un polinucleótido sustancialmente igual o idéntico a SEC ID NO: 41 puede codificar esta secuencia de aminoácido de cadena ligera. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a la SEC ID NO: 40, y la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 42.

En algunas modalidades, los anticuerpos se producen mediante células que producen anticuerpos depositados con la Recolección de Cultivo Tipo Americano (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 16 de Julio del 2008, y se le ha asignado el No. de acceso PTA-9376. En algunas modalidades, los anticuerpos, o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, tienen una afinidad de enlace para GD2 de los anticuerpos producidos mediante las células que producen anticuerpos depositados. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos o los fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, comprenden la CDRs de cadena pesada y ligera de los anticuerpos producidos a través de las células que producen anticuerpos depositados. En algunas modalidades, los anticuerpos, o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, comprenden las regiones variables de cadena pesada y ligera o los fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, que comprenden las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos producidos a través de las células que producen anticuerpos depositados. En algunas modalidades, los anticuerpos, o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, exhiben un nivel igual o sustancialmente mayor de actividad citotóxica dependiente de complemento que los anticuerpos producidos a través de las células que producen anticuerpos depositados. Además, los anticuerpos, o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos, que compiten con los anticuerpos producidos a través de las células depositadas para enlazar a GD2, están contemplados para estar dentro del alcance de los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, un anticuerpo puede competir con otro anticuerpo, o un fragmento de enlace de antígeno, si evita u obstaculiza el que el otro anticuerpo enlace a un sitio antigénico al cual el anticuerpo de otra manera podría enlazar en la ausencia del anticuerpo de competición.

También se describen polinucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos que enlazan específicamente a GD2. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una secuencia CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2. En algunas, modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene el CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento de enlace de antigeno del mismo que tiene una cadena pesada con una CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3; y una CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una . CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; y una CDR3 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 codificada por una secuencia de nucleótido sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3; y una CDR3 codificada por una secuencia de nucleótido sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4; y una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; y una CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20. Las distribuciones de enlace de antígeno de CDRs también se pueden construir utilizando proteínas tipo anticuerpo como el andamiaje CDR. Dichas proteínas de enlace de antígenos construidas están dentro del alcance de la presente descripción.

En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la FWR1 de cadena pesada es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7; y una FWR1 de cadena ligera es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23.

En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3; y una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4; una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; y una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20; una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NÓ: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23.

En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y ligera, en donde los polinucleótidos codifican una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11,. por ejemplo SEC ID NO: 3; una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4; una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7; y una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20; una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23. Los polinucleótidos que codifican las proteínas de enlace de antígeno construidas también están dentro del alcance de la presente descripción.

Se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican anticuerpos y el fragmento de enlace de antígeno, como células que expresan los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos que enlazan específicamente a GD2.

Se describen métodos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con GD2 en un sujeto que necesita de dicho tratamiento. En algunas modalidades, la enfermedad asociada con GD2 es cáncer. En algunas modalidades, la enfermedad asociada con GD2 es melanoma. El método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza específicamente a GD2 en una cantidad efectiva para tratar o prevenir enfermedad asociada con GD2. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar la composición farmacéutica que incluye un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo y un transportador farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo es un anticuerpo IgM o fragmento de enlace de antígeno. En algunas modalidades, los métodos descritos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con GD2 en un sujeto, se pueden llevar a cabo con un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, que compite para enlazar con los anticuerpos específicos de GD2 aquí descritos.

Aquí se describen métodos para detectar células que expresan in vivo o in vitro. Los métodos pueden incluir administrar a un sujeto un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, del mismo descrito en la presente invención, que enlaza específicamente a GD2 para permitir la detección o localización en el sujeto. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos o fragmentos de enlace de antígenos pueden etiquetarse de manera detectable. Dichas etiquetas detectables pueden incluir etiquetas fluorescentes, radioetiquetas, biotina y similares. Como alternativa en algunas modalidades, los anticuerpos específicos de GD2 o fragmentos de enlace de antígenos no son etiquetados y en su lugar, son detectados por un anticuerpo secundario el cual es etiquetado en forma detectable. En algunas modalidades, los métodos de detección descritos se pueden llevar a cabo con un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno, que compite para enlazar con anticuerpos específicos de GD2 y fragmentos de enlace de antígenos aquí descritos.

Se describen en la presente invención métodos para elaborar y purificar o aislar anticuerpos IgM o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos. Los métodos incluyen cultivar una célula huésped bajo condiciones adecuadas para producir los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos, recuperar los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos del cultivo celular, y purificar o aislar los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos recuperados. Asimismo se presentan métodos para purificar o aislar anticuerpos IgM o fragmentos de enlace de antígenos, incluyendo opcionalmente lavar los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos con un detergente, aplicar una solución que comprende los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos a una columna de cromatografía de afinidad, aplicar el eluato de la columna de cromatografía de afinidad a una columna de cromatografía de intercambio de cationes, y aplicar el eluato de la columna de cromatografía de intercambio de cationes a una columna de cromatografía de hidroxiapatita y recuperar el eluato de la columna de cromatografía de hidroxiapatita.

Los métodos adicionales incluyen aumentar la viabilidad de las células eucarióticas cultivadas suplementando el medio de cultivo celular con composiciones que comprenden aminoácidos, azúcares y vitaminas. En algunas modalidades, las composiciones pueden comprender glucosa, glutamato, aspartato, serina, histidina, treonina, arginina, tirosina, cisteína, valina, metionina, triptofan, fenilalanina, isoleucina, leucina, Usina, prolina, amida de ácido nicotínico, HCI de piridoxina, ácido fólico, vitamina B12, riboflavina, y HCI de tiamina. Aquí también se describen métodos para mejorar la producción de proteínas mediante células modificadas para producir proteínas. En un aspecto, estos métodos incluyen suplementar al medio de crecimiento de las células con ácido valérico.

Se describen en la presente invención conjugados de proteína de albúmina, por ejemplo, albúmina de suero de bovino (BSA) y un gangliósido y métodos para producir dichos conjugados de proteína. En una modalidad, el gangliósido conjugado puede ser GD2. En una modalidad, el gangliósido conjugado puede ser GM2. En una modalidad, el gangliósido conjugado puede ser GM3. En una modalidad, la albúmina se conjuga a un extremo de reducción de una porción de carbohidrato de un gangliósido mediante aminación reductiva. En una modalidad, la aminación reductiva se cataliza mediante cianoborohidruro de sodio.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1, muestra una especificidad de antígeno variable de anticuerpos presentes en el sobrenadante de una combinación de linfoblasto humano transformado con virus Epstein-Barr (HLP) tal como se determina mediante ELISA. La figura 1A demuestra que los sobrenadantes de cultivo celular concentrados de HLP, en el pasaje de célula 2 (8.1X concentrado) o 4 (14.2X concentrado), contiene anticuerpos IgM específicos para GD2. La figura 1B demuestra que los sobrenadantes de cultivo celular del HLP contienen anticuerpos IgM que enlazan a los gangliósidos GD1a, GD2, GM2 y GM3.

La figura 2, muestra los niveles de enlace de anticuerpos IgM producidos a través de cultivo de célula HLP en células de melanoma 1205LU que expresan GD2, tal como se analiza mediante clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS). La figura 2A sirve como un control negativo, que muestra el enlace en la ausencia del anticuerpo primario específico de GD2. Las figuras 2B y 2C, muestran el enlace de IgM derivado de HLP obtenido de sobrenadantes de cultivo celular concentrados ya sea a 8.1X o 14.2X, respectivamente. La figura 2D muestra el enlace del anticuerpo IgM específico de GD2 de múrido, producido mediante hibridoma de murido HB-856.8™ (ATCC #HB 8568™) y sirve como un control positivo.

La figura 3, muestra un ELISA específico de antígenos que utiliza un medio gastado de los clones de hibridoma generados mediante hibridomas derivados de HLP. La figura 3A muestra características de enlace de los anticuerpos IgM contenidos en el medio de los hibridomas 3B2, 5D7 y 10B4 para los gangliósidos GD2, GD1 a, GM2 y GM3. La figura 3B muestra las características de enlace de los anticuerpos IgM contenidos en el medio del subclon de hibridoma 1470 para los gangliósidos GD2, G D 1 a, GM2 y GM3.

La figura 4, muestra niveles de enlace de anticuerpos IgM producidos mediante el hibridoma 3B2 y los cultivos de célula 1470 en células de melanoma GD2 que expresan GD2, tal como se analiza mediante FACS. La figura 4A, sirve como un control negativo que muestra la carencia de enlace en la ausencia del anticuerpo primario específico de GD2. La figura 4B, que sirve como un control positivo, muestra el enlace de un anticuerpo IgM específico de GD2 de múrido producido mediante células HB-8568™. Las figuras 4C y 4D muestran el enlace de IgM producido mediante células de hibridoma 3B2 y 1470, respectivamente.

La figura 5, muestra la muerte celular debido a la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) transmitida mediante IgM obtenida del sobrenadante de cultivo de tejido de hibridoma 3B2 o IgM humano no específico de GD2 (nhlgM).

La figura 6, proporciona una representación esquemática de la clonación de los segmentos de cadena pesada y ligera del anticuerpo AB527.

La figura 7, proporciona una representación esquemática del vector de expresión AB527.

La figura 8, ilustra la actividad de enlace de AB527 para los gangliósidos GD2, GM2 y GD3, tal como se mide mediante resonancia de plasmón de superficie.

La figura 9, proporciona una representación gráfica del equilibrio de enlace AB527 tal como se mide mediante resonancia de plasmón de superficie para diferentes concentraciones de anticuerpo enlazado a GD2.

La figura 10, muestra los patrones de manchado de diversos gangliósidos separados mediante cromatografía de capa delgada. El manchado orcinol muestra un manchado de ganglíósido no específico, que proporciona una base para comparación con manchado AB527.

La figura 11, muestra la citometría de flujo (columnas I y II) e imágenes de microscopio de luz y microscopio de inmunofluorescencia comparativos (columnas II y IV) de AB527 que enlaza a líneas de célula de melanoma humana que expresan GD2 (líneas de células: M14, M0023, M101, 18, M10-Vac, PM0496) o carencia de expresión GD2 (líneas negat¡vas-GD2: M21, M238, IMCD0023, MG1055).

La figura 12, proporciona una representación gráfica de una curva de enlace de saturación y el trazo Scatchard correspondiente que caracteriza el enlace de AB527 a células EL4.

La figura 13, muestra el manchado AB527 de líneas de célula de melanoma positivas GD2 (M 14) y negativas (MG1055, RPMI7951 y JS0592). Se llevó a cabo el análisis inmunohistoquímico utilizando AB527 biotinilado (figura 13A) o IgM de control, no específico de GD2, biotinilado (figura 13B).

La figura 14, muestra que las secciones de tumor M14 no son inmunorreactivas con hlgM biotinilado (14a), pero muestran inmunorreactividad con AB527 biotinilado (14b).

La figura 15 muestra una comparación de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) de células negativas GD2 o positivas GD2 transmitidas ya sea mediante IgM obtenido de hibridoma AB527-HYB-3B2-3C9 o AB527 IgM.

La figura 16, es una representación gráfica de CDC transmitida mediante AB527- en la presencia o ausencia de complemento, para células de tumor humano que expresan ya sea GD2 (M 14) o no expresan GD2 (1205LU).

La figura 17, ilustra el grado relativo de actividad CDC para IgM humano no específico, AB527, hlgG no específico y AB527 cambiado por isotipo que tiene una región constante lgG1.

La figura 18, muestra el grado relativo de actividad CDC para anticuerpos AB527 con o sin cadena-J (JC).

La figura 19, muestra la reducción de gel SDS-PAGE del sobrenadante de cultivo acondicionado tratado con detergente (CCS) aplicado a una columna de cromatografía de afinidad de proteína A (Load) y el material recolectado de las fracciones combinadas después de la elución mediante MgCI2 (Elute). Las flechas apuntan hacia la cadena pesada (~70kD) y cadena ligera (~25kD).

La figura 20, muestra una reducción del gel SDS-PAGE de AB527 capturado mediante diferentes cantidades de la resina de intercambio de cationes acroCap™ SP. Las flechas apuntan hacia la cadena pesada (~70kD) y cadena ligera (~25kD) IgM.

La figura 21, muestra cantidades relativas de diversas formas de AB527 IgM en el flujo (figura 21A) o eluato (figura 21B) recolectada después de la aplicación de diferentes volúmenes de intermediario AB527 a la resina de intercambio de cationes MacroCap™ SP.

La figura 22, ilustra cromatogramas para HPLC de exclusión por tamaño que verifica la distribución de tamaño del material presente en el flujo (figura 22A) y elución (figura 22B) de la columna MacroCap™ SP.

La figura 23, proporciona una representación gráfica del enlace AB527 al conjugado GD2-BSA.

La figura 24, proporciona una representación gráfica que compara el enlace AB527 a los conjugados GD2-BSA, GM2-BSA y GM3-BSA.

La figura 25, muestra una comparación de la densidad celular viable con el tiempo de células que expresan AB527 cultivadas en un medio con (suplemento de medio de cultivo (CMS)) y sin (control CD CHO) la adición de una modalidad del CMS.

La figura 26, muestra el porcentaje relativo de células viables con el tiempo para células que expresan AB527 cultivadas en un medio (CMS) y sin (control CD CHO) la adición de una modalidad del CMS.

La figura 27, muestra la densidad celular viable integral (IVC) con el tiempo para células que expresan AB527 cultivadas en un medio con (CMS) y sin (control CD CHO) la adición de una modalidad del CMS.

La figura 28, muestra la producción de anticuerpo total después de 14 días de cultivo para células que expresan AB527 cultivadas en un medio con (CMS) y sin (control CD CHO) la adición de una modalidad del CMS.

Descripción Detallada de la Invención Diversos de los términos que se relacionan con los aspectos de la presente descripción, se utilizan a lo largo de la especificación y reivindicaciones. A dichos términos se les proporcionará su significado ordinario en la técnica, a menos que se indique de otra manera. Se construirán otros términos definidos de manera específica, en una forma consistente con las definiciones aquí proporcionadas.

Tal como se utiliza en la presente especificación en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células, y similares.

El término "aproximadamente" tal como se utiliza en la presente invención, cuando se refiere a un valor medióle tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, significa que comprende variaciones de hasta ± 20% del valor específico, ya que dichas variaciones son adecuadas para llevar a cabo los métodos descritos. A menos que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc. utilizadas en la especificación y reivindicaciones, serán comprendidas como estando modificadas en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente especificación y reivindicaciones adjuntas, son aproximaciones que puedan variar ' dependiendo de las propiedades deseadas que se pueden obtener en la presente invención. Por último, y no como un intento de limitar aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe ser construido al menos a la luz del número de dígitos significativos reportados y aplicando técnicas de redondeo ordinarias.

Sin embargo ya que los rangos y parámetros numéricos que establecen el amplio alcance de la presente invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se reportan en forma tan precisa como es posible. Sin embargo, cualquier valor numérico, contendrá inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas medidas de prueba.

Tal cómo se describe en la presente invención, el término agente "citotóxico" o "citoestático" se refiere a un agente que inhibe los procesos biológicos de una célula, o reduce la viabilidad o potencial de proliferación de una célula. Los agentes citotóxicos o citoestáticos pueden funcionar en una variedad de formas, por ejemplo, pero no a manera de limitación, induciendo el daño al ADN, induciendo la detención del ciclo celular, inhibiendo la síntesis de ADN, inhibiendo transcripción, inhibiendo la traducción o síntesis de proteína, inhibiendo la división celular o induciendo la apoptosis. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "agente quimioterapéutico" se refiere a agentes citotóxicos, citoestáticos y antineoplásticos que aniquilan preferentemente, inhiben el crecimiento de o inhiben la metástasis de células neoplásticas o interrumpen el ciclo celular de las células que se proliferan rápidamente. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, compuestos sintéticos, toxinas bacterianas recombinantes y naturales, toxinas fúngicas naturales y recombinantes, toxinas de plantas naturales y recombinantes, núclidos desinteg rabies y radionúclidos. Los ejemplos específicos de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, proteína antiviral de fitolaca, abrina, ricina y cada una de sus cadenas A, momordina, saporina, briodina 1, bouganina, gelonina, toxina de difteria, exotoxina de seudomonas, toxina de Shiga, caliqueamicina, maytansinoide, plomo-212, bismuto-212, estanina-211 , yodo-131, escandio-47, renio-186, renio-188, itrio-90, yodo-123, yodo-124, yodo-125, bromo-77, indio-111, boro-10, actinida, altretamina, actinomicina D, plicamicina, puromicina, gramicidina D, doxorrubicina, colquicina, citocalasina B, ciclofosfamida, emetina, maytansina, amsacrina, cisplastino, etoposida, ortoquinona de etoposida, teniposida, daunorrubicina, gemcitabina, doxorrubicina, mitoxantraona, bisantrena, Bleomicina, metotrexato, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, BCNU, taxol, tarceva, avastina, mitomicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida y ciertas citocinas tales como TNF-alfa y TNF-beta.

El término "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" del estado natural. Si una molécula o composición ocurre en la naturaleza, ha sido "aislada" si ha sido cambiada o eliminada de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en una planta o animal vivo no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes en su estado natural es "aislado", tal como el término es empleado en la presente invención.

El término "polinucleótido" se refiere en forma sinónima a una "molécula de ácido nucleico" o "ácido nucleico", se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que pueda ser ADN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen sin limitación ADN de hebra simple doble, ADN que es una mezcla de regiones de hebra simple doble, ARN de hebra simple doble y ARN que es una mezcla de regiones de hebra simple y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebra simple, más normalmente, de hebra doble o una mezcla de regiones de hebra simple y doble. Además, el término "polinucleótido" se refiere a regiones de hebra triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido también incluye ADNs o ARNs que contienen una o más bases modificadas y ADNs o ARNs con esqueletos modificados para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se puede realizar una variedad de modificaciones para el ADN y ARN; por lo tanto, el término "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos tal como se encuentran normalmente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN característico de virus y células. El término "polinucleótido" también abarca cadenas de ácido nucleico relativamente cortas, con frecuencia referidas como oligonucleótidos.

El término "sustancialmente igual" con respecto a secuencias de ácido nucleico o de aminoácido, significa al menos el 65% de identidad entre dos o más secuencias. Preferentemente, el término se refiere al menos al 70% de identidad entre dos o más secuencias, más preferentemente al menos el 75% de identidad, más preferentemente al menos 80% de identidad, más preferentemente al menos 85% de identidad, más preferentemente al menos 90% de identidad, más preferentemente al menos 91% de identidad, más preferentemente al menos 92% de identidad , más preferentemente al menos 93% de identidad , más preferentemente al menos 94% de identidad , más preferentemente al menos 95% de identidad , más preferentemente al menos 96% de identidad, más preferentemente al menos 97% de identidad , más preferentemente al menos 98% de identidad, y más preferentemente al menos el 99% o más de identidad. Dicha identidad puede ser determinada utilizando el algoritmo mBLAST (Altschul y asociados. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-8; Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-7).

Un "vector" es un replicón, tal como plásmido, fago, cósmido o virus en el cual otro segmento de ácido nucleico puede ser insertado en forma operable para llevar aproximadamente la réplica o expresión del segmento.

El término "enlazado en forma operable" o "insertado en forma operable" significa que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia de codificación, se colocan en una molécula de ácido nucleico en las posiciones adecuadas relativas a la secuencia de codificación, para habilitar la expresión de la secuencia de codificación. A manera de ejemplo, un promotor se enlaza en forma operable con una secuencia de codificación, cuando el promotor tiene la capacidad de controlar la transcripción o expresión de dicha secuencia de codificación. Las secuencias de codificación pueden ser enlazadas en forma operable a secuencias promotoras o reguladoras en una orientación de sentido o antisentido. El término "enlazado en forma operable" algunas veces se aplica a la distribución de los otros elementos de control de transfección (por ejemplo, aumentadores) en un vector de expresión.

Una célula ha sido "transformada" cuando se han introducido dentro de la célula ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, tal como ADN. El ADN de transformación puede o no estar integrado (enlazado en forma covalente) en el genoma de la célula. En procariotos, la levadura y células de mamífero, por ejemplo, el ADN de transformación puede mantenerse en un elemento episomal tal como un plásmido. Con respecto a células eucarióticas, se demuestra una célula transformada en forma estable, o "célula estable" mediante la capacidad de la célula eucariótica para establecer líneas celulares o clones comprendidos de una población de células hija que contienen el ADN de transformación. Un "clon" es una población de células derivadas de una célula simple o ancestro común mediante mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que tiene la capacidad de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones. En algunos ejemplos aquí proporcionados, las células son transformadas, transfectando las células con ADN.

El término "polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces de péptidos o enlaces de péptido modificado, es decir, isósteres de péptido. El término "polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente referidas como péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente referidas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos además de los 20 aminoácidos del código genético. Los "polipéptidos" incluyen secuencias de aminoácido modificadas ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento post-traducción, o mediante técnicas de modificación química que son conocidas en el arte. Dichas modificaciones se describen en textos básicos, monografías y literatura de investigación. Pueden ocurrir modificaciones en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo el esqueleto del péptido, las cadenas laterales de aminoácido y el término amino o carboxilo. Puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en diversos grados en diversos sitios en un polipéptido determinado. Asimismo, un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos post-traducción naturales o pueden elaborarse a través de métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, adhesión covalente de flavina, adhesión covalente de una porción heme, adhesión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, adhesión covalente de un lípido o derivado de lípido, adhesión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, reciclado, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de ancla GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racenruzación, selenoilación, sulfación, adición de aminoácidos transmitida por ARN de transferencia a proteínas tales como arginilación y ubiquitinación (Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Estructura y Propiedades Moleculares de las Proteínas, 2o Edición, T. E. Creighton, W. H. Freeman y Company, Nueva York, 1993 y Wold, F., Modificaciones de Proteína Posttraducción: Perspectivas y Prospectos, páginas 1 a 12 en Modificación Covalente Posttraducción de Proteínas, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter y asociados, Análisis para Modificaciones de Proteína y Cofactores de No Proteína, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 y Rattan y asociados, Síntesis de Proteína: Modificaciones Posttraducción y Envejecimiento, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62).

El término "biomoléculas" incluye proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, lípidos, monosacáridos, polisacáridos y todos los fragmentos, análogos, homólogos, conjugados y derivados de los mismos.

Los términos "expresar" y producir" se utilizan de manera sinónima en la presente invención y se refieren a la biosíntesis de un producto de gen. Estos términos comprenden la transcripción de un gen en ARN. Estos términos también comprenden la traducción de ARN en uno o más polipéptidos, y además comprenden todas las modificaciones post-transcripción y post-transcripción que ocurren naturalmente. La expresión o producción de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, puede estar dentro del citoplasma de la célula, o en el medio extracelular, tal como el medio de crecimiento de un cultivo celular.

Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a cualquier éxito o indicio de éxito en la atenuación o disminución de una lesión, patología o condición, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como abatimiento, remisión, disminución de síntomas o, a hacer que la lesión, patología o condición sea más tolerable para el paciente, disminución en el rango de degeneración o declinación, hacer el punto final de degeneración menos debilitante, mejorar el bienestar físico o mental de un sujeto, o la prolongar la sobrevivencia. El tratamiento puede ser evaluado a través de parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de una revisión física, revisión neurológica o evaluaciones psiquiátricas.

Una "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención y se refieren a una cantidad de anticuerpo, fragmento de enlace de antígeno, o composición de anticuerpo tal como aquí se describe, efectiva para lograr un resultado biológico o terapéutico particular tal como pero sin limitarse a, los resultados biológicos o terapéuticos descritos, o ejemplificados en la presente invención. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, puede variar de acuerdo con factores tales como el estado, la enfermedad, edad, sexo y peso de individuo, y la capacidad del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Dichos resultados pueden incluir pero no se limitan al tratamiento de cáncer, tal como se determina a través de cualquier medio adecuado en la técnica.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las propiedades y sustancias que son aceptables para un paciente desde un punto de vista farmacológico/toxicológico y para la fabricación del químico farmacéutico desde un punto de vista físico/químico con respecto a la composición, formulación, estabilidad, aceptación del paciente y biodisponibilidad.

El término "transportador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente(s) activo y no es tóxico para el receptor al cual se administra.

El término "anticuerpo" se refiere a todos los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgE, IgM, I g D y IgY) incluyendo diversas formas monoméricas y poliméricas de cada isotipo, a menos que se especifique de otra manera.

Los fragmentos de enlace de antígenos son cualquier estructura proteinácea que puede exhibir afinidad de enlace para un antígeno particular. Algunos fragmentos de enlace de antígenos están compuestos de porciones de anticuerpos intactos que retienen la especificidad de enlace de antígeno de la molécula del anticuerpo de origen. Por ejemplo, los fragmentos de enlace de antígenos pueden comprender al menos una región variable' (ya sea una región variable de cadena pesada o de cadena ligera) o una o más CDRs de un anticuerpo conocido por enlazar un antígeno particular. Los ejemplos de fragmentos de enlace de antígenos adecuados incluyen, sin limitación diacuerpos y moléculas de cadena simple así como moléculas Fab, F(ab')2, Fe, Fabc y Fv, anticuerpos de cadena simple (Se), cadenas ligeras de anticuerpo individuales, cadenas pesadas de anticuerpo individuales, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpo o CDRs y otras proteínas, andamios de proteína o moléculas, monómeros o dimeros de cadena pesada, monómeros o dimeros de cadena ligera, dimeros que consisten en una cadena pesada y una ligera y similares. Todos los isotipos de anticuerpo pueden utilizarse para producir fragmentos de enlace de antígeno. Además, los fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir estructuras proteináceas sin anticuerpo que pueden incorporar en forma exitosa segmentos de polipéptido en una orientación que confiere afinidad para un antígeno de interés determinado, tal como andamios de proteína. Los fragmentos de enlace de antígenos pueden ser producidos en forma recombinante o producidos mediante disociación enzimática o química de anticuerpos intactos. La frase "un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo" se puede utilizar para indicar que un fragmento de enlace de antígenos determinado incorpora uno o más segmentos de aminoácido del anticuerpo referido en dicha frase.

Las "composiciones de anticuerpo" se refieren a anticuerpos o fragmentos de enlace de los mismos que se acoplan con al menos un transportador farmacéuticamente aceptable, un agente quimioterapéutico o una porción de diagnóstico, tal como ácido 111 ln-1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecano-N,N',N",NM,-tetraácetico (11 ?-????)._ El "enlace específico" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno, para enlazar a una biomolécula particular con una afinidad que es mayor a la afinidad con la cual puede enlazar otras biomoléculas.

Las modalidades aquí descritas no se limitan a métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos particulares, los cuales, por supuesto, pueden variar.

Además, la terminología utilizada en la presente invención es con el propósito de describir anticuerpos particulares o fragmentos de enlace de antígenos únicamente, y no pretende ser limitante.

Anticuerpos específicos de GD2 En la presente invención se describen anticuerpos aislados o fragmentos de enlace de antígenos que enlazan específicamente al gangliósido GD2. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace de antígeno; sin embargo, otras modalidades incluyen anticuerpos policlonales específicos de GD2 y derivados o fragmentos de anticuerpos que retienen la especificidad para GD2. La estructura general de una molécula de anticuerpo comprende un dominio de enlace de antígenos, que incluye cadenas pesadas y ligeras, y el dominio Fe, el cual sirve para una variedad de funciones, incluyendo fijación de complemento. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos transmiten la citotoxicidad dependiente de complemento.

Existen cinco clases de inmunoglobulinas, en donde la estructura primaria de la cadena pesada, en la región Fe, determina la clase de inmunoglobulina. Específicamente, las cadenas alfa, delta, épsilon, gamma y mu corresponden a los isotipos IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, respectivamente. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos descritos incluyen todos los isotipos y multímeros sintéticos de la estructura de inmunoglobulina de cuatro cadenas. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos descritos también incluyen el isotipo IgY generalmente encontrado en suero de gallina o pavo y yema de huevo de gallina o pavo. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos enlazan en forma no covalente, específica y reversible un antígeno.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno del asunto materia descrito, pueden derivarse de cualesquiera especies. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden ser de ratón, rata, cabra, caballo, cerdo, bovino, pollo, conejo, asno, humano y similares. Para utilizarse en el tratamiento de humanos, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos no derivados de humanos pueden ser genética o estructuralmente alterados para ser menos antigénicos al momento de la administración a un paciente humano.

En algunas modalidades, el antígeno o fragmentos de enlace de antígenos son quiméricos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno "quimérico", significa un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que tiene al menos cierta parte de al menos un dominio variable derivado de la secuencia de aminoácido de anticuerpo de un mamífero no humano, un roedor o un reptil, en tanto que las partes restantes del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, son derivadas de un humano. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender un dominio de enlace de antígeno de ratón con un Fe humano u otro dominio estructural.

En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados pueden ser inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace de antígenos de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en donde los residuos de una región de determinación de complementariedad (CDR) del receptor, son reemplazados por residuos de una CDR de especies no humanas (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región de estructura Fv (FWR) de la inmunoglobulina humana, se reemplazan mediante residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de estructura o CDR importadas. Estas modificaciones se elaboran para refinar y optimizar en forma adicional el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los cuales todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas ó sustancialmente todas las regiones FWR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá en forma óptima al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver las Publicaciones de Jones y asociados, 321 Nature 522-5 (1986); Reichmann y asociados, 332 Nature 323-9 (1988); y Presta, 2 Curr. Op. Struct. Biol. 593-6 (1992).

En algunos casos, los anticuerpos descritos son anticuerpos humanos o fragmentos de enlace de antígenos de los mismos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo humano" significa que el anticuerpo es ya sea solamente de origen humano, o un anticuerpo en el cual las secuencias de dominio variables constantes son secuencias humanas. El término comprende anticuerpos con secuencias derivadas de (es decir, que utilizan) genes humanos, pero que han sido cambiadas, por ejemplo, para disminuir la posible inmunogenicidad, incrementar afinidad, eliminar cisteínas que pueden originar una multiplicación no deseable, etc. El término comprende los anticuerpos producidos en forma recombinante en células no humanas, que pueden impartir glucosilación no típica de células humanas.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos aquí descritos pueden ser etiquetados o conjugados de otra forma para diversas porciones químicas o de biomolécula, por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico. Las porciones pueden ser citotóxicas, por ejemplo, toxinas bacterianas, toxinas virales, radioisótopos y similares. Las porciones pueden ser etiquetas detectables, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, radioetiquetas, biotina y similares, por ejemplo, 111ln-DOTA, ácido 1 ln-dietilenotriaminopentaacético (DTPA), o radionúclidos, tales como, pero sin limitarse a plomo-212, bismuto-212, astatina-211 , yodo-131, escandio-47, renio-186, renio-188, itrio-90, yodo-123, yodo-124, yodo-125, bromo-77, indio-111 y nucleótidos desintegrables tales como boro-10 o una actinida.

En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos se conjugan a uno o más agentes quimioterapéuticos, tales como, pero sin limitarse a radionúclidos, toxinas y agentes citotóxicos y citoestáticos. En otras modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos se utilizan en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos aquí descritos se pueden utilizar solos o con (por ejemplo, coadministrarse o conjugarse) una biomolécula o agente quimioterapéutico tal como un agente citotóxico o citoestático. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un radionúclido, incluyendo pero sin limitarse a plomo-212, bismuto-212, astatina-211 , yodo-131, escandio-47, renio-186, renio-188, itrio-90, yodo-123, yodo-124, yodo-125, bromo-77, indio-111 y núclidos desintegrables tales como boro-10 o una actinida. En otras modalidades, el agente quimioterapéutico es una toxina o fármaco citotóxico, proteína antiviral de fitolaca, abrina, ricina y cada una de sus cadenas A, momordina, saporina, briodina 1, boguanina, gelonina, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, toxina Shiga, caliqueamicina, maytansinoide, altretamina, actinomicina D, plicamicina, puromicina, gramicidina D, doxorrubicina, colquicina, citocalasina B, ciclofosfamida, emetina, maytansina, amsacrina, cisplastin, etoposida, ortoquinona de etoposida, teniposida, daunorrubicina, gemcitabina, doxorrubicina, mitoxantraona, bisantreno, Bleomicina, metotrexato, pemetrexed, cisplatino, vindesina, adriamicina, vincristina, vinblastina, BCNU, un taxano (por ejemplo, Taxol™), tarceva, avastina, mitomicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida, ciertas citocinas tales como TNF-alfa y TNF-beta, y similares. Los métodos para conjugación de anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos a dichos agentes son conocidos en la literatura.

La especificidad de anticuerpos determinada principalmente por las seis regiones CDR, especialmente cadena H CDR3 (Kala y asociados, 132 J. Biochem. 535-41 (2002); Morea y asociados, 275 J. Mol. Biol. 269-94 (1998); y, Chothia y asociados, 196 J. Mol. Biol. 901-17 (1987)). Las regiones de estructura de anticuerpo, sin embargo, pueden desempeñar un papel importante en las interacciones de antígeno-anticuerpo (Panka y asociados, 85 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 3080-4 (1988)), particularmente en influenciar la conformación de los lazos CD (Foote y asociados, 224 J. Mol. Biol. 487-99 (1992)). Por lo tanto, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden comprender cualquier combinación de regiones CDR o FWR de cadena H o L que confieren especificidad para GD2. Los experimentos de revoltura de dominio, los cuales se llevan a cabo en forma rutinaria en la técnica (Jirholt y asociados, 215 Gene 471-6 (1998); Sóderlind y asociados, 18 Nature Biotechnology 852-6 (2000)), se pueden emplear para generar anticuerpos que enlazan específicamente GD2 de acuerdo con las especificaciones aquí descritas y ejemplificadas. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos generados a través de dichos experimentos de revoltura de dominio, están dentro del alcance de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos aquí descritos. Además, las CDRs también se pueden distribuir para enlazar a un antígeno determinado construyendo proteínas tipo anticuerpo que sirven como andamiaje CDR (Nicaise y asociados, 13 Protein Sci. 1882 (2004)). Dichas proteínas de enlace de antígenos están dentro del alcance de los anticuerpos aquí descritos.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos aquí descritos pueden surgir en una variedad de formas, pero incluirán uno o más de los segmentos de anticuerpo mostrados en la tabla 1.

Tabla 1. Segmentos de anticuerpo de los anticuerpos y fragmentos de enlace de antígenos descritos de los mismos ("Le" indica cadena ligera y "He" indica cadena pesada).

En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, y también tienen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente Igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28. Los ajustes de enlace de antígenos de CDRs, también pueden ser construidos utilizando proteínas tipo anticuerpo como un andamiaje CDR. Dichas proteínas de enlace de antígeno construidas están dentro del alcance de la presente descripción.

En algunas modalidades los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una secuencia de aminoácido FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una secuencia de aminoácido FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14; y una secuencia de FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada incluye una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 15; y la cadena ligera incluye una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31.

En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12; una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos incluyen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28; una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos tienen una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12; una secuencia de aminoácido FWR1 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 13; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 14; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15; y la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácido CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26; una secuencia de aminoácido CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27; y una secuencia de aminoácido CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28; una secuencia de aminoácido , FWR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29; una secuencia de aminoácido FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30; y una secuencia de aminoácido FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31. Las distribuciones de enlace de antígeno de CDRs y FWRs también pueden construirse utilizando proteínas tipo anticuerpo como andamiaje CDR. Dichas proteínas de enlace de antígenos construidas están dentro del alcance de la presente descripción.

En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, tienen una cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a la SEC ID NO: 40. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, tienen una cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a la SEC ID NO: 42. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos, pueden tener una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada incluye la secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a la SEC ID NO: 40 y la cadena ligera incluye la secuencia de aminoácido sustancialmente igual o idéntica a la SEC ID NO: 42.

También se describen polinucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos que enlazan específicamente a GD2. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una secuencia CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene el CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen el CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una cadena pesada con una CDR1 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3; y una CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; y una CDR3 sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20. Los polinucleótidos pueden codificar un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 codificada por una secuencia de nucleótido sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3; y una CDR3 codificada por una secuencia de nucleótido sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4; y una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; y una CDR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20.

En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tienen una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la FWR1 de cadena pesada es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7; y una FWR1 de cadena ligera es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera es sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23.

En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NÓ: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3; y una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4; una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7. En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; y una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20; una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23.

En algunas modalidades, los polinucleótidos codifican un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y ligera, en donde los polinucleótidos codifican una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 10, por ejemplo SEC ID NO: 2; una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 11, por ejemplo SEC ID NO: 3; una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 12, por ejemplo SEC ID NO: 4; una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 13, por ejemplo SEC ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 14, por ejemplo SEC ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a, SEC ID NO: 15, por ejemplo SEC ID NO: 7; y una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 26, por ejemplo SEC ID NO: 18; una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 27, por ejemplo SEC ID NO: 19; una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 28, por ejemplo SEC ID NO: 20; una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 29, por ejemplo SEC ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 30, por ejemplo SEC ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual o idéntica a SEC ID NO: 31, por ejemplo SEC ID NO: 23.

Los polinucleótidos que codifican las proteínas de enlace de antígeno construidas, también están dentro del alcance de la presente descripción.

En algunas modalidades, los polinucleótidos descritos (y los péptidos que codifican) incluyen una secuencia líder. Cualquier secuencia líder conocida en la técnica puede ser empleada. La secuencia líder puede incluir, pero no se limita a, un sitio de restricción o un sitio de inicio de traducción. En algunas modalidades, la secuencia líder tiene la secuencia de ácido nucleico ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTAC AGGTGTACACAGC (SEC ID NO: 43). En algunas modalidades, la secuencia líder codifica la secuencia de aminoácido MGWSCI I LFLVATATGVHS (SEC ID NO: 44).

Debido a que probablemente exista la variación de secuencia natural entre las cadenas pesadas y ligeras y los genes que las codifican, se puede esperar encontrar cierto nivel de variación dentro de las secuencias de aminoácidos ó los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, con poco o ningún impacto en sus propiedades de enlace únicas (por ejemplo, especificidad y afinidad). Dicha expectativa se debe en parte, a la degeneración del código genético, así como al éxito evolutivo de las variaciones de secuencia de aminoácido conservadoras, las cuales no alteran en forma apreciable la naturaleza de la proteína codificada. Por consiguiente, algunas modalidades incluyen anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno que tienen el 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% de homología con los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de la presente invención. Otras modalidades incluyen anticuerpos específicos de GD-2 o fragmentos de enlace de antígeno, que tienen una estructura, andamio u otras regiones de no enlace que no comparten una homología significativa con los anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, pero que incorporan una o más CDRs u otras secuencias necesarias para conferir un enlace que sea el 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% homólogo a las secuencias aquí descritas.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos incluyen variantes que tienen múltiples sustituciones, eliminaciones, o adiciones de aminoácido que retienen las propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad de enlace o actividad de efectora inmune) de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos. Los expertos en la técnica pueden producir variantes que tienen sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos simples o múltiples. Estas variantes pueden incluir: (a) variantes en las cuales uno o más residuos de aminoácido son sustituidos con aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las cuales uno o más aminoácidos se agregan o se eliminan del polipéptido, (c) variantes en las cuales uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, y (d) variantes en las cuales el polipéptido se fusiona con otro péptido o polipéptido tal como una parte de fusión, una etiqueta de proteína u otra porción química, que puede conferir propiedades útiles al polipéptido, tal como, por ejemplo, un epítope para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, una porción de biotina y similares. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos pueden incluir variantes en las cuales los residuos de aminoácido de una especie son sustituidos por el residuo correspondiente en otras especies, ya sea en las posiciones conservadas o no conservadas. En otras modalidades, los residuos de aminoácido en las posiciones no conservadas son sustituibles con residuos conservadores o no conservadores. Las técnicas para obtener estas variantes, incluyendo técnicas genéticas (supresiones, eliminaciones, mutaciones, etc), químicas y enzimáticas, son conocidas por los expertos en la técnica.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, pueden representar diversos isotipos de anticuerpo, tales como IgM, IgD, IgG, IgA y IgE. La especificidad del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, es determinada en gran parte por la secuencia de aminoácido, y la distribución de las CDRs. Por consiguiente, las CDRs de un isotipo pueden ser transferidas a otro isotipo sin alterar la especificidad del antígeno. Como alternativa, se han establecido técnicas para originar que los hibridomas cambien de producir un isotipo de anticuerpo a otro (cambio de isotipo) sin alterar la especificidad del antígeno. Por consiguiente, dichos isotipos del anticuerpo están dentro del alcance de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno.

El alterar el isotipo de un anticuerpo, puede ser útil para combinar diferentes funciones efectoras, conferidas por la región constante de anticuerpo, con especificidad de antígeno. Por ejemplo, se produce IgG en forma monomérica, es efectiva en activar el complemento y se encuentra comúnmente en el plasma y compartimentos intracelulares del cuerpo. IgA se produce como un monómero y un dímero asociado con la cadena-J. IgA se encuentra más comúnmente en los espacios luminales del cuerpo y leche materna, debido a que la forma dimérica puede ser transportada a través de las barreras de célula epitelial.

Igual que IgA, IgM también püede formar polímeros, sin embargo, tiende a formar pentámeros, cuando se asocia con la cadena-J, y pentámeros y hexámeros no asociados con la cadena-J. Estos anticuerpos altamente poliméricos sirven para incrementar la capacidad de enlace de antígeno general, incrementando la avidez sin reducir la afinidad. Ambas formas poliméricas de IgM pueden activar eficientemente el complemento, lo cual puede dar como resultado una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, en algunas modalidades, son anticuerpos IgM poliméricos o fragmentos de enlace de antígeno. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno son anticuerpos IgM pentaméricos o fragmentos de enlace de antígeno que están asociados con la cadena-J. En otras modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno son anticuerpos hexaméricos IgM o fragmentos de enlace de antígeno que no están asociados con la cadena-J. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno son anticuerpos pentaméricos IgM o fragmentos de enlace de antígeno que no están asociados con la cadena-J. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno son anticuerpos hexaméricos IgM o fragmentos de enlace de antígeno que están asociados con la cadena-J.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos tienen afinidades de enlace (en M) para GD2 que incluyen una constante de disociación (KD) menor a 1 x 10"2. En algunas modalidades, la KD es menor a 1 x 10"3. En otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10~4. En algunas modalidades, la KD es menor a 1 x 10"5. Aún en otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10"6, 2 x 10"6, 3 x 10"6, 4 x 10-6, 5 x 10-6, 6 x 10"6, 7 x 10-6, 8 x 10~6, o 9 x 10"6. En otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10~7, 2 x 10"7, o 3 x 10"7, 2 x 10"7, 3 x 1Q-7, 4 x 10"7, 5 x 10"7, 6 x 10"7, 7 x 10"7, 8 x 10"7, o 9 x 10"7. En otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10"8, 2 x 10"8, 3 x 10"8, 4 x 10"8, 5 x 10"8, 6 x 10"8, 7 x 10"8, 8 x 1CT8, o 9 x 10"8. En otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10"9, 2 x 10"9, 3 x 10"9, 4 x 10"9, 5 x 10"9, 6 x 10"9, 7 x 10"9, 8 x 10"9, o 9 x 10"9. En otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10"10, 2 x 10"10, 3 x 10" 10, 2 x 10-10, 3 x 10"10, 4 x 10"10, 5 x 10"10, 6 x ??'10, 7 x ??'10, 8 x 10"10, o 9 x 10"10. Aún en otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10-11, 2 x 10-11, 3 x 10"11, 4 x 1CT11, 5 x 1(G11, 6 x 10"11, 7 x 10"11, 8 x 10'11, o 9 x 10"11. En algunas modalidades, la KD es menor a 1 x 10'12. En otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10"13. En otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10"14. Aún en otras modalidades, la KD es menor a 1 x 10~15. En modalidades preferidas, la KD es de 4.5 x 10"9 o menos.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, en algunas modalidades, tienen afinidades de enlace específicas para GD2 en contraste con cada uno de GD1a, GM2 o GM3. En algunas modalidades, la KD para GD2 difiere de KD para cada una de GD1a, GM2 o GM3 al menos 3 veces, preferentemente 10 veces.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos pueden ser modificados, por ejemplo, a través de la adhesión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, de modo que la unión covalente no evite que el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno se enlace a su epítope. Los ejemplos de modificaciones adecuadas, incluyen, pero no se limitan a glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación y similares. En algunas modalidades los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno por sí mismos pueden ser derivados mediante grupos de bloqueo/protección conocidos, disociación proteolítica, ligadura a un ligando celular u otras proteínas, y similares. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno pueden tener porciones post-traducción que mejoran en la actividad o estabilidad del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo. Estas porciones incluyen azufre, metilo, carbohidrato, fósforo, así como otros grupos químicos comúnmente encontrados en moléculas de inmunoglobulina. Además, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos pueden ser etiquetados con, o conjugados para porciones tóxicas o no tóxicas. Las porciones tóxicas incluyen por ejemplo, toxinas bacterianas, toxinas virales, toxinas de plantas, toxinas fúngicas, radioisótopos, y similares. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno pueden ser etiquetados para utilizarse en ensayos biológicos (por ejemplo, etiquetas de radioisótopo, etiquetas fluorescentes), para ayudar a la detección del anticuerpo fragmento de enlace de antígeno. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno también pueden ser etiquetados o conjugados para propósitos de diagnóstico o terapéuticos, por ejemplo, con isótopos radioactivos que proporcionan radiación directamente a un sitio deseado para aplicaciones tales como radioinmunoterapia (Garmestani y asociados, 28 Nucí. Med. Biol. 409 (2001)), técnicas de generación de imagen y cirugía radioinmunoguiada o etiquetas que permiten la generación de imágenes in vivo o detección de complejos de anticuerpos/antígeno específicos. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno también pueden ser conjugados con toxinas para proporcionar una inmunotoxina (ver Kreitman, R. J., 31 Adv. Drug Del. Rev. 53 (1998)).

Aquí se describen composiciones que comprenden un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno descrito del mismo, y un transportador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones son útiles, por ejemplo, para administración a pacientes para tratar cáncer, tal como los descritos y ejemplificados en la presente invención. Las composiciones pueden ser formuladas como cualesquiera de diversas preparaciones que son conocidas y adecuadas en la técnica, incluyendo las descritas y ejemplificadas en la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones son formulaciones acuosas. Las soluciones acuosas pueden ser preparadas mezclando en adición los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno en agua o un amortiguador fisiológico adecuado, y agregando opcionalmente colorantes, saborizantes, conservadores, agentes de estabilización, engrosamiento y similares adecuados, según se desee. También se pueden elaborar suspensiones acuosas, dispersando los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno en agua o un amortiguador fisiológico con material viscoso, tal como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y otros agentes de suspensión bien conocidos.

También se incluyen formulaciones líquidas y preparaciones en forma sólida que pretenden ser convertidas, un poco antes de su uso, en preparaciones líquidas. Dichos líquidos incluyen soluciones, suspensiones, jarabes, partes de emulsiones. Las preparaciones líquidas pueden prepararse a través de medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabes de sorbitol, derivados de celulosa o grasas o aceites comestibles hidrogenados); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres aceitosos, o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metilo o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Estas preparaciones pueden contener, además del agente activo, colorantes, saborizantes, estabilizadores, amortiguadores, edulcorantes, artificiales y naturales, dispersantes, engrosadores, agentes de solubilización, y similares. Las composiciones pueden estar en forma de polvo o liofilizadas para constitución con un vehículo adecuado, tal como agua estéril, un amortiguador fisiológico, solución salina o alcohol antes de utilizarse.

Las composiciones pueden ser formuladas para inyección en un sujeto. Para inyección, las composiciones descritas pueden ser formuladas en soluciones acuosas tal como agua o alcohol, o en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o amortiguador salino fisiológico. La solución puede contener uno o más agentes de formulación, tal como agentes de suspensión, estabilización o dispersión. Las formulaciones de inyección también se pueden preparar como preparaciones de forma sólida que están proyectadas para ser convertidas, un poco antes de su uso, en preparaciones de forma líquida adecuadas para inyección, por ejemplo, mediante constitución con un vehículo adecuado, tal como agua estéril, solución salina o alcohol, antes de utilizarse.

Las composiciones pueden ser formuladas en vehículos de liberación sostenida o preparaciones de depósito. Las formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, forma subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones pueden ser formuladas con materiales poliméricos o hidrofobicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio de iones, o como derivados solubles en forma moderada, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro de acuerdo para utilizarse como transportadores para fármacos hidrofóbicos.

Aquí se describieron métodos para detectar células que expresan GD-2 utilizando los anticuerpos descritos, o fragmentos de enlace de antígeno, ya sea ¡n vivo o ¡n vitro. Algunas modalidades hacen uso de los anticuerpos descritos, o fragmentos de enlace de antígeno, que son conjugados para etiquetas detectables tales como etiquetas fluorescentes, radioetiquetas, biotinas, enzimas y similares, por ejemplo 111ln-DOTA, 111ln-DTPA, o radionúclidos, incluyendo pero sin limitarse a, plomo-212, bismuto-212, astatina-211 , yodo-131, escandio-47, renio-186, renio-188, itrio-90, yodo-123, yodo-124, yodo-125, bromo-77, indio-111, y núclidos desintegrables tal como boro-10 o una actinida. Por ejemplo, un anticuerpo etiquetado en forma inyectable, o fragmento de enlace de antígeno, puede administrarse a un sujeto para detectar y localizar células en un sujeto que expresa GD2. Dichos métodos también pueden ser utilizados para detectar células o tejidos en donde GD2 se expresa en alto nivel en forma relativa a otras células o tejidos en el sujeto. Como alternativa, una modalidad del método descrito para detectar células que expresan GD-2, pueden incluir utilizar un anticuerpo etiquetado en forma detectable o fragmento de enlace de antígeno aquí descrito, para detectar o cuantificar la expresión de GD2 mediante células obtenidas de un sujeto, tal como células obtenidas de una muestra de sangre o biopsia de tejido.

Como alternativa, los métodos descritos para detectar células que expresan GD-2 utilizando los anticuerpos descritos o fragmentos de enlace de antígeno, se pueden llevar a cabo utilizando anticuerpos específicos de GD2 que no son etiquetados. Por ejemplo, en una modalidad, las células que expresan GD2 pueden detectarse en un sujeto administrando primero al sujeto un anticuerpo específico de GD2 o fragmento de enlace de antígeno, aquí descrito seguido de administración de un anticuerpo secundario etiquetado en forma detectable con la capacidad de enlazar al anticuerpo específico de GD2, o fragmento de enlace de antígeno, administrado inicialmente. Una metodología similar puede utilizarse para detectar células que expresan GD2 in vitro.

En la presente invención también se describen métodos para tratar o prevenir enfermedades en sujetos que necesitan de tratamiento o prevención. En algunos aspectos, los métodos pueden incluir identificar un sujeto que necesita de tratamiento o prevención de enfermedades asociados con GD2, tal como cáncer, por ejemplo, melanoma. Otras modalidades incluyen un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que es etiquetado o conjugado para propósitos de diagnóstico, por ejemplo, con isótopos radioactivos que suministran la radiación directamente a un sitio deseado, tal como técnicas de generación de imagen o detección de complejos de anticuerpo/antígeno específico. En una modalidad, los métodos comprenden administrar al sujeto un anticuerpo específico de GD2- o fragmento de enlace de antígeno, tal como un anticuerpo IgM específico de GD2 humano, recombinante en una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad. En un aspecto, los métodos incluyen administrar al sujeto una composición tal como las descritas y ejemplificadas en la presente invención, en donde la composición comprende un transportador farmacéuticamente aceptable y al menos un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno que enlaza específicamente a GD2, en una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad. En una modalidad, los métodos comprenden administrar al sujeto al menos un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, tal como los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos y ejemplificados en la presente invención, que enlazan en forma específica a GD2, en una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad. En una modalidad, los métodos comprenden administrar al sujeto al menos un anticuerpo específico de GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo etiquetado o conjugado para porciones tóxicas o no tóxicas aquí ejemplificadas.

Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos pueden administrarse en forma oral en cualquier forma de dosificación aceptable tal como cápsulas, tabletas, suspensiones acuosas, soluciones o similares. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno también se pueden administrar en forma parenteral, incluyendo pero sin limitarse a: inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intrasternal, intranasal, tópica, intratecal, intrahepática, intralesión, e intracraneal o técnicas de infusión. Como alternativa, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno se administraran en forma intravenosa o intraperitoneal, por ejemplo, mediante inyección.

El sujeto puede ser cualquier animal, y preferentemente un mamífero tal como un ratón, rata, hámster, cerdo de guinea, conejo, gato, perro, mono, asno, vaca, caballo, cerdo y similares. Más preferentemente, el mamífero es un humano. En algunas modalidades, a los sujetos se les puede administrar al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo en una dosis diaria que fluctúa de 0.01 pg a 500 mg de anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo por kg del peso del sujeto. La dosis administrada al sujeto puede medirse en términos de cantidad total de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo administrado por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran de 5 a 5000 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 10 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día.

En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 100 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 250 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 750 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. ¦> En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 1000 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 1500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 2000 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 2500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 3000 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 3500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 4000 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 4500 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, a un sujeto se le administran hasta 5000 miligramos de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo por día. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo se administra a un sujeto en forma semanal o bi-semanal.

Se puede iniciar el tratamiento con dosis más pequeñas, que son menores a la dosis óptima de al menos un anticuerpo anti-GD2 o fragmento de enlace de antígeno, seguido de un incremento en la dosis con el curso del tratamiento hasta que se alcance el efecto óptimo de acuerdo con las circunstancias. Si se indica, la dosis diaria total puede dividirse y administrarse en porciones a lo largo del día.

Para un tratamiento efectivo de enfermedades relacionadas con GD2, un experto en la técnica puede recomendar un programa de dosis y cantidad de dosis adecuados para el sujeto que esté siendo tratado. La dosificación puede ocurrir hasta 4 ó más veces al día todo el tiempo que sea necesario. La dosis puede ocurrir en forma menos frecuente, si las composiciones están formuladas en vehículos de suministro sostenido. El programa de dosificación también puede variar dependiendo de la concentración activa del fármaco, lo cual puede depender de las necesidades del sujeto.

También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos aquí descritos. Los vectores pueden ser vectores de expresión. De esta forma se proporcionan vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de interés. El vector de expresión puede contener una o más secuencias adicionales tales como pero sin limitarse a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor aumentador) un marcador de selección y una señal de poliadenilación. Los vectores para transformar una amplia variedad "de células huésped son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BACs), cromosomas artificiales de levadura (YACs), así como otros vectores bacterianos, de levadura y virales.

Los vectores de expresión recombinantes que están dentro del alcance de la presente invención incluyen fragmentos de ácido nucleicos sintéticos, genómicos o derivados de cADN, que codifican al menos una proteína recombinante que puede estar enlazada en forma operable a elementos reguladores adecuados. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor de transcripción, secuencias que codifican sitios de enlace ribosomal de mARN adecuados y secuencias que controlan la terminación de transcripción y traducción. Los vectores de expresión, especialmente vectores de expresión de mamíferos también pueden incluir uno o más elementos no transcritos, tal como un origen de réplica, un promotor adecuado y un aumentador enlazado al gen que será expresado, otras secuencias no transcritas de flanqueo 5' o 3', secuencias no traducidas, 5' o 3' (tal como sitios de enlace de ribosoma necesarios), un sitio de poliadenilación , sitios donadores y aceptores de división o secuencias de terminación de transcripción. También se puede incorporar un origen de réplica que confiere la capacidad de replicarse en un huésped.

Las secuencias de control de transcripción y traducción en vectores de expresión que serán utilizados en la transformación de células de vertebrados, se pueden proporcionar a través de fuentes virales. Los vectores de ejemplo pueden ser construidos tal como se describe en la Publicación de Okayama y Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).

En algunas modalidades, el anticuerpo o secuencia que codifica el fragmento de enlace de antígeno se coloca bajo el control de un promotor constitutivo por el uso, tal como los promotores para los siguientes genes: transferasa de fosforibosil de hipoxantina (HPRT), deaminasa de adenosina, quinasa de purivato, beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano y otros. Además, muchos promotores virales funcionan en forma consecutiva en células eucarióticas y son adecuados para utilizarse con las modalidades descritas. Dichos promotores virales incluyen sin limitación, promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), los promotores tempranos y tardíos de SV40, el promotor de Virus de Tumor Mamario de Ratón (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTRs) de virus de leucemia de Maloney, Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV), Virus de Epstein Barr (EBV), Virus de Sarcoma Rous (RSV), y otros retrovirus, y el promotor de cinasa de timidina de Virus de Herpes Simple. En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que codifica una secuencia, se coloca bajo el control de un promotor inducible tal como el promotor de metalotioneina, promotor inducible mediante tetraciclina, promotor inducible mediante doxiciclina, promotores que contienen uno o más elementos de respuesta estimulados por interferón (ISRE) tales como cinasa de proteína R, sintetasas de 2',5'-oligoadenilado, genes Mx, ADARI, y similares.

Los vectores aquí descritos pueden contener uno o más Sitio(s) de Entrada de Ribosoma Interno (IRES). La inclusión de una secuencia IRES en vectores de fusión puede ser benéfica para aumentar la expresión de algunas proteínas. En algunas modalidades, el sistema de vector incluirá uno o más sitios de poliadenilación (por ejemplo, SV40), y puede ser la corriente ascendente o corriente descendente de cualesquiera de las secuencias de ácido nucleico antes mencionado. Los componentes de vector pueden ser enlazados en forma contigua o distribuirse en una forma que proporcione el desplazamiento óptimo para expresar los productos de gen (por ejemplo, a través de la introducción de nucleótidos "espaciadores" entre los ORFs), o colocados de otra forma. Los elementos reguladores tales como el motivo IRES, también se pueden distribuir para proporcionar un desplazamiento óptimo para expresión.

Los vectores pueden comprender marcadores de selección, los cuales son conocidos en la técnica. Los marcadores de selección incluyen marcadores de selección positivo y negativo, por ejemplo, genes de resistencia antibióticos (por ejemplo, gen de resistencia a neomicina, gen de resistencia a higromicina, gen de resistencia a kanamicina, gen de resistencia a tetraciclina, gen de resistencia a penicilina), genes de sintasa de glutamato, derivados de HSV-TK, HSV-TK para selección de ganciclovir, o gen de fosforilasa de nucleósido de purina bacterian.a de selección de 6-metilpurina (Gadi y asociados, 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). La secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección o el sitio de clonación puede ser la corriente ascendente o descendente de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés o sitio de clonación.

Los vectores aquí descritos pueden ser utilizados para transformar diversas células con los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos. Por ejemplo, los vectores se pueden utilizar para generar anticuerpos o células que producen el fragmento de enlace de antígeno. Por lo tanto, otro aspecto presenta células huésped transformadas con vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza específicamente GD2, tal como los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígenos descritos y ejemplificados en la presente invención.

Se conocen numerosas técnicas en el arte para la introducción de genes extraños en las células y se pueden utilizar para construir las células recombinantes para propósitos de llevar a cabo los métodos descritos, de acuerdo con las diversas modalidades aquí descritas y ejemplificadas. La técnica utilizada debe proporcionar la transferencia estable de la secuencia de gen heterologa para la célula huésped, de modo que la secuencia de gen heterologa sea heredable y expresabie por la progenie celular, de modo que no se interrumpan el desarrollo y las funciones fisiológicas necesarias de las células receptoras. Las técnicas que se pueden utilizar incluyen pero no se limitan a transferencia de cromosoma (por ejemplo, fusión celular, transferencia de gen transmitida por cromosoma, transferencia de gen transmitida por micro célula), métodos físicos (por ejemplo, transfección, fusión de esferoplasto, microinyección, electroporación , transportador de liposomas), transferencia de vector viral (por ejemplo, virus de ADN recombinante, virus de ARN recombinante) y similares (descritos en la Publicación de Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). También se puede utilizar para transformar células, la fusión inducida por polietilenglicol (PEG) y precipitación de fosfato de calcio de protoplastos bacterianos con células de mamífero.

Las células adecuadas para utilizarse en la expresión de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, son preferentemente células eucarióticas, más preferentemente células de origen de plantas, roedores, o humanos, por ejemplo pero sin limitarse a NSO, CHO, perC.6, Tk-ts13, BHK, células HEK293, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, células L, C127, 3T3, HeLa, NS1, células de mieloma Sp2/0, y líneas de células BHK entre otras. Además, la expresión de anticuerpo se puede lograr utilizando células de hibridoma. Los métodos para producir hibridomas son bien establecidos en la técnica.

Las células transformadas con vectores de expresión aquí descritos pueden ser seleccionadas y clasificadas para expresión recombinante de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos. Las células positivas recombinantes son expandidas y clasificadas para subclones que exhiben un fenotipo deseado, tal como un alto nivel de expresión, propiedades de crecimiento mejoradas, o la capacidad de producir proteínas cón características bioquímicas deseadas, por ejemplo, debido a la modificación de proteína o modificaciones post-traducción alteradas. Estos fenotipos pueden ser debido a propiedades inherentes de un subclon determinado o a una mutación. Las mutaciones pueden efectuarse, a través del uso de químicos, luz de longitud de onda-UV, radiación, virus, mutagenes de inserción, inhibición de reparación de incompatibilidad de ADN o una combinación de dichos métodos.

Una vez que se identifica una célula que expresa la proteína deseada, puede expandirse y seleccionarse. Las células transformadas pueden ser seleccionadas en una cantidad de formas. Por ejemplo, las células pueden ser seleccionadas para expresión del polipéptido de interés. Las células transformadas son un vector que contiene un marcador seleccionado, tal como |la producción de proteína fluorescente, pueden ser seleccionadas en forma positiva para expresión de un marcador. En otras modalidades, las células que contienen un vector con un gen de resistencia a fármacos, pueden ser seleccionados por su capacidad de crecer bajo condiciones selectivas.

Equipos Se proporciona un equipo para inhibir o reducir el crecimiento de células de cáncer en un paciente. También se proporcionan equipos para identificar la presencia de células displástica in vitro o ¡n vivo.

Los equipos aquí descritos pueden comprender un anticuerpo, fragmentos de enlace de antígeno del mismo, o una composición de anticuerpo aquí descritas e instrucciones para utilizar el equipo en un método para inhibir o reducir el crecimiento de células de tumor en el paciente o en un método para identificar la presencia de células displásticas, por ejemplo, en una muestra biológica. El equipo puede comprender al menos un reactivo quimioterapéutico o citotóxico. El equipo puede comprender un compuesto de antifolato. El equipo puede comprender al menos un reactivo de diagnostico. Un ejemplo de un reactivo de diagnóstico es una etiqueta detectable, por ejemplo pero sin limitarse a un agente radioactivo, fluorescente o cromofórico (por ejemplo, 11 ln-DOTA). La etiqueta detectable puede comprender una enzima. El equipo puede comprender instrucciones y un medio para administrar el anticuerpo o composición de anticuerpo, por ejemplo, mediante inyección.

Usos y Métodos para Elaborar Conjugados de BSA-Gangliósido En la presente invención se describe un conjugado de albúmina-gangliósido y métodos para producir dichos conjugados. Para determinar si un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno, de interés es efectivo en transmitir un enlace a un antígeno determinado, se debe caracterizar el enlace de anticuerpo. Existen numerosas formas para caracterizar un enlace de anticuerpo, tal como manchado de punto, manchado western, ensayo de inmunoprecipitación, ELISA, análisis FACS/citometría de Flujo, y detección de inmunofluorescencia de anticuerpo enlazado. Aunque están disponibles una variedad de ensayos para probar el enlace de anticuerpo, el ensayo particular utilizado debe ser seleccionado con la comprensión en mente del propósito del anticuerpo. Por ejemplo, si un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno será utilizado en una instalación clínica, debe ser caracterizado a través de un ensayo que presentará el antígeno de interés en una forma que se encuentra más probablemente in vivo. En este caso, y en el caso de una proteína de superficie celular, la citometría de flujo puede ser un ensayo útil debido a que permite la interacción del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo para ser evaluada dentro del contexto del antígeno nativo.

Una forma de identificar células que contienen un vector que codifica una proteína de enlace específica de antígeno es utilizar Ensayo Inmunoabsorbente Enlazado por Enzimas (ELISA) que hace uso del antígeno de interés. Existen dos métodos principales utilizados para llevar a cabo un ELISA: un ELISA indirecto y un ELISA de emparedado. Para llevar a cabo un ELISA indirecto, el antígeno de interés es absorbido o fijado a la superficie de una placa de microtitulación y posteriormente el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de interés, se agrega a la placa de microtitulación para detectar el antígeno. De manera inversa, un ELISA de emparedado, hace uso de un anticuerpo conocido por ser específico para el antígeno de interés, además del anticuerpo que está siendo caracterizado. El anticuerpo conocido se utiliza para recubrir la placa de microtitulación, de modo que enlazará, o capturará el antígeno de interés cuando se agregue a la placa de microtitulación. Una vez que el antígeno de interés ha sido capturado, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de interés se agrega a la placa de microtitulación para evaluar sus características de enlace para el antígeno. En cualquier caso, el anticuerpo enlazado o fragmento de enlace de antígeno del mismo normalmente es detectado por un anticuerpo secundario conjugado por enzimas que es específico para el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo de interés.

Un ELISA útil para caracterizar los anticuerpos específicos de gangliósido o fragmentos de enlace de antígeno, puede ser útil para determinar las aplicaciones potenciales de dichos anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno. El uso de gangliósidos como antígenos ELISA es complicado, sin embargo, por el hecho de que los gangliósidos libres son deficientemente inmunogénicos (Jacques y asociados, 4 Org. Biomol. Chem. 142-154 (2006)).

Conjugados de Gangliósido La presente invención se describe en conjugados de gangliósido-albúmina que no únicamente retienen las propiedades antigénicas de gangliósido conjugado, sino que incrementan la estabilidad del gangliósido y permiten una mejor adherencia a una placa de microtitulación ELISA. Un gangliósido es conjugado a albúmina a través de aminación reductiva del gangliósido mediante aminas primarias en albúmina en la presencia de cianoborohidruro de sodio. La conjugación procede a través de la formación de base Schiff para el extremo(s) de reducción de la porción de carbohidrato en el gangliósido, seguido de reducción con cianoborohidruro de sodio. Por consiguiente, algunas modalidades aquí descritas incluyen un gangliósido conjugado para una proteína transportadora a través de un extremo(s) de reducción de la porción de carbohidrato en el gangliósido. Algunas modalidades comprenden un gangliósido conjugado a una proteína transportadora, en donde el transportador es BSA. En algunas modalidades, el gangliósido es GD2. En algunas modalidades, el gangliósido es GM3. En algunas modalidades, el gangliósido es GM2. En otra modalidad, GD2 es conjugado a BSA. En algunas modalidades, la aminación reductiva de un gangliósido es catalizada por cianoborohidruro de sodio.

En algunas modalidades el conjugado de gangliósido-albúmina retiene la antigenicidad del gangliósido, de modo que un anticuerpo monoclonal específico de gangliósido o fragmento de enlace de antígeno del mismo, puede enlazar el conjugado. En algunas modalidades el conjugado GD2-BSA retiene la antigenicidad GD2 de modo que un anticuerpo monoclonal específico de GD2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo pueda enlazar el conjugado. En algunas modalidades el conjugado GM2-BSA retiene la antigenicidad GM2 de modo que un anticuerpo monoclonal específico de GM2 o fragmento de enlace de antígeno del mismo puede enlazar en conjugado. En algunas modalidades el conjugado GM3-BSA retiene la antigenicidad G 3 de modo que un anticuerpo monoclonal específico de GM3 o fragmento de enlace de antígeno del mismo pueda enlazar el conjugado.

Los conjugados de albúmina-gangliósido aquí descritos se pueden utilizar en un ELISA para caracterizar la especificidad de un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo para un gangliósido particular. En un aspecto, los conjugados de albúmina-gangliósido descritos proporcionan la capacidad mejorada de absorber los gangliosidos conjugados para placas ELISA relativas a los gangliósidos no conjugados. Una vez absorbidos, los conjugados se pueden utilizar como antígeno de gangliósido en un ELISA directo, para caracterizar los aspectos de enlace de los anticuerpos específicos de gangliósido o fragmentos de enlace de antígeno. En una modalidad, el conjugado albúmina-gangliósido puede ser un conjugado BSA-GD2e. En una modalidad, el conjugado de BSA-gangliósido puede ser un conjugado BSA-GM2. En una modalidad, el conjugado de BSA-gangliósido puede ser un conjugado BSA-GM3. Otros de dichos gangliósidos pueden ser conjugados para BSA utilizando los métodos descritos y posteriormente utilizarse para los propósitos aquí descritos. Dichos conjugados y usos de los mismos están dentro del alcance de la presente descripción.

Las modalidades de los conjugados de proteína incluyen las siguientes.

La modalidad A1 proporciona un conjugado de proteína que comprende albúmina y un gangliósido.

La modalidad A2 proporciona el conjugado de la modalidad A1 en donde la albúmina es albúmina de suero de bovino.

La modalidad A3 proporciona el conjugado de la modalidad A1, en donde el gangliósido es conjugado a albúmina a través de un extremo de reducción de la porción de carbohidrato en el gangliósido.

La modalidad A4 proporciona el conjugado de la modalidad A3, en donde la albúmina es albúmina de suero de bovino.

La modalidad A5 proporciona el conjugado de la modalidad A3, en donde el gangliósido es GD2.

La modalidad A6 proporciona el conjugado de la modalidad A1, en donde el conjugado es inmunoreactivo con un anticuerpo específico de GD2.' La modalidad A7 proporciona el conjugado de la modalidad A , en donde el gangliósido es GM2.

La modalidad A8 proporciona el conjugado de la modalidad A7, en donde el conjugado es inmunoreactivo con el anticuerpo específico de GM2.

La modalidad A9 proporciona el conjugado de la modalidad A1, en donde el gangliósido es G 3.

La modalidad A10 proporciona el conjugado de la modalidad A9, en donde el conjugado es inmunoreactivo con el anticuerpo específico de GM3.

La modalidad A11 proporciona un método para conjugar un gangliósido para albúmina, en donde el método comprende aminar en forma reductiva un extremo de reducción de una porción de carbohidrato en el gangliósido.

La modalidad A12 proporciona el método de la modalidad A11, en donde la albúmina es albúmina de suero de bovino.

La modalidad Á13 proporciona el método de la modalidad A11, en donde la aminación reductiva es catalizada por cianoborohidruro de sodio.

La modalidad A14 proporciona el método de la modalidad A13, en donde el gangliósido es GD2.

La modalidad A15 proporciona el método de la modalidad A13, en donde el gangliósido es GM2.

La modalidad A16 proporciona el método de la modalidad A13, en donde el gangliósido es GM3.

Composiciones y Métodos de Cultivo Celular En la presente invención se describen composiciones y métodos para cultivar células eucarióticas. Las células pueden ser cualquier tipo de célula eucariótica, pero en una modalidad, son preferentemente de origen mamífero. En algunas modalidades, las células son células de ovario de Hámster Chino (CHO). En algunas modalidades, las células eucarióticas son modificadas genéticamente para producir anticuerpos IgM o fragmentos de enlace de antígeno. Las células eucarióticas pueden ser aislados clínicos, transformados con ADN o ARN extraño, inmortalizados, infectados con virus o modificados a través de otros medios biológicos o químicos generalmente conocidos. Las células eucarióticas pueden crecerse en monocapas o en un cultivo suspendido, l o' cual puede ocurrir en un incubador de cultivo celular, bioreactor, frasco de agitación u otro aparato de cultivo de tejido similar. Además, las células eucarióticas pueden ser cultivadas a una temperatura superior a 32°C y debajo de 50°C, entre 2% a 8% C02, con o sin agitación. En una modalidad, las células se pueden cultivar a una temperatura de 37°C, en 5% C02, con agitación en 120 rpm. Las células eucarióticas se pueden cultivar en un medio de cultivo de tejido, tal como un medio completo GIBCO-CD-CHO (1 L GIBCO-CD-CHO de medio + 25 µ? MSX) o un medio completo similar, en combinación con las composiciones y métodos aquí descritos. Las células eucarióticas cultivadas se pueden construir para producir una proteína extraña, en donde las composiciones y métodos aquí descritos, pueden, aunque no de manera necesaria, mejorarse.

En la presente invención se describen composiciones adecuadas para utilizarse con un medio de cultivo de célula eucariótica. La composición incluye pero no se limita a diversos aminoácidos esenciales y no esenciales, por ejemplo, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triprofan, tirosina, y valina; azúcares, por ejemplo, glucosa, fructosa, mañosa, y galactosa; y vitaminas, tales como ácido fótico, vitamina B- 2, vitamina D, y riboflavina que pueden influenciar las características de crecimiento de las células eucarióticas cultivadas. En la modalidad B 1 , la composición incluye glucosa, glutamato, aspartato, serina, histidina, treonina, arginina, tirosina, cisteína, valina, metionina, triprofan, fenilalanina, isoleucina, leucina, lisina, prolina, amida de ácido nicotínico, HCI de piridoxina, ácido fólico, vitamina B-12, riboflavina, y tiamina HCI.

En la modalidad B2, la composición comprende el cultivo celular de la modalidad B1, en donde la concentración de glucosa es 50 g/L, la concentración de glutamato es de 2.5 a 3.75 g/L, la concentración de aspartato es de 1.5 a 2.0 g/L, la concentración de serina es de 0.3 a 0.5 g/L, la concentración de histidina es de 1.1 a 1.5 g/L, la concentración de treonina es de 2.0 a 3.0 g/L, la concentración de arginina es de 1.0 a 1.5 g/L, la concentración de tirosina es de 1.8 a 2.2 g/L, la concentración de cisteína es de 0.9 a 1.1 g/L, la concentración de valina es de 1.0 a 3.0, la concentración de metionina es de 0.8 a 1.2 g/L, la concentración de triptofan es de 0.5 a 0.8 g/L, la concentración de fenilalanina 1:3 a 1.7 g/L, la concentración de isoleucina es de 0.8 a 2.4 g/L, la concentración de leucina es de 1.5 a 4.5 g/L, la concentración de lisina es de 3.5 a 5.0 g/L, la concentración de prolina es de 0.5 a 0.7 g/L, la concentración de amida de ácido nicótínico es de 30 a 40 mg/L, la concentración de HCI piridoxina es de 200 a 250 mg/L, la concentración de ácido fólico 100 a 130 mg/L, la concentración de vitamina B-12 20 a 40 mg/L, la concentración de riboflavina es de 20 a 40 mg/L, y la concentración de tiamina HCI es de 100 a 150 mg/L.

También se describen en la presente invención métodos para cultivar células eucarióticas, en donde una composición descrita en el párrafo anterior, puede ser utilizada para aumentar la viabilidad de las células eucarióticas. Por ejemplo, las composiciones pueden agregarse a células CHO cultivadas y a células eucarióticas que producen IgM cultivadas (por ejemplo, CHO). La composición se puede utilizar para aumentar la viabilidad de las células de cultivo de tejido eucariótico, agregando la composición al medio de crecimiento, como un suplemento del medio, ya sea antes o después de que el medio de crecimiento es aplicado a las células eucarióticas. Como alternativa, se pueden agregar componentes del medio de crecimiento a la composición para producir un medio de crecimiento que contiene la composición.

La modalidad B3 proporciona un método para cultivar células eucarióticas en donde el método comprende agregar a las células un medio de cultivo de tejido primario y posteriormente suplementar el medio de cultivo de tejido primario con una composición de cultivo celular que comprende, glucosa, glutamato, aspartato, serina, histidina, treonina, arginina, tirosina, cisteína, valina, metionina, triprofan, fenilalanina, isoleucina, leucina, lisina, prolina, amida de ácido nicotínico, HCI de piridoxina, ácido fótico, vitamina B-12, riboflavina, y tiamina HCI.

La modalidad B4 proporciona un método de la modalidad B3, en donde el volumen de la composición de cultivo celular que se agrega al medio de cultivo de tejido primario está entre 1.0% y 20% del volumen del medio de cultivo de tejido primario.

La modalidad B5 proporciona el método de la modalidad B3, en donde la composición de cultivo celular no se agrega al medio de cultivo de tejido primario antes del tercer día después de la adición del medio de cultivo de tejido primario.

La modalidad B6 proporciona el método de la modalidad B3, en donde las células eucarióticas han sido transformadas para producir una o más proteínas.

La modalidad B7 proporciona el método de la modalidad B6, en donde la una o más proteínas es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

La modalidad B8 proporciona el método de la modalidad B7, en donde el anticuerpo es un IgM.

La modalidad B9 proporciona el método de la modalidad B3, en donde la composición de cultivo celular se agrega al medio de cultivo de tejido primario en días consecutivos.

En otra modalidad, la composición se puede utilizar para incrementar la cantidad de proteína producida a través de una célula eucariótica que es modificada genéticamente para producir una proteína recombinante. Por ejemplo, la composición se puede agregar a las células cultivadas construidas para expresar un anticuerpo humano recombinante fragmento de enlace de antígeno del mismo (por ejemplo, células modificadas para expresar IgM y más específicamente células CHO modificadas para expresar IgM). La composición se puede utilizar para incrementar la expresión de proteína recombinante, agregando la composición al medio de crecimiento, como un suplemento al medio, ya sea antes o después de que se aplique el medio de crecimiento a las células eucarióticas. Como alternativa, los componentes del medio de crecimiento se pueden agregar a la composición para producir un medio de crecimiento que contiene la composición.

La composición se puede utilizar como un medio de crecimiento o como un suplemento para el medio de crecimiento. Como un suplemento, la composición se puede agregar al medio de cultivo celular ya sea antes o después de que el medio de cultivo se agrega a los contenedores del cultivo de tejido. La composición aquí descrita se puede utilizar para suplementar el medio de cultivo de célula eucariótica a una concentración total de 1.5% a 2.5%. Estas mismas concentraciones se pueden utilizar para producir el medio de cultivo celular que ya contiene la composición.

También se presentan métodos para incrementar la cantidad de proteína producida a través de una célula eucariótica que es modificada en forma genética para producir una proteína recombinante agregando ácido valérico al medio de cultivo celular. Por ejemplo, se puede agregar ácido valérico al medio para CHO cultivado, hibridoma, y células NSO construidas para expresar un anticuerpo humano recombinante o fragmento de enlace de antígeno. En una modalidad, se puede agregar ácido valérico al medio de cultivo celular en una concentración final de 0.1 mM a 10 mM. En una modalidad, se puede agregar ácido valérico en puntos específicos en el período de crecimiento celular, por ejemplo, el ácido valérico se puede agregar al medio de cultivo en días específicos después de revivir las reservas celulares o después de que se dividen los cultivos celulares.

La modalidad B10 proporciona un método para aumentar la producción de proteína mediante células, en donde el método comprende suplementar el medio de crecimiento de las células con ácido valérico.

La modalidad B11 proporciona el método de la modalidad B10, en donde las células son células que producen anticuerpo.

La modalidad B12 proporciona el método de la modalidad B10, en donde el medio de crecimiento es suplementado para tener una concentración de ácido valérico de 0.1 mM a 10 mM. Aislamiento o Purificación de Anticuerpo Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno aquí descritos, se pueden separar de una parte sustancial del medio de crecimiento celular del cual se recuperan para permitir una forma más purificada o aislada del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno. En la presente invención se describen métodos para purificar o aislar anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno, tal como anticuerpos IgM humanos o fragmentos de enlace de antígeno, de una solución, por ejemplo, sobrenadante de cultivo acondicionado (CCS). El incrementar la pureza de una solución que contiene los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno, se puede lograr en una cantidad de formas, incluyendo pero sin limitarse a diálisis, cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación, cromatografía de intercambio de iones, centrifugación de gradiente, filtración con filtro de exclusión por tamaño, cromatografía por afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, y cromatografía líquida de alto desempeño. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos también se pueden modificar, en forma genética o química, para incluir una etiqueta de afinidad, tal como polihistidina, que se puede utilizar para incrementar la pureza del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, a través de técnicas de purificación de afinidad.

Por consiguiente, algunas modalidades incluyen un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que es separado de una solución mediante cromatografía por afinidad. Algunas modalidades comprenden un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que está sustancialmente separado de una solución mediante cromatografía de afinidad, en donde la afinidad para el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, es transmitida por la proteína A. Algunas modalidades comprenden un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que está sustancialmente separado de una solución mediante cromatografía de intercambio de iones. Algunas modalidades comprenden un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que es sustancialmente separado de una solución mediante cromatografía de intercambio de cationes, en donde la columna de cromatografía de intercambio de cationes comprende una resina de copolímero de acrilamida-dextrano. Algunas modalidades comprenden un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que es sustancialmente separado de la solución a través de cromatografía de hidroxiapatita. Algunas modalidades comprenden un anticuerpo o fragmento de enlace ¦ de antígeno del mismo que es sustancialmente separado de una solución mediante cromatografía de hidroxiapatita, en donde la columna de cromatografía de hidroxiapatita incorpora una resina de fosfato de calcio de cerámica.

El proceso a través del cual los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos pueden ser purificados o aislados, pueden variar según los requerimientos del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo resultante, que pueden variar dependiendo de la aplicación para la cual se utilizarán los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno para utilizarse en una composición farmacéutica, pueden requerir una purificación estricta, en tanto que los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno para utilizarse en un ensayo de diagnóstico in vitro pueden ser purificados hasta un menor grado. Por consiguiente, algunas modalidades incluyen contactar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno que contiene una muestra, con una matriz de proteína A. Algunas modalidades incluyen contactar un anticuerpo o muestra que contiene un fragmento de enlace de antígeno con una matriz de intercambio de iones. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser una matriz de cromatografía de intercambio de cationes. En una modalidad más preferida, la matriz de cromatografía de intercambio de cationes puede incluir una resina de copolímero de acrilamida-dextrano. Algunas modalidades incluyen contactar un anticuerpo o muestra que contiene un fragmento de enlace de antígeno con una matriz de hidroxiapatita. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede incluir una resina de fosfato de calcio.

Cromatografía de afinidad en serie es un proceso que produce una proteína aislada o purificada. El proceso puede emplear dos o más vueltas de diferentes técnicas de cromatografía de afinidad para producir una proteína de interés purificada o aislada (Friedrichs y Grose, 49 J. Virol. 992 (1984)). Por consiguiente, en algunas modalidades un anticuerpo o muestra que contiene fragmento de enlace de antígeno puede contactarse con una matriz de proteína A bajo condiciones que promueven el enlace de anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno a la matriz; la matriz puede ser lavada para eliminar proteínas no enlazadas; el material enlazado a través de la matriz de proteína A puede ser eluido; el material eluido puede ser contactado a través de una matriz de cromatografía de intercambio de cationes bajo condiciones que promueven el enlace de anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno a la matriz; la matriz puede ser lavada para eliminar proteínas no enlazadas el material enlazado por la matriz de cromatografía de intercambio de cationes puede ser eluido; el material eluido puede ser contactado a través de una resina de hidroxiapatita bajo condiciones que promueven el enlace de anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno a la matriz; la matriz puede ser lavada para eliminar las proteínas no enlazadas; y el material enlazado puede ser eluido. Además, se pueden agregar pasos opcionales a diversos puntos en este proceso, para permitir una purificación más estricta del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo o solución que contiene el fragmento de enlace de antígeno puede ser suplementado con detergente, tal como Triton®-X 100 o Tween® 80, para desactivar microbios, tales como bacterias, virus, y parásitos.

La cromatografía basada en la afinidad de las proteínas es un proceso de múltiples pasos que generalmente implica equilibrar una columna de cromatografía, contactar una solución de muestra con la matriz de una columna, lavar el material no enlazado en la columna y eluir el material deseado. Este proceso general puede repetirse una o más veces, bajo condiciones diversas, para incrementar la pureza de una muestra, según sea necesario. En algunas modalidades, se puede utilizar una matriz de proteína A para contactar la muestra que sea purificada. En una modalidad, la matriz de proteína A puede ser porosa, tener poros que fluctúan de 1000 a 5000 angstroms de diámetro. En otra modalidad, la matriz de proteína A tiene poros con un diámetro promedio de 3000 angstroms.

En algunas modalidades, la matriz de afinidad se lava y equilibra antes de utilizarse. Por ejemplo, la matriz de afinidad puede ser lavada con agua purificada para eliminar cualesquiera contaminantes. En algunas modalidades, la matriz de afinidad puede ser lavada con 3 a 10 volúmenes de columna de agua purificada. En otra modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con 5 volúmenes de columna de agua purificada. En algunas modalidades la matriz de afinidad puede ser lavada con al menos un amortiguador ácido. Por ejemplo, la matriz de afinidad puede ser lavada con 1 a 5 volúmenes de columna de 20 mM HCI en pH 1.5. En otra modalidad, la matriz de afinidad se lava con 3 volúmenes de columna de 20 mM HCI en pH 1.5.

Además, la matriz de afinidad puede lavarse con al menos un amortiguador adicional, tal como 6 M guanidina-HCI. Antes de contactar la matriz de afinidad con una muestra, la matriz se puede equilibrar con un amortiguador de pH levemente básico o neutral. En una modalidad, la matriz de afinidad puede equilibrarse con 2 a 8 volúmenes de columna de columna de un amortiguador en un pH 7.5. En otra modalidad, la matriz de afinidad puede equilibrarse con 5 volúmenes de columna de columna de un amortiguador de fosfato de sodio 10 mM que contiene NaCI 200 mM y 0.01% de Tween®-80, en pH 7.5. Los amortiguadores de fosfato de sodio aquí descritos pueden prepararse a partir de una mezcla de fosfato de sodio monobásico y dibásico. Mezcladas en Jas proporciones correctas, estas soluciones pueden producir amortiguadores de fosfatos dentro del rango de pH 4 a pH 10.

Las muestras que serán purificadas o aisladas a través del contacto de la matriz de afinidad, deben estar sustancialmente libres de materia de particulado grande. Dicha materia de particulado puede ser eliminada en una variedad de formas, tal como mediante centrifugación o filtración. En otra modalidad, el sobrenadante de cultivo acondicionado (CCS) aquí descritos se elabora sustancialmente libre de materia de particulado grande antes de contactarse con una matriz de afinjdad. Aún en otra modalidad, el CCS se filtra para eliminar la materia de particulado. Se puede utilizar un filtro con un tamaño de poro adecuado, tal como un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 1 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.75 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.5 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.22 pm, o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.1 µ?t?.

Antes de contactar la matriz de afinidad con una solución que contiene una muestra que será purificada o aislada, la solución puede ser tratada con detergente para desactivar al menos un contaminante microbiano, tal como bacteria, virus, y parásitos. En una modalidad, el CCS es suplementado con detergente para desactivar al menos un contaminante microbiano. En una modalidad, el detergente es Tritón® X-100. La concentración de detergente agregada a la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede variar para cumplir la necesidad de un esquema de purificación particular. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 10% de detergente. En otra modalidad, la solución que contiene una muestra para ser purificada o aislada puede tener el 7% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 5% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 3% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 2% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 1% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 0.5% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o^aislada puede tener el 0.1% detergente.

Una vez aplicada a la matriz de afinidad, la muestra puede procesarse en un rango de flujo deseado, por ejemplo, para facilitar el procesamiento o enlace de la muestra. Aunque se puede utilizar cualquier rango de flujo, los rangos de flujo comunes están entre 1 y 200 cm/h. En algunas modalidades el rango de flujo de la muestra puede ser de 1 cm/h. En otras modalidades, el rango de flujo de la muestra puede ser de 10 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 25 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 50 cm/h. En otra modalidad el rango de flujo de la muestra puede ser de 76 cm/h. En otra modalidad el rango de flujo de la muestra puede ser de 100 cm/h. En algunas modalidades el rango de flujo de la muestra puede ser de 125 cm/h. En otra modalidad el rango de flujo de la muestra puede ser de 150 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 175 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 200 cm/h.

Después de que la matriz de afinidad ha sido contactada por el material de muestra, se puede eliminar el material de muestra no enlazado lavando con un amortiguador. En una modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con un amortiguador con un pH ácido. En una modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con un amortiguador con un pH neutral. En una modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con un amortiguador con un pH básico. En otra modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con 5 a 15 volúmenes de columna de un amortiguador de fosfato de sodio 10 mM que contiene 200 mM de NaCI y 0.01% de Tween®-80, en pH 7.5.

Después de que las proteínas no enlazadas han sido eliminadas de la matriz de afinidad mediante lavado, las proteínas enlazadas a la matriz de afinidad pueden ser eluidas lavando la matriz de afinidad con un amortiguador de elución. El amortiguador de elución debe ser seleccionado cuidadosamente para asegurar que interrumpa la interacción entre la proteína de interés, por ejemplo, anticuerpo IgM humano, y la matriz, pero que no desnaturalice o deteriore de otra manera la condición de la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con un amortiguador con un pH ácido para eluir la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con un amortiguador con un pH neutral para eluir la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de afinidad puede ser lavada con un amortiguador con un pH básico para eluir la proteína de interés. Algunas modalidades . incluyen un amortiguador que tienen fosfato de sodio y cloruro de magnesio para eluir el material enlazado a una cromatografía de columna, en donde se utilizan hasta 10 volúmenes de columna de este amortiguador para eluir el material enlazado de la columna. En algunas modalidades, el amortiguador que tienen entre 5 y 10 mM de fosfato de sodio y 1 y 5 M de cloruro de magnesio se pueden utilizar para eluir el material enlazado a una matriz de afinidad. Otra modalidad, incluye 3 volúmenes de columna de un amortiguador que comprende 5 mM de fosfato de sodio y 3 M de cloruro de magnesio para eluir el material enlazado a una matriz de afinidad. En algunas modalidades, se puede eluir IgM de una matriz de proteína A utilizando 5 mM de un amortiguador de fosfato de sodio suplementado con 3 M de MgCI2 en pH 6.8.

En la presente invención se describen métodos para purificar o aislar proteínas, por ejemplo, anticuerpos IgM o fragmentos de enlace de antígeno, utilizando cromatografía de intercambio de iones. La cromatografía de intercambio de iones de las proteínas es un proceso de múltiples pasos que generalmente implique equilibrar una columna de cromatografía, contactar una solución de muestra con la matriz de una columna, lavar el material no enlazado en la columna y eluir el material deseado. Este proceso general puede ser repetido una o más veces, bajo condiciones variantes, para incrementar la pureza de una muestra, según sea necesario. En algunas modalidades, la matriz de cromatografía de intercambio de cationes puede ser una resina de copolímero de acrilamida-dextrano. En una modalidad, la matriz de cromatografía de intercambio de cationes puede ser una resina MacroCap™ SP.

En algunas modalidades, la matriz de intercambio de iones se lava y equilibra antes de utilizarse. Por ejemplo, la matriz de intercambio de iones puede lavarse con agua purificada para eliminar cualesquiera contaminantes. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede lavarse con 1 a 10 volúmenes de columna de agua purificada. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con 2 volúmenes de columna de agua purificada. En algunas modalidades, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con al menos un amortiguador. Por ejemplo, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con 1 a 5 volúmenes de columna de un amortiguador que tiene 0.5 M de NaOH. En otra modalidad, la matriz de intercambio de iones se lava con 3 volúmenes de columna de un amortiguador que tiene 0.5 M de NaOH. En algunas modalidades, la matriz de intercambio de iones se lava con 3 volúmenes de columna de un amortiguador que tienen 2 de NaCI. Antes de contactar la matriz de intercambio de iones con una muestra, la matriz puede ser equilibrada con un amortiguador de pH ácido, básico o neutral. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser equilibrada con 2 a 8 volúmenes de columna de un amortiguador en pH 6.8. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser equilibrada con 5 volúmenes de columna de un amortiguador fosfato de sodio 10 mM, que contiene 75 mM de NaCI y 0.01% de Tween®-80, en pH 6.8.

Las muestras que serán purificadas o aisladas contactando la matriz de intercambio de iones, deben estar sustancialmente libres de materia de particulado grande. Dicha materia de particulado puede ser eliminada en una variedad de formas, tal como mediante centrifugación o ultrafiltración . En algunas modalidades, el sobrenadante de cultivo acondicionado (CCS) aquí descrito, se elabora sustancialmente libre de materia de particulado grande antes de haberse contactado con una matriz de intercambio de ión. En otra modalidad, el CCS se filtra para eliminar una materia de particulado. Se puede utilizar un filtro con cualquier tamaño de poro, tal como un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 1 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.75 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.5 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de Ó.22 pm, o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.1 pm.

Antes de contactar la matriz de intercambio de iones con una solución que contiene una muestra que será purificada, la solución puede ser tratada con detergente para desactivar al menos un contaminante microbiano, tal como bacteria, virus, y parásitos, o para ayudar a mantener la proteína objetivo en un estado soluble. En algunas modalidades, la muestra puede ser suplementada con detergente para desactivar al menos un contaminante microbiano o para ayudar a mantener la proteína objetivo en un estado soluble. En una modalidad, el detergente es Tritón® X-100. En una modalidad, el detergente es Tween®-80. La concentración de detergente agregado a la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada, puede variar para cumplir con las necesidades de un esquema de purificación en particular. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 10% de detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 7% de detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 5% de detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 3% de detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 2% de detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 1 % de detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 0.5% de detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener 0.1% de detergente.

Una vez aplicada a la matriz de intercambio de iones, la muestra puede ser procesada en un rango de flujo deseado, por ejemplo, para facilitar el procesamiento o enlace de la muestra.

Aunque se puede utilizar cualquier rango de flujo, los rangos de flujo comunes son entre 1 y 200 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 1 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 10 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 25 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 50 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 76 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 100 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 125 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 150 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 175 cm/h. En otra modalidad el rango de flujo de la muestra puede ser de 200 cm/h.

Después de que la matriz de intercambio de iones ha sido contactada por el material de muestra, el material de la muestra no enlazada puede ser eliminado lavando con un amortiguador. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con un amortiguador con un pH ácido. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con un amortiguador con un pH neutral. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con un amortiguador con un pH básico. En una modalidad, la matriz de intercambio ión puede ser lavada con 5 a 15 volúmenes de columna de un amortiguador que contiene 10 mM de fosfato de sodio, 75 mM de NaCI, y 0.01% de Tween®-80, con un pH de 6.8.

Después de que las proteínas no enlazadas han sido eliminadas de la matriz de intercambio de iones mediante lavado, las proteínas enlazadas a la matriz de intercambio de iones pueden ser eluidas lavando la matriz de intercambio de ión con un amortiguador de elución. El amortiguador de elución debe ser seleccionado cuidadosamente para asegurar que interrumpa la interacción entre la^ proteína de interés, por ejemplo, un anticuerpo IgM humano, y la matriz, pero que no desnaturalice o deteriore de otra manera la condición de la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con un amortiguador con un pH ácido para eluir la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con un amortiguador con un pH neutral para eluir la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de intercambio de iones puede ser lavada con un amortiguador con un pH básico para eluir la proteína de interés. Algunas modalidades incluyen un amortiguador que tiene fosfato de sodio y cloruro de sodio para eluir el material enlazado a una columna de cromatografía, en donde hasta 10 volúmenes de columna de este amortiguador se utilizan para eluir el material enlazado de la columna. En algunas modalidades, se puede utilizar un amortiguador que tiene entre 5 y 50 mM de fosfato de sodio y 150 y 500M de cloruro de sodio, para eluir el material enlazado a una matriz de una matriz de intercambio de ión. Otra modalidad incluye 4 volúmenes de columna de un amortiguador que comprende 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio que contiene 200 mM de NaCI para eluir el material enlazado a una matriz de intercambio de ión. En algunas modalidades, el IgM puede ser eluido de una matriz MacroCap™ SP utilizando un amortiguador de fosfato de sodio 10 mM que contiene 200 mM de NaCI y 0.01% de Tween®- 80, en pH 6.8.

En la presente invención se describen métodos para purificar o aislar proteínas, por ejemplo, anticuerpos IgM o fragmentos de enlace de antígeno, utilizando cromatografía de hidroxiapatita. La cromatografía de hidroxiapatita de proteínas es un proceso de múltiples pasos que generalmente implica equilibrar una cromatografía de columna, contactar una solución de muestra con la matriz de una columna, lavar el material no enlazado en la columna, y eluir el material deseado. Este proceso general puede ser repetido una o más veces bajo condiciones diversas, para incrementar la pureza de una muestra, según sea necesario. En algunas modalidades, la matriz de cromatografía de hidroxiapatita puede ser una de fosfato de calcio. En una modalidad, la matriz de cromatografía de hidroxiapatita puede ser Hidroxiapatita Cerámica CHT® II, tamaño de gránulo 80 pm.

En algunas modalidades, la matriz de hidroxiapatita es hidratada antes de utilizarse. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita es hidratada con una solución que tienen 200 mM de fosfato de potasio, en pH 9.0, utilizando 0.54g de una matriz seca por cada ml_ del volumen de cama-columna deseado. Antes de contactar la matriz de hidroxiapatita con una muestra, la matriz puede ser equilibrada con un amortiguador de pH ácido, básico o neutral. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser equilibrada con 2 a 8 volúmenes de columna de un amortiguador en un pH 6.8. En otra modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser equilibrada con 5 volúmenes de columna de un amortiguador que contiene 10 mM de fosfato de sodio, 100 mM de NaCI, y 0.01% Tween®-80, en pH 6.8.

Las muestras que serán purificadas o aisladas a través del contacto de la matriz de hidroxiapatita, deben estar sustancialmente libres de materia de particulado grande. Dicha materia de particulado puede ser eliminada en una variedad de formas, tal como mediante centrifugación o filtración. En otra modalidad, el sobrenadante de cultivo acondicionado (CCS) aquí descritos se elabora sustancialmente libre de materia de particulado grande antes de contactarse con una matriz de afinidad. Aún en otra modalidad, el CCS se filtra para eliminar la materia de particulado. Se puede utilizar un filtro con un tamaño de poro adecuado, tal como un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 1 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.75 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.5 pm o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.22 pm, o un filtro que tiene poros con un diámetro promedio de 0.1 pm.

Antes de contactar la matriz de hidroxiapatita con una solución que contiene una muestra que será purificada o aislada, la solución puede ser tratada con detergente para desactivar al menos un contaminante microbiano, tal como bacteria, virus, y parásitos. En una modalidad, el CCS es suplementado con detergente para desactivar al menos un contaminante microbiano. En una modalidad, el detergente es Tritón® X-100. La concentración de detergente agregada a la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede variar para cumplir la necesidad de un esquema de purificación particular. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 10% de detergente. En otra modalidad, la solución que contiene una muestra para ser purificada o aislada puede tener el 7% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 5% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 3% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 2% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 1% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 0.5% detergente. En una modalidad, la solución que contiene una muestra que será purificada o aislada puede tener el 0.1% detergente.

Una vez aplicada a la matriz de hidroxiapatita, la muestra puede procesarse en un rango de flujo deseado, por ejemplo, para facilitar el procesamiento o enlace de la muestra. Aunque se puede utilizar cualquier rango de flujo, los rangos de flujo comunes están entre 1 y 200 cm/h. En algunas modalidades el rango de flujo de la muestra puede ser de 1 cm/h. En otras modalidades, el rango de flujo de la muestra puede ser de 10 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 25 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 50 cm/h. En otra modalidad el rango de flujo de la muestra puede ser de 76 cm/h. En otra modalidad el rango de flujo dé la muestra puede ser de 100 cm/h. En algunas modalidades el rango de flujo de la muestra puede ser de , 125 cm/h. En otra modalidad el rango de flujo de la muestra puede ser de 150 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 175 cm/h. En una modalidad, el rango de flujo de la muestra puede ser de 200 cm/h.

Depués de que la matriz de hidroxiapatita ha sido contactada por el material de muestra, el. material de muestra no enlazado puede er eliminado lavando con un amortiguador. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser lavada con un amortiguador con un PH ácido. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser lavada con un amortiguador con un PH neutral. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser lavada con un amortiguador con un PH básico. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser lavada con 5 a 15 volúmenes de columna de un amortiguador que contiene 10nM de fosfato de sodio, 100Nm de NaCI y 0.01% de Tween®-80 en un pH de 6.8.

Después de que las proteínas no enlazadas han sido eliminadas de la matriz de hidroxiapatita mediante lavado, las proteínas enlazadas a la matriz de hidroxiapatita pueden ser eluidas lavando la matriz de hidroxiapatita con un amortiguador de elución. El amortiguador de elución debe ser seleccionado cuidadosamente para asegurar que interrumpa la interacción entre la proteína de interés, por ejemplo, un anticuerpo IgM humano, y la matriz, pero no desnaturalice o deteriore de otra forma la condición de la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser lavada con un amortiguador con un pH ácido para eluir la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser lavada con un amortiguador con un pH neutral para eluir la proteína de interés. En una modalidad, la matriz de hidroxiapatita puede ser lavada con un amortiguador con un pH básico para eluir la proteína de interés. Algunas modalidades incluyen un amortiguador que tienen fosfato de sodio y cloruro de sodio para eluir el material enlazado a una columna de hidroxiapatita, en donde hasta 10 volúmenes de columna de este amortiguador, se utilizan para eluir el material enlazado de la columna. En algunas modalidades, se puede utilizar un amortiguador que tiene entre 150 y 500 mM de fosfato de sodio y 50 y 200 M de cloruro de sodio para eluir el material enlazado a una matriz de hidroxiapatita. En una modalidad, se puede utilizar 4 volúmenes de columna de un amortiguador que comprende 175 mM de amortiguador de fosfato de sodio que contiene 100 mM de NaCI, para eluir el material enlazado a una matriz de hidroxiapatita. En otra modalidad, IgM se puede eluir de una matriz de Hidroxiapatina Cerámica CHT® II utilizando un amortiguador que contiene 175 mM de fosfato de sodio, 100 mM de NaCI, y 0.01% de Tween®-80, en un pH 6.8.

Los amortiguadores de composición diversa, con respecto a las sales utilizadas, concentración de sal, detergentes utilizados, concentraciones de detergente, pH, y similares, se pueden utilizar para llevar a cabo sustancialmente los métodos aquí descritos. Por consiguiente; dichas variaciones están contempladas para estar dentro del alcance de la descripción proporcionada, la cual no pretende ser exclusiva o limitante.

La modalidad C1, proporciona un método para purificar o aislar proteínas, en donde el método comprende aplicar una solución que comprende la proteína una columna de cromatografía de afinidad, aplicar el eluado de la columna de cromatografía de afinidad a una columna de cromatografía de intercambio de cationes, y aplicar el eluado de la columna de cromatografía de intercambio de cationes a una columna de cromatografía de hidroxiapatita, y obtener el eluato de la columna de cromatografía de hidroxiapatita.

La modalidad C2 proporciona el método de la modalidad C1, en donde la columna de cromatografía de afinidad comprende al menos un substrato recubierto con proteína A.

La modalidad C3, proporciona el método de la modalidad C2, en donde el al menos un substrato recubierto con la proteína A es poroso.

La modalidad C4, proporciona un método de la modalidad C3, en donde el substrato poroso comprende poros de 3000 angstroms.

La modalidad C5, proporciona el método de la modalidad C1, en donde la al menos un sustancia recubierta con proteína A enlaza una proteína.

La modalidad C6, proporciona el método de la modalidad C5, en donde la proteína enlazada por al menos una sustancia recubierta con proteína A, es eluida con una solución que comprende cloruro de magnesio.

La modalidad C7, proporciona el método de la modalidad C6, en donde la solución que comprende cloruro de magnesio es una solución de 1M a 5M de cloruro de magnesio.

La modalidad C8, proporciona el método de la modalidad C6, en donde la solución que comprende cloruro de magnesio es una solución de 3 M de cloruro de magnesio.

La modalidad C9, proporciona el método de la modalidad C5, en donde la proteína enlazada por la al menos un sustancia recubierta con proteína A es un anticuerpo.

La modalidad C10, proporciona el método de la modalidad C9, en donde el anticuerpo es IgM.

La modalidad C11, proporciona el método de la modalidad C1, en donde la columna de cromatografía de intercambio de cationes comprende una resina de copolímero de acrilamida-dextrano.

La modalidad C12, proporciona el método de la modalidad C11, en donde la resina de copolímero de acrilamida-dextrano enlaza a una proteína.

La modalidad C13, proporciona el método de la modalidad C12, en donde la proteína enlazada por la resina de copolímero de acrilamida-dextrano se eluye con una solución que comprende 10 mM de fosfato de sodio, 200 mM de cloruro de sodio, y 0.01% de polisorbato 80.

La modalidad C14, proporciona el método de la modalidad C13, en donde la proteína enlazada por la resina de copolímero de acrilamida-dextrano es un anticuerpo.

La modalidad C15, proporciona el método de la modalidad C14, en donde el anticuerpo es IgM.

La modalidad C16, proporciona el método de la modalidad C1, en donde la columna de cromatografía de hidroxiápatita comprende una resina de fosfato de calcio.

La modalidad C17, proporciona el método de la modalidad C16, en donde la resina de fosfato de calcio enlaza a una proteína.

La modalidad C18, proporciona el método de la modalidad C17, en donde la proteína enlazada por la resina de fosfato de calcio es eluida con una solución que comprende 175 mM fosfato de sodio, 100 mM de cloruro de sodio, y 0.01% de polisorbato 80.

La modalidad C19, proporciona el método de la modalidad C18, en donde la proteína enlazada por la resina de fosfato de calcio es un anticuerpo.

La modalidad C20, proporciona el método de la modalidad C19, en donde el anticuerpo es IgM.

La modalidad C21, proporciona un método para purificar o aislar una proteína, en donde el método comprende: a. aplicar una solución que contiene la proteína a una columna de cromatografía de afinidad que comprende al menos un substrato recubierto con proteína A, y eluir cualesquiera proteínas enlazadas por la al menos una sustancia recubierta con proteína A con una solución que comprende 3M cloruro de magnesio; b. aplicar el eluato de la columna de cromatografía de afinidad a una columna de cromatografía de intercambio de cationes, que comprende una resina de copolímero de acrilamida-dextrano, y eluir cualesquiera proteínas enlazada por la resina de copolímero de acrilamida-dextrano con una solución que comprende 10 mM de fosfato de sodio, 200 mM de cloruro de sodio, y 0.01% de polisorbato 80; c. aplicar el eluato de la columna de cromatografía de intercambio de cationes a una hidroxiapatita que comprende una resina de fosfato de calcio, y eluir cualesquiera proteínas enlazadas a la resina de fosfato de calcio con una solución que comprende 175 mM de fosfato de sodio, 100 mM de cloruro de sodio, y 0.01% de polisorbato 80.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir las modalidades descritas aquí con mayor detalle. Pretenden ser ilustrativas, no limitar las modalidades.

EJEMPLO 1 Especificidad GD-2 de IqM Derivado de CV-3 Una combinación de células de linfoblasto humanas transformadas con Virus Epstein-Barr (HLP) (Cahan, y asociados) se probó con respecto a la capacidad de producir anticuerpos IgM específicos de GD2. Las células fueron cultivadas en un medio completo RMPI (10% de FBS desactivado por calor, 1% de L-Glu, 1% de antibióticos (Sigma)). Se recolectó el medio de crecimiento gastado en los pasajes del 2 al 4 y se ensayó para concentración IgM y reactividad con GD2. El HLP produjo 6-8 de pg/mL IgM, (cuantificado mediante ELISA), después se creció durante 3 días un cultivo de 2-5 x 105 células/mL.

Para determinar si el IgM producido mediante HLP fue específico para GD2, se analizó mediante ELISA el medio gastado de cada cultivo. En síntesis, se recubrieron los gangliósidos para placas ELISA evaporando 200 µ? de etanol que contiene 25 ng de GD2, GD1a, GM2 o GM3. Posteriormente las placas fueron bloqueadas y se evaluó el enlace del medio de cultivo de célula que contiene IgM o IgM humano de acuerdo con procedimientos ELISA regulares. El medio gastado del HLP (concentrado ya sea 8.1-veces o 14.2-veces) contenía IgM reactivo-GD2 (figura 1A); sin embargo, los anticuerpos también reconocieron los gangliósidos GD1a, GM2, y GM3 (figura 1B). estos datos indican que el IgM producido mediante HLP es polireactivo.

Se llevó a cabo el análisis FACS para determinar si el IgM producido mediante HLP puede enlazar GD2 expresado en la superficie de células de melanoma. En síntesis, las células 1205LU, una línea celular de melanoma humana que expresa GD2 en su superficie, se incubaron con un medio gastado de cultivos HLP, se lavaron y posteriormente se etiquetaron con anticuerpo secundario Ig anti-humano-cabra-FITC (Jackson Laboratories). Tal como se muestra en la figura 2, únicamente el medio de cultivo de pasajes muy tempranos de HLP (pasaje 2) produjeron IgM que puede reconocer GD2 en la superficie celular (figura 2B). Sin embargo, esta actividad se perdió rápidamente después del subcultivo de HLP durante pocas semanas (figura 2C). Estos resultados sugieren que las células que producen , IgM reactivo de GD2 específico, son estimuladores de crecimiento lento en el HLP y son rápidamente sobrepobladas por productores de anticuerpo no específicos o no productores, o la producción de este IgM no es estable. El anticuerpo IgM de múrido anti-GD2 MAb- 26 (ATCC# HB-8568™), se utilizó como un control positivo y demostró un enlace específico-GD2 robusto (figura 2D).

EJEMPLO 2 Hibridomas Derivados de HLP Producen IgM Específico de GD-2 que Transmite Actividad CDC en Células Positiva GD2 Con el objeto de generar líneas de hibridoma-nulo que produce IgM específicas de anti-GD2, se fusionaron células de pasajes tempranos de HLP con partes de fusión A6 (ATCC CRL-8192) o K6H6/B5 (ATCC CRL-1823) para formar hibridomas. Debido a la abundancia aparentemente baja de subclones específicos de GD2 en el HLP, se clasificaron 80,000 clones mediante ELUSA específico de GD2. Aproximadamente del 5% al 10% de las preparaciones de anticuerpo de estas líneas de hibridoma mostraron una reactividad GD2 positiva. Sin embargo, alrededor de 90% de los clones positives GD2 mostraron reactividad para múltiples gangliósidos, cuando se clasificaron para especificidad utilizando un panel de gangliósidos (G D 1 , GM2 y GM3) (figura 3A - clones 5D7 y 10B4). Además, la mayoría de los anticuerpos polireactivos se reticularon para un panel de proteína se control no relacionadas (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que las células del linfoblasto que producen IgM específico de GD2, son raras en HLP.

Los esfuerzos de subclonación y clasificación condujeron al aislamiento de líneas de célula de hibridoma que producen IgM específicos de GD2. Se aislaron dos líneas de hibridoma específicos GD2, 3B2 y 1470. Los cultivos de ambas líneas celulares fueron sembrados en 0.3-0.4e6/mL de células con una densidad de sembrado y se dividieron cada 3 a 4 días, lo cual produjo 3-8 g/mL de IgM en un medio gastado. El ELISA específico de gangliósido reveló reactividad positiva con GD2 únicamente, y no reactividad para 3 gangliósidos de control (GD1a, GM2, y GM3) (figuras 3A y B), lo que sugiere que estas células producen anticuerpos específicos de GD2. Además, el análisis FACS mostró un manchado positive de células de melanoma humano 1205LU con anticuerpos 3B2 y 1470, lo que sugiere que estos anticuerpos puedan reconocer GD2 en la superficie celular (figura 4). Los análisis moleculares de los clones 3B2 y 1470, se llevaron a cabo para determinar el origen del clon. El ELISA específico de cadena ligera mostró que ambos clones secretaron IgM que contiene una cadena ligera kappa (datos no mostrados). El análisis de secuencia del cADN de estas células reveló secuencias de cadena pesada y ligera idénticas, lo que sugiere que los 2 clones fueron derivados del mismo clon de linfoblasto HLP (datos no mostrados).

El anticuerpo parcialmente purificado del cultivo 3B2, fue utilizado para evaluar la capacidad de este anticuerpo para transmitir la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) en líneas de célula de melanoma que expresan GD2, ya que esta actividad depende en gran parte de la conformación que el anticuerpo asume cuando se enlaza a su antígeno (Janeway y asociados, I mmunobiology, 9-12 (5° edición 2001)). Las líneas de célula objetivo de melanoma (líneas de célula positiva-GD2 LF0023 y M14, y líneas de célula negativa-GD2 PM0496 y JS0592) se cultivaron en RPMI1640 suplementado con 10% FBS, 2 mM de L-Glutamina, aminoácidos no esenciales, y 6 µ? HEPES y se recolectaron con tripsina antes de utilizarse. Las células objetivo se incubaron con sobrenadante que contiene IgM 3B2 en la presencia de 20% de suero humano. Después de incubación durante 1 hora a una temperatura de 37°C, las células vivas se identificaron con un reactivo Cell Titer Glo® reagent, (Promega Corp., Madison, Wl). Se determinó el porcentaje de aniquilación como la proporción de señal de células tratadas versus no tratadas. Los datos en la figura 1 sugieren que el IgM producido mediante el clon 3B2, puede provocar una potente reacción CDC en ciertas líneas de célula de melanoma positivo GD2.

Se llevaron a cabo análisis moleculares para determinar si los clones 3B2 y 1470 fueron infectados con EBV. Se designaron 6 pares de cebador PCR ((EBNA2-1141 f (SEC ID NO: 45) y EBNA2-144Ór (SEC ID NO: 46); EBV2001Í (SEC ID NO: 47) y EBV2622r (SEC ID NO: 48); EBV1901F (SEC ID NO: 49) y EBV2822R (SEC ID NO: 50); EBV169461Í (SEC ID NO: 51) y EBV170100r (SEC ID NO: 52); EBV169480Í (SEC ID NO: 53) y EBV170080r (SEC ID NO: 54); EBV8491F (SEC ID NO: 55) y EBV9020r (SEC ID NO: 56)) para verificar la existencia y lo intacto del genoma EBV. Uno de los pares de cebador amplificó las estructuras de lectura abierta de EBNA-2; 2 conjuntos de traslape, cada uno amplificó el extremo 5' y 3' del genoma EBV; y un par amplificó el origen de réplica. I nicialmente, los clones tanto 3B2 como 1470 fueron positivos EBV tal como se demuestra mediante PCR genómico (datos no mostrados). Sin embargo, la subclonación adicional mediante la limitación del revestimiento de dilución en menos de una célula por depósito, generó subclones de las líneas 3B2 y 1470 que no contienen el genoma EBV, tal como se determina mediante análisis PCR específico de EBV PCR (datos no mostrados).

Los subclones 3B2 negativos EBV (AB527-H YB-3B2-EBVnull) han sido colocados con el Recolección de Cultivo Tipo Americano (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 16 de Julio de 2008 y se les ha asignado el No. de Acceso PTA-9376. Los subclones AB527-HYB-3B2-EBVnulo fueron sometidos a una segunda vuelta de subclonación para identificar clones que produjeron una forma simple de cadenas-J de inmunoglobulina, ya que el hibridoma original puede producir la cadena-J humana o de ratón. Para identificar clones que poseen una forma simple de la cadena-J, o clones nulos-cadena-J, se llevó a cabo RT-PCR utilizando cebadores específicos para la cadena-J humana (hu-285F (SEC ID NO: 57) y hu-418R (SEC ID NO: 58)), o cadena-J de ratón (m-230F (SEC ID NO: 59) y m-370R (SEC ID NO: 60)). Los resultados indicaron que el subclon 3B2, AB527-H YB-3B2-3C9 , es nulo EBV, nulo de cadena-J humana, positivo de cadena-J de múrido y secreta aproximadamente 30 mg/L de IgM específico-GD2 monoclonal en un cultivo estático.

EJEMPLO 3 Producción de una Línea de Célula de Transfectoma que Exprese IgM Específico de GD2 El ARN total aislado de AB527-H YB-3B2-3C9 , EBV nulo, la cadena-J humana nula, el hibridoma positivo de cadena-J de múrido, fue transcrito en forma inversa en cADN y se utilizó como plantilla para la amplificación PCR de la cadena pesada IgM, utilizando cebadores que corresponden a las SEC ID NOs: 33 y 35, y cadena ligera, utilizando cebadores que corresponden a las SEC ID NOs: 36 y 38. La secuencia de nucleótidos de cadena pesada amplificad a partir de AB527-HYB-3B2-3C9, codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 40, y la secuencia de nucleótido de cadena ligera amplificada de AB527-HYB-3B2-3C9 codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 42. Se llevó a cabo una segunda vuelta de amplificación PCR para agregar una secuencia líder humana, junto con sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción 5' y 3' que fueron introducidos con el objeto de facilitar la clonación de los amplicones en pEE6.4 (cadena pesada) y pEE14.4 (cadena ligera), ambos vectores fueron suministrados como parte del Sistema de Expresión Lonza Biologies Glutamine Synthetase (GS System). La segunda vuelta de amplificación PCR de la cadena pesada IgM se llevó a cabo utilizando cebadores que corresponden a SEC ID NOs: 34 y 35, en tanto que la amplificación de cadena ligera utilizó cebadores que corresponden a las SEC ID NOs: 37 y 38.

El cADN de cadena ligera amplificado mediante PCR, fue digerido con Hindlll y EcoRI y se ligó en un corte similar pEE14.4, en tanto que el cADN de cadena pesada fue digerido con Hindlll y Mfel y se ligó en pEE6.4 digerido con Hindlll y EcoRI (Mfel y EcoRI dejan extremos "adherentes compatibles"). Después de la verificación de la secuencia de nucleótidos de las cadenas pesadas y ligeras, se introdujo el cartucho de expresión de cadena pesada en pEE 14.4-AB527-LC como un fragmento Notl/Pvul para construir el vector de expresión final pEE14.4-AB527-LC-HC (p0311) (figura 6). pEE14.4 es un vector 10 Kb que contiene in mini gen de sintasa y glutamina, que permite la selección de transfectantes estables en la presencia del inhibidor GS, sulfoximina de L-metionina (MSX). La transcripción de los insertos de cADN en este vector, es controlada por el promotor temprano inmediato CMV humano, la corriente ascendente del inserto de cADN es la región no traducida hCMV-MIE 5' incluyendo los intrones 1, la corriente descendente del inserto de cADN es la señal de poliadenilación SV40 que permite la poliadenilación eficiente de la transcripción (figura 7).

Las células CHO fueron transfectadas con el vector de gen doble, linealizado p0311 mediante electroporación para permitir la expresión del IgM específico de GD2 recombinante. Después de a transfección, las células fueron revestidas en placas de 96 depósitos utilizando un medio no selectivo que contiene suero de bovino fetal dializado (dFBS) y suplemento de sintasa de glutamina. Al siguiente día, se agregó a cada depósito un medio selectivo que contiene dFBS, suplemento de sintasa de glutamina y MSX (10 µ? de concentración final), permitiendo la selección de células que contienen el vector de expresión. Se detectaron únicamente las colonias percibidas como que vienen de una célula transfectada simple.

Los transfectantes fueron clasificados para la presencia de IgM humano mediante ELISA. Las colonias fueron expandidas en un medio de selección que contiene suero y las colonias sobrevivientes se revisaron mediante ensayo secundario cuantitativo para identificar las colonias de producción más alta. Los transfectantes de producción más altas se adaptaron al medio IS-CHO-CD™ definido en forma química (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y se sembraron en 2,500 células/depósito en placas de 96 depósitos de fondo plano (80 placas) en un medio que contiene 10 µ? MSX. Se analizaron las colonias resistentes a fármacos para producción IgM mediante ELISA. Las colonias positivas para producción IgM, fueron escaladas y analizadas para la productividad de anticuerpo en ensayos secundarios (6 depósitos) y terciarios (frasco de agitación de 20 mL) subsecuentes. Esto dio como resultado la identificación de un clon de transfectoma CHO-KISV que produce IgM, 127C8. El clon 127C8 no expresa la cadena-J, por consiguiente, elige IgM AB527 recombinante producido mediante estas líneas celulares deficiente en cadena-J. Las secuencias de aminoácido de las cadenas pesadas y ligeras de AB527 son representadas mediante las SEC ID NOs: 40 y 42, respectivamente.

EJEMPLO 4 AB527 se Enlaza Específicamente a GD2 In Vitro Se llevaron a cabo diversos experimentos para determinar si el AB527 recombinante puede enlazar a GD2 purificado in vitro. Inicialmente, se llevaron a cabo experimentos de resonancia de plasmón de superficie no únicamente para determinar si AB527 recombinante puede enlazar a GD2, sino también para determinar si exhibe afinidad para GM2 o GD3 (figura 8). Los experimentos se llevaron a cabo como se indica a continuación: se inyectaron 40 µ?_ de soluciones 0.3 mg/mL de GD2 (BioDesign), GD3 (HyTest), y GM2 (USBiological) en 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA (HBS-E) que contiene 30% de etanol, sobre células de flujo 2, 3, y 4, respectivamente, de un pedazo de CM5 en un rango de flujo de 5 µ?/minuto utilizando un instrumentos BIAcore 3000. Se llevaron a cabo 5 inyecciones repetidas de 20 µ?_ de 10 mM NaOH después de inmovilización de cada gangliósido hasta que se logró una línea de base estable. Posteriormente, se inyectaron 80 µ!_ de 200 nM de AB527 recombinante en amortiguador en HBS-E en las 4 células de flujo (célula de flujo 1 fue utilizada como una célula de flujo de referencia) en un rango de flujo de 20 µ?/???????. La disociación de AB527 recombinante fue seguida durante 6 minutos. La superficie del pedazo se degeneró con 50 µ\- de 10 mM NaOH.

Para caracterizar de mejor manera las cinéticas de enlace de AB527, se llevaron a cabo experimentos de resonancia de plasmón de superficie adicionales utilizando diluciones en serie de AB527 y GD2 inmovilizado en un trozo CM5 de BIAcore chip. En síntesis, se inyectaron diluciones en serie al doble de AB527, comenzando en 800 nM, sobre un pedazo de CM5 que contiene GD2, descrito anteriormente, en un rango de flujo de 20 µ?-Jminuto en amortiguador HBS-E. La superficie del chip se regeneró entre cada ciclo con 50 µ?_ de 10 mM de NaOH. Se determinó el enlace de equilibrio en cada concentración (Req) para cada concentración probada en un software BIAevaíuation y posteriormente se realizó un trazo de Req versus la concentración. Los datos resultantes fueron ajustados a un modelo de enlace de estado, constante no lineal utilizando un software GraphPad Prizm®. Cuando el Req es trazado como una función de la concentración AB527, el estado constante KD, o la concentración de AB527 en la cual se logra el enlace máximo a la mitad, se pueden determinar (figura 9). Para el enlace de AB527 a GD2, el valor KD de estado constante es de 4.5 x 10"9 M.

La especificidad de AB527 recombinante también se probó inmunomanchando diversos gangliósidos separados mediante cromatografía de capa delgada (TLC). Se utilizaron los siguientes gangliósidos en el análisis inmunoTLC: mezcla GM (Matreya, 0.5 mg/mL en etanol contiene GM1, GM2, y GM3), mezcla GD (Matreya, 0.5 mg/mL en etanol, contiene GD1a, G D b, y GD3), GM4 (Matreya, 1 mg/mL en etanol), GD2 (BioDesign, 1 mg/mL en etanol), y GM3 (USBiological, 1 mg/mL en etanol). Se mancharon un total de 2 µ? de cada gangliósido sobre una placa TLC de sílice de 5 x 10 cm (EMD Chemicals, Inc.) y se desarrolló en una solución que tiene una proporción de 58:37:8 de CHCI3, MeOH, y 0.1 M CaCI2. Las placas TLC se mancharon para gangliósido total rociando con 0.1% de orcinol en 1.36N H2S04 y calentando a una temperatura de 100°C. Para el análisis inmunoTLC, las placas desarrolladas fueron tratadas primero con 0.1% de poliisobutilmetacrilato en H20, y posteriormente se secaron. Posteriormente las placas fueron bloqueadas durante 1 hora con 1% de BSA en solución salina amortiguada por fosfato 1x (PBS). Posteriormente la placa bloqueada se incubó en 2 pg/mL AB527 en 1x PBS que contiene 1% BSA durante la noche a una temperatura de 4°C. Las placas se lavaron subsecuentemente con 1x PBS, posteriormente se incubaron con conjugado de peroxidasa de rábano-lgG/lgM antihumano de cabra diluido 1:4000 en PBS que contiene 1% de BSA. Las placas fueron lavadas, y se detectó el anticuerpo enlazado incubando las placas en 0.3 mg/mL 4-cloro 1-naptol y 0.03% de H202. Los resultados del manchado comparativo se muestran en la figura 10.

Ejemplo 5 AB527 Marca las Células que Expresan GD2 Se evaluó la capacidad de AB527 para marcar en forma específica las líneas de célula de melanoma que expresan GD2. Se cultivaron líneas positivas-GD2: M14, M0023, M101, M18, M10-Vac, y PM0496, y líneas negativas-GD2: M21, M238, IMCD0023, MG1055 por separado en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-Glutamina, aminoácidos no esenciales, y 6 µ? de HEPES y se recolectaron con tripsina.

Las células tripsinizadas fueron incubadas ya sea con 10 g mL de IgM de control (IgM humano, Pierce cat# 31146) (columna I) o 10 pg/mL de AB527 (columna II) durante 1 hora sobre hielo. Después de 3 lavados con 1x PBS, las células se incubaron con 10 g/mL de anticuerpo Ig anti-humano de cabra etiquetado-FITC (H + L) (Southern Biotech, Birmingham, AL) durante 1 hora sobre hielo, seguido ya sea de citometría de flujo (columnas I y II, respectivamente) o microscopio de luz y análisis de microscopio de inmunofluorescencia (columnas III y IV, respectivamente). Tal como se muestra en la figura 11, las células etiquetadas con AB527 expresan GD2 en su superficie (columna II). De manera inversa, ninguna de las líneas celulares revisadas mostraron manchado con IgM humano no específico de GD2 (columna I). Los estudios ¡nmunofluorescentes mostraron una correlación directa con los datos de citometría de flujo (columna IV), las imágenes del microscopio de luz también se muestran con propósitos de comparación (columna III).

Los ELISAs a base de células se llevaron a cabo para evaluar el enlace AB527 a las líneas de célula que expresan GD2 M14, LLC-MK2, células EL4 y a células CHO-K1 (control negativo), lo cual proporciona los datos para llevar a cabo los análisis Scatchard correspondientes. La figura 12 proporciona un conjunto representativo de datos de Scatchard para células EL4. Se determinó el enlace AB527 a células M14 y LLC-MK2 como casi idéntico (0.13±0.02 nM y 0.15±0.04 nM, respectivamente). El enlace a células EL4 fue un poco inferior (0.93±0.16 nM). Esta diferencia puede ser debido a la expresión marcadamente inferior de GD2 observada en células EL4 relativas a M14 y LLC-MK2 (datos no mostrados). Para estos experimentos, las células M14, LLC-MK2, EL4, y CHO-K1 fueron obtenidas de la Recolección de Tejido Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA). Se cultivaron células M14, EL4, y CHO-K1 en RPMI suplementado con 10% de suero de bovino fetal. Las células LLC-MK2 fueron cultivadas en un Medio 199 suplementado con 1% de suero de caballo. Las células fueron suspendidas en 1X PBS y se agregaron a una placa de microtitulacion de fondo en forma de U color negro (Grenier cat. # 665209) en 2.5x106 células/depósito, posteriormente se peletizaron en 1500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue desechado, y las células fueron resuspendidas en una solución que contiene AB527 comenzando en 20 pg/mL diluidos en serie 1:2 en PBS que contiene 2% BSA. Las células fueron incubadas con anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas tres veces con 200 pL PBS que contiene 2% BSA y 0.05% Tween®-20, centrifugando en 1500 rpm durante 5 minutos para recolectar células entre los pasos de lavado. Posteriormente las células se incubaron en una solución PBS que contiene 1 pg/mL de IgG/lgM anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (Jackson I mmunoresearch) y 2% de BSA durante 1 hora en temperatura ambiente. Las células fueron lavadas como se indicó anteriormente. Se detectó el AB527 enlazado utilizando el substrato fluorescente QuantaBlu™ (Pierce), con longitudes de onda de excitación/emisión de 325 nm/420 nm, en un lector de placa multimodal SpectraMax® M5 (Molecular Devices). Los datos sin procesar fueron trazados en SoftMax Pro® (ver. 5.2) y se adaptaron a un modelo de 4 parámetros. El análisis de datos se llevó a cabo en un software GraphPad Prizm® (ver. 4.03). El fondo no específico fue sustraído primero (enlace a células CHO-K1), y posteriormente los datos fueron analizados mediante análisis Scatchard.

Se llevaron a cabo experimentos inmunohistoquímicos (IHC) para determinar si AB527 exhibió reactividad cruzada a células de melanoma que no expresan GD2. AB527 purificado, así como un IgM humano no específico (Pierce cat# 31146), fueron biotinilados utilizando una química de acoplamiento de éster NHS, en una proporción molar de 50:1 de reactivo de biotinilación (EZ-Link™ sulfo-NHS-LC-biotin, Pierce cat# 21335) en solución salina amortiguada por fosfato, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas, y utilizadas para manchar diversas líneas celulares positivas GD2 (M14) o negativas GD2 (MG1055, RPMI7951 y JS0592). En síntesis, cada línea de célula de melanoma fue sembrada en correderas de cámara y cultivadas durante la noche en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-Glutamina, aminoácidos no esenciales, y 6 µ? de HEPES. Las células se lavaron una vez con 1x PBS y se fijaron con formalina. Las células fijas se incubaron durante la noche con 1 pg/mL de AB527 biotinilado o IgM humano no específico biotinilado (control negativo) y las células etiquetadas fueron detectadas utilizando el sistema de detección BioGenex Super Sensitive™ Link-Label IHC Detection System. Tal como se muestra en la figura 13A, AB527 se enlaza específicamente a células positivas GD2 y tiene una mínima reactividad cruzada con células negativas GD2, en tanto que el anticuerpo de control de isótopo no específico no mancha cualquier tipo de célula (figura 13B).

También se evaluaron las características de enlace de AB527 utilizando muestras de tejido de tumor y .normales. Se biotinilaron AB527 y un IgM humano normal no específico (hlgM) en Covance Research Products y se utilizaron para estudios IHC en Charles River Laboratories. Las células de cáncer de melanoma humano, M14, fueron implantadas en ratones desprotegidos para establecer tumores de xenoinjerto, los cuales posteriormente se utilizaron como tejido de control positivo GD2 para el desarrollo de un método IHC. Los estudios preliminares utilizando un procedimiento complejo de avidina-biotina-peroxidasa directo (ABC) produjeron un manchado positivo de secciones de tumor M14 con AB527 biotinilado (figura 14(b)) pero no con hlgM biotinilado (figura 14(a)). Tal como se espera, los linfocitos en criosecclones de bazo humano normal, no mancharon con cualquier anticuerpo. Después de la titulación de los anticuerpos, las concentraciones de manchado para AB527 biotinilado y hlgM biotinilado seleccionado para el estudio de reactividad cruzada de tejido humano GLP, se ajustaron en 3 y 15 g/mL. Utilizando este método, se llevó a cabo un estudio para determinar el enlace AB527 en 35 tejidos humanos normales (3 muestras/donadores por tejido). Tal como se espera, el manchado membranoso de alta afinidad (membrana de célula positiva que mancha en la concentración más baja de AB527 - 3 µ9/???-) puede detectarse en secciones de tumor M14. Tal como se muestra en la tabla 2, el manchado membranoso de alta afinidad se encontró únicamente en las células epiteliales del esófago (2 de 3 muestras), tubo falopiano (1 de 3 muestras), y uretra (1 de 3 muestras), así como en células deciduales de placenta (3 de 3 muestras), y células reticulares del depósito as en decidual células de timo (2 de 3 muestras). Todos los otros tejidos no mostraron manchado membranoso de alta afinidad (tabla 2).

Tabla 2: Inmunohistoquímica AB527 en Tejidos Humanos Normales EJEMPLO 6 AB527 Facilita la Citotoxicidad Dependiente de Complemento de Células que Expresan GD2 Para determinar si AB527 transmite CDC, las líneas de célula de melanoma descritas anteriormente para la figura 11, fueron incubadas con anticuerpo parcialmente purificado del clon AB527-HYB-3B2-3C9 o AB527. Las células objetivo fueron cultivadas en RPMII 640 suplementado con 10% FBS, 2 mM de L-Glutamina, aminoácidos no esenciales, y 6 µ? de HEPES y se recolectaron con tripsina antes de utilizarse. Las células objetivo fueron incubadas con 10 g/mL del IgM del clon ya sea AB527 o AB527-HYB-3B2-3C9 en la presencia de 20% de suero humano. Después de incubación durante 1 hora a una temperatura de 37°C, se identificaron células vivas con reactivo Cell Titer Glo® (Promega Corp., Madison, Wl). Se determinó el porcentaje de aniquilación como la proporción de señal de las células tratadas versus no tratadas. Los datos en la figura 15 muestran que ambos anticuerpos pueden provocar una potente reacción CDC en ciertas líneas de célula de melanoma, con AB527 originando en forma consistente un mayor grado de CDC. Los resultados de los experimentos utilizando AB527 descritos en este ejemplo se resumen en la tabla 3.

Tabla 3: Comparación de FACS, Microscopio de Inmunofluorescencia y Análisis CDC de líneas de célula de melanoma humano tratadas con AB527.

Se realizó un trabajo adicional para mostrar que AB527 facilita CDC únicamente de células que expresan GD2 en la presencia de complemento. Tal como se muestra en la figura 16, la actividad CDC transmitida por AB527 únicamente ocurrió en niveles apreciables en la presencia de complemento y células que expresan GD2, tal como, células M14, en forma opuesta a célula 1205LU, las cuales son células de tumor humano que no expresan GD2.

Para evaluar la capacidad in vitro de AB527 conmutado con isotipo I g G 1 para inducir CDC, el fragmento de ADN de la región variable HindIII/BamHI de AB527 fue clonado en-cuadro en un vector pEE6.4 diferido con HindIII/BamHI que contiene la región constante lgG1. La expresión en conjunto con la cadena ligera AB527, originó la producción de una versión lgG1 de AB527. La capacidad de este anticuerpo para transmitir CDC de células M14 se comparó con la versión IgM de AB527 en 1-100 µg/mL, tal como se muestra en la figura 17..

También se llevaron a cabo estudios para evaluar el desempeño que puede tener la cadena-J en CDC transmitido por AB527. Para producir moléculas IgM AB527 que tienen cadena-J, el plásmido p0362, el cual codifica la cadena-J, fue transfectado con células CHOKI-SV y se generó una línea clonal que expresa la cadena-J, estable. Posteriormente se introdujo en esta línea el plásmido de expresión AB527 para generar clones que expresan AB527 y la cadena-J. Se aislaron 3 clones, es decir 5.F2-JC, 5.F8-JC, y 6.C3-JC. Los anticuerpos fueron purificados en paralelo para comparar su actividad CDC relativa contra una versión que no contiene cadena-J de AB527. Las curvas de respuesta de la dosis se muestran en la figura 18. El 90% calculado de la dosis efectiva (ED90) para AB527, 5.F2-JC, 5.F8-JC, y 6.C3-JC, .fue de 1.21, 4.35, 2.52, y 6.81 pg/mL, respectivamente. El IgM que contiene la cadena-J (5.F2-JC, 5.F8-C, y 6.C3-JC) parece ser menos efectivo en transmitir CDC, en comparación con AB527 sin cadena-J.

EJEMPLO 7 Captura de IgM a Partir del Sobrenadante de Cultivo Acondicionado Mediante Cromatografía de Afinidad de proteína Se empacó una columna con resina CPG3000A-proteína A (Millipore). El volumen de la resina utilizado para capturar IgM fue estimado, con la comprensión de que 1 ml_ de resina enlaza aproximadamente 8 mg de IgM en un rango de flujo de 76 cm/h (tabla 4). Una vez que se cargó la columna con la cantidad deseada de resina, se conectó a un aparato FPLC y se lavó con 5 volúmenes de columna de agua purificada; 3 volúmenes de columna de 20 mM de HCI, pH 1.5 (amortiguador A2); y 3 volúmenes de columna de 6 M guanidina-HCI (amortiguador A3). Antes de cargar la muestra, la columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio que contiene 200 mM de NaCI y 0.01% de Tween®-80, pH 7.5 (amortiguador A1).

Se aclaró el sobrenadante de cultivo acondicionado (CCS) mediante filtración a través de un filtro de membrana.22 µ?t?. Se agregó detergente al CCS filtrado, dando como resultado una solución que contiene 1% de Tritón® X-100 y 0.1% de TNBP y se incubó a una temperatura de 4°C durante más de 2 horas. Se aplicó CCS tratado con detergente a una columna de proteína A CPG3000A equilibrada y se procesó en un rango de flujo de 76 cm/h. Después de lavar las proteínas no enlazadas con 10 volúmenes de columna de amortiguador A1, se eluyó el IgM de la columna utilizando un amortiguador de fosfato de sodio 5 mM suplementado con MgCI2 3 M, pH 6.8 (amortiguador B). Se eliminaron las proteínas enlazadas restantes de la columna, aplicando 3 volúmenes de columna de amortiguador A2 y 3 volúmenes de columna de amortiguador A3. Se llevó a cabo una reducción de gel SDS-PAGE que compara el CCS tratado con detergente aplicado a la columna de proteína A (Carga) y AB527 recolectado de las fracciones reunidas después de elución (Eluato) (figura 19 - las flechas apuntan hacia la cadena IgM µ (~70kD) y la cadena ligera (~25kD)). La cromatografía de afinidad de proteína A permitió la recuperación del >90% de IgM de entrada, el cual está sustancialmente libre de contaminantes. í Tabla 4- Capacidad de enlace dinámico de IgM mediante resina de proteína A CPG3000A. Se corrieron diversos volúmenes de CCS que contiene AB527 a través de una columna CPG3000A 10X25 mm en diferentes rangos de flujo lineal. La concentración en AB527 cargada en la columna y presente en el flujo, se midió determinando sus concentraciones relativas en comparación con las de una curva estándar para estándares IgM conocidos determinados en una columna de proteína A (POROS A, Applied Biosystems), adaptado en un sistema HPLC. La proporción de AB527 en cada flujo a la cantidad de anticuerpo cargada se completó para cada inyección, para determinar la capacidad de enlace dinámico de la columna en 5% y 10% IgM de rompimiento.

EJEMPLO 8 Separación de IgM de Contaminantes de Sobrenadante de Cultivo Acondicionado Mediante Cromatoqrafía de Intercambio de Cationes Para eliminar los contaminantes, se concentró IgM suspendido en amortiguador B mediante diafiltración utilizando un cartucho Prep/Scale-TFF 1 (Millipore) y un volumen de 10-veces de un amortiguador que contiene 10 mM de fosfato de sodio, 75 mM de NaCI. Se llevó a cabo la diafiltración en un rango de flujo de aproximadamente 200 mL/minuto, con una presión de entrada mantenida en menos de 20 PSI y un flujo de impregnación en aproximadamente 60 mL/minuto. Se agregó una solución de 10% de Tritón® X-100 a la muestra diafiltrada para producir una concentración final de 1% de Tritón® X-100, y la muestra se incubó en temperatura ambiente durante 1 hora y se filtró a través de una membrana 0.2 µ??.

Se empacó una columna de intercambio de cationes con resina MacroCap™ SP (GE Healthcare). El volumen de resina utilizado para capturar Ig fue estimado, con la comprensión de que 1 mL de resina enlaza aproximadamente 9 mg de IgM en un rango de flujo de 76 cm/h (figura 20). Una vez que la columna fue cargada con la cantidad de resina deseada, se conectó a un aparato FPLC y se lavó con 2 volúmenes de columna de agua purificada; 3 volúmenes de columna de 0.5 M NaOH (amortiguador A6), y 3 volúmenes de columna de 2 M, NaCI. Antes de cargar la muestra, la columna se equilibro con 5 volúmenes de columna de un amortiguador que contiene 10 mM de fosfato de sodio, 75 mM de NaCI, 0.01% de Tween®-80, pH 6.8 (amortiguador A4).

La muestra diafiltrada fue aplicada a la columna y se proceso en un rango de flujo de 76 cm/h. Después de lavar las proteínas no enlazadas con 5 volúmenes de columna de amortiguador A4, IgM se eluyó de la columna utilizando 4 volúmenes de columna de un amortiguador de fosfato de sodio 10 mM que contiene 200 mM de NaCI y 0.01% de Tween®-80, pH 6.8 (amortiguador C). Las proteínas enlazadas restantes fueron eliminadas de la columna aplicando 3 volúmenes de columna de amortiguador A6 y 3 volúmenes de columna de 2 M de NaCI. Tal como se muestra en las figuras 13 A y B, el material de flujo contenía en gran parte una mezcla de trímeros y dímeros IgM (figura 21A); sin embargo, el material eluido fue casi exclusivamente IgM pentamérico (figura 21B). La cromatografía de intercambio de cationes proporciona un rendimiento del > 95% de IgM pentamérico que está sustancialmente libre de contaminantes y IgM ensamblado en forma incompleta (figura 22).

EJEMPLO 9 Separación de IgM de los Contaminantes de Sobrenadante de Cultivo Acondicionado Mediante Cromatografía de Hidroxiapatita La columna de hidroxiapatita se preparó utilizando CHT® II Ceramic Hydroxyapatite, tamaño de gránulo 80 µ?t? (Bio-Rad Laboratories, #157-8100). El volumen de resina utilizado para capturar IgM fue estimado, con la compresión de que 1 mL de la resina enlaza aproximadamente 20 mg de IgM en un rango de flujo de 76 cm/h, y que en este rango de flujo existe menos del 5% de pérdida de IgM en el flujo de la columna. La columna se empacó hidratando la matriz con 200 mM de fosfato de potasio pH 9.0, utilizando 0.54 g de matriz seca por cada mL del volumen de columna-cama. La matriz hidratada se agregó a la columna, permitiendo que se asentara antes de que la resina se ? equilibrara con 5 volúmenes de columna de un amortiguador que contiene. 10 mM de fosfato de sodio, 100 mM de NaCI, 0.01% de Tween®-80, pH 6.8 (amortiguador A8) Para reducir los contaminantes, IgM se suspendió en 10 mM de fosfato de sodio, 200 mM de NaCI, 0.01% de Tween®-80, pH 6.8 se diluyó con un volumen equivalente de 0.01% de Tween®-80 y se agregó a la columna equilibrada. Se proceso la suspensión IgM a través de la columna en un rango de flujo de 76 cm/h. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de amortiguador A8, para eliminar las sustancias no enlazadas. Se eluyó el IgM enlazado con 4 volúmenes de columna de un amortiguador de fosfato de sodio 175 mM que contiene NaCI 100 mM y 0.01% de Tween®-80, pH 6.8 (datos no mostrados). Después de la elución, se eliminaron las proteínas enlazadas restantes de la columna con un amortiguador de fosfato de sodio 500 mM que contiene NaCHOO mM, pH 6.8. La solución IgM resultante estuvo sustancialmente libre de contaminantes. La solución eluida de la matriz de hidroxiapatita, cuando estuvo precedida de cromatografía de afinidad de proteína y cromatografía de intercambio de cationes, aquí descritas, fue aproximadamente el 99% pura en comparación con el sobrenadante de cultivo de célula aclarado.

EJEMPLO 10 Producto de Conjugados de Gangliósido-BSA Un conjugado GD2-BSA se produjo para proporcionar un antígeno GD2 efectivo para revisar la especificidad de anticuerpos específicos de GD2 mediante inmunoensayo. Además, los conjugados GM2-BSA y GM3-BSA fueron producidos para servir como controles para especificidad de enlace GD2-BSA. Los conjugados covalentes fueron preparados mediante aminación reductiva específica del sitio de los gangliósidos mediante aminas presentes en BSA, utilizando cianoborohidruro de sodio como un agente de reducción leve. Se considera que el acoplamiento ocurre principalmente para los grupos e-amino terminales en las cadenas laterales de los residuos de lisina presentes en BSA.

Para preparar los conjugados, se combinaron 400 µ? de una solución 2 mg/ml de BSA disuelta en 0.05 , M de amortiguador de carbonato-bicarbonato, pH 9.6, con 500 µ? de una solución 1 mg/ml de GD2 (Biodesign International, #A86168H ), GM2 (Axxora, #ALX-302-005-M001 ), o GM3 (Axxora, #ALX-302-003-M002) disuelta en etanol absoluto; 2070 µ? de amortiguador de carbonato-bicarbonato 0.05 M, pH 9.6; y 30 µ? de una solución de cianoborohidruro de sodio 5 M de hidróxido de sodio 10 mM. La mezcla de reacción se incubó a una temperatura de 25°C durante 2 horas antes de agregar 1200 µ? de etanolamina 1M, pH 8.0 e incubar a una temperatura de 25°C durante 15 minutos adicionales. La solución de reacción se colocó en una tubería de diálisis (Pierce Biotechnology, # 68100) y se dializó 2 veces en 1L de una solución de carbonato-bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.6, a una temperatura de 2°C a 8°C durante 6 a 18 horas.

EJEMPLO 11 AB527 Enlaza a GD2 Conjugado por BSA Se evaluó la antigenicidad del conjugado GD2-BSA mediante ELISA. Se preparó el amortiguador de recubrimiento ELISA disolviendo una cápsula de carbonato/bicarbonato (Sigma) en 100 mL de agua ultrapura. Se diluyó el conjugado GD2-BSA a una concentración de 2 pg/ml, en amortiguador de recubrimiento ELISA, y se agregó a depósitos de una placa ELISA de 96-depósitos (Greiner Bio-One cat # 655081). Las placas se sellaron e incubaron a una temperatura de 2°C a 8°C durante 16 a 24 horas. Después de la incubación, el amortiguador de recubrimiento fue eliminado de los depósitos y se agregaron 0.3 mL/depósito de una solución de bloqueo ELISA (PBS suplementado con 2.5% BSA (p/v) y 0.05% Tween®-20). Las placas se incubaron, agitando al mismo tiempo en un agitador de microplaca, durante 2 horas a una temperatura de 21°C a 25°C antes agregar anticuerpo AB527. Se agregaron diluciones en serie al doble de AB527 (concentración de trabajo inicial de 2 pg/ml) a las placas ELISA bloqueadas y se incubaron con agitación en un agitador de microplaca a una temperatura de 21°C a 25°C durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces en el lavador de placa Dynex Ultrawash™, utilizando amortiguador de lavado ELISA 0.3 mL/depósito. El AB527 enlazado fue detectado con IgG + IgM anti-humano de cabra conjugado-HRP (H + L) diluido 1:10,000 en amortiguador de bloqueo ELISA. Se eliminó el conjugado-HRP y los depósitos fueron lavados tres veces con amortiguador de lavado ELISA 0.3 mL/depósito. Se agregó substrato SureBlue™ TMB (50 µ?/depósito) a los depósitos lavados y las placas se incubaron a una temperatura de 21°C a 25°C durante 15 minutos, antes de que el enlace ÁB527 fuera evaluado mediante absorción de luz (450 nm) (figura 23). Se determinó la absorción no específica en 450 nm para ser de 0.065 en la ausencia de AB527.

En contraste con el conjugado GD2-BSA, AB527 no reconoció otros conjugados de gangliósido-BSA. Los gangliósidos GM2 y GM3 fueron conjugados para BSA, a través del método descrito para GD2, y ambos fueron evaluados mediante ELISA, con respecto a la capacidad dé provocar un enlace AB527. Tal como se muestra en la figura 24, AB527 reconoció únicamente el conjugado GD2-BSA. Se deberá observar que un anticuerpo específico de GM2 tiene la capacidad de detectar el conjugado GM2-BSA; sin embargo, un anticuerpo específico de GM3 adecuado, no está disponible para evaluar la naturaleza antigénica del conjugado GM3-BSA (datos no mostrados).

EJEMPLO 12 Efecto de CMS en Células que Expresan AB527 Crecidas en un Medio Completo en GIBCO-CD CHQ Para determinar el efecto del suplemento del medio de cultivo (CMS) en el crecimiento celular de producción de anticuerpos, las células fueron revividas y cultivadas en un frasco de agitación en 20 mL de un medio completo GIBCO-CD-CHO. Todos los cultivos se incubaron en un frasco de agitación de 125 mL a una temperatura de 37°C, 5% C02, 120 rpm. La densidad de sembrado fue de 3.5 x 105 células/mL en una viabilidad de > 95%. Las células fueron cultivadas durante 14 días ya sea en un medio CD-CHO o en un medio CD-CHO suplementado los días 3 y 7 con 2% (vol/vol) CMS. Después de la adición de CMS el día 7, se había suplementado un total de 10% del volumen de cultivo inicial con CMS. Se determinaron la densidad de célula viable (figura 25), porcentaje de viabilidad (figura 26), y densidad de célula viable integral (IVC) (figura 27) utilizando un contado de célula automática CEDEX los días 0, 3, 5, 7, 10, 13, y 14. Se determinó la producción de anticuerpos para cada grupo de células de cultivo el día 14 mediante HPLC de proteína A (figura 28).

Tal como se muestra en la figura 25, las células cultivadas abastecidas con 2% de CMS del día 3 al día 7, lograron una densidad de célula viable máxima de 12.8 x 106 células/mL el día 7. El cultivo de la célula de control, sin CMS, alcanzó una densidad de célula máxima de 10.7x106 células/mL el día 7. El uso de CMS, renueva los componentes del medio limitantes tales como glucosa, aminoácidos y vitaminas y ayuda al cultivo alcanzar una mayor densidad celular. En ambas condiciones del cultivo celular, las células mantuvieron una buena viabilidad (> 90%) hasta el día 7 (figura 26); sin embargo, las células cultivadas que proporcionaron CMS del día 3 al día 7, demostraron una mejor viabilidad que el cultivo de control después del día 7. Es posible que algunos nutrientes fueran agotados en el cultivo de control después del día 7, mientras que CMS agregó nuevamente los nutrientes claves y ayudó a la célula a mantener una mejor viabilidad.

El día 14, se evaluó la producción de anticuerpo total para cada cultivo. Las células cultivadas con CMS alcanzaron un titulador de anticuerpo máximo de 7240 mg/L, mucho mayor que el observado para el cultivo de control (3036 mg/L) (figura 28). El titulador de anticuerpo mayor puede ser un resultado de un rango de producción de anticuerpo específico superior después de la adición de los nutrientes.

La investigación de los perfiles del crecimiento celular y producción de anticuerpo para cada condición de crecimiento demostró que el cultivo abastecido con CMS, logró un incremento del 140% en la producción de anticuerpos (tabla 5). Incluso aunque el tiempo de duplicación fue el mismo para ambos cultivos, el CMS ayudo a los cultivos a lograr una mejoría del 50% en IVC y otro incremento del 50% en el rango de producción de anticuerpo específico. El 50% de mejoría en IVC, fue debido a una mayor densidad de célula máxima lograda en el cultivo con CMS. Ya que el titulador de anticuerpo final es igual al rango de producción específico múltiple IVC, se sugiere que tanto IVC como el rango de producción de anticuerpo específico contribuyan al incremento del anticuerpo /en la producción de anticuerpo en el cultivo celular con CMS. La tabla 5 resume los efectos de CMS en células que expresan AB527.

Tabla 5 - Resumen de los Efectos de CMS en el Crecimiento Celular y Producción de Anticuerpo de Células que Expresan AB527.

EJEMPLO 13 Efecto de Ácido Valérico en Células que Expresan AB527 Crecidas en un Medio Completo GIBCO-CD CHO Para determinar el efecto del ácido valérico en el crecimiento celular, se cultivaron células que expresan AB527 en un medio completo GIBCO-CD-CHO suplementado con ácido valérico a una concentración de 0 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM, o 8 mM. Las células fueron cultivadas durante 14 días y se determinaron la densidad de célula viable, porcentaje de viabilidad y densidad de célula viable integral utilizando un contador de célula automática CEDEX los días 0, 3, 5, 7, 10, 13, y 14. La producción de anticuerpo fue determinada para cada grupo de células cultivadas el 14 mediante HPLC de proteína A.

Las células cultivadas en ácido valérico lograron la densidad celular máxima de 10.8 x 106 células/mL el día 7; sin embargo, las células cultivadas con ácido valérico crecieron en forma mucho más lenta conforme incrementó la concentración de ácido valérico. Por ejemplo, las células cultivadas en 8 mM de ácido valérico, alcanzó una densidad celular máxima de 5.4 x 106 células/mL el día 7, lo cual es la densidad celular máxima más baja de todos los cultivos. Los estudios de viabilidad celular demostraron que las células cultivadas con ácido valérico tuvieron una menor viabilidad antes del día 7, con la viabilidad más baja el día 7 (67.4%) observada para células cultivadas en 8 mM de ácido valérico. Estos resultados indican que una mayor concentración del ácido valérico inhibió la proliferación celular. Después del día 7, la viabilidad del cultivo de control cayó en forma mucho más rápida; sin embargo, esto se debe probablemente al consumo de nutrientes claves, ya que este cultivo celular tuvo una densidad celular mucho mayor que los cultivados en ácido valérico (tabla 6).

Sin embargo, en forma inesperada, el ácido valérico tuvo un efecto positivo en la producción de anticuerpos. Todas las células cultivadas en la presencia de ácido valérico, con la excepción de la concentración más alta de 8 mM, tuvieron mayores tituladores de anticuerpo que el cultivo de control el día 14. Las células cultivadas en ácido valérico 1 mM, produjeron el titulador de anticuerpo más alto (4137 mg/L) el día 14, el cual es de 36% mayor que el del cultivo de control (3036 mg/L) (tabla 6).

Incluso aunque el ácido valérico inhibió el crecimiento celular, no demostró el efecto negativo significativo en la integral de la densidad de célula viable, excepto en la concentración más alta de 8 mM. Los valores IVC el día 14, fueron muy similares a los de las otras cuatro condiciones de cultivo. Es probable que la inhibición de ácido valérico en la proliferación celular conduzca a un consumo más dentro de los nutrientes, evitando de esta forma un medio agotado de nutrientes de etapa tardía, el cual se encuentra en el cultivo de control .

En síntesis, el cultivo celular puede lograr una mejor producción de anticuerpos en la presencia del ácido valérico. El rango de producción de anticuerpo específico que fluctúa de 52 a 58 mg/109 células/día, fue observado en cultivos con ácido valérico (tabla 6), los cuales son mucho mayores que el valor de 44 mg/109 células/día observado para el cultivo de control. Por lo tanto, la producción de anticuerpo más alta lograda por células cultivadas en ácido valérico 1 mM, se debió principalmente a los incrementos en la producción de anticuerpo específico (tabla 6).

Tabla 6 - Resumen de Efecto de Ácido Valérico en Crecimiento Celular y Producción de Anticuerpo de Células que Expresan AB527.

Claims (43)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que enlaza específicamente a GD2 humano, en donde la CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12.

2. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la CDR1 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10, la CDR2 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11, la CDR1 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 26, la CDR2 de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 27, y la CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 28.

3. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano.

4. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16.

5. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1 caracterizado porque el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 32.

6. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 40.

7. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 42.

8. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo es del isotipo IgM.

9. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo es polimérico.

10. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque el estado polimérico del anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo es pentamérico.

11. El anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo pentamérico o fragmento de enlace de antígeno del mismo no incorpora una cadena-J.

12. Un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe' en la reivindicación 1, caracterizado porque transmite la citotoxicidad dependiente de complemento.

13. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno, tal como se describe en la reivindicación 1.

14. El polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque comprende SEC ID NO: 4.

15. El polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque comprende las secuencias de ácido nucleico de SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, y SEC ID NO: 20.

16. El polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 8.

17. El polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 24.

18. El polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 39.

19. El polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 41.

20. Una composición que comprende el anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno, tal como se describe en la reivindicación 1 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

21. Un vector que comprende la secuencia de polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 14.

22. Una célula que comprende el vector tal como se describe en la reivindicación 21.

23. La célula tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque la célula es una célula bacteriana.

24. La célula tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque la célula es una célula eucariótica.

25. La célula eucariótica tal como se describe en la reivindicación 24, caracterizado porque la célula eucariótica es una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO).

26. Una célula que expresa el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 1.

27. Una célula que expresa el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo tal como se describe en la reivindicación 11.

28. La célula tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque la célula es un hibridoma.

29. La célula tal como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque la célula es un transfectoma.

30. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con GD2 en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo que enlaza específicamente a GD2 en una cantidad efectiva para tratar o prevenir una enfermedad.

31. El método tal como se describe en la reivindicación 30, caracterizado porque la enfermedad asociada con GD2 es cáncer.

32. El método tal como se describe en la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad asociada con GD2 es melanoma.

33. El método tal como se describe en la reivindicación 30, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.

34. El método tal como se describe en la reivindicación 30, caracterizado porque el mamífero es un humano.

35. Un método para elaborar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, en donde el método comprende cultivar una célula huésped tal como se describe en la reivindicación 26, bajo condiciones adecuadas para producir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, y recuperar el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo del cultivo celular.

36. Un método para elaborar un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped tal como se describe en la reivindicación 27 bajo condiciones adecuadas para producir el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno, y recuperar el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo del cultivo celular.

37. Un anticuerpo, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, producido atmósfera de una célula AB527-H YB-3B2- 3C9, en donde el anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, no incorpora la cadena-J.

38. Un método para detectar una célula que expresa GD2 en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno, tal como se describe en la reivindicación 1 y detectar células que expresan GD2.

39. El método tal como se describe en la reivindicación 38, caracterizado porque, el anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, es etiquetado en forma detectable.

40. El método tal como se describe en la reivindicación 39, caracterizado porque la etiqueta detectable es yodo-131.

41. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 2, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque el anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno, exhibe una constante de disociación de estado constante (KD) para GD2 de 4.5 x 10~9 molar.

42. Un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende las CDRs de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo producido a través de una célula que tiene el acceso ATCC No. PTA-9376.

43. Un anticuerpo, o fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizado porque comprende los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo producido a través de una célula que tiene el acceso ATCC No. PTA- 9376.