TWI466684B - 抗gd2抗體及其相關方法及用途 - Google Patents
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Description
本發明概言之係關於免疫治療劑領域。更具體而言,本發明係關於結合神經節苷脂之單株抗體及使用該等抗體治療需要該治療之個體的方法。亦提供使用所述抗體用於診斷及治療目的之方法。此外,亦提供組織培養基組合物及關於培養表現所述抗體之細胞的方法、以及純化或分離所述抗體之方法。
此申請案主張2008年6月30日提出申請的美國臨時申請案第61/077,041號及2008年9月15日提出申請的美國臨時申請案第61/097,034號之權利,其二者均以引用的方式併入本文中。
在美國,癌症係第二大死亡原因。美國國家衛生研究院(U.S.National Institutes of Health)(NIH)的國家癌症研究所(National Cancer Institute)(NCI)估計2008年將有超過500,000個體死於癌症且超過1.4百萬個體將被診斷患有癌症。開發治療癌症之方法及增強對如何預防癌症的一般瞭解係全球研究努力的目標,其中諸如英國、美國及其他國家等均最優先考慮癌症相關研究。例如,在2008會計年度,NIH已撥放超過50億美元資金專門用於癌症相關研究,幾乎是提供用於其他嚴重疾病(例如HIV及心臟病)之資金額的兩倍。
有超過100種不同類型的癌症。儘管癌症有很多種,但大多數與癌症有關之死亡係由少數常見癌症引起的,例如肺癌、結腸直腸癌及乳癌。NCI估計2008年該三種形式的癌症造成超過250,000例死亡。儘管皮膚癌不如上述彼等癌症那樣具有致命性,但皮膚癌佔美國所有新診斷出癌症的大約一半,此使得其成為最常見的癌症類型。在各種類型的皮膚癌中,黑素瘤最罕見且最具致命性。美國癌症協會(American Cancer Society)估計,儘管在美國黑素瘤僅佔所有已診斷出皮膚癌的4%,但其所造成死亡在所有與皮膚癌有關之死亡中佔79%。
成功的癌症治療通常歸因於早期診斷及治療。診斷癌症之有效方法係檢測已知與癌症相關之腫瘤標誌物。腫瘤標誌物係由腫瘤細胞或體內其他細胞對癌症反應所產生之物質,通常係蛋白質。腫瘤標誌物可發現於血液、尿、腫瘤細胞表面上、或其他非癌細胞及組織上(或其中)。已經鑑別出神經節苷脂係一類與許多腫瘤相關的標誌物(Hako-mori,99 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10718(2002))。
神經節苷脂係具有至少一個糖鏈接唾液酸之鞘糖脂(gly-colsphingolipids)。該等化合物係細胞質膜之組份,且認為在各種生物功能(例如細胞生長、細胞分化、細胞信號傳導,及作為微生物毒素之受體)中起重要作用(Jacques等人.4 Org.Biomol.Chem.142(2006))。已經鑑別出40種以上的不同神經節苷脂,然而,該等之某一子集(subset)GM3、GM2、GD3、及GD2通常由腫瘤細胞過度表現(同上)。此外,據報導神經節苷脂在人類具有高免疫原性。高免疫原性與由腫瘤細胞過度表現之組合使得神經節苷脂成為癌症治療劑之潛在靶。
已經開發出神經節苷脂-特異性單株抗體,且在一些情況下已檢驗在人類之功效(通常參見Azuma等人,13 Clin.Cancer Res.2745(2007);Irie等人,53 Cancer Immunol.Immunother.110(2004);Irie及Morton,83 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8694(1986))。關於人類GD2-特異性抗體之一個最早報導係Cahan等人(79 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.7629(1982))。免疫療法研究已經顯示,對於接種黑素瘤疫苗之患者,較高存活率係與神經節苷脂-特異性IgM而非IgG相關(Jones等人,66 J.Natl.Cancer Inst.249(1981))。與此發現一致,涉及神經節苷脂GD2及GD3之IgM抗體的人類研究對於使用該等抗體作為黑素瘤之可能治療已經提供令人鼓舞的結果(Irie等人,53 Cancer Immunol.Immunother.110;Irie及Morton,83 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8694(1986))。
IgM係五種人類抗體類型(antibody isotypes)中的一種;其餘係IgG、IgA、IgE、及IgD。IgM通常係體液免疫反應中所產生的第一種抗體,因為IgM重鏈恆定基因之位置允許其產生而無需類型轉換(isotype switching)(Charles A.Janeway等人Immunobiology 9-12(第5版,2001))。由於IgM通常在基因成熟之前產生,故此類抗體類型通常對於既定抗原具有比其他類型低的親和力(同上)。IgM藉由形成聚合物來補償低親和力,聚合物增加抗體分子之抗體親抗原性(同上)。聚合IgM通常形成為與J鏈相關之五聚體(一種促進抗體聚合之約15 kD分子);然而,其在沒有J鏈之情況下亦可聚合成五聚體或六聚體(同上,第4-19頁)。在一些情況下,IgM之聚合狀態允許其在病原體之存在下高效調節補體途徑之活化。舉例而言,含J鏈之五聚IgM除非當其結合抗原時結構發生改變,否則其在活化補體方面通常無效(同上,第9-17頁)。相反,無J鏈或六聚IgM已經展示對於活化補體比五聚IgM好高達100倍(Weirsma等人,160 J.Immunol.5979(1998))。
癌症係一個全球健康問題。儘管在治療此疾病之各種形式方面已經取得進展,但仍需要經改良之治療劑。認為免疫治療劑對於癌症療法具有極大潛力。可證實,特異性針對由癌症細胞所表現抗原之IgM抗體係有效癌症治療劑。
本文所闡述者係特異性結合神經節苷脂GD2之經分離抗體及抗原結合片段。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段係IgM。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段係五聚體或六聚體。儘管抗體或抗原結合片段可為人類、人源化或嵌合體抗體或抗原結合片段,但抗體或抗原結合片段較佳係人類抗體或抗原結合片段。抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:40相同或與其一致之重鏈及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:42相同或與其一致之輕鏈。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3。抗體或抗原結合片段可包括具有以下之重鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3。抗體或抗原結合片段可包括具有以下之輕鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3。抗體或抗原結合片段可包括具有以下之重鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3,而且包括具有以下之輕鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3。
抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之輕鏈FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括具有以下之重鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括具有以下之輕鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括重鏈及輕鏈,其中該重鏈包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3;且該輕鏈包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括具有以下之重鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括具有以下之輕鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段具有重鏈及輕鏈,其中該重鏈具有胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3;且該輕鏈具有胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。亦可使用抗體樣蛋白質作為CDR骨架來改造CDR及FWR之抗原結合排列。該等經改造抗原結合蛋白在揭示內容之範圍內。
所述抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:40相同或與其一致之重鏈。在一些實施例中,基本上與SEQ ID NO:39相同或與其一致之多核苷酸可編碼此重鏈胺基酸序列。所述抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:42相同或與其一致之輕鏈。在一些實施例中,基本上與SEQ ID NO:41相同或與其一致之多核苷酸可編碼此輕鏈胺基酸序列。所述抗體或抗原結合片段可包括重鏈及輕鏈,其中該重鏈具有基本上與SEQ ID NO:40相同或與其一致之胺基酸序列,且該輕鏈具有基本上與SEQ ID NO:42相同或與其一致之胺基酸序列。
在一些實施例中,抗體係由於2008年7月16日美國典型培養物保藏中心(Amer.Type Cult.Coll.)(10801 University Blvd.,Manassas,Virginia 20110-2209)所存放的抗體產生細胞產生且已經指定登錄號為PTA-9376。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段對由所存放抗體產生細胞所產生抗體之GD2具有結合親和力。在一些實施例中,所揭示抗體或其抗原結合片段包含由所存放抗體產生細胞所產生抗體之重鏈及輕鏈CDR。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段包含由所存放抗體產生細胞所產生抗體之重鏈及輕鏈可變區。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段展示與所存放抗體產生細胞所產生抗體基本上相同或比其大之補體依賴性細胞毒性活性程度。此外,與由所存放細胞所產生抗體競爭結合GD2之抗體或其抗原結合片段涵蓋於本文所述抗體之範圍內。例如,如果一個抗體阻止或阻礙另一抗體結合至抗原位點(在沒有競爭抗體之情況下原本該另一抗體結合至該抗原位點),則該抗體可與該另一抗體或抗原結合片段競爭。
本發明亦揭示多核苷酸,其編碼特異性結合GD2之抗體或抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1序列(例如SEQ ID NO:2)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2(例如SEQ ID NO:3)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3(例如SEQ ID NO:4)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1(例如SEQ ID NO:18)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2(例如SEQ ID NO:19)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3(例如SEQ ID NO:20)的抗體或其抗原結合片段。多核苷酸可編碼具有重鏈之抗體或其抗原結合片段,該重鏈具有基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1,例如SEQ ID NO:2;基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2,例如SEQ ID NO:3;及基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3,例如SEQ ID NO:4。多核苷酸可編碼具有輕鏈之抗體或其抗原結合片段,該輕鏈具有基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2,例如SEQ ID NO:19;及基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3,例如SEQ ID NO:20。多核苷酸可編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1,例如SEQ ID NO:2;由基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之核苷酸序列編碼的CDR2,例如SEQ ID NO:3;及由基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之核苷酸序列編碼的CDR3,例如SEQ ID NO:4;及基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2,例如SEQ ID NO:19;及基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3,例如SEQ ID NO:20。亦可使用抗體樣蛋白質作為CDR骨架來改造CDR之抗原結合排列。該等經改造抗原結合蛋白在揭示內容之範圍內。
在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1(例如SEQ ID NO:5)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2(例如SEQ ID NO:6)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3(例如SEQ ID NO:7)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1(例如SEQ ID NO:21)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2(例如SEQ ID NO:22)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之輕鏈FWR3(例如SEQ ID NO:23)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1,例如SEQ ID NO:5;基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2,例如SEQ ID NO:6;及基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3,例如SEQ ID NO:7。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1,例如SEQ ID NO:21;基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2,例如SEQ ID NO:22;及基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3,例如SEQ ID NO:23。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有重鏈及輕鏈之抗體或其抗原結合片段,其中重鏈FWR1基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致,例如SEQ ID NO:5;重鏈FWR2基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致,例如SEQ ID NO:6;及重鏈FWR3基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致,例如SEQ ID NO:7;且輕鏈FWR1基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致,例如SEQ ID NO:21;輕鏈FWR2基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致,例如SEQ ID NO:22;及輕鏈FWR3基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致,例如SEQ ID NO:23。
在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下的抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1,例如SEQ ID NO:2;基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2,例如SEQ ID NO:3;及基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3,例如SEQ ID NO:4;基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1,例如SEQ ID NO:5;基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2,例如SEQ ID NO:6;及基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3,例如SEQ ID NO:7。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2,例如SEQ ID NO:19;及基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3,例如SEQ ID NO:20;基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1,例如SEQ ID NO:21;基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2,例如SEQ ID NO:22;及基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之輕鏈FWR3,例如SEQ ID NO:23。
在一些實施例中,多核苷酸編碼具有重鏈及輕鏈之抗體或其抗原結合片段,其中該等多核苷酸編碼:基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1,例如SEQ ID NO:2;基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2,例如SEQ ID NO:3;基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3,例如SEQ ID NO:4;基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1,例如SEQ ID NO:5;基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2,例如SEQ ID NO:6;及基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3,例如SEQ ID NO:7;及基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2,例如SEQ ID NO:19;基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3,例如SEQ ID NO:20;基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1,例如SEQ ID NO:21;基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2,例如SEQ ID NO:22;及基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之輕鏈FWR3,例如SEQ ID NO:23。編碼經改造抗原結合蛋白之多核苷酸亦在本揭示內容之範圍內。
本發明提供包含編碼抗體及抗原結合片段之多核苷酸的載體以及表現特異性結合GD2之抗體或抗原結合片段的細胞。
本文闡述治療或預防需要該治療之個體GD2相關疾病之方法。在一些實施例中,GD2相關疾病係癌症。在一些實施例中,GD2相關疾病係黑素瘤。該等方法包含向個體投與有效治療或預防GD2相關疾病之量的特異性結合GD2至抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,該等方法包含投與包括抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。在一些態樣中,抗體或其抗原結合片段係IgM抗體或抗原結合片段。在一些實施例中,所述治療或預防個體的GD2相關疾病的方法可利用與本文所述GD2-特異性抗體競爭結合之抗體或抗原結合片段來實施。
本文闡述在活體內或在活體外檢測GD2表現細胞之方法。該等方法可包括向個體投與本文所述特異性結合GD2之抗體或其抗原結合片段以在個體中進行檢測或定位。在一些實施例中,所述抗體或抗原結合片段可以可檢測方式標記。該等可檢測標記物可包括螢光標記物、放射性標記物、生物素及諸如此類。或者,在一些實施例中,GD2-特異性抗體或抗原結合片段未經標記,而是藉由以可檢測方式標記之二級抗體進行檢測。在一些實施例中,所述檢測方法可利用與本文所述GD2-特異性抗體及抗原結合片段競爭結合之抗體或抗原結合片段來實施。
本文闡述製造及純化或分離IgM抗體或其抗原結合片段之方法。方法包括在適於產生抗體或抗原結合片段之條件下培養宿主細胞、從細胞培養物中回收該等抗體或抗原結合片段、及純化或分離所回收抗體或抗原結合片段。本發明之特徵亦在於純化或分離IgM抗體或抗原結合片段之方法包括視情況用洗滌劑沖洗抗體或抗原結合片段、將包含該等抗體或抗原結合片段之溶液施加於親和層析管柱、將來自親和層析管柱之析出液施加於陽離子交換層析管柱、及將來自陽離子交換層析管柱之析出液施加至羥基磷灰石層析管柱及回收來自羥基磷灰石層析管柱之析出液。
額外方法包括藉由用包含胺基酸、糖及維生素之組合物補充細胞培養基來增強所培養真核細胞之存活力。在一些實施例中,組合物可包含葡萄糖、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、絲胺酸、組胺酸、蘇胺酸、精胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、脯胺酸、煙酸醯胺、吡多辛(pyridoxine)HCl、葉酸、維生素B-12、核黃素、及硫胺HCl。本文亦闡述藉由經改良細胞增強蛋白質產生之方法以產生蛋白質。在一個態樣中,該等方法包括用戊酸補充細胞之生長培養基。
本文闡述白蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA))及神經節苷脂之蛋白質結合物及產生該等蛋白質結合物之方法。在一個實施例中,所結合神經節苷脂可為GD2。在一個實施例中,所結合神經節苷脂可為GM2。在一個實施例中,所結合神經節苷脂可為GM3。在一個實施例中,白蛋白係藉由還原胺化結合至神經節苷脂碳水化合物部分之還原端。在一個實施例中,還原胺化係由氰基硼氫化鈉催化。
在整個說明書及申請專利範圍中使用與闡述態樣有關之各種術語。除非另有說明,否則該等術語將被賦予其在此項技術中之一般含義。其他特別定義之術語應以與本文所提供之定義一致之方式解釋。
除非本文明確另外說明,否則本說明書及隨附申請專利範圍中所用單數形式「一」(「a」、「an」)及「該」(「the」)包括複數個指示物。因此,例如,提及「一個細胞」包括兩個或兩個以上細胞之組合及諸如此類。
本文所用術語「約」當係指諸如數量、時段及諸如此類等可量測數值時,意欲涵蓋與給定值高達±20%之偏差,因此該等偏差適於實施所揭示方法。除非另有說明,否則說明書及申請專利範圍中所用所有表示成份數量、性質(例如分子量)、反應條件等之數字在所有情況下皆應理解為由術語「約」修飾。因此,除非說明相反情況,否則,以下說明書及隨附申請專利範圍中所列示之數字參數均為可隨本發明尋求達成之期望性質而變化的近似值。無論如何,且並非試圖限制申請專利範圍之等效項之原則的應用,每一數字參數皆應至少根據所報道的有效位的數量且藉由使用普通舍入技術來解釋。
儘管本發明之寬範圍所列示之數值範圍及參數係近似值,但在特定實例中所列示之數值盡可能準確地報告。然而,任何數值固有包含必然由其各自測試量測中存在之標準偏差引起的必然誤差。
如本文所用術語「細胞毒性」或「細胞生長抑制」劑係指抑制細胞之生物過程、或降低細胞之存活力或增殖可能性之試劑。細胞毒性或細胞生長抑制劑可以各種方式發揮作用,例如(而非限定性說明)藉由誘導DNA破壞、誘導細胞週期停滯、抑制DNA合成、抑制轉錄、抑制轉譯或蛋白質合成、抑制細胞分裂、或誘導細胞凋亡。如本文所用術語「化學治療劑」係指優先殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞之生長、或抑制腫瘤細胞之轉移或干擾增殖細胞之細胞週期的細胞毒性、細胞生長抑制及抗腫瘤劑。化學治療劑包括(但不限於)合成化合物、天然及重組細菌毒素、天然及重組真菌毒素、天然及重組植物毒素、可裂變核素及放射性核素。化學治療劑之特定實例包括(但不限於)美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、相思豆毒素、蓖麻毒素及其每一A鏈、木鱉子皂苷、皂草素、異株瀉根毒蛋白(bryodin)1、步格敏(bouganin)、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、志賀毒素(Shiga toxin)、卡奇黴素、類美登素(maytansinoid)、鉛-212、鉍-212、砹-211、碘-131、鈧-47、錸-186、錸-188、釔-90、碘-123、碘-124、碘-125、溴-77、銦-111、硼-10、錒系元素、六甲蜜胺(altretamine)、放線菌素D、普利黴素(plicamycin)、嘌呤黴素、短桿菌肽D、多柔比星(doxorubicin)、秋水仙素(colchicine)、松胞菌素B、環磷醯胺、依米丁(emetine)、美坦辛(maytansine)、安吖啶(amsacrine)、順鉑、依託泊苷(etoposide)、依託泊苷鄰醌、替尼泊苷(teniposide)、柔紅黴素(daunorubicin)、吉西他濱(gemcitabine)、多柔比星、雙氫蒽醌(mitoxantraone)、比生群(bisanthrene)、博來黴素(Bleomycin)、胺甲蝶呤、長春地辛(vindesine)、阿黴素(adriamycin)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、BCNU、紫杉醇(taxol)、塔西法(tarceva)、阿伐他汀(avastin)、絲裂黴素(mitomycin)、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺及某些細胞因子(例如,TNF-α及TNF-β)。
「經分離」係指「藉由人工」自其天然狀態改變。若分子或組合物天然存在,則若其已自其起始環境改變或移出、或二者,其已「經分離」。例如,天然存在於活植物或動物內之多核苷酸或多肽未「經分離」,但從其天然狀態之共存物質分離出之相同多核苷酸或多肽「經分離」,如本文所使用術語。
「多核苷酸」與「核酸分子」或「核酸」同義,係指可為未經修飾RNA或DNA或經修飾RNA或DNA之任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸。「多核苷酸」包括(但不限於)單鏈及雙鏈DNA、單鏈及雙鏈區域混合物之DNA、單鏈及雙鏈RNA、及單鏈及雙鏈區域混合物之RNA、包含可為單鏈或更通常雙鏈或單鏈與雙鏈區域之混合物的DNA及RNA的雜交分子。此外,「多核苷酸」係指包含RNA或DNA或RNA與DNA二者之三鏈區域。術語多核苷酸亦包括包含一或多個經修飾鹼基之DNA或RNA及具有出於穩定性或其他原因經修飾骨架之DNA或RNA。「經修飾」鹼基包括(例如)三苯甲基化鹼基及稀有鹼基(例如,肌苷)。可對DNA及RNA進行各種修飾;因此,「多核苷酸」涵蓋通常在自然界中所發現的多核苷酸之經化學、酶解或代謝方式修飾之形式、以及病毒及細胞特有的DNA及RNA之化學形式。「多核苷酸」亦涵蓋相對較短的核酸鏈,其通常稱為寡核苷酸。
就核酸或胺基酸序列而言,「基本上相同」意味著兩個或更多序列之間具有至少65%一致性。較佳地,該術語係指兩個或更多序列之間具有至少70%一致性、更佳至少75%一致性、更佳至少80%一致性、更佳至少85%一致性、更佳至少90%一致性、更佳至少91%一致性、更佳至少92%一致性、更佳至少93%一致性、更佳至少94%一致性、更佳至少95%一致性、更佳至少96%一致性、更佳至少97%一致性、更佳至少98%一致性、且更佳至少99%或更高一致性。該一致性可使用mBLAST演算法確定(Altschul等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-8;Karlin及Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-7)。
「載體」係複製子,例如質粒、噬菌體、黏粒、或病毒,其中可操作地插入另一核酸區段以便使該區段複製或表現。
術語「可操作地鏈接」或「可操作地插入」意味著將編碼序列之表現所需之調控序列相對於該編碼序列放置於核酸分子中適當位置中以便能夠表現該編碼序列。舉例而言,當啟動子能夠控制編碼序列之轉錄或表現時,該啟動子與編碼序列可操作地鏈接。編碼序列可在有義或反義方向上可操作地鏈接至啟動子或調控序列。術語「可操作地鏈接」有時應用於表現載體中其他轉錄控制元件(例如,增強子)之排列。
當已將外源或異源核酸(例如,DNA)引入細胞內時,則該細胞已經「轉化」。轉化DNA可整合於(共價鏈接)或未整合於細胞之基因組中。例如,在原核生物細胞、酵母細胞、及哺乳動物細胞中,轉化DNA可保持於附加型元件(例如,質粒)上。就真核細胞而言,穩定轉化細胞或「穩定細胞」係藉由真核細胞建立由含轉化DNA之子細胞群組成之細胞系或純系的能力來表明。「純系」係自單細胞或共同祖先藉由有絲分裂衍生之細胞群。「細胞系」係能夠在活體外穩定生長許多世代之初代細胞之純系。在本文所提供之一些實例中,細胞係藉由利用DNA來轉染細胞而轉化。
「多肽」係指包含兩個或更多個藉由肽鍵或經修飾肽鍵(即,肽等排體)彼此連接之胺基酸的任何肽或蛋白質。「多肽」係指短鏈(通常稱為肽、寡肽或寡聚物)及較長鏈(通常稱為蛋白質)二者。多肽可包含除經20個基因編碼胺基酸以外之胺基酸。「多肽」包括藉由天然過程(例如,轉譯後處理)或藉由此項技術中已知之化學修飾技術修飾之胺基酸序列。該等修飾已充分闡述於基礎教科書、專著及研究文獻中。修飾可在多肽之任何地方發生,其包括肽骨架、胺基酸側鏈及胺基末端或羧基末端。相同修飾類型可以相同程度或不同程度出現於既定多肽之數個位點上。而且,既定多肽可含有多種修飾類型。多肽可具支鏈(例如,由遍在蛋白化產生的支鏈)且其可為具支鏈或不具支鏈之環形。環形、具支鏈及具支鏈環形多肽可由天然轉譯後過程產生或可藉由合成方法來製備。修飾包括乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素之共價連結、血紅素部分之共價連結、核苷酸或核苷酸衍生物之共價連結、脂質或脂質衍生物之共價連結、磷脂醯肌醇之共價連結、交聯、環化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯之形成、胱胺酸之形成、焦麩胺酸鹽之形成、甲醯化、γ-羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻醯基化、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒基化、硫酸鹽化、轉移-RNA介導之胺基酸至蛋白質的添加(例如,精胺醯化)、及遍在蛋白化(參見例如,Proteins-Structure and Molecular Properties,第2版,T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company,New York,1993;及Wold,F.,Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospects,第1-12頁Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,1983;Seifter等人,Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors,Meth Enzymol(1990)182:626-646及Rattan等人,Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging,Ann NY Acad Sci(1992)663:48-62)。
「生物分子」包括蛋白質、多肽、核酸、脂質、單糖、多糖、及其所有片段、類似物、同系物、結合物及衍生物。
本文術語「表現」及「產生」同義使用,且係指基因產物之生物合成。該等術語涵蓋將基因轉錄為RNA中。該等術語亦涵蓋將RNA轉譯為一或多種多肽,且進一步涵蓋所有天然存在的轉錄後及轉譯後修飾。抗體或其抗原結合片段之表現或產生可在細胞之胞質內、或在胞外環境(例如,細胞培養物之生長培養基)中。
術語「治療(treating或treatment)」係指在減輕或改善損傷、病態或病狀方面(包括任何客觀或主觀參數)取得任何成功或出現成功的跡象,例如,症狀減輕、緩解、消除或使患者更能耐受該損傷、病態或病狀、減緩惡化或衰退速度、減弱惡化之終點、改良個體之身體或精神狀態、或延長存活時間。該治療可藉由客觀或主觀參數來評價;其包括體格檢查、神經學檢查或精神病學評估之結果。
「有效量」及「治療有效量」在本文中互換使用,且係指本文所述之抗體、抗原結合片段或抗體組合物有效達成特定生物或治療結果(例如但不限於本文所揭示、闡述或例示的生物或治療結果)之量。抗體或其抗原結合片段之治療有效量可根據下述因素而有所變化:例如疾病狀態、年齡、性別、及個體體重、以及抗體或其抗原結合片段於該個體內引發期望反應之能力。該等結果可包括(但不限於)癌症之治療,如藉由任何適於此項技術中之方式所確定。
「醫藥上可接受」係指對於患者從藥理及/或毒理學觀點考慮且對於製藥化學家從組合物、調配物、穩定性、患者接受度及生物利用度之物理/化學觀點考慮可以接受之性質及/或物質。
「醫藥上可接受之載劑」係指不會干擾活性成分生物活性之功效且對所投與之宿主無毒之媒介。
「抗體」係指免疫球蛋白之所有類型(isotypes)(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD、及IgY),除非另有說明,否則其包括每一類型之各種單體及聚合形式。
抗原結合片段係可對特定抗原展示結合親和力之任何蛋白質結構。一些抗原結合片段可由保留親代抗體分子之抗原結合特異性之完整抗體部分組成。舉例而言,抗原結合片段可包含習知結合特定抗原之抗體的至少一個可變區(重鏈或輕鏈可變區)或一或多個CDR。適宜抗原結合片段之實例包括(但不限於)雙功能抗體及單鏈分子以及Fab、F(ab')2、Fc、Fabc、及Fv分子、單鏈(Sc)抗體、個別抗體輕鏈、個別抗體重鏈、抗體鏈或CDR與其他蛋白質、蛋白質骨架或分子間之嵌合融合體、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、由一個重鏈及一個輕鏈構成之二聚體及諸如此類。所有抗體類型均可用產生抗原結合片段。另外,抗原結合片段可包括非抗體蛋白質框架(例如,蛋白質骨架)以便可在賦予對所關注既定抗原之親和力之方向上成功納入多肽區段。抗原結合片段可以重組方式產生且藉由完整抗體之酶或化學裂解來產生。片語「抗體或其抗原結合片段」可用於表示既定抗原結合片段納入此片語中所提及抗體之一或多個胺基酸區段。
「抗體組合物」係指抗體或其結合片段加上至少一個醫藥上可接受之載劑、化學治療劑或診斷部分(例如,111In-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(111
In-DOTA)。
「特異性結合」係指抗體或抗原結合片段以大於其可結合另一生物分子之親和力結合特定生物分子。
本文所闡述之實施例並不限於特定方法、試劑、化合物、組合物或生物系統,該等當然可有所改變。此外,本文所用之術語僅用於闡述特定抗體或抗原結合片段之目的,且並非意欲限制。
GD2-特異性抗體
本文所闡述者係特異性結合神經節苷脂GD2之經分離抗體或抗原結合片段。在一個實施例中,抗體或其抗原結合片段係單株抗體或抗原結合片段;然而,其他實施例包括GD2-特異性多株抗體及保留對GD2之特異性的抗體衍生物或片段。抗體分子之一般結構包含抗原結合結構域(其包括重鏈及輕鏈)及Fc結構域(其起各種作用,包括補體固定)。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段調節補體依賴性細胞毒性。
有五類免疫球蛋白,其中Fc區中重鏈之一級結構決定免疫球蛋白類型。特定而言,α、δ、ε、γ及μ鏈分別對應於IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類型。所述抗體或抗原結合片段包括四鏈免疫球蛋白結構之所有類型及合成多聚體。所述抗體或抗原結合片段亦包括通常在母雞或火雞血清及母雞或火雞蛋黃中發現的IgY類型。抗體或抗原結合片段非共價、特異性且可逆地結合抗原。
所揭示標的物之抗體或抗原結合片段可源自任何物種。舉例而言,抗體或抗原結合片段可為小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔子、猴子、人類及諸如此類。對於用於治療人類而言,非人類源抗體或抗原結合片段當投與給人類患者時可在遺傳或結構上經改變以使其抗原性較低。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段係嵌合。如本文所用術語「嵌合」抗體或抗原結合片段意味著抗體或其抗原結合片段具有源自非人類哺乳動物、齧齒類動物或爬行動物之抗體胺基酸序列之至少一個可變區的至少一部分、同時保留源自人類之抗體或其抗原結合片段部分。舉例而言,嵌合抗體可包含具有人類Fc或其他此類結構域之小鼠抗原結合結構域。
在一些實施例中,該等抗體係人源化抗體。人源化抗體可為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如,Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合序列),其包含源自非人類免疫球蛋白之最小序列。就絕大部分而言,人源化抗體係人類免疫球蛋白(接受者抗體),其中來自接受者抗體之互補決定區(CDR)的殘基由來自諸如小鼠、大鼠或兔等非人類物種(供體抗體)之CDR且具有期望特異性、親和力及容量的殘基所替代。在一些情況下,人類免疫球蛋白之Fv框架區(FWR)殘基係由對應非人類殘基替代。此外,人源化抗體可包含既未見於接受者抗體亦未見於引入CDR或框架序列中之殘基。實施該等修飾以進一步改良及最佳化抗體性能。一般而言,人源化抗體應包含實質上所有的至少一個且通常兩個可變結構域,其中所有或基本上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋之CDR區,且所有或基本上所有FWR區為人類免疫球蛋白序列之FWR區。人源化抗體最佳亦應包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定區)。對於更詳細闡述,參見Jones等人,321 Nature 522-5(1986);Riechmann等人,332 Nature 323-9(1988);及Presta,2 Curr.Op.Struct.Biol.593-6(1992)。
在一些情況下,所述抗體係人類抗體或其抗原結合片段。如本文所用術語「人類抗體」意指抗體僅來自人類起源或其中可變結構域序列及恆定結構域序列為人類序列之抗體。該術語涵蓋具有源自(即,利用)人類基因但已發生改變以(例如)降低可能的免疫原性、增加親和力、除去可造成不期望摺疊效應之半胱胺酸等之序列的抗體。該術語涵蓋在非人類細胞中以重組方式產生之彼等抗體,其可產生人類細胞中並不常見之糖基化。
本文所述抗體或抗原結合片段可經標記或者與各種化學或生物分子部分結合以用於(例如)治療或診斷應用。該等部分可為細胞毒性,例如細菌毒素、病毒毒素、放射性同位元素及諸如此類。該等部分可為可檢測標記物,例如螢光標記物、放射性標記物、生物素及諸如此類,例如111
In-DOTA、111
In-二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、或放射性核素(例如但不限於鉛-212、鉍-212、砹-211、碘-131、鈧-47、錸-186、錸-188、釔-90、碘-123、碘-124、碘-125、溴-77、銦-111)、及可裂變核素(例如,硼-10或錒系元素)。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段與一或多種化學治療劑結合,例如(但不限於)放射性核素、毒素、及細胞毒性及細胞生長抑制劑。在其他實施例中,抗體或抗原結合片段係與一或多種化學治療劑組合使用。本文所述抗體或抗原結合片段可單獨使用或與生物分子或化學治療劑(例如,細胞毒性或細胞生長抑制劑)一起使用(例如,共同投與或與其結合)。在一些實施例中,化學治療劑係放射性核素,其包括(但不限於)鉛-212、鉍-212、砹-211、碘-131、鈧-47、錸-186、錸-188、釔-90、碘-123、碘-124、碘-125、溴-77、銦-111、及可裂變核素(例如,硼-10或錒系元素)。在其他實施例中,化學治療劑係毒素或細胞毒性藥物、美洲商陸抗病毒蛋白、相思豆毒素、蓖麻毒素及其每一A鏈、木鱉子皂苷、皂草素、異株瀉根毒蛋白1、步格敏、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、志賀毒素、卡奇黴素、類美登素、六甲蜜胺、放線菌素D、普利黴素、嘌呤黴素、短桿菌肽D、多柔比星、秋水仙素、松胞菌素B、環磷醯胺、依米丁、美坦辛、安吖啶、順鉑、依託泊苷、依託泊苷鄰醌、替尼泊苷、柔紅黴素、吉西他濱、多柔比星、雙氫蒽醌、比生群、博來黴素、胺甲蝶呤、培美曲塞(pemetrexed)、順鉑、長春地辛、阿黴素、長春新鹼、長春鹼、BCNU、紫杉烷(例如,紫杉醇(Taxol)TM
)、塔西法、阿伐他汀、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺、某些細胞因子(例如,TNF-α及TNF-β)及諸如此類。抗體或抗原結合片段與該等試劑結合之方法已在文獻中得知。
抗體特異性主要由6個CDR區、尤其H鏈CDR3確定(Kala等人,132 J.Biochem.535-41(2002);Morea等人,275 J.Mol.Biol.269-94(1998);及Chothia等人,196 J.Mol.Biol.901-17(1987))。然而,抗體框架區可在抗原-抗體相互作用中起作用(Panka等人,85 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 3080-4(1988)),具體而言在影響CDR環之構象方面起作用(Foote等人,224 J.Mol.Biol.487-99(1992))。因此,所述抗體或抗原結合片段可包含賦予對GD2之特異性的H或L鏈CDR或FWR區之任何組合。此項技術中按照常規實施(Jirholt等人,215 Gene 471-6(1998);Sderlind等人,18 Nature Biotechnology 852-6(2000))之結構域洗牌試驗(Domain shuffling experiment)可用於產生根據本文所闡述及例示之說明書特異性結合GD2之抗體。藉由該等結構域洗牌試驗所產生之抗體或抗原結合片段在本文所述抗體或抗原結合片段之範圍內。此外,亦可藉由改造抗體樣蛋白質使其作為CDR骨架而將CDR排列為結合既定抗原(Nicaise等人,13 Protein Sci.1882(2004))。該等抗原結合蛋白在本文所述抗體之範圍內。
本文所述抗體或抗原結合片段可以各種形式出現,但將包括一或多個表1中所示之抗體區段。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括重鏈及輕鏈,其中該重鏈具有胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3;且該輕鏈具有胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3。亦可使用抗體樣蛋白質作為CDR骨架來改造CDR之抗原結合排列。該等經改造抗原結合蛋白在揭示內容之範圍內。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之輕鏈FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括具有以下之重鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括具有以下之輕鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括重鏈及輕鏈,其中該重鏈包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3;且該輕鏈包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。
在一些實施例中,抗體或抗原結合片段可包括具有以下之重鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括具有以下之輕鏈:胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段包括重鏈及輕鏈,其中該重鏈包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3;且該輕鏈包括胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之CDR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之FWR1;胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2;及胺基酸序列基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3。亦可使用抗體樣蛋白質作為CDR骨架來改造CDR及FWR之抗原結合排列。該等經改造抗原結合蛋白在揭示內容之範圍內。
在一些實施例中,本文所述抗體或抗原結合片段具有包括基本上與SEQ ID NO:40相同或與其一致之胺基酸序列的重鏈。在一些實施例中,本文所述抗體或抗原結合片段具有包括基本上與SEQ ID NO:42相同或與其一致之胺基酸序列的輕鏈。所述抗體或抗原結合片段可具有重鏈及輕鏈,其中該重鏈包括基本上與SEQ ID NO:40相同或與其一致之胺基酸序列且該輕鏈包括基本上與SEQ ID NO:42相同或與其一致之胺基酸序列。
亦闡述編碼特異性結合GD2之抗體或抗原結合片段的多核苷酸。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1序列(例如SEQ ID NO:2)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2(例如SEQ ID NO:3)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3(例如SEQ ID NO:4)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1(例如SEQ ID NO:18)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2(例如SEQ ID NO:19)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3(例如SEQ ID NO:20)的抗體或其抗原結合片段。多核苷酸可編碼具有以下的抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1,例如SEQ ID NO:2;基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之CDR2,例如SEQ ID NO:3;及基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之CDR3,例如SEQ ID NO:4。多核苷酸可編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2,例如SEQ ID NO:19;及基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3,例如SEQ ID NO:20。多核苷酸可編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1,例如SEQ ID NO:2;由基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之核苷酸序列編碼的CDR2,例如SEQ ID NO:3;及由基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之核苷酸序列編碼的CDR3,例如SEQ ID NO:4;及基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之CDR2,例如SEQ ID NO:19;及基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之CDR3,例如SEQ ID NO:20。
在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1(例如SEQ ID NO:5)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2(例如SEQ ID NO:6)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3(例如SEQ ID NO:7)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1(例如SEQ ID NO:21)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2(例如SEQ ID NO:22)的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之(例如SEQ ID NO:23)輕鏈FWR3的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1,例如SEQ ID NO:5;基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之FWR2,例如SEQ ID NO:6;及基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之FWR3,例如SEQ ID NO:7。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1,例如SEQ ID NO:21;基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之FWR2,例如SEQ ID NO:22;及基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之FWR3,例如SEQ ID NO:23。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有重鏈及輕鏈之抗體或其抗原結合片段,其中重鏈FWR1基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致,例如SEQ ID NO:5;重鏈FWR2基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致,例如SEQ ID NO:6;及重鏈FWR3基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致,例如SEQ ID NO:7;且輕鏈FWR1基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致,例如SEQ ID NO:21;輕鏈FWR2基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致,例如SEQ ID NO:22;及輕鏈FWR3基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致,例如SEQ ID NO:23。
在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1,例如SEQ ID NO:2;基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2,例如SEQ ID NO:3;及基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3,例如SEQ ID NO:4;基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1,例如SEQ ID NO:5;基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2,例如SEQ ID NO:6;及基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3,例如SEQ ID NO:7。在一些實施例中,多核苷酸編碼具有以下之抗體或其抗原結合片段:基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2,例如SEQ ID NO:19;及基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3,例如SEQ ID NO:20;基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1,例如SEQ ID NO:21;基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2,例如SEQ ID NO:22;及基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之輕鏈FWR3,例如SEQ ID NO:23。
在一些實施例中,多核苷酸編碼具有重鏈及輕鏈的抗體或其抗原結合片段,其中該多核苷酸編碼以下:基本上與SEQ ID NO:10相同或與其一致之重鏈CDR1,例如SEQ ID NO:2;基本上與SEQ ID NO:11相同或與其一致之重鏈CDR2,例如SEQ ID NO:3;基本上與SEQ ID NO:12相同或與其一致之重鏈CDR3,例如SEQ ID NO:4;基本上與SEQ ID NO:13相同或與其一致之重鏈FWR1,例如SEQ ID NO:5;基本上與SEQ ID NO:14相同或與其一致之重鏈FWR2,例如SEQ ID NO:6;及基本上與SEQ ID NO:15相同或與其一致之重鏈FWR3,例如SEQ ID NO:7;及基本上與SEQ ID NO:26相同或與其一致之輕鏈CDR1,例如SEQ ID NO:18;基本上與SEQ ID NO:27相同或與其一致之輕鏈CDR2,例如SEQ ID NO:19;基本上與SEQ ID NO:28相同或與其一致之輕鏈CDR3,例如SEQ ID NO:20;基本上與SEQ ID NO:29相同或與其一致之輕鏈FWR1,例如SEQ ID NO:21;基本上與SEQ ID NO:30相同或與其一致之輕鏈FWR2,例如SEQ ID NO:22;及基本上與SEQ ID NO:31相同或與其一致之輕鏈FWR3,例如SEQ ID NO:23。
編碼經改造抗原結合蛋白之多核苷酸亦在本揭示內容之範圍內。
在一些實施例中,所述多核苷酸(及其編碼之肽)包括前導序列。可使用此項技術中習知之任何前導序列。前導序列可包括(但不限於)限制酶切位點或轉譯起始位點。在一些實施例中,前導序列具有核酸序列ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGC(SEQ ID NO:43)。在一些實施例中,前導序列編碼胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:44)。
由於在重鏈與輕鏈及編碼其之基因之間可能存在天然序列變異,故可預料到在本文所述抗體或抗原結合片段之胺基酸序列或編碼其之基因內發現一定程度之變異,同時對其獨特結合性質(例如,特異性及親和力)幾乎沒有影響。此一預期部分地由於遺傳密碼之簡併性、以及進化成功之保守胺基酸序列變異,此並不會顯著改變所編碼蛋白質之性質。因此,一些實施例包括與本文之抗體或抗原結合片段具有90%、95%、96%、97%、98%、或99%同源性之抗體或抗原結合片段。其他實施例包括GD-2特異性抗體或抗原結合片段,其具有不與本文所述抗體及抗原結合片段共有明顯同源性之框架、骨架或其他非結合區,但納入一或多個CDR或與本文所述之彼等序列具有90%、95%、96%、97%、98%、或99%同源性之其他所需可賦予結合之序列。
本文所述抗體或抗原結合片段包括具有單個或多個胺基酸取代、刪除或加成之變體,其保留所述抗體或抗原結合片段之生物性質(例如,結合親和力或免疫效應子活性)。熟悉此項技術者可產生具有單個或多個胺基酸取代、刪除或加成之變體。該等變體可包括:(a)其中一或多個胺基酸殘基經保守或非保守胺基酸取代之變體,(b)其中將一或多個胺基酸添加於多肽或從其刪除之變體,(c)其中一或多個胺基酸包括取代基團之變體,及(d)其中多肽與可賦予多肽有用性質之另一肽或多肽(例如,融合夥伴、蛋白質標籤或其他化學部分)融合之變體,例如抗體之表位、聚組胺酸序列、生物素部分及諸如此類。本文所述抗體或抗原結合片段可包括其中來自一個物種之胺基酸殘基在保守或非保守位置替換為另一物種之相應殘基之變體。在其他實施例中,非保守位置處之胺基酸殘基經保守或非保守殘基取代。獲得該等變體之技術(包括遺傳(抑制、刪除、突變等)、化學及酶技術)已為熟悉此項技術者習知。
本文所述抗體或抗原結合片段可體現為若干抗體類型,例如,IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。抗體或其抗原結合片段特異性很大程度上由CDR之胺基酸序列及排列決定。因此,一種類型之CDR可轉移至另一類型而不改變抗原特異性。或者,已經建立使融合瘤從產生一種抗體類型轉換為產生另一種(類型轉換)而不改變抗原特異性之技術。因此,該等抗體類型在所述抗體或抗原結合片段之範圍內。
改變抗體之類型可用於將由抗體恆定區賦予之不同效應子功能與抗原特異性組合。舉例而言,IgG係以單體形式產生,有效激活補體,且通常在體內血漿及胞內隔室中發現。IgA係作為單體及J鏈聯接之二聚體。IgA最常見於體內之腔空間及母乳中,此乃因二聚體形式可輸送穿過上皮細胞障壁。如同IgA一樣,IgM亦可形成聚合物,然而,其往往形成與J鏈聯接之五聚體、及不與J鏈聯接之五聚體及六聚體。該等高度聚合抗體藉由增加抗體親抗原性而不降低親和力而用於增加總體抗原結合能力。IgM之兩種聚合形式可有效激活補體,此可獲得補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在一些實施例中,本文所述抗體或抗原結合片段係聚合IgM抗體或抗原結合片段。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段係與J鏈聯接之五聚IgM抗體或抗原結合片段。在其他實施例中,抗體或抗原結合片段係不與J鏈聯接之六聚IgM抗體或抗原結合片段。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段係不與J鏈聯接之五聚IgM抗體或抗原結合片段。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段係與J鏈聯接之六聚IgM抗體或抗原結合片段。
本文所述抗體或抗原結合片段對於GD2之結合親和力(以M表示)包括小於1×10-2
之解離常數(KD
)。在一些實施例中,KD
小於1×10-3
。在其他實施例中,KD
小於1×10-4
。在一些實施例中,KD
小於1×10-5
。在其他實施例中,KD
小於1×10-6
、2×10-6
、3×10-6
、4×10-6
、5×10-6
、6×10-6
、7×10-6
、8×10-6
、或9×10-6
。在其他實施例中,KD
小於1×10-7
、2×10-7
、或3×10-7
、2×10-7
、3×10-7
、4×10-7
、5×10-7
、6×10-7
、7×10-7
、8×10-7
、或9×10-7
。在其他實施例中,KD
小於1×10-8
、2×10-8
、3×10-8
、4×10-8
、5×10-8
、6×10-8
、7×10-8
、8×10-8
、或9×10-8
。在其他實施例中,KD
小於1×10-9
、2×10-9
、3×10-9
、4×10-9
、5×10-9
、6×10-9
、7×10-9
、8×10-9
、或9×10-9
。在其他實施例中,KD
小於1×10-10
、2×10-10
、3×10-10
、2×10-10
、3×10-10
、4×10-10
、5×10-10
、6×10-10
、7×10-10
、8×10-10
、或9×10-10
。在再其他實施例中,KD
小於1×10-11
、2×10-11
、3×10-11
、4×10-11
、5×10-11
、6×10-11
、7×10-11
、8×10-11
、或9×10-11
。在一些實施例中,KD
小於1×10-12
。在其他實施例中,KD
小於1×10-13
。在其他實施例中,KD
小於1×10-14
。在再其他實施例中,KD
小於1×10-15
。在較佳實施例中,KD
為4.5×10-9
或更小。
在一些實施例中,本文所述抗體或抗原結合片段對於GD2與對於GD1a、GM2或GM3相比具有特異性結合親和力。在一些實施例中,對於GD2之KD
與對於GD1a、GM2或GM3之KD
相差至少3倍、較佳10倍。
本文所述抗體或抗原結合片段可藉由(例如)以共價連結不會妨礙抗體或其抗原結合片段結合至其表位的方式將任何類型分子共價連結至該抗體或其抗原結合片段來修飾。適宜修飾之實例包括(但不限於)糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷醯化、醯胺化及諸如此類。在一些實施例中,抗體或抗原結合片段自身可藉由已知保護/阻斷基團、溶蛋白性裂解、鍵結至細胞配體或其他蛋白質及諸如此類來衍生。抗體或抗原結合片段可具有改良抗體或其抗原結合片段活性或穩定性之轉譯後部分。該等部分包括硫、甲基、碳水化合物、磷以及其他免疫球蛋白分子上通常發現之化學基團。此外,抗體或抗原結合片段可包含一或多個非經典胺基酸。
本文所述抗體或抗原結合片段可經標記或者結合至有毒或無毒部分。有毒部分包括(例如)細菌毒素、病毒毒素、植物毒素、真菌毒素、放射性同位元素及諸如此類。抗體或抗原結合片段可經標記用於生物分析(例如,放射性同位元素標記物、螢光標記物)以幫助檢測抗體或抗原結合片段。抗體或抗原結合片段亦可經標記或結合用於診斷及治療目的,例如,利用直接將放射遞送至期望位點用於諸如放射免疫療法(Garmestani等人,28 Nucl.Med.Biol.409(2001))、成像技術及放射免疫導向手術等應用之放射性同位素或允許在活體內成像或檢測特異性抗體/抗原複合物之標記物。抗體或抗原結合片段亦可與毒素結合以提供免疫毒素(參見,Kreitman,R.J.,31 Adv.Drug Del.Rev.53(1998))。
本文所闡述包含至少一所述抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受載劑之組合物。該等組合物用於(例如)投與給患者以治療癌症,例如,彼等本文所闡述及例示者,該等組合物可調配成此項技術已習知且適宜之各種製劑中的任一種,包括彼等本文所闡述及例示者。在一些實施例中,組合物係含水調配物。水溶液可藉由將抗體或抗原結合片段於水或適宜生理緩衝液中混合、且若需要視情況添加適宜著色劑、矯味劑、防腐劑、穩定劑及增稠劑及諸如此類來製備。水性懸浮液亦可藉由將抗體或抗原結合片段分散於具有黏性物質(例如,天然或合成樹膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及其他習知懸浮劑)之水或生理緩衝液中來製得。
亦包括液體調配物及意欲在即將使用前轉化成液體製劑之固體形式製劑。該等液體包括溶液、懸浮液、糖漿、漿液及乳液。液體製劑可藉由習用方式利用醫藥上可接受之添加劑來製備,例如懸浮劑(例如,山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪或油);乳化劑(例如,卵磷脂或阿拉伯樹膠);非水性媒劑(例如,杏仁油、油性酯或經分餾植物油);及防腐劑(例如,對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。該等製劑除活性劑以外亦可包含著色劑、矯味劑、穩定劑、緩衝劑、人工及天然甜味劑、分散劑、增稠劑、增溶劑及諸如此類。組合物可為粉末或凍乾形式用於在使用前利用適宜媒劑(例如,無菌水、生理緩衝液、鹽水溶液或醇)進行構成。
組合物可經調配用於注入個體中。對於注射,所述組合物可調配於水溶液(例如,水或醇)或生理上相容緩衝液(例如,漢克氏溶液(Hanks's solution)、林格溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中。該溶液可含有諸如懸浮劑、穩定劑或分散劑等一或多種調配劑。注射調配物亦可製成意欲在即將使用前轉化成適於注射之液體形式製劑之固體形式製劑,例如藉由在使用前利用適宜媒劑(例如,無菌水、生理緩衝液、鹽水溶液或醇)進行構成。
組合物可調配於持續釋放媒劑或儲積製劑中。該等長效調配物可藉由植入(例如,經皮下或肌內)或藉由肌內注射投與。因此,例如,該等組合物可用適合聚合或疏水材料(例如作為可接受油中之乳液)或離子交換樹脂調配,或作為微溶性衍生物,例如,微溶性鹽。習知適於作為疏水性藥物載劑之遞送媒劑之實例係脂質體及乳液。
本文揭示使用所述抗體或抗原結合片段在活體內或在活體外檢測GD-2表現細胞之方法。一些實施例利用所揭示結合可檢測標記物之抗體或抗原結合片段,例如,螢光標記物、放射性標記物、生物素、酶及諸如此類,例如111
In-DOTA、111
In-DTPA、或放射性核素,其包括(但不限於)鉛-212、鉍-212、砹-211、碘-131、鈧-47、錸-186、錸-188、釔-90、碘-123、碘-124、碘-125、溴-77、銦-111、及可裂變核素,例如,硼-10或錒系元素。舉例而言,可將以可檢測方式標記之抗體或抗原結合片段投與給個體以檢測並定位個體中表現GD2之細胞。該等方法亦可用於檢測與個體中之其他細胞或組織相比其中GD2高度表現之細胞或組織。或者,所揭示用於檢測GD-2表現細胞之方法的一個實施例可包括使用本文所述以可檢測方式標記之抗體或抗原結合片段來檢測或量化在從個體中獲得之細胞(例如,從血液試樣或組織活體檢查獲得之細胞)中GD2之表現。
或者,所述使用所述抗體或抗原結合片段檢測GD-2表現細胞之方法可使用未經標記之GD2-特異性抗體實施。舉例而言,在一個實施例中,可藉由以下檢測個體中之GD2表現細胞:首先投與給個體本文所述GD2-特異性抗體或抗原結合片段、隨後投與能夠結合初始所投與GD2-特異性抗體或抗原結合片段之以可檢測方式標記之二級抗體。可使用類似方法在活體外檢測GD2表現細胞。
本文亦闡述治療或預防需要該治療或預防之個體的疾病的方法。在一些態樣中,該等方法可包括鑑別需要治療或預防GD2相關疾病(例如,癌症,例如黑素瘤)之個體。其他實施例包括經標記或結合用於診斷目的之抗體或其抗原結合片段,例如利用將放射直接遞送至期望位點之放射性同位素,例如,成像技術或特異性抗體/抗原複合物之檢測。在一個實施例中,方法包含向個體投與有效治療或預防疾病之量的GD2-特異性抗體或抗原結合片段(例如,重組人類GD2特異性IgM抗體)。在一個態樣中,方法包含向個體投與有效治療或預防疾病之量的組合物(例如,彼等本文所闡述及例示者),該組合物包含醫藥上可接受之載劑及至少一種特異性結合GD2之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中,方法包含向個體投與有效治療或預防疾病之量的至少一種特異性結合GD2之抗體或抗原結合片段(例如,本文所闡述及例示之抗體或抗原結合片段)。在一個實施例中,方法包含向個體投與至少一種本文所例示經標記或結合至有毒或無毒部分之GD2-特異性抗體或其抗原結合片段。
本文所述抗體或抗原結合片段可經口以任何可接受劑型投與,例如,膠囊、錠劑、水性懸浮液、溶液或諸如此類。抗體或抗原結合片段亦可非經腸投與,其包括(但不限於):皮下、靜脈內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鼻內、經局部、鞘內、肝內、病灶內、及顱內注射或輸注技術。或者,抗體或抗原結合片段將經靜脈內或腹膜內(例如注射)投與。
個體可為任何動物,且較佳為哺乳動物,例如,小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔子、貓、狗、猴子、驢子、牛、馬、豬、及諸如此類。最佳地,哺乳動物為人類。在一些實施例中,個體可以0.01 μg至500 mg抗體或其抗原結合片段/kg個體重量之日劑量範圍投與至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。投與給個體之劑量亦可根據每天所投與的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段之總量來衡量。在一些實施例中,個體每天投與5-5000毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多10毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多100毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多250毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多500毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多750毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多1000毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多1500毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多2000毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多2500毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多3000毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多3500毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多4000毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多4500毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,個體每天投與至多5000毫克的至少一種抗GD2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,抗體或其抗原結合片段係每週一次或兩週一次投與給個體。
治療可以小於至少一種抗GD2抗體或抗原結合片段之最適劑量之較小劑量開始,隨後在治療期間增加劑量直至達到在該等環境下之最佳效果為止。若需要,總日劑量可分開並在全天分批投與。
為有效治療GD2相關疾病,熟悉此項技術者可建議適於所治療個體之劑量方案及劑量量。只要需要,可每天投藥1至4次或更多次。若組合物調配於持續遞送媒劑中,則可以較低頻率投藥。劑量方案亦可隨活性藥物濃度而變,而活性藥物濃度可隨個體之需要而變。
亦提供包含本文所述多核苷酸之載體。該等載體可為表現載體。因此,提供包含編碼所關注多肽之序列的重組表現載體。表現載體可含有一或多個額外序列,例如(但不限於)調控序列(例如,啟動子、增強子)、選擇標誌及聚腺苷酸化信號。用於轉化各種宿主細胞之載體已經習知且包括(但不限於)質粒、噬菌粒、黏粒、杆狀病毒、杆粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母菌人工染色體(YAC)、以及其他細菌、酵母菌及病毒載體。
在本說明範圍內之重組表現載體包括合成、基因組或cDNA衍生的核酸片段,該等核酸片段編碼至少一個可操作地鏈接至調控元件之重組蛋白質。該等調控元件可包括轉錄啟動子、編碼適宜mRNA核糖體結合位點之序列、及控制轉錄及轉譯終止之序列。表現載體、尤其哺乳動物表現載體亦可包括一或多個非轉錄元件,例如,複製起點、鏈接至所表現基因之適宜啟動子及增強子、其他5'或3'側翼非轉錄序列、5'或3'非轉譯序列(例如,所需核糖體結合位點)、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點、或轉錄終止序列。亦可納入賦予宿主複製能力之複製起點。
用於轉化脊椎動物細胞之表現載體中之轉錄及轉譯控制序列可由病毒來源提供。實例性載體可如Okayama及Berg,3 Mol.Cell.Biol.280(1983)所述來構建。
在一些實施例中,將編碼抗體或抗原結合片段之序列置於強效組成型啟動子之控制下,例如,用於以下基因之啟動子:次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷脫胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白、人類肌球蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸、及其他基因。此外,許多病毒啟動子以組成方式在真核細胞中起作用且適於與所述實施例一起使用。適宜病毒啟動子包括(但不限於)巨細胞病毒(CMV)極早期啟動子、SV40之早期及後期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、馬羅尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus))(EBV)、勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)(RSV)、及其他反轉錄病毒之長末端重複序列(LTR)、及單純皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。在一個實施例中,將編碼抗體或其抗原結合片段之序列置於誘導型啟動子之控制下,例如,金屬硫蛋白啟動子、四環素-誘導型啟動子、多西環素-誘導型啟動子、含有一或多個干擾素刺激反應元件(ISRE)之啟動子,例如,蛋白激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1及諸如此類。
本文所述載體可含有一或多個內核糖體進入位點(IRES)。將IRES序列納入融合載體可有益於增強一些蛋白質之表現。在一些實施例中,載體系統將包括一或多個聚腺苷酸化位點(例如,SV40),其可為任一上述核酸序列之上游或下游。載體組份可連續鏈接、或以提供最佳間隔用於表現基因產物之方式(即,藉由在ORF之間引入「間隔體」核苷酸)排列、或以另一種方式定位。調控元件(例如,IRES基元)亦可經排列以提供表現之最佳間隔。
載劑可包含此項技術中習知之選擇標誌。選擇標誌包括正及負選擇標誌,例如抗生素抗性基因(例如,新黴素抗性基因、潮黴素抗性基因、卡那黴素抗性基因、四環素抗性基因、青黴素抗性基因)、麩胺酸鹽合酶基因、用於更昔洛韋(ganciclovir)選擇之HSV-TK、HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇之細菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人,7 Gene Ther.1738-1743(2000))。編碼選擇標誌或選殖位點之核酸序列可為編碼所關注多肽或選殖位點之核酸序列的上游或下游。
本文所述載體可用於轉化各種具有編碼所述抗體或抗原結合片段之基因的細胞。舉例而言,載體可用於產生抗體或抗原結合片段產生細胞。因此,另一態樣之特徵在於宿主細胞已利用包含編碼特異性結合GD2之抗體或其抗原結合片段(例如,本文所闡述及例示之抗體或抗原結合片段)之核酸序列的載體進行轉化。
此項技術中已習知若干將外源基因引入細胞之技術且可用於構建重組細胞用於根據本文所闡述及例示之各個實施例實施所述方法。所用技術應提供異源基因序列至宿主細胞之穩定轉移,以便異源基因序列可遺傳且可由細胞子代表現,且因此不破壞受體細胞之所需發育及生理功能。可使用之技術包括(但不限於)染色體轉移(例如,細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移)、物理方法(例如,轉染、細胞質體融合、微注射、電穿孔、脂質體載劑)、病毒載體轉移(例如,重組DNA病毒、重組RNA病毒)及諸如此類(闡述於Cline,29 Pharmac.Ther.69-92(1985)中)。磷酸鈣沉澱及聚乙二醇(PEG)誘導的細菌原生質體與哺乳動物細胞之融合亦可用於轉化細胞。
適用於表現本文所述抗體或抗原結合片段之細胞較佳係真核細胞、更佳植物、齧齒類動物或人類起源之細胞,尤其例如(但不限於)NSO、CHO、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293細胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤細胞、及BHK細胞系。此外,抗體之表現可使用融合瘤細胞實現。此項技術已建立良好的產生融合瘤之方法。
利用本文所述表現載體轉化之細胞可經選擇或篩選用於本文所述抗體或抗原結合片段之重組表現。重組陽性細胞經擴展並篩選展示期望表型之亞純系,例如,高效表現、增強生長性質、或獲得具有期望生物化學特性之蛋白質的能力(例如由於蛋白質修飾或改變轉譯後修飾)。該等表型可能係由於既定亞純系之固有性質或由於突變。突變可藉助使用化學品、UV波長的光、輻射、病毒、插入的誘變劑、抑制DNA失配修復、或該等方法之組合來實現。
一旦鑑別出表現期望蛋白質之細胞,則其可經擴展並選擇。經轉化細胞可以若干途徑進行選擇。舉例而言,可選擇用於表現所關注多肽之細胞。利用含有可選標誌物(例如,螢光蛋白質之產生)之載體轉化之細胞可針對標誌物之表現正向選擇。在其他實施例中,含具有藥物抗性基因之載體的細胞可針對在選擇條件下之生長能力正向選擇。
套組
提供抑制或減少患者中癌症細胞生長之套組。亦提供在活體外或在活體內鑑別是否存在結構不良細胞之套組。
本文所述套組可包含本文所述抗體、其抗原結合片段、或抗體組合物及在抑制或減少患者腫瘤細胞之生長的方法中或鑑別(例如)生物試樣中是否存在結構不良細胞之方法中使用該套組之說明書。套組可包含至少一種化學治療劑或細胞毒性劑。套組可包含抗葉酸化合物。套組可包含至少一種診斷試劑。診斷試劑之實例係可檢測標記物,例如(但不限於)放射性試劑、螢光劑、或顯色劑(例如,111
In-DOTA)。可檢測標記物可包含酶。套組可包含說明書及用於(例如)藉由注射投與抗體或抗體組合物之構件。
BSA-神經節苷脂結合物之用途及其製造方法本文闡述白蛋白-神經節苷脂結合物及產生該等結合物之方法。為確定所關注抗體或抗原結合片段在調節至既定抗原之結合方面是否有效,必須表徵抗體結合。有許多表徵抗體結合之途徑,例如,斑點印跡、西方印跡(western blot)、免疫沉澱分析、ELISA、FACS分析/流動式細胞測量法、及結合抗體之免疫螢光檢測。儘管有各種分析可用於測試抗體結合,但所用具體分析必須考慮對抗體目的之瞭解來進行選擇。舉例而言,若抗體或其抗原結合片段欲用於臨床環境,則其應由將使所關注抗原呈在活體內最可能發現之形式的分析來表徵。在此情況下,且在細胞表面蛋白之情況下,流動式細胞測量法可由於其允許所評估抗體或其抗原結合片段在天然抗原之環境中相互作用而成為有用分析。
一種鑑別含編碼抗原特異結合蛋白之載體細胞的方法係使用利用所關注抗原之酶聯免疫吸附分析(ELISA)。有兩種用於實施ELISA之主要途徑:間接ELISA及夾心ELISA。為實施間接ELISA,將所關注抗原吸附或固定於微量滴定板之表面且然後將所關注抗體或其抗原結合片段添加於微量滴定板以檢測抗原。相反,除所表徵抗體以外,夾心ELISA利用已知對所關注抗原具有特異性之抗體。該已知抗體係用於塗佈微量滴定板,以便當所關注抗原添加於微量滴定板中時其將結合或捕獲所關注抗原。一旦所關注抗原被捕獲,則將所關注抗體或其抗原結合片段添加於微量滴定板以評估其對該抗原之結合特性。在任一種情況下,所結合抗體或其抗原結合片段通常藉由針所關注抗體或其抗原結合片段具有特異性之酶結合二級抗體來檢測。
用於表徵神經節苷脂-特異性抗體或抗原結合片段之ELISA將用於確定該等抗體或抗原結合片段之潛在應用。然而,由於神經節苷脂具有差的免疫原性之事實,使用神經節苷脂作為ELISA抗原很複雜(Jacques等人,4 Org.Biomol.Chem.142-154(2006))。
神經節苷脂結合物
本文揭示神經節苷脂-白蛋白結合物,其不僅保留所結合神經節苷脂之抗原性質,而且增加神經節苷脂之穩定性且允許更好的附著於ELISA微量滴定板。神經節苷脂係在氰基硼氫化鈉之存在下藉由白蛋白中之一級胺使神經節苷脂還原胺化結合至白蛋白。結合係藉助神經節苷脂碳水化合物部分之還原端上形成席夫鹼(Schiff base)、隨後用氰基硼氫化鈉還原來實施。因此,本文所述之一些實施例包括經由神經節苷脂上碳水化合物部分之還原端結合至載體蛋白之神經節苷脂。一些實施例包含結合至載體蛋白之神經節苷脂,其中該載體係BSA。在一些實施例中,神經節苷脂為GD2。在一些實施例中,神經節苷脂為GM3。在一些實施例中,神經節苷脂為GM2。在另一實施例中,GD2與BSA結合。在一些實施例中,神經節苷脂之還原胺化由氰基硼氫化鈉催化。
在一些實施例中,神經節苷脂-白蛋白結合物保留神經節苷脂抗原性以便神經節苷脂特異性單株抗體或其抗原結合片段可結合結合物。在一些實施例中,GD2-BSA結合物保留GD2抗原性以便GD2特異性單株抗體或其抗原結合片段可結合結合物。在一些實施例中,GM2-BSA結合物保留GM2抗原性以便GM2-特異性單株抗體或其抗原結合片段可結合結合物。在一些實施例中,GM3-BSA結合物保留GM3抗原性以便GM3-特異性單株抗體或其抗原結合片段可結合結合物。
本文所述白蛋白-神經節苷脂結合物可用於ELISA以表徵抗體或其抗原結合片段對於特定神經節苷脂之特異性。在一個態樣中,所述白蛋白-神經節苷脂結合物與未結合神經節苷脂相比提供將所結合神經節苷脂吸附至ELISA板之增強能力。一旦吸附,結合物可用作直接ELISA中之神經節苷脂抗原以表徵神經節苷脂特異性抗體或抗原結合片段之結合態樣。在一個實施例中,白蛋白-神經節苷脂結合物可為BSA-GD2結合物。在一個實施例中,BSA-神經節苷脂結合物可為BSA-GM2結合物。在一個實施例中,BSA-神經節苷脂結合物可為BSA-GM3結合物。其他該等神經節苷脂可使用本文所述方法與BSA結合且然後用於本文所述目的。該等結合物及其用途在本揭示內容之範圍內。
蛋白質結合物之實施例包括以下實施例。
實施例A1提供包含白蛋白及神經節苷脂之蛋白質結合物。
實施例A2提供實施例A1之結合物,其中該白蛋白係牛血清白蛋白。
實施例A3提供實施例A1之結合物,其中該神經節苷脂係經由神經節苷脂上碳水化合物部分之還原端結合至白蛋白。
實施例A4提供實施例A3之結合物,其中該白蛋白係牛血清白蛋白。
實施例A5提供實施例A3之結合物,其中該神經節苷脂係GD2。
實施例A6提供實施例A1之結合物,其中該結合物與GD2-特異性抗體具有免疫反應性。
實施例A7提供實施例A1之結合物,其中該神經節苷脂係GM2。
實施例A8提供實施例A7之結合物,其中該結合物與GM2-特異性抗體具有免疫反應性。
實施例A9提供實施例A1之結合物,其中該神經節苷脂係GM3。
實施例A10提供實施例A9之結合物,其中該結合物與GM3-特異性抗體具有免疫反應性。
實施例A11提供將神經節苷脂與白蛋白結合之方法,該方法包含還原胺化神經節苷脂上碳水化合物部分之還原端。
實施例A12提供實施例A11之方法,其中該白蛋白係牛血清白蛋白。
實施例A13提供實施例A11之方法,其中該還原胺化係由氰基硼氫化鈉催化。
實施例A14提供實施例A13之方法,其中該神經節苷脂係GD2。
實施例A15提供實施例A13之方法,其中該神經節苷脂係GM2。
實施例A16提供實施例A13之方法,其中該神經節苷脂係GM3。
細胞培養組合物及方法
本文闡述用於培養真核細胞之組合物及方法。該等細胞可為任何類型之真核細胞,但在一個實施例中,較佳為哺乳動物起源。在一些實施例中,該等細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施例中,真核細胞經遺傳修飾以產生IgM抗體或抗原結合片段。真核細胞可為臨床分離物,其利用外源DNA或RNA轉化、永生化、病毒感染或藉由其他通常已知生物或化學方式修飾。真核細胞可以單層或懸浮培養物形式生長,其可在細胞培養箱、生物反應器、振盪燒瓶或其他類似組織培養裝置。此外,真核細胞可在高於32℃且低於50℃之溫度下在2%至8%間之CO2
中且在有或沒有振盪的情況下培養。在一個實施例中,細胞可在37℃之溫度下在5% CO2
中培養,同時以120 rpm振盪。真核細胞可結合本文所述組合物及方法於組織培養基中培養,例如,GIBCO-CD-CHO完全培養基(1 L GIBCO-CD-CHO培養基+25μM MSX)或類似完全培養基。所培養真核細胞可經改造以產生外源蛋白質,本文所述組合物及方法可增強該外源蛋白質,但非必需的。
本文揭示適於與真核細胞培養基一起使用之組合物。組合物包括(但不限於)各種必需及非必需的胺基酸,例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、及纈胺酸;糖,例如,葡萄糖、果糖、甘露糖、及半乳糖;及維生素,例如,葉酸、維生素B-12、維生素D;及可影響所培養真核細胞之生長特性的核黃素。在實施例B1中,組合物包括葡萄糖、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、絲胺酸、組胺酸、蘇胺酸、精胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、脯胺酸、煙酸醯胺、吡多辛HCl、葉酸、維生素B-12、核黃素、及硫胺HCl。
在實施例B2中,組合物包含實施例B1之細胞培養基,其中葡萄糖之濃度為50 g/L,麩胺酸鹽之濃度為2.5-3.75 g/L,天冬胺酸鹽之濃度為1.5-2.0 g/L,絲胺酸之濃度為0.3-0.5 g/L,組胺酸之濃度為1.1-1.5 g/L,蘇胺酸之濃度為2.0-3.0 g/L,精胺酸之濃度為1.0-1.5 g/L,酪胺酸之濃度為1.8-2.2 g/L,半胱胺酸之濃度為0.9-1.1 g/L,纈胺酸之濃度為1.0-3.0,甲硫胺酸之濃度為0.8-1.2 g/L,色胺酸之濃度為0.5-0.8 g/L,苯丙胺酸之濃度為1.3-1.7 g/L,異亮胺酸之濃度為0.8-2.4 g/L,亮胺酸之濃度為1.5-4.5 g/L,離胺酸之濃度為3.5-5.0 g/L,脯胺酸之濃度為0.5-0.7 g/L,煙酸醯胺之濃度為30-40 mg/L,吡多辛HCl之濃度為200-250 mg/L,葉酸之濃度為100-130 mg/L,維生素B-12之濃度為20-40 mg/L,核黃素之濃度為20-40 mg/L,且硫胺HCl之濃度為100-150 mg/L。
本文亦揭示培養真核細胞之方法,其中先前章節中所述之組合物可用於增強真核細胞之存活力。舉例而言,組合物可添加於所培養CHO細胞及所培養產生IgM之真核(例如,CHO)細胞。可藉由在生長培養基施加於真核細胞之前或之後將組合物作為培養基補充物添加於生長培養基中利用該組合物來增強真核組織培養細胞之存活力。或者,可將生長培養基組份添加於組合物中以產生含有該組合物之生長培養基。
實施例B3提供培養真核細胞之方法,其包含向細胞中添加初始組織培養基且然後用細胞培養組合物補充該初始組織培養基,該組合物包含葡萄糖、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽、絲胺酸、組胺酸、蘇胺酸、精胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、離胺酸、脯胺酸、煙酸醯胺、吡多辛HCl、葉酸、維生素B-12、核黃素、及硫胺HCl。
實施例B4提供實施例B3之方法,其中添加於該初始組織培養基中之細胞培養組合物的體積為該初始組織培養基體積的1.0%與20%之間。
實施例B5提供實施例B3之方法,其中在添加該初始組織培養基之後的前3天內未將該細胞培養組合物添加於該初始組織培養基中。
實施例B6提供實施例B3之方法,其中該等真核細胞已經轉化以產生一或多種蛋白質。
實施例B7提供實施例B6之方法,其中該一或多種蛋白質係抗體或其抗原結合片段。
實施例B8提供實施例B7之方法,其中該抗體係IgM。
實施例B9提供實施例B3之方法,其中該細胞培養組合物係連續數天添加於該初始組織培養基中。
在另一實施例中,組合物可用於增加由真核細胞所產生蛋白質之數量,該真核細胞遺傳上經修飾以產生重組蛋白質。舉例而言,組合物可添加於經改造以表現重組人類抗體或其抗原結合片段之所培養細胞中(例如,經修飾以表現IgM之細胞且更特定而言經設計以表現IgM之CHO細胞)。該組合物亦可藉由在生長培養基施加於真核細胞之前或之後將組合物作為培養基補充物添加於生長培養基中用於增加重組蛋白質表現。或者,可將生長培養基組份添加於組合物中以獲得含有該組合物之生長培養基。
該組合物可用作生長培養基或作為生長培養基之補充物。作為補充物,該組合物可在培養基添加於組織培養容器之前或之後添加於細胞培養基中。本文所述組合物可用於補充真核細胞培養基至總濃度為1.5%至2.5%。可使用該等相同濃度以產生已含該組合物之細胞培養基。
本發明之特徵亦在於藉由添加戊酸至細胞培養基中增加由真核細胞所產生蛋白質之量的方法,該真核細胞遺傳上經修飾以產生重組蛋白質。舉例而言,戊酸可添加於用於經改造以表現重組人類抗體或抗原結合片段之所培養CHO、融合瘤及NS0細胞之培養基中。在一個實施例中,戊酸可添加於細胞培養基中至最終濃度為0.1 mM至10 mM。在一個實施例中,戊酸可在細胞生長期之特定點處添加,例如,戊酸可在細胞原液復蘇之後或細胞培養物分裂之後特定天數時添加於培養基中。
實施例B10提供增強由細胞產生蛋白質之方法,該方法包含用戊酸補充該細胞生長培養基。
實施例B11提供實施例B10之方法,其中該等細胞係抗體產生細胞。
實施例B12提供實施例B10之方法,其中該生長培養基係補充至戊酸濃度為0.1 mM至10 mM。
抗體分離或純化
可將本文所述抗體或抗原結合片段與相當大部分細胞生長培養基分開,自其中回收以允許進一步純化或分離出抗體或抗原結合片段。本文闡述從溶液(例如條件培養上清液(CCS))純化或分離抗體或抗原結合片段(例如,人類IgM抗體或抗原結合片段)之方法。增加含抗體或抗原結合片段之溶液的純度可藉由若干途徑實現,其包括(但不限於)透析、尺寸排除層析法、離心、離子交換層析法、梯度離心、利用尺寸排除過濾器過濾、親和層析法、免疫親和層析法、及高效液相層析法。所述抗體或抗原結合片段亦可遺傳上或化學上經修飾以包括親和標籤(例如,聚組胺酸),該親和標籤可藉助親和純化技術用於增加抗體或其抗原結合片段純度。
因此,一些實施例包括藉由親和層析法與溶液分離之抗體或其抗原結合片段。一些實施例包含藉由親和層析法基本上與溶液分開之抗體或其抗原結合片段,其中對該抗體或其抗原結合片段之親和力由蛋白質A調節。一些實施例包含藉由離子交換層析法基本上與溶液分開之抗體或其抗原結合片段。一些實施例包含藉由陽離子交換層析法基本上與溶液分開之抗體或其抗原結合片段,其中該陽離子交換層析管柱包含丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂。一些實施例包含藉由羥基磷灰石層析法基本上與溶液分開之抗體或其抗原結合片段。一些實施例包含藉由羥基磷灰石層析法基本上與溶液分開之抗體或其抗原結合片段,其中該羥基磷灰石層析管柱納入陶瓷磷酸鈣樹脂。
由於對所得抗體或其抗原結合片段之要求可根據將使用該等抗體或抗原結合片段之應用而不同,故可純化或分離所述抗體或抗原結合片段之方法可有所變化。舉例而言,用於醫藥組合物中之抗體或抗原結合片段將需要嚴格純化,而用於在活體外診斷分析之抗體或抗原結合片段之純化程度可較低。因此,一些實施例包括使含抗體或抗原結合片段之試樣與蛋白質A基質接觸。一些實施例包括使含抗體或抗原結合片段之試樣與離子交換基質接觸。在一個實施例中,該離子交換基質可為陽離子交換層析基質。在更佳實施例中,該陽離子交換層析基質可包括丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂。一些實施例包括使含抗體或抗原結合片段之試樣與羥基磷灰石基質接觸。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可包括磷酸鈣樹脂。
連續親和層析法係獲得經分離或純化蛋白質之方法。該方法可利用兩輪或更多輪不同親和層析法技術以產生經純化或分離之關注蛋白(Friedrichs及Grose,49 J.Virol.992(1984))。因此,在一些實施例中,可使含抗體或抗原結合片段之試樣與蛋白質A基質在促使抗體或抗原結合片段結合至該基質之條件下接觸;該基質可經洗滌以去除未結合蛋白質;該與蛋白質A基質結合之物質可經溶析;該經溶析物質可在促使抗體或抗原結合片段結合至該基質之條件下與陽離子交換層析基質接觸;該基質可經洗滌以去除未結合蛋白質;該與陽離子交換層析基質結合之物質可經溶析;該經溶析物質可在促使抗體或抗原結合片段結合至該基質之條件下與羥基磷灰石樹脂結合;該基質可經洗滌以去除未結合蛋白質;且該經結合物質可經溶析。此外,在此方法之各個點可添加可選步驟以更嚴格的純化抗體或其抗原結合片段。舉例而言,含抗體或抗原結合片段之溶液可補充有洗滌劑(例如,Triton-X 100或Tween80)以滅活微生物(例如,細菌、病毒及寄生蟲)。
蛋白質基於親和力之層析法係多步驟製程,其通常涉及平衡層析管柱、使試樣溶液與管柱基質接觸、清洗掉管柱中未結合的物質、及溶析出所期望的物質。視需要,此一般製程可在各種條件下重複一或多次以增加試樣純度。在一些實施例中,蛋白質A基質可用於接觸欲純化試樣。在一個實施例中,蛋白質A基質可為多孔基質,其具有直徑在1000埃至5000埃範圍內之孔。在另一實施例中,蛋白質A基質具有平均直徑為3000埃之孔。
在一些實施例中,在使用前將親和基質洗滌並平衡。舉例而言,該親和基質可用純化水洗滌以去除任何污染物。在一些實施例中,該親和基質可用3倍至10倍管柱體積的純化水洗滌。在另一實施例中,該親和基質可用5倍管柱體積的純化水洗滌。在一些實施例中,該親和基質可用至少一種酸性緩衝液洗滌。舉例而言,該親和基質可用1倍至5倍管柱體積的pH 1.5的20 mM HCl洗滌。在另一實施例中,該親和基質可用3倍管柱體積的pH 1.5的20 mM HCl洗滌。
此外,該親和基質可用至少一種額外緩衝液洗滌,例如,6 M胍.HCl。在親和基質與試樣接觸之前,基質可用適當鹼性或中性pH緩衝液進行平衡。在一個實施例中,該親和基質可用2倍至8倍管柱體積的pH 7.5的緩衝液進行平衡。在另一實施例中,該親和基質可用5倍管柱體積的10 mM磷酸鈉緩衝液進行平衡,該緩衝液含有200 mM NaCl及0.01% Tween-80且pH為7.5。本文所述磷酸鈉緩衝液可由磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉之混合物製得。以恰當比率混合,該等溶液可獲得在pH 4至pH 10之範圍內的磷酸鹽緩衝液。
欲經由接觸親和基質純化或分離之試樣應基本上不含大的顆粒物質。該顆粒物質可以各種方式去除,例如,藉由離心或過濾。在另一實施例中,使本文所述條件培養上清液(CCS)在與親和基質接觸之前基本上不含大的顆粒物質。在又一實施例中,CCS經過濾以去除顆粒物質。可使用具有適當孔徑之過濾器,例如,孔平均直徑為1 μm之過濾器或孔平均直徑為0.75 μm之過濾器或孔平均直徑為0.5 μm之過濾器或孔平均直徑為0.22 μm之過濾器或孔平均直徑為0.1 μm之過濾器。
使親和基質與含欲純化或分離試樣之溶液接觸之前,該溶液可用洗滌劑處理以滅活至少一種微生物污染物,例如,細菌、病毒及寄生蟲。在一個實施例中,CCS補充有洗滌劑以滅活至少一種微生物污染物。在一個實施例中,該洗滌劑係TritonX-100。添加於含欲純化或分離試樣之溶液中的洗滌劑濃度可改變以符合特定純化流程之需求。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有10%洗滌劑。在另一實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有7%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有5%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有3%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有2%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有1%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有0.5%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有0.1%洗滌劑。
一旦施加至該親和基質,試樣即可以期望流速處理以(例如)促進試樣之處理或結合。儘管可使用任何流速,但常用流速可介於1與200 cm/h之間。在一些實施例中試樣之流速可為1 cm/h。在其他實施例中,試樣之流速可為10 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為25 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為50 cm/h。在另一實施例中,試樣之流速可為76 cm/h。在另一實施例中,試樣之流速可為100 cm/h。在一些實施例中試樣之流速可為125 cm/h。在另一實施例中,試樣之流速可為150 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為175 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為200 cm/h。
在該親和基質與試樣物質接觸後,可用緩衝液洗滌去除未結合試樣物質。在一個實施例中,該親和基質可用具有酸性pH之緩衝液洗。在一個實施例中,該親和基質可用具有中性pH之緩衝液洗。在一個實施例中,該親和基質可用具有鹼性pH之緩衝液洗。在另一實施例中,該親和基質可用5到15管柱體積的10 mM磷酸鈉緩衝液洗,該緩衝液包含200 mM NaCl及0.01% Tween-80於pH 7.5。
由洗滌親和基質去除未結合蛋白質之後,結合至親和基質之蛋白質可藉由溶析緩衝液洗滌親和基質來溶析。溶析緩衝液應小心選擇以確保其不會干擾所關注蛋白質(例如人類IgM抗體)與基質間之相互作用,而且不會使所關注蛋白質變性或者狀態變差。在一個實施例中,該親和基質可用具有酸性pH之緩衝液洗以溶析出所關注蛋白質。在一個實施例中,該親和基質可用具有中性pH之緩衝液洗以溶析出所關注蛋白質。在一個實施例中,該親和基質可用具有鹼性pH之緩衝液洗以溶析出所關注蛋白質。一些實施例包括具有磷酸鈉及氯化鎂之緩衝液用於溶析結合至層析管柱之物質,其中使用多至10管柱體積的此緩衝液來從管柱溶析出結合物質。在一些實施例中,可使用具有介於5與10 mM間之磷酸鈉及1與5 M間之氯化鎂之緩衝液來溶析結合至親和基質之物質。另一實施例包括3管柱體積含5 mM磷酸鈉及3 M氯化鎂之緩衝液來溶析結合至親和基質之物質。在一些實施例中,IgM可使用補充3 M MgCl2
於pH 6.8之5 mM磷酸鈉緩衝液從蛋白質A基質溶析出。
本文揭示使用離子交換層析法純化或分離蛋白質(例如IgM抗體或抗原結合片段)之方法。蛋白質之離子交換層析法係多步驟製程,其通常涉及平衡層析管柱、使試樣溶液與管柱基質接觸、洗掉管柱中未結合的物質、及溶析出所期望的物質。視需要,此一般製程可在各種條件下重複一或多次以增加試樣純度。在一些實施例中,該陽離子交換層析基質可為丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂。在一個實施例中,陽離子交換層析基質可為MacroCapTM
SP樹脂。
在一些實施例中,在使用前將離子交換基質洗滌並平衡。舉例而言,該離子交換基質可用純化水洗滌以去除任何污染物。在一個實施例中,該離子交換基質可用1倍至10倍管柱體積的純化水洗滌。在一個實施例中,該離子交換基質可用2倍管柱體積的純化水洗滌。在一些實施例中,該離子交換基質可用至少一種酸性緩衝液洗滌。舉例而言,該離子交換基質可用1倍至5倍管柱體積的具有0.5 M NaOH的緩衝液洗滌。在另一實施例中,該離子交換基質係用3倍管柱體積的具有0.5 M NaOH的緩衝液洗滌。在一些實施例中,該離子交換基質係用3倍管柱體積的具有2 M NaCl的緩衝液洗滌。在離子交換基質與試樣接觸之前,基質可用適當酸性、鹼性或中性pH緩衝液進行平衡。在一個實施例中,該離子交換基質可用2倍至8倍管柱體積的pH 6.8的緩衝液進行平衡。在一個實施例中,該離子交換基質可用5倍管柱體積的10 mM磷酸鈉緩衝液進行平衡,該緩衝液含有75 mM NaCl及0.01% Tween-80且pH為6.8。
欲經由接觸離子交換基質純化或分離之試樣應基本上不含大的顆粒物質。該顆粒物質可以各種方式去除,例如,藉由離心或過濾。在一些實施例中,使本文所述條件培養上清液(CCS)在與離子交換基質接觸之前基本上不含大的顆粒物質。在另一實施例中,CCS經過濾以去除顆粒物質。可使用具有任何孔徑之過濾器,例如,孔平均直徑為1 μm之過濾器或孔平均直徑為0.75 μm之過濾器或孔平均直徑為0.5 μm之過濾器或孔平均直徑為0.22 μm之過濾器或孔平均直徑為0.1 μm之過濾器。
在離子交換基質與含欲純化試樣之溶液接觸之前,該溶液可用洗滌劑處理以滅活至少一種微生物污染物(例如,細菌、病毒及寄生蟲)或以幫助將靶蛋白質維持在可溶狀態。在一些實施例中,該試樣可補充有洗滌劑以滅活至少一種微生物污染物或以幫助將靶蛋白質維持在可溶狀態。在一個實施例中,該洗滌劑係TritonX-100。在一個實施例中,洗滌劑係Tween-80。添加於含欲純化或分離試樣之溶液中的洗滌劑濃度可改變以符合特定純化流程之需求。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有10%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有7%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有5%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有3%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有2%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有1%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有0.5%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有0.1%洗滌劑。
一旦施加至該離子交換基質,試樣即可以期望流速處理以(例如)促進試樣之處理或結合。儘管可使用任何流速,但常用流速可介於1與200 cm/h之間。在一個實施例中,試樣之流速可為1 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為10 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為25 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為50 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為76 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為100 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為125 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為150 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為175 cm/h。在另一實施例中,試樣之流速可為200 cm/h。
使離子交換基質與試樣物質接觸後,可藉由用緩衝液洗滌以去除未結合試樣物質。在一個實施例中,該離子交換基質可用具有酸性pH之緩衝液洗滌。在一個實施例中,該離子交換基質可用具有中性pH之緩衝液洗滌。在一個實施例中,該離子交換基質可用具有鹼性pH之緩衝液洗滌。在一個實施例中,該離子交換基質可用5倍至15倍管柱體積的緩衝液洗滌,該緩衝液包含10 mM磷酸鈉、75 mM NaCl、及0.01% Tween-80且pH為6.8。
藉由洗滌從離子交換基質去除未結合蛋白質之後,結合至離子交換基質之蛋白質可藉由用溶析緩衝液洗滌離子交換基質來溶析。溶析緩衝液應經仔細選擇以確保其將不會干擾所關注蛋白質(例如人類IgM抗體)與基質間之相互作用,而且不會使所關注蛋白質變性或者使其狀態變差。在一個實施例中,該離子交換基質可用具有酸性pH之緩衝液洗滌以溶析出所關注蛋白質。在一個實施例中,該離子交換基質可用具有中性pH之緩衝液洗滌以溶析出所關注蛋白質。在一個實施例中,該離子交換基質可用具有鹼性pH之緩衝液洗滌以溶析出所關注蛋白質。一些實施例包括具有磷酸鈉及氯化鈉之緩衝液用於溶析結合至層析管柱之物質,其中使用至多10倍管柱體積的此緩衝液來從管柱溶析出結合物質。在一些實施例中,可使用具有介於5與50 mM之間磷酸鈉及150與500M氯化鈉之緩衝液來溶析結合至離子交換基質之物質。另一實施例包括用4倍管柱體積的緩衝液(包含200 mM NaCl之10 mM磷酸鈉緩衝液)來溶析結合至離子交換基質之物質。在一些實施例中,IgM可使用10 mM磷酸鈉緩衝液從MacroCapTM
SP基質中溶析出,該緩衝液含有200 mM NaCl及0.01% Tween-80且pH為6.8。
本文揭示使用羥基磷灰石層析法純化或分離蛋白質(例如IgM抗體或抗原結合片段)之方法。蛋白質之羥基磷灰石層析法係多步驟製程,其通常涉及平衡層析管柱、使試樣溶液與管柱基質接觸、清洗掉管柱中未結合的物質、及溶析出所期望的物質。視需要,此一般製程可在各種條件下重複一或多次以增加試樣純度。在一些實施例中,該羥基磷灰石層析基質可為磷酸鈣基質。在一個實施例中,該羥基磷灰石層析基質可為CHTII陶瓷羥基磷灰石(80 μm珠粒尺寸)。
在一些實施例中,羥基磷灰石基質在使用之前進行水合。在一個實施例中,利用具有200 mM磷酸鉀之溶液(pH 9.0)每mL期望管柱床體積使用0.54g乾基質對羥基磷灰石基質進行水合。在羥基磷灰石基質與試樣接觸之前,基質可用酸性、鹼性或中性pH緩衝液平衡。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用2倍至8倍管柱體積pH為6.8的緩衝液進行平衡。在另一實施例中,該羥基磷灰石基質可用5倍管柱體積的緩衝液進行平衡,該緩衝液含有10 mM磷酸鈉、100 mM NaCl、及0.01% Tween-80且pH為6.8。
欲經由接觸羥基磷灰石基質純化或分離之試樣應基本上不含大的顆粒物質。該顆粒物質可以各種方式去除,例如,藉由離心或過濾。在一個實施例中,使條件培養上清液(CCS)在與羥基磷灰石基質接觸之前基本上不含大的顆粒物質。在一個實施例中,CCS經過濾以去除顆粒物質。可使用具有任何孔徑之過濾器,例如,孔平均直徑為1 μm之過濾器或孔平均直徑為0.75 μm之過濾器或孔平均直徑為0.5 μm之過濾器或孔平均直徑為0.22 μm之過濾器或孔平均直徑為0.1 μm之過濾器。
在羥基磷灰石基質與含欲純化試樣之溶液接觸之前,該溶液可用洗滌劑處理以滅活至少一種微生物污染物(例如,細菌、病毒及寄生蟲)或以幫助將靶蛋白質維持在可溶狀態。在一些實施例中,該試樣可補充有洗滌劑以滅活至少一種微生物污染物或以幫助將靶蛋白質維持在可溶狀態。在一個實施例中,該洗滌劑為TritonX-100。在一個實施例中,該洗滌劑為Tween-80。添加於含欲純化或分離試樣之溶液中的洗滌劑濃度可改變以符合特定純化流程之需求。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有10%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有7%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有5%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有3%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有2%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有1%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有0.5%洗滌劑。在一個實施例中,該含欲純化或分離試樣之溶液可具有0.1%洗滌劑。
一旦施加至該羥基磷灰石基質,試樣即可以期望流速處理以(例如)促進試樣之處理或結合。儘管可使用任何流速,但常用流速可介於1與200 cm/h之間。在一個實施例中,試樣之流速可為1 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為10 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為25 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為50 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為76 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為100 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為125 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為150 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為175 cm/h。在一個實施例中,試樣之流速可為200 cm/h。
使羥基磷灰石基質與試樣物質接觸後,可藉由用緩衝液洗滌以去除未結合試樣物質。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用具有酸性pH之緩衝液洗滌。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用具有中性pH之緩衝液洗滌。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用具有鹼性pH之緩衝液洗滌。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用5倍至15倍管柱體積的緩衝液洗滌,該緩衝液包含10 mM磷酸鈉、100 mM NaCl、及0.01% Tween-80且pH為6.8。
藉由洗滌從羥基磷灰石基質去除未結合蛋白質之後,結合至羥基磷灰石基質之蛋白質可藉由用溶析緩衝液洗滌羥基磷灰石基質來溶析。溶析緩衝液應經仔細選擇以確保其將不會干擾所關注蛋白質(例如人類IgM抗體)與基質間之相互作用,而且不會使所關注蛋白質之狀態變差。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用具有酸性pH之緩衝液洗滌以溶析出所關注蛋白質。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用具有中性pH之緩衝液洗滌以溶析出所關注蛋白質。在一個實施例中,該羥基磷灰石基質可用具有鹼性pH之緩衝液洗滌以溶析出所關注蛋白質。一些實施例包括具有磷酸鈉及氯化鈉之緩衝液用於溶析結合至羥基磷灰石管柱之物質,其中使用至多10倍管柱體積的此緩衝液來從管柱溶析出結合物質。在一些實施例中,可使用具有介於150與500 mM之間磷酸鈉及50與200M氯化鈉之緩衝液來溶析結合至羥基磷灰石基質之物質。在一個實施例中,可使用4倍管柱體積的緩衝液(包含含有100 mM NaCl之175 mM磷酸鈉緩衝液)用於溶析結合至羥基磷灰石基質之物質。在另一實施例中,IgM可使用緩衝液從CHTII陶瓷羥基磷灰石基質中溶析出,該緩衝液含有175 mM磷酸鈉、100 mM NaCl、及0.01% Tween-80且pH為6.8。
在所用鹽、鹽濃度、所用洗滌劑、洗滌劑濃度、pH等方面改變組成之緩衝液可用於大體上實施本文所述方法。因此,該等變化涵蓋於所提供揭示內容之範圍內,其並非意欲排他或限制本發明。
實施例C1提供純化或分離蛋白質之方法,該方法包含將包含該蛋白質之溶液施加於親和層析管柱,將來自該親和層析管柱之析出液施加至陽離子交換層析管柱,並將來自該陽離子交換層析管柱之析出液施加至羥基磷灰石層析管柱,及獲得來自該羥基磷灰石層析管柱之析出液。
實施例C2提供實施例C1之方法,其中該親和層析管柱包含至少一種經蛋白質A塗佈之受質。
實施例C3提供實施例C2之方法,其中該至少一種經蛋白質A塗佈之受質係多孔受質。
實施例C4提供實施例C3之方法,其中該多孔受質包含3000埃之孔。
實施例C5提供實施例C1之方法,其中該至少一種經蛋白質A塗佈之物質結合蛋白質。
實施例C6提供實施例C5之方法,其中該與至少一種經蛋白質A塗佈之物質結合之蛋白質係利用含氯化鎂之溶液溶析。
實施例C7提供實施例C6之方法,其中該含氯化鎂之溶液係1 M至5M氯化鎂溶液。
實施例C8提供實施例C6之方法,其中該含氯化鎂之溶液係3 M氯化鎂溶液。
實施例C9提供實施例C5之方法,其中該與該至少一種經蛋白質A塗佈之物質結合之蛋白質係抗體。
實施例C10提供實施例C9之方法,其中該抗體係IgM。
實施例C11提供實施例C1之方法,其中該陽離子交換層析管柱包含丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂。
實施例C12提供實施例C11之方法,其中該丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂結合蛋白質。
實施例C13提供實施例C12之方法,其中該與該丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂結合之蛋白質係利用包含10 mM磷酸鈉、200 mM氯化鈉及0.01%聚山梨醇酯80之溶液溶析。
實施例C14提供實施例C13之方法,其中該與該丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂結合之蛋白質係抗體。
實施例C15提供實施例C14之方法,其中該抗體係IgM。
實施例C16提供實施例C1之方法,其中該羥基磷灰石層析管柱包含磷酸鈣樹脂。
實施例C17提供實施例C16之方法,其中該磷酸鈣樹脂結合蛋白質。
實施例C18提供實施例C17之方法,其中該與該磷酸鈣樹脂結合之蛋白質係利用包含175 mM磷酸鈉、100 mM氯化鈉及0.01%聚山梨醇酯80之溶液溶析。
實施例C19提供實施例C18之方法,其中該與該磷酸鈣樹脂結合之蛋白質係抗體。
實施例C20提供實施例C19之方法,其中該抗體係IgM。
實施例C21提供純化或分離蛋白質之方法,其包含a.將含該蛋白質之溶液施加至包含至少一種經蛋白質A塗佈之物質的親和層析管柱,並用含3 M氯化鎂之溶液溶析出與該至少一種經蛋白質A塗佈之物質結合的任何蛋白質;b.將來自該親和層析管柱之析出液施加至含丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂之陽離子交換層析管柱,並用含10 mM磷酸鈉、200 mM氯化鈉及0.01%聚山梨醇酯80之溶液溶析出與丙烯醯胺-葡聚糖共聚物樹脂結合之任何蛋白質;c.將來自該陽離子交換層析管柱之析出液施加至含磷酸鈣樹脂之羥基磷灰石,並利用含175 mM磷酸鈉、100 mM氯化鈉及0.01%聚山梨醇酯80之溶液溶析出與磷酸鈣樹脂結合之任何蛋白質。
提供以下實例以更詳細的闡述本文所述實施例。該等意欲闡述而非限制該等實施例。
測試經艾伯斯坦-巴爾病毒轉化之人類淋巴母細胞(HLP)之池(Cahan等人)產生GD2特異性IgM抗體之能力。將細胞培養於RMPI完全培養基(10%熱滅活FBS、1%L-Glu、1%抗生素(Sigma))中。收集第2代至第4代之間的耗竭生長培養基(Spent growth media)並分析IgM濃度及與GD2之反應性。使2-5×105
個細胞/mL之培養物生長3天後,HLP產生6-8 μg/mL IgM(藉由ELISA定量)。
為確定由HLP產生之IgM是否特異性針對GD2,藉由ELISA分析來自每一培養之耗竭培養基。簡言之,藉由蒸發含25 ng的GD2、GD1a、GM2或GM3之200 μl乙醇將神經節苷脂塗佈至ELISA板。然後將板封阻並根據常規ELISA程序分析含IgM之細胞培養基或人類IgM之結合。來自HLP之耗竭培養基(濃縮8.1倍或14.2倍)含有GD2反應性IgM(圖1A);然而,該抗體亦識別神經節苷脂GD1a、GM2、及GM3(圖1B)。該等數據表明,由HLP產生之IgM具有多反應性。
實施FACS分析以確定由HLP產生之IgM是否結合在黑素瘤細胞表面上表現之GD2。簡言之,將1205LU細胞(在表面上表現GD2之人類黑素瘤細胞系)利用來自HLP培養物之耗竭培養基培養,洗滌,且然後用二級抗體FITC-山羊-抗-人類Ig(Jackson Laboratories)進行標記。如圖2中所示,僅來自較早的幾代HLP(第2代)之培養基產生可識別細胞表面GD2之IgM(圖2B)。然而,當HLP繼代培養數周後此活性迅速消失(圖2C)。該等結果表明,產生特定GD2反應性IgM之細胞在HLP中係緩慢生長物且迅速因非產生物或非特異性抗體產生物而密度過大,或者表明此IgM之產生不穩定。使用鼠科動物抗GD2 IgM抗體MAb-126(ATCC編號HB-8568TM
)作為陽性對照且展示穩健GD2特異性結合(圖2D)。
為產生獲得抗GD2特異性IgM之EBV缺失融合瘤細胞系,將來自前幾代HLP的細胞與融合夥伴A6(ATCC CRL-8192)或K6H6/B5(ATCC CRL-1823)融合以形成融合瘤。由於HLP中GD2特異性亞純系之明顯低豐度,故藉由GD2特異性ELISA對80,000個純系進行篩選。大約5-10%來自該等融合瘤細胞系之抗體製劑展示陽性GD2反應性。然而,當使用一組神經節苷脂(GD1、GM2及GM3)針對特異性進行篩選時,90%以上的GD2陽性純系對多個神經節苷脂展示反應性(圖3A-純系5D7及10B4)。而且,大多數多反應性抗體與一組不相關對照蛋白質發生交叉反應(未展示數據)。該等結果表明,在HLP中產生GD2特異性IgM之淋巴母細胞極少。
亞選殖及篩選作用致使分離出GD2特異性IgM產生融合瘤細胞系。分離出兩種GD2特異性融合瘤細胞系3B2及1470。兩個細胞系之培養物均以0.3-0.4e6
/mL細胞之接種密度接種且每3至4天分裂一次,此在耗竭培養基中獲得3-8 μg/mL的IgM。神經節苷脂特異性ELISA僅顯示與GD2之正反應性且對於三種對照神經節苷脂(GD1a、GM2、及GM3)無反應性(圖3A及B),此表明該等細胞產生GD2-特異性抗體。此外,FACS分析展示1205LU人類黑素瘤細胞對於3B2及1470抗體呈現陽性染色,此表明該等抗體可識別細胞表面上之GD2(圖4)。對純系3B2及1470實施分子分析以確定純系起源。輕鏈特異性ELISA展示兩個純系均分泌含κ輕鏈之IgM(數據未展示)。該等細胞之cDNA的序列分析顯示相同之重鏈及輕鏈序列,此表明該兩個純系係源自同一HLP淋巴母細胞純系(數據未展示)。
使用來自3B2培養物之部分經純化抗體評估此抗體調節對GD2表現黑素瘤細胞系之補體依賴性細胞毒性(CDC)的能力,此乃因當抗體結合其抗原時此活性很大程度上依賴於該抗體所呈現之構象(Janeway等人,Immunobiology,9-12(第5版,2001))。將黑素瘤靶細胞系(GD2-陽性細胞系LF0023及M14,及GD2-陰性細胞系PM0496及JS0592)於補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺、非必需胺基酸、及6 μM HEPES之RPMI1640中培養,並用胰蛋白酶收穫,然後使用。將靶細胞與3B2含IgM之上清液在20%人類血清之存在下一起培養。於37℃下培育1小時之後,利用Cell Titer Glo試劑(Promega公司,Madison,WI)鑑別活細胞。%殺死係以來自經處理細胞對未經處理細胞之信號比來測定。圖5中之數據表明,由3B2純系產生之IgM可引發對某些GD2陽性黑素瘤細胞系之強CDC反應。
實施分子分析以確定純系3B2及1470是否經EBV感染。設計六對PCR引物對((EBNA2-1141f(SEQ ID NO:45)與EBNA2-1440r(SEQ ID NO:46);EBV2001f(SEQ ID NO:47)與EBV2622r(SEQ ID NO:48);EBV1901F(SEQ ID NO:49)與EBV2822R(SEQ ID NO:50);EBV169461f(SEQ ID NO:51)與EBV170100r(SEQ ID NO:52);EBV169480f(SEQ ID NO:53)與EBV170080r(SEQ ID NO:54);EBV8491F(SEQ ID NO:55)與EBV9020r(SEQ ID NO:56))以驗證EBV基因組之存在性及完整性。該等引物對中的一對擴增EBNA-2之開放讀碼框;兩個重疊組中每一組擴增EBV基因組之5'及3'端;且一對擴增複製起點。開始,3B2及1470兩個純系均為EBV陽性,如藉由基因組PCR所證明(數據未展示)。然而,藉由將稀釋平板限制為少於1個細胞/孔來進一步亞選殖產生不含EBV基因組之3B2及1470細胞系之亞純系,如藉由EBV特異性PCR分析所確定(數據未展示)。
EBV陰性3B2亞純系(AB527-HYB-3B2-EBV缺失)已於2008年7月16日存放於美國典型培養物保藏中心(Amer.Type Cult.Coll.)(10801 University Blvd.,Manassas,Virginia 20110-2209)且已指定登錄號為PTA-9376。對AB527-HYB-3B2-EBV缺失亞純系進行第二輪亞選殖以鑑別產生免疫球蛋白單一形式J鏈之純系,此乃因原始融合瘤可產生人類或小鼠J鏈。為鑑別具有單一形式J鏈之純系、或J鏈缺失之純系,使用特定針對人類J鏈(hu-285F(SEQ ID NO:57)及hu-418R(SEQ ID NO:58))、或小鼠J鏈(m-230F(SEQ ID NO:59)及m-370R(SEQ ID NO:60))之引物實施RT-PCR。該等結果表明,3B2亞純系AB527-HYB-3B2-3C9係EBV缺失、人類J鏈缺失、鼠科動物J鏈陽性且在靜置培養中分泌大約30 mg/L的單株GD2特異性IgM。
將從AB527-HYB-3B2-3C9(EBV缺失、人類J鏈缺失、鼠科動物J鏈陽性融合瘤)分離出之總RNA逆轉錄於cDNA中並作為模板使用對應於SEQ ID NO:33及35之引物用於IgM重鏈之PCR擴增且使用對應於SEQ ID NO:36及38之引物用於輕鏈之PCR擴增。從AB527-HYB-3B2-3C9擴增之重鏈核苷酸序列編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:40之多肽,且從AB527-HYB-3B2-3C9擴增之輕鏈核苷酸序列編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:42之多肽。實施第二輪PCR擴增以添加人類前導序列,同時引入5'及3'限制性內切核酸酶識別位點以促使擴增子選殖於pEE6.4(重鏈)及pEE14.4(輕鏈)中,兩個載體均提供用為Lonza Biologics麩醯胺合成酶表現系統(GS System)之一部分。IgM重鏈之第二輪PCR擴增係使用對應於SEQ ID NO:34及35之引物實施,而輕鏈擴增則係使用對應於SEQ ID NO:37及38之引物。
PCR擴增之輕鏈cDNA用HindIII及EcoRI消化並接入類似切割之pEE14.4,而重鏈cDNA用HindIII及MfeI消化並接入用HindIII及EcoRI消化之pEE6.4(MfeI及EcoRI留下相容「黏性」末端)。證實重鏈及輕鏈之核苷酸序列之後,將重鏈表現基因盒引入pEE14.4-AB527-LC中作為NotI/PvuI片段以構建最終表現載體pEE14.4-AB527-LC-HC(p0311)(圖6)。pEE14.4係含有麩醯胺合成酶小基因之10 Kb載體,此允許在GS抑制劑L-甲硫胺酸亞碸亞胺(MSX)之存在下選擇穩定轉染子。此載體中cDNA插入段之轉錄係由人類CMV即可早期啟動子控制,該cDNA插入段之上游係包括內含子1之hCMV-MIE 5'非轉譯區,該cDNA插入段之下游係允許轉錄物有效聚腺苷酸化之SV40聚腺苷酸化信號(圖7)。
CHO細胞藉由電穿孔用線性化雙基因載體p0311轉染以表現重組GD2特異性IgM。轉染之後,將細胞置於96孔板中並使用含透析胎牛血清(dFBS)及麩醯胺合成酶補充物之非選擇性培養基培養。次日,向各孔中添加含dFBS、麩醯胺合成酶補充物及MSX(10 μM最終濃度)之選擇性培養基,其能夠選擇含表現載體之細胞。僅追蹤已察覺到來自單一轉染細胞之純系。
藉由ELISA篩選存在人類IgM之轉染子。使純系在含血清之選擇培養基擴展並藉由定量輔助分析檢查存活的純系以鑑別最高產率的純系。最高產率的轉染子適於化學限定IS-CHO-CDTM
培養基(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)並以2,500個細胞/孔接種於含10 μM MSX之培養基的平底96孔板(80個板)中。藉由ELISA針對IgM產生對耐藥純系進行分析。使對IgM產生呈現陽性之純系按比例增加並在隨後第二次(6孔)及第三次(20 mL振盪燒瓶)分析中分析抗體產生率。此鑑別出IgM產生CHO-K1SV轉染瘤純系127C8。該127C8純系並不表現J鏈,因此,由此細胞系產生之重組AB527 IgM缺少J鏈。AB527之重鏈及輕鏈的胺基酸序列分別由SEQ ID NO:40及42表示。
實施若干試驗以確定在活體外重組AB527是否可與純化GD2結合。開始,實施表面電漿共振試驗以確定重組AB527是否能結合GD2,亦測定其對GM2或GD3是否展示親和力(圖8)。該等試驗係如下實施:將40 μL GD2(BioDesign)、GD3(HyTest)、及GM2(USBiological)於10 mM HEPES中的0.3 mg/mL溶液、150 mM NaCl、3 mM含30%乙醇的EDTA(HBS-E)以5 μl/分鐘之流速使用BIAcore 3000儀器分別注射於CM5晶片之流動池(flow cell)2、3、及4上。進行五次重複注入20 μL 10 mM NaOH,之後固定每一神經節苷脂直至達成穩定基線為止。然後,將80 μL於HBS-E緩衝液中之200 nM重組AB527以20 μL/分鐘之流速注射於所有4個流動池上(流動池1用作參照流動池)。隨後使重組AB527分裂6分鐘。晶片表面用50 μL 10 mM NaOH再生。
為更好的表徵AB527之結合動力學,使用連續稀釋的AB527及固定於BIAcore CM5晶片上之GD2實施另外的表面電漿共振試驗。簡言之,以800 nM開始將2倍連續稀釋的AB527如上所述以20 μL/分鐘之流速於HBS-E緩衝液中注射於含GD2之CM5晶片上。每一循環之間晶片表面均用50 μL 10 mM NaOH再生。在BIA評估軟體中針對每一所測試濃度確定每一濃度下之平衡結合(Req
)並然後繪製Req
對濃度之曲線。使用GraphPad Prizm軟體將所得數據擬合至非線性穩態結合模型。當將Req
繪製為AB527濃度之函數時,可確定穩態KD
或達成一半最大結合時之AB527濃度(圖9)。當AB527結合GD2時,穩態KD
值為4.5x10-9
M。
亦藉由免疫染色各種藉由薄層層析法(TLC)分離之神經節苷脂來測試重組AB527之特異性。在免疫TLC分析中使用以下神經節苷脂:GM混合物(Matreya,0.5 mg/mL於乙醇中,含有GM1、GM2、及GM3)、GD混合物(Matreya,0.5 mg/mL於乙醇中,含有GD1a、GD1b、及GD3)、GM4(Matreya,1 mg/mL於乙醇中)、GD2(BioDesign,1 mg/mL於乙醇中)、及GM3(USBiological,1 mg/mL於乙醇中)。將總共2 μl的每一神經節苷脂在5×10 cm二氧化矽TLC板(EMD Chemicals公司)上點樣並在比率為58:37:8之CHCl3
、MeOH、及0.1 M CaCl2
之溶液中顯影。藉由將TLC板用於1.36N H2
SO4
中之0.1%苔黑酚噴灑並於100℃下加熱使所有神經節苷脂染色。對於免疫TLC分析,將經顯影之板首先用於H2
O中之0.1%聚甲基丙烯酸異丁酯處理,且然後乾燥。然後將板用於1x磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的1% BSA封阻1小時。然後將經封阻之板於存於含1% BSA之1x PBS中的2 μg/mL AB527中於4℃下過夜培育。隨後將板用1x PBS洗滌,然後與以1:4000稀釋於含1% BSA之PBS中的山羊抗人類IgG/IgM-辣根過氧化物酶結合物一起培養。將板洗滌,並藉由將板於0.3 mg/mL 4-氯1-萘酚及0.03% H2
O2
中培育來檢測結合抗體。比較的染色結果展示於圖10中。
評估AB527特異性標記GD2表現黑素瘤細胞系之能力。GD2陽性細胞系:M14、M0023、M101、M18、M10-Vac、及PM0496,且GD2陰性細胞系:M21、M238、IMCD0023、MG1055,將該等於補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺、非必需胺基酸及6 μM HEPES之RPMI1640中單獨培養並用胰蛋白酶收穫。將胰蛋白酶化細胞與10 μg/mL的對照IgM(人類IgM,Pierce目錄編號31146)(行I)一起或與10 μg/mL AB527(行II)一起於冰上培育1小時。用1x PBS洗滌3次之後,將細胞與10 μg/mL經FITC標記之山羊抗人類Ig(H+L)抗體(Southern Biotech,Birmingham,AL)一起於冰上培育1小時,隨後實施流動式細胞測量法(分別針對行I及II)或光學顯微鏡及免疫螢光顯微鏡分析(分別針對行III及IV)。如圖11所示,AB527標記之細胞在其表面上表現GD2(行II)。相反,所檢查細胞系均未展示經非GD2特異性人類IgM(行I)染色。免疫螢光研究展示與流動式細胞測量數據(行IV)直接相關,出於比較目的亦展示光學顯微鏡圖像(行III)。
實施基於細胞之ELISA以評估AB527至GD2表現細胞系M14、LLC-MK2、EL4細胞及至CHO-K1細胞(陰性對照)之結合,其提供數據以實施相應斯卡查德分析(Scatchard analyses)。圖12提供EL4細胞之代表性斯卡查德數據集合。經確定AB527與M14及LLC-MK2細胞之結合幾乎相同(分別為0.13±0.02 nM及0.15±0.04 nM)。與EL4細胞之結合略低(0.93±0.16 nM)。此差異可能係由於相對於M14及LLC-MK2在EL4細胞上所觀察到之GD2的表現明顯較低(數據未展示)。對於該等試驗,M14、LLC-MK2、EL4、及CHO-K1細胞均自American Tissue Type Collection(ATCC,Manassas,VA)獲得。M14、EL4、及CHO-K1細胞均於補充有10%胎牛血清之RPMI中培育。LLC-MK2細胞係於補充有1%馬血清之培養基199中培育。將細胞懸浮於1X PBS中並以2.5x106
個細胞/孔添加於黑色U形底微量滴定板(Grenier目錄編號665209),然後以1500 rpm於室溫下離心5分鐘。丟棄上清液,並將細胞重新懸浮於含AB527之溶液中,其係以20 μg/mL開始連續以1:2稀釋於含2% BSA之PBS中。將細胞與抗體一起於室溫下培育1小時。將細胞用200 μL含2% BSA及0.05% Tween-20之PBS洗滌三次,以1500 rpm離心5分鐘以在洗滌步驟之間收集細胞。然後將細胞於PBS溶液中於室溫下培育1小時,該PBS溶液含有1 μg/mL辣根過氧化物酶結合之山羊抗-人類IgG/IgM(Jackson Immunoresearch)及2% BSA。如上所述洗滌細胞。使用QuantaBluTM
螢光受質(Pierce)利用325 nm/420 nm之激發/發射波長在SpectraMaxM5多模態板讀取器(Molecular Devices)中檢測經結合AB527。在SoftMax Pro(ver.5.2)中繪製原始數據並擬合至4-參數模型。在GraphPad Prizm軟體(ver.4.03)中實施數據分析。首先減去非特異性背景(與CHO-K1細胞之結合),且然後藉由斯卡查德分析來分析數據。
實施免疫組織化學(IHC)試驗以確定AB527是否展示與未表現GD2之黑素瘤細胞的交叉反應性。根據所提供說明書使用NHS酯偶聯化學法以50:1之莫耳比利用存於磷酸鹽緩衝鹽水中之生物素化試劑(EZ-LinkTM
磺基-NHS-LC-生物素,Pierce目錄編號為21335)對經純化AB527、以及非特異性人類IgM(Pierce目錄編號為31146)實施生物素化,並將其用於染色各種GD2陽性(M14)或GD2陰性(MG1055、RPMI7951及JS0592)細胞系。簡言之,將每一黑素瘤細胞系接種於室玻片上並於補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺、非必需胺基酸、及6 μM HEPES之RPMI1640中過夜培育。將細胞用1x PBS洗滌一次並福爾馬林(formalin)固定。將經固定細胞與1 μg/mL生物素化AB527或生物素化非特異性人類IgM(陰性對照)一起過夜培育並使用BioGenex Super SensitiveTM
Link-Label IHC檢測系統檢測經標記細胞。如圖13A中所示,AB527特異性結合GD2陽性細胞且與GD2陰性細胞具有最小交叉反應性,而非特異性同位素對照抗體未使任一細胞類型染色(圖13B)。
亦使用腫瘤及正常組織試樣評估AB527之結合特性。將AB527及非特異性正常人類IgM(hIgM)於Covance Research Products進行生物素化並於Charles River Laboratories用於IHC研究。將人類黑素瘤癌細胞M14植入裸小鼠中以建立異種移植腫瘤,其然後作為GD2陽性對照組織用於IHC方法研發。使用直接抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合物(ABC)程序實施初步研究使得M14腫瘤切片對於生物素化AB527(圖14(b))而非對於生物素化hIgM(圖14(a))呈現陽性染色。如所預計,正常人類脾冷凍切片中之淋巴細胞未經任一抗體染色。對抗體進行滴定後,所選用於GLP人類組織交叉反應研究之生物素化AB527及生物素化hIgM的染色濃度設定為3及15 μg/mL。利用此方法,實施研究以確定AB527在35個正常人類組織(每一組織3個試樣/供體)中之結合。如所預計,在M14腫瘤切片中可檢測到高親和力膜染色(陽性細胞膜以較低AB527濃度-3 μg/mL染色)。如表2中所示,高親和力膜染色僅在食道(3個試樣中的2個)、輸卵管(3個試樣中的1個)、及輸尿管(3個試樣中的1個)之上皮細胞、以及胎盤之蛻膜細胞(3個試樣中的3個)、及胸腺之網狀細胞(3個試樣中的2個)中發現。所有其他組織均未展示高親和力膜染色(表2)。
為確定AB527是否調節CDC,將以上圖11中所闡述之黑素瘤細胞系與來自AB527-HYB-3B2-3C9純系或AB527之部分純化抗體一起培育。將靶細胞於補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺、非必需胺基酸、及6 μM HEPES之RPMI1640中培養並用胰蛋白酶收穫,然後使用。將靶細胞與10 μg/mL AB527或AB527-HYB-3B2-3C9純系IgM在20%人類血清之存在下一起培育。於37℃下培育1小時之後,利用Cell Titer Glo試劑(Promega公司,Madison,WI)鑑別活細胞。%殺死係以來自經處理細胞對未經處理細胞之信號比來測定。圖15中之數據表明,兩種抗體均可引發對某些黑素瘤細胞系之強CDC反應,其中AB527始終造成較高程度的CDC。此實例中所述利用AB527之試驗結果匯總於表3中。
另外實施的研究展示AB527僅促進在補體之存在下表現GD2之細胞的CDC。如圖16中所示,僅在補體及GD2表現細胞(例如,M14細胞)存在下才會出現可量測程度之AB527介導的CDC活性,此與1205LU細胞即不表現GD2之人類腫瘤細胞有所不同。
為評估IgG1類型轉變AB527在活體外誘導CDC之能力,將AB527之HindIII/BamHI可變區DNA片段框架內選殖於HindIII/BamHI消化的含IgG1恆定區之pEE6.4載體中。與AB527輕鏈共同表現使得產生AB527之IgG1形式。將此抗體調節M14細胞CDC之能力與AB527之IgM形式在1-100 μg/mL下之能力相比較,如圖17中所示。
亦實施研究以評估J鏈在AB527介導的CDC中可能起到的作用。為產生具有J鏈之AB527 IgM分子,將編碼J鏈之質粒p0362轉染於CHOK1-SV細胞中並產生穩定表現J鏈之純系細胞系。然後將表現AB527之質粒引入此細胞系中以產生表現AB527及J鏈之純系。分離出三種純系,即5.F2-JC、5.F8-JC及6.C3-JC。將抗體平行純化以針對不含J鏈之AB527形式比較其相對CDC活性。劑量反應曲線展示於圖18中。經計算,AB527、5.F2-JC、5.F8-JC、及6.C3-JC的90%有效劑量(ED90)分別為1.21、4.35、2.52、及6.81 μg/mL。含J鏈之IgM(5.F2-JC、5.F8-C、及6.C3-JC)在調節CDC方面看來不如無J鏈之AB527有效。
將管柱用CPG3000A-蛋白質A樹脂(Millipore)填充。估計捕獲IgM所用之樹脂體積,其中應瞭解1 mL樹脂在76 cm/h之流速下結合大約8 mg的IgM(表4)。當管柱裝載有期望量的樹脂後,將其連接至FPLC裝置並用5倍管柱體積的純化水;3倍管柱體積的20 mM HCl,pH 1.5(緩衝液A2);及3倍管柱體積的6 M胍.HCl(緩衝液A3)洗滌。裝載試樣之前,將管柱用5倍管柱體積的含200 mM NaCl及0.01% Tween-80之10 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)(緩衝液A1)平衡。
將條件培養上清液(CCS)藉由用.22 μm膜過濾器過濾來澄清。將洗滌劑添加於經過濾CCS中,獲得含1% TritonX-100及0.1% TNBP之溶液並於4℃下培育2小時以上。將洗滌劑處理之CCS施加於經平衡CPG3000A蛋白質A管柱並以76 cm/h之流速處理。利用10倍管柱體積的緩衝液A1沖洗掉未結合蛋白質之後,利用補充有3 M MgCl2
的5 mM磷酸鈉緩衝液,pH 6.8(緩衝液B)將IgM從管柱溶析出。藉由施加3倍管柱體積的緩衝液A2及3倍管柱體積的緩衝液A3從該管柱去除殘餘結合蛋白。為評估純度,實施還原SDS-PAGE凝膠以將施加於蛋白質A管柱的洗滌劑處理之CCS(裝載)與在溶析之後從混合部分中所收集AB527(溶析)進行比較(圖19-箭頭指向IgM μ鏈(約70 kD)及輕鏈(約25 kD))。蛋白質A親和層析法的回收率90%的輸入IgM,其基本上不含污染物。
為去除污染物,將懸浮於緩衝液B中之IgM藉由使用Prep/Scale-TFF 1卡匣(Millipore)及10倍體積的含10 mM磷酸鈉、75 mM NaCl之緩衝液透析來濃縮。以大約200 mL/分鐘之流速實施透析,其中入口壓力保持小於20 PSI且滲透物流速為大約60 mL/分鐘。將10% TritonX-100溶液添加於經透析試樣中以獲得1%最終濃度的TritonX-100,並將試樣於室溫下培育1小時並用0.2 μm膜過濾。
將陽離子交換管柱用MacroCapTM
SP樹脂(GE Healthcare)填充。估計捕獲IgM所用之樹脂體積,其中應瞭解1 mL樹脂在76 cm/h之流速下結合大約9 mg的IgM(圖20)。當管柱裝載有期望量的樹脂後,將其連接至FPLC裝置並用2倍管柱體積的純化水;3倍管柱體積的0.5 M NaOH(緩衝液A6);及3倍管柱體積的2 M NaCl洗滌。裝載試樣之前,將管柱用5倍管柱體積的含10 mM磷酸鈉、75 mM NaCl、0.01% Tween-80之緩衝液,pH 6.8(緩衝液A4)平衡。。
將經透析試樣施加於管柱並以76 cm/h之流速處理。利用5倍管柱體積的緩衝液A4沖洗掉未結合蛋白質之後,利用4倍管柱體積的含200 mM NaCl及0.01% Tween-80之10 mM磷酸鈉緩衝液,pH 6.8(緩衝液C)將IgM從該管柱溶析出。藉由施加3倍管柱體積的緩衝液A6及3倍管柱體積的2 M NaCl從該管柱去除殘餘結合蛋白。如圖13A及B中所示,流出物質主要含有IgM三聚體與二聚體之混合物(圖21A);然而,經溶析物質幾乎排他地為五聚IgM(圖21B)。陽離子交換層析法提供95%的五聚IgM產率,其基本上不含污染物及不完全裝配IgM(圖22)。
使用CHTII陶瓷羥基磷灰石,80 μm珠粒尺寸(Bio-Rad Laboratories,編號157-8100)製備羥基磷灰石管柱。估計捕獲IgM所用之樹脂體積,其中應瞭解1 mL樹脂在76 cm/h之流速下結合大約20 mg的IgM,且在此流速下管柱流出物中IgM的損失小於5%。藉由用200 mM磷酸鉀pH 9.0使基質水合來填充管柱,每mL期望管柱床體積使用0.54g乾基質。將經水合基質添加於管柱中,以使其沉降,然後樹脂用5倍管柱體積的含10 mM磷酸鈉、100 mM NaCl、0.01% Tween-80之緩衝液,pH 6.8(緩衝液A8)平衡。
為減少污染物,將懸浮於10 mM磷酸鈉、200 mM NaCl、0.01% Tween-80,pH 6.8中之IgM用等量體積的0.01% Tween-80稀釋並添加於已平衡管柱中。IgM懸浮液以76 cm/h之流速藉助管柱進行處理。將管柱用10倍管柱體積的緩衝液A8洗滌,以去除未結合物質。用4倍管柱體積的含100 mM NaCl及0.01% Tween-80之175 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)溶析結合IgM(數據未展示)。溶析之後,用含100 mM NaCl之500 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)從管柱去除殘餘結合蛋白。所得IgM溶液基本上不含污染物。當羥基磷灰石層析在本文蛋白質A親和層析及陽離子交換層析之後時,從羥基磷灰石基質溶析出之溶液與澄清細胞培養物上清液相比超過99%純。
產生GD2-BSA結合物提供有效GD2抗原以藉由免疫分析檢查GD2特異性抗體之特異性。此外,產生GM2-BSA及GM3-BSA結合物以用作GD2-BSA結合特異性之對照。藉由BSA上存在之胺利用氰基硼氫化鈉作為溫和還原劑來位點特異性還原胺化神經節苷脂製得共價結合物。主要藉助BSA中離胺酸殘基側鏈上之末端ε-胺基進行偶聯。
為製備結合物,將400 μl溶於0.05 M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.6)中之2 mg/ml BSA溶液與以下組合:500 μl溶於無水乙醇中之1 mg/ml GD2(Biodesign International,編號A86168H)、GM2(Axxora,編號ALX-302-005-M001)或GM3(Axxora,編號ALX-302-003-M002)之溶液;2070 μl的0.05 M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液,pH 9.6;及30 μl的存於10 mM氫氧化鈉中之5 M氰基硼氫化鈉溶液。將反應混合物於25℃下培育2小時,然後添加1200 μl的1 M乙醇鈉(pH 8.0)並於25℃下再培育15分鐘。將反應溶液置於透析管(Pierce Biotechnology,編號68100)中並在1L 50 mM碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液(pH 9.6)中於2-8℃下透析兩次,持續6-18小時。
藉由ELISA評估GD2-BSA結合物之抗原性。藉由將一個碳酸鹽/碳酸氫鹽膠囊(Sigma)溶於100 mL超純水中製備ELISA塗佈緩衝液。將GD2-BSA結合物於ELISA塗佈緩衝液中稀釋至濃度為2 μg/ml,並添加至96孔ELISA板(Greiner Bio-One目錄編號655081)之孔中。將板密封並於2-8℃下培育16-24小時。培育之後,從孔中去除塗佈緩衝液並添加0.3 mL/孔的ELISA封阻溶液(補充有2.5% BSA(w/v)及0.05% Tween-20之PBS)。在微孔板振盪器上振盪的同時將板於21-25℃下培育2小時,然後添加AB527抗體。將2倍連續稀釋之AB 527(初始工作濃度為2 μg/ml)添加於經封阻ELISA板並於微孔板振盪器上振盪的同時於21-25℃下培育1小時。將板在Dynex UltrawashTM
板洗滌器上使用0.3mL/孔ELISA洗滌緩衝液洗滌三次。利用以1:10,000稀釋於ELISA封阻緩衝液中之與HRP結合的山羊抗-人類IgG+IgM(H+L)檢測所結合AB527。去除HRP-結合物且各孔用0.3 mL/孔ELISA洗滌緩衝液洗滌三次。將SureBlueTM
TMB基質(50 μl/孔)添加於經洗滌孔中並將板於21-25℃下培育15分鐘,然後藉由光吸收(450 nm)評估AB527結合(圖23)。經測定,在不存在AB527之情況下於450 nm下之非特異性吸收為0.065。
與GD2-BSA結合物相反,AB527並不識別其他神經節苷脂-BSA結合物。神經節苷脂GM2及GM3藉由針對GD2所闡述之方法與BSA結合,且二者均藉由ELISA評估引發AB527結合之能力。如圖24中所示,AB527僅識別GD2-BSA結合物。應注意,GM2-特異性抗體能夠檢測GM2-BSA結合物;然而,沒有適當GM3-特異性抗體可用於評估GM3-BSA結合物之抗原性(數據未展示)。
為確定培養基補充物(CMS)對細胞生長及抗體產生之影響,使細胞復活並於振盪燒瓶中於20 mL GIBCO-CD-CHO完全培養基中培養。所有培養物均在125 mL振盪燒瓶中於37℃、5% CO2
、120 rpm下培育。接種密度為3.5x105
個細胞/mL,存活力>95%。將細胞於CD-CHO培養基中或者於在第3-7天補充2%(vol/vol)CMS之CD-CHO培養基中培養14天。在第7天添加CMS之後,已補充總共為初始培養體積10%的CMS。使用CEDEX自動細胞計數器在第0、3、5、7、10、13、及14天測定活細胞密度(圖25)、%存活力(圖26)及積分活細胞密度(IVC)(圖27)。在第14天藉由蛋白質A HPLC測定每一組培養細胞之抗體產生(圖28)。
如圖25中所示,從第3天至第7天提供2% CMS所培養之細胞在第7天達成最大活細胞密度12.8×106
個細胞/mL。無CMS之對照細胞培養物在第7天達到最大細胞密度10.7×106
個細胞/mL。使用CMS補充有限培養基組份(例如,葡萄糖、胺基酸及維生素)並幫助培養物達到較高細胞密度。在兩種細胞培養條件下,第7天時細胞均維持良好存活力(>90%)(圖26);然而,從第3天至第7天提供CMS之培養細胞在第7天之後展示比對照培養物旺盛的存活力。第7天之後對照培養物中之一些關鍵營養物可被消耗掉,而CMS則可添加回該等關鍵營養物並幫助細胞維持較旺盛存活力。
在第14天時,評估每一培養物之總抗體產生。利用CMS培養之細胞達到7240 mg/L之最大抗體滴度,其遠高於對照培養物所觀察到的(3036 mg/L)(圖28)。較高抗體滴度可能係由於添加營養物之後較高特異性抗體產率。研究每一生長條件之細胞生長及抗體產生曲線表明,提供CMS之培養物使抗體產生達成140%增加(表5)。雖然兩種培養物之倍增時間相同,但CMS幫助培養物達成IVC之50%改良及特異性抗體產率之另一50%增加。IVC之50%改良係由於利用CMS在培養物中達成較高最大細胞密度。由於最終抗體滴度等於IVC乘以比產率,故提出IVC與特異性抗體產率二者在利用CMS之細胞培養物中均有助於抗體產生之140%增加。表5匯總了CMS對AB527表現細胞之影響。
為確定戊酸對細胞生長之影響,將AB527表現細胞於補充有濃度為0 mM、1 mM、2 mM、4 mM、或8 mM之戊酸的GIBCO-CD-CHO完全培養基中培養。將細胞培養14天並在第0、3、5、7、10、13及14天使用CEDEX自動細胞計數器測定活細胞密度、%存活力及積分活細胞密度。在第14天藉由蛋白質A HPLC測定每一組培養細胞之抗體產生。
在無戊酸之情況下培養之細胞在第7天達成最大細胞密度10.8×106
個細胞/mL;然而,利用戊酸所培養細胞之生長隨戊酸濃度之增加而越來越慢。舉例而言,於8 mM戊酸中培養之細胞在第7天達到最大細胞密度5.4×106
個細胞/mL,此係所有培養物中最低的最大細胞密度。細胞存活力研究表明,利用戊酸培養之細胞在第7天之前具有較低存活力,其中在第7天具有最低存活力(67.4%),如在8 mM戊酸中所培養之細胞中所觀察。該等結果表明,較高濃度的戊酸抑制細胞增殖。第7天之後,對照培養物之存活力更快的下降;然而,此可能係由於關鍵營養物之消耗,此乃因此細胞培養物之細胞密度遠高於在戊酸中所培養細胞(表6)。
然而,出乎意料地,戊酸對於抗體產生具有有利作用。所有在戊酸(其中最高濃度8 mM除外)存在下培養之細胞在第14天均具有比對照培養物高的抗體滴度。於1 mM戊酸中培養之細胞在第14天產生最高抗體滴度(4137 mg/L),其比對照培養物之滴度高36%(3036 mg/L)(表6)。
雖然戊酸抑制細胞生長,但除在最高濃度8 mM下以外其並未展示對活細胞密度之積分具有明顯不利作用。在第14天之IVC值與其他四種培養條件非常類似。很可能戊酸對細胞增殖之抑制導致營養物消耗較慢,因此避免了後期營養物耗竭之培養基,而對照培養物則遭遇此種情況。
總之,細胞培養物在戊酸之存在下可達成較好抗體產生。在具有戊酸之培養物中觀察到特異性抗體產率在52-58 mg/109
個細胞/天之範圍內(表6),其遠高於對照培養物所觀察到的值44 mg/109
個細胞/天。因此,在1 mM戊酸中培養之細胞所達成之最高抗體產生主要係由於特異性抗體產生增加(表6)。
圖1展示在艾伯斯坦-巴爾病毒病毒轉化之人類淋巴母細胞池(HLP)之上清液中所存在抗體之可變抗原特異性,如藉由ELISA所測定。圖1A表明在第2代細胞(8.1X濃縮)或第4代細胞(14.2X濃縮)時來自HLP之濃縮細胞培養物上清液含有特定針對GD2之IgM抗體。圖1B表明來自HLP之濃縮細胞培養物上清液含有結合神經節苷脂GD1a、GD2、GM2及GM3之IgM抗體;圖2展示由HLP細胞培養物所產生IgM抗體對GD2表現1205LU黑素瘤細胞之結合程度,如藉由螢光激活細胞分選(FACS)所分析。圖2A作為陰性對照,其展示在不存在GD2特異性一級抗體之情況下的結合。圖2B及2C展示從分別濃縮至8.1X或14.2X的細胞培養物上清液所獲得HLP衍生之IgM的結合。圖2D展示由鼠科動物融合瘤HB-8568TM
(ATCC編號HB 8568TM
)產生之鼠科動物GD2特異性IgM抗體的結合且作為陽性對照;圖3展示利用來自HLP衍生融合瘤所產生融合瘤純系之耗竭培養基實施的抗原特異性ELISA。圖3A展示融合瘤3B2、5D7、及10B4之培養基中所包含IgM抗體對神經節苷脂GD2、GD1a、GM2、及GM3之結合特性。圖3B展示1470融合瘤亞純系之培養基中所包含IgM抗體對神經節苷脂GD2、GD1a、GM2、及GM3之結合特性;圖4展示由融合瘤3B2及1470細胞培養物所產生IgM抗體對GD2表現1205LU黑素瘤細胞之結合程度,如藉由FACS所分析。圖4A作為陰性對照(Hu-IgM),其展示在不存在GD2特異性一級抗體之情況下沒有結合。圖4B係作為陽性對照,其展示由HB-8568TM
細胞所產生鼠科動物GD2特異性IgM抗體之結合。圖4C及D展示分別由3B2與1470融合瘤細胞所產生IgM之結合;
圖5展示由於補體依賴性細胞毒性(CDC)所導致之細胞死亡,該CDC係由從融合瘤3B2組織培養上清液所獲得之IgM或非GD2特異性人類IgM(nhIgM)調節;圖6提供AB527抗體重鏈及輕鏈區段之選殖的示意圖;圖7提供AB527表現載體之示意圖;圖8繪示AB527對於神經節苷脂GD2、GM2及GD3之結合活性,如藉由表面電漿共振所量測;圖9提供AB527結合平衡之示意圖,如藉由表面電漿共振在不同的GD2結合抗體濃度下所量測;圖10展示藉由薄層層析法所分離各種神經節苷脂之染色圖案。苔黑酚染色(A)展示非特異性神經節苷脂染色,其提供與AB527染色(B)進行比較之基礎;圖11展示結合人類黑素瘤細胞系之AB527的流動式細胞測量法(行I及II)及比較光學顯微鏡及免疫螢光顯微鏡圖像(行II及IV),該等細胞系在細胞表面表現GD2(細胞系:M14、M0023、M101、M18、M10-Vac、PM0496)或缺乏GD2表現(GD2陰性細胞系:M21、M238、IMCD0023、MG1055);圖12提供飽和結合曲線之示意圖及表徵AB527至EL4細胞之結合的相應斯卡查德圖表;圖13展示GD2陽性(M14)及陰性(MG1055、RPMI7951及JS0592)黑素瘤細胞系之AB527染色。免疫組織化學分析係使用生物素化AB527(圖13A)或生物素化非GD2特異性對照IgM(圖13B)實施;圖14展示M14腫瘤切片,該等切片與生物素化hIgM無免疫反應性(14a),但展示與生物素化AB527具有免疫反應性(14b);圖15展示GD2陽性或GD2陰性細胞之補體依賴性細胞毒性(CDC)的比較,該CDC係由從融合瘤AB527-HYB-3B2-3C9獲得之IgM或AB527 IgM調節;圖16係對於表現GD2(M14)或不表現GD2(1205LU)之人類腫瘤細胞在存在或不存在補體之情況下AB527介導之CDC之示意圖;圖17繪示非特異性人類IgM、AB527、非特異性hIgG、及具有IgG1恆定區之類型轉變AB527之CDC活性的相對程度;圖18展示有或沒有J鏈(JC)之AB527抗體之CDC活性的相對程度;圖19展示施加於蛋白質A親和層析管柱之經洗滌劑處理之條件培養上清液(CCS)(裝載)與藉由3 M MgCl2
溶析之後從混合部分中所收集物質(溶析)之還原SDS-PAGE凝膠。箭頭指向IgM重鏈(約70 kD)及輕鏈(約25 kD);圖20展示藉由不同量的MacroCapTM
SP陽離子交換樹脂所捕獲的AB527之還原SDS-PAGE凝膠。箭頭指向IgM重鏈(約70 kD)及輕鏈(約25 kD);圖21展示將不體積的AB527中間體施加於MacroCapTM
SP陽離子交換樹脂之後所收集的流出物(圖21A)或析出液(圖21B)中各種形式之AB527 IgM的相對量;圖22繪示尺寸排除-HPLC之層析圖,其證實了來自MacroCapTM
SP管柱之流出物(圖22A)及溶析液(圖22B)中所存在物質之尺寸分佈;圖23提供AB527至GD2-BSA結合物之結合的示意圖;圖24提供比較AB527至GD2-BSA、GM2-BSA、及GM3-BSA結合物之結合的示意圖;圖25展示在添加(培養基補充物(CMS))及未添加(CD CHO對照)CMS實施例之培養基中所培養的AB527表現細胞活細胞密度隨時間流失的比較;圖26展示在添加(CMS)及未添加(CD CHO對照)CMS實施例的培養基中所培養的AB527表現細胞活細胞隨時間流逝之相對百分數;圖27展示在添加(CMS)及未添加(CD CHO對照)CMS實施例的培養基中所培養的AB527表現細胞的積分活細胞密度(IVC)隨時間的變化;及圖28展示在添加(CMS)及未添加(CD CHO對照)CMS實施例的培養基中所培養的AB527表現細胞14天之後培養物中之總抗體產生。
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(無元件符號說明)
Claims (35)
- 一種重組之IgM抗體,其特異性結合人類GD2,其中重鏈CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:10,重鏈CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:11,重鏈CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:12,輕鏈CDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO:26,輕鏈CDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO:27,輕鏈CDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO:28,且其中該抗體為不包含J鏈的五聚IgM。
- 如請求項1之抗體,其中該抗體係人類抗體。
- 如請求項1之抗體,其中重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:16。
- 如請求項1之抗體,其中輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO:32。
- 如請求項1之抗體,其中該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:40。
- 如請求項1之抗體,其中該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO:42。
- 如請求項1之抗體,其調節補體依賴性細胞毒性。
- 一種多核苷酸,其編碼如請求項1之抗體。
- 如請求項8之多核苷酸,其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20。
- 如請求項9之多核苷酸,其包含核酸序列SEQ ID NO:8。
- 如請求項9之多核苷酸,其包含核酸序列SEQ ID NO: 24。
- 如請求項9之多核苷酸,其包含核酸序列SEQ ID NO:39。
- 如請求項9之多核苷酸,其包含核酸序列SEQ ID NO:41。
- 一種組合物,其包含如請求項1之抗體及醫藥上可接受之載劑。
- 一種載體,其包含如請求項8之多核苷酸序列。
- 一種細胞,其包含如請求項15之載體。
- 如請求項16之細胞,其中該細胞係細菌細胞。
- 如請求項16之細胞,其中該細胞係真核細胞。
- 如請求項18之細胞,其中該真核細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
- 一種細胞,其表現如請求項1之抗體。
- 如請求項20之細胞,其中該細胞係融合瘤。
- 如請求項20之細胞,其中該細胞係轉染瘤(transfectoma)。
- 一種如請求項1之抗體之用途,其用於製造用於治療或預防個體GD2相關疾病之藥劑。
- 如請求項23之用途,其中該GD2相關疾病係癌症。
- 如請求項24之用途,其中該GD2相關疾病係黑素瘤。
- 如請求項23之用途,其中該個體係哺乳動物。
- 如請求項23之用途,其中該個體係人類。
- 一種製造抗體之方法,其包含如請求項20之宿主細胞在 適於產生該抗體之條件下培養,及從該細胞培養物中回收該抗體。
- 一種如請求項1之抗體之用途,其用於製造用於檢測個體中GD2表現細胞之藥劑。
- 如請求項29之用途,其中該抗體經可檢測標記。
- 如請求項30之用途,其中該可檢測標記物係碘-131。
- 如請求項1之抗體,其中該抗體對於GD2呈現4.5×10-9 莫耳(molar)之穩態解離常數(KD )。
- 一種抗體,其包含食品工業發展研究所登錄號BCRC 960406之細胞所產生抗體的重鏈及輕鏈CDRs。
- 一種重組多核苷酸,其編碼包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12的重鏈可變域。
- 一種重組多核苷酸,其編碼包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28的輕鏈可變域。
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