CN105637097A

CN105637097A - 从头合成的基因文库

Info

Publication number: CN105637097A
Application number: CN201480054963.8A
Authority: CN
Inventors: 威廉·巴尼亚伊; 比尔·詹姆士·佩克; 安德烈斯·费尔南德斯; 陈思远; 皮埃尔·尹德穆勒
Original assignee: Special Biological Science Co Ltd Of Tevez
Current assignee: Special Biological Science Co Ltd Of Tevez
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2016-06-01
Also published as: US20180029001A1; KR102160389B1; US20190314783A1; KR20200111278A; US20160089651A1; JP2020022453A; TWI707038B; TWI805996B; US20170327819A1; US9555388B2; ES2815099T3; CA2918258A1; EP4242321A3; US9889423B2; US20150038373A1; US9403141B2; US10773232B2; US10618024B2; TW202118874A; TWI721929B

Abstract

本文提供了具有低错误率的从头合成的核酸大文库。此外，本文描述了用于制备高质量结构单元如寡核苷酸的装置。较长的核酸可使用微流体组装件平行合成。此外，本文的方法允许快速构建高质量长基因的大文库。本文进一步描述了用于制备高质量长核酸的大文库的装置。

Description

从头合成的基因文库

交叉引用

本申请要求2013年8月5日提交的美国临时申请号61/862445和2013年8月5日提交的美国临时申请号61/862457的权益，这些申请通过引用并入本文。

背景技术

具有高保真度和低成本的高效化学基因合成在生物技术和医学以及基础生物医学研究中发挥核心作用。

从头基因合成是基础生物学研究和生物技术应用的强大工具。尽管已知用于以小规模合成相对较短片段的各种方法，但这些技术在可放大性、自动化、速度、精确度和成本方面却不尽人意。需要用于保证所需基因的成功合成并适于自动化的简单、可重现、可放大、不易出错并具成本效益的方法的装置。

发明内容

如上所述，迫切需要能够以较少的错误快速而高效地合成大基因文库或相对较长的寡核苷酸片段的方法、装置和系统。类似地，还需要能够以微流体规模划分(partition)和混合液体试剂以供平行进行大量可单独寻址的反应的方法。本发明解决了这些需求，并且还提供了相关的优势。

在一方面，本发明提供了如本文所述的基因文库。该基因文库包含基因的集合。在一些实施方案中，该集合包含至少100种不同的预选合成基因，所述预选合成基因可具有至少0.5kb的长度，并且相比于包含这些基因的预定序列具有小于1/3000bp的错误率。在另一方面，本发明还提供了包含基因的集合的基因文库。该集合可包含至少100种不同的预选合成基因，其每一种可具有至少0.5kb的长度。至少90％的预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列可包含小于1/3000bp的错误率。所需的预定序列可通过任何方法提供，通常由用户，例如由用户使用计算机化的系统输入数据来提供。在不同的实施方案中，将合成的核酸与这些预定序列进行比较，在一些情况下通过对合成的核酸的至少一部分进行测序，例如使用下一代测序方法。在一些涉及本文所述的任何基因文库的实施方案中，至少90％的预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/5000bp的错误率。在一些实施方案中，至少0.05％的预选合成基因无错误。在一些实施方案中，至少0.5％的预选合成基因无错误。在一些实施方案中，至少90％的预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/3000bp的错误率。在一些实施方案中，至少90％的预选合成基因无错误或基本上无错误。在一些实施方案中，预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/3000bp的缺失率。在一些实施方案中，预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/3000bp的插入率。在一些实施方案中，预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/3000bp的置换率。在一些实施方案中，如本文所述的基因文库进一步包含每一种合成基因的至少10个拷贝。在一些实施方案中，如本文所述的基因文库进一步包含每一种合成基因的至少100个拷贝。在一些实施方案中，如本文所述的基因文库进一步包含每一种合成基因的至少1000个拷贝。在一些实施方案中，如本文所述的基因文库进一步包含每一种合成基因的至少1000000个拷贝。在一些实施方案中，如本文所述的基因的集合包含至少500种基因。在一些实施方案中，所述集合包含至少5000种基因。在一些实施方案中，所述集合包含至少10000种基因。在一些实施方案中，预选合成基因为至少1kb。在一些实施方案中，预选合成基因为至少2kb。在一些实施方案中，预选合成基因为至少3kb。在一些实施方案中，预定序列相比于预选合成基因还包含小于20bp。在一些实施方案中，预定序列相比于预选合成基因还包含小于15bp。在一些实施方案中，合成基因中的至少一种与任何其他合成基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，合成基因中的每一种与任何其他合成基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，合成基因中的至少一种与任何其他合成基因至少10％不同。在一些实施方案中，合成基因中的每一种与任何其他合成基因至少10％不同。在一些实施方案中，合成基因中的至少一种与任何其他合成基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，合成基因中的每一种与任何其他合成基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，如本文所述的基因文库进一步包含小于2kb的合成基因，其相比于这些基因的预选序列有小于1/20000bp的错误率。在一些实施方案中，可传送基因的子集共价连接在一起。在一些实施方案中，基因的集合的第一子集编码具有一种或多种代谢终产物的第一代谢途径的组分。在一些实施方案中，如本文所述的基因文库进一步包含所述一种或多种代谢终产物的选择，从而构建基因的集合。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢终产物包括生物燃料。在一些实施方案中，基因的集合的第二子集编码具有一种或多种代谢终产物的第二代谢途径的组分。在一些实施方案中，基因文库在小于100m³的空间中。在一些实施方案中，基因文库在小于1m³的空间中。在一些实施方案中，基因文库在小于1m³的空间中。

在另一方面，本发明还提供了构建基因文库的方法。该方法包括以下步骤：在第一时间点之前在计算机可读非暂时性介质中输入至少第一基因列表和第二基因列表，其中所述基因为至少500bp并且当编译成联合列表(jointlist)时，该联合列表包含至少100种基因；在第二时间点之前合成所述联合列表中超过90％的基因，从而构建具有可传送(deliverable)基因的基因文库。在一些实施方案中，所述第二时间点与第一时间点相隔少于一个月。

在实施如本文提供的构建基因文库的任何方法中，如本文所述的方法进一步包括在第二时间点传送至少一种基因。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与所述基因文库中的任何其他基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与所述基因文库中的任何其他基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与所述基因文库中的任何其他基因至少10％不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与所述基因文库中的任何其他基因至少10％不同。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与所述基因文库中的任何其他基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与所述基因文库中的任何其他基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，至少90％的可传送基因无错误。在一些实施方案中，所述可传送基因包含小于1/3000的错误率，这导致生成偏离联合基因列表中的基因序列的序列。在一些实施方案中，至少90％的可传送基因包含小于1/3000bp的错误率，这导致生成偏离联合基因列表中的基因序列的序列。在一些实施方案中，可传送基因的子集中的基因共价连接在一起。在一些实施方案中，联合基因列表的第一子集编码具有一种或多种代谢终产物的第一代谢途径的组分。在一些实施方案中，如本文所述的构建基因文库的任何方法进一步包括选择所述一种或多种代谢终产物，从而构建第一、第二或联合基因列表。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢终产物包括生物燃料。在一些实施方案中，联合基因列表的第二子集编码具有一种或多种代谢终产物的第二代谢途径的组分。在一些实施方案中，联合基因列表包含至少500种基因。在一些实施方案中，联合基因列表包含至少5000种基因。在一些实施方案中，联合基因列表包含至少10000种基因。在一些实施方案中，所述基因可为至少1kb。在一些实施方案中，所述基因为至少2kb。在一些实施方案中，所述基因为至少3kb。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于25天。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于5天。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于2天。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置或系统结合。

在另一方面，本文提供了构建基因文库的方法。该方法包括以下步骤：在第一时间点在计算机可读非暂时性介质中输入基因列表；合成该基因列表中超过90％的基因，从而构建具有可传送基因的基因文库；以及在第二时间点传送可传送基因。在一些实施方案中，所述列表包含至少100种基因且所述基因可为至少500bp。在又一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于一个月。

在实施如本文提供的构建基因文库的任何方法中，在一些实施方案中，如本文所述的方法进一步包括在第二时间点传送至少一种基因。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与所述基因文库中的任何其他基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与所述基因文库中的任何其他基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与所述基因文库中的任何其他基因至少10％不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与所述基因文库中的任何其他基因至少10％不同。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与所述基因文库中的任何其他基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与所述基因文库中的任何其他基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，至少90％的可传送基因无错误。在一些实施方案中，所述可传送基因包含小于1/3000的错误率，这导致生成偏离基因列表中的基因序列的序列。在一些实施方案中，至少90％的可传送基因包含小于1/3000bp的错误率，这导致生成偏离基因列表中的基因序列的序列。在一些实施方案中，可传送基因的子集中的基因共价连接在一起。在一些实施方案中，基因列表的第一子集编码具有一种或多种代谢终产物的第一代谢途径的组分。在一些实施方案中，构建基因文库的方法进一步包括选择所述一种或多种代谢终产物，从而构建基因列表。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢终产物包括生物燃料。在一些实施方案中，基因列表的第二子集编码具有一种或多种代谢终产物的第二代谢途径的组分。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置或系统结合。

在实施如本文提供的构建基因文库的任何方法中，在一些实施方案中，基因列表包含至少500种基因。在一些实施方案中，所述列表包含至少5000种基因。在一些实施方案中，所述列表包含至少10000种基因。在一些实施方案中，所述基因为至少1kb。在一些实施方案中，所述基因为至少2kb。在一些实施方案中，所述基因为至少3kb。在一些实施方案中，如在构建基因文库的方法中所述的第二时间点与第一时间点相隔少于25天。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于5天。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于2天。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置或系统结合。

在另一方面，本发明还提供了在基底上合成n-聚体(n-mer)寡核苷酸的方法。该方法包括a)提供具有解析座位(resolvedloci)的基底，该解析座位用适合于核苷酸偶联的化学部分功能化；以及b)根据座位特异性预定序列使至少两个结构单元(buildingblock)与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少12个核苷酸的速率偶联，从而合成n个碱基对长的多个寡核苷酸。本文描述了涉及在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法的不同实施方案。

在如本文提供的在基底上合成n-聚体寡核苷酸的任何方法中，在一些实施方案中，该方法进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少15个核苷酸的速率偶联，在一些实施方案中，该方法进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少20个核苷酸的速率偶联。在一些实施方案中，该方法进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少25个核苷酸的速率偶联，在一些实施方案中，至少一个解析座位包含以小于1/500bp的错误率偏离座位特异性预定序列的n-聚体寡核苷酸。在一些实施方案中，至少一个解析座位包含以小于1/1000bp的错误率偏离座位特异性预定序列的n-聚体寡核苷酸。在一些实施方案中，至少一个解析座位包含以小于1/2000bp的错误率偏离座位特异性预定序列的n-聚体寡核苷酸。在一些实施方案中，基底上的所述多个寡核苷酸以小于1/500bp的错误率偏离各自的座位特异性预定序列。在一些实施方案中，基底上的所述多个寡核苷酸以小于1/1000bp的错误率偏离各自的座位特异性预定序列。在一些实施方案中，基底上的所述多个寡核苷酸以小于1/2000bp的错误率偏离各自的座位特异性预定序列。

在实施如本文提供的在基底上合成n-聚体寡核苷酸的任何方法中，在一些实施方案中，结构单元包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿苷基团或修饰的核苷酸。在一些实施方案中，结构单元包含修饰的核苷酸。在一些实施方案中，结构单元包含二核苷酸或三核苷酸。在一些实施方案中，结构单元包含亚磷酰胺。在一些实施方案中，n-聚体寡核苷酸的n至少为100。在一些实施方案中，n至少为200。在一些实施方案中，n至少为300。在一些实施方案中，n至少为400。在一些实施方案中，所述表面包含至少100,000个解析座位并且所述多个生长寡核苷酸中的至少两个可彼此不同。

在一些实施方案中，如本文所述在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法进一步包括在偶联之前真空干燥该基底。在一些实施方案中，结构单元包含封闭基团。在一些实施方案中，该封闭基团包含酸不稳定的DMT。在一些实施方案中，该酸不稳定的DMT包含4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些实施方案中，如本文所述在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法进一步包括氧化或硫化。在一些实施方案中，如本文所述在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法进一步包括对未偶联的寡核苷酸链进行化学加帽。在一些实施方案中，如本文所述在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法进一步包括去除封闭基团，从而解除对生长寡核苷酸链的封闭。在一些实施方案中，偶联步骤过程中基底的位置在真空干燥步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，偶联步骤过程中基底的位置在氧化步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，偶联步骤过程中基底的位置在加帽步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，偶联步骤过程中基底的位置在解除封闭步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，基底包含提供基底的第一表面与基底的第二表面之间流体连通的至少10,000个通孔(vias)。在一些实施方案中，基底包含提供基底的第一表面与基底的第二表面之间流体连通的至少100,000个通孔。在一些实施方案中，基底包含提供基底的第一表面与基底的第二表面之间流体连通的至少1,000,000个通孔。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置或系统结合。

在本发明的另一方面，本文提供了用于进行一组平行反应的系统。该系统包括：具有多个解析座位的第一表面；具有多个解析反应器帽的加帽元件。在一些实施方案中，该系统使所述多个解析反应器帽与第一表面上的所述多个解析座位对准，以在第一表面与加帽元件之间形成暂时的密封，从而将第一表面上的座位物理地分成至少两个座位的组，分至与每一个反应器帽相关联的反应器内。在一些实施方案中，每一个反应器容纳第一组试剂。

在一些涉及如本文所述进行一组平行反应的任何系统的实施方案中，从第一表面释放时，反应器帽保留第一组试剂的至少一部分。在一些实施方案中，该部分为约30％。在一些实施方案中，该部分为约90％。在一些实施方案中，所述多个解析座位位于被制作于支持表面内的微结构上。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度为每mm²至少1个。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度为每mm²至少10个。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度为每mm²至少100个。在一些实施方案中，所述微结构包含至少两个彼此流体连通的通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同宽度的两个通道。在一些实施方案中，至少两个通道包含具有不同长度的两个通道。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个长于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个短于1000μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径窄于100μm。在一些实施方案中，所述系统进一步包含具有密度为每mm²至少0.1个的多个解析座位的第二表面。在一些实施方案中，所述系统进一步包含具有密度为每mm²至少1个的多个解析座位的第二表面。在一些实施方案中，所述系统进一步包含具有密度为每mm²至少10个的多个解析座位的第二表面。

在一些涉及如本文所述进行一组平行反应的任何系统的实施方案中，第一表面的解析座位包含试剂的涂层。在一些实施方案中，第二表面的解析座位包含试剂的涂层。在一些实施方案中，试剂的涂层与第一或第二表面共价连接。在一些实施方案中，试剂的涂层包含寡核苷酸。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1.45μm²的表面积。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1.25μm²的表面积。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1μm²的表面积。在一些实施方案中，所述多个解析座位中的解析座位包含密度为至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长。在一些实施方案中，所述多个解析座位中的解析座位包含密度为至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长。在一些实施方案中，第一表面的所述多个解析座位中的解析座位包含高能表面。在一些实施方案中，第一和第二表面包含就给定液体而言不同的表面张力。在一些实施方案中，高表面能对应于小于20度的水接触角。在一些实施方案中，所述多个解析座位位于固体基底上，该固体基底包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，加帽元件包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置或系统结合。

在又一方面，本发明还提供了包围体(enclosures)的阵列。该包围体阵列包含：多个解析反应器，其包含第一基底和含有反应器帽的第二基底；每一个反应器中的至少2个解析座位。在一些情况下，解析反应器用可释放的密封隔开。在一些情况下，从第一基底上释放第二基底时，该反应器帽保留该反应器的内容物的至少一部分。在一些实施方案中，第二基底上的反应器帽具有每mm²至少0.1个的密度。在一些实施方案中，第二基底上的反应器帽具有每mm²至少1个的密度。在一些实施方案中，第二基底上的反应器帽具有每mm²至少10个的密度。

在一些涉及如本文提供的包围体阵列的实施方案中，反应器帽保留反应器的内容物的至少30％。在一些实施方案中，反应器帽保留反应器的内容物的至少90％。在一些实施方案中，解析座位的密度为至少2个/mm²。在一些实施方案中，解析座位的密度为至少100个/mm²。在一些实施方案中，包围体阵列进一步包含在每一个反应器中的至少5个解析座位。在一些实施方案中，如本文所述的包围体阵列进一步包含在每一个反应器中的至少20个解析座位。在一些实施方案中，如本文所述的包围体阵列进一步包含在每一个反应器中的至少50个解析座位。在一些实施方案中，如本文所述的包围体阵列进一步包含在每一个反应器中的至少100个解析座位。

在一些涉及如本文所述的包围体阵列的实施方案中，解析座位位于被制作于支持表面内的微结构上。在一些实施方案中，所述微结构包含至少两个彼此流体连通的通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同宽度的两个通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同长度的两个通道。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个长于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个短于1000μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径窄于100μm。在一些实施方案中，所述微结构包含具有至少0.01μm/μm²的密度的至少两个通道的周长的标称弧长。在一些实施方案中，所述微结构包含具有至少0.001μm/μm²的密度的至少两个通道的周长的标称弧长。在一些实施方案中，解析反应器用可释放的密封隔开。在一些实施方案中，该密封包括毛细管被动阀(capillaryburstvalve)。

在一些涉及如本文所述的包围体阵列的实施方案中，第一基底的所述多个解析座位包含试剂的涂层。在一些实施方案中，第二基底的所述多个解析座位包含试剂的涂层。在一些实施方案中，试剂的涂层与第一或第二表面共价连接。在一些实施方案中，试剂的涂层包含寡核苷酸。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1μm²的表面积。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1.25μm²的表面积。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1.45μm²的表面积。在一些实施方案中，第一基底的所述多个解析座位包含高能表面。在一些实施方案中，第一和第二基底包含就给定液体而言不同的表面张力。在一些实施方案中，表面能对应于小于20度的水接触角。在一些实施方案中，所述多个解析座位或反应器帽位于固体基底上，该固体基底包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列或系统结合。

在又一方面，本发明还提供了进行一组平行反应的方法。该方法包括：(a)提供具有多个解析座位的第一表面；(b)提供具有多个解析反应器帽的加帽元件；(c)使所述多个解析反应器帽与第一表面上的所述多个解析座位对准，以在第一表面与加帽元件之间形成暂时的密封，从而将第一表面上的座位物理地分成至少两个座位的组；(d)进行第一反应，从而形成第一组试剂；以及(e)从第一表面上释放加帽元件，其中每一个反应器帽保留第一反应容积中的第一组试剂的至少一部分。在一些实施方案中，该部分为约30％。在一些实施方案中，该部分为约90％。

在一些实施方案中，如本文所述进行一组平行反应的方法进一步包括以下步骤：(f)提供具有多个解析座位的第二表面；(g)使所述多个解析反应器帽与第二表面上的所述多个解析座位对准，以在第二表面与加帽元件之间形成暂时的密封，从而物理地划分第二表面上的座位；(h)使用第一组试剂的一部分进行第二反应，从而形成第二组试剂；以及(i)从第二表面上释放加帽元件，其中每一个反应器帽可保留第二反应容积中的第二组试剂的至少一部分。在一些实施方案中，该部分为约30％。在一些实施方案中，该部分为约90％。

在实施如本文所述进行一组平行反应的任何方法中，所述多个解析座位可具有在第一表面上每mm²至少1个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析座位具有在第一表面上每mm²至少10个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析座位具有在第一表面上每mm²至少100个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析反应器帽具有在加帽元件上每mm²至少0.1个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析反应器帽具有在加帽元件上每mm²至少1个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析反应器帽具有在加帽元件上每mm²至少10个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析座位具有在第二表面上每mm²多于0.1个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析座位具有在第二表面上每mm²多于1个的密度。在一些实施方案中，所述多个解析座位具有在第二表面上每mm²多于10个的密度。

在实施如本文所述进行一组平行反应的任何方法中，加帽元件从表面上释放的步骤，诸如在如本文所述的(e)和(i)中的释放步骤，可以以不同的速度进行。在一些实施方案中，第一表面的解析座位包含用于第一反应的试剂的涂层。在一些实施方案中，第二表面的解析座位包含用于第二反应的试剂的涂层。在一些实施方案中，试剂的涂层与第一或第二表面共价连接。在一些实施方案中，试剂的涂层包含寡核苷酸。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1μm²的表面积。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1.25μm²的表面积。在一些实施方案中，试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1.45μm²的表面积。在一些实施方案中，所述寡核苷酸为至少25kb。在一些实施方案中，所述寡核苷酸为至少200kb。在一些实施方案中，所述寡核苷酸为至少300kb。在一些实施方案中，第一表面的解析座位包含高能表面。在一些实施方案中，第一和第二表面包含就给定液体而言不同的表面张力。在一些实施方案中，表面能对应于小于20度的水接触角。

在一些涉及如本文所述进行一组平行反应的方法的实施方案中，所述多个解析座位或所述解析反应器帽位于固体基底上，该固体基底包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，第一和第二反应容积是不同的。在一些实施方案中，第一或第二反应包括聚合酶循环组装。在一些实施方案中，第一或第二反应包括酶促基因合成、退火和连接反应、两个基因经由杂合基因的同时合成、鸟枪法连接和共连接、插入基因合成、经由DNA的一条链的基因合成、模板指导的连接、连接酶链反应、微阵列介导的基因合成、固相组装、Sloning结构单元技术或RNA连接介导的基因合成。在一些实施方案中，如本文所述进行一组平行反应的方法进一步包括冷却加帽元件。在一些实施方案中，如本文所述进行一组平行反应的方法进一步包括冷却第一表面。在一些实施方案中，如本文所述进行一组平行反应的方法进一步包括冷却第二表面。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列或系统结合。

在另一方面，本发明提供了具有功能化表面的基底。具有功能化表面的基底可包含具有多个解析座位的固体支持物。在一些实施方案中，解析座位用提高固体支持物的表面能的部分进行功能化。在一些实施方案中，解析座位定位于微通道上。

在一些涉及如本文所述具有功能化表面的基底的实施方案中，所述部分是化学惰性部分。在一些实施方案中，微通道包含小于1nl的容积。在一些实施方案中，微通道包含0.036μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，功能化表面包含每1.0μm²的基底平面表面积至少1μm²的标称表面积。在一些实施方案中，功能化表面包含每1.0μm²的基底平面表面积至少1.25μm²的标称表面积。在一些实施方案中，功能化表面包含每1.0μm²的基底平面表面积至少1.45μm²的标称表面积。在一些实施方案中，所述多个解析座位中的解析座位包含试剂的涂层。在一些实施方案中，试剂的涂层与基底共价连接。在一些实施方案中，试剂的涂层包含寡核苷酸。在一些实施方案中，所述微通道中的至少一个长于100μm。在一些实施方案中，所述微通道中的至少一个短于1000μm。在一些实施方案中，所述微通道中的至少一个的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述微通道中的至少一个的直径窄于100μm。在一些实施方案中，表面能对应于小于20度的水接触角。在一些实施方案中，固体支持物包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度为至少1个/mm²。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度为至少100个/mm²。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在另一方面，本发明还提供了在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法。该方法包括：(a)通过至少一个喷墨泵向多个座位的第一座位施加至少一滴第一试剂；(b)向基底施加负压；以及(c)通过至少一个喷墨泵向第一座位施加至少一滴第二试剂。

在实施如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的任何方法中，第一和第二试剂可以是不同的。在一些实施方案中，第一座位用提高其表面能的部分进行功能化。在一些实施方案中，所述部分是化学惰性部分。在一些实施方案中，所述多个座位位于被制作于基底表面内的微结构上。在一些实施方案中，所述微结构包含至少两个彼此流体连通的通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同宽度的两个通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同长度的两个通道。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个长于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个短于1000μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径窄于100μm。在一些实施方案中，基底表面包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。

在一些涉及如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法的实施方案中，第一和/或第二试剂的滴的体积为至少2pl。在一些实施方案中，滴的体积为约40pl。在一些实施方案中，滴的体积为至多100pl。在一些实施方案中，微通道包含至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，微通道包含至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，功能化表面包含每1.0μm²的基底平面表面积至少1μm²的标称表面积。在一些实施方案中，功能化表面包含每1.0μm²的基底平面表面积至少1.25μm²的标称表面积。在一些实施方案中，功能化表面包含每1.0μm²的基底平面表面积至少1.45μm²的标称表面积。在一些实施方案中，基底周围的压力降至小于1毫托。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括使源于第一滴的至少一个第一结构单元与第一座位上的生长寡核苷酸链偶联。在一些实施方案中，该结构单元包含封闭基团。在一些实施方案中，该封闭基团包含酸不稳定的DMT。在一些实施方案中，该酸不稳定的DMT包含4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括氧化或硫化。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括对未偶联的寡核苷酸链进行化学加帽。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括去除封闭基团，从而解除对生长寡核苷酸链的封闭。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在偶联步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在氧化步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在加帽步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在解除封闭步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，第一座位位于被制作于基底表面内的微结构上。在一些实施方案中，用于氧化步骤的至少一种试剂通过用包含所述至少一种试剂的溶液充溢(flooding)微结构来提供。在一些实施方案中，用于加帽步骤的至少一种试剂通过用包含所述至少一种试剂的溶液充溢微结构来提供。在一些实施方案中，第一座位位于被制作于基底表面内的微结构上，并且用于解除封闭步骤的至少一种试剂可通过用包含所述至少一种试剂的溶液充溢微结构来提供。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括将基底包围在密封的区室内。在一些实施方案中，密封的区室允许从第一座位中清除液体。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括通过与第一座位可操作地连接的排水管排出液体。在一些实施方案中，向基底施加负压后，基底的含水量小于1ppm。在一些实施方案中，表面能提高以对应于小于20度的水接触角。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在又一方面，本发明提供了使试剂沉积至多个解析座位的方法。该方法包括通过喷墨泵向所述多个座位的第一座位施加至少一滴第一试剂；通过喷墨泵向解除多个解析座位的第二座位施加至少一滴第二试剂。在一些实施方案中，第二座位与第一座位邻近。在又一些实施方案中，第一和第二试剂是不同的。在又一些实施方案中，第一和第二座位位于被制作于支持表面内的微结构上。在又一些实施方案中，所述微结构包含深度大于100μm的至少一个通道。

在实施如本文所述使试剂沉积至多个解析座位的任何方法中，在一些实施方案中，微结构包含彼此流体连通的至少两个通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同宽度的两个通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同长度的两个通道。在一些实施方案中，第一座位接收少于0.1％的第二试剂，而第二座位接收少于0.1％的第一试剂。在一些实施方案中，所述座位包含至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，所述座位包含至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，第一和第二座位包含试剂的涂层。在一些实施方案中，试剂的涂层与基底共价连接。在一些实施方案中，试剂的涂层包含寡核苷酸。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个长于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个短于1000μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径窄于100μm。在一些实施方案中，支持表面包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度为至少1个/mm²。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度为至少100个/mm²。在一些实施方案中，滴的体积为至少2pl。在一些实施方案中，滴的体积为约40pl。在一些实施方案中，滴的体积为至多100pl。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在又一方面，本发明提供了一种微流体系统。该微流体系统包含具有密度为每mm²至少10个的多个微孔的第一表面；和在所述多个微孔中的一个的内部的小滴。在一些实施方案中，在所述多个微孔中的一个的内部的小滴具有约1-1000范围内的雷诺数。在一些实施方案中，所述多个微孔的密度为每mm²至少1个。在一些实施方案中，所述多个微孔的密度为每mm²至少10个。

在一些涉及如本文所述的微流体系统的实施方案中，该微流体系统进一步包括喷墨泵。在一些实施方案中，小滴通过喷墨泵进行沉积。在一些实施方案中，小滴在第一微孔尺寸的下半部分中移动。在一些实施方案中，小滴在第一微孔尺寸的中间三分之一部分中移动。在一些实施方案中，所述多个微孔的密度为每mm²至少100个。在一些实施方案中，第一微孔尺寸大于小滴。在一些实施方案中，微孔长于100μm。在一些实施方案中，微孔短于1000μm。在一些实施方案中，微孔的直径宽于50μm。在一些实施方案中，微孔的直径窄于100μm。在一些实施方案中，小滴的体积为至少2pl。在一些实施方案中，小滴的体积为约40pl。在一些实施方案中，小滴的体积为至多100pl。在一些实施方案中，所述多个微孔中的每一个与至少一个微通道流体连接。在一些实施方案中，所述至少一个微通道用提高表面能的部分涂覆。在一些实施方案中，所述部分是化学惰性部分。在一些实施方案中，表面能对应于小于20度的水接触角。在一些实施方案中，微孔在固体支持物上形成，该固体支持物包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，微通道包含至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，微通道包含0.001μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.25μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.45μm²的标称表面积。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。在一些实施方案中，小滴包含能够合成寡核苷酸的试剂。在一些实施方案中，该试剂是核苷酸或核苷酸类似物。

在另一方面，本发明提供了使小滴沉积至多个微孔的方法。该方法包括通过喷墨泵向所述多个微孔的第一微孔施加至少一个小滴。在一些情况下，在所述多个微孔中的一个的内部的小滴具有约1-1000范围内的雷诺数。在一些实施方案中，所述多个微孔具有至少1个/mm²的密度。在又一些情况下，所述多个微孔具有至少10个/mm²的密度。

在实施如本文提供的使小滴沉积至多个微孔的任何方法中，所述多个微孔可具有至少100个/mm²的密度。在一些实施方案中，所述微孔长于100μm。在一些实施方案中，所述微孔短于1000μm。在一些实施方案中，所述微孔的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述微孔的直径窄于100μm。在一些实施方案中，小滴以至少2m/sec的速度施加。在一些实施方案中，小滴的体积为至少2pl。在一些实施方案中，小滴的体积为约40pl。在一些实施方案中，小滴的体积为至多100pl。在一些实施方案中，所述多个微孔中的每一个与至少一个微通道流体连接。在一些实施方案中，所述至少一个微孔用提高表面能的部分涂覆。在一些实施方案中，所述部分是化学惰性部分。在一些实施方案中，表面能对应于小于20度的水接触角。在一些实施方案中，微孔在固体支持物上形成，该固体支持物包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，微通道包含至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，微通道包含至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.25μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.45μm²的标称表面积。在一些实施方案中，微孔内部的小滴在微孔的中间三分之一部分中移行。在一些实施方案中，微孔内部的小滴在微孔的下半部分中移行。在一些实施方案中，小滴包含能够合成寡核苷酸的试剂。在一些实施方案中，该试剂是核苷酸或核苷酸类似物。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在另一方面，本发明还提供了一种划分方法。该划分方法包括使在第一多个解析座位处包含液体的第一表面与包含第二多个解析座位的第二表面接触；确定释放的速度，使得所需部分(fraction)的该液体可从第一多个解析座位转移到第二多个解析座位；以及使第二表面以所述速度从第一表面上脱离。在一些实施方案中，第一表面包含就所述液体而言的第一表面张力，而第二表面可包含就所述液体而言的第二表面张力。

在实施如本文提供的任何划分方法中，第一表面的一部分可用增加表面张力的部分涂覆。在一些实施方案中，所述部分是化学惰性部分。在一些实施方案中，第一表面的表面张力对应于小于20度的水接触角。在一些实施方案中，第二表面的表面张力对应于大于90度的水接触角。在一些实施方案中，第一表面包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，所述多个解析座位包含至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，所述多个解析座位包含至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.25μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.45μm²的标称表面积。在一些实施方案中，第一多个解析座位的密度为至少1个/mm²。在一些实施方案中，第一多个解析座位的密度为至少100个/mm²。在一些实施方案中，第一或第二表面包含容纳液体的至少一部分的微通道。在一些实施方案中，第一或第二表面包含容纳液体的至少一部分的纳米反应器。在一些实施方案中，如本文所述的划分方法进一步包括使第三表面与第三多个解析座位接触。在一些实施方案中，所述液体包含核酸。在一些实施方案中，所需的部分超过30％。在一些实施方案中，所需的部分超过90％。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在又一方面，本发明还提供了如本文所述的混合方法。该方法包括：(a)提供包含在其上制作的多个微结构的第一基底；(b)提供包含多个解析反应器帽的第二基底；(c)使第一和第二基底对准，使得所述多个解析反应器帽中的第一反应器帽可被配置为接收来自第一基底中的n个微结构的液体；以及(d)将来自所述n个微结构的液体传送至第一反应器帽，从而混合来自所述n个微结构的液体以形成混合物。

在实施如本文所述的任何混合方法中，所述多个解析反应器帽的密度可为至少0.1个/mm²。在一些实施方案中，所述多个解析反应器帽的密度为至少1个/mm²。在一些实施方案中，所述多个解析反应器帽的密度为至少10个/mm²。在一些实施方案中，所述多个微结构中的每一个均可包含至少两个不同宽度的通道。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个长于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个短于1000μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径窄于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个用提高表面能的部分涂覆。在一些实施方案中，所述部分是化学惰性部分。在一些实施方案中，微结构在固体支持物上形成，该固体支持物包含选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、PDMS和玻璃的材料。在一些实施方案中，微通道包含至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，微通道包含至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长的密度。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.25μm²的标称表面积。在一些实施方案中，用所述部分涂覆的表面包含每1.0μm²的第一表面的平面表面积至少1.45μm²的标称表面积。在一些实施方案中，所述多个微结构包含试剂的涂层。在一些实施方案中，试剂的涂层与第一表面共价连接。在一些实施方案中，试剂的涂层包含寡核苷酸。在一些实施方案中，微结构的密度为至少1个/mm²。在一些实施方案中，微结构的密度为至少100个/mm²。

在一些涉及如本文所述的混合方法的实施方案中，在步骤(c)使第一和第二基底对准以使得所述多个反应器帽中的第一反应器帽可被配置为接收来自第一基底中n个微结构的液体之后，在第一与第二基底之间具有小于100μm的间隙。在一些实施方案中，在步骤(c)之后，在第一与第二基底之间具有小于50μm的间隙。在一些实施方案中，在步骤(c)之后，在第一与第二基底之间具有小于20μm的间隙。在一些实施方案中，在步骤(c)之后，在第一与第二基底之间具有小于10μm的间隙。在一些实施方案中，混合物部分地扩散至该间隙内。在一些实施方案中，该混合方法进一步包括通过使第一和第二基底靠得更近而密封所述间隙。在一些实施方案中，两个通道之一用提高对应于小于20度的水接触角的表面能的部分涂覆。在一些实施方案中，所述部分是化学惰性部分。在一些实施方案中，通过压力进行传送。在一些实施方案中，混合物的体积大于反应器帽的容积。在一些实施方案中，所述液体包含核酸。在一些实施方案中，n至少为10。在一些实施方案中，n至少为25。在一些实施方案中，微结构(来自它的液体混合以形成混合物)的数目n可至少为50。在一些实施方案中，n至少为75。在一些实施方案中，n至少为100。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在又一方面，本发明还提供了如本文所述在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法。该方法包括：提供具有解析座位的基底，该解析座位用适合于核苷酸偶联的化学部分进行功能化；以及在至少两个结构单元的偶联之间未转运基底的情况下，根据座位特异性预定序列使所述至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链偶联，从而合成n个碱基对长的多个寡核苷酸。

在实施如本文所述的在基底上合成n-聚体寡核苷酸的任何方法中，该方法可进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少12个核苷酸的速率偶联。在一些实施方案中，该方法进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少15个核苷酸的速率偶联。在一些实施方案中，该方法进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少20个核苷酸的速率偶联。在一些实施方案中，该方法进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少25个核苷酸的速率偶联。在一些实施方案中，至少一个解析座位包含以小于1/500bp的错误率偏离座位特异性预定序列的n-聚体寡核苷酸。在一些实施方案中，至少一个解析座位包含以小于1/1000bp的错误率偏离座位特异性预定序列的n-聚体寡核苷酸。在一些实施方案中，至少一个解析座位包含以小于1/2000bp的错误率偏离座位特异性预定序列的n-聚体寡核苷酸。在一些实施方案中，基底上的所述多个寡核苷酸以小于1/500bp的错误率偏离各自的座位特异性预定序列。在一些实施方案中，基底上的所述多个寡核苷酸以小于1/1000bp的错误率偏离各自的座位特异性预定序列。在一些实施方案中，基底上的所述多个寡核苷酸以小于1/2000bp的错误率偏离各自的座位特异性预定序列。

在一些涉及如本文所述的在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法的实施方案中，所述结构单元包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿苷基团或修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述结构单元包含修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述结构单元包含二核苷酸。在一些实施方案中，所述结构单元包含亚磷酰胺。在一些实施方案中，n至少为100。在一些实施方案中，其中n至少为200。在一些实施方案中，n至少为300。在一些实施方案中，n至少为400。在一些实施方案中，基底包含至少100,000个解析座位并且所述多个生长寡核苷酸中的至少两个彼此不同。在一些实施方案中，该方法进一步包括在偶联之前真空干燥所述基底。在一些实施方案中，所述结构单元包含封闭基团。在一些实施方案中，该封闭基团包含酸不稳定的DMT。在一些实施方案中，该酸不稳定的DMT包含4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些实施方案中，该方法进一步包括氧化或硫化。在一些实施方案中，该方法进一步包括对未偶联的寡核苷酸链进行化学加帽。在一些实施方案中，该方法进一步包括去除封闭基团，从而解除对生长寡核苷酸链的封闭。在一些实施方案中，基底包含提供基底的第一表面与基底的第二表面之间流体连通的至少10,000个通孔。在一些实施方案中，基底包含提供基底的第一表面与基底的第二表面之间流体连通的至少100,000个通孔。在一些实施方案中，基底包含提供基底的第一表面与基底的第二表面之间流体连通的至少1,000,000个通孔。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在又一方面，本发明还提供了如本文所述的构建基因文库的方法。该方法包括：在第一时间点在计算机可读非暂时性介质中输入基因列表，其中所述列表包含至少100种基因且其中所述基因为至少500bp；合成所述基因列表中超过90％的基因，从而构建具有可传送基因的基因文库；制备代表该基因文库的测序文库；获得序列信息；基于该序列信息选择可传送基因的至少一个子集；以及在第二时间点传送所选的可传送基因，其中第二时间点与第一时间点相隔少于一个月。

在实施如本文所述的构建基因文库的任何方法中，序列信息可通过下一代测序获得。序列信息可通过Sanger测序获得。在一些实施方案中，该方法进一步包括在第二时间点传送至少一种基因。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与基因文库中的任何其他基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与基因文库中的任何其他基因至少0.1％不同。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与基因文库中的任何其他基因至少10％不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与基因文库中的任何其他基因至少10％不同。在一些实施方案中，所述基因中的至少一种与基因文库中的任何其他基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，所述基因中的每一种与基因文库中的任何其他基因至少有2个碱基对不同。在一些实施方案中，至少90％的可传送基因无错误。在一些实施方案中，可传送基因包含小于1/3000的错误率，这导致生成偏离基因列表中的基因序列的序列。在一些实施方案中，至少90％的可传送基因包含小于1/3000bp的错误率，这导致生成偏离基因列表中的基因序列的序列。在一些实施方案中，可传送基因的子集共价连接在一起。在一些实施方案中，基因列表的第一子集编码具有一种或多种代谢终产物的第一代谢途径的组分。在一些实施方案中，该方法进一步包括一种或多种代谢终产物的选择，从而构建基因列表。在一些实施方案中，所述一种或多种代谢终产物包括生物燃料。在一些实施方案中，基因列表的第二子集编码具有一种或多种代谢终产物的第二代谢途径的组分。在一些实施方案中，该列表包含至少500种基因。在一些实施方案中，该列表包含至少5000种基因。在一些实施方案中，该列表包含至少10000种基因。在一些实施方案中，该基因为至少1kb。在一些实施方案中，该基因为至少2kb。在一些实施方案中，该基因为至少3kb。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于25天。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于5天。在一些实施方案中，第二时间点与第一时间点相隔少于2天。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

本文在一些实施方案中提供了用于核酸合成的微流体装置，该微流体装置包含基本上为平面的基底部分，该基底部分在相对的表面之间包含n个分组的m个微流体连接，其中n*m个微流体连接中的每一个包含第一通道和第二通道，并且其中所述n个分组中的每个分组内的第一通道为所有m个微流体连接所共用，其中所述多个微流体连接沿着基底的最小维度跨越所述基本上为平面的基底部分，并且其中n和m至少为2。在一些实施方案中，用能够促进寡核苷酸附着至装置的涂层对第二通道进行功能化。在一些实施方案中，该装置还包含第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸附着至所述n个分组中的k个分组内的第二通道。在一些实施方案中，k为1。在一些实施方案中，该装置还包含第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸附着至所述n个分组中的l个分组。在一些实施方案中，l为1。在一些实施方案中，所述l个分组中的所有分组都不在所述k个分组中。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸至少为10个核苷酸、25个核苷酸、50个核苷酸、75个核苷酸、100个核苷酸、125个核苷酸、150个核苷酸或200个核苷酸长。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸相差至少2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸或10个核苷酸。

在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接至多为5mm、1.5mm、1.0mm或0.5mm长。在一些实施方案中，所述n个分组中的每一个内的第一通道至多为5mm、1.5mm、1.0mm或0.5mm长。在一些实施方案中，所述n个分组中的每一个内的第一通道至少为0.05mm、0.75mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm或0.4mm长。在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道至多为0.2mm、0.1mm、0.05mm、0.04mm、或0.03mm长。在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道至少为0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.02mm或0.03mm长。在一些实施方案中，所述n个分组中的每一个内的第一通道的横截面至少为0.01mm、0.025mm、0.05mm或0.075mm。在一些实施方案中，所述n个分组中的每一个内的第一通道的横截面至多为1mm、0.5mm、0.25mm、0.1mm或0.075mm。在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道的横截面至少为0.001mm、0.05mm、0.01mm、0.015mm或0.02mm。在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道的横截面至多为0.25mm、0.125mm、0.050mm、0.025mm、0.02mm。在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接中的每一个内的第二通道的横截面标准偏差小于横截面平均值的25％、20％、15％、10％、5％或1％。在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接的至少90％的第二通道内的横截面变化至多为25％、20％、15％、10％、5％或1％。

在一些实施方案中，n至少为10、25、50、100、1000或10000。在一些实施方案中，m至少为3、4或5。

在一些实施方案中，该基底包含至少5％、10％、25％、50％、80％、90％、95％或99％的硅。

在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接的至少90％的第二通道用提高表面能的部分来功能化。在一些实施方案中，表面能提高到与小于75、50、30或20度的水接触角相对应的水平。

在一些实施方案中，所述n*m个微流体连接的至少90％的第二通道的宽深比(aspectratio)小于1、0.5或0.3。在一些实施方案中，所述n个分组中的至少90％的第一通道的宽深比小于0.5、0.3或0.2。

在一些实施方案中，至少10％、25％、50％、75％、90％或95％的所述n*m个微流体连接的总长度处于基本上为平面的基底的最小维度的10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、500％或1000％以内。

在一些实施方案中，该装置的基本上为平面的部分由SOI晶片制成。

在另一方面，本发明涉及一种核酸扩增方法，其包括：(a)提供包含n个环化单链核酸的样品，所述n个环化单链核酸各自包含不同的靶序列；(b)提供可与所述n个环化单链核酸中的m个上的至少一个衔接子杂交序列杂交的第一衔接子；(c)提供适合于使用所述m个环化单链核酸作为模板延伸第一衔接子的条件，从而生成m个单链扩增子核酸，其中所述m个单链扩增子核酸中的每一个均包含来自其模板的靶序列的多个复制物(replicas)；(d)提供可与第一衔接子杂交的第一辅助寡核苷酸；以及(e)在适合于第一作用物(agent)在多个切割位点处切割所述m个单链扩增子核酸的条件下提供第一作用物，从而生成所述m个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。在一些实施方案中，n或m至少为2。在一些实施方案中，n或m至少为3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、300、400或500。在一些实施方案中，m小于n。在一些实施方案中，包含所述n个环化单链核酸的样品通过以下步骤形成：提供各自包含不同靶序列中的一个的至少n个线性单链核酸，并使所述n个线性单链核酸环化，从而生成所述n个环化单链核酸。在一些实施方案中，所述第一衔接子可与所述n个线性单链核酸的两端同时杂交。在一些实施方案中，所述n个线性单链核酸中的不同靶序列的侧翼为第一和第二衔接子杂交序列。在一些实施方案中，所述至少n个线性单链核酸通过从头寡核苷酸合成而生成。在一些实施方案中，所述n个线性单链核酸中的每一个中的第一衔接子杂交序列相差不超过两个核苷酸碱基。在一些实施方案中，第一或第二衔接子杂交序列为至少5个核苷酸长。在一些实施方案中，第一或第二衔接子杂交序列为至多75、50、45、40、35、30或25个核苷酸长。在一些实施方案中，当第一衔接子与所述线性单链核酸的两端同时杂交时，所述n个线性单链核酸的末端与第一衔接子上的相邻碱基配对。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置使得所述衔接子杂交序列从m个环化单链核酸复制物的至少5％的剩余序列部分上断裂下来。在一些实施方案中，除了至少一个衔接子杂交序列外，所述m个环化单链核酸复制物的至少5％的序列保持未切割。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置在所述至少一个衔接子杂交序列的外部。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置不依赖于所述靶序列。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置由第一衔接子或第一辅助寡核苷酸的序列内的至少一个序列元件来决定。在一些实施方案中，所述序列元件包含限制性内切核酸酶的识别位点。在一些实施方案中，所述第一辅助寡核苷酸或第一衔接子寡核苷酸包含IIS型限制性内切核酸酶的识别位点。在一些实施方案中，识别位点远离切割位点至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，所述多个切割位点在单链和双链核酸的连接处。在一些实施方案中，所述双链核酸包含第一衔接子和第一辅助寡核苷酸。在一些实施方案中，所述单链核酸基本由m个不同的靶序列组成。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多95％的逐对相似性。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多90％的逐对相似性。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多80％的逐对相似性。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多50％的逐对相似性。在一些实施方案中，生成m个单链扩增子核酸包括链置换扩增。在一些实施方案中，所述第一辅助寡核苷酸包含亲和标记物。在一些实施方案中，所述亲和标记物包括生物素或生物素衍生物。在一些实施方案中，该方法进一步包括从所述样品中分离双链核酸。在一些实施方案中，所述分离包括亲和纯化、层析或凝胶纯化。在一些实施方案中，所述第一作用物包括限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括至少两种限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括IIS型限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括切口内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括至少两种切口内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括至少一种选自下组的酶：MlyI、SchI、AlwI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、FokI、HgaI、PleI、SfaNI、BfuAI、BsaI、BspMI、BtgZI、EarI、BspQI、SapI、SgeI、BceFI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、FaqI、AceIII、BbvII、BveI、LguI、BfuCI、DpnII、FatI、MboI、MluCI、Sau3AI、Tsp509I、BssKI、PspGI、StyD4I、Tsp45I、AoxI、BscFI、Bsp143I、BssMI、BseENII、BstMBI、Kzo9I、NedII、Sse9I、TasI、TspEI、AjnI、BstSCI、EcoRII、MaeIII、NmuCI、Psp6I、MnlI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HphI、HpyAV、MboII、AcuI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsmI、BsrDI、BtsI、EciI、MmeI、NmeAIII、Hin4II、TscAI、Bce83I、BmuI、BsbI、BscCI、NlaIII、Hpy99I、TspRI、FaeI、Hin1II、Hsp92II、SetI、TaiI、TscI、TscAI、TseFI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、AspCNI、BscGI、BspNCI、EcoHI、FinI、TsuI、UbaF11I、UnbI、Vpak11AI、BspGI、DrdII、Pfl1108I、UbaPI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI和Nt.BspQI及其变体。在一些实施方案中，与所列出的任何第一作用物和变体相比，第一作用物包含基本相同的功能，识别相同或基本相同的识别序列，或在相同或基本相同的切割位点处进行切割。在一些实施方案中，所述至少两种限制性内切核酸酶包括MlyI和BciVI，或BfuCI和MlyI。在一些实施方案中，该方法进一步包括(a)将所述样品划分为多个部分；(b)提供至少一个具有第二衔接子的部分，所述第二衔接子可与n个不同环化单链核酸中的k个上的至少一个衔接子杂交序列杂交；(c)提供适合于使用所述k个环化单链核酸作为模板延伸第二衔接子的条件，从而生成k个单链扩增子核酸，其中第二单链扩增子核酸包含来自其模板的靶序列的多个复制物；(d)提供可与第二衔接子杂交的第二辅助寡核苷酸；以及(e)在适合于所述作用物在第二多个切割位点处切割所述k个单链扩增子核酸的条件下提供第二作用物，从而生成所述k个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。在一些实施方案中，所述第一和第二衔接子是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二辅助寡核苷酸是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二作用物是相同的。在一些实施方案中，k+m小于n。在一些实施方案中，k至少为2。在一些实施方案中，包含n个环化单链核酸的样品通过单链核酸扩增形成。在一些实施方案中，所述单链核酸扩增包括：(a)提供包含至少m个环化单链前体核酸的样品；(b)提供可与所述m个环化单链前体核酸杂交的第一前体衔接子；(c)提供适合于使用所述m个环化单链前体核酸作为模板延伸第一前体衔接子的条件，从而生成m个单链前体扩增子核酸，其中所述单链扩增子核酸包含所述m个环化单链前体核酸的多个复制物；(d)提供可与第一前体衔接子杂交的第一前体辅助寡核苷酸；以及(e)在适合于第一前体作用物在多个切割位点处切割第一单链前体扩增子核酸的条件下提供第一前体作用物，从而生成m个线性前体核酸。在一些实施方案中，该方法进一步包括使所述m个线性前体核酸环化，从而形成所述m个环化单链前体核酸的复制物。在一些实施方案中，所述m个环化单链前体核酸在单链复制物中扩增至少10、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施方案中，所述m个环化单链核酸中的至少一个的浓度为约或至多约100nM、10nM、1nM、50pM、1pM、100fM、10fM、1fM或更小。在一些实施方案中，环化包括连接。在一些实施方案中，连接包括使用选自T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA连接酶和9NDNA连接酶的连接酶。

在又一方面，本发明在不同的实施方案中涉及一种试剂盒，其包含：(a)第一衔接子；(b)可与该衔接子杂交的第一辅助寡核苷酸；(c)连接酶；和(d)第一裂解剂，其包括至少一种选自下组的酶：MlyI、SchI、AlwI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、FokI、HgaI、PleI、SfaNI、BfuAI、BsaI、BspMI、BtgZI、EarI、BspQI、SapI、SgeI、BceFI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、FaqI、AceIII、BbvII、BveI、LguI、BfuCI、DpnII、FatI、MboI、MluCI、Sau3AI、Tsp509I、BssKI、PspGI、StyD4I、Tsp45I、AoxI、BscFI、Bsp143I、BssMI、BseENII、BstMBI、Kzo9I、NedII、Sse9I、TasI、TspEI、AjnI、BstSCI、EcoRII、MaeIII、NmuCI、Psp6I、MnlI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HphI、HpyAV、MboII、AcuI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsmI、BsrDI、BtsI、EciI、MmeI、NmeAIII、Hin4II、TscAI、Bce83I、BmuI、BsbI、BscCI、NlaIII、Hpy99I、TspRI、FaeI、Hin1II、Hsp92II、SetI、TaiI、TscI、TscAI、TseFI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、AspCNI、BscGI、BspNCI、EcoHI、FinI、TsuI、UbaF11I、UnbI、Vpak11AI、BspGI、DrdII、Pfl1108I、UbaPI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI和Nt.BspQI及其变体。在一些实施方案中，与所列出的任何第一裂解剂和变体相比，第一裂解剂包含基本相同的功能，识别相同或基本相同的识别序列，或在相同或基本相同的切割位点处进行切割。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含第二裂解剂。在一些实施方案中，第二裂解剂包括选自下组的酶：MlyI、SchI、AlwI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、FokI、HgaI、PleI、SfaNI、BfuAI、BsaI、BspMI、BtgZI、EarI、BspQI、SapI、SgeI、BceFI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、FaqI、AceIII、BbvII、BveI、LguI、BfuCI、DpnII、FatI、MboI、MluCI、Sau3AI、Tsp509I、BssKI、PspGI、StyD4I、Tsp45I、AoxI、BscFI、Bsp143I、BssMI、BseENII、BstMBI、Kzo9I、NedII、Sse9I、TasI、TspEI、AjnI、BstSCI、EcoRII、MaeIII、NmuCI、Psp6I、MnlI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HphI、HpyAV、MboII、AcuI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsmI、BsrDI、BtsI、EciI、MmeI、NmeAIII、Hin4II、TscAI、Bce83I、BmuI、BsbI、BscCI、NlaIII、Hpy99I、TspRI、FaeI、Hin1II、Hsp92II、SetI、TaiI、TscI、TscAI、TseFI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、AspCNI、BscGI、BspNCI、EcoHI、FinI、TsuI、UbaF11I、UnbI、Vpak11AI、BspGI、DrdII、Pfl1108I、UbaPI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI和Nt.BspQI及其变体。在一些实施方案中，与所列出的任何第二裂解剂和变体相比，第二裂解剂包含基本相同的功能，识别相同或基本相同的识别序列，或在相同或基本相同的切割位点处进行切割。在一些实施方案中，第一裂解剂包括MlyI。在一些实施方案中，第二裂解剂包括BciVI或BfuCI。

在又一方面，本发明涉及核酸扩增方法，其包括：(a)提供包含n个环化单链核酸的样品，所述n个环化单链核酸各自包含不同的靶序列；(b)提供可与所述n个环化单链核酸中的m个上的至少一个衔接子杂交序列杂交的第一衔接子；(c)提供适合于使用所述m个环化单链核酸作为模板延伸第一衔接子的条件，从而生成m个单链扩增子核酸，其中所述m个单链扩增子核酸中的每一个均包含来自其模板的靶序列的多个复制物；(d)在所述m个单链扩增子核酸上生成针对第一作用物的双链识别位点；以及(e)在适合于第一作用物在多个切割位点处切割所述m个单链扩增子核酸的条件下提供第一作用物，从而生成所述m个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。在一些实施方案中，所述双链识别位点包括所述双链识别位点的第一链上的第一衔接子的第一部分和所述双链识别位点的第二链上的第一衔接子的第二部分。在一些实施方案中，所述衔接子包含回文序列。在一些实施方案中，所述双链识别位点通过使第一衔接子的第一和第二部分彼此杂交而生成。在一些实施方案中，所述m个单链扩增子核酸包含多个双链自杂交区。

在又一方面，本发明涉及用于生成长核酸分子的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供固定在表面上的多个核酸，其中所述多个核酸包括具有重叠互补序列的核酸；(b)将所述多个核酸释放至溶液中；以及(c)提供促进下述的条件：i)杂交所述重叠互补序列以形成多个杂交的核酸；和ii)延伸或连接所述杂交的核酸以合成长核酸分子。

在另一方面，本发明涉及能够处理一种或多种基底的自动化系统，其包括：用于在基底上喷射包含化学种类的微滴的喷墨打印头；用于扫描邻近打印头的基底以选择性地使微滴在指定位点处沉积的扫描传输件(transport)；用于处理基底的流动池，通过将基底暴露于一种或多种选择的流体使微滴沉积在该基底上；用于每当基底邻近于打印头定位以供沉积时使基底相对于打印头正确对准的对准单元；并且不包括用于在打印头与流动池之间移动基底以供在流动池中处理的处理传输件，其中所述处理传输件和所述扫描传输件是不同的元件。

在又一方面，本发明涉及用于在基底上合成寡核苷酸的自动化系统，所述自动化系统能够处理一种或多种基底，其包括：用于在基底上喷射包含核苷或活化核苷的溶液的喷墨打印头；用于扫描邻近打印头的基底以选择性地使核苷在指定位点处沉积的扫描传输件；用于处理基底的流动池，其通过将基底暴露于一种或多种选择的流体使单体沉积在该基底上；用于每当基底邻近于打印头定位以供沉积时使基底相对于打印头正确对准的对准单元；并且不包括用于在打印头与流动池之间移动基底以供在流动池中处理的处理传输件，其中所述处理传输件和所述扫描传输件是不同的元件。

在又一方面，本发明涉及一种自动化系统，其包括：用于在基底上喷射包含化学种类的微滴的喷墨打印头；用于扫描邻近打印头的基底以选择性地使微滴在指定位点处沉积的扫描传输件；用于处理基底的流动池，其通过将基底暴露于一种或多种选择的流体使微滴沉积在该基底上；和用于每当基底邻近于打印头定位以供沉积时使基底相对于打印头正确对准的对准单元；并且其中所述系统不包括用于在打印头与流动池之间移动基底以供在流动池中处理的处理传输件。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如具体地和个别地指出每一单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

具体实施方式

在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考对在其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的以下详细描述和附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在附图中：

图1示出了概括基因合成和纳米反应器技术的示例过程。图1A图示了使用喷墨打印机在基底上合成寡核苷酸的示例过程；图1B图示了解析包围体或纳米反应器中的基因扩增的示例过程。图1C图示了使用多个晶片的示例，该晶片连接用于平行进行寡核苷酸合成和基因组装的微流体反应。

图2A-图2C是示出示例性商业工艺流程的框图。可以跳过对所合成的基因的克隆(图2B)。在图2C中，在运输之前克隆所合成的基因(图2C)。

图3示出了包括用于试剂沉积的打印机(例如，喷墨打印机)、基底(晶片)的用于寡核苷酸合成的系统的示例性略图，概括系统元件在多个方向上的对准的示意图，以及试剂流的示例性设置。

图4图示了内建于基底中的设计微结构(寡核苷酸晶片反应器)的示例。

图5是示出用于将试剂沉积到图4中所示微结构中的示例性过程的图示。用于表面功能化的选定区域允许试剂在润湿条件下扩散到较小的功能化孔中。

图6A是进一步示例说明图4中所示的微结构的示图。图6B是微结构的各个备选设计的示图。图6C图示了微结构在基底(晶片)上的布局设计。

图7图示了加帽元件上的反应器帽的示例性布局。

图8是示出基因合成到运输的示例性处理工作流的示图。

图9A示出了在盖板打开或闭合时的示例性流通池的示图。图9B图示了示例性流通池和废物收集器组装件的剖视图。图9C图示了示例性流通池和废物收集器组装件的放大剖视图。

图10A图示了具有单一1-5mm沟槽的、直径为198mm的单槽真空吸盘的示例。图10B图示了基底(晶片)与真空吸盘之间的烧结金属嵌件，以及并入至接纳元件中的任选热控制元件。图10C图示了图10A中所示例说明的单槽真空吸盘(烧结金属吸盘)的剖视图。

图11图示了用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺化学法的示例性应用。

图12图示了聚合酶链组装(PCA)的示例性应用。

图13是说明使用较长的寡核苷酸(例如约300bp)相对于使用较短的寡核苷酸(例如约50bp)的优势的示图。较长的寡核苷酸可在基因产物的组装中使用，具有减少的错误。

图14是说明用于将寡核苷酸组装成基因产物的PCA和Gibson方法的示例性组合应用的示图。

图15是说明尤其适合于具有较高错误率的基因合成产物应用的错误校正方法的示图。

图16是说明尤其适合于具有较低错误率的基因合成产物应用的错误校正方法的示图。

图17是说明使用扣锁探针生成分子条形码化测序文库和包括下一代测序(NGS)的质量控制(QC)过程的示图。

图18示出了具有10个喷墨头的喷墨组装件的示例，所述喷墨头具有硅孔板，该硅孔板在254μm中心上具有256个喷嘴，并且具有100μm的飞移高度。

图19示出了可结合本发明的示例实施方案使用的计算机系统的实例。

图20是示出可结合本发明的示例实施方案使用的计算机系统2000的第一示例架构的框图。

图21是说明网络2100的示图，网络2100被配置用于并入多个计算机系统、多个蜂窝电话和个人数据助理，以及可结合本发明的示例实施方案使用的网络附加存储(NAS)。

图22是使用可结合本发明的示例实施方案使用的共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统2200的框图。

图23是说明构成用于在基底(例如硅片)上制作微结构的前端处理的示例性步骤的示图。

图24是说明构成用于功能化基底(例如硅片)上的微结构表面的后端处理的示例性步骤的示图。

图25A-图25C描绘了包含高密度分组的聚簇(cluster)的不同视图。图25D-图25E描绘了包含基本上为平面的基底部分的微流体装置的示图的不同视图。图25F描绘了包含基本上为平面的基底部分的微流体装置的示图的装置视图，所述基底部分具有108个反应孔和用于标签的指定区域。图25G描绘了包含109个分组的聚簇的装置视图。

图26A描绘了纳米反应器的示图的剖面图，其中该视图示出了包含11个孔的一行纳米反应器。图26B描绘了包含108个凸起孔的纳米反应器的示图的装置视图。详图F描绘了纳米反应器的一个孔的详细视图。图26C描绘了图26B中所示纳米反应器示图的成角度的装置视图。图26D描绘了纳米反应器的示图的处理(handle)视图。详图H描绘了纳米反应器的处理侧上的基准标记的详细视图。图26E描绘了包含108个孔和标签的纳米反应器的示图的装置视图。

图27详细图示了差异功能化的示例性寡核苷酸合成装置的设计特征。

图28图示了图15中的示例性装置的前端制造工艺的工作流程。

图29图示了用于差异功能化的图15所示示例性寡核苷酸合成装置的后端制造的示例性基线工艺流程。

图30图示了用于核酸合成的、具有受控密度的活性基团的功能化表面。

图31示出了根据本文所述方法制造的装置的图像。

图32图示了示例性纳米反应器装置的设计细节。

图33图示了图20中所述示例性装置的前端制造的示例性基线工艺流程。

图34图示了用于功能化的图20所示示例性纳米反应器装置的后端制造的示例性基线工艺流程。

图35示出了如本文所述制造的纳米反应器装置中的纳米孔。图35B示出了图35A所示的纳米孔的特写视图。

图36A-图36F示出了用于差异功能化的不同配置。在每张图中，亮阴影线表示活性表面，而暗线表示钝化表面。

图36A示出了均一功能化的表面。图36B-图36F示出了在不同配置中差异功能化的表面。

图37A-图37F示出了装置功能化的工艺流程。

图38描绘了抗蚀剂应用的示例性图示，其中抗蚀剂被拉进小结构中并停在锐利边缘处。

图39A-图39B示出了使用底层结构来阻止或芯吸在示例性实施方案中应用的抗蚀剂。

图40A-图40C示出了在示例性差异功能化配置中的平版印刷后的抗蚀剂图案。图40A示出了平版印刷后的抗蚀剂图案的亮视野视图。图40B示出了平版印刷后的抗蚀剂图案的暗视野视图。图40C示出了平版印刷后的抗蚀剂图案的横截面示意视图。

图41A-图41C示出了在另一示例性差异功能化配置中的平版印刷后的抗蚀剂图案。图41A示出了平版印刷后的抗蚀剂图案的亮视野视图。图41B示出了平版印刷后的抗蚀剂图案的暗视野视图。图41C示出了平版印刷后的抗蚀剂图案的横截面示意视图。

图42A-图42C示出了用氟硅烷功能化之后的后抗蚀剂剥离。图42A示出了亮视野视图。图42B示出了暗视野视图。图42C示出了横截面示意视图。

图43A-图43C示出了载满DMSO的示例性寡核苷酸合成装置(“角蛋白芯片”)。图43A示出了载满DMSO的角蛋白芯片的亮视野视图。指示出亲水区和疏水区。图43B示出了载满DMSO的角蛋白芯片的暗视野视图。图43C示出了载满DMSO的角蛋白芯片的横截面示意视图，表明转轮(revolver)的自发润湿。

图44A-图44F概述了用于图36所示的配置6的示例性工艺流程。

图45A-图45B显示了来自寡核苷酸合成装置的斑点采样配置(A)和图45A的五个斑点中每一个的对应的BioAnalyzer数据(B)。

图46显示了在硅寡核苷酸合成装置上合成的、表面提取的100-聚体寡核苷酸的BioAnalyzer数据。

图47显示了PCR扩增之后，在硅寡核苷酸合成装置上合成的、表面提取的100-聚体寡核苷酸的BioAnalyzer数据。

图48表示从斑点8采集的样品的序列比对，其中“x”表示单碱基缺失，“星号”表示单碱基突变，而“+”表示在Sanger测序中的低质量斑点。

图49表示从斑点7采集的样品的序列比对，其中“x”表示单碱基缺失，“星号”表示单碱基突变，而“+”表示在Sanger测序中的低质量斑点。

图50A-图50B提供了在提取(A)之后和PCR扩增(B)之后，在三维寡核苷酸装置上合成的100-聚体寡核苷酸的BioAnalyzer结果。

图51表示在3D寡核苷酸装置上合成的100-聚体寡核苷酸的PCR扩增样品的序列比对图。

图52表示使用CorrectASE通过应用两轮错误校正的校正结果。

图53A-图53C示出了在功能化之后在示例性差异功能化配置中的表面功能化图案。图53A示出了亮视野视图。图53B示出了暗视野视图。图53C示出了表面功能化图案的横截面示意视图和躲避疏水区造成的鼓起的水性流体。

图54描绘了用于纳米反应器装置的功能化的示例性工作流程。清洗后是抗蚀剂沉积、功能化和最终的抗蚀剂剥离。

图55描绘了按照印迹法从寡核苷酸合成装置转移到单独的纳米反应器孔中的一些寡核苷酸的BioAnalyzer结果。图56A-图56B描绘了供替代的流动池设计。

图56A描绘了流动池的线源(linesource)/线排(linedrain)设计。

图56B描绘了流动池的点源(pointsource)/点排(pointdrain)设计。

图57示出了安装在具有50um间隙的配置中的寡核苷酸合成装置和纳米反应器装置。在示例性实施方案中，所述装置被维持在这一配置中10分钟。

图58A-图58B显示了不受理论的束缚，通过扩散，寡核苷酸随时间从寡核苷酸合成装置到纳米反应器装置的重新分布。

图58A显示了在转轮通道中的液体中浓缩的寡核苷酸，以及在纳米反应器区室中的少量或没有寡核苷酸。图58B图示了在相对于图58A的较晚时间点，通过转轮区室中和纳米反应器区室中的液体均匀分布的寡核苷酸。

图59显示了PCA反应之前和之后用于基因组装的纳米反应器孔阵列的视图。

图60A-图60C描绘了在纳米反应器装置的不同孔中的基因组装的结果。图60A描绘了合成寡核苷酸的装置。标记出孔1-10。图60B描绘了在图60A中的孔中组装的基因的分析。用孔的编号标记出对应于每个孔中的基因的峰。图60C描绘了在图60B中分析的寡核苷酸的电泳。

图61A-图61B呈现了符合本文公开内容的高容量寡核苷酸合成装置的单元视图。图61A呈现了如本文公开的单元的完整的、成角度的视图。图61B呈现了穿过如本文公开的单元切割的横截面的成角度视图。

图62描绘了符合本文公开内容的另一高容量寡核苷酸合成装置的单元视图，该装置在其表面上具有增加表面积的柱状物的阵列。

图63描绘了使用滚环扩增而扩增的单链核酸的电泳，其中扩增产物用裂解剂的不同组合来切割。

图64A-图64F表示用于扩增单链核酸的方法。

图65A-图65F表示用于扩增单链核酸的方法，它可与图64中示出的方法耦合。

具体实施方式

贯穿本公开内容，本发明的各个方面能够以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简明，而不应被解释为对本发明范围的硬性限制。相应地，对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的单个数值，除非上下文另有明确规定。例如，诸如从1至6的范围描述应被认为已经明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的单个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本发明之中，但受制于所声称范围中的任何被明确排除的限值。当所声称范围包括限值中之一或全部两者时，排除了这些包括的限值中之一或全部二者的范围也被包括在本发明中，除非上下文另有明确规定。

在另一方面，本发明还提供了在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法。该方法包括a)提供具有解析座位(resolvedloci)的基底，该解析座位用适合于核苷酸偶联的化学部分功能化；以及b)根据座位特异性预定序列使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少12个核苷酸的速率偶联，从而合成n个碱基对长的多个寡核苷酸。本文描述了涉及在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法的不同实施方案。

在一些涉及如本文所述的包围体阵列的实施方案中，解析座位位于被制作于支持表面内的微结构上。在一些实施方案中，所述微结构包含至少两个彼此流体连通的通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同宽度的两个通道。在一些实施方案中，所述至少两个通道包含具有不同长度的两个通道。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个长于100μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个短于1000μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径宽于50μm。在一些实施方案中，所述通道中的至少一个的直径窄于100μm。在一些实施方案中，所述微结构包含具有至少0.01μm/μm²的密度的至少两个通道的周长的标称弧长。在一些实施方案中，所述微结构包含具有至少0.001μm/μm²的密度的至少两个通道的周长的标称弧长。在一些实施方案中，解析反应器用可释放的密封隔开。在一些实施方案中，该密封包括毛细管被动阀。

在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括使源于第一滴的至少一个第一结构单元与第一座位上的生长寡核苷酸链偶联。在一些实施方案中，该结构单元包含封闭基团。在一些实施方案中，该封闭基团包含酸不稳定的DMT。在一些实施方案中，该酸不稳定的DMT包含4,4'-二甲氧基三苯甲基。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括氧化或硫化。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括对未偶联的寡核苷酸链进行化学加帽。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括去除封闭基团，从而解除对生长寡核苷酸链的封闭。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在偶联步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在氧化步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在加帽步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，负压施加过程中基底的位置在解除封闭步骤过程中基底位置的10cm之内。在一些实施方案中，第一座位位于被制作于基底表面内的微结构上。在一些实施方案中，用于氧化步骤的至少一种试剂通过用包含所述至少一种试剂的溶液充溢微结构来提供。在一些实施方案中，用于加帽步骤的至少一种试剂通过用包含所述至少一种试剂的溶液充溢微结构来提供。在一些实施方案中，第一座位位于被制作于基底表面内的微结构上，并且用于解除封闭步骤的至少一种试剂可通过用包含所述至少一种试剂的溶液充溢微结构来提供。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括将基底包围在密封的区室内。在一些实施方案中，密封的区室允许从第一座位中清除液体。在一些实施方案中，如本文所述在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法进一步包括通过与第一座位可操作地连接的排水管排出液体。在一些实施方案中，向基底施加负压后，基底的含水量小于1ppm。在一些实施方案中，表面能提高以对应于小于20度的水接触角。值得注意的是，此处所述的任何实施方案可与本发明中提供的任何方法、装置、阵列、基底或系统结合。

在又一方面，本发明提供了使试剂沉积至多个解析座位的方法。该方法包括通过喷墨泵向所述多个座位的第一座位施加至少一滴第一试剂；通过喷墨泵向所述多个解析座位的第二座位施加至少一滴第二试剂。在一些实施方案中，第二座位与第一座位邻近。在又一些实施方案中，第一和第二试剂是不同的。在又一些实施方案中，第一和第二座位位于被制作于支持表面内的微结构上。在又一些实施方案中，所述微结构包含深度大于100μm的至少一个通道。

在一些实施方案中，至少10％、25％、50％、75％、90％或95％的所述n*m个微流体连接的总长度与基本上为平面的基底的最小维度相差10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、500％或1000％以内。

在另一方面，本发明涉及一种核酸扩增方法，其包括：(a)提供包含n个环化单链核酸的样品，所述n个环化单链核酸各自包含不同的靶序列；(b)提供可与所述n个环化单链核酸中的m个上的至少一个衔接子杂交序列杂交的第一衔接子；(c)提供适合于使用所述m个环化单链核酸作为模板延伸第一衔接子的条件，从而生成m个单链扩增子核酸，其中所述m个单链扩增子核酸中的每一个均包含来自其模板的靶序列的多个复制物(replicas)；(d)提供可与第一衔接子杂交的第一辅助寡核苷酸；以及(e)在适合于第一作用物在多个切割位点处切割所述m个单链扩增子核酸的条件下提供第一作用物，从而生成所述m个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。在一些实施方案中，n或m至少为2。在一些实施方案中，n或m至少为3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、300、400或500。在一些实施方案中，m小于n。在一些实施方案中，包含所述n个环化单链核酸的样品通过以下步骤形成：提供各自包含不同靶序列中的一个的至少n个线性单链核酸，并使所述n个线性单链核酸环化，从而生成所述n个环化单链核酸。在一些实施方案中，所述第一衔接子可与所述n个线性单链核酸的两端同时杂交。在一些实施方案中，所述n个线性单链核酸中的不同靶序列的侧翼为第一和第二衔接子杂交序列。在一些实施方案中，所述至少n个线性单链核酸通过从头寡核苷酸合成而生成。在一些实施方案中，所述n个线性单链核酸中的每一个中的第一衔接子杂交序列相差不超过两个核苷酸碱基。在一些实施方案中，第一或第二衔接子杂交序列为至少5个核苷酸长。在一些实施方案中，第一或第二衔接子杂交序列为至多75、50、45、40、35、30或25个核苷酸长。在一些实施方案中，当第一衔接子与所述线性单链核酸的两端同时杂交时，所述n个线性单链核酸的末端与第一衔接子上的相邻碱基配对。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置使得所述衔接子杂交序列从m个环化单链核酸复制物的至少5％的剩余序列部分上断裂下来。在一些实施方案中，除了至少一个衔接子杂交序列外，所述m个环化单链核酸复制物的至少5％的序列保持未切割。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置在所述至少一个衔接子杂交序列的外部。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置不依赖于所述靶序列。在一些实施方案中，所述多个切割位点的位置由第一衔接子或第一辅助寡核苷酸的序列内的至少一个序列元件来决定。在一些实施方案中，所述序列元件包含限制性内切核酸酶的识别位点。在一些实施方案中，所述第一辅助寡核苷酸或第一衔接子寡核苷酸包含IIS型限制性内切核酸酶的识别位点。在一些实施方案中，识别位点距离切割位点至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方案中，所述多个切割位点在单链和双链核酸的连接处。在一些实施方案中，所述双链核酸包含第一衔接子和第一辅助寡核苷酸。在一些实施方案中，所述单链核酸基本由m个不同的靶序列组成。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多95％的逐对相似性。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多90％的逐对相似性。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多80％的逐对相似性。在一些实施方案中，所述m个不同的靶序列具有至多50％的逐对相似性。在一些实施方案中，生成m个单链扩增子核酸包括链置换扩增。在一些实施方案中，所述第一辅助寡核苷酸包含亲和标记物。在一些实施方案中，所述亲和标记物包括生物素或生物素衍生物。在一些实施方案中，该方法进一步包括从所述样品中分离双链核酸。在一些实施方案中，所述分离包括亲和纯化、层析或凝胶纯化。在一些实施方案中，所述第一作用物包括限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括至少两种限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括IIS型限制性内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括切口内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括至少两种切口内切核酸酶。在一些实施方案中，所述第一作用物包括至少一种选自下组的酶：MlyI、SchI、AlwI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、FokI、HgaI、PleI、SfaNI、BfuAI、BsaI、BspMI、BtgZI、EarI、BspQI、SapI、SgeI、BceFI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、FaqI、AceIII、BbvII、BveI、LguI、BfuCI、DpnII、FatI、MboI、MluCI、Sau3AI、Tsp509I、BssKI、PspGI、StyD4I、Tsp45I、AoxI、BscFI、Bsp143I、BssMI、BseENII、BstMBI、Kzo9I、NedII、Sse9I、TasI、TspEI、AjnI、BstSCI、EcoRII、MaeIII、NmuCI、Psp6I、MnlI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HphI、HpyAV、MboII、AcuI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsmI、BsrDI、BtsI、EciI、MmeI、NmeAIII、Hin4II、TscAI、Bce83I、BmuI、BsbI、BscCI、NlaIII、Hpy99I、TspRI、FaeI、Hin1II、Hsp92II、SetI、TaiI、TscI、TscAI、TseFI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、AspCNI、BscGI、BspNCI、EcoHI、FinI、TsuI、UbaF11I、UnbI、Vpak11AI、BspGI、DrdII、Pfl1108I、UbaPI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI和Nt.BspQI及其变体。在一些实施方案中，与所列出的任何第一作用物和变体相比，第一作用物包含基本相同的功能，识别相同或基本相同的识别序列，或在相同或基本相同的切割位点处进行切割。在一些实施方案中，所述至少两种限制性内切核酸酶包括MlyI和BciVI，或BfuCI和MlyI。在一些实施方案中，该方法进一步包括(a)将所述样品划分为多个部分；(b)提供至少一个具有第二衔接子的部分，所述第二衔接子可与n个不同环化单链核酸中的k个上的至少一个衔接子杂交序列杂交；(c)提供适合于使用所述k个环化单链核酸作为模板延伸第二衔接子的条件，从而生成k个单链扩增子核酸，其中第二单链扩增子核酸包含来自其模板的靶序列的多个复制物；(d)提供可与第二衔接子杂交的第二辅助寡核苷酸；以及(e)在适合于所述作用物在第二多个切割位点处切割所述k个单链扩增子核酸的条件下提供第二作用物，从而生成所述k个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。在一些实施方案中，所述第一和第二衔接子是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二辅助寡核苷酸是相同的。在一些实施方案中，所述第一和第二作用物是相同的。在一些实施方案中，k+m小于n。在一些实施方案中，k至少为2。在一些实施方案中，包含n个环化单链核酸的样品通过单链核酸扩增形成。在一些实施方案中，所述单链核酸扩增包括：(a)提供包含至少m个环化单链前体核酸的样品；(b)提供可与所述m个环化单链前体核酸杂交的第一前体衔接子；(c)提供适合于使用所述m个环化单链前体核酸作为模板延伸第一前体衔接子的条件，从而生成m个单链前体扩增子核酸，其中所述单链扩增子核酸包含所述m个环化单链前体核酸的多个复制物；(d)提供可与第一前体衔接子杂交的第一前体辅助寡核苷酸；以及(e)在适合于第一前体作用物在多个切割位点处切割第一单链前体扩增子核酸的条件下提供第一前体作用物，从而生成m个线性前体核酸。在一些实施方案中，该方法进一步包括使所述m个线性前体核酸环化，从而形成所述m个环化单链前体核酸的复制物。在一些实施方案中，所述m个环化单链前体核酸在单链复制物中扩增至少10、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施方案中，所述m个环化单链核酸中的至少一个的浓度为约或至多约100nM、10nM、1nM、50pM、1pM、100fM、10fM、1fM或更小。在一些实施方案中，环化包括连接。在一些实施方案中，连接包括使用选自T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA连接酶和9NDNA连接酶的连接酶。

在又一方面，本发明涉及核酸扩增方法，其包括：(a)提供包含n个环化单链核酸的样品，所述n个环化单链核酸各自包含不同的靶序列；(b)提供可与所述n个环化单链核酸中的m个上的至少一个衔接子杂交序列杂交的第一衔接子；(c)提供适合于使用所述m个环化单链核酸作为模板延伸第一衔接子的条件，从而生成m个单链扩增子核酸，其中所述m个单链扩增子核酸中的每一个均包含来自其模板的靶序列的多个复制物；(d)在所述m个单链扩增子核酸上生成针对第一作用物的双链识别位点；以及(e)在适合于第一作用物在多个切割位点处切割所述m个单链扩增子核酸的条件下提供第一作用物，从而生成所述m个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。在一些实施方案中，所述双链识别位点包括所述双链识别位点的第一链上的第一衔接子的第一部分和所述双链识别位点的第二链上的第一衔接子的第二链。在一些实施方案中，所述衔接子包含回文序列。在一些实施方案中，所述双链识别位点通过使第一衔接子的第一和第二部分彼此杂交而生成。在一些实施方案中，所述m个单链扩增子核酸包含多个双链自杂交区。

在又一方面，本发明涉及用于生成长核酸分子的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供固定在表面上的多个核酸，其中所述多个核酸包括具有重叠互补序列的核酸；(b)将所述多个核酸释放至溶液中；以及(c)提供促进下述的条件：i)将所述重叠互补序列杂交以形成多个杂交的核酸；和ii)延伸或连接所述杂交的核酸以合成长核酸分子。

在又一方面，本发明涉及用于在基底上合成寡核苷酸的自动化系统，所述自动化系统能够处理一种或多种基底，其包括：用于在基底上喷射包含核苷或活化核苷的溶液的喷墨打印头；用于扫描邻近打印头的基底以选择性地使核苷在指定位点处沉积的扫描传输件；用于处理基底的流动池，通过将基底暴露于一种或多种选择的流体使单体沉积在该基底上；用于每当基底邻近于打印头定位以供沉积时使基底相对于打印头正确对准的对准单元；并且不包括用于在打印头与流动池之间移动基底以供在流动池中处理的处理传输件，其中所述处理传输件和所述扫描传输件是不同的元件。

在又一方面，本发明涉及一种自动化系统，其包括：用于在基底上喷射包含化学种类的微滴的喷墨打印头；用于扫描邻近打印头的基底以选择性地使微滴在指定位点处沉积的扫描传输件；用于处理基底的流动池，通过将基底暴露于一种或多种选择的流体使微滴沉积在该基底上；和用于每当基底邻近于打印头定位以供沉积时使基底相对于打印头正确对准的对准单元；并且其中所述系统不包括用于在打印头与流动池之间移动基底以供在流动池中处理的处理传输件。

鉴于以上所述，对出于示例说明目的而示出在图1-图2中的组合物、系统和方法中体现的本发明的附图作出更具体的参考。应当理解，在本发明的各个实施方案中，所述方法、系统和组合物在配置上和单个部分的细节上可能有所不同。此外，所述方法在事件或动作的细节和顺序上可有所不同。在各个实施方案中，主要就随核酸，特别是随DNA寡聚体和多核苷酸一起使用而言描述本发明。然而应当理解，本发明亦可与多种不同类型的分子一起使用，这些分子包括RNA或其他核酸、肽、蛋白质或感兴趣的其他分子。这些感兴趣的较大分子中的每一种的适当结构单元是本领域中已知的。

本发明提供在感兴趣的分子文库的制备和合成中有用的组合物、系统和方法，其中感兴趣的分子包括核酸、多肽、蛋白质及其组合。在各个实施方案中，本发明考虑到使用静态和动态晶片，例如，由硅基底制成的晶片，用于平行地进行微米级、纳米级或皮米级反应。此外，该晶片可适用于对流体进行微米级、纳米级或皮米级的平行操作，以便允许连接多个解析体积内的多个反应。流体的操作可包括流动、组合、混合、分级分离、滴的生成、加热、冷凝、蒸发、密封、分层、加压、干燥或本领域中已知的任何其他合适的流体操作。在各个实施方案中，所述晶片提供内建于表面中的、用于流体操作的架构。在晶片基底内或贯穿晶片基底可建构出不同形状和尺寸的特征。在各个实施方案中，本发明的方法和组合物使用在本文中进一步详细举例说明的专门建构的装置用于生物分子的合成。具体而言，本发明提供例如使用标准亚磷酰胺化学法和适当的基因组装技术，通过精确控制诸如时间、剂量和温度等反应条件，对包含高质量的长寡核苷酸和多聚核苷酸的高密度大基因文库的从头合成。

现参考图1C，本发明在各个实施方案中考虑到使用一个或多个静态或动态晶片进行流体操作。晶片可由如本文进一步描述的多种合适的材料(例如，硅)构建而成。纳米反应器晶片可被配置用于在多个特征中接收和容纳液体。附加的晶片，例如用于原位合成反应的晶片，可与纳米反应器晶片相接触，以便收集和/或混合液体。纳米反应器可从多个附加晶片收集液体。通常，当接触纳米反应器晶片时，纳米反应器与附加晶片上的一个或多个解析座位对准。在接触之前，可在纳米反应器内提供试剂和溶剂。或者，在接触附加晶片之前，纳米反应器可以是空的。在一些实施方案中，纳米反应器收集在DNA合成晶片的一个或多个解析座位中合成的寡核苷酸。这些寡核苷酸可在纳米反应器内组装成更长的基因。在附加晶片的对准和接触后，纳米反应器可通过任何合适的手段密封，例如毛细管被动阀、压力、粘合剂或本领域中已知的任何其他合适的密封手段。密封可以是可释放的。纳米反应器晶片内的反应可在密封的容积中进行，并且可包括例如在PCR或PCA中适用的温度循环。诸如等温扩增之类的等温反应也在本发明的范围内。DNA合成晶片可配置用于在精确控制下在表面之上或之内的解析座位处进行寡核苷酸的原位合成。可使用喷墨打印头来向合成晶片的解析座位上递送用于合成(例如，标准亚磷酰胺合成)的试剂滴。多个解析座位所共用的其他试剂可以成批地通过这些座位。在一些实施方案中，如本文其他部分所进一步描述，以用于除DNA寡核苷酸之外的分子的原位合成的合成晶片来替代DNA合成晶片。因此，本发明考虑到通过对多个小体积中的反应条件的精确控制来高质量地进行寡核苷酸和长基因的大文库的快速合成。本发明的进一步的益处在于，相比于本领域中已知的传统合成方法，减少了试剂用量。

考虑用于以低错误率进行基因文库的从头合成的各种方法。图2图示了用于平行合成具有长序列的高质量大基因文库的本发明方法和组合物的示例性应用。在各个实施方案中，静态和动态晶片能够实现工艺流程中的多个反应。例如，在通常于DNA合成晶片上原位进行的寡核苷酸合成之后，可以跟随着基因组装反应，诸如经合成的寡核苷酸到更长序列的聚合酶循环组装(PCA)。组装的序列可以例如通过PCR而扩增。可以使用本文所述或本领域已知的合适的错误校正反应来将偏离靶序列的组装序列的数目减到最少。可以构建测序文库并可以分出产物的一部分以供测序，诸如下一代测序(NGS)。

如图2中举例说明的基因合成过程可根据请求者的需要进行调整。根据由初始测序步骤例如NGS获得的结果，具有可接受的错误率的组装的基因可在例如平板上运送至请求者(图2B)。本发明的方法和组合物允许容易地实现小于约1/10kb的错误率，虽然可以如本文别处进一步详细描述的那样设置供替代的错误阈值。为了实现更高程度的纯度，从头合成/组装的序列可从单个菌落来克隆纯化。正确的所需序列的身份可通过测序例如NGS进行检测。任选地，例如经由另一测序方法，如Sanger测序，可获得测序信息的准确度的更高置信度。验证的序列可在例如平板上运送至请求者(图2C)。本文别处进一步详细描述了用于生成测序文库的方法。

基底/晶片

在一方面，本文描述了通过本文所述的任何方法制成的具有功能化表面的基底，和在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法。该基底可包括具有多个解析座位的固体支持物。所述多个解析座位可具有任何几何结构、取向或组构。解析座位可为任何尺度(例如，微米尺度或纳米尺度)，或者含有制作到基底表面内的微结构。解析座位可定位于具有至少一个维度的微通道上。基底中的单个解析座位可彼此流体分离，例如，用于合成第一寡核苷酸的第一解析座位可位于基底的两个表面之间的第一通孔上，而用于合成第二寡核苷酸的第二解析座位可位于基底的两个表面之间的第二通孔上，所述第一通孔和第二通孔未在基底内流体连通，但都始于并终于该基底的相同的两个表面。在一些情况下，解析座位的微结构可为2D或3D的微通道或微孔。“3D”微通道意指该微通道的腔体可在固体支持物内互连或延伸。在微通道或微孔内，可存在具有任何几何结构、取向或组构的次级微结构或特征。次级特征的表面可利用能够降低次级特征的表面的表面能的部分进行功能化。用于合成寡核苷酸的试剂小滴可沉积到微通道或微孔中。本文所使用的“微孔”是指能够容纳液体的微流体尺度的结构。在各个实施方案中，微孔允许液体在顶端与底端之间通过各端上的流体开口而流动，因此发挥像微通道那样的作用。在这些背景下，术语“微孔”和“微通道”在整个说明书中可互换使用。

图3图示了包括第一基底和任选的如本文所述的第二基底的用于寡核苷酸合成的系统的示例。喷墨打印机打印头可在X-Y方向上移动至第一基底的位置。第二基底可在Z方向上移动以便与第一基底密封，从而形成解析反应器。合成的寡核苷酸可从第一基底递送到第二基底。在另一方面，本发明还涉及用于寡核苷酸组装的系统。所述用于寡核苷酸组装的系统可包括用于晶片处理的系统。图4图示了根据本发明各个实施方案的基底布局设计的示例。基底可包括多个微孔，并且微孔可按均匀间距(例如，1.5mm间距)排列。或者，可在布局的不同方向上挑选多个间距，例如，可由第一间距限定微结构的行，而在每行之内，微结构可隔开第二间距。间距可包括任何合适的尺寸，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5或5mm。微孔可设计成具有任何合适的尺寸，例如，如图4中所示例的80μm直径，或者任何合适的直径，包括10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500μm，并且微孔可连接至多个较小的微孔。所述较小的微孔的表面可在选定区域中得到功能化，从而例如经由高能表面功能化而促进试剂液体流入。如图4中所示，所述较小的微孔的直径可为大约20μm，或者为任何合适的直径，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80μm。图5图示了当试剂小滴由喷墨打印机沉积到微孔中时的情况。液体小滴可分散在较小的微孔各处并填充较小的微孔，这在一些情况下通过微孔表面与相邻表面相比的高能表面修饰而得到促进。

在具有功能化表面的基底上具有高密度的解析座位可能对于获得小装置和/或用小装置合成大量分子和/或合成大量的不同分子是期望的。基底的功能化表面可包含任何合适的解析座位密度(例如，适合于以给定的所要合成的不同寡核苷酸总数、给定的合成过程时间量或者给定的每一寡核苷酸、基因或文库的成本来合成寡核苷酸的密度)。在一些实施方案中，表面具有的解析座位密度为每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或约500000个位点。在一些实施方案中，表面具有的解析座位密度为每1mm²至少约50、至少75、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1500、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000或至少约500000个位点。基底上的解析座位可具有任何不同的组构。例如但非限制性地，解析座位可彼此紧密聚集以形成一个或多个圆形区域、矩形区域、椭圆形区域、不规则区域等。在一方面，解析座位紧密堆积并具有低交叉污染量或者无交叉污染量(例如，沉积到一个解析座位中的试剂小滴基本上不会与沉积到另一最靠近的解析座位中的试剂小滴相混合)。可将基底上的解析座位的组构设计成使得其允许每个子区域或整个区域被一起覆盖从而创造出密封腔体，其中在该密封腔体中具有受控的湿度、压力或气体含量，以使得每个子区域或整个区域可具有与流体相连条件下所允许的相同的湿度、压力或气体含量或基本上相似的湿度、压力或气体含量。在图6中图示了基底上的解析座位的不同设计的一些示例。例如，图6Bb是被称为孔穴阵列(ArrayofHoles)的布局设计；图6Bc是被称为花朵(Flowers)的布局设计；图6Bd是被称为瞄准器(Gunsight)的布局设计；并且图6Be是被称为径向花朵(RadialFlower)的布局设计。图6C示例说明了覆盖有位于97.765μm漏板(stencil)上的一系列微孔的基底的设计。如图6C中所示例说明的微孔聚集成岛。微孔可用来自喷墨头的试剂填充。

基底上的每个解析座位可具有本领域中已知的任何形状，或者具有可由本领域中已知的方法制成的任何形状。例如，每个解析座位可具有圆形、矩形、椭圆形或不规则形状的区域。在一些实施方案中，解析座位可为允许液体容易地流过而不产生气泡的形状。在一些实施方案中，解析座位可为圆形，其直径可约为、至少约为或小于约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm或750μm。解析座位可具有单分散尺寸分布，即，所有微结构可具有大致相同的宽度、高度和/长度。或者，解析座位可具有有限数目的形状和/或尺寸，例如，解析座位可呈现为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20种或更多种不同的形状，每种形状具有单分散尺寸。在一些实施方案中，相同的形状能够以多个单分散尺寸分布(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或更多个单分散尺寸分布)重复。单分散分布可反映为具有小于模式的25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更小的标准偏差的幺模分布。

具有高密度解析座位的基底通常导致在小区域内有解析座位。因此，其可产生较小的微通道。所述微通道可容纳不同体积的沉积的试剂小滴。微通道可具有允许针对本发明多个实施方案的足够大的表面积和/或容积的任何合适的尺度。在一方面，微通道的容积适当地大，使得沉积在微通道内的小滴中的试剂不会在寡核苷酸合成过程中完全耗尽。除其他方面之外，在这些方面中，孔结构的容积可决定可用以合成寡核苷酸的时间周期或密度。

每个解析座位可具有任何合适的面积来进行根据本文所述发明的各个实施方案的反应。在一些情况下，多个解析座位可占据基底总表面积的任何合适的百分比。在一些情况下，解析座位的面积可为内建于基底中的微通道或微孔的横截面积。在一些实施方案中，多个微结构或解析座位可直接占据约、至少约或小于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的基底表面。在一些实施方案中，多个解析座位可占据约、至少约或小于约10mm²、11mm²、12mm²、13mm²、14mm²、15mm²、16mm²、17mm²、18mm²、19mm²、20mm²、25mm²、30mm²、35mm²、40mm²、50mm²、75mm²、100mm²、200mm²、300mm²、400mm²、500mm²、600mm²、700mm²、800mm²、900mm²、1000mm²、1500mm²、2000mm²、3000mm²、4000mm²、5000mm²、7500mm²、10000mm²、15000mm²、20000mm²、25000mm²、30000mm²、35000mm²、40000mm²、50000mm²、60000mm²、70000mm²、80000mm²、90000mm²、100000mm²、200000mm²、300000mm²或更大的总面积。

内建于基底中的微结构可包括微通道或微孔，其中微结构始于基底的顶面或底面，并且在一些情况下流体连接至通常相对的表面(例如，底面或顶面)。术语“顶”和“底”并不一定涉及基底在任何给定时间相对于重力的位置，而一般是为了方便和清楚而使用的。微通道或微孔可具有任何合适的深度或长度。在一些情况下，微通道或微孔的深度或长度是从基底的表面(和/或固体支持物的底部)到固体支持物的顶部测量的。在一些情况下，微通道或微孔的深度或长度大致等于固体支持物的厚度。在一些实施方案中，微通道或微孔约为、小于约或大于约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、300μm、400μm或500μm长或深。微通道或微孔可具有适合于本文所述发明实施方案的任何长度的周长。在一些情况下，微通道或微孔的周长按横截面积(例如，垂直于流体经过所述微通道或微孔的流动方向的横截面积)的周长测量。在一些实施方案中，微通道或微孔的周长约为、小于约或至少约为1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、31μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、300μm、400μm或500μm。在一些实施方案中，微通道或微孔的标称弧长密度可具有任何合适的每μm²平面基底面积的弧长。本文所述的弧长密度是指微通道或微孔横截面的周长长度/平面基底的表面积。例如但非限制性地，微通道或微孔的标称弧长密度可至少为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1μm/μm²或更大。在一些实施方案中，微通道或微孔的标称弧长密度可为0.036μm/μm²。在一些实施方案中，微通道或微孔的标称弧长密度可至少为0.001μm/μm²。在一些实施方案中，微通道或微孔的标称弧长密度可至少为0.01μm/μm²。此外，适合于本文所述反应的微通道或微孔的标称表面积可例如通过表面涂覆合适的部分而得到最大化。如本文所述涂覆有合适的部分的微通道或微孔的表面积可促进寡核苷酸与表面的附着。在一些实施方案中，适合于本文所述反应如寡核苷酸合成的微通道或微孔的标称表面积至少为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、1.8、1.85、1.9、1.95、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5或5μm²的平面基底面积。

微通道或微孔可具有适合于本文所述方法和组合物的任何容积。在一些实施方案中，微通道或微孔的容积小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950皮升(pl)，小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或990纳升(nl)，小于约0.5微升(μl)、小于约1μl、小于约1.5μl、小于约2μl、小于约2.5μl、小于约3μl、小于约3.5μl、小于约4μl、小于约4.5μl、小于约5μl、小于约5.5μl、小于约6μl、小于约6.5μl、小于约7μl、小于约7.5μl、小于约8μl、小于约8.5μl、小于约9μl、小于约9.5μl、小于约10μl、小于约11μl、小于约12μl、小于约13μl、小于约14μl、小于约15μl、小于约16μl、小于约17μl、小于约18μl、小于约19μl、小于约20μl、小于约25μl、小于约30μl、小于约35μl、小于约40μl、小于约45μl、小于约50μl、小于约55μl、小于约60μl、小于约65μl、小于约70μl、小于约75μl、小于约80μl、小于约85μl、小于约90μl、小于约95μl或小于约100μl。在一些实施方案中，微通道或微孔的容积等于或大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950皮升(pl)，等于或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或990纳升(nl)，等于或大于约0.5微升(μl)，约1μl、约1.5μl、约2μl、约2.5μl、约3μl、约3.5μl、约4μl、约4.5μl、约5μl、约5.5μl、约6μl、约6.5μl、约7μl、约7.5μl、约8μl、约8.5μl、约9μl、约9.5μl、约10μl、约11μl、约12μl、约13μl、约14μl、约15μl、约16μl、约17μl、约18μl、约19μl、约20μl、约25μl、约30μl、约35μl、约40μl、约45μl、约50μl、约55μl、约60μl、约65μl、约70μl、约75μl、约80μl、约85μl、约90μl、约95μl或约100μl。

微通道或微孔可具有小于1的宽深比。本文所使用的术语“宽深比”是指通道的宽度与该通道的深度的比值。因此，宽深比小于1的通道的深度大于其宽度，而宽深比大于1的通道的宽度大于其深度。在一些方面，微通道或微孔的宽深比可小于或等于约0.5、约0.2、约0.1、约0.05或更小。在一些实施方案中，微通道或微孔的宽深比可为约0.1。在一些实施方案中，微通道或通道的宽深比可为约0.05。本文所述的微结构，例如宽深比小于1、0.1或0.05的微通道或微孔，可包括具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个转角、转弯等的通道。本文所述的微结构可包括关于特定解析座位内所包含的所有微通道或微孔(例如，一个或多个交叉通道、这些通道中的一些通道、单一通道，以及甚至一个或多个微通道或微孔的一个部分或多个部分)所述的宽深比，例如小于1、0.1或0.05。美国专利号5,842,787中描述了制造具有低宽深比的微通道的其他设计和方法，该专利通过引用而并入于此。

位于具有多个解析座位的基底上的诸如微通道或微孔等微结构可通过本文所述的或除此之外在本领域中已知的任何方法(例如，微制造工艺)制造而成。可用于制造本文所公开的基底的微制造工艺包括但不限于：平版印刷术；刻蚀技术，诸如湿化学法、干法和光致抗蚀剂脱除法；微机电(MEMS)技术，包括微流体/芯片实验室、光学MEMS(亦称MOEMS)、RFMEMS、PowerMEMS和BioMEMS技术，以及深反应离子刻蚀(DRIE)；纳米机电(NEMS)技术；硅的热氧化；电镀和无电镀；扩散过程，诸如硼、磷、砷和锑扩散；离子注入；薄膜沉积，诸如蒸发(细丝、电子束、闪光、遮蔽和阶梯覆盖)、溅射、化学汽相沉积(CVD)、外延(汽相、液相和分子束)、电镀、丝网印刷和层压。总体参见Jaeger,IntroductiontoMicroelectronicFabrication(Addison-WesleyPublishingCo.,ReadingMass.1988)；Runyan等人,SemiconductorIntegratedCircuitProcessingTechnology(Addison-WesleyPublishingCo.,ReadingMass.1990)；ProceedingsoftheIEEEMicroElectroMechanicalSystemsConference1987-1998；Rai-Choudhury编著,HandbookofMicrolithography,Micromachining&Microfabrication(SPIEOpticalEngineeringPress,Bellingham,Wash.1997)。

在一方面，具有多个解析座位的基底可使用本领域中已知的任何方法制成。在一些实施方案中，具有多个解析座位的基底的材料可为半导体基底，诸如二氧化硅。基底的材料还可为其他III-V族或II-VI族化合物材料，诸如砷化镓(GaAs)——一种通过丘克拉斯基法(Czochralskiprocess)生产的半导体(Grovenor,C.(1989).MicroelectronicMaterials.CRCPress.pp.113–123)。该材料可呈现硬的平面，该平面展现出针对与其表面相接触的溶液的反应性氧化物(–OH)基团的均匀覆盖。这些氧化物基团可作为后续硅烷化过程的附着点。或者，可以沉积模拟硅氧化物的刻蚀特性的亲脂性和疏水性表面材料。根据本发明各个实施方案，还可利用氮化硅和碳化硅表面来制造合适的基底。

在一些实施方案中，可在基底上沉积钝化层，该钝化层可具有或者可不具有反应性氧化物基团。钝化层可包含氮化硅(Si₃N₄)或聚酰亚胺(polymide)。在一些情况下，可使用光刻步骤来限定在钝化层上形成解析座位的区域。

用于生产具有多个解析座位的基底的方法可由基底开始。基底(例如，硅)可具有安置于其上的任何数目的层，包括但不限于诸如金属等导电层。在一些情况下，该导电层可为铝。在一些情况下，基底可具有保护层(例如，氮化钛)。在一些情况下，基底可具有拥有高表面能的化学层。所述层可借助于各种沉积技术来沉积，所述沉积技术诸如有：化学汽相沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD、等离子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热丝CVD(HWCVD)、引发CVD(iCVD)、改进型CVD(MCVD)、汽相轴向沉积(VAD)、外汽相沉积(OVD)以及物理汽相沉积(例如，溅射沉积、蒸发沉积)。

在一些情况下，在基底上沉积氧化物层。在一些情况下，该氧化物层可包含二氧化硅。二氧化硅可使用原硅酸四乙酯(TEOS)、高密度等离子体(HDP)或者其任何组合来沉积。

在一些情况下，可使用低温技术来沉积二氧化硅。在一些情况下，该工艺是二氧化硅的低温化学汽相沉积。温度一般低至足以使芯片上预先存在的金属不受损坏。沉积温度可为约50℃、约100℃、约150℃、约200℃、约250℃、约300℃、约350℃等。在一些实施方案中，沉积温度低于约50℃、低于约100℃、低于约150℃、低于约200℃、低于约250℃、低于约300℃、低于约350℃等。沉积可在任何合适的压力下进行。在一些情况下，沉积工艺使用RF等离子能。

在一些情况下，通过干燥热生长氧化物程序(例如，可使用接近或超过1000℃温度的程序)来沉积氧化物。在一些情况下，通过湿蒸汽工艺来产生硅氧化物。

二氧化硅可沉积到适合于制造本文其他部分进一步详细描述的合适的微结构的厚度。

二氧化硅可沉积到任何合适的厚度。在一些实施方案中，二氧化硅层可具有至少或至少约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、300nm、400nm或500nm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm或更大的厚度。二氧化硅层可具有至多或至多约2.0μm、1.9μm、1.8μm、1.7μm、1.6μm、1.5μm、1.4μm、1.3μm、1.2μm、1.1μm、1.0μm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、9nm、8、nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm或更小的厚度。二氧化硅层可具有1.0nm-2.0μm、1.1-1.9μm、1.2-1.8nm、1.3-1.7μm、1.4-1.6μm的厚度。本领域技术人员知晓，二氧化硅层可具有处于由任何这些值所约束的任何范围内的厚度，例如(1.5-1.9μm)。二氧化硅可具有处于由充当范围的端点的任何值所限定的任何范围内的厚度。解析座位(例如，微通道或微孔)可使用本领域中已知的各种制造技术创建在二氧化硅基底中。此类技术可包括半导体制造技术。在一些情况下，使用光刻技术(诸如在半导体行业中使用的技术)创建解析座位。例如，可向二氧化硅上涂覆(例如通过晶片的旋涂)光致抗蚀剂(例如，当暴露于电磁辐射时会改变性质的材料)以达到任何合适的厚度。可将包括光致抗蚀剂的基底暴露于电磁辐射源。可以使用掩模来从光致抗蚀剂的一些部分屏蔽辐射，以便限定解析座位的区域。光致抗蚀剂可为负性抗蚀剂或正性抗蚀剂(例如，可将解析座位的区域暴露于电磁辐射，或者可将除解析座位之外的区域暴露于如由掩模所限定的电磁辐射)。将覆盖要在其中创建解析座位的位置的区域暴露于电磁辐射，以限定对应于二氧化硅层中的解析座位的位置和分布的图案。光致抗蚀剂可通过限定与解析座位相对应的图案的掩模而暴露于电磁辐射。接下来，可例如借助于洗涤操作(例如，去离子水)来移除光致抗蚀剂的暴露部分。继而可将掩模的被移除部分暴露于化学刻蚀剂，以刻蚀基底并将解析座位的图案转移到二氧化硅层中。刻蚀剂可包括酸，例如，硫酸(H₂SO₄)。可通过各向异性的方式来刻蚀二氧化硅层。使用本文所述的方法，可应用诸如DRIE等高各向异性制造方法来在基底上或基底内制造微结构，诸如包含合成座位的微孔或微通道，其中所述微结构具有垂直相对于基底的表面偏离小于约±3°、2°、1°、0.5°、0.1°或更小的侧壁。可以实现小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1μm或更小的底切值，从而产生高度均匀的微结构。

可以使用各种刻蚀程序来在待形成解析座位的区域中刻蚀二氧化硅。刻蚀可以是各向同性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率等于或基本上等于沿着正交方向的刻蚀速率)，或各向异性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率低于沿着正交方向的刻蚀速率)，或者它们的变化形式。刻蚀技术可以是湿法硅刻蚀(诸如KOH、TMAH、EDP等)，和干法等离子体刻蚀(例如DRIE)。这两者都可用于通过互连来刻蚀微结构晶片。

在一些情况下，各向异性刻蚀移除解析座位的大部分体积。可以移除解析座位的体积的任何合适的百分比，包括约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。在一些情况下，在各向异性刻蚀中移除至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的材料。在一些情况下，在各向异性刻蚀中移除至多约60％、至多约70％、至多约80％、至多约90％或至多约95％的材料。在一些实施方案中，各向异性刻蚀不贯穿基底移除二氧化硅材料。根据一些实施方案，使用各向同性刻蚀来贯穿基底移除材料从而创造出孔穴。

在一些情况下，使用光刻步骤来刻蚀出孔以限定解析座位，随后进行混合干-湿刻蚀。光刻步骤可包括用光致抗蚀剂涂覆二氧化硅，以及通过具有限定解析座位的图案的掩模(或中间掩模(reticle))来将光致抗蚀剂暴露于电磁辐射。在一些情况下，混合干-湿刻蚀包括：(a)干法刻蚀，以移除位于通过光刻步骤在光致抗蚀剂中所限定出的解析座位的区域中的大部分二氧化硅；(b)清洗基底；以及(c)湿法刻蚀，以从基底的解析座位的区域中移除剩余的二氧化硅。

基底可借助于等离子体刻蚀化学或者暴露于氧化剂而得到清洗，该氧化剂例如为H₂O₂、O₂、O₃、H₂SO₄或它们的组合，诸如H₂O₂和H₂SO₄的组合。清洗可包括移除残留聚合物、移除可能阻碍湿法刻蚀的材料，或者它们的组合。在一些情况下，清洗为等离子体清洗。清洗步骤可进行任何合适的时间段(例如，15至20秒)。在一个示例中，清洗可使用具有100mT、200W、20G、20O₂的设置的AppliedMaterialseMAx-CT机器进行20秒。

干法刻蚀可为基本上垂直地(例如，朝向基底)而非横向地或基本上横向地(例如，平行于基底)进行刻蚀的各向异性刻蚀。在一些情况下，干法刻蚀包括用诸如CF₄、CHF₃、C₂F₆、C₃F₆或其任意组合等基于氟的刻蚀剂来进行刻蚀。在一个实例中，刻蚀使用具有100mT、1000W、20G和50CF4的设置的AppliedMaterialseMax-CT机器进行400秒。本文所述的基底可通过深反应性离子刻蚀(DRIE)来刻蚀。DRIE是一种高度各向异性的刻蚀工艺，用于在晶片/基底中创造出通常具有高宽深比的深穿透、陡边孔穴和沟槽。可以使用两种主要的高速率DRIE技术刻蚀基底：低温技术和Bosch技术。美国专利号5501893中描述了应用DRIE的方法，该专利通过引用而全文并入本文。

湿法刻蚀可为在所有方向上移除材料的各向同性刻蚀。在一些情况下，湿法刻蚀对光致抗蚀剂进行底切。底切光致抗蚀剂可使光致抗蚀剂在后续步骤中更容易移除(例如，光致抗蚀剂“剥离”)。在一个实施方案中，湿法刻蚀为缓冲氧化物刻蚀(BOE)。在一些情况下，使用可被(例如，利用氟化铵)缓冲以减慢刻蚀速率的氢氟酸基质在室温下进行湿法氧化物刻蚀。刻蚀速率可取决于被刻蚀的膜以及HF和/或NH₄F的比浓度。完全移除氧化物层所需的刻蚀时间通常凭经验确定。在一个实例中，在22℃下，以15:1的BOE(缓冲氧化物刻蚀)进行刻蚀。

二氧化硅层可被刻蚀至深达下面的材料层。例如，可刻蚀二氧化硅层直至氮化钛层。

在一方面，用于制备具有多个解析座位的基底的方法包括：使用(a)光刻步骤以限定解析座位；(b)干法刻蚀以移除通过光刻步骤所限定的解析座位的区域中的大部分二氧化硅；以及(c)湿法刻蚀以从基底的解析座位的区域中移除剩余的二氧化硅，向诸如包含涂覆于其上的二氧化硅层的硅基底之类的基底中刻蚀出诸如微孔或微通道等解析座位。在一些情况下，该方法还包括移除残留聚合物、移除可阻碍湿法刻蚀的材料，或者它们的组合。该方法可包括等离子体清洗步骤。

在一些实施方案中，在光刻步骤或一些情况下的混合干-湿刻蚀之后，不从二氧化硅移除光致抗蚀剂。留下光致抗蚀剂可用于在后续步骤中将金属选择性地引导至解析座位中，而不是二氧化硅层的上表面上。在一些情况下，基底涂覆有金属(例如，铝)，并且湿法刻蚀不移除金属上的某些成分，例如，保护金属免遭腐蚀的成分(例如，氮化钛(TiN))。然而在一些情况下，可例如借助于化学机械平坦化(CMP)而移除光致抗蚀剂层。

基底的差异功能化

如本文所述，表面(例如硅片的表面)的功能化可指材料的表面性质通过在表面上沉积化学种类而得到改变的任何方法。实现功能化的常见方法是通过化学汽相沉积对有机硅烷分子的沉积。这还可以在湿法硅烷化方法中完成。

差异功能化(也常被称为“选择性区域沉积”或“选择性区域功能化”)可指在单片结构上产生两个或更多个不同区域的任何方法，该单片结构中至少一个区域具有不同于同一结构上的其他区域的表面或化学性质。所述性质包括但不限于表面能、化学终止、化学部分的表面浓度等。所述不同的区域可以是连续的。

活化功能化(activefunctionalization)可指将参与一些下游生产步骤如DNA合成或DNA或蛋白质结合的表面的功能化。因此，选择如本文别处所述或本领域已知的合适的功能化方法以允许具体的下游产生步骤在表面上发生。

钝化功能化(passivefunctionalization)可指将使得那些区域在活性区域的主要功能方面失效的表面的功能化。例如，如果活化功能化被设计为结合DNA，则被钝化功能化的区域将不结合DNA。

光致抗蚀剂通常是指在标准工业方法诸如光刻术中常用以形成图案化的涂层的光敏材料。它作为液体被施加，但是当混合物中的挥发性溶剂蒸发时它在基底上凝固。它可在旋转涂布法中作为薄膜(1um至100um)被施加至平面基底。它可通过将其暴露于穿过掩模或中间掩模的光，改变它在显影剂中的溶解速率来图案化。这可能是“正面的”(曝光增加溶解)或“负面的”(曝光降低溶解)。它可用作牺牲层，充当用于修饰下面基底的后续步骤(诸如刻蚀)的阻挡层。一旦修饰完成，即去除抗蚀剂。

光刻术可指用于对基底进行图案化的方法。常见的基本过程包括1)将光致抗蚀剂施加至基底，2)将抗蚀剂暴露于穿过二元掩模的光，该二元掩模在一些区域不透明而在其他区域透明，以及随后3)使抗蚀剂显影，这导致基于哪些区域被暴露而使抗蚀剂得到图案化。显影后，图案化的抗蚀剂充当掩模以用于后续的处理步骤，诸如刻蚀、离子注入或沉积。处理步骤之后，通常去除抗蚀剂，例如经由等离子体剥离或湿法化学去除。

在多个实施方案中，采用使用光致抗蚀剂的方法，其中光致抗蚀剂促进具有差异功能化的基底的制造。

一系列的制造步骤可构成差异功能化方法的基线，其中根据本发明的多个实施方案，个别步骤可被修改、去除或用附加步骤补充以在表面上实现所需的功能化图案。首先，目标表面的初始制备可通过例如化学清洗实现，并可包括初始活化或钝化表面功能化。

第二，光致抗蚀剂的施加可通过多种不同的技术实现。在多个实施方案中，抗蚀剂向结构的不同部分的流动通过结构的设计来控制，例如通过利用流体在结构的不同点处诸如在锐利阶跃边缘处的固有阻塞特性。一旦抗蚀剂的运输溶剂蒸发，则光致抗蚀剂留下固体膜。

第三，光刻术可任选地用来去除在基底的某些特定区域中的抗蚀剂，使得这些区域可进一步得到修饰。

第四，可以使用等离子体除渣—一种通常为使用例如氧等离子体的短的等离子体清洗步骤—来促进抗蚀剂清除区域中任何残余的有机污染物的去除。

第五，可以在抗蚀剂覆盖的区域受到针对任何活化或钝化功能化的保护的同时对所述表面进行功能化。本文所述或本领域已知的改变表面的化学性质的任何合适的方法可用来使表面功能化，例如有机硅烷的化学汽相沉积。通常，这导致功能化物质的自组装单层(SAM)的沉积。

第六，可剥离并去除抗蚀剂，例如通过使其溶解在合适的有机溶剂中、等离子体刻蚀、曝光和显影等，从而暴露已被抗蚀剂覆盖的基底的区域。在一些实施方案中，选择不会去除功能化基团或以其他方式破坏功能化表面的方法用于抗蚀剂剥离。

第七，可任选进行涉及活化或钝化功能化的第二功能化步骤。在一些实施方案中，通过第一功能化步骤功能化的区域阻止在第二功能化步骤中使用的功能化基团的沉积。

在多个实施方案中，差异功能化促进在芯片上的区域的空间控制，在该芯片上合成DNA。在一些实施方案中，差异功能化提供了改善的灵活性，以控制芯片的流体特性。在一些实施方案中，因此，寡核苷酸从寡核苷酸合成装置转移到纳米孔装置的过程通过差异功能化而得到改善。在一些实施方案中，差异功能化提供装置例如纳米反应器或寡核苷酸合成装置的制造，其中如本文别处所述，孔或通道的壁是相对亲水的，而如本文别处所述，外部表面是相对疏水的。

图36示出了根据本发明的多个实施方案，差异功能化在微流体装置上的示例性应用。活化和钝化功能化区域用不同的阴影表示。特别地，在这些实例中使用与它们连接形成所谓的转轮图案的第一通道(通孔)和第二通道，以示出三维的差异功能化。除了帮助控制抗蚀剂的施加的少数指导外，这些示例性基底内三维特征的特定布局对于功能化方法在很大程度上是不重要的。

图37示出了用于生成在图37B-D中示出的差异功能化图案的示例性工作流程。因此，可以首先清洗基底，例如使用水虎鱼洗液(piranhasolution)，然后是O₂等离子体暴露(图37A)。可将光致抗蚀剂施加至装置层，埋置第二通道(又称为转轮；图37B)。使用对于图案合适的掩模，光刻术和/或等离子体除渣步骤可用来在基底上生成所需的光致抗蚀剂图案(图37C)。掩模图案可以改变，以控制光致抗蚀剂在哪里停留和在哪里被清除。可进行例如采用氟硅烷、烃硅烷或形成可使表面钝化的有机层的任何基团的功能化步骤，以限定装置上被钝化功能化的区域(图37D)。可使用本文别处所述或本领域已知的合适方法来剥离抗蚀剂(图37E)。一旦去除抗蚀剂，即可对暴露的区域进行活化功能化，留下所需的差异功能化图案(图37F)。

在多个实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及用于在选择性区域中生成改变的表面性质的光致抗蚀剂的施加，其中光致抗蚀剂的施加依赖于基底的流体特性，其限定光致抗蚀剂的空间分布。在不受理论束缚的情况下，与所用流体有关的表面张力效应可限定光致抗蚀剂的流动。例如，表面张力和/或毛细作用效应可促进在抗蚀剂溶剂蒸发之前以受控制的方式将光致抗蚀剂吸入小结构(图38)。在一个实施方案中，抗蚀剂接触点被锐利边缘阻塞住，从而控制流体的前进。可基于用于在制造和功能化方法期间施加光致抗蚀剂的所需的流型来设计底层结构。溶剂蒸发后留下的固体有机层可用来继续进行制造方法的后续步骤。

基底可被设计为通过促进或抑制通向邻近的流体路径内的芯吸效应来控制流体的流动。例如，图39A示出了避免顶部与底部边缘之间的重叠的设计，这帮助将流体保持在顶部结构中，以允许抗蚀剂的特定沉积。相反，图39B示出了供替代的设计，其中顶部与底部边缘重叠，导致所用流体芯吸至底部结构内。可根据所需的抗蚀剂的施加相应地选择合适的设计。

图40示出了根据在图40C中示出的小盘状光致抗蚀剂图案经受抗蚀剂的装置在光刻术之后的亮视野(A)和暗视野(B)图像。

图41示出了根据在图41C中示出的完整盘状光致抗蚀剂图案经受抗蚀剂的装置在光刻术之后的亮视野(A)和暗视野(B)图像。

图42示出了根据在图42C中的图案进行功能化的装置在钝化功能化和剥离抗蚀剂之后的亮视野(A)和暗视野(B)图像。

图43示出了根据图43C中的图案，使用二甲基亚砜(DMSO)作为流体，在亮视野(A)和暗视野(B)图像中的差异功能化表面的不同流体特性。使用被疏水区域包围的转轮内的亲水表面实现转轮的自发润湿。

图44示出了用于生成图36F中示出的差异功能化图案的另一示例性工作流程。相应地，可以首先清洗基底，例如使用水虎鱼洗液，然后是O₂等离子体暴露(图44A)。可进行例如采用氟硅烷、烃硅烷或可以形成可使表面钝化的有机层的任何基团的功能化步骤，以限定装置上钝化功能化的区域(图44B)。可将光致抗蚀剂施加至装置层，埋置第二通道(又称为转轮；图44C)。使用对于图案合适的掩模，光刻术和/或刻蚀步骤可用来在基底上生成所需的光致抗蚀剂图案(图44D)。掩模图案可以改变，以控制光致抗蚀剂在哪里停留和在哪里被清除。可使用本文别处所述或本领域已知的合适方法剥离抗蚀剂(图44E)。一旦去除抗蚀剂，即可对暴露的区域进行活化功能化，以留下所需的差异功能化图案(图44F)。

在另一实施方案中，设计功能化工作流程，使得抗蚀剂从通孔(底)侧施加，并流入通孔和转轮。可对外表面上的暴露区域进行功能化。可使用平版印刷术或刻蚀将抗蚀剂从例如装置的背(底)侧去除，以允许在暴露区域中进行活化功能化，从而产生图36E中描述的图案。

在又一实施方案中，可在如图39B所示的通孔与转轮通道边缘之间选择重叠设计。抗蚀剂可从前(顶)侧施加，以将流体芯吸至通孔。钝化功能化、抗蚀剂的剥离及随后的活化功能化将引起图36E示出的图案的制作。

包括基本上为平面的基底部分的示例性微流体装置被显示为图25D中的示图。图25E中示出了该示图的横截面。基底包括多个聚簇，其中每个聚簇包括多个分组的微流体连接。每个分组包括从第一通道延伸的多个第二通道。图25A是包括高密度分组的聚簇的装置视图。图25C是图25A的聚簇的处理视图。图25B是图25的剖视图。

分组聚簇可布置成任何数目的构型。在图25A中，分组布置成偏移的行，以形成圈状图案的聚簇。图25C描绘了多个这样的聚簇在示例性微流体装置上的布置。在一些实施方案中，单个聚簇被包含在单个聚簇区域内，所述聚簇区域的内部形成凸集(convexset)。在一些实施方案中，单个聚簇区域互不重叠。单个聚簇区域可为圆形或任何其他合适的多边形，例如，三角形、正方形、矩形、平行四边形、六边形等。如2503所表示，从每个分组的中心测量，三行分组之间的示例性距离可为约0.05mm至约1.25mm。2、3、4、5行或更多行的分组之间的距离可约为或至少约为0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm、0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.2mm或1.3mm。2、3、4、5行或更多行的分组之间的距离可约为或至多约为1.3mm、1.2mm、1.1mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.75mm、0.65mm、0.6mm、0.55mm、0.5mm、0.45mm、0.4mm、0.35mm、0.3mm、0.25mm、0.2mm、0.15mm、0.1mm、0.05mm或更小。2、3、4、5行或更多行的分组之间的距离的范围可在0.05-1.3mm、0.1-1.2mm、0.15-1.1mm、0.2-1mm、0.25-0.9mm、0.3-0.8mm、0.35-0.8mm、0.4-0.7mm、0.45-0.75mm、0.5-0.6mm、0.55-0.65mm或0.6-0.65mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如，0.05mm-0.8mm。如2506所示，从每个分组的中心测量，在一行分组中的两个分组之间的示例性距离可为约0.02mm至约0.5mm。在一行分组中的两个分组之间的距离可约为或至少约为0.02mm、0.04mm、0.06mm、0.08mm、0.1mm、0.12mm、0.14mm、0.16mm、0.18mm、0.2mm、0.22mm、0.24mm、0.26mm、0.28mm、0.3mm、0.32mm、0.34mm、0.36mm、0.38mm、0.4mm、0.42mm、0.44mm、0.46mm、0.48mm或0.5mm。在一行分组中的两个分组之间的距离可约为或至多约为0.5mm、0.48mm、0.46mm、0.44mm、0.42mm、0.4mm、0.38mm、0.36mm、0.34mm、0.32mm、0.3mm、0.28mm、0.26mm、0.24mm、0.22mm、0.2mm、0.18mm、0.16mm、0.14mm、0.12mm、0.1mm、0.08mm、0.06mm、0.04mm或0.02mm或者更小。两个分组之间的距离的范围可在0.02-0.5mm、0.04-0.4mm、0.06-0.3mm或0.08-0.2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如，0.04mm-0.2mm。

每个分组的第一通道和第二通道的长度和宽度可根据实验条件进行优化。在一些实施方案中，如2504所表示，分组中的第一通道的横截面约为或至少约为0.01mm、0.015mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm、0.04mm、0.045mm、0.05mm、0.055mm、0.06mm、0.065mm、0.07mm、0.075mm、0.08mm、0.085mm、0.09mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm或0.5mm。在一些实施方案中，分组中的第一通道的横截面约为或至多约为0.5mm、0.45mm、0.4mm、0.35mm、0.3mm、0.25mm、0.2mm、0.15mm、0.1mm、0.09mm、0.085mm、0.08mm、0.075mm、0.07mm、0.065mm、0.06mm、0.055mm、0.05mm、0.045mm、0.04mm、0.035mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.015mm或0.01mm或更小。分组中的第一通道的横截面的范围可在0.01-0.5mm、0.02-0.45mm、0.03-0.4mm、0.04-0.35mm、0.05-0.3mm、0.06-0.25或0.07-0.2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.04mm-0.2mm。在一些实施方案中，如2505所表示，分组中的第二通道的横截面约为或至少约为0.001mm、0.002mm、0.004mm、0.006mm、0.008mm、0.01mm、0.012mm、0.014mm、0.016mm、0.018mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm、0.04mm、0.045mm、0.05mm、0.055mm、0.06mm、0.065mm、0.07mm、0.075mm或0.08mm。在一些实施方案中，分组中的第二通道的横截面约为或至多约为0.08mm、0.075mm、0.07mm、0.065mm、0.06mm、0.055mm、0.05mm、0.045mm、0.04mm、0.035mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.018mm、0.016mm、0.014mm、0.012mm、0.01mm、0.008mm、0.006mm、0.004mm、0.002mm、0.001mm或更小。分组中的第二通道的横截面的范围可在0.001-0.08mm、0.004-0.07mm、0.008-0.06mm、0.01-0.05mm、0.015-0.04mm、0.018-0.03mm或0.02-0.025mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.008mm-0.04mm。图25B描述了包括一行11个分组的聚簇的示例性横截面。在一些实施方案中，每个分组中的第二通道的高度约为或至少约为0.005mm、0.008mm、0.01mm、0.015mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.1mm、0.12mm、0.14mm、0.16mm、0.18mm或0.2mm长。在一些实施方案中，如2501所示，每个分组中的第二通道的高度约为或至多约为0.2mm、0.18mm、0.16mm、0.14mm、0.12mm、0.1mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.015mm、0.01mm、0.008mm或0.005mm长。每个分组中的第二通道的高度的范围可在0.005-0.2mm、0.008-.018mm、0.01-0.16mm、0.015-0.1mm、0.02-0.08mm或0.025-0.04mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.01mm-0.04mm。在一些实施方案中，如2502所示，每个分组内的第一通道的高度约为或至多约为5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1.0mm、0.8mm、0.5mm、0.4mm、0.375mm、0.35mm、0.3mm、0.275mm、0.25mm、0.225mm、0.2mm、0.175mm、0.15mm、0.125mm、0.1mm、0.075mm或0.05mm。在一些实施方案中，如2502所示，每个分组内的第一通道的高度约为或至少约为0.05mm、0.075mm、0.1mm、0.125mm、0.15mm、0.175mm、0.2mm、0.225mm、0.25mm、0.275mm、0.3mm、0.325mm、0.35mm、0.375mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。每个分组内的第一通道的高度的范围可在0.05-5mm、0.075-4mm、0.1-3mm、0.15-2mm、0.2-1mm或0.3-0.8mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-1mm。

分组的聚簇可布置成适合于在如图25D所示的微流体装置的基本上为平面的基底部分的单一反应孔中放置的构型。图25D是包括108个反应孔的微流体装置的基本上为平面的基底部分的示图，其中每个反应孔包括多个分组。基底可包括任何数目的孔，包括但不限于在约2至约250之间的任何数目。在一些实施方案中，孔的数目包括从约2个至约225个孔、从约2个至约200个孔、从约2个至约175个孔、从约2个至约150个孔、从约2个至约125个孔、从约2个至约100个孔、从约2个至约75个孔、从约2个至约50个孔、从约2个至约25个孔、从约25个至约250个孔、从约50个至约250个孔、从约75个至约250个孔、从约100个至约250个孔、从约125个至约250个孔、从约150个至约250个孔、从约175个至约250个孔、从约200个至约250个孔或者从约225个至约250个孔。本领域技术人员知晓，孔的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-125个。另外，每个孔可包括任何数目的分组的聚簇，包括但不限于在约2个到约250个分组之间的任何数目。在一些实施方案中，聚簇包含从约2个至约225个分组、从约2个至约200个分组、从约2个至约175个分组、从约2个至约150个分组、从约2个至约125个分组、从约2个至约100个分组、从约2个至约75个分组、从约2个至约50个分组、从约2个至约25个分组、从约25个至约250个分组、从约50个至约250个分组、从约75个至约250个分组、从约100个至约250个分组、从约125个至约250个分组、从约150个至约250个分组、从约175个至约250个分组、从约200个至约250个分组或者从约225个至约250个分组。本领域技术人员知晓，分组的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-125个。作为示例，图25D中所示基底的108个孔中的每个孔可包括图25A中所示的109个分组的聚簇，从而产生存在于微流体装置的基本上为平面的基底部分中的11772个分组。

图25D包括由0,0(X,Y)轴所指示的参考原点，其中示出了微流体装置的示例性的基本上为平面的基底部分的左下角。在一些实施方案中，如2508所表示，从原点测量，基本上为平面的基底的宽度沿着一个维度为从约5mm至约150mm。在一些实施方案中，如2519所表示，从原点测量，基本上为平面的基底的宽度沿着另一维度为从约5mm至约150mm。在一些实施方案中，基底在任何维度上的宽度为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或者从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该宽度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-100mm。图25D中所示的基本上为平面的基底部分包括108个分组聚簇。所述聚簇可布置成任何配置。在图25D中，聚簇布置成行，从而形成正方形。无论如何布置，在X轴或Y轴上测量，聚簇均可开始于离原点约0.1mm至约149mm的距离处。长度2518和2509分别表示聚簇中心在X轴和Y轴上的最远距离。长度2517和2512分别表示聚簇中心在X轴和Y轴上的最近距离。在一些实施方案中，聚簇布置成使得存在两个聚簇之间的重复距离。如2507和2522所示，两个聚簇之间的距离可相距约0.3mm至约9mm。在一些实施方案中，两个聚簇之间的距离约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，两个聚簇之间的距离约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。两个聚簇之间的距离的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。

可以在本文所述的微流体装置上放置基准标记，以促进这样的装置与系统的其他组件的对准。本发明的微流体装置可具有一个或多个基准标记，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基准标记。图25D中所示的示例性微流体装置的基本上为平面的基底部分包括三个对于将装置与系统的其他组件对准有用的基准标记。基准标记可位于微流体装置的基本上为平面的基底部分内的任何位置。如2513和2516所示，基准标记可位于原点附近，其中基准标记比任一聚簇都更加靠近原点。在一些实施方案中，如2511和2521所示，基准标记位于基底部分的边缘附近，其中离边缘的距离分别由2510和2520所指示。基准标记可位于离基底部分的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离基底部分的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离基底部分约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。基准标记可位于离基底的边缘0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm处。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。基准标记可位于距离靠近聚簇之处，其中2515和2514分别指示出示例性X轴距离和Y轴距离。在一些实施方案中，聚簇与基准标记之间的距离约为或至少约为0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm或8mm。在一些实施方案中，聚簇与基准标记之间的距离约为或至多约为8mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.7mm、2.5mm、2.2mm、2mm、1.7mm、1.5mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.02mm、0.01mm、0.005mm或0.001mm。聚簇与基准标记之间的距离的范围可在0.001-8mm、0.01-7mm、0.05-6mm、0.1-5mm、0.5-4mm、0.6-3mm、0.7-2mm或0.8-1.7mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。

图25E描绘了图25D中所示的示例性微流体装置的基本上为平面的基底部分的横截面。该截面示出了一行11个分组，各自包括分组聚簇，其中每个分组包括从第一通道延伸的多个第二通道。如2523所示例，分组的总长度可为从约0.05mm至约5mm长。在一些实施方案中，分组的总长度约为或至少约为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm、3mm、3.2mm、3.5mm、3.7mm、4mm、4.2mm、4.5mm、4.7mm或5mm。在一些实施方案中，分组的总长度约为或至多约为5mm、4.7mm、4.5mm、4.2mm、4mm、3.7mm、3.5mm、3.2mm、3mm、2.7mm、2.5mm、2.2mm、2mm、1.7mm、1.5mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm或0.05mm或者更小。分组的总长度的范围可在0.05-5mm、0.06-4mm、0.07-3mm、0.08-2mm、0.09-1mm、0.1-0.9mm、0.2-0.8mm或0.3-0.7mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1-0.7mm。在一些实施方案中，如描绘微流体装置中的聚簇的示例性布局的图25F中所示例，微流体装置可具有用于标签或序号标签的位置。如距离2603所示例，标签可位于基底的边缘附近。在一些实施方案中，标签位于离基底的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，标签位于离基底的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，标签位于离基底的边缘约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。该距离可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm、0.9-2mm或1.5mm之间的范围内。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。如2602所示例，标签可开始于离原点约0.1mm至约20mm的位置。如2601所示例，标签的长度可为约1mm至约32mm。

用于高质量(mass)寡核苷酸合成的具有大尺寸通孔的晶片

在一些实施方案中，本发明提供了用于表面上寡核苷酸合成的受控制的流动和质量转移路径的方法和系统。本文提供的系统和方法的优势允许针对在寡核苷酸合成过程中受控制的且均匀分布的质量转移路径、化学暴露次数和洗涤功效改进结构水平。此外，本文所述的方法和系统允许增加波及效率(sweepefficiency)，诸如通过提供足以用于生长的寡核苷酸的体积，使得由生长的寡核苷酸排除的体积占可用于或适合于生长寡核苷酸的初始可用体积的不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。另外，本文所述的方法和系统允许足够的结构，该结构足以使寡聚体的生长超过80聚体至100、120、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500-聚体或更长。

因此，本文所述的方法和系统提供了实现这些优势的解决方案，诸如小的平行通道的收集。诸如小通孔的结构可用来为较小的结构进料，诸如在“转轮图案”中发现的那些(图56B)。在内表面上具有低表面能表面的结构可使气体挂在壁上。气泡可在寡核苷酸合成循环或用于基因组装的后续水性步骤过程中妨碍流速和流动均匀性。因此，适合于寡核苷酸合成的结构可包含如本文别处所述的具有提高的表面能的表面。

在一些实施方案中，本发明的方法和系统利用硅片方法制造用于寡核苷酸合成的基底。这样的基底可具有经由沉积装置如喷墨可进行材料沉积的一系列位点。根据本发明多个实施方案制造的基底可支持在通过其平面的多个这样的位点之间共享的充溢化学步骤。在多个实施方案中，装置允许大量注入且汇集水性试剂(图61)。

在多个实施方案中，具有大通孔的这样的寡核苷酸合成装置在标准绝缘体上硅(SOI)硅片上创建。寡核苷酸合成装置可具有至少或至少约10微米(μm)、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm,750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm或更大的总宽度。寡核苷酸合成装置可具有至多或至多约1000μm、900μm、850μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、500μm、450μm、400μm、350μm、300μm、250μm、200μm、190μm、180μm、170μm、160μm、150μm、140μm、130μm、120μm、110μm、100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、19μm、18μm、17μm、16μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm或更小的总宽度。寡核苷酸合成装置可具有10-1000μm、11-950μm、12-900μm、13-850μm、14-800μm、15-750μm、16-700μm、17-650μm、18-600μm、19-550μm、20-500μm、25-450μm、30-400μm、35-350μm、40-300μm、45-250μm、50-200μm、55-150μm,60-140μm、65-130μm、70-120μm、75-110μm、70-100μm、75-80μm、85-90μm或90-95μm的总宽度。本领域技术人员知晓，寡核苷酸合成装置的总宽度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如20-80μm。寡核苷酸装置的总宽度可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。它可被细分为处理层和装置层。装置的全部或部分可被二氧化硅层覆盖。二氧化硅层可具有至少或至少约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、300nm、400nm、500nm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm或更大的厚度。二氧化硅层可具有至多或至多约2.0μm、1.9μm、1.8μm、1.7μm、1.6μm、1.5μm、1.4μm、1.3μm、1.2μm、1.1μm、1.0μm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、9nm、8、nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm或更小的厚度。二氧化硅层可具有1.0nm-2.0μm、1.1-1.9μm、1.2-1.8nm、1.3-1.7μm、1.4-1.6μm的厚度。本领域技术人员知晓，二氧化硅层可具有处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的厚度，例如(1.5-1.9μm)。二氧化硅可具有处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内的厚度。

如本文别处所述，装置层可包含适合寡核苷酸生长的多个结构，诸如多个小孔穴(图61)。装置层可具有至少或至少约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm或更大的厚度。装置层可具有至多或至多约500μm、400μm、300μm、200μm、100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、19μm、18μm、17μm、16μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小的厚度。装置层可具有1-100μm、2-95μm、3-90μm、4-85μm、5-80μm、6-75μm、7-70μm、8-65μm、9-60μm、10-55μm、11-50μm、12-45μm、13-40μm、14-35μm、15-30μm、16-25μm、17-20μm、18-19μm的厚度。本领域技术人员知晓，装置层的厚度可处于入由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如(20-60μm)。装置层的厚度可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。处理层和/或装置层可包括深的特征。这样的深特征可使用合适的MEMS技术如深反应离子刻蚀来制作。可使用一系列的刻蚀来构建所需的装置几何形状。刻蚀的其中之一可被允许持续较长时间并穿透绝缘体层。因此，可构建跨越装置的整个宽度的通道。这样的通道可用来将流体从基底(诸如基本上为平面的基底)的一个表面传递到另一个表面。

在一些实施方案中，装置层具有穿透装置层的至少两个且最多500个位点、至少2至约250个位点、至少2至约200个位点、至少2至约175个位点、至少2至约150个位点、至少2至约125个位点、至少2至约100个位点、至少2至约75个位点、至少2至约50个位点、至少2至约25个位点或至少2至约250个位点。在一些实施方案中，装置层具有至少或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30,50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500个或更多个位点。本领域技术人员知晓，穿透装置层的位点的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如75-150个位点。装置层可为至少或至少约2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm厚或更厚。装置层可为至多或至多约100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、19μm、18μm、17μm、16μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm厚或更薄。装置层可具有处于1-100μm、2-95μm、3-90μm、4-85μm、5-80μm、6-75μm、7-70μm、8-65μm、9-60μm、10-55μm、11-50μm、12-45μm、13-40μm、14-35μm、15-30μm、16-25μm、17-20μm、18-19μm的任何厚度。本领域技术人员知晓，装置层可具有可以处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的任何厚度，例如4-100μm。

装置层的厚度可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。处理层可具有蚀刻至晶片内的较大的区域，所述晶片与装置层中的特征邻近。处理层可具有至少或至少约10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm,750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm或更大的厚度。处理层可具有至多或至多约1000μm、950μm、900μm、850μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、500μm、450μm、400μm、350μm、300μm、250μm、200μm、150μm、100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、30μm、25μm、20μm、19μm、18μm、17μm、16μm、15μm、14μm,13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小的厚度。处理层可具有10-1000μm、11-950μm、12-900μm、13-850μm、14-800μm、15-750μm、16-700μm、17-650μm、18-600μm、19-550μm、20-500μm、25-450μm、30-400μm、35-350μm、40-300μm、45-250μm、50-200μm、55-150μm、60-140μm、65-130μm、70-120μm、75-110μm、70-100μm、75-80μm、85-90μm或90-95μm的任何厚度。本领域技术人员知晓，处理层可具有处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的厚度，例如20-350μm。处理层的厚度处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。

处理层中的刻蚀区域可形成埋置在基底中的孔状结构。在一些实施方案中，处理层内的刻蚀区可具有至少或至少约100μm、101μm、102μm、103μm、104μm、105μm、106μm、107μm、108μm、109μm,110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1000μm或更大的厚度。处理层内的刻蚀区可具有至多或至多约1000μm、950μm、900μm、850μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、500μm、450μm、400μm、350μm、300μm、250μm、200μm、190μm、180μm、170μm、160μm,150μm、140μm、130μm、120μm、110μm、109μm、108μm、107μm、106μm、105μm、104μm、103μm、102μm、101μm、100μm或更小的任何厚度。处理层内的刻蚀区域可具有100-1000μm、101-950μm、102-900μm、103-850μm、104-800μm、105-750μm、106-700μm、105-650μm、106-600μm、107-550μm、108-500μm、109-450μm、110-400μm、120-350μm、130-300μm、140-250μm、150-200μm、160-190μm、170-180μm的任何厚度。本领域技术人员知晓，处理层可具有处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的厚度，例如200-300μm。

处理层内刻蚀区域的形状可以是矩形的或曲线形的。

在一些实施方案中，处理层内的大的刻蚀区域允许在寡核苷酸合成循环过程中和/或寡核苷酸释放诸如寡核苷酸释放至气相的过程中气相很容易地转变为液相。

具有高表面积合成位点的基底

在多个实施方案中，本文所述的方法和系统涉及用于合成高质量的寡核苷酸的寡核苷酸合成装置。所述合成可以是平行的。例如，可以平行合成至少或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、10000、50000、100000个或更多个寡核苷酸。可以平行合成的寡核苷酸的总数可为2-100000、3-50000、4-10000、5-1000、6-900、7-850、8-800、9-750、10-700、11-650、12-600、13-550、14-500、15-450、16-400、17-350、18-300、19-250、20-200、21-150、22-100、23-50、24-45、25-40、30-35。本领域技术人员知晓，平行合成的寡核苷酸的总数可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-100。平行合成的寡核苷酸的总数可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。在装置内合成的寡核苷酸的总摩尔质量或寡核苷酸中的每一种的摩尔质量可为至少或至少约10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、25000、50000、75000、100000皮摩尔或更大。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可为至少或至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、300、400、500个核苷酸或更多。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可为至多或至多约500、400、300、200、150、100、50、45、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个核苷酸或更少。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可处于10-500、9-400、11-300、12-200、13-150、14-100、15-50、16-45、17-40、18-35、19-25之间。本领域技术人员知晓，寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如100-300。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。

在多个实施方案中，高表面积通过如图62中举例说明的建造具有凸起和/或凹陷特征的基底的表面来实现。凸起的或凹陷的特征可具有锐利或圆滑的边缘，并可具有任何所需的几何形状的横截面(宽度)，诸如矩形、圆形等。它们可沿着整个基底表面或其一部分形成通道。凸起的或凹陷的特征可具有至少或至少约1:20、2:20、3:20、4:20、5:20、6:20、10:20、15:20、20:20、20:10、20:5、20:1或更大的宽深比。凸起的或凹陷的特征可具有至多或至多约20:1、20:5、20:10、20:20、20:15、20:10、20:10、6:20、5:20、4:20、3:20、2:20、1:20或更小的宽深比。凸起的或凹陷的特征可具有处于1:20-20:1、2:20-20:5、3:20-20:10、4-20:20:15、5:20-20:20、6:20-20:20之间的宽深比。本领域技术人员知晓，凸起的或凹陷的特征可具有可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的宽深比，例如3:20-4:20。凸起的或凹陷的特征可具有处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内的宽深比。

凸起的或凹陷的特征可具有至少或至少约10纳米(nm)、11nm、12nm、20nm、30nm、100nm、500nm、1000nm、10000nm、100000nm、1000000nm或更大的横截面。凸起的或凹陷的特征可具有至少或至多或至多约1000000nm、100000nm、10000nm、1000nm、500nm、100nm、30nm、20nm、12nm、11nm、10nm或更小的横截面。凸起的或凹陷的特征可具有处于10nm-1000000nm、11nm-100000nm、12nm-10000nm、20nm-1000nm、30nm-500nm之间的横截面。本领域技术人员知晓，凸起的或凹陷的特征可具有可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的横截面，例如10nm-100nm。凸起的或凹陷的特征可具有处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内的横截面。

凸起的或凹陷的特征可具有至少或至少约10纳米(nm)、11nm、12nm、20nm、30nm、100nm、500nm、1000nm、10000nm、100000nm、1000000nm或更大的高度。凸起的或凹陷的特征可具有至多或至多约1000000纳米(nm)、100000nm、10000nm、1000nm、500nm、100nm、30nm、20nm、12nm、11nm、10nm或更小的高度。凸起的或凹陷的特征可具有处于10nm-1000000nm、11nm-100000nm、12nm-10000nm、20nm-1000nm、30nm-500nm之间的高度。本领域技术人员知晓，凸起的或凹陷的特征可具有可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的高度，例如100nm-1000nm。凸起的或凹陷的特征可具有处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内的高度。单独的凸起的或凹陷的特征可与邻近的凸起的或凹陷的特征分开至少或至少约5纳米(nm)、10nm、11nm、12nm、20nm、30nm、100nm、500nm、1000nm、10000nm、100000nm、1000000nm或更大的距离。单独的凸起的或凹陷的特征可与邻近的凸起的或凹陷的特征分开至多或至多约1000000纳米(nm)、100000nm、10000nm、1000nm、500nm、100nm、30nm、20nm、12nm、11nm、10nm、5nm或更小的距离。凸起的或凹陷的特征可具有处于5-1000000nm、10-100000nm、11-10000nm、12-1000nm、20-500nm、30-100nm之间的高度。本领域技术人员知晓，单独的凸起的或凹陷的特征可与邻近的凸起的或凹陷的特征分开一定的距离，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如100-1000nm。单独的凸起的或凹陷的特征可与邻近的凸起的或凹陷的特征分开一定的距离，该距离处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。在一些实施方案中，两个凸起的或凹陷的特征之间的距离为凸起的或凹陷的特征的横截面(宽度)或平均横截面的至少或至少约0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0倍或更大。两个凸起的或凹陷的特征之间的距离为凸起的或凹陷的特征的横截面(宽度)或平均横截面的至多或至多约10.0、5.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1倍或更小。两个凸起的或凹陷的特征之间的距离可为凸起的或凹陷的特征的横截面(宽度)或平均横截面的0.1-10、0.2-5.0、1.0-3.0倍。本领域技术人员知晓，两个凸起的或凹陷的特征之间的距离可为凸起的或凹陷的特征的横截面(宽度)或平均横截面的任何倍数，该倍数处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如5-10倍。两个凸起的或凹陷的特征之间的距离可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。

在一些实施方案中，凸起的或凹陷的特征的群组彼此分离。凸起的或凹陷的特征的群组的周长可用不同类型的结构特征或通过差异功能化进行标记。一组凸起的或凹陷的特征可专门用于单一寡核苷酸的合成。一组凸起的或凹陷的特征可跨越横截面为至少或至少约10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、20μm、50μm、70μm、90μm、100μm、150μm、200μm或更宽的区域。一组凸起的或凹陷的特征可跨越横截面为至多或至多约200μm、150μm、100μm、90μm、70μm、50μm、20μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm或更窄的区域。一组凸起的或凹陷的特征可跨越横截面为10-200μm、11-150μm、12-100μm、13-90μm、14-70μm、15-50μm、13-20μm宽的区域。本领域技术人员知晓，一组凸起的或凹陷的特征可跨越处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的区域，例如12-200μm。一组凸起的或凹陷的特征可跨越处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内的区域。

在多个实施方案中，基底上的凸起的或凹陷的特征使得用于寡核苷酸合成的总可用面积增加了至少或至少约1.1、1.2、1.3、1.4、2、5、10、50、100、200、500、1000倍或更多。基底上的凸起的或凹陷的特征使得用于寡核苷酸合成的总可用面积增加了1.1-1000、1.2-500、1.3-200、1.4-100、2-50、5-10倍。本领域技术人员知晓，基底上的凸起的或凹陷的特征可使得用于寡核苷酸合成的总可用面积增加由这些值中的任何值所限定的任何倍数，例如20-80倍。基底上的凸起的或凹陷的特征使得用于寡核苷酸合成的总可用面积增加了可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内的倍数。

使用大的寡核苷酸合成表面的本发明的方法和系统允许平行合成大量寡核苷酸，其中核苷酸添加循环时间为至多或至多约20min、15min、14min、13min、12min、11min、10min、1min、40sec、30sec或更少。使用大的寡核苷酸合成表面的本发明的方法和系统允许平行合成大量寡核苷酸，其中核苷酸添加循环时间为30sec-20min、40sec-10min、1min-10min。本领域技术人员知晓，使用大的寡核苷酸合成表面的本发明的方法和系统允许平行合成大量寡核苷酸，其中核苷酸添加循环时间为这些值中的任何值，例如30sec-10min。使用大的寡核苷酸合成表面的本发明的方法和系统允许平行合成大量寡核苷酸，其中核苷酸添加循环时间可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。

对于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更多的在基底上合成的寡核苷酸，或对于基底平均值，在基底上合成的每种寡核苷酸的总错误率或单个错误类型如缺失、插入或置换的错误率可为至多或至多约1:100、1:500、1:1000、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000、1:50000、1:60000、1:70000、1:80000、1:90000、1:1000000或更小。对于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更多的在基底上合成的寡核苷酸，或基底平均值，在基底上合成的每种寡核苷酸的总错误率或单个错误类型如缺失、插入或置换的错误率可以处于1:100至1:10000、1:500至1:30000之间。本领域技术人员知晓，对于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更多的在基底上合成的寡核苷酸，或基底平均值，在基底上合成的每种寡核苷酸的总错误率或单个错误类型如缺失、插入或置换的错误率可以处于这些值中的任何值之间，例如1:500至1:10000。对于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或更多的在基底上合成的寡核苷酸，或基底平均值，在基底上合成的每种寡核苷酸的总错误率或单个错误类型如缺失、插入或置换的错误率可以处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。

可采用标准硅片方法来创建基底，该基底将具有如上所述的高表面积和受控制的流动，从而允许化学暴露的快速交换。可用充分分开的一系列结构创建寡核苷酸合成基底，以允许合成大于至少或至少约20聚体、25聚体、30聚体、50聚体、100聚体、200聚体、250聚体、300聚体、400聚体、500聚体或更大的寡聚体链，而对总体通道或孔隙尺寸没有实质影响，例如由于随着寡核苷酸生长的排除体积效应。可用充分分开的一系列结构创建寡核苷酸合成基底，以允许合成大于至多或至多约500聚体、200聚体、100聚体、50聚体、30聚体、25聚体、20聚体或更小的寡聚体链，而对总体通道或孔隙尺寸没有实质影响，例如由于随着寡核苷酸生长的排除体积效应。可用充分分开的一系列结构创建寡核苷酸合成基底，以允许合成至少或至少约20聚体、50聚体、75聚体、100聚体、125聚体、150聚体、175聚体、200聚体、250聚体、300聚体、350聚体、400聚体、500聚体或更大的寡聚体链，而对总体通道或孔隙尺寸没有实质影响，例如由于随着寡核苷酸生长的排除体积效应。本领域技术人员知晓，可用充分分离的一系列结构创建寡核苷酸合成基底，以允许合成大于任何这些值之间例如20-300聚体、200聚体的寡聚体链，而对总体通道或孔隙尺寸没有实质影响，例如由于随着寡核苷酸生长的排除体积效应。

图62显示了根据具有结构阵列的本发明实施方案的示例性基底。特征之间的距离可大于至少或至少约5nm、10nm、20nm、100nm、1000nm、10000nm、100000nm、1000000nm或更大。特征之间的距离可大于至多或至多约1000000nm、100000nm、10000nm、1000nm、100nm、20nm、10nm、5nm或更小。特征之间的距离可以处于5-1000000nm、10-100000nm、20-10000nm、100-1000nm之间。本领域技术人员知晓，特征之间的距离可以处于这些值中的任何值之间，例如，20-1000nm。特征之间的距离可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。在一个实施方案中，特征之间的距离大于200nm。所述特征可通过本文别处所述或本领域已知的任何合适的MEMS方法创建，诸如采用定时反应离子刻蚀过程的方法。这样的半导体制造方法通常可创建小于200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、10nm、5nm或更小的特征尺寸。本领域技术人员知晓，小于200nm的特征尺寸可以在这些值中的任何之间，例如，20-100nm。特征尺寸可处于由充当范围端点的这些值中的任何值所限定的任何范围内。在一个实施方案中，40um宽的柱状物的阵列被刻蚀成30um深，这大概使可用于合成的表面积加倍。

凸起的或凹陷的特征的阵列可被隔离开，以允许通过亚磷酰胺化学法进行材料沉积，以便生成高度复杂且密集的文库。可通过较大的结构或通过表面的差异功能化实现这种隔离，以生成用于寡核苷酸合成的活化和钝化区域。或者，通过在一定条件下创建附接至表面的可裂解和不可裂解的寡核苷酸区域，单独的寡核苷酸的合成位置可彼此分离。可以使用诸如喷墨打印机等装置将试剂沉积在单独的寡核苷酸合成位置。差异功能化还可实现疏水性在基底表面上的交替出现，从而造成可引起沉积的试剂结珠或润湿的水接触角效应。采用较大的结构可减少飞溅和邻近斑点的试剂对单独的寡核苷酸合成位置的交叉污染。

反应器

在另一方面，本文描述了包围体阵列。该包围体阵列可包含多个解析反应器，所述解析反应器包含第一基底和含有反应器帽的第二基底。在一些情况下，每个反应器中至少包含两个解析座位。解析反应器可使用可释放的密封隔开。反应器帽可在从第一基底上释放第二基底时保留反应器的内容物。所述多个解析反应器可为任何合适的密度，其密度至少为1个/mm²。所述多个反应器帽可用部分涂覆。该部分可为化学惰性部分或化学活性部分。涂覆到反应器帽上的部分可以是能够使寡核苷酸的附着最小化的部分。本文其他部分进一步详细地描述了化学部分的类型。

在一些实施方案中，本文所描述的反应器帽可涉及在加帽元件基底的表面上具有敞开的顶部的包围体。例如，反应器帽可类似于在基底表面之上突出的圆柱体。反应器帽的内径可约为、至少约为或小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、115、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500μm。反应器帽的外径可约为、至少约为或小于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、115、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或600μm。所述圆柱体的边缘的宽度可约为、至少约为或小于约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或400μm。反应器帽在内部测量的高度可约为、至少约为或小于约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、60、70、80、90或100μm。图7图示了加帽元件上的反应器帽的示例性实施方案。

可以使用本文其他部分进一步详细描述的和本领域中已知的合适的表面修饰方法来修饰整个反应器帽表面或其一部分，诸如边缘表面。在一些情况下，工程构建表面不规则性。化学表面修饰和不规则性可用来调整边缘的水接触角。类似的表面处理还可应用于基底的表面上，该基底表面紧靠反应器帽，从而形成密封，例如可逆密封。如本文其他部分进一步详细描述，可在两个表面之间采用毛细管被动阀。表面处理在对此类包含毛细管被动阀的密封的精确控制中可能是有用的。

包含在基底中的反应器帽可为本领域中已知的任何形状或设计。反应器帽可含有一定容积的腔体，该腔体能够围合反应器的内容物。反应器的内容物可来源于相邻基底上的多个解析座位。反应器帽可以是圆形、椭圆形、矩形或不规则形状。反应器帽可具有尖锐边角。在一些情况下，反应器帽可具有圆滑边角，以将保留的任何气泡减到最少，并促进反应器内容物更好地混合。反应器帽可制成允许反应器内容物的可控转移或混合的任何形状、组构或设计。反应器帽的设计可与如本申请中所描述的位于基底上的解析座位相似。在一些实施方案中，反应器帽可为允许液体容易地流入而不产生气泡的形状。在一些实施方案中，反应器帽可为圆形，其直径可约为、至少约为或小于约1微米(μm)、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm或750μm。反应器帽可具有单分散尺寸分布，即，所有的微结构可具有大致相同的宽度、高度和/或长度。或者，反应器帽可具有有限数目的形状和/或尺寸，例如，反应器帽可呈现为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20种或更多种不同形状，每种形状具有单分散尺寸。在一些实施方案中实施方案中，相同的形状能够以多个单分散尺寸分布(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个或更多个单分散尺寸分布)重复。单分散分布可反映为具有小于模式的25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或更小的标准偏差的幺模分布。

根据本文描述的本发明的各个实施方案，每个反应器帽可具有用于进行反应的任何适合的面积。在一些情况下，所述多个反应器帽可占据基底的总表面积的任何合适的百分比。在一些实施方案中，所述多个反应器帽可占据基底的表面的约、至少约或小于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，反应器帽可占据约、至少约或小于约0.1mm²、0.15mm²、0.2mm²、0.25mm²、0.3mm²、0.35mm²、0.4mm²、0.45mm²、0.5mm²、0.55mm²、0.6mm²、0.65mm²、0.7mm²、0.75mm²、0.8mm²、0.85mm²、0.9mm²、0.95mm²、1mm²、2mm²、3mm²、4mm²、5mm²、6mm²、7mm²、8mm²、9mm²、10mm²、11mm²、12mm²、13mm²、14mm²、15mm²、16mm²、17mm²、18mm²、19mm²、20mm²、25mm²、30mm²、35mm²、40mm²、50mm²、75mm²、100mm²、200mm²、300mm²、400mm²、500mm²、600mm²、700mm²、800mm²、900mm²、1000mm²、1500mm²、2000mm²、3000mm²、4000mm²、5000mm²、7500mm²、10000mm²、15000mm²、20000mm²、25000mm²、30000mm²、35000mm²、40000mm²、50000mm²、60000mm²、70000mm²、80000mm²、90000mm²、100000mm²、200000mm²、300000mm²或者更大的总面积。解析反应器、解析座位和反应器帽可为任何密度。在一些实施方案中，表面可具有每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个位点的解析反应器、解析座位或反应器帽密度。在一些实施方案中，表面具有每1mm²至少约50、至少约75、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1500、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000或至少约500000个位点的解析反应器、解析座位或反应器帽密度。

将相邻基底表面上的解析座位的密度纳入考虑，可相应地设计反应器帽的密度、分布和形状，以便将其配置成与每个反应器中的优选数目的解析座位对准。所述多个解析反应器中的每一个可包含多个解析座位。例如，但非限制性地，每个反应器可包含约、至少约或少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个解析座位。在一些情况下，每个反应器可包含至少100个解析座位。

包含在多个包围体的阵列内的解析座位或反应器帽可位于被制作到支持表面内的微结构上。如本文其他段落中所描述，该微结构可通过本领域中的任何已知方法制成。该微结构可以是具有任何2D或3D形状和设计的微通道或微孔。该微结构(例如，微通道或微孔)可包含至少两个彼此流体连通的通道。例如，微通道可互连起来，从而允许流体在给定条件(诸如真空抽吸)下灌流穿过。单个微结构可以是可单独寻址和解析的，使得两个解析座位的内容物保持不被混合。微通道可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个以任何组合流体连通的通道，从而允许流体的受控混合、连通或分布。微通道的连通性可由微流体设计领域中已知的阀系统来控制。例如，可以直接在基底的流体连通层之上制作基底的流体控制层。在MarcA.Unger等人,"MonolithicMicrofabricatedValvesandPumpsbyMultilayerSoftLithography"Science,vol.288,no.7,pp.113-116,2000年4月，以及DavidC.Duffy等人,"RapidPrototypingofMicrofluidicSystemsinPoly(dimethylsiloxane)",AnalyticalChemistry,vol.70,no.23,pp.4974-4984,1998年12月中描述了不同的微流体阀系统。

包含在多个包围体的阵列内的解析座位或反应器帽可位于诸如微通道或通道等微结构上。在本文其他部分描述了相邻基底表面上的解析座位的微通道的尺寸和设计。该微结构可包含至少两个流体连通的通道，其中所述至少两个通道可包括至少两个具有不同宽度的通道。在一些情况下，所述至少两个通道可具有相同的宽度，或者相同宽度或不同宽度的组合。例如，但非限制性地，通道或微通道的宽度可为约、至少约或小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm。通道或微通道可具有允许解析座位的流体连通的任何长度。至少一个通道可包括约为、至少约、小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm的表面积与长度比，或周长。至少一个通道可具有圆形的横截面，并且可包括约为、至少约、小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm的横截面半径。

如本文所述，包围体阵列可包含多个解析反应器，所述解析反应器包含第一基底和含有反应器帽的第二基底。解析反应器可通过将第二基底组合或加帽至第一基底上并将它们密封在一起而形成。密封可以是可逆的或不可逆的。在优选实施方案中，密封是可逆的或可释放的。当密封解析反应器时，可将诸如扩增或其他下游反应所需的寡核苷酸或试剂等反应器内容物释放在解析反应器内并在其中混合。解析反应器可以用可释放的密封隔开，并且其中反应器帽可在从第一基底上释放第二基底之后保留反应器的所有或一部分内容物。根据第一基底和第二基底的材料，可以不同地设计密封，以允许在第一基底与第二基底之间有可逆密封，并形成解析反应器。第一基底和第二基底可在形成密封时直接物理接触。在一些情况下，第一基底和第二基底可以紧密靠近，但它们的紧紧围绕纳米反应器或处于两个纳米反应器之间的相应表面却不直接物理接触。密封可包括毛细管被动阀。当形成密封时第一基底与第二基底之间的距离可为约、至少约、小于约0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm或10μm。密封可包括毛细管被动阀。

在一些情况下，解析包围体可包含压力释放孔。所述压力释放孔可允许第一基底和第二基底的分离。在通过引用而全文并入本文的欧洲专利号EP1987275A1中描述了带有压力释放系统的微流体系统的设计。

基底上的多个解析反应器帽可通过本文所述或本领域已知的任何方法(例如，微制造工艺)制造。可在制作具有本文公开的多个反应器帽或反应器的基底中使用的微制造工艺非限制性地包括平版印刷术；刻蚀技术，诸如湿法化学、干法和光致抗蚀剂去除；微机电(MEMS)技术，其包括微流体/芯片实验室、光学MEMS(也被称为MOEMS)、RFMEMS、PowerMEMS和BioMEMS技术以及深反应离子刻蚀(DRIE)；纳米机电(NEMS)技术；硅的热氧化；电镀和无电镀；扩散过程，诸如硼、磷、砷和锑扩散；离子注入；薄膜沉积，诸如蒸发(细丝、电子束、闪光和遮蔽以及阶梯覆盖)、溅射、化学汽相沉积(CVD)、外延(汽相、液相和分子束)、电镀、丝网印刷和层压。总体参见Jaeger,IntroductiontoMicroelectronicFabrication(Addison-WesleyPublishingCo.,ReadingMass.1988)；Runyan等人,SemiconductorIntegratedCircuitProcessingTechnology(Addison-WesleyPublishingCo.,ReadingMass.1990)；ProceedingsoftheIEEEMicroElectroMechanicalSystemsConference1987-1998；Rai-Choudhury编著,HandbookofMicrolithography,Micromachining&Microfabrication(SPIEOpticalEngineeringPress,Bellingham,Wash.1997)。

在一方面，具有多个解析反应器帽的基底可使用本领域中已知的任何方法制成。在一些实施方案中，具有多个反应器帽的基底的材料可为半导体基底，诸如二氧化硅。基底的材料还可为其他III-V族或II-VI族化合物材料，诸如(GaAs)——一种通过丘克拉斯基法(Czochralskiprocess)生产的半导体(Grovenor,C.(1989).MicroelectronicMaterials.CRCPress.pp.113–123)。该材料可呈现硬的平面，该平面展现出针对与其表面相接触的溶液的反应性氧化物(–OH)基团的均匀覆盖。这些氧化物基团可作为后续硅烷化过程的附着点。或者，可以沉积模拟硅氧化物的刻蚀特性的亲脂性和疏水性表面材料。根据本发明各个实施方案，还可利用氮化硅和碳化硅表面来制造合适的基底。

在一些实施方案中，可在基底上沉积钝化层，该钝化层可具有或者可不具有反应性氧化物基团。钝化层可包含氮化硅(Si₃N₄)或聚酰亚胺。在一些情况下，可使用光刻步骤来限定在钝化层上形成解析座位的区域。

用于生产具有多个反应器帽的基底的方法可由基底开始。基底(例如，硅)可具有安置于其上的任何数目的层，包括但不限于诸如金属等导电层。在一些情况下，该导电层可为铝。在一些情况下，基底可具有保护层(例如，氮化钛)。在一些情况下，基底可具有拥有高表面能的化学层。所述层可借助于各种沉积技术来沉积，所述沉积技术例如有：化学汽相沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD、等离子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热丝CVD(HWCVD)、引发CVD(iCVD)、改进型CVD(MCVD)、汽相轴向沉积(VAD)、外汽相沉积(OVD)以及物理汽相沉积(例如，溅射沉积、蒸发沉积)。

在一些情况下，可使用低温技术来沉积二氧化硅。在一些情况下，该工艺是二氧化硅的低温化学气相沉积。温度一般低至足以使芯片上预先存在的金属不受损坏。沉积温度可为约50℃、约100℃、约150℃、约200℃、约250℃、约300℃、约350℃等。在一些实施方案中，沉积温度低于约50℃、低于约100℃、低于约150℃、低于约200℃、低于约250℃、低于约300℃、低于约350℃等。沉积可在任何合适的压力下进行。在一些情况下，沉积工艺使用RF等离子能。

二氧化硅可沉积到适合于形成反应器帽的厚度，所述反应器帽可形成包含用于试剂沉积和混合的容积的多个解析反应器，所述解析反应器可适合于扩增任何所需量的寡核苷酸或如本发明的其他段落所述的其他下游反应。

二氧化硅可沉积到任何合适的厚度。在一些实施方案中，二氧化硅为约、至少约或小于约1纳米(nm)、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm、约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约125nm、约150nm、约175nm、约200nm、约300nm、约400nm或约500nm的厚度。

反应器帽可使用本领域中已知的各种制造技术创建在二氧化硅基底中。此类技术可包括半导体制造技术。在一些情况下，使用光刻技术(诸如在半导体行业中使用的技术)创建反应器帽。例如，可向二氧化硅上涂覆(例如通过晶片的旋涂)光致抗蚀剂(例如，当暴露于电磁辐射时会改变性质的材料)以达到任何合适的厚度。可将包括光致抗蚀剂的基底暴露于电磁辐射源。可以使用掩模来从光致抗蚀剂的一些部分屏蔽辐射，以便限定解析座位的区域。光致抗蚀剂可为负性抗蚀剂或正性抗蚀剂(例如，可将反应器帽的区域暴露于电磁辐射，或者可将除反应器帽之外的区域暴露于如由掩模所限定的电磁辐射)。将覆盖要在其中创建反应器帽的位置的区域暴露于电磁辐射，以限定对应于二氧化硅层中的反应器帽的位置和分布的图案。光致抗蚀剂可通过限定与反应器帽相对应的图案的掩模而暴露于电磁辐射。接下来，可例如借助于洗涤操作(例如，去离子水)来移除光致抗蚀剂的暴露部分。继而可将掩模的被移除部分暴露于化学刻蚀剂，以刻蚀基底并将反应器帽的图案转移到二氧化硅层中。刻蚀剂可包括酸，例如，硫酸(H₂SO₄)。可通过各向异性的方式来刻蚀二氧化硅层。使用本文所述的方法，可应用诸如DRIE等高各向异性制造方法在基底上或基底内制作微结构，诸如反应器帽，其中所述微结构具有相对于基底的表面垂直偏差小于约±3°、2°、1°、0.5°、0.1°或更小的侧壁。可以实现小于约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1μm或更小的底切值，从而产生高度均匀的微结构。

可以使用各种刻蚀程序在待形成反应器帽的区域中刻蚀二氧化硅。刻蚀可以是各向同性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率等于沿着正交方向的刻蚀速率)，或各向异性刻蚀(即，沿着一个方向的刻蚀速率低于沿着正交方向的刻蚀速率)，或者它们的变化形式。刻蚀技术可以是湿法硅刻蚀(诸如KOH、TMAH、EDP等)，和干法等离子体刻蚀(例如DRIE)。这两者都可用于通过互连来刻蚀微结构晶片。

在一些情况下，各向异性刻蚀移除反应器帽的大部分体积。可以移除反应器帽的体积的任何合适的百分比，包括约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。在一些情况下，在各向异性刻蚀中移除至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的材料。在一些情况下，在各向异性刻蚀中移除至多约60％、至多约70％、至多约80％、至多约90％或至多约95％的材料。在一些实施方案中，各向异性刻蚀不贯穿基底移除二氧化硅材料。在一些情况下，各向同性刻蚀贯穿基底移除材料从而创造出孔穴。

在一些情况下，使用光刻步骤来刻蚀出反应器帽以限定反应器帽，随后进行混合干-湿刻蚀。光刻步骤可包括用光致抗蚀剂涂覆二氧化硅，以及通过具有限定反应器帽的图案的掩模(或中间掩模(reticle))来将光致抗蚀剂暴露于电磁辐射。在一些情况下，混合干-湿刻蚀包括：(a)干法刻蚀，以移除位于通过光刻步骤在光致抗蚀剂中所限定出的反应器帽的区域中的大部分二氧化硅；(b)清洗基底；以及(c)湿法刻蚀，以从基底的反应器帽的区域中移除剩余的二氧化硅。

基底可借助于等离子体刻蚀化学或者暴露于氧化剂而得到清洗，所述氧化剂例如为H₂O₂、O₂、O₃、H₂SO₄或它们的组合，诸如H₂O₂和H₂SO₄的组合。清洗可包括移除残留聚合物、移除可能阻碍湿法刻蚀的材料，或者它们的组合。在一些情况下，清洗为等离子体清洗。清洗步骤可进行任何合适的时间段(例如，15至20秒)。在一个示例中，清洗可使用具有100mT、200W、20G、20O₂的设置的AppliedMaterialseMAx-CT机器进行20秒。

在一方面，用于制备具有多个反应器帽的基底的方法包括：使用(a)光刻步骤以限定解析座位；(b)干法刻蚀以移除通过光刻步骤所限定的反应器帽的区域中的大部分二氧化硅；以及(c)湿法刻蚀以从基底的反应器帽的区域中移除剩余的二氧化硅，向诸如包含涂覆于其上的二氧化硅层的硅基底之类的基底中刻蚀出反应器帽的腔体。在一些情况下，该方法还包括移除残留聚合物、移除可阻碍湿法刻蚀的材料，或者它们的组合。该方法可包括等离子体清洗步骤。

在一些实施方案中，在光刻步骤或一些情况下的混合干-湿刻蚀之后，不从二氧化硅移除光致抗蚀剂。留下光致抗蚀剂可用于在后续步骤中将金属选择性地引导至反应器帽中，而不是二氧化硅层的上表面上。在一些情况下，基底涂覆有金属(例如，铝)，并且湿法刻蚀不移除金属上的某些成分，例如，保护金属免遭腐蚀的成分(例如，氮化钛(TiN))。然而在一些情况下，可例如借助于化学机械平坦化(CMP)而移除光致抗蚀剂层。

图26A-图26D以多个视图示出了示例性纳米反应器。该纳米反应器包括108个孔，所述孔单个地从纳米反应器的基底凸起。图26A示出了纳米反应器的横截面。图26B和图26C示出了纳米反应器的装置视图。图26D示出了纳米反应器的处理视图。纳米反应器可配置用于在多个特征中接收和容纳液体。图26中的纳米反应器被设计用于在108个孔中的任何数目的孔中容纳液体。如图25中所示例，纳米反应器可与基底接触和/或对准。纳米反应器的孔并不限于图26中所示的配置，这是因为可将任何配置的任何数目的孔布置在纳米反应器内。在一些实施方案中，纳米反应器的孔布置成与基底配置对准的配置。如2701所表示，纳米反应器的高度可约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm。在一些实施方案中，纳米反应器的高度可约为或至多约为10mm、9.5mm、9mm、8.5mm、8mm、7.5mm、7mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm或者更小。在一些实施方案中，纳米反应器的高度的范围可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.2mm-0.8mm。如2702所表示，纳米反应器的孔的高度可约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm。在一些实施方案中，纳米反应器的孔的高度可约为或至多约为10mm、9.5mm、9mm、8.5mm、8mm、7.5mm、7mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm或者更小。在一些实施方案中，纳米反应器的孔的高度的范围可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-0.6mm。

图26B包括由0,0(X,Y)轴所指示的参考原点，其中示出了示例性纳米反应器的左上角。在一些实施方案中，如2703所表示，从原点测量，纳米反应器的宽度沿着一个维度为约5mm至约150mm。在一些实施方案中，如2704所表示，从原点测量，纳米反应器的宽度沿着另一维度为约5mm至约150mm。在一些实施方案中，纳米反应器在任何维度上的宽度为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或者从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该宽度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如5-25mm。在一些实施方案中，纳米反应器在任何维度上的宽度约为或至少约为5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm。在一些实施方案中，纳米反应器在任何维度上的宽度约为或至多约为150mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm或5mm或者更小。

图26B中所示的纳米反应器包括108个孔。这些孔可布置成任何配置。在图26B中，孔布置成行，从而形成正方形。无论如何布置，在X轴或Y轴上测量，孔均可开始于离原点约0.1mm至约149mm的距离处，并终止于离原点约1mm至约150mm的距离处。长度2706和2705分别表示孔的中心在X轴和Y轴上离原点的最远距离。长度2710和2709分别表示孔的中心在X轴和Y轴上离原点的最近距离。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上离原点的最远距离约为或至少约为1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最远距离约为或至多约为150mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、1mm或更小。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最远距离为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如5-25mm。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上离原点的最近距离约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或149mm。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最近距离约为或至多约为149mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm或更小。在一些实施方案中，孔的中心在任何维度上的最近距离为从约0.1mm至约125mm、从约0.5mm至约100mm、从约0.5mm至约75mm、从约0.5mm至约50mm、从约0.5mm至约25mm、从约1mm至约50mm、从约1mm至约40mm、从约1mm至约30mm、从约1mm至约20mm或从约1mm至约5mm。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1-5mm。

纳米反应器的孔可位于离纳米反应器的边缘的任何距离处。2707和2708示出了孔与纳米反应器的边缘之间的示例距离。在一些实施方案中，孔的中心与纳米反应器的边缘之间在任何维度上的距离约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或149mm。在一些实施方案中，孔的中心与纳米反应器的边缘之间在任何维度上的距离约为或至多约为149mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm或更小。在一些实施方案中，孔的中心与纳米反应器的边缘之间在任何维度上的距离为从约0.1mm至约125mm、从约0.5mm至约100mm、从约0.5mm至约75mm、从约0.5mm至约50mm、从约0.5mm至约25mm、从约1mm至约50mm、从约1mm至约40mm、从约1mm至约30mm、从约1mm至约20mm或从约1mm至约5mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1-5mm。

在一些实施方案中，孔布置成使得在两个孔之间存在重复的距离。如2711和2712所示，两个孔之间的距离可相距约0.3mm至约9mm。在一些实施方案中，两个孔之间的距离约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，两个孔之间的距离约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。两个孔之间的距离的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。

在一些实施方案中，如2721所示，孔的内部的横截面约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，孔的内部的横截面约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。孔的内部的横截面的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该横截面可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。在一些实施方案中，如2720所示，包括孔的边沿在内的孔的横截面约为或至少约为0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm或9mm。在一些实施方案中，包括孔的边沿在内的孔的横截面约为或至多约为9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm或0.3mm。包括孔的边沿在内的孔的横截面的范围可在0.3-9mm、0.4-8mm、0.5-7mm、0.6-6mm、0.7-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm或0.9-2mm之间。本领域技术人员知晓，该横截面可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.8mm-2mm。

纳米反应器可包括任何数目的孔，包括但不限于约2个至约250个之间的任何数目。在一些实施方案中，孔的数目包括从约2个至约225个孔、从约2个至约200个孔、从约2个至约175个孔、从约2个至约150个孔、从约2个至约125个孔、从约2个至约100个孔、从约2个至约75个孔、从约2个至约50个孔、从约2个至约25个孔、从约25个至约250个孔、从约50个至约250个孔、从约75个至约250个孔、从约100个至约250个孔、从约125个至约250个孔、从约150个至约250个孔、从约175个至约250个孔、从约200个至约250个孔或者从约225个至约250个孔。本领域技术人员知晓，孔的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-125个。

可以在本文所述的纳米反应器上放置基准标记，以促进纳米反应器与系统的其他组件(例如，微流体装置或微流体装置的组件)的对准。本发明的纳米反应器可具有一个或多个基准标记，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基准标记。图25B中所示的纳米反应器的装置视图包括三个对于将装置与系统的其他组件对准有用的基准标记。基准标记可位于纳米反应器内的任何位置上。如2716和2717所示，基准标记可位于原点附近，其中基准标记比任一孔都更为靠近原点。在一些实施方案中，如2713所示，基准标记位于纳米反应器的边缘附近，其中2714和2715示例了离边缘的距离。基准标记可位于离纳米反应器的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边缘约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。基准标记可位于离纳米反应器的边缘0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm处。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。基准标记可位于靠近孔的距离处，其中2719和2718分别指示出示例性X轴距离和Y轴距离。在一些实施方案中，孔与基准标记之间的距离约为或至少约为0.001mm、0.005mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm或8mm。在一些实施方案中，孔与基准标记之间的距离约为或至多约为8mm、6.5mm、6mm、5.5mm、5mm、4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.7mm、2.5mm、2.2mm、2mm、1.7mm、1.5mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.02mm、0.01mm、0.005mm或0.001mm。孔与基准标记之间的距离的范围可在0.001-8mm、0.01-7mm、0.05-6mm、0.1-5mm、0.5-4mm、0.6-3mm、0.7-2mm或0.8-1.7mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。

图26D中所示的纳米反应器的处理视图包括四个对于将装置与系统的其他组件对准有用的基准标记。基准标记可位于纳米反应器内的任何位置。如基准标记H的详细视图上的2722和2723所示，基准标记可位于处理侧上的纳米反应器的边角附近。基准标记可位于离纳米反应器的边角约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边角约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，基准标记位于离纳米反应器的边角约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。基准标记可位于离纳米反应器的边角0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm处。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。基准标记可具有适合于功能的任何宽度。在一些实施方案中，如2724和2725所示例，基准标记的宽度约为或至少约为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm。在一些实施方案中，基准标记的宽度约为或至多约为10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm。基准标记的宽度的范围可为0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.1-6mm、0.2-5mm、0.3-4mm、0.4-3mm或0.5-2mm长。本领域技术人员知晓，该宽度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.1mm-5mm。如2726所示，基准标记的横截面可为任何合适的尺寸。在一些实施方案中，基准标记的横截面约为或至少约为0.001mm、0.002mm、0.004mm、0.006mm、0.008mm、0.01mm、0.012mm、0.014mm、0.016mm、0.018mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm、0.04mm、0.045mm、0.05mm、0.055mm、0.06mm、0.065mm、0.07mm、0.075mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm。在一些实施方案中，基准标记的横截面约为或至多约为0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.075mm、0.07mm、0.065mm、0.06mm、0.055mm、0.05mm、0.045mm、0.04mm、0.035mm、0.03mm、0.025mm、0.02mm、0.018mm、0.016mm、0.014mm、0.012mm、0.01mm、0.008mm、0.006mm、0.004mm、0.002mm、0.001mm或更小。基准标记的横截面的范围可在0.001-0.5mm、0.004-0.4mm、0.008-0.3mm、0.01-0.2mm、0.015-0.1mm、0.018-0.1mm或0.02-0.05mm之间。本领域技术人员知晓，该横截面可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.02mm-0.1mm。

在一些实施方案中，如在描绘纳米反应器中的孔的示例性布局的图26E中所示例，纳米反应器可具有用于标签或序号标签的位置。在一些实施方案中，标签为序号。如距离2728和2727所示例，标签可位于纳米反应器的边缘附近。在一些实施方案中，标签的任何部分位于离纳米反应器的边缘约0.1mm至约10mm处。在一些实施方案中，标签的任何部分位于离纳米反应器的边缘约或至少约0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm、6mm、6.2mm、6.4mm、6.6mm、6.8mm、7mm、7.2mm、7.4mm、7.6mm、7.8mm、8mm、8.2mm、8.4mm、8.6mm、8.8mm、9mm或10mm处。在一些实施方案中，标签的任何部分位于离纳米反应器的边缘约或至多约10mm、9mm、8.8mm、8.6mm、8.4mm、8.2mm、8mm、7.8mm、7.6mm、7.4mm、7.2mm、7mm、6.8mm、6.6mm、6.4mm、6.2mm、6mm、5.8mm、5.6mm、5.4mm、5.2mm、5mm、4.8mm、4.6mm、4.4mm、4.2mm、4mm、3.8mm、3.6mm、3.4mm、3.2mm、3mm、2.8mm、2.6mm、2.4mm、2.2mm、2mm、1.8mm、1.6mm、1.4mm、1.2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm处。该距离的范围可在0.1-10mm、0.2-9mm、0.3-8mm、0.4-7mm、0.5-6mm、0.6-5mm、0.7-4mm、0.8-3mm、0.9-2mm或1.5mm之间。本领域技术人员知晓，该距离可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如0.5-2mm。如2726所示例，标签可具有任何长度，包括从约1mm至约25mm。在一些实施方案中，标签的长度约为或至少约为1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm。在一些实施方案中，标签的长度约为或至多约为150mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、50mm、40mm、30mm、25mm、20mm、15mm、10mm、5mm、1mm或更小。在一些实施方案中，标签的长度为从约5mm至约125mm、从约5mm至约100mm、从约5mm至约75mm、从约5mm至约50mm、从约5mm至约25mm、从约25mm至约150mm、从约50mm至约150mm、从约75mm至约150mm、从约100mm至约150mm或者从约125mm至约150mm。本领域技术人员知晓，该长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如5-25mm。

材料

基底、固体支持物或其中的微结构或反应器可由适合于本文所述发明的方法和组合物的多种材料制成。在某些实施方案中，用于制造本发明的基底/固体支持物的材料展现出低水平的寡核苷酸结合。在一些情况下，可采用对可见光和/或紫外线透明的材料。可以使用具有足够的导电性的材料，例如，可跨整个本文所述基底/固体支持物或其一部分形成均匀电场的材料。在一些实施方案中，此类材料可接地。在一些情况下，基底或者固体支持物可以是导热的或隔热的。该材料可以是耐化学品和耐热的，以支持化学反应或生化反应，诸如一系列寡核苷酸合成反应。对于柔性材料而言，感兴趣的材料可包括：改性及未改性的尼龙、硝酸纤维素、聚丙烯等。对于刚性材料而言，感兴趣的具体材料包括：玻璃；熔融石英；硅、塑料(例如，聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸脂，以及其混合物等)；金属(例如，金、铂等)。基底、固体支持物或反应器可由选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃的材料制成。基底/固体支持物或者其中的微结构、反应器可使用本文所列材料或本领域中已知的任何其他合适材料的组合制成。

表面修饰

在多个实施方案中，利用表面修饰来通过加成工艺或减成工艺进行对表面的化学和/或物理改变，以改变基底表面或基底表面的选定位点或区域的一种或多种化学和/或物理性质。例如，表面修饰可涉及：(1)改变表面的润湿性质；(2)对表面进行功能化，即，提供、修改或取代表面官能团；(3)对表面进行去功能化，即，移除表面官能团；(4)以其他方式例如通过刻蚀来改变表面的化学组成；(5)增大或减小表面粗糙度；(6)在表面上提供涂层，例如，展现出与表面的润湿性质不同的润湿性质的涂层；和/或(7)在表面上沉积微粒。

寡核苷酸或其他部分所沉积到的基底表面或解析座位可以是光滑的或基本上为平面的，或者具有不规则性，诸如凹陷或隆起。可以用有助于以期望的方式改变表面性质的一个或多个不同化合物层来修饰表面。感兴趣的此类修饰层包括：无机层和有机层，诸如金属、金属氧化物、聚合物、有机小分子等。感兴趣的聚合物层包括如下材料的层：肽、蛋白质、核酸或其模拟物(例如，肽核酸等)；多糖、磷脂、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯等，或者本文所述的或除此之外本领域中已知的任何其他合适的化合物，其中聚合物可为杂聚物或均聚物，并且可具有或者可不具有附着于其上的单独的功能部分(例如，缀合的)。在通过引用而全文并入本文的美国专利号6,773,888和美国公开号2007/0054127中描述了用于基底的表面修饰或固体支持物的涂覆的其他材料和方法。

解析座位可使用能够增大或减小固体支持物的表面能的部分进行功能化。所述部分可以是化学惰性的，或者替代地，为适于支持期望的化学反应的部分。表面的表面能或表面的疏水性可决定寡核苷酸附着到表面上的亲和力。用于制备基底的方法可包括：(a)提供具有包含二氧化硅的表面的基底；和(b)使用本文所述的或除此之外本领域中已知的合适的硅烷化剂，例如，有机官能烷氧基硅烷分子，来对表面进行硅烷化。在一些情况下，该有机官能烷氧基硅烷分子可为二甲基氯十八烷基硅烷、甲基二氯十八烷基硅烷、三氯十八烷基硅烷、三甲基十八烷基硅烷、三乙基十八烷基硅烷或其任何组合。

还可使用本领域中已知的任何方法来准备基底的表面以使之具有低表面能。降低表面能可促进寡核苷酸向表面的附着。可对表面进行功能化，以实现可降低表面能的分子部分的共价结合，以便可减小润湿性。在一些实施方案中，表面的功能化能够实现表面能和润湿性的增大。

在一些实施方案中，通常经由存在于基底表面上的反应性亲水部分，在有效地将硅烷偶联至基底表面的反应条件下，使基底的表面与含有硅烷混合物的衍生化组合物相接触。硅烷化一般可用于通过自组装而使用有机官能烷氧基硅烷分子来覆盖表面。还可使用本领域中当前已知的多种硅氧烷功能化试剂，例如，用于降低或增大表面能。有机官能烷氧基硅烷根据其有机官能来分类。硅氧烷功能化试剂的非限制性示例包括：羟烷基硅氧烷(甲硅烷基化表面，用乙硼烷功能化，并通过过氧化氢来氧化该醇)、二醇(二羟基烷基)硅氧烷(甲硅烷基化表面，并水解成二醇)、氨基烷基硅氧烷(胺不需要中间功能化步骤)、环氧丙氧基硅烷(3-环氧丙氧基丙基-二甲基-乙氧基硅烷、环氧丙氧基-三甲氧基硅烷)、巯基硅烷(3-巯基丙基-三甲氧基硅烷，3-4环氧环己基-乙基三甲氧基硅烷或3-巯基丙基-甲基-二甲氧基硅烷)、联环庚烯基-三氯硅烷、丁基-醛基-三甲氧基硅烷或二聚仲氨基烷基硅氧烷。羟烷基硅氧烷可包括变成3-羟基丙基的烯丙基三氯氯硅烷或变成8-羟基辛基的7-辛-1-烯基三氯氯硅烷。二醇(二羟基烷基)硅氧烷包括缩水甘油基三甲氧基硅烷衍生的(2,3-二羟基丙氧基)丙基。氨基烷基硅氧烷包括变成3-氨丙基的3-氨丙基三甲氧基硅烷(3-氨丙基-三乙氧基硅烷、3-氨丙基-二乙氧基-甲基硅烷、3-氨丙基-二甲基-乙氧基硅烷或3-氨丙基-三甲氧基硅烷)。二聚仲氨基烷基硅氧烷可以是变成双(甲硅烷基氧基丙基)胺的双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)胺。此外，在本发明中可以使用许多种替代的功能化表面。非限制性示例包括以下各项：1.聚乙烯/聚丙烯(通过γ辐射或铬酸氧化并还原为羟烷基表面而功能化)；2.高度交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯(通过氯甲基化衍生化，并胺化为苄胺功能表面)；3.尼龙(末端氨基己基直接是反应性的)；或4.刻蚀的、还原的聚四氟乙烯。在通过引用而全文并入本文的美国专利号5474796中描述了其他方法和功能化剂。功能化基团(例如，硅烷)的混合物可为任何不同的比率。例如但非限制性地，该混合物可包含至少两种不同类型的功能化剂，例如硅烷。混合物中的至少两种类型的表面功能化剂(例如，硅烷)的比率可约为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、2:3、2:5、2:7、2:9、2:11、2:13、2:15、2:17、2:19、3:5、3:7、3:8、3:10、3:11、3:13、3:14、3:16、3:17、3:19、4:5、4:7、4:9、4:11、4:13、4:15、4:17、4:19、5:6、5:8、5:9、5:11、5:12、5:13、5:14、5:16、5:17、5:18、5:19、6:7、6:11、6:13、6:17、6:19、7:8、7:9、7:10、7:11、7:12、7:13、7:15、7:16、7:18、7:19、8:9、8:11、8:13、8:15、8:17、8:19、9:10、9:11、9:13、9:14、9:16、9:17、9:19、10:11、10:13、10:17、10:19、11:12、11:13、11:14、11:15、11:16、11:17、11:18、11:19、11:20、12:13、12:17、12:19、13:14、13:15、13:16、13:17、13:18、13:19、13:20、14:15、14:17、14:19、15:16、15:17、15:19、16:17、16:19、17:18、17:19、17:20、18:19、19:20或任何其他用以达到两种基团的所需表面表示的比率。不受理论制约，应当理解，表面表示将会高度地与混合物中两种基团的比率成比例。通过提供功能化剂的比率，可以实现根据本发明的方法和组合物的期望的表面张力、润湿性、水接触角或针对其他合适的溶剂的接触角。此外，混合物中的试剂可选自用于下游反应的合适的反应性和惰性部分，从而将反应性基团的表面密度稀释成根据本发明的方法和组合物的期望水平。在一些实施方案中，在寡核苷酸合成反应中发生反应以形成生长的寡核苷酸的表面官能团部分的密度为约、小于约或大于约0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0、50.0、75.0、100.0μMol/m²。

在多个实施方案中，用反应性亲水部分的涂层来修饰表面，以使之具有更高的表面能，或者变得更加亲水。通过改变基底表面的不同部分的表面能，可以调节并且在一些情况下促进沉积的试剂液体的扩散。例如，图5图示了当通过喷墨打印机将试剂小滴沉积到微孔中时的情况。由于在该情况下微孔的表面与附近其他表面相比具有更高的表面能，因此液体小滴可在更小的微孔上扩散并填充更小的微孔。基底表面上的反应性亲水部分可为羟基、羧基、巯基和/或取代或未取代的氨基。合适的材料包括但不限于可用于固相化学合成的支持物，例如，交联的聚合物材料(例如，基于二乙烯基苯苯乙烯的聚合物)、琼脂糖(例如，)、葡聚糖(例如，)、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、二氧化硅、玻璃(特别是可控多孔玻璃，或“CPG”)、陶瓷等。支持物可从市场购得并直接使用，或者可在功能化之前对其加以处理或涂覆。

亲水性表面和疏水性表面

表面的表面能或疏水性可通过测量水接触角而评估或测量。水接触角是当小水滴与固体表面相遇时水滴表面与固体表面之间的角度。固体表面可以是光滑、平坦或平面表面。这可经由杨氏方程(Youngequation)来量化液体(例如，水)对固体表面的润湿。在一些情况下，可以观察到水接触角滞后，范围从所谓的前进(最大)水接触角到后退(最小)水接触角。在这些数值中可以找到并可由其计算平衡水接触。疏水性和亲水性可使用水接触角以相对定量的方式表示。若表面具有小于90°的水接触角，则可认为固体表面是亲水性的或极性的。若表面具有大于90°的水接触角，则可认为固体表面是疏水性的或非极性的。具有低表面能的高度疏水性表面可具有大于120°的水接触角。

可以通过适合于寡核苷酸合成的各种方式来调节涂覆表面的表面特性。可将表面选择成对普通寡核苷酸合成的条件呈惰性；例如，根据选定的化学，固体表面可在单体添加期间缺乏对本体溶剂界面的游离羟基、氨基或羧基。或者，表面可在寡核苷酸合成的第一循环或前几个循环开始之前包含反应性部分，而这些反应性部分可在寡核苷酸合成反应的一个、两个、三个、四个、五个或更多个循环之后很快地被消耗到不可测量的密度。可以针对例如由诸如乙腈和乙二醇醚或水性溶剂等常用有机溶剂引起的更好或更差的润湿，来相对于周围表面对表面进一步优化。

不受理论束缚，润湿现象被理解为在固-液界面处分子之间的表面张力或吸引力的量度，并以达因/cm²表示。例如，氟碳化合物具有非常低的表面张力，这通常归因于碳-氟键的独特的极性(电负性)。在结构紧密的Langmuir-Blodgett型膜中，层的表面张力可能主要由烷基链末端中的氟的百分比来决定。对于紧密有序的膜，单一的末端三氟甲基基团可使得表面几乎与全氟烷基层一样为疏脂性的。当氟碳化合物共价附接至下面的衍生化固体(例如高度交联的聚合物)支持物时，反应位点的密度可能低于Langmuir-Blodgett和基团密度。例如，甲基三甲氧基硅烷表面的表面张力可以为约22.5mN/m，而氨基丙基三乙氧基硅烷表面可以为约35mN/m。硅烷表面的其他实例在ArklesB等人，"Theroleofpolarityinthestructureofsilanesemployedinsurfacemodification",SilanesandOtherCouplingAgents,Vol.5"中描述，其通过引用以其全文并入本文。简而言之，一般认为表面的亲水行为发生在临界表面张力大于45mN/m时。随着临界表面张力增加，期望的接触角的减小伴随着较强的吸附行为。一般认为表面的疏水行为发生在临界表面张力小于35mN/m时。首先，临界表面张力的降低与亲油行为即表面被烃油的润湿有关。随着临界表面张力降低至20mN/m以下，表面抵抗被烃油润湿，并被认为既疏油又疏水。例如，可使用硅烷表面修饰来生成宽范围的临界表面张力。相应地，本发明的方法和组合物可使用表面涂层，例如，包含硅烷的涂层，来获得小于5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、115、120mN/m或更高的表面张力。此外，本发明的方法和组合物可使用表面涂层，例如包含硅烷的表面涂层，来获得大于115、110、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6mN/m或更小的表面张力。在通过引用而全文并入本文的Arkles等人(SilanesandOtherCouplingAgents,Vol.5v:TheRoleofPolarityintheStructureofSilanesEmployedinSurfaceModification.2009)的表1和表2中描述了表面涂层(例如，包含硅烷的表面涂层)的非限制性示例的水接触角和表面张力。所述表格复制如下。

表1

注：表1中，硅烷的接触角是指硅烷向光滑表面上的水解沉积。这里的数据提取自多方面的文献来源和作者著作。基底之间的精确对比未考虑测试方法的差异，或者所报告的是前进、后退还是平衡接触角。

表2

用以测量水接触角的方法可使用本领域中已知的任何方法，包括静态座滴法、动态座滴法、动态吊片法、单纤维吊片法、粉末接触角法等。在一些情况下，可将本发明中在此所描述的基底的表面或基底的表面的一部分功能化或修饰成疏水性的，具有低表面能，或者具有如本文所述在基底相关功能化表面的非弯曲、光滑或平面等效物上测得大于约90°、95°、100°、105°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°或150°的水接触角。本文所描述的功能化表面的水接触角可以指小水滴在非弯曲、平滑、平坦和平面几何形状的功能化表面上的接触角。在一些情况下，可将本发明中在此描述的基底的表面或者基底的表面的一部分功能化或修饰成亲水性的，具有高表面能，或者具有如本文所述在基底相关功能化表面的非弯曲、光滑或平面等效物上测得小于约90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角。可以将基底的表面或者基底的表面的一部分功能化或修饰成与在功能化或修饰之前的表面或表面的部分相比更加亲水或疏水。

在一些情况下，可将一个或多个表面修饰成具有在一个或多个非弯曲、光滑或平面等效表面上测得大于90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角差异。在一些情况下，可将微结构、通道、解析座位、解析反应器帽或基底的其他部分的表面修饰成具有差别疏水性，该差别疏水性对应于在此类表面的非弯曲、光滑或平面等效表面上测得大于90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角差异。除非另有说明，本文提及的水接触角对应于在所讨论的表面的非弯曲、光滑或平面等效物上进行的测量。

在通过引用而全文并入本文的美国专利号6,028,189中描述了用于对表面进行功能化的其他方法。例如，亲水性解析座位可如下生成：首先在基底内的每个座位上施加保护剂或抗蚀剂。继而可以用疏水剂来涂覆无保护区域，以产生非反应性表面。例如，可以通过向受保护圈周围的暴露氧化物上化学汽相沉积(十三氟四氢辛基)-三乙氧基硅烷来创造疏水涂层。最后，可移除保护剂或抗蚀剂，从而暴露出基底的座位区以供进一步的修饰和寡核苷酸合成。在一些实施方案中，此类无保护区的最初修饰可抵抗进一步的修饰并保留其表面功能化，而新的无保护区域可经历后续的修饰步骤。

多重平行微流体反应

在另一方面，本文描述了用于进行一组平行反应的系统和方法。该系统可包括两个或更多个基底，所述基底可彼此密封(例如，可释放地密封)，从而在密封时形成多个可单独寻址的反应容积或反应器。通过从第二基底上释放第一基底并将其与第三基底对准，可以形成新的反应器组。每个基底可携载用于期望反应的试剂，例如，寡核苷酸、酶、缓冲液或溶剂。在一些实施方案中，该系统包括第一表面和加帽元件，其中所述第一表面带有处于第一适当密度的多个解析座位，而所述加帽元件带有处于第二适当密度的多个解析反应器帽。该系统可将所述多个解析反应器帽与第一表面上的所述多个解析座位对准，从而在第一表面与加帽元件之间形成暂时密封。在对准的基底之间的暂时密封可物理地将第一表面上的座位划分成约、至少约或少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200个或者更多个座位的组。本文所述的一组平行反应可根据本发明的方法和组合物来进行。可以将带有处于第一密度的多个解析座位的第一表面与带有处于第二密度的多个解析反应器帽的加帽元件对准，使得所述多个解析反应器帽与第一表面上的所述多个解析座位在第一表面与加帽元件之间形成暂时的密封，从而物理地将第一表面上的座位划分成约、至少约或少于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200个或者更多个座位的组。可以进行第一反应，从而形成第一组试剂。可以从第一表面上释放加帽元件。在释放之后，反应器帽可各自保留先前密封的反应容积中的所述第一组试剂的至少一部分。所述多个解析座位的密度可为约、至少约或小于每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个。在一些实施方案中，所述多个解析座位的密度可为约、至少约、小于每mm²约100个。所述多个解析反应器帽的密度可为约、至少约、小于每mm²约1个。在一些实施方案中，所述多个解析反应器帽的密度可为约、至少约或小于每1mm²约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个。本文所述的方法还可包括提供带有处于第三密度的多个解析座位的第二表面，以及将所述多个解析反应器帽与该第二表面上的多个解析座位对准，并在第二表面与加帽元件之间形成密封，通常是暂时的或可释放的密封。新形成的密封可物理地将第二表面上的座位划分成约、至少约或小于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200个或者更多个座位的组。可以任选地使用第一组试剂的一部分来进行第二反应，从而形成第二组试剂。可以从第二表面上释放加帽元件。在释放之后，反应器帽可各自保留先前密封的第二反应容积中的第二组试剂的至少一部分。在一些情况下，带有多个解析座位的第二表面的座位密度可至少为每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个。本文描述了该系统、方法和仪器的实施方案的各个方面。

系统组装件可包括任何数目的静态晶片和任何数目的动态晶片。例如，该系统可在一列中包括三个基底且在一行中包括四个基底。传送系统可包括三个静态晶片(或基底)和一个动态晶片(或基底)。动态晶片可在多个静态晶片之间移动或传送。动态晶片可在三个静态安装的晶片之间传送。在一些实施方案中，动态晶片可具有约50、100、150、200或250mm或者2、4、6、8英寸或更大的直径。动态晶片可安装在温控真空吸盘中。本发明的系统允许如下配置：其中动态晶片可以在Z方向上移动(Z方向可以是与将要面对第二晶片的表面的晶片的表面相垂直的方向)，并具有约或小于约0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3μm的Z-位置控制，并可例如通过将动态晶片上的图案与静态晶片上的另一图案在容差范围内相匹配来对准晶片的θ_z(两个晶片的要彼此面对的表面的法线之间的角度)。对于在x-y平面上的旋转角的差，晶片定位容差可以为约或小于约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500微弧度。在一些实施方案中，对于在x-y平面上的旋转角的差，晶片定位容差可以为约或小于约50微弧度。对于在x方向上的距离，晶片定位容差可以为约或小于约0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15μm。对于在y方向上的距离，晶片定位容差可以为约或小于约0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15μm。对于x-y平面在z方向上的旋转，晶片定位容差可以为约或小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10微弧度。在一些实施方案中，对于x-y平面在z方向上的旋转，晶片定位容差可以为约或小于约5微弧度。在一些实施方案中，对于在z方向上的距离，晶片定位容差可以为约或小于约0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5μm。在一些实施方案中，对于在z方向上距离的晶片定位容差可以为约或小于约0.5μm。

在一些情况下，用于进行一组平行反应的系统和方法还可包括带有多个解析座位的第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十表面和/或带有多个解析反应器帽的加帽元件。第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十表面可对准，并可在两个表面与对应的加帽元件之间形成暂时的密封，从而物理地划分表面上的座位和/或反应器帽。可以使用从先前反应保留的试剂(即，第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九组试剂)的一部分来进行第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十反应，从而形成第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十组试剂。可将本文所述的每个加帽元件从其对应的表面上释放，其中反应器帽可保留另一反应容积的上一组试剂的至少一部分。在一些情况下，带有多个解析座位的第二表面的密度可为至少2个/mm²。在一些实施方案中，带有多个解析座位的第二表面的座位密度至少为每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000或者约500000个。每次保留的试剂的部分可根据所要进行的反应而不同，并被控制成期望的部分。

在多个实施方案中，本发明考虑到用于进行一组平行反应的系统，其包括带有多个解析座位的第一表面和带有多个解析反应器帽的加帽元件。如本文其他部分所进一步详细描述的，可将多个解析座位与带有多个解析反应器帽的加帽元件相组合以形成多个解析反应器。在一些情况下，第一基底的第一表面的解析座位可包含试剂涂层。第二基底的第二表面的解析座位可包含试剂涂层。在一些实施方案中，所述试剂涂层可共价连接至第一表面或第二表面。在存在第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十表面时的情况下，每个表面可包含试剂涂层。

第一表面或第二表面上的试剂涂层可包含寡核苷酸。如本文其他部分所进一步描述的，该寡核苷酸可为任意长度，例如，至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300bp，或者更长。当用解析反应器帽密封解析座位时，可释放被包含在试剂涂层内的寡核苷酸。可以在多个解析反应器内进行多种反应，例如，寡核苷酸扩增反应、PCA、测序文库的生成或错误校正。

寡核苷酸可通过如在本文其他部分更详细描述且本领域公知的多种合适的方法(例如通过如本领域众所周知的酶切)从被涂覆的表面上释放。这类酶切的实例包括但不限于使用限制酶(如MIyI)，或其他酶，或能够切割单链或双链DNA的酶(诸如但不限于尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA核酸内切酶IV)的组合。其他本领域公知的切割方法也可在本发明中有利地使用，包括但不限于DNA分子的化学(碱不稳定的)切割或从表面上光学(光不稳定的)切割。还可采用PCR或其他扩增反应以通过在寡核苷酸仍锚定于基底的同时将其复制来产生基因合成的构建材料。释放寡核苷酸的方法在P.C.T.专利公开号WO2007137242和美国专利号5,750,672中描述，该文献通过引用以其全文并入本文。

在一些情况下，在从第一表面上释放加帽元件中的释放，和从第二表面上释放加帽元件可以以不同的速度进行。从相应的表面上释放加帽元件时保留的部分试剂的量可通过速度或者加帽元件与相应表面的表面能来控制。在一些情况下，第一或第二表面包含对于给定液体如水而言不同的表面张力、表面能或疏水性。在一些情况下，第一表面的解析座位可包含高的表面能、表面张力或疏水性。加帽元件和相应表面的表面能或疏水性的差异可以是控制在释放时保留的试剂的部分的参数。第一和第二反应的容积可以不同。

在一些情况下，解析反应器外的空气压力可大于解析反应器内的压力。在其他情况下，解析反应器外的空气压力可小于解析反应器内的压力。解析反应器外与解析反应器内的空气压力的差(或压差)可影响解析反应器的密封。通过改变第一表面和第二表面的表面能或疏水性，压差可在第一表面与第二表面的反应器帽之间的间隙内导致弯曲或直的气/液界面。此外，从表面上释放加帽元件所需的力可通过压差和表面能差控制。在一些情况下，可将表面修饰为具有表面能差和压差，使得加帽元件能够容易地从表面上释放。

第一或第二反应，或者任何在第二反应后的反应，均可包含多种如本文所述的分子或生化试验或本领域公知的任何合适的反应。在一些情况下，第一或第二反应可包括聚合酶循环组装。在一些情况下，第一或第二反应可包括酶促基因合成、退火和连接反应、两个基因经由杂合基因的同时合成、鸟枪法连接和共连接、插入基因合成、经由DNA的一条链的基因合成、模板指导的连接、连接酶链反应、微阵列介导的基因合成、固相组装、Sloning结构单元技术或RNA连接介导的基因合成。用于进行一系列平行反应的反应或方法还可包括冷却加帽元件或冷却第一表面(第二表面)。

图8中图示了使用本文所述系统的本发明的方法和组合物的总体处理工作流。

辅助仪器

在一方面，本发明涉及用于寡核苷酸合成的系统和方法。用于寡核苷酸合成的系统可包括扫描沉积系统。用于寡核苷酸合成的系统可包括第一基底(例如，寡核苷酸合成晶片)和喷墨打印机，所述基底具有功能化表面和多个解析座位，而所述喷墨打印机通常包括多个打印头。每个打印头通常配置用于沉积多种用于在第一基底的解析座位中进行的反应的结构单元之一，例如，用于亚磷酰胺合成的核苷酸结构单元。如本文其他部分所进一步详细描述的，寡核苷酸合成晶片的解析座位可位于微通道中。可以例如通过提供液体的持续流动而将基底密封在流通池内，该液体例如含有用于在解析座位内的反应的必要试剂(例如，甲苯中的氧化剂)，或允许对合成位置(例如，寡核苷酸合成晶片的解析座位)处的试剂剂量和浓度进行精确控制的溶剂(例如，乙腈)。可以使用诸如氮气等惰性气体的流动来干燥基底，通常是通过挥发性基底的增强蒸发。可以使用多种手段，例如真空源/减压泵或真空罐，来创造降低的相对压强(负压)或真空，从而改善干燥以及减少表面上的残余湿度量和任何小液滴。相应地，紧紧围绕基底或其解析座位的压强可测得为约或小于约100、75、50、40、30、20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01毫托，或者更小。

图3图示了用于寡核苷酸合成的系统的示例。相应地，寡核苷酸合成晶片被配置用于通过入口歧管以及任选的出口歧管来为用于寡核苷酸合成的解析座位提供必要的本体试剂(bulkreagent)。本体试剂可包括在不同实施方案中的多个解析座位中普遍需要的、用于寡核苷酸合成的任何合适的试剂、载体、溶剂、缓冲液或气体，如氧化剂、解封闭剂、乙腈或氮气。喷墨打印机打印头可在X-Y方向上移动至第一基底的可寻址位置。如本文其他部分更详细描述的第二基底，如加帽元件，可在Z方向上移动，并且如果需要，可在X和Y方向上移动，以与第一基底密封，从而形成多个解析反应器。或者，第二基底可以是固定的。在这类情况下，合成基底可在Z方向上移动，并且如果需要，可在X和Y方向上移动，以对准第二基底并与第二基底密封。合成的寡核苷酸可从第一基底递送至第二基底。适量的流体可通过入口歧管和第一基底的解析座位，进入第二基底以促进试剂从第一基底/其解析座位向第二基底中的递送。在另一方面，本发明涉及包括晶片处理的用于寡核苷酸组装的系统。

在多个实施方案中，本发明利用了用于扫描沉积的系统。扫描沉积系统可包括喷墨打印机(inkjet)，该喷墨打印机可用于向刻蚀到基底中的解析座位或微孔沉积试剂。在一些实施方案中，扫描沉积系统可使用有机溶剂或墨水。在一些情况下，扫描沉积系统可包括多个晶片，诸如硅晶片，其直径通常为约200mm。在一些情况下，整个系统可放置在气压控制的包围体内并在其内发挥功能。扫描沉积系统可包括工作包封(workenvelope)、打印头组装件、流通池组装件和/或服务包封(serviceenvelope)。在一些情况下，打印头组装件可以移动而流通池组装件保持静止。扫描沉积系统可包括服务于一个或多个基底/晶片(诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50个或更多个基底/晶片)的一个或多个流通池，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50个或更多个流通池。晶片可保持固定在流通池内。在一些情况下，该系统可通过θ_z自动化来促进基底的对准。在一个具体的实施方案中，工作包封可包括包含扫描方向行进(scanningdirectiontravel)的区域，例如，约(n-1)打印头间距+晶片直径＝9*20mm+200mm＝380mm。可设想具有等效设置的合适的工作包封。服务包封可包含停靠等待服务的打印头。在一些情况下，服务包封可与更大的盒体在环境上隔离。在多个实施方案中，用于本文所述的方法和组合物的系统可包括用于寡核苷酸合成、寡核苷酸组装或更普遍地用于试剂制备的扫描沉积系统。

所述多个解析座位和多个解析反应器帽可位于具有互连性或流体连通的微结构上。这样的流体连通允许针对反应的不同步骤进行洗涤和以小滴形式或使用连续流来灌注新试剂。流体连通微通道可含有通往和/或离开多个解析座位和多个解析反应器的入口和出口。可以用本领域已知的任何方法制作入口和/或出口。例如，入口和/或出口可以设置在基底的前侧和背侧上。创建入口和/或出口的方法在美国专利公开号US20080308884A1(其通过引用以其全文并入本文)中描述，并且可包括通过在前侧上进行平版印刷和蚀刻过程制作合适的微结构组件；从所述基底的背侧钻出与前侧上的微结构精确对准的孔穴，从而提供通往和/或离开所述微机械结构入口和/或出口。入口和/或出口可以是Hele-Shaw型流通池，其中流体在通过歧管进料的薄间隙中流动。如图9A所示，本文所述的基底可构成流通池的一部分。通过在基底(即，晶片)顶部上滑动盖板可以闭合流通池，并且可将其夹持到位从而围绕基底的边缘形成耐压密封。在一些实施方案中，密封可足以抵抗真空或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个大气压密封。可将试剂引入到基底(即晶片)下方的薄间隙中并通过基底向上流动。然后可将试剂收集在如图9B所示的锥形废物收集器中。在一些实施方案中，在最终的溶剂洗涤步骤后，晶片可被排干(例如通过组装件的底部)，然后用氮气吹扫。然后可使区室降低至真空以将任何微结构中的剩余溶剂完全干燥，从而使残留液体或水分按体积计减少至少至50％、30％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％或更少。然后可使区室降低至真空以将基底周围的压力减少到小于0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、75、100、200、300、400、500或1000毫托。在一些情况下，在真空步骤后可用氮气充满区室，并且可再次将顶盖滑开以使得系统的辅助部分(例如打印机)能够接近(access)。在一些情况下，流通池可以打开。如图9B中所示，基底/晶片可安装成将废物歧管侧向移置。这种设置可允许喷墨打印机更容易接近晶片。在这时可将试剂沉积到微孔中。在一些实施方案中，解析包围体(即流通池)的盖板可充当废物收集器，且试剂的液体可流动到其中。图9B和图9C中的箭头表示试剂的示例性流动方向。在一些情况下，如图9C中所示，试剂可通过底部上的薄间隙进入，穿过基底(例如，硅晶片)中的孔穴，并被收集在废物收集器中。在一些情况下，可以通过上部歧管或底部歧管吹扫气体，以便例如通过流通池的底部或顶部逐出液体。出口或入口端口可连接至真空以完成干燥。如图10中所示，真空端口可连接至废物侧或入口侧。在一些实施方案中，可存在穿过基底(即，晶片)的多个压力释放孔。所述多个孔可多于约1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000或2000000个。在一些情况下，所述多个孔可多于五百万个。在一些情况下，本文其他部分所进一步详细描述的用于合成的微结构充当压力释放孔。这些孔可允许气体在解析包围体被抽空时从晶片的一侧穿过，以使基底干燥。在一些情况下，例如如果空气被逐出废物收集器侧，废物收集器侧的空气压力(P_废物)可维持在与入口侧的空气压力(P)基本相同的水平。在一些实施方案中，可使用将入口歧管连接至废物收集器的端口。因此，本文所述的多个步骤，如扫描、沉积、充溢、洗涤、吹扫和/或干燥，可在不传送晶片基底的情况下进行。

通过密封第一基底和第二基底形成的解析反应器可被包围在具有受控的湿度、空气含量、蒸汽压力和/或压力的区室中，以形成具有受控环境的组装体。在一些实施方案中，区室的湿度可以为饱和的或约100％，以防止反应期间液体从解析反应器蒸发。例如，湿度可以控制为约、小于约或大于约100％、99.5％、99％、98.5％、98％、97.5％、97％、96.5％、96％、95.5％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或25％。

本文所述的系统，诸如上述具有受控环境组装件的系统，可包括可操作地与多个解析反应器相连接的真空装置/吸盘和/或温度控制系统。基底可放置在真空吸盘上。真空吸盘可包括位于基底正下方的表面不规则性。在多个实施方案中，表面不规则性可包括通道或凹陷。真空吸盘可与基底流体连通，以将气体抽出由通道所限定的空间。在通过引用而全文并入本文的美国专利号8247221中进一步详细描述了将基底保持在真空装置上的方法。

在多个实施方案中，基底(例如，硅晶片)可以放置到吸盘，诸如上文所述的真空吸盘上。图10举例说明了单槽真空吸盘和位于基底与温度控制装置之间的烧结金属件的系统组装件。真空吸盘可包括具有用以容纳基底的合适尺寸的单个沟槽。在一些实施方案中，将真空吸盘设计成使得基底可在本文所述的一个或多个方法的过程中被保持就位。在图10A中作为示例而示出的真空吸盘包括直径大致为198mm的单个1-5mm沟槽。在一些情况下，单槽真空吸盘设计可用于提供改善的向基底的热传递。图10B图示了位于基底(例如，硅晶片)与真空吸盘之间的烧结金属嵌件，该烧结金属嵌件用粘合剂固定就位。在一些实施方案中，如在通过引用而全文并入本文的美国专利号5,530,516中所进一步描述的，该吸盘可为静电吸盘。

如在全部通过引用而全文并入本文的美国专利号8,367,016和欧洲专利号EP0126621B1中所描述的，可以使用本领域中已知的任何技术将多个解析反应器帽与第一表面上的多个解析座位对准，从而在第一表面与加帽元件之间形成暂时的密封。例如，对于带有具有x、y和z维度以及沿着z维度定位的座位深度中心点的多个解析座位的基底，该座位深度中心点可位于离嵌入在基底内的基准标记的已知z维度距离处。基底可放置在成像系统内，该成像系统可包括能够检测基准标记的光学器件。该光学器件可限定与z维度轴向对准的光路，并可具有垂直于该光路的焦平面。当焦平面沿着光路移动时，与当焦平面基本上不与z深度共面时相比，当焦平面处于z深度时可最大程度地检测到基准标记。基准标记可选择性地以合适的空间布置放置在第一基底(例如，包含多个解析座位的合成晶片)和/或第二基底(例如，包含多个加帽元件的反应器元件)上。在一些实施方案中，全局对准基准标记可形成于解析座位附近。根据应用，可能存在变化、改变和修改。例如，基准标记中的两个可位于解析座位附近，并且第三基准标记可位于基底的边缘。举另一例而言，本文所述基底中的微结构的图案本身能够以适合于对准的可识别方式来选择，例如为非对称图案，并且可用于对准。在一些情况下，基准标记充当用以校正景深或其他光学特性的对准点。通过引用而全文并入本文的美国专利号4,123,661公开了位于基底上的电子束对准标记，这些标记彼此相邻但隔开一定距离，使得该标记的上升沿和下降沿可被视频信号检测到，从而允许对准。

该系统可包括加热组件、冷却组件或者温度控制元件(例如，热循环器件)。在多个实施方案中，可将随多个解析反应器使用的热循环器件配置用于进行核酸扩增或组装，诸如PCR或PCA，或者本文所述或本领域中已知的任何其他合适的核酸反应。可以控制温度，使得反应器内的温度可以是均匀的并且热量可以被迅速传导。在多个实施方案中，本文所述的系统可具有用于例如在寡核苷酸合成、基因组装或核酸扩增期间从反应器或基底内的个别微结构进行终点或实时检测的检测组件。

本文所述的任何系统均能够可操作地连接至计算机，并且可以本地或远程地通过计算机进行自动化。用于控制本文所述的系统组件的计算机和计算机系统在本文其他部分进一步描述。

主要组合物-寡核苷酸

本文所使用的术语“预选序列”、“预定序列”或“预确定顺序”可互换使用。所述术语意味着聚合物的序列是已知的，并且是在聚合物的合成或组装之前选择的。具体地，本发明的多个方面主要就核酸分子的制备、在核酸分子合成或组装前已知的和选择的寡核苷酸或多核苷酸的序列而在本文中进行了描述。在一个实施方案中，寡核苷酸为短核酸分子。例如，寡核苷酸可为从约10个到约300个核苷酸、从约20个到约400个核苷酸、从约30个至约500个核苷酸、从约40个到约600个核苷酸，或者多于约600个核苷酸长。本领域技术人员知晓，寡核苷酸长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，从约10个到约400个核苷酸，或者从约300个到约400个核苷酸等)。根据特定应用的需要，可使用适当短或长的寡核苷酸。单个寡核苷酸可被设计成具有与文库中的另一寡核苷酸不同的长度。寡核苷酸可相对较短，例如更具体而言，短于200、100、80、60、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5或4个核苷酸。还考虑到相对较长的寡核苷酸；在一些实施方案中，寡核苷酸长于或等于7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、350、400、500、600个核苷酸，或者更长。通常，寡核苷酸为单链DNA或RNA分子。

在本发明的一个方面，提供了用于合成多个具有预定序列的核酸的装置。该装置可包括具有多个特征的支持物，每个特征都具有多个寡核苷酸。在一些实施方案中，所述具有预定序列的多个寡核苷酸固定于固体支持物的不同离散特征上。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是单链的。在一些实施方案中，所述多个寡核苷酸序列可包含简并序列。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是与支持物结合的。在一些实施方案中，所述装置包含具有多个斑点(spot)或特征的固体支持物，所述多个斑点中的每一个包括多个与支持物结合的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸通过其3’端共价连接至固体支持物上。然而，在其他实施方案中，所述寡核苷酸通过其5’端共价连接至固体支持物上。

在一些实施方案中，表面或者与支持物结合的寡核苷酸通过其3’端固定。应当理解，所谓3’端，意指位于5’端下游的序列，例如，在5’端的2、3、4、5、6、7、10、15、20个或更多个核苷酸下游，再如，在该序列的3’半部、三分之一或者四分之一上，又如，远离绝对3’端不到2、3、4、5、6、7、10、15或20个核苷酸；所谓5’端，意指位于3’端上游的序列，例如，在3’端的2、3、4、5、6、7、10、15、20个或更多个核苷酸上游，再如，在该序列的5’半部、三分之一或者四分之一上，又如，远离绝对5’端不到2、3、4、5、6、7、10、15或20个核苷酸。例如，寡核苷酸可通过核苷酸序列(例如，简并结合序列)、连接体或者间隔区(例如，不参与杂交的部分)固定在支持物上。在一些实施方案中，寡核苷酸包含间隔区或者连接体以将寡核苷酸序列与支持物隔开。有用的间隔区或连接体包括可光切割的连接体或者其他传统的化学连接体。在一个实施方案中，寡核苷酸可通过可切割的连接部分附接到固体支持物上。例如，可将固体支持物功能化以提供用于共价连接至寡核苷酸的可切割的连接体。连接体部分可以是六个或更多个原子的长度。或者，可切割部分可在寡核苷酸内，并可在原位合成过程中引入。众多的可切割部分在固相和微阵列寡核苷酸合成领域中是可获得的(参见，例如Pon,R.,MethodsMol.Biol.20:465-496(1993)；Verma等人,Annu.Rev.Biochem.67:99-134(1998)；美国专利号5,739,386、5,700,642和5,830,655；以及美国专利公布号2003/0186226和2004/0106728)。可选择合适的可切割部分以与核苷碱基的保护基团的性质、固体支持物的选择和/或试剂递送的模式等相匹配。在示例性的实施方案中，从固体支持物上切下的寡核苷酸含有游离的3'-OH端。或者，在寡核苷酸切割后，还可通过化学或酶处理获得游离的3'-OH端。在多个实施方案中，本发明涉及用于将与支持物或表面结合的寡核苷酸释放到溶液中的方法和组合物。可在不会降解寡核苷酸的条件下将可切割部分去除。优选地可采用两种方法切割连接体：在与脱保护步骤相同的条件下同时进行，或在脱保护步骤完成之后采用不同的用于连接体切割的条件或试剂随后进行。

在其他实施方案中，寡核苷酸在溶液中。例如，寡核苷酸可在离散的体积，如在不同离散特征处的小滴或微滴内提供。在一些实施方案中，可采用在约0.5pL与约100nL之间的离散微体积。然而，可采用更小或更大的体积。在一些实施方案中，可使用合适的分配器或连续流(如由泵驱动的通过微结构的流)将小于100nL、小于10nL、小于5nL、小于100pL、小于10pL或小于0.5pL的体积转移到本文所述基底的微结构以及它们之间。例如，通过推动流体通过寡核苷酸合成晶片，来自寡核苷酸合成晶片的一个或多个微结构的小体积可被分配到加帽元件的反应器帽中。

在一些实施方案中，在支持物的不同特征上提供多个核苷酸构建体。在一些实施方案中，核酸构建体(包括短的寡核苷酸和较长的/组装的多核苷酸)是部分双链的或双链体寡核苷酸。如本文所使用的，术语“双链体”是指至少部分地为双链的核酸分子。术语“核苷”或“核苷酸”意在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还含有其他已被修饰的杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖，或其他杂环化合物，或本文所描述的或本领域已知的任何其他合适的修饰。此外，术语“核苷”和“核苷酸”还包括那些不仅含有常规的核糖和脱氧核糖而且还含有其他糖的部分。修饰的核苷或核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基基团被卤素原子或脂肪族基团替代，或被功能化为醚、胺等。

应理解，如本文所用，术语“核苷”和“核苷酸”是指不仅含有常规的嘌呤和嘧啶碱基(即腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U))，还含有其保护形式(例如，其中碱基用诸如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基等保护基团保护)以及嘌呤和嘧啶类似物的核苷和核苷酸。合适的类似物将是本领域技术人员所知的，并在相关文本和文献中描述。常见的类似物包括但不限于1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨基甲基)尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、辫苷(queosine)、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-巯基嘌呤以及2,6-二氨基嘌呤。此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括那些不仅含有常规的核糖和脱氧核糖而且还含有其他糖的部分。修饰的核苷或核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基基团被卤素原子或脂肪族基团替代，或被功能化为醚、胺等。

如本文所使用的，术语“寡核苷酸”应当为以下物质的统称：多聚脱氧核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其他类型的为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的多核苷酸，以及其他含有非核苷酸骨架的聚合物(例如，PNA)，条件是该聚合物含有呈允许碱基配对和碱基堆积的配置的核碱基，如在DNA和RNA中所发现的。因此，这些术语包括已知类型的寡核苷酸修饰，例如，一个或多个天然存在的核苷酸被类似物置换，核苷酸间修饰，例如，具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等)、具有带负电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)以及具有带正电荷的键(例如，氨基烷基亚磷酰胺、氨基烷基磷酸三酯)的修饰，含有突出部分例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的修饰，具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的修饰，含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间在长度上并没有有意的区别，这些术语可以互换使用。

术语“附接”，如在例如具有“附接”至其上的部分的基底表面中所使用的，包括共价结合、吸附和物理固定。术语“结合”与术语“附接”在含义上是相同的。

在多个实施方案中，本发明涉及除核酸外的分子的合成，如化学合成。如在整个说明书和权利要求书中所用的术语“肽”、“肽基”和“肽的”旨在包括由两个或更多个氨基酸组成的任何结构。在大多数情况下，在本阵列中的肽包含约5至10,000个氨基酸，优选约5至1000个氨基酸。构成肽的全部或部分的氨基酸可以是二十种传统的、天然存在的氨基酸中的任何氨基酸，即，丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(L)、赖氨酸(L)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。构成本阵列的肽分子中的任何氨基酸均可被非传统的氨基酸替代。通常，保守替换是优选的。保守替换将原始氨基酸置换为在一个或多个其特有性质(例如，电荷、疏水性、空间体积；例如，可以用Nval替换Val)上与原始氨基酸类似的非传统氨基酸。术语“非传统氨基酸”是指除了传统氨基酸之外的氨基酸，并且包括例如，传统氨基酸的异构体和修饰(例如，D-氨基酸)、非蛋白质氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶修饰的氨基酸、设计为模拟氨基酸的构建体或结构(例如，α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、β-丙氨酸、萘基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羟基脯氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸以及正亮氨酸)，和在肽骨架内的一个或多个位点处天然存在的酰胺-CONH-键被非传统键(如N-取代的酰胺、酯、硫代酰胺、反式肽(retropeptide)(-NHCO-)、反式硫代酰胺(retrothioamide)(-NHCS-)、磺酰氨基(-SO2NH-))替换的肽，和/或类肽(N-取代的甘氨酸)键。因此，阵列的肽分子包括伪肽和拟肽。本发明的肽可以是(a)天然存在的，(b)通过化学合成产生的，(c)通过重组DNA技术产生的，(d)通过较大分子的生物化学或酶促片段化产生的，(e)通过从上面列出的方法(a)到(d)的组合得到的方法产生的，或(f)通过任何其他用于产生肽的手段产生的。

术语“寡聚物”意在包括任何具有重复部分(如核苷酸、氨基酸、碳水化合物等)的多核苷酸或多肽或其他化学化合物。

在一些实例中，所述装置在特定位置(即，“地址”)具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、25、30、40、50、100、1000、4000、10000、100000、1000000个或更多个不同的特征(或“区域”或“斑点”)。应当理解，装置可包含一个或多个固体支持物。装置的每个可寻址位置可保持不同的组合物，如不同的寡核苷酸。或者，装置的成组可寻址位置可保持完全或基本相似的组合物，如寡核苷酸，这些组合物不同于保持在装置的其他组显微结构中的那些组合物。

可利用本发明的方法在可单独寻址的位置和/或在混合群体中制备的每种寡核苷酸的数目可以在5到500000、500到500000、1000到500000、5000到500000、10000到500000、20000到500000、30000到500000、5000到250000、5000到100000、5到5000、5到50000、5000到800000、5000到1000000、5000到2000000、10000到2000000、20000到1000000、30000到2000000等范围内。在多个实施方案中，可以合成每种寡核苷酸的大约或超过约5、10、20、50、100、500、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000个或更多个拷贝。在一些情况下，可以合成寡核苷酸的少于100000000、10000000、1000000、100000、10000、1000、100个或更少的拷贝。

寡核苷酸硫代磷酸酯(OPS)是修饰的寡核苷酸，其中磷酸酯部分中的一个氧原子被硫替代。在非桥接位置处具有硫的硫代磷酸酯得到广泛使用。OPS对于核酸酶的水解明显更加稳定。该性质使得OPS成为在包括广泛暴露于核酸酶的体外和体内应用中用作反义寡核苷酸的有利候选物。类似地，为了提高siRNA的稳定性，常常在有义和/或反义链的3'-末端处引入至少一个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物涉及OPS的从头/化学合成。大量OPS的合成可采用本文所述的方法和组合物平行进行。

单链核酸的扩增

在多个实施方案中，所述方法和系统涉及单链核酸的扩增。相应地，单链核酸，例如单链DNA(ssDNA)，可在分离的样品中扩增，在多个样品中平行扩增，或在同一样品内有多种不同单链核酸的样品中以多重化(multiplexed)形式扩增。所述多个可以以平行形式扩增的样品可以为至少或至少约1、2、3、4、5、10、20、25、50、55、100、150、200、250、300、350、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多。所述多个可以以平行形式扩增的样品可以在1-1000、2-950、3-900、4-850、5-800、10-800、20-750、25-700、30-650、35-600、40-550、45-500、50-450、55-400、60-350、65-250、70-200、75-150、80-100个之间。本领域技术人员应理解，所述多个可以以平行形式扩增的样品可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如3-800个。多重扩增反应的数目可以为至少或至少约1、2、3、4、5、10、20、25、50、100个或更多。多重扩增反应的数目可以在1-100、2-50、3-25、4-20、5-10之间。本领域技术人员应理解，多重扩增反应的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如3-100个。

在同一样品内的不同单链核酸的数目可以为至少或至少约1、2、3、10、50、100、150、200、1000、10000、100000个或更多。在同一样品内的不同单链核酸的数目可以为至多或至多约10000、10000、1000、200、150、100、50、10、3、2、1个或更少。在同一样品内的不同单链核酸的数目可以处于1-100000、2-10000、3-1000、10-200、50-100个之间。本领域技术人员理解，在同一样品内的不同单链核酸的数目可以处于由这些值中的任何值所限定的这些范围中的任何值范围内，例如，3-100个。

单链靶核酸可以为至少或至少约10、20、50、100、200、500、1000、3000个或更多个核苷酸的长度。单链靶核酸可以为至多或至多约3000、1000、500、200、100、50、20、10个或更少个核苷酸的长度。单链靶核酸可以为50-500、75-450或100-400个核苷酸的长度。本领域技术人员理解，单链靶核酸的长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如50-1000个。

现参考图64，单链靶核酸的侧翼可具有一个或多个衔接子杂交序列。这些衔接子杂交序列可以为至少或至少约12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核苷酸的长度。这些衔接子杂交序列可以为至少或至少约20、19、18、17、16、15、14、13、12个或更少个核苷酸的长度。衔接子杂交序列可以为15-20、16-19、17-18个核苷酸的长度。本领域技术人员理解，衔接子杂交序列的长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如15-17、12-20或13-25个。衔接子杂交序列可以由样品内的多种核酸共享，其中这类多种单链核酸具有不同的单链靶核酸区域。多组单链核酸(每组均具有不同的衔接子杂交序列)可在样品内共存并经历本文所述的扩增方法。不同的衔接子杂交序列可彼此相差至少或至少约1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。不同的衔接子杂交序列可彼此相差至多或至多约50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、2、1个或更少的核苷酸。不同的衔接子杂交序列可彼此相差1-50、2-45、5-40、10-35、15-25或20-30的核苷酸数目。本领域技术人员理解，不同的衔接子杂交序列可彼此相差处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内的核苷酸数目，例如2-50个。因此，单个通用衔接子可用于许多共享末端序列的单链核酸，使得该通用衔接子可与它们全部杂交。多个衔接子可在具有多组单链核酸的样品中使用，其中每个衔接子可与一个或多个该组中的末端序列杂交。至少或至少约1、2、3、4、5、10、20、25、30、50、100个或更多个衔接子可以以多重化方式使用。至多或至多约100、50、30、25、20、10、5、4、3、21、1个或更少的衔接子可以以多重化方式使用。1-100、2-50、3-30、4-25、5-20个衔接子可以以多重化方式使用。本领域技术人员理解，可以以多重化方式使用的衔接子的数目可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如2-30个。衔接子上的第一序列可与单链核酸的5’端杂交，而该衔接子上的第二序列可与同一单链核酸的3’端杂交，从而促进该单链核酸的环化。

单链核酸可在与衔接子杂交后环化。环化的单链核酸可在其5’和3’端接合，形成连续的环。如本文其他部分所述或本领域已知的，多种连接方法和酶适用于该反应。

可采用环化的单链核酸作为模板来延伸衔接子。或者，除了衔接子之外或代替衔接子，一个或多个不同的引物还可用于在环上的其他位置退火，并可通过聚合酶延伸。延伸反应，如滚环扩增、多引物滚环扩增或任何其他合适的延伸反应，可促进产生一个包含单链模板核酸和衔接子杂交序列的交替复制物的线性长单链扩增子核酸。在一些实施方案中，衔接子杂交序列的组合复制物是衔接子序列的拷贝，或相差少于8、7、6、5、4、3或2个核苷酸。为方便起见，这些序列将一起被称为“衔接子拷贝”，但应理解，其可指采用环作为模板由延伸反应产生的许多不同类型的序列。

可提供一个或多个辅助寡核苷酸以与单链扩增子核酸退火。辅助寡核苷酸可以与衔接子拷贝部分或完全互补。辅助寡核苷酸与单链扩增子核酸的杂交可形成交替的单链和双链区。单链区可对应于单链模板核酸序列的复制物。辅助寡核苷酸与单链扩增子核酸例如在衔接子拷贝处的杂交可产生切割剂(如限制性内切核酸酶，例如，IIS型限制性内切核酸酶)的识别位点。可以以使得切割剂的切割位点落在单链和双链区的接合点处或附近的方式来设计序列。在一些情况下，用一种或多种切割剂切割时，将会形成单链靶核酸的多个单链复制物，其中该单链靶核酸不含有任何来自衔接子拷贝的部分，或含有少于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个来自衔接子拷贝的核苷酸。

辅助寡核苷酸可具有亲和标记物，如生物素或生物素衍生物。亲和标记物可以在5’端、3’端或在寡核苷酸的中间。可在纯化介质如链霉亲和素涂覆的珠子表面上使用亲和结合配偶体或任何其他适当的亲和纯化方法来促进从样品中纯化辅助寡核苷酸。切割的衔接子拷贝或其部分还可与辅助寡核苷酸一起被纯化，这由它们与辅助寡核苷酸的杂交来促进。在使用多个衔接子的多重反应中，可使用多个辅助寡核苷酸，其每一个均与不同组的单链扩增子核酸例如在衔接子拷贝的位置处杂交。替代的纯化方法，如HPLC或PAGE纯化，可与或不与亲和标记的寡核苷酸一起使用。

现参考图65，除了对序列和切割剂进行选择以使得切割位点落在衔接子拷贝内，从而使得与侧翼区形成单链靶核酸序列的单链复制物之外，还可以以与针对图64描述的方法相似的方式扩增单链核酸。这样的侧翼区可以是原始的单链靶核酸序列的侧翼区的反向互补序列。或者，根据切割位点的确切位置，其可将核苷酸从一个侧翼区“移动”到其他侧翼区。在这类情况下，衔接子核苷酸的反向互补寡核苷酸仍可有效地与两端杂交，从而促进另一轮环化。因此，在图65中示出的方法可单独地或作为图64中示出的方法的前驱反应重复多次，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30次或更多次，以扩增单链靶核酸。图64中示出的方法可作为最后一轮用以除去侧翼区，留下单链靶核酸的扩增的单链拷贝或复制物。

包含扩增的所需寡核苷酸和衔接子寡核苷酸的单链重复单元的延伸反应产物，如滚环扩增产物，可在衔接子寡核苷酸内或附近被切割，以产生释放的所需寡核苷酸，其中该释放的期望寡核苷酸在所需寡核苷酸的5’或3’端可以包含或可以不包含衔接子核苷酸。在一些实施方案中，正好在扩增的所需寡核苷酸的单链重复单元与衔接子序列的接合点处完成切割。在一些实施方案中，衔接子序列的一个或多个区域包含分子条形码、蛋白质结合位点、限制性内切核酸酶位点或其任意组合。在一些实施方案中，用一种或多种限制性内切核酸酶在限制性内切核酸酶识别位点处或附近切割扩增产物，其中该识别位点位于衔接子寡核苷酸序列内。在用内切核酸酶切割之前，扩增产物可与包含序列的辅助寡核苷酸杂交，该序列与包含限制性内切核酸酶识别位点的衔接子寡核苷酸序列互补。

可用II型内切核酸酶在识别位点的5’端处切割扩增产物。切割位点可以在识别位点的第一个核苷酸上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸处。识别位点的5’或3’端可形成0、1、2、3、4或5个核苷酸的突出端。切割后产生0个核苷酸的突出端的平端II型内切核酸酶包括MlyI和SchI。产生5’突出端(例如，1、2、3、4、5个核苷酸的突出端)的示例性IIS型内切核酸酶包括但不限于AlwI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、FokI、HgaI、PleI、SfaNI、BfuAI、BsaI、BspMI、BtgZI、EarI、BspQI、SapI、SgeI、BceFI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、FaqI、AceIII、BbvII、BveI和LguI。去除识别位点并在识别位点的5’侧切割的切口内切核酸酶包括但不限于Nb.BsrDI、Nb.BtsI、AspCNI、BscGI、BspNCI、EcoHI、FinI、TsuI、UbaF11I、UnbI、Vpak11AI、BspGI、DrdII、Pfl1108I和UbaPI。

扩增产物可用非IIS型内切核酸酶切割，该酶在两条链上的识别位点的5’端处都进行切割以产生平端。扩增产物可用非IIS型内切核酸酶切割，该酶在一条链上的识别位点的5’端处并在另一条链上的识别位点的中间进行切割，从而产生5’突出端。产生5’突出端的内切核酸酶的实例包括但不限于BfuCI、DpnII、FatI、MboI、MluCI、Sau3AI、Tsp509I、BssKI、PspGI、StyD4I、Tsp45I、AoxI、BscFI、Bsp143I、BssMI、BseENII、BstMBI、Kzo9I、NedII、Sse9I、TasI、TspEI、AjnI、BstSCI、EcoRII、MaeIII、NmuCI和Psp6I。

扩增产物可用在识别位点的5’端处进行切割以产生切口的切口内切核酸酶来切割。切口位点可以在识别位点的第一个核苷酸上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸处。示例性的切口内切核酸酶包括但不限于Nb.BsrDI、Nb.BtsI、AspCNI、BscGI、BspNCI、EcoHI、FinI、TsuI、UbaF11I、UnbI、Vpak11AI、BspGI、DrdII、Pfl1108I和UbaPI。

可用IIS型内切核酸酶在识别位点的3’端处切割扩增产物。识别位点的5’或3’端可形成0、1、2、3、4或5个核苷酸的突出端。切割位点可以在识别位点的最后核苷酸下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸处。在识别位点的最后核苷酸下游0个核苷酸处进行切割的IIS型内切核酸酶包括MlyI和SchI。产生3’突出端(例如，1、2、3、4、5个核苷酸的突出端)的示例性IIS型内切核酸酶包括但不限于MnlI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HphI、HpyAV、MboII、AcuI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsmI、BsrDI、BtsI、EciI、MmeI、NmeAIII、Hin4II、TscAI、Bce83I、BmuI、BsbI和BscCI。在一条链上去除识别位点并在另一条链上产生3’突出端或平端的非II型内切核酸酶包括但不限于NlaIII、Hpy99I、TspRI、FaeI、Hin1II、Hsp92II、SetI、TaiI、TscI、TscAI和TseFI。去除识别位点并在识别位点的3’端切割的切口内切核酸酶包括Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI和Nt.BspQI。

识别位点与切割位点之间的距离可取决于用于切割的限制性内切核酸酶。例如，可在最佳反应条件下有效切割的、切割位点位于识别位点下游或上游1个碱基对处的限制性内切核酸酶包括但不限于Agel、ApaI、AscI、BmtI、BsaI、BsmBI、BsrGI、DdeI、DraIII、HpaI、MseI、PacI、Pcil、PmeI、PvuI、SacII、SapI、Sau3AI、ScaI、Sfil、SmaI、SphI、StuI和XmaI。可在最佳反应条件下有效切割的、切割位点位于识别位点下游或上游2个碱基对处的限制性内切核酸酶包括但不限于AgeI、AluI、ApaI、AscI、BglII、BmtI、BsaI、BsiWI、BsmBI、BsrGI、BssHII、DdeI、DralII、EagI、HpaI、KpnI、MseI、NlaIII、PacI、PciI、PmeI、PstI、PvuI、RsaI、SacII、SapI、Sau3AI、Sbfl、ScaI、Sfil、SmaI、SphI、SspI、StuI、StyI和XmaI。可在最佳反应条件下有效切割的、切割位点位于识别位点下游或上游3个碱基对处的限制性内切核酸酶包括但不限于AgeI、AluI、ApaI、AscI、AvrII、BamHI、BglII、BmtI、BsaI、BsiWI、BsmBI、BsrGI、BssHII、DdeI、DralII、EagI、FseI、HindIII、HpaI、KpnI、MfeI、MluI、MseI、NcoI、NdeI、NheI、NlaIII、NsiI、PacI、PciI、PmeI、PstI、RsaI、SacI、SacII、SaII、SapI、Sau3AI、Sbfl、ScaI、Sfil、SmaI、SphI、SspI、StuI、StyI和XmaI。可在最佳反应条件下有效切割的、切割位点位于识别位点下游或上游4个碱基对处的限制性内切核酸酶包括但不限于AgeI、AluI、ApaI、AscI、AvrII、BamHI、BglII、BmtI、BsaI、BsiWI、BsmBI、BsrGI、BssHII、ClaI、DdeI、DralII、EagI、EcoRI、FseI、HindIII、HpaI、KpnI、MfeI、MluI、MseI、NcoI、NdeI、NheI、NlaIII、NsiI、PacI、PciI、PmeI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、SacI、SacII、SaII、SapI、Sau3AI、Sbfl、ScaI、Sfil、SmaI、SphI、SspI、StuI、StyI、XhoI和XmaI。可在最佳反应条件下有效切割的、切割位点位于识别位点下游或上游5个碱基对处的限制性内切核酸酶包括但不限于AgeI、AluI、ApaI、AscI、AvrII、BamHI、BglII、BmtI、BsaI、BsiWI、BsmBI、BsrGI、BssHII、ClaI、DdeI、DralII、EagI、EcoRI、EcoRV、FseI、HindIII、HpaI、KpnI、MfeI、MluI、MseI、NcoI、NdeI、NheI、NlaIII、NsiI、NspI、PacI、PciI、PmeI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、SacI、SacII、SaII、SapI、Sau3AI、Sbfl、ScaI、Sfil、SmaI、SphI、SspI、StuI、StyI、XhoI和XmaI。

衔接子序列可包含一个或多个限制性识别位点。在一些实施方案中，识别位点为至少4、5或6个碱基对的长度。在一些实施方案中，识别位点是非回文的。在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸包含两个或更多个识别位点。两个或更多个识别位点可用一种或多种限制酶进行切割。本领域技术人员将知晓，用两种或更多种限制酶切割两个或更多个识别位点可通过缓冲液和反应温度优化而实现和/或完善。衔接子序列中的示例性识别位点对包括但不限于MlyI-MlyI、MlyI-Nt.AlwI、BsaI-MlyI、MlyI-BciVI和BfuCI-MlyI。

基因

在多个实施方案中，本发明的方法和组合物允许构建包含一批感兴趣的可单独获取的多核苷酸的基因文库。该多核苷酸可以是线性的，可维持在载体(例如，质粒或噬菌体)、细胞(例如，细菌细胞)中，作为纯化的DNA，或作为本领域已知的其他合适的形式。文库成员(不同地称为克隆、构建体、多核苷酸等)可以以多种方式储存以用于检索和使用，包括例如，在多孔培养物或微量滴定板中，在小瓶中，在合适的细胞环境(例如，大肠杆菌细胞)中，作为在合适的储存介质(例如，StorageIsoCodeDIDTMDNA文库卡；Schleicher&SchuellBioScience)上的纯化的DNA组合物，或多种本领域已知的其他合适的文库形式。基因文库可包含至少约10、100、200、300、400、500、600、750、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000、15000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000个或更多个成员。本文所述的核酸分子可以以微尺度的量产生(例如，飞摩尔到纳摩尔的量，如从约0.001飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约0.01飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约0.1飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约0.001飞摩尔到约0.1纳摩尔、从约0.001飞摩尔到约0.01纳摩尔、从约0.001飞摩尔到约0.001纳摩尔、从约1.0飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约1.0飞摩尔到约0.1纳摩尔、从约1.0飞摩尔到约0.01纳摩尔、从约1.0飞摩尔到约0.001纳摩尔、从约10飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约10飞摩尔到约0.001纳摩尔、从约20飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约100飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约500飞摩尔到约1.0纳摩尔、从约1纳摩尔到约800纳摩尔、从约40纳摩尔到约800纳摩尔、从约100纳摩尔到约800纳摩尔、从约200纳摩尔到约800纳摩尔、从约500纳摩尔到约800纳摩尔、从约100纳摩尔到约1,000纳摩尔等)。本领域技术人员理解，核酸的量可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，从约0.001飞摩尔到约1000纳摩尔或从约0.001飞摩尔到约0.01飞摩尔)。通常，核酸分子可以以大约或超过约0.001、0.01、0.1、1、10、100飞摩尔，1、10、100皮摩尔，1、10、100纳摩尔，1毫摩尔或更多的量产生。在一些实施方案中，核酸分子可以以少于约1微摩尔，100、10、1纳摩尔、100、10、1皮摩尔、100、10、1、0.1、0.001、0.001飞摩尔或更少的量产生。在一些实施方案中，核酸分子可以以大约或超过约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、750、1000nM的浓度产生。在一些实施方案中，基因文库在小于1000、100、10、1m³，100、10、1dm³，100、10、1cm³或更小的空间中合成/组装和/或保持。

可以得到或容易确定可单独获取的成员的位置。可单独获取的成员可以容易地从文库中检索得到。

在多个实施方案中，本发明的方法和组合物允许产生合成的(即从头合成的)基因。包含合成基因的文库可通过在本文其他部分更详细描述的多种方法来构建，如PCA、非PCA基因组装方法或分层基因组装，将两条或更多条双链多核苷酸(这里称为“合成子(synthons)”)组合(“缝接”)起来以产生更大的DNA单元(即，多合成子或底盘(chassis))。大构建体的文库可包含长度为至少1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500kb或更长的多核苷酸。大构建体可被约5000、10000、20000或50000个碱基对的独立选择的上限约束。任意数目的编码多肽区段的核苷酸序列的合成，该序列包括编码非核糖体肽(NRP)的序列，编码以下物质的序列：非核糖肽合成酶(NRPS)模块和合成变体、其他模块化蛋白质如抗体的多肽区段、来自其他蛋白质家族的多肽区段，包括非编码DNA或RNA，如调控序列，例如启动子、转录因子、增强子、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、衍生自微RNA的核仁小RNA，或感兴趣的任何功能性或结构性DNA或RNA单元。如本文所用的术语“基因”广义地指任何类型的编码或非编码的长多核苷酸或多核苷酸类似物。

在多个实施方案中，本发明的方法和组合物涉及基因的文库。基因文库可包含多个子区段。在一个或多个子区段中，文库中的基因可共价地连接在一起。在一个或多个子区段中，文库中的基因可编码具有一种或多种代谢终产物的第一代谢途径的组分。在一个或多个子区段中，文库中的基因可根据一种或多种目标代谢终产物的制备过程来选择。所述一种或多种代谢终产物包括生物燃料。在一个或多个子区段中，文库中的基因可编码具有一种或多种代谢终产物的第二代谢途径的组分。第一和第二代谢途径的一种或多种终产物可包括一种或多种共享的终产物。在一些情况下，第一代谢途径包含在第二代谢途径中操作的终产物。

在一些实施方案中，文库中的子区段可包含编码合成生物体(例如病毒或细菌)的基因组的一部分或者全部的基因、由该基因组成或者基本上由该基因组成。因此，术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可以互换使用并且指代核苷酸聚合物。除非另有限制，这些术语包括天然核苷酸的已知的类似物，这些类似物能够以与天然存在的核苷酸相似的方式起作用(如，杂交)。它们可以是任何长度的聚合形式的核苷酸，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并可执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、基因间DNA、由连锁分析限定的基因座(座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核仁小RNA、核酶、互补DNA(cDNA)(其为mRNA的DNA表现形式，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增获得)；经合成或通过扩增产生的DNA分子、基因组DNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物的组装之前或之后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，如通过与标记组分缀合。除非另有说明，当提供多核苷酸序列时，其以5'到3'方向列出。

术语核酸包括双链或三链核酸，以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不必共同延伸(即，双链核酸不必沿两条链的全长均是双链的)。

术语核酸还包括其任何化学修饰，如通过甲基化和/或通过加帽。核酸修饰可包括向单个核酸碱基或作为一个整体的核酸添加并入额外的电荷、极化性、氢键键合、静电相互作用和功能性的化学基团。这类修饰可包括碱基修饰，如2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺处的修饰、5-溴尿嘧啶的置换、骨架修饰、不寻常的碱基配对组合，如异碱基异胞苷和异胍等。

更具体地，在某些实施方案中，核酸可包括多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)和为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型的核酸，以及其他含有非核苷酸骨架的聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和聚吗啉(可从Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oreg.作为Neugene商购)聚合物以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是该聚合物含有呈允许碱基配对和碱基堆积的构型的核碱基，如在DNA和RNA中所发现的。术语核酸还包括联核酸(LNA)，其在美国专利号6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中描述，这些专利由于其中LNA的公开内容而通过引用以其全文并入本文。

如本文所使用的，术语“互补”是指在两个核苷酸之间精确配对的能力。如果核酸中给定位置处的核苷酸能与另一个核酸中的核苷酸氢键键合，则认为这两个核酸在该位置上是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有部分的核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，它可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率以及强度具有显著的影响。

“杂交”和“退火”是指这样的反应：其中一个或多个多核苷酸发生反应以形成复合体，该复合体通过核苷酸残基的碱基之间的氢键键合而得到稳定。氢键键合可通过WatsonCrick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合体可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合体的三条或更多条链、自杂交的单链，或它们的任何组合。杂交反应可构成更广泛的过程中的一步，如PCR或其他扩增反应的启动，或者核酶对多核苷酸的酶切。可通过与第二序列的核苷酸残基的碱基进行氢键键合而被稳定的第一序列被称为与所述第二序列“可杂交的”。在这种情况下，第二序列也同样可以被称为可与第一序列杂交。

应用于多核苷酸的术语“杂交的”是指通过在核苷酸残基的碱基之间的氢键键合来稳定化的复合体中的多核苷酸。氢键键合可通过WatsonCrick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。该复合体可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合体的三条或更多条链、自杂交的单链，或它们的任何组合。杂交反应可构成更广泛的过程中的一步，如PCR反应的启动，或者核酶对多核苷酸的酶切。与给定序列杂交的序列被称为给定序列的“互补序列”。

“特异性杂交”是指在定义的严格条件下，在不存在与杂交混合物中存在的其他核苷酸序列大量结合的情况下，核酸与靶核苷酸序列的结合。本领域技术人员认识到，放松杂交条件的严格性使得能够容许序列错配。

通常，给定序列的“互补序列”是完全或基本上与给定序列互补并可与之杂交的序列。通常，可与第二序列或一组第二序列杂交的第一序列可特异性地或选择性地与第二序列或该组第二序列杂交，使得在杂交反应期间，与第二序列或该组第二序列的杂交相比于与非靶序列的杂交是优选的(例如在给定的一组条件下，如在本领域中常用的严格条件下，在热力学上是更稳定的)。通常，可杂交的序列在其各自长度的全部或部分上共有一定程度的序列互补性，如25％-100％的互补性，包括至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列互补性。

术语“引物”是指这样的寡核苷酸：它能与核酸杂交(也称为“退火”)，并能在适当的条件下(即，在四种不同核苷三磷酸和用于聚合的试剂，如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶的存在下)在适当的缓冲液中和合适的温度下充当核苷酸(RNA或DNA)聚合的起始位点。合适的引物长度取决于预期的引物用途，但引物的长度通常为至少7个核苷酸长，并且更通常地范围在10到30个核苷酸，或者甚至更通常地为15到30个核苷酸长。其他引物可以稍长，例如，30到50或40-70个核苷酸长。本领域技术人员理解，引物长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，7到70或50到70个)。如本文进一步描述的具有不同长度的寡核苷酸可用作扩增和/或基因组装反应的引物或结构单元。在这种语境中，“引物长度”是指与互补的“靶”序列杂交并引发核苷酸合成的寡核苷酸或核酸的部分。短引物通常需要更低的温度以与模板形成足够稳定的杂合复合体。引物不需要反映模板的准确序列，但必须足够互补以便与模板杂交。术语“引物位点”或“引物结合位点”是指与引物杂交的靶核酸的区段。呈现引物结合位点的构建体常常被称为“引发就绪的构建体(primingreadyconstruct)”或“扩增就绪的构建体(amplificationreadyconstruct)”。

如果引物或其部分与核酸内的核苷酸序列杂交，则称引物与另一核酸退火。引物与特定核苷酸序列杂交的陈述并非意在暗示该引物与该核苷酸序列完全地或排他性地杂交。

寡核苷酸合成

在本文中所描述的基底上合成的寡核苷酸可优选在小于20、10、5、1、0.1cm²或更小的表面积内包含多于约100个，优选多于约1000个，更优选多于约16000个，且最优选多于约50000个或250000个或甚至多于约1000000个不同的寡核苷酸探针。

在多个实施方案中，本文进一步描述了在基底上快速合成n-聚体，如约为或至少约100、150、200、250、300、350个或更长的核苷酸、寡核苷酸的方法。该方法可使用具有解析座位的基底，该解析座位用适于核苷酸偶联的化学部分进行功能化。在一些情况下可使用标准亚磷酰胺化学法。因此，至少两个结构单元以较快的速率与多个各自位于一个解析座位上的生长寡核苷酸链偶联，如以至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、125、150、175、200个核苷酸每小时或更快的速率偶联。在一些实施方案中，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶结构单元或其类似物/修饰形式如本文其他地方更详细描述地使用。在一些情况下，添加的结构单元包括基于二核苷酸、三核苷酸或更长的核苷酸的结构单元，如含有约或至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的结构单元。在一些实施方案中，n-聚体寡核苷酸的大文库在基底上，例如在具有约为或至少约100、1000、10000、100000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000个承接(hosting)寡核苷酸合成的解析座位的基底上平行合成。各个座位可承接彼此不同的寡核苷酸的合成。在一些实施方案中，在亚磷酰胺化学法的流程期间，例如在具有偶联、加帽、氧化和解封闭步骤的过程中，可通过液体的连续/置换流的循环和真空干燥步骤，如新结构单元偶联之前的真空干燥步骤，来精确控制试剂剂量。该基底可包含通孔，如至少约100、1000、10000、100000、1000000个或者更多个通孔，来提供基底的第一表面与基底的第二表面之间的流体连通。在亚磷酰胺化学法循环内的一个或全部步骤期间，可将基底保持就位，并且流动试剂可通过该基底。

常用的制备合成核酸的方法基于Caruthers的基础研究，并且被称为亚磷酰胺法(M.H.Caruthers,MethodsinEnzymology154,287-313,1987；其通过引用以全文并入本文)。所得到的分子的序列可通过合成的顺序来控制。诸如H-膦酸酯法等其他方法用于同样的从聚合物的亚单元连续合成聚合物的目的。

通常，通过本发明的方法进行的DNA寡聚体的合成可通过传统的亚磷酰胺化学法实现。基于亚磷酰胺的核酸的化学合成是本领域技术人员公知的，综述于Streyer,Biochemistry(1988)第123-124页以及美国专利号4,415,732中，这些文献通过引用而并入本文。包括可与本发明一起使用的B-氰乙基(CE)亚磷酰胺单体和CPG(可控多孔玻璃)试剂在内的亚磷酰胺试剂可从包括AmericanInternationalChemical(NatickMass.)、BDBiosciences(PaloAltoCalif.)等众多商业来源购买得到。

在多个实施方案中，核酸的化学合成压倒性地采用在固体表面上的亚磷酰胺化学法(BeaucageSL,CaruthersMH.Deoxynucleosidephosphoramidites—anewclassofkeyintermediatesfordeoxypolynucleotidesynthesis.TetrahedronLett.1981；22:1859–1862；CaruthersMH.Genesynthesismachines–DNAchemistryanditsuses.Science.1985；230:281–285.)的变化形式来进行，这两者都通过引用以其全文并入本文。

例如，基于亚磷酰胺的方法可用于合成脱氧核糖核酸和核糖核酸的高丰度的碱基、骨架和糖修饰，以及核酸类似物(BeaucageSL,IyerRP.Advancesinthesynthesisofoligonucleotidesbythephosphoramiditeapproach.Tetrahedron.1992；48:2223–2311；BeigelmanL,Matulic-AdamicJ,KarpeiskyA,HaeberliP,SweedlerD.Base-modifiedphosphoramiditeanalogsofpyrimidineribonucleosidesforRNAstructure-activitystudies.MethodsEnzymol.2000；317:39–65；ChenX,DudgeonN,ShenL,WangJH.Chemicalmodificationofgenesilencingoligonucleotidesfordrugdiscoveryanddevelopment.DrugDiscov.Today.2005；10:587–593；PankiewiczKW.Fluorinatednucleosides.CarbohydrateRes.2000；327:87–105；LesnikowskiZJ,ShiJ,SchinaziRF.Nucleicacidsandnucleosidescontainingcarboranes.J.OrganometallicChem.1999；581:156–169；FoldesiA,TrifonovaA,KunduMK,ChattopadhyayaJ.Thesynthesisofdeuterionucleosides.NucleosidesNucleotidesNucleicAcids.2000；19:1615–1656；LeumannCJ.DNAAnalogues:fromsupramolecularprinciplestobiologicalproperties.Bioorg.Med.Chem.2002；10:841–854；PetersenM,WengelJ.LNA:aversatiletoolfortherapeuticsandgenomics.TrendsBiotechnol.2003；21:74–81；DeMesmaekerA,AltmannK-H,WaldnerA,WendebornS.Backbonemodificationsinoligonucleotidesandpeptidenucleicacidsystems.Curr.Opin.Struct.Biol.1995；5:343–355)，所有这些通过引用以其全文并入本文。

亚磷酰胺化学法已适用于DNA在诸如微阵列的固体基底上的原位合成。这样的合成通常是通过对合成循环的一个步骤的空间控制来实现的，这种空间控制导致数千至数十万个独特的寡核苷酸分布在小区域，如数平方厘米的区域内。用于合成寡核苷酸的区域和基底架构将会在本文的其他部分进一步更详细地描述。用于实现空间控制的合适的方法可包括(i)通过喷墨打印(Agilent,Protogene；HughesTR,MaoM,JonesAR,BurchardJ,MartonMJ,ShannonKW,LefkowitzSM,ZimanM,SchelterJM,MeyerMR等人Expressionprofilingusingmicroarraysfabricatedbyanink-jetoligonucleotidesynthesizer.Nat.Biotechnol.2001；19:342–347；ButlerJH,CroninM,AndersonKM,BiddisonGM,ChatelainF,CummerM,DaviDJ,FisherL,FrauendorfAW,FruehFW,etal.Insitusynthesisofoligonucleotidearraysbyusingsurfacetension.J.Am.Chem.Soc.2001；123:8887–8894)或物理掩模(SouthernEM,MaskosU,ElderJK.Analyzingandcomparingnucleicacidsequencesbyhybridizationtoarraysofoligonucleotides:evaluationusingexperimentalmodels.Genomics.1992；13:1008–1017.)来控制偶联步骤，(ii)通过对光不稳定的单体进行的经典的(Affymetrix；PeaseAC,SolasD,SullivanEJ,CroninMT,HolmesCP,FodorSPA.Light-generatedoligonucleotidearraysforrapiddna-sequenceanalysis.Proc.NatlAcad.Sci.USA.1994；91:5022–5026.)和无掩模的(Nimblegen；Singh-GassonS,GreenRD,YueYJ,NelsonC,BlattnerF,SussmanMR,CerrinaF.Masklessfabricationoflight-directedoligonucleotidemicroarraysusingadigitalmicromirrorarray.Nat.Biotechnol.1999；17:974–978)光刻脱保护来控制5’-羟基解封闭步骤，或者(iii)光生酸(photogeneratedacid)的数字活化，以进行标准的脱三苯甲基化(Xeotron/Atactic；GaoXL,LeProustE,ZhangH,SrivannavitO,GulariE,YuPL,NishiguchiC,XiangQ,ZhouXC.Aflexiblelight-directedDNAchipsynthesisgatedbydeprotectionusingsolutionphotogeneratedacids.NucleicAcidsRes.2001；29:4744–4750)，所有这些文献均通过引用以其全文并入本文。

可将在基底上制备的寡核苷酸从其固体表面上切割并任选地合并以能够实现新的应用，如基因组装、核酸扩增、测序文库、shRNA文库等(ClearyMA,KilianK,WangYQ,BradshawJ,CavetG,GeW,KulkarniA,PaddisonPJ,ChangK,ShethN等人Productionofcomplexnucleicacidlibrariesusinghighlyparallelinsituoligonucleotidesynthesis.NatureMethods.2004；1:241–248)、基因合成(RichmondKE,LiMH,RodeschMJ,PatelM,LoweAM,KimC,ChuLL,VenkataramaianN,FlickingerSF,KaysenJ等人Amplificationandassemblyofchip-elutedDNA(AACED):amethodforhigh-throughputgenesynthesis.NucleicAcidsRes.2004；32:5011–5018；TianJD,GongH,ShengNJ,ZhouXC,GulariE,GaoXL,ChurchG.AccuratemultiplexgenesynthesisfromprogrammableDNAmicrochips.Nature.2004；432:1050–1054)和定点诱变(SaboulardD,DugasV,JaberM,BroutinJ,SouteyrandE,SylvestreJ,DelcourtM.High-throughputsite-directedmutagenesisusingoligonucleotidessynthesizedonDNAchips.BioTechniques.2005；39:363–368)，所有这些文献均通过引用以其全文并入本文。

高的逐步偶联产率(例如至少约99.5％的逐步偶联产率)强有力地支持了高质量的长寡核苷酸的成功合成。在多个实施方案中，本发明的方法和组合物预期有超过98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或更高的偶联产率。不受理论的束缚，如果偶联效率较低，例如在99％以下，则对序列完整性的影响通常遵循两种情况之一。如果使用了加帽，则低偶联效率将通过短的、截短的序列证明。如果未使用加帽，或者如果加帽未成功，则寡核苷酸中将发生单碱基缺失，并因此将形成大量的缺少一个或两个核苷酸的失败序列。5′-羟基保护基团的有效去除进一步支持高质量的长寡核苷酸以期望的高产率合成，如在每个循环中以接近100％的非常高的效率合成，例如以大于或等于98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％或更高的效率合成。使用本文所述的方法和组合物，该步骤可通过对试剂剂量以及其他环境参数的精确控制来优化，从而避免终产物混合物除了所需产物外还包含具有单碱基缺失的一批寡聚物。

此外，对于长寡核苷酸的合成，使最普遍的副反应—脱嘌呤最小化至关重要(CarrPA,ParkJS,LeeYJ,YuT,ZhangSG,JacobsonJM.Protein-mediatederrorcorrectionfordenovodnasynthesis.NucleicAcidsRes.2004；32:e162)。脱嘌呤导致脱碱基位点的形成，该脱碱基位点通常不干扰链延伸。关键性的DNA损伤在碱性条件下在最终核碱基脱保护期间发生，其还在脱碱基位点处切割寡核苷酸链。不受理论的束缚，脱嘌呤可通过产生通常可定位于嘌呤核碱基中的短的、截短的序列而影响序列完整性。因此，对脱嘌呤以及高效率偶联和5′-羟基脱保护反应的控制支持了寡核苷酸的高产率、高质量合成。在高偶联产率和低脱嘌呤的情况下，可合成高质量的长寡核苷酸而无需大量的纯化和/或PCR扩增来补偿低产率。在多个实施方案中，本发明的方法和组合物提供了实现这样的高偶联产率、低脱嘌呤和保护基团的有效去除的条件。

在多个实施方案中，本文所描述的本发明的方法和组合物依赖于本领域已知的在功能化基底上进行的标准亚磷酰胺化学法，该功能化基底例如是任选地采用合适的修饰的甲硅烷基化晶片。通常，在用于亚磷酰胺化学法的具有适当修饰的单体如单核苷酸、二核苷酸或更长的寡核苷酸沉积之后，可至少一次地进行下列步骤中的一个或多个，以实现高质量聚合物的原位分步合成：1)偶联，2)加帽，3)氧化，4)硫化，5)解封闭(脱三苯甲基化)，和6)洗涤。通常，使用氧化或硫化作为一个步骤，而不是两个都使用。图11例示了包括偶联、加帽、氧化和解封闭步骤的四步亚磷酰胺合成法。

生长的寡脱氧核苷酸的延伸可通过随后通常经由形成磷酸三酯核苷酸间键添加亚磷酰胺结构单元而实现。在偶联步骤期间，通常为0.02–0.2M浓度的亚磷酰胺结构单元例如核苷亚磷酰胺(或几种亚磷酰胺的混合物)在乙腈中的溶液，可用例如酸性唑类催化剂1H-四唑、2-乙硫基四唑(Sproat等人,1995,"Anefficientmethodfortheisolationandpurificationofoligoribonucleotides".Nucleosides&Nucleotides14(1&2):255–273)、2-苄硫基四唑(Stutz等人,2000,"Novelfluoride-labilenucleobase-protectinggroupsforthesynthesisof3'(2')-O-amino-acylatedRNAsequences",Helv.Chim.Acta83(9):2477–2503；Welz等人,2002,"5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazoleasactivatorfor2'-O-TBDMSphosphoramiditebuildingblocksinRNAsynthesis",TetrahedronLett.,43(5):795–797)、4,5-二氰基咪唑(Vargeese等人,1998,"Efficientactivationofnucleosidephosphoramiditeswith4,5-dicyanoimidazoleduringoligonucleotidesynthesis",Nucl.AcidsRes.,26(4):1046–1050)或许多类似化合物的通常浓度为0.2–0.7M的溶液来活化。混合可在将组分递送至本文其他部分更详细描述的合适基底的选定斑点的同时，在喷墨打印机的流体线中实现。亚磷酰胺结构单元，诸如如上所述活化的那些，通常以相对于基底结合材料1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100倍或更多倍过量来提供，然后与起始固体支持物(第一偶联)或支持物结合的寡核苷酸前体(偶联后)接触。在从3'到5'的合成中，前体的5'羟基可被设置为与进入的核苷亚磷酰胺的活化的亚磷酰胺部分反应，以形成亚磷酸三酯键。该反应对水的存在也是高度敏感的，特别是当使用亚磷酰胺的稀溶液时，因此其通常在无水乙腈中进行。偶联完成后，可通过洗涤步骤去除任何未结合的试剂和副产物。

偶联反应的产物可用加帽剂进行处理，该加帽剂可例如使失败序列酯化和/或切割杂环碱基上的磷酸酯反应产物。加帽步骤可通过用作为催化剂的乙酸酐和1-甲基咪唑或DMAP的混合物处理固体支持物结合的材料来进行，并可用于两个目的：在偶联反应完成后，固体支持物结合的5'-OH基团的一部分(例如0.1到1％)可能仍未反应。这些未反应的基团可永久地受到封闭而无法进行进一步的链延伸，从而防止形成具有内部碱基缺失的寡核苷酸，通常被称为(n-1)短聚体(shortmer)。未反应的5'-羟基可被加帽混合物乙酰化。此外，应理解，用1H-四唑活化的亚磷酰胺在较小程度上与鸟苷的O6位反应。不受理论的束缚，在用I₂/水氧化后，该副产物(可能是经由O6-N7迁移)可经历脱嘌呤。无嘌呤位点可终止在寡核苷酸的最终脱保护的过程中被切割，从而降低全长产物的产率。O6修饰可通过在用I₂/水氧化之前用加帽试剂处理而去除。

寡核苷酸硫代磷酸酯(OPS；在本文其他部分更详细描述)的合成通常不涉及用I₂/水氧化，因此在这种程度下不会遭受上述的副反应。在另一方面，加帽混合物可干扰硫转移反应。不受理论的束缚，加帽混合物可导致广泛形成磷酸三酯核苷间键，而不是期望的PS三酯。因此，对于OPS的合成，硫化步骤可在任意加帽步骤之前进行。

可通常在弱碱(例如，吡啶、卢剔啶或可力丁)的存在下，用碘和水处理支持物结合的材料，以影响亚磷酸三酯向四配位磷酸三酯的氧化，该四配位磷酸三酯是天然存在的磷酸二酯核苷间键的受保护的前体。氧化可在无水条件下采用例如叔丁基过氧化氢或(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)-氧杂吖丙啶(CSO)进行。氧化步骤可以用硫化步骤来替代，以获得寡核苷酸硫代磷酸酯。

在多个实施方案中，寡核苷酸硫代磷酸酯(OPS)的合成可采用本发明的方法和组合物与天然寡核苷酸的合成类似地实现。简单地说，氧化步骤可被硫转移反应(硫化)替代，并且可在硫化之后进行任何加帽步骤。许多试剂能够进行有效的硫转移，包括但不限于3-(二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(也被称为Beaucage试剂)和N,N,N'N'-四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)。

解封闭(或脱三苯甲基化)步骤可用来例如用酸如2％三氯乙酸(TCA)或3％二氯乙酸(DCA)在惰性溶剂(二氯甲烷或甲苯)中的溶液来去除封闭基团，如DMT基团。可进行洗涤步骤。固体支持物结合的寡核苷酸前体受到影响以带有游离的5'-末端羟基。进行延长时间的脱三苯甲基化或者用比推荐的酸溶液更强的酸溶液进行脱三苯甲基化可导致固体支持物结合的寡核苷酸的脱嘌呤增加，并因此降低了所需的全长产物的产率。本文所述的本发明的方法和组合物提供了受控的解封闭条件，从而限制不期望的脱嘌呤反应。

在一些实施方案中，可使用包含THF/吡啶/H₂O中的约0.02MI₂的氧化溶液或对本领域技术人员而言显而易见的任何合适的变化形式。脱三苯甲基化溶液可以是在甲苯或二氯甲烷或任何其他合适的惰性溶剂中的3％二氯乙酸(DCA)或2％三氯乙酸(TCA)。脱三苯甲基化溶液的合适的变化被理解为对本领域技术人员而言是显而易见的。本发明的方法和组合物使得能够在不允许溶剂显著蒸发的情况下置换脱三苯甲基化溶液，从而防止脱嘌呤组分例如DCA或TCA的浓缩斑点。例如，可在脱三苯甲基化溶液后运行追踪溶液(chasingsolution)。可调节追踪溶液的密度以实现先入先出的方法。密度稍大的追踪溶液可用于实现这一结果。例如，可用氧化溶液追踪脱三苯甲基化溶液。追踪溶液可包含猝灭剂，如吡啶。在一些实施方案中，采用连续的液体条件直到解封闭溶液基本从基底上的寡核苷酸合成座位去除。可严密控制脱嘌呤组分的浓度，例如，将其在基底上的寡核苷酸合成座位上的值限制为小于初始浓度的3、2.5、2、1.5、1.4、1.3、1.25、1.2、1.15、1.1、1.05、1.04、1.03、1.02、1.01、1.005倍或更小。

可优化置换过程以将寡核苷酸合成座位上的化学剂量充分控制在有用的范围内。剂量可共同地指代时间、浓度和温度对预期反应(脱三苯甲基化)的完成和副反应(脱嘌呤)的程度的动力学效应的加和。

此外，脱三苯甲基化由于是可逆的，可导致一系列缺少一个或多个正确核苷酸的寡聚物的合成。由Sierzchala等人(Solid-phaseoligodeoxynucleotidesynthesis:Atwo-stepcycleusingperoxyaniondeprotection.J.Am.Chem.Soc.2003；125:13427–13441)提出的两步化学法可通过避免使用生长链的5'或3'端的酸脱保护来解决脱嘌呤的问题。该两步合成循环利用在温和碱性条件例如约pH9.6下缓冲的水性过氧阴离子来去除芳氧羰基，该基团替换在四步亚磷酰胺合成中常用的DMT基团。因此，过氧阴离子溶液，或任何合适的具有强亲核性(nucleophylic)和温和氧化性质的变化允许解封闭和氧化步骤合并成一个。此外，高的循环产率使得能够消除加帽步骤。

DNA的脱保护和从基底上的切割可以如Cleary等人(Productionofcomplexnucleicacidlibrariesusinghighlyparallelinsituoligonucleotidesynthesis.NatureMethods.2004；1:241–248)所述进行，例如通过用NH₄OH处理，通过向可光切割的连接体施加紫外线，通过靶向例如热处理无嘌呤位点，如由掺入的dU残基的尿嘧啶-DNA糖基化酶处理产生的那些，或任何合适的本领域已知的切割方法。在切割后可通过冻干来回收寡核苷酸。

为了承接亚磷酰胺化学法，基底中寡核苷酸合成座位的表面可经化学修饰，以提供用于将正在生长的核苷酸链连接至表面的合适的位点。存在允许将核苷酸附接至基底表面的不同类型的表面修饰化学法。表面修饰在其实施上可以不同，这取决于寡核苷酸链是伴随着核酸碱基的脱保护而从表面上切下，还是在脱保护之后保持附接在表面上。不同类型的合适的表面修饰化学法是本领域已知的，并在www.glenresearch.com描述，其通过引用而以其全文并入本文。存在一种表面修饰技术，其允许在寡核苷酸链保持附接在基底的同时，A、G和C碱基的环外N原子被脱保护。

另一个方案包括使三烷氧基甲硅烷基胺(例如(CH₃CH₂O)₃Si-(CH₂)₂-NH₂)与玻璃或二氧化硅表面SiOH基团反应，随后与琥珀酸酐与胺反应，以产生酰胺键和游离的OH，可在该游离OH上开始核苷酸链生长。

第三类型的连接体基团可基于可光切割的引物。这种类型的连接体允许将寡核苷酸从基底上去除(通过用光，例如用约350nm的光照射)，而不切割每个碱基上的含氮官能团上的保护基团。典型的氨或NH₃处理在用作从基底上切割寡聚体的试剂时将所有基团脱保护。这种类型的可光切割的连接体的应用在www.glenresearch.com描述。其他各种合适的可切割的连接体基团是本领域已知的，并可替代使用。

氧化和脱三苯甲基化的时间框架通常可分别约为30s和60s。试剂可以被排出，随后用乙腈(ACN)洗涤。在脱嘌呤控制的脱三苯甲基化过程中，可采用氧化溶液的连续流入逐出脱三苯甲基化溶液而之间无需排出步骤。

原位合成步骤期间对试剂流动的精确控制使得能够提高产物的产率、均匀性和质量。例如，可精确地控制酸浓度和脱三苯甲基化时间。可选择基底的，特别是原位合成区域和/或周围区域的水接触角，以便减少脱嘌呤和/或降低合成的速度。水接触角的合适的期望值在本文其他部分描述。在一些实施方案中，可在较高表面能即较低接触角的表面上实现较少量的脱嘌呤。

本发明的方法和组合物使得能够降低寡核苷酸合成期间脱嘌呤的速率，例如，以低于每循环0.1％、0.09％、％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％、0.0001％或更低的速率。此外，本文所述的本发明的方法和组合物使得能够减少或消除跨过支撑寡核苷酸原位合成的基底表面的脱嘌呤梯度。因此，高度均匀的、高质量且高产率的寡核苷酸合成可在能够承载高密度的解析寡核苷酸座位的基底上实现。

寡核苷酸的原位合成通常从相对疏水的固体支持物开始，随后随着影响其表面能的寡核苷酸特征的合成变得越来越亲水。寡核苷酸特征可随着寡核苷酸长度的增加获得大量的表面能。通常，在约10-20个合成循环后，这些由受保护的寡核苷酸组成的位点或特征获得足够的表面能，从而变得对在亚磷酰胺合成中常用的高表面张力的有机溶剂如乙腈或碳酸丙烯酯自发地润湿。本发明的方法和组合物使得能够在生长的寡核苷酸的合成期间随着长度改变参数，如时间、流速、温度、体积、粘度或试剂浓度，来导致寡核苷酸合成座位上变化的表面性质。这样的变化可以通过在合成的重复循环中以恒定的或变化的增量连续改变参数来施加。或者，可以仅在选定的合成循环中改变参数，并且可任选地按照模式，如每隔一个循环，每隔两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个循环等。

在多个实施方案中，本发明的方法和组合物考虑了在基底上合成的寡核苷酸文库，其中该文库包含不同大小的寡核苷酸，正如在本文的其他部分进一步详细描述的。此外，本发明的方法和组合物允许在基底上合成不同大小、序列或核苷酸组成的基本相似量的寡核苷酸，或者在一些情况下，不同的预选的量的寡核苷酸。任意两种合成的寡核苷酸之间量的差异可限制为少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或者更少，或者，作为整个文库中的相对误差或偏差百分比。正如本文其他部分进一步详细描述的，本文所描述的本发明的方法和组合物考虑在基底上以期望的量合成的寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物允许在基底上合成寡核苷酸的文库，其中每个寡核苷酸的化学计量得到紧密控制并且可通过改变所合成的特征的相对数目而调节。用于微调生长的寡核苷酸在基底的解析座位上的密度的合适的表面功能化和涂层在本文其他部分更详细地描述，并且可均匀地施加至基底的所有微结构，或可替代地，可以以选定的量和比例施加至单个微结构。

原位合成方法包括在关于合成肽阵列的美国专利号5,449,754，以及关于采用亚磷酰胺或其他化学法合成多核苷酸(尤其是DNA)的WO98/41531及其中引用的参考文献中描述的那些方法。其他描述原位核酸阵列合成方案和装置的专利包括美国公开号2013/0130321和美国公开号2013/0017977及其中引用的参考文献，其通过引用以全文并入本文。

这样的原位合成方法可基本看作是对以下小滴沉积顺序进行重复：受保护的单体沉积至基底上的预定位置上，以与适当活化的基底表面(或与先前沉积的脱保护的单体)连接；对沉积的单体进行脱保护，以使它能与随后沉积的受保护的单体反应；以及沉积另外的受保护的单体以供连接。在任何一个循环中，不同的单体可在基底上的不同区域沉积，从而使所完成的阵列的不同区域会如所期望的在所完成的阵列中携带不同的生物聚合物序列。每次重复时可能需要另外的一个或多个中间步骤，如氧化、硫化和/或洗涤步骤。

多种可用于在单个基底上产生寡核苷酸阵列的方法在美国专利号5,677,195、5,384,261和PCT公开号WO93/09668中描述。在这些申请中公开的方法中，通过以下方式将试剂递送至基底：(1)在预定区域上限定的通道内流动，或(2)在预定区域上“点样”，或(3)通过使用光致抗蚀剂。然而，可以采用其他方法，以及点样和流动的组合。在每种情况下，当单体溶液递送至不同的反应位点时，基底的某些活化的区域与其他区域被机械地分离。因此，可通过将本领域已知的各种合适的合成方法应用到本文所描述的方法和组合物中来实现寡核苷酸的原位合成。一种这样的方法是基于光刻技术，该技术涉及通过使用光不稳定的保护基团，在固体或者聚合物表面上的预定的解析位点处直接原位合成寡核苷酸(Kumar等人，2003)。羟基基团可在表面上产生并被光不稳定的保护基团封闭。当该表面例如通过光刻掩模暴露于～UV光时，可在表面上产生游离的羟基基团的图案。这些羟基基团可依照亚磷酰胺化学法与光保护的核苷亚磷酰胺反应。可采用第二光刻掩模，且表面可暴露于UV光以产生羟基基团的第二图案，随后与5'-光保护的核苷亚磷酰胺偶联。同样，可产生图案并可使寡聚物链延伸。若干种可以从5'-羟基官能团上干净且快速地去除的光不稳定保护基团是本领域已知的。不受理论的束缚，可光切割的基团的不稳定性取决于波长和所采用的溶剂的极性，并且光切割的速率可受暴露的持续时间和光的强度影响。该方法可利用许多因素，例如，掩模对准的准确性、光保护基团去除的效率和亚磷酰胺偶联步骤的产率。此外，不期望的光向邻近位点的泄露可被最小化。每个斑点合成寡聚物的密度可通过调整合成表面上的先导核苷的负载来监控。

应理解，本发明的方法和组合物可利用许多种合适的、本领域公知的构建技术，例如，无掩模阵列合成仪、利用掩模的光引导法、流动通道法、点样法等。在一些实施方案中，可采用无掩模阵列合成仪(MAS)在固体支持物上合成构建和/或选择寡核苷酸。无掩模阵列合成仪在例如PCT申请号WO99/42813和相应的美国专利号6,375,903中描述。无掩模仪器的其他实例是已知的，其可制造定制的DNA微阵列，在其中阵列中的每个特征都具有所需序列的单链DNA分子。其他用于合成构建和/或选择寡核苷酸的方法包括，例如，利用掩模的光引导法、流动通道法、点样法、基于针的方法以及利用多个支持物的方法。用于寡核苷酸合成的利用掩模的光引导法(例如，VLSIPS^TM法)在例如美国专利号5,143,854、5,510,270和5,527,681中描述。这些方法包括活化固体支持物的预定区域，然后将该支持物与预选的单体溶液接触。可大体上以集成电路制造中使用的光刻技术的方式，通过用通过掩模的光源照射来活化选择的区域。支持物的其他区域由于照射被掩模阻挡而仍未活化，且其仍是被化学保护的。因此，光图案限定了支持物的哪些区域与给定单体反应。通过反复活化不同组的预定区域并使不同的单体溶液与支持物接触，在支持物上产生聚合物的多样性阵列。可任选地使用其他步骤，如从支持物上洗涤未反应的单体溶液。其他可适用的方法包括机械方法，如在美国专利号5,384,261中描述的那些方法。其他可适用于在单个支持物上合成构建和/或选择寡核苷酸的方法在例如美国专利号5,384,261中描述。例如，可通过在预定区域上限定的通道内流动或在预定区域上“点样”，将试剂递送至支持物。也可采用其他方法，以及点样和流动的组合。在每种情况下，当单体溶液递送至不同的反应位点时，支持物的某些活化的区域与其他区域被机械地分离。流动通道方法包括，例如，微流体系统，以控制寡核苷酸在固体支持物上的合成。例如，可通过在支持物的表面上或表面中形成允许适当的试剂穿过其流动或适当的试剂放置在其中的流动通道，而在固体支持物的选定区域处合成多样的聚合物序列。用于在固体支持物上制备寡核苷酸的点样方法包括通过将反应物直接沉积在选定的区域或与其流体连接的结构中而递送相对少量的反应物。在一些步骤中，可用溶液喷射或以其他方式涂覆整个支持物表面。可通过在区域间移动的分配器将单体溶液的精确测量的等份逐滴地沉积。用于在固体支持物上合成寡核苷酸的基于针的方法在例如美国专利号5,288,514中描述。基于针的方法采用具有多个针或其他延伸物的支持物。每个针均同时插入到在托盘中的单独的试剂容器中。

在替代的方法中，高密度微阵列的光引导的合成可以在5'-3'方向上实现(Albert等人，2003)。由于3'-端可用于酶促反应，如序列特异性引物延伸和连接反应，该方法使得能够在合成表面上完成下游反应，如平行基因分型或测序。可采用光保护的5'-OH基团的完全或基本完全的脱保护、NPPOC(2-(2-硝基苯基)丙氧基羰基)的碱辅助的光脱保护(Beier等人，2002)。

本文所述的方法和组合物可促进在包括平面或不规则表面在内的各种几何形状的基底上采用原位合成产生合成核酸。多种适用于这些基底的材料，例如硅，在本文中描述或是本领域已知的。基底在合成期间可负载大量的不同序列。基底上的原位合成方法使得能够在常见支持物上的可寻址位置处制备大量的具有不同且确定序列的寡聚物。本文所述的方法和组合物使得能够原位合成如本文其他部分更详细描述的更长且更高质量的寡核苷酸。合成步骤可包括多组进料材料，在寡核苷酸合成的情况下，通常A、G、T和C这4种碱基，以及本领域已知的、其中一些在本文中描述的适当修饰的碱基，可用于在支持物或基底上以解析的方式构建核酸聚合物的所需序列。

固体支持物上高密度寡核苷酸如阵列的制备和应用之前已进一步公开于例如PCT公布号WO97/10365、WO92/10588、在1996年12月23日提交的美国专利号6,309,822、在1995年9月15日提交的序列号6,040,138、在1993年12月15日提交的序列号08/168,904、在1990年12月6日提交的序列号07/624,114、在1990年6月7日提交的序列号07/362,901，以及美国5,677,195中，上述所有文献均为了所有目的通过引用而并入本文。在一些采用高密度阵列的实施方案中，使用诸如在美国专利号5,445,934和6,566,495(均为了所有目的通过引用而并入本文)中所公开的超大规模固定化聚合物合成(VLSIPS)等方法合成高密度寡核苷酸阵列。每个寡核苷酸都占用基底上的一个已知位置。

以最少数目的合成步骤形成寡核苷酸、肽和其他聚合物序列的高密度阵列的其他各种合适的方法是本领域已知的。寡核苷酸类似物阵列可通过多种方法在固体基底上合成，该方法包括但不限于光引导的化学偶联和机械引导的偶联。参见Pirrung等人,美国专利号5,143,854(也可参见PCT申请WO90/15070)；和Fodor等人,PCT公布号WO92/10092和WO93/09668和美国序列号07/980,523，这些文献公开了使用例如光引导的合成技术来形成肽、寡核苷酸以及其他分子的巨大阵列的方法。也可参见Fodor等人,Science,251,767-77(1991)。这些用于合成聚合物阵列的程序现在被称为VLSIPS方法。使用VLSIPS方法，通过在多个反应位点处同时偶联，将聚合物的一个非均质阵列转化为不同的非均质阵列。参见美国申请序列号07/796,243和07/980,523。

如果在VLSIPS方法中使用具有聚酰胺骨架的寡核苷酸类似物，那么使用亚磷酰胺化学法来进行合成步骤通常是不合适的，因为单体不通过磷酸键彼此连接。相反，肽合成方法可以被替换，例如Pirrung等人在美国专利号5,143,854中描述的，其通过引用其全文并入本文。

单个的分子种类可通过用于添加合成进料材料的分开的流体区室来划分，例如在基于喷墨打印技术的所谓的原位点样法或压电技术中就是这样(A.Blanchard,inGeneticEngineering,PrinciplesandMethods,Vol.20,Ed.J.Sedlow,111-124,PlenumPress；A.P.Blanchard,R.J.Kaiser,L.E.Hood,High-DensityOligonucleotideArrays,Biosens.&Bioelectronics11,687,1996)。寡核苷酸的解析的原位合成还可通过合成位点的空间解析活化而实现，这通过选择性照射、通过活化试剂(脱保护试剂)的选择性或空间解析的生成或通过活化试剂(脱保护试剂)的选择性添加是可能的。

到目前为止已知的用于阵列原位合成的方法的实例为：基于光的光刻合成(McGall,G.等人；J.Amer.Chem.Soc.119；5081-5090；1997)，基于投影仪基于光的合成(PCT/EP99/06317)，利用反应空间的物理分离而进行的流体合成(本领域技术人员从英国牛津的E.Southern教授以及英国牛津的OxfordGeneTechnologies公司的研究可知)，通过光活化的光酸(photo-acid)和在反应支持物中的合适的反应室或者物理分离的反应空间而进行的基于投影仪的光控制的间接合成，利用由电极诱导的质子产生通过支持物上各个电极上的空间解析脱保护而进行的电诱导合成，以及通过活化的合成单体的空间解析沉积而进行的流体合成(从A.Blanchard,GeneticEngineering中,PrinciplesandMethods,Vol.20,Ed.J.Sedlow,111-124,PlenumPress；A.P.Blanchard,R.J.Kaiser,L.E.Hood,High-DensityOligonucleotideArrays,Biosens.&Bioelectronics11,687,1996中可知)。

在常见固体支持物上制备合成核酸，特别是核酸双链的方法也可从PCT公开WO00/49142和WO2005/051970获知，这两篇都通过引用以其全文并入本文。

核酸阵列的原位制备可以以从3′到5′，以及更传统地从5′到3′方向来实现。试剂的添加可通过例如将合适的核苷酸亚磷酰胺和活化剂脉冲喷射沉积到基底表面(例如，涂覆的硅片表面)之上或之中的每个解析座位来实现。基底的解析座位可进一步经受其他亚磷酰胺循环步骤(5′-羟基基团的脱保护、氧化、硫化和/或磺化)的其他试剂，这可以平行进行。沉积和普通的亚磷酰胺循环步骤可在不移动寡核苷酸合成晶片的情况下进行。例如，通过使试剂通过基底从基底的一个表面流动到相反的表面，试剂可穿过基底内的解析座位。或者，对于一些亚磷酰胺循环步骤，基底可以移动至例如流动池。然后可在打印下一层单体之前将基底重新定位、重新注册和/或重新对准。

可采用来自在原位制备的情况下的多核苷酸前体单元(如单体)的脉冲喷射，或先前合成的多核苷酸的脉冲喷射的液滴沉积来制备具有寡核苷酸的基底。这类方法在例如美国公开号2013/0130321和美国公开号2013/0017977及其中引用的参考文献中详细描述，其通过引用以其全文并入本文。这些参考文献通过引用并入本文。如本文其他地方所述，其他液滴沉积方法可用于制备。也可采用如本领域已知的光引导的制备方法，而不是液滴沉积方法。特别是当通过光引导的合成方案制备阵列时，特征间的区域无需存在。

可采用多种已知的原位制备装置，其中代表性的脉冲喷射装置包括但不限于在美国公开号US2010/0256017、美国专利公开号US20120050411和美国专利号6,446,682中描述的那些装置，这些专利的公开内容通过引用以其全文并入本文。

在多个实施方案中，可使用先前获得的生物聚合物的沉积或者原位合成方法来制备基底上或基底内的生物聚合物阵列。该沉积方法通常包括在基底之上或之内的预定位置处沉积生物聚合物，该位置已被适当地活化，从而使生物聚合物可与之连接。不同序列的生物聚合物可在基底之上或之内的不同区域沉积。本领域已知的用于沉积先前获得的多核苷酸，尤其是诸如完整寡聚物或cDNA的DNA的典型程序包括但不限于将多核苷酸以脉冲喷射头的形式加载到液滴分配器内，并发射到基底上。这种技术已经在WO95/25116和WO98/41531中描述，这两篇文献均通过引用而全文并入本文。用于将液滴沉积至基底的解析座位的各种合适的喷墨形式是本领域已知的。

在一些实施方案中，本发明可以依赖于在整个寡核苷酸文库或其部分内，例如在固定在表面上的寡核苷酸文库内使用预先合成的寡核苷酸。可通过在基底之上、之内或穿过基底的预定位置上沉积预先合成的或天然的核酸来制备支持高密度核酸阵列的基底。可通过光引导的靶向、寡核苷酸引导的靶向或者本领域已知的任何其他合适的方法将合成的或天然的核酸沉积在基底的特定位置上。也可将核酸引导至特定位置。可使用在不同的区域之间移动以将核酸沉积在特定斑点中的分配器。该分配器可通过通向选定区域的微通道来沉积核酸。典型的分配器包括用于将核酸递送至基底的微量移液管或毛细管针，和用于控制微量移液管相对于基底的位置的机器人系统。在其他实施方案中，该分配器包括一系列的管、歧管、移液管或毛细管针阵列等，以便能将各种试剂同时递送到反应区。

使用光引导的方法、流动通道和点样法、喷墨法、基于针的方法和基于珠子的方法将预合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列附接至支持物及其原位合成在下列参考文献中进一步阐述：McGall等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:13555；SyntheticDNAArraysInGeneticEngineering,Vol.20:111,PlenumPress(1998)；Duggan等人(1999)Nat.Genet.S21：10；Microarrays：MakingThemandUsingThemInMicroarrayBioinformatics,CambridgeUniversityPress,2003；美国专利申请公开号2003/0068633和2002/0081582；美国专利号6,833,450、6,830,890、6,824,866、6,800,439、6,375,903和5,700,637；以及PCT公开号WO04/031399、WO04/031351、WO04/029586、WO03/100012、WO03/066212、WO03/065038、WO03/064699、WO03/064027、WO03/064026、WO03/046223、WO03/040410和WO02/24597；这些参考文献的公开内容为了所有目的通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，采用点样法将预先合成的寡核苷酸附接至支持物或进行合成，其中单体溶液通过从在区域之间移动的分配器(例如，喷墨打印机)逐滴沉积。在一些实施方案中，采用例如机械波致动的分配器将寡核苷酸点样在支持物上。

本文所描述的系统可进一步包括用于向具有多个支持物结合的寡核苷酸的第一斑点(或特征)提供小滴的构件。在一些实施方案中，该小滴可包括一种或多种组合物，该组合物包含核苷酸或待添加特定或预定核苷酸的寡核苷酸(本文中也称为核苷酸添加构建体)，和/或允许进行杂交、变性、链延伸反应、连接以及消化中的一个或多个的试剂。在一些实施方案中，在任一个重复中，可将不同的组合物或不同的核苷酸添加构建体沉积在支持物上的不同位置处，以便产生预定的寡核苷酸序列的阵列(具有不同的预定寡核苷酸序列的支持物的不同特征)。一种特别有用的组合物沉积方法是将一个或多个小滴(每个小滴都含有所需试剂(例如核苷酸添加构建体))从与支持物表面间隔开的脉冲喷射装置沉积到支持物表面上或者内建于支持物表面的特征上。

为使由亚单位合成聚合物的化学方法的自动化成为可能，通常采用固相，在该固相上锚定正在生长的分子链。一旦合成结束，就可以将其分离，这可通过断裂实际聚合物与固相之间的适宜连接体来实现。为了自动化，该方法可直接采用基底表面，或者该方法可采用活化粒子形式的固相的基底表面，这些活化粒子填充在诸如可控多孔玻璃(CPG)的基底的列(column)或微通道中。基底表面有时会携带一种可特定移除类型的、具有预定序列的寡核苷酸(oligo)。然后可将各种合成试剂以可控的方式添加。可通过各种因素控制合成的分子的量，这些因素包括但不限于，专用的基底表面的大小、支持物材料的量、反应批量的大小、用于合成的可用功能化基底面积、功能化程度或合成反应的持续时间。

因此，本发明的多个实施方案涉及保持组合物(通常为寡核苷酸)文库的基底的制造和使用。当具有解析特征的基底具有不同部分(例如，不同的多核苷酸序列)的多个区域，使得在基底上的特定预定位置(即，“地址”)处的区域(即，基底的“特征”或“斑点”)将检测特定靶标或特定类别的靶标(尽管特征可能偶然检测到该位置上的非靶标)时，该基底是“可寻址的”。基底特征通常，但并不需要由间隙来隔开。在一些情况下，特征可以内建于基底中并且可创造出一维、二维或三维微流体几何结构。“基底布局”是指特征如位于基底上的特征的一个或多个特性、一个或多个特征维度以及在给定位置处的部分的指示。

其他分子的合成

本发明的方法和组合物可用于合成其他类型的感兴趣的分子。在选定的网格区域处合成肽是一种这样的情况。在阵列表面上使肽逐步生长中使用的多种合适的化学法是本领域已知的。在通过引用以其全文并入本文的美国专利号5,449,754中描述的肽合成技术可与本发明一起使用。本文所述的本发明的方法和组合物还可应用于药物、蛋白质抑制剂的化学合成，或其中需要快速合成多种化合物的任何化学品合成。

基因组装

在多个实施方案中，本发明涉及多核苷酸序列(也称为“基因”)的制备，其中采用在基底表面上合成的或点样的重叠的较短寡核苷酸的组装，或具有(housing)用于合成或点样寡核苷酸的适宜表面的基底，例如珠子。利用具有互补区的寡核苷酸与组装的连续寡核苷酸的退火，例如，使用缺乏链置换活性的聚合酶、连接酶、点击(Click)化学或本领域已知的任何其他合适的组装方法，可以将较短的寡核苷酸在同一条链上拼凑在一起。以这种方式，退火的核苷酸的序列可在相对链的连续寡核苷酸之间进行复制。在一些情况下，例如使用连接酶、点击化学或本领域已知的任何其他合适的组装化学方法，可以将同一条链的连续寡核苷酸缝接在一起，而不引入来自退火的寡核苷酸的序列元件。在一些情况下，可通过涉及较短的多核苷酸/寡核苷酸的数轮组装而分层合成较长的多核苷酸。

如在病毒基因组(7.5kb；Cello等人,Science,2002,297,1016)、噬菌体基因组(5.4kb；Smith等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2003,100,15440)和大至32kb的基因簇(Kodumal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2004,101,15573)的合成中描述的，基因或基因组可通过组装大的多核苷酸从寡核苷酸从头合成，所有这些参考文献均通过引用以其全文并入本文。可依照由Venter和同事在细菌(生殖支原体)的582kb基因组组装中描述的方法(Gibson等人,Science,2008,319,1215)制备长的合成DNA序列的文库，其通过引用以全文并入本文。此外，大的DNA生物分子可用寡核苷酸构建，如针对15kb核酸的情况所述(Tian等人,Nature,2004,432,1050；通过引用以其全文并入本文)。本发明的方法和组合物考虑了采用本文所述或本领域已知的基因组装方法从头合成的多核苷酸序列的大文库。这类序列的合成通常在本文其他地方更详细描述的基底的合适区域上以高密度平行地进行。此外，可以非常低的错误率合成这些大文库，这在本文其他部分更详细地描述。

基因可由合并的大量合成的寡核苷酸组装而成。例如，可应用如Tian等人(Tian等人,Nature,432:1050,2004)所述的、使用具有600种不同寡核苷酸的池(pool)的基因合成。组装的基因的长度可通过使用较长的寡核苷酸进一步延长。对于甚至更大的基因和DNA片段，例如大于约0.5、1、1.5、2、3、4、5kb或更大，通常在分层基因组装过程内，可以应用多于一轮合成。如下文所述，如本文所公开的从寡核苷酸进行的PCR组装和合成可适于串联使用。

根据本发明的方法和组合物，可使用多种基因组装方法，从诸如连接酶链反应(LCR)(Chalmers和Curnow,Biotechniques,30(2),249-52,2001；Wosnick等人,Gene,60(1),115-27,1987)等方法到成套PCR策略(Stemmer等人,164,Gene,49-53,1995；Prodromou和L.H.Pearl,5(8),ProteinEngineering,827-9,1992；Sandhu等人,12(1),BioTechniques,14-6,1992；Young和Dong,NucleicAcidsResearch,32(7),e59,2004；Gao等人,NucleicAcidsRes.,31,e143,2003；Xiong等人,NucleicAcidsResearch,32(12),e98,2004)(图11)。尽管大多数组装方法都开始于重叠的合成寡核苷酸的池，并终止于组装基因的PCR扩增，但这两点之间的途径可以是相当不同的。在LCR的情况下，初始的寡核苷酸群体具有磷酸化的5′端，使得连接酶例如PfuDNA连接酶能够将这些“结构单元”共价地连接在一起，以形成初始的模板。然而，PCR组装通常利用未磷酸化的寡核苷酸，其经历重复的PCR循环以延伸和创建全长的模板。此外，LCR过程可能需要在μM范围内的寡核苷酸浓度，而单链和双链的PCR选项均具有低得多的浓度要求(例如，nM范围)。

公开的合成尝试已使用了大小在20-70bp范围内的寡核苷酸，通过重叠区(6-40bp)的杂交而组装。由于许多因素由寡核苷酸的长度和组成(Tm、二级结构等)决定，该群体的大小和异质性可对组装的效率和组装基因的质量有较大的影响。正确的最终DNA产物的百分比依赖于“结构单元”寡核苷酸的质量和数目。与较长的寡核苷酸相比，较短的寡核苷酸具有较低的突变率，但需要更多的寡核苷酸来构建DNA产物。此外，较短的寡核苷酸的减少的重叠导致退火反应的T_m较低，这促进了非特异性退火，因此降低了组装过程的效率。本发明的方法和组合物通过以低错误率递送长寡核苷酸来解决该问题。

随时间变化的热场是指随时间调控的微流体装置的加热，以使得能够进行PCR扩增或PCA反应。随时间变化的热场可在外部施加，例如通过将带有反应器例如纳米反应器的装置基底放置在热加热块的上方，或整合在微流体装置内，例如作为刚刚位于PCA和PCR区室下方的薄膜加热器。温度控制器可改变与温度传感器耦合的加热元件的温度，该温度传感器与加热器元件相连或整合在反应区室中。计时器可改变施加于反应区室的热量的持续时间。

热场的温度可根据PCR或PCA反应的变性、退火和延伸步骤而变化。通常，核酸在约95℃变性2min，随后是30个或更多个循环的在95℃变性30sec、在40-60℃退火30sec及在约72℃延伸30sec，最后在72℃延伸10min。所使用的持续时间和温度可根据寡核苷酸的组成、PCR引物、扩增产物大小、模板和所使用的试剂例如聚合酶而变化。

聚合酶是掺入核苷三磷酸，或脱氧核苷三磷酸以延伸PCR引物、寡核苷酸或DNA片段的3′羟基末端的酶。关于聚合酶的一般性讨论见Watson,J.D.等人,(1987)MolecularBiologyoftheGene,4thEd.,W.A.Benjamin,Inc.,MenloPark,Calif。合适的聚合酶包括但不限于KOD聚合酶；Pfu聚合酶；Taq-聚合酶；大肠杆菌DNA聚合酶I，“Klenow”片段、T7聚合酶、T4聚合酶、T5聚合酶和逆转录酶，所有这些均是本领域已知的。具有校对能力的聚合酶，如Pfu和Pyrobest，可用于以高保真度复制DNA。PfuDNA聚合酶具有3′到5′核酸外切酶校正活性，因此其可校正核苷酸错掺错误。在本发明的多个实施方案中，优选地通过核酸片段的相互互补区段的重叠区之间的特异性杂交反应来将核酸片段连接在一起，由此获得较长的合成双链核酸。用于构建更长核酸的单个序列区段可具有例如20-200、50-300、75-350或100-400个核苷酸的结构单元的长度。本领域技术人员理解，序列区段长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，20-350或200-350个)。

序列区段可优选地以这种方式选择：其至少与待合成的互补核酸的反义链的序列区段部分重叠，以使得待合成的核酸链可通过单个序列区段的杂交而累积。在可替代的实施方案中，优选地选择序列区段以使得待合成的核酸的两条链上的序列区段完全重叠，并因此或多或少完整的双链的制备现在仅需要磷酸二酯骨架的共价键。单个片段之间的互补区或重叠的长度可以为例如10-50、10-100、12-25、20-80、15-20或15-25个核苷酸的结构单元。本领域技术人员理解，序列区段长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，25-100或10-25个)。如果两个核酸片段之间的重叠或互补性区域具有高的AT含量，例如，AT含量超过50％、60％、65％或更高，则其与更富含GC的序列相比结合常数较低。因此，由于热力学的原因，这些片段之间的杂交可具有相对较低的效率。这可对2个或更多个片段的组装有影响。可能的序列依赖性的结果是具有正确靶序列的核酸双链的产率降低。因此，用于组装基因的序列区段可设计为在重叠区中具有所需水平的GC含量，例如GC含量超过35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或更高。示例性基因组装方法的更详细的讨论可见于美国专利号8367335，其通过引用以其全文并入本文。

在多个实施方案中，基于聚合酶链反应(PCR)且非基于聚合酶循环组装(PCA)的策略可用于化学基因合成。此外，采用不同的策略和方法的非基于PCA的化学基因合成，包括酶促基因合成、退火和连接反应、通过杂合基因的两种基因的同时合成、鸟枪法连接和共连接、插入基因合成、经由DNA的一条链的基因合成、模板指导的连接、连接酶链反应、微阵列介导的基因合成、BlueHeron固体支持物技术、Sloning结构单元技术、RNA介导的基因组装、基于PCR的热力学平衡的由内向外法(TBIO)(Gao等人，2003)、结合双不对称PCR(DA-PCR)的两步总基因合成方法(Sandhu等人，1992)、重叠延伸PCR(Young和Dong，2004)、基于PCR的两步DNA合成(PTDS)(Xiong等人，2004b)、连续PCR方法(Xiong等人，2005、2006a)或任何其他本领域已知的合适方法，可与本文所述的方法和组合物结合使用，用于从较短的寡核苷酸来组装较长的多核苷酸。

已采用本发明的方法和组合物化学合成的DNA序列可延伸成长的多核苷酸序列，例如，超过500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7500、10000、20000、30000、40000、50000、75000、100000个碱基对或更长的多核苷酸序列。如本文其他部分更详细描述的，本发明的方法和组合物还可使得能够以非常低的错误率化学合成多核苷酸序列。

在多个实施方案中，聚合酶介导的组装技术的变化形式(统称为聚合酶构建和扩增)用于多核苷酸的化学合成。一些本领域已知的用于定制基因合成的常用技术基于聚合酶循环组装，并且通过寡核苷酸池的组装可实现较长寡核苷酸的从头合成。可合成寡核苷酸池作为结构单元，以用于各种基因合成技术。寡核苷酸的序列、长度和精确分布，以及该池内的任何序列重叠，可根据所需要的多核苷酸序列和使用的组装方法来设计。例如，采用对于重叠寡核苷酸的变性、退火和延伸必要的温度条件，通过数个PCR步骤，可获得所需要的全长DNA。

PCR组装(PCA)

PCR组装采用聚合酶介导的链延伸结合至少两种具有可以退火的互补末端的寡核苷酸，使得至少一种多核苷酸具有能够通过聚合酶(例如，热稳定聚合酶，如Taq聚合酶、VENT^TM聚合酶(NewEnglandBiolabs)、KOD(Novagen)等)进行多核苷酸链延伸的游离的3′-羟基。可将重叠的寡核苷酸混合在含有dNTP、聚合酶和缓冲液的标准PCR反应中。在退火时，寡核苷酸的重叠末端创建了双链核酸序列的区域，该区域用作在PCR反应中通过聚合酶延伸的引物。延伸反应的产物用作用于较长双链核酸序列形成的底物，最终导致全长靶序列的合成。可将PCR条件最优化，以增加目标长DNA序列的产率。

多种基于PCR的方法可用于从寡核苷酸合成基因。这些方法包括但不限于热力学平衡的由内向外法(TBIO)(Gao等人,NucleicAcidsResearch,31:e143,2003)、连续PCR(Xiong等人,NucleicAcidsResearch,32:e98,2004)、双不对称PCR(DA-PCR)(Sandhu等人,Biotechniques,12:14,1992)、重叠延伸PCR(OE-PCR)(Young和Dong,NucleicAcidsResearch,32:e59,2004；Prodromou和Pearl,ProteinEng.,5:827,1992)以及基于PCR的两步DNA合成(PTDS)(Xiong等人,NucleicAcidsResearch,32:e98,2004)，所有这些参考文献均通过引用以其全文并入本文，并且可适合于在微流体装置中组装PCR模板。

DA-PCR是用于构建合成基因的一步方法。在一个实例中，使用四种相邻的、例如长度为17-100个碱基的、具有例如15-17个碱基的重叠区的寡核苷酸作为PCR反应的引物。其他合适的寡核苷酸和重叠区大小处于如本文进一步描述的本发明的界限内。两种内部引物的量是高度受限的，并且由于两种侧翼引物的过量，所引起的反应导致总序列的两个半部的不对称单链扩增。在随后的PCR循环中，这些互相重叠的双不对称的扩增片段产生双链的全长产物。

TBIO合成对于基因序列的氨基末端半部仅需要有义链引物且对于基因序列的羧基末端半部仅需要反义链引物。此外，TBIO引物可含有相同的温度优化的引物重叠区域。TBIO方法包括在下一对外侧引物与完全合成的内部片段的末端之间的互补。对于给定外侧引物对的TBIO双向延伸在发生下一轮双向延伸前完成。

连续PCR是单步PCR方法，其中有义引物与待组装的模板的一半相对应，且反义引物与待组装的模板的另一半相对应。通过该方法，使用外部引物对的双向扩增直到在采用内部引物对的扩增完成时才发生。

PDTS通常包括两个步骤。首先，合成感兴趣的DNA的单个片段：在本发明的一些实施方案中，混合10-12种具有约20bp重叠区的寡核苷酸，如长度约为60、80、100、125、150、175、200、250、300、350个或更多个核苷酸的寡核苷酸，并且使用聚合酶如pfuDNA进行PCR反应以产生较长的DNA片段。其次，合成感兴趣的DNA的整个序列：将5-10种来自第一步的PCR产物混合并作为模板用于使用聚合酶如pyrobestDNA聚合酶、以两种最外侧寡核苷酸作为引物的第二PCR反应。

尽管对于相对较短的核酸，采用短寡核苷酸的PCR组装能够很好地进行，但可能存在能够在单个反应内组装的寡核苷酸的最大数目的限制。这可能对双链DNA产物造成大小限制。该问题的解决方案是串联地制备DNA。在这种方案中，在单独的区室中、在多个芯片中平行地或串联地合成多个较小的DNA区段，然后将其一起引入以作为PCA反应的前体，用于组装成为用于随后PCR扩增的“较大的”DNA片段。换句话说，采用寡核苷酸的PCR组装将产生用于PCR扩增的模板(首轮模板)。许多这样产生的首轮模板可用作大于首轮模板的DNA片段的PCA组装的前体，从而产生次轮模板。随之，次轮模板可用作第三轮模板组装的前体，以此类推。该方法可重复进行直至获得所需的DNA。

在合成反应中使用的寡核苷酸通常是用于组装比该寡核苷酸自身长的核酸的单链分子。寡核苷酸可以为例如20-200、50-300、75-350或100-400个核苷酸的结构单元。本领域技术人员理解，序列区段长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，20-350或200-350个)。含有多种寡核苷酸的PCA区室是指用来产生对应于基因或DNA片段的模板所必需的寡核苷酸的池。当合成反应和装置串联使用时，在反应的随后系列中的PCA区室将含有用于组装成PCR模板的DNA片段而不是起始寡核苷酸的池。图12示出了通过多轮反应，来自重叠寡核苷酸池的较长构建体经聚合酶循环组装成逐渐更长的构建体。

应理解，如本文所述的较长的寡核苷酸可有利地在多种基因组装方法中使用，以避免组装错误并提高合成的基因的质量(图13)。待组装的序列中同源的重复或高GC的区域可引入与较小寡核苷酸的正确顺序和杂交相关的错误。较长的寡核苷酸可通过减少待排序和比对的寡核苷酸的数目，通过避免有问题的序列，如来自比对位点的同源性重复或高GC区域，和/或通过减少组装所需基因所需的组装循环次数，来规避这些问题。

可通过如图14中所示例的将基因组装方法分层地结合来合成较大的基因。因此，许多中等长度例如约2kb的基因可采用第一基因组装方法如PCA来组装。第二基因组装方法，例如Gibson组装(Gibson等人,Science,2008,319,1215)可用于将中等长度的基因组合成更大的基因，例如约5或10kb。分层组装可阶段性地采用。体外重组技术可用于将中等长度的基因盒组装成越来越长的序列，例如，超过5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000kb或更长。

对基因从头组装有用的寡核苷酸可在一个或多个固体支持物上合成。示例性固体支持物包括，例如，载玻片、珠子、芯片、颗粒、链、凝胶、片材、管、球、容器、毛细管、垫、片、膜、板、聚合物或微流体装置。此外，固体支持物可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或其组合。在基本上为平面的支持物上，可采用例如沟槽、凹槽、孔或化学阻挡物(例如，疏水涂层，等等)将支持物物理地分离成多个区域。支持物还可包括构建在表面中的，任选地跨越该表面的整个宽度的物理分离的区域。用于改进的寡核苷酸合成的合适的支持物在本文中进一步描述。

在一个方面，寡核苷酸可在固体支持物上提供以在微流体装置中使用，例如，作为PCA反应室的一部分。或者，可以合成寡核苷酸并随后将其引入到微流体装置中。

通常，酌情将完整的基因序列分解成可变或固定长度(N)的寡核苷酸。可选择合适的寡核苷酸长度，例如，20-200、50-300、75-350或100-400个核苷酸的结构单元。本领域技术人员理解，序列区段长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，20-350或200-350个)。子序列之间的重叠区的长度为约或小于约N/2，但可根据组装反应规定的需要而选择，例如，6-40bp、10-20bp和20-30bp的重叠区。本领域技术人员理解，序列区段长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，20-40或6-30个)。部分碱基互补性的量可根据所使用的组装方法而变化。对于多种重叠基因组装方法，除了构成所得PCR模板的末端的那些外，PCA寡核苷酸可在5′和3′端都重叠。寡核苷酸之间的碱基对错配可根据该错配的性质而影响杂交。寡核苷酸的3′端处或附近的错配可抑制延伸。然而，富含G/C的重叠区可克服错配，从而导致含有错误的模板。因此，在寡核苷酸设计中考虑重叠序列、解链温度、交叉杂交的可能性和二级结构可考虑在内。

从PCR组装反应得到的核酸序列可被称为模板并可用作通过PCR再生互补链的靶核酸。通常，在组装反应后，或许由于不完全的组装和/或多联体，PCR组装产物可以是不同大小的双链DNA。在一些实施方案中，首轮模板从寡核苷酸组装。在其他实施方案中，次轮模板从包含至少两种首轮模板的DNA片段组装，这两种模板是从前两次运行获得的、任选地纯化和/滤去错误的PCR反应产物。第三轮模板从包含至少两种次轮模板的DNA片段组装，其可以类似地滤去错误，以此类推。

非基于聚合酶循环组装的策略，如退火和连接反应(Climie和Santi,1990；Smith等人,1990；Kalman等人,1990)、插入基因合成(IGS)(Ciccarelli等人,1990)、经由一条链的基因合成(Chen等人,1990)、模板指导的连接(TDL)(Strizhov等人,1996)、连接酶链反应(Au等人,1998)或本领域已知的任何合适的组装方法，也可用于多核苷酸的化学合成。其他非基于聚合酶循环组装的基因合成策略包括但不限于基于微阵列的基因合成技术(Zhou等人,2004)、BlueHeron固体支持物技术、Sloning结构单元技术(Ball,2004；Schmidt,2006；Bugl等人,2007)和RNA介导的从DNA阵列的基因组装(Wu等人,2012)。

酶促基因合成

修复双链DNA中的单链断裂的酶在二十世纪六十年代在大肠杆菌和T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中首次发现(Meselson,1964；Weiss和Richardson,1967；Zimmerman等人,1967)，其可用于接合化学合成的寡核苷酸如脱氧核糖多核苷酸，以形成连续的双螺旋结构(Gupta等人,1968a)。在另一个实例中，DNA聚合酶I(Klenow)可用于将寡核苷酸与较长的多核苷酸接合。寡核苷酸可进一步通过例如采用连接酶如采用噬菌体T4多核苷酸连接酶的连接接合在一起。在一些情况下，寡核苷酸可分层地连接，从而在每一步中形成越来越长的多核苷酸。

退火和连接反应

另一种简便的基因合成方法包括通过退火和连接反应从许多寡核苷酸组装多核苷酸(Climie和Santi,1990；Smith等人,1990；Kalman等人,1990)。首先，所需序列的两条链都可被分割以具有短的粘端，使得邻近的互补寡核苷酸对可以退火。可采用例如激酶对合成的寡核苷酸进行磷酸化，并在连接成为双链体之前退火。

鸟枪法连接和共连接

鸟枪法连接方法包括从若干个合成的区块来组装完整的基因(Eren和Swenson,1989)。因此，基因可在若干个部分中亚组装，每个部分均通过若干个化学合成的寡核苷酸的互补对的酶促连接来构建，该寡核苷酸中的短单链与相邻对的短单链互补。这些部分的共连接可实现最终多核苷酸的合成。

插入基因合成

插入基因合成(IGS)(Ciccarelli等人,1990)可用于以逐步的方式在含有单链DNA噬菌体复制起点的质粒内组装DNA序列。IGS方法基于通过寡核苷酸引导的诱变，长DNA寡核苷酸在质粒内的连续靶向插入。

经由一条链的基因合成

经由一条链的基因合成是指经由一条链合成基因的方法(Chen等人；1990)。靶基因的正链DNA可通过在多种(例如两种)末端互补的寡核苷酸和多种(例如三种)短的片段间互补的寡核苷酸的存在下与若干种(例如六种)寡核苷酸进行逐步或单步T4DNA连接酶反应来组装。相比于双链或重叠方法，更少的合成碱基的使用可降低成本。

模板指导的连接

模板指导的连接是指经由与来源于野生型基因的单链DNA模板的部分退火，通过寡核苷酸模块的连接构建大合成基因的方法(Strizhov等人；1996)。与其他需要合成两条链的技术相反，可合成仅包含一条链的寡核苷酸。可使用连接酶如PfuDNA连接酶进行热循环，以用于全长寡核苷酸的组装、选择和连接以及用于模板指导的连接(TDL)产物的线性扩增。由于其对同源模板的依赖性，该方法适用于合成仅有限数目的与现有多核苷酸分子具有相似性的序列。

连接酶链反应

连接酶链反应(LCR)可以是用于多核苷酸合成的方法(Au等人；1998)。可采用连接酶，例如PfuDNA连接酶，经由连接从若干个寡核苷酸组装成片段。在LCR后，可通过采用外部的两种寡核苷酸的变性和延伸，用共享重叠区的片段的混合物扩增全长基因。

微阵列介导的基因合成

微阵列介导的基因合成，作为一般的概念，是基于将数万个特异性探针固定在小固体表面上的能力(Lockhart和Barlow，2001)。为了产生阵列，DNA可以直接在固体支持物上合成(Lipshutz等人，1999；Hughes等人，2001)或可使用例如针或喷墨打印机以预先合成的形式沉积在表面上(Goldmann和Gonzalez，2000)。所获得的寡核苷酸可在热循环条件下的连接中使用，以产生数百个碱基对的DNA构建体。另一种用于精确的多重基因合成的基于微芯片的技术—改进的阵列介导的基因合成技术(Tian等人，2004)，与一种针对高通量基因合成而开发的方法—芯片洗脱的DNA的扩增和组装(AACED)相似(Richmond等人，2004)。数千种“构建”寡核苷酸和标记的互补“选择”寡核苷酸的池可在可光编程的微流体芯片上合成、释放、连接扩增并通过杂交选择，以减少合成错误(Tian等人，2004)。

BlueHeron技术

由BlueHeronBiotechnology开发的BlueHeron技术基于以GeneMaker平台为基础的固相支持物策略并使得能够自动化(Parker和Mulligan，2003；Mulligan和Tabone，2003；Mulligan等人，2007)。GeneMaker方案通常可包括用户序列数据输入，为输入序列的组装、寡核苷酸合成和杂交成为双链体设计合适的寡核苷酸的算法，通过固体支持物基质上柱子内自动化连续添加的基于自动化连接的固相组装，和/或克隆和序列验证。BlueHeron技术依赖于结构单元的连续添加，以降低在其他基于结构单元的非连续池的基因组装方法如PCR方法中发生的错误。

本发明的多个实施方案采用如在BlueHeron技术的实施中例示的连续和分层组装方法。

Sloning结构单元技术

Sloning结构单元技术(Slonomics^TM；SloningBiotechnologyGmbH,Puchheim,德国)是另一种采用基于连接的策略的用于化学基因合成的方法(AdisInternational，2006)。Sloning合成方法由一系列平行重复的和标准化的反应步骤(移液、混合、温育、洗涤)组成(Schatz和O'Connell，2003；Schatz等人，2004；Schatz，2006)。与连接针对给定基因构建体特别设计和合成的寡核苷酸相反，Sloning技术采用标准化的结构单元的文库，这些结构单元可通过一系列标准化的、完全自动化的、经济有效的反应步骤组合起来以形成任何所需的序列(Schatz和O'Connell，2003；Schatz，2006)。

GoldenGate组装

Golden-gate方法(参见例如，Engler等人(2008)PLoSONE,3(11):e3647；Engler等人(2009)PLoSONE4(5):e5553)提供了标准化的、多部分的DNA组装。Golden-gate方法可使用识别位点在其酶切位点远端的IIs型内切核酸酶。存在若干种不同的、选自例如BsaI的IIs型内切核酸酶。Golden-gate方法通过利用单种IIs型内切核酸酶可以是有利的。Golden-gate方法在美国专利公开2012/0258487中进一步描述，其通过引用以其全文并入本文。

在一些情况下，用于基因组装的方法和组合物可包括特别合成的结构单元和预先合成的结构单元的组合。可将预先合成的寡核苷酸的文库储存，并且可对所需的靶核酸的组装过程进行优化以使预先合成的寡核苷酸的使用最大化、使对新合成的需求最小化。特别合成的寡核苷酸可填充靶核酸中预先合成的寡核苷酸文库没有覆盖的部分。

RNA介导的基因组装

在多个实施方案中，RNA介导的基因组装用于从DNA元件组装RNA转录物，其任选地固定至表面上形成固定的DNA阵列。DNA元件被设计为包括朝向5'端的RNA聚合酶(RNAP)启动子序列，如T&RNA聚合酶启动子序列。编码启动子序列如T7RNAP启动子序列的寡核苷酸与DNA元件的杂交可产生双链启动子。RNAP的添加可影响从这些任选地表面结合的启动子的转录，产生许多RNA拷贝。可将这些扩增的RNA分子设计为允许自组装以产生更长的RNA。简单来说，可将DNA元件设计成编码“区段序列”和“夹板序列”，区段序列是期望的全长RNA转录物的部分，夹板序列是用作引导RNA区段正确组装的模板的互补RNA。可选择编码RNA区段或夹板的DNA元件，以优化组装的多核苷酸的合成中的一个或多个反应。例如，可以构建DNA元件，使得每个RNA转录物的5'端与GG二核苷酸相对应，据信该GG二核苷酸影响由T7RNA聚合酶(T7RNAP)展现的较高的转录效率。由于在GTP偶联期间酶的“滑移”，可以反过来避免在5'末端的GGG三核苷酸序列，以避免产生其中G残基的数目可在1-3之间的多聚G转录物梯。通过区段与夹板的RNA：RNA杂交可以影响组装。可采用合适的本领域已知的酶将切口化学地或酶促地密封。在一个实例中，将RNA区段序列组装成全长RNA转录物包括与T4RNA连接酶2的连接。可在连接前将三磷酸化的转录物如由T7RNA聚合酶产生的那些“修剪”成其单磷酸化的类似物。修剪可通过用RNA5'焦磷酸水解酶处理转录物池以从每个RNA的5'端去除焦磷酸基团而实现。转录物一旦合成，就可通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)复制以产生相应的基因。可采用合适的核酸扩增方法，包括本文其他部分描述的那些方法，将组装的RNA序列或其DNA等价物扩增。该方法在Wu等人(Cheng-HsienWu,MatthewR.Lockett,andLloydM.Smith,RNA-MediatedGeneAssemblyfromDNAArrays,2012,Angew.Chem.Int.Ed.51,4628-4632)中进一步描述，其通过引用以其全文并入本文。

DNA的非酶促化学连接

其他方法包括例如用溴化氰作为缩合剂的DNA的非酶促化学连接法，如针对183bp生物活性小基因的合成所描述的(Shabarova等人，1991)。

在一些实施方案中，寡核苷酸的组装包括点击化学(CLICKchemistry)的使用。采用点击化学连接不同分子的合适方法是本领域所知的(关于寡核苷酸的点击化学连接，参见例如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,201))。点击化学可在Cu1的存在下进行。

错误率和校正

目前基因合成技术的关键限制是该方法的低序列保真度：从化学合成的DNA创建的基因克隆常常含有序列错误。这些错误可以在该方法的多个阶段引入：在组分寡核苷酸的化学合成期间，在双链寡核苷酸的组装期间，以及通过在DNA的操作和分离期间或克隆过程期间出现的化学损伤。

产生化学合成的DNA片段的已知方法具有非常高的序列错误率，例如，平均每200到500bp。本文所述的方法允许寡核苷酸和较长的多核苷酸能以非常低的错误率初始从头合成。寡核苷酸中的常见突变包括可由加帽、氧化和/或解封闭失败引起的缺失。其他明显的副反应包括鸟苷(G)被氨修饰以产生编码为腺苷(A)的2,6-二氨基嘌呤。胞苷(C)形成尿苷(U)及腺苷形成肌苷(I)的脱氨基化也是可能的。

不受理论的束缚，通常在采用亚磷酰胺方法的寡核苷酸合成期间产生的碱基修饰的非限制性实例包括脱氧鸟苷的O6-氧转氨形成2,6-二氨基嘌呤残基、脱氧胞苷的N4-胺脱氨形成尿苷残基(Eadie,J.S.和Davidson,D.S.,NucleicAcidsRes.15:8333,1987)、N6-苯甲酰脱氧腺苷脱嘌呤产生无嘌呤位点(Shaller,H.和Khorana,H.G.,J.Am.Chem.Soc.85:3828,1963；Matteucci,M.D.和Caruthers,M.H.,J.Am.Chem.Soc.103:3185,1981)以及脱氧鸟苷上的N2-异丁酰胺保护基团的不完全去除。这些副产物(副产品)中的每一种均可导致克隆的合成多核苷酸中的序列错误。

此外，寡核苷酸合成的常用方法倾向于形成小于所需寡核苷酸的全长的截短的产物。寡核苷酸合成的固相方法包括建立寡聚物链，该寡聚物链通常通过其3'-羟基锚定到固体支持物上，并通过结构单元与其5'端的偶联而延长。在给定的链延长循环中的每个偶联步骤的产率通常将<100％。对于长度为n的寡核苷酸，存在n-1个键，并且最大产率估计值通常将取决于[偶联效率]^n-1。对于25-聚体，假设偶联效率为98％，则全长产物的计算的最大产率将在61％左右。因此最终产物将含有n-1、n-2、n-3等数目逐渐减少的失败序列。

另一种类型的合成失败是比所需寡核苷酸的全长更长的“n+”产物的形成。不受理论的束缚，这些产物可源自生长的寡核苷酸的支化，其中亚磷酰胺单体通过该碱基，特别是腺苷的N-6和鸟苷的O-6反应。n+产物的另一种来源是从固体支持物上不想要的反应性位点的起始和复制。如果在偶联步骤中5'-三苯甲基保护基团无意中被脱保护，也可形成n+产物。这种5'-羟基的过早暴露使得亚磷酰胺双倍加入。寡核苷酸合成过程的这种类型的合成失败也可导致合成基因中的序列错误。在多个实施方案中，本发明的方法和组合物使得能够通过如本文其他部分更详细描述的对反应参数的精确控制，减少寡核苷酸从头合成过程中的错误。

其他类型的错误可能在基于PCR的以及非基于PCR的组装方法过程中在寡核苷酸组装成更长构建体期间引入。例如，合成的双链寡核苷酸与其他合成的双链寡核苷酸连接形成更大的合成双链寡核苷酸中可能容易出错。例如，T4DNA连接酶展现出较差的保真度，用3′和5′A/A或T/T错配(Wu,D.Y.和Wallace,R.B.,Gene76:245-54,1989)、5′G/T错配(Harada,K.和Orgel,L.NucleicAcidsRes.21:2287-91,1993)或3′C/A、C/T、T/G、T/T、T/C、A/C、G/G或G/T错配(Landegren,U.、Kaiser,R.、Sanders,J.和Hood,L.,Science241:1077-80,1988)封闭切口。

错误率还限制了基因合成对于产生基因变体文库的价值。错误率为1/300时，在1500个碱基对的基因中约0.7％的克隆将是正确的。由于大多数来自寡核苷酸合成的错误导致移码突变，所以在这样的文库中超过99％的克隆将不会产生全长蛋白质。将错误率降低75％将使正确的克隆的比例提高40倍。本发明的方法和组合物使得能够以比通常观察到的基因合成方法更低的错误率快速从头合成大寡核苷酸和基因文库，该低的错误率是由于合成质量的改善和使得能够以大规模平行且具时效性的方式进行的错误校正方法的适用性两者。因此，可以以在整个文库中或超过80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的文库中低于1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1250、1/1500、1/2000、1/2500、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000、1/12000、1/15000、1/20000、1/25000、1/30000、1/40000、1/50000、1/60000、1/70000、1/80000、1/90000、1/100000、1/125000、1/150000、1/200000、1/300000、1/400000、1/500000、1/600000、1/700000、1/800000、1/900000、1/1000000或更低的碱基插入、缺失、置换或总错误率来合成文库。本发明的方法和组合物还涉及具有低错误率的大合成寡核苷酸和基因文库，该错误率与该文库的至少一个子集中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的寡核苷酸或基因相关，涉及与预定/预选序列相比的无错误序列。在一些实施方案中，文库内的独立体积中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的寡核苷酸或基因具有相同的序列。在一些实施方案中，与超过95％、96％、97％.98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％95％、96％、97％.98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高的相似性或同一性有关的任意寡核苷酸或基因中的至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多具有相同序列。在一些实施方案中，优化与寡核苷酸或基因上的特定座位有关的错误率。因此，一个或多个作为大文库的部分的寡核苷酸或基因的给定座位或多个选定座位可各自具有低于1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1250、1/1500、1/2000、1/2500、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000、1/12000、1/15000、1/20000、1/25000、1/30000、1/40000、1/50000、1/60000、1/70000、1/80000、1/90000、1/100000、1/125000、1/150000、1/200000、1/300000、1/400000、1/500000、1/600000、1/700000、1/800000、1/900000、1/1000000或更低的错误率。在多个实施方案中，这类错误优化的座位可包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、100000、500000、1000000、2000000、3000000个或更多个座位。错误优化的座位可分布到至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、100000、500000、1000000、2000000、3000000个或更多个寡核苷酸或基因。

可在使用或不使用错误校正的情形下获得错误率。错误率可在整个文库，或在文库的超过80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多中获得。

文库可包含超过100、200、300、400、500、600、750、1000、15000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、750000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000种或更多种不同的寡核苷酸或基因。所述不同的寡核苷酸或基因可与预定/预选序列有关。文库可包含超过500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1250bp、1500bp、1750bp、2000bp、2500bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp、10kb、20kb、30kb、40kb、50kb、60kb、80kb、90kb、100kb长或更长的寡核苷酸或基因。应理解，文库可由多个不同的子部分，如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个子部分组成，这取决于不同的错误率和/或构建体大小。本发明的组合物和方法还允许在较短时间框架内，如在少于三个月、两个月、一个月、三周、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2天或更短的时间内，以上述低错误率构建寡核苷酸或基因的上述大合成文库。上述文库的基因可通过经由本文其他部分更详细描述或本领域已知的合适的基因组装方法组装从头合成的寡核苷酸来合成。

若干种用于在合成的基因中去除含有错误的序列的方法是本领域已知的。可采用DNA错配结合蛋白MutS(来自水生栖热菌)使用不同的策略从合成基因中去除失败产物(Schofield和Hsieh,2003；Carr等人,2004；Binkowski等人，2005)。一些其他的策略(Pogulis等人,1996；Ling和Robinson,1997；An等人,2005；Peng等人,2006b)采用通过重叠延伸PCR的定点诱变来校正错误，并且可以与寡核苷酸的两轮或更多轮的克隆和测序以及额外的合成结合。基因合成后的功能性选择和鉴定是另一种方法(Xiong等人,2004b；Smith等人,2003)。另一种错误校正方法采用SURVEYOR内切核酸酶(Transgenomic)、错配特异性DNA内切核酸酶来扫描在异源双链体DNA中的已知和未知的突变以及多态性。SURVEYOR技术基于来自芹菜的错配特异性DNA内切核酸酶—Surveyor核酸酶，其为植物DNA内切核酸酶的CEL核酸酶家族的成员(Qiu等人，2004)。Surveyor核酸酶在两条DNA链中任何碱基置换错配和其他失真位点(包括多达至少12个核苷酸的所有碱基置换和插入/缺失)的3'侧高特异性地切割。插入/缺失错配和所有碱基置换错配可被识别，基于错配序列有不同的切割效率。在一个实例中，Surveyor核酸酶技术可用于在包括四个步骤的方法中的错配检测：(i)具有突变/变异和野生型/所需序列两者的期望多核苷酸靶标的任选的多核苷酸扩增，例如PCR；(ii)产生包含错配的异源双链体的杂交；(iii)用Surveyor核酸酶处理异源双链体以在错配位点处切割；以及(iv)采用选择的检测/分离平台对消化的多核苷酸产物的任选的分析(图15-16)。由异源双链体处理得到的切割产物可在酶切位点处的错误被消除(chewedout)(例如通过外切核酸酶)后进行PCA，以产生消除错误的产物(图15)。错配碱基可基本上或在一些情况下完全去除，以产生无错误的链。在一些实施方案中，切割的链可与多核苷酸池中的靶标再退火并延伸。由于在异源双链体的初始退火和切割去除错配后，含有错误的多核苷酸的频率非常低，大多数切割的链将与具有无错误序列的靶标在初始错配的位点处退火。通过沿着靶标延伸，可以再次合成无初始错配的多核苷酸。基因组装的多个实例包括错误校正。例如，基于PCR的准确合成(PAS)方案可包括：基因和寡核苷酸的设计，寡核苷酸的纯化，第一PCR以合成区段，第二PCR以组装全长基因，以及测序和错误校正(Xiong等人,2006)。或者，可对样品进行PCR，其中切割的产物不能参与，由此将样品中错误的丰度稀释(图16)。

在某些实施方案中，本发明提供了选择性地从含有完美匹配的合成DNA片段的溶液中去除具有错配、凸起和小环、化学改变的碱基和其他在DNA的化学合成过程中产生的异源双链体的双链寡核苷酸如DNA分子的方法。该方法将直接在异源双链体DNA上形成的或通过包含掺入的核苷酸类似物(例如，基于在生物素分子或生物类似物的引入后形成的抗生物素蛋白-生物素-DNA复合体的类似物)的亲和系统形成的特异性蛋白质-DNA复合体分离成含有DNA的异源双链体并随后被抗生物素蛋白家族的蛋白质的任意成员(包括链霉亲和素)结合。该抗生物素蛋白可固定在固体支持物上。

该方法的核心是这样的酶：其特异性识别并结合至双链寡核苷酸(例如，DNA)分子内的错配或未配对碱基，且在异源双链体位点处或附近保持关联，产生单链或双链断裂，或能够在异源双链体位点处或附近引发链转移转座事件。错配的、错误配对的和化学改变的异源双链体DNA分子从DNA分子的合成溶液中的去除导致与预期的合成DNA序列不同的DNA分子的浓度降低。

错配识别蛋白通常结合在错配上或其附近之内。用于基于错配识别蛋白质的错误校正的试剂可包括为内切核酸酶、限制酶、核糖核酸酶、错配修复酶、解离酶(resolvase)、解旋酶、连接酶、错配特异性抗体及其变体的蛋白质。该酶可选自例如T4内切核酸酶7、T7内切核酸酶1、S1、绿豆内切核酸酶、MutY、MutS、MutH、MutL、切割酶(cleavase)和HINF1。在本发明的某些实施方案中，错配识别蛋白在错配位点附近的错配DNA的至少一条链上切割。

对于识别并切割异源双链体DNA形成单链切口的蛋白质，例如CELI内切核酸酶，生成的切口可用作DNA聚合酶的底物以掺入适合于亲和配偶(affinitypartnership)的修饰的核苷酸，例如含有生物素部分或其类似物的核苷酸。存在许多识别错配DNA并产生单链切口的蛋白质的实例，包括解离酶、内切核酸酶、糖基化酶和具有内切核酸酶活性的特化的MutS样蛋白。在一些情况下，在进一步处理后在异源双链体DNA分子中产生切口，例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶可用于识别错配DNA并水解在脱氧核糖与DNA中的一个碱基之间的键，从而产生脱碱基位点，而不一定要切割DNA的糖磷酸骨架。脱碱基位点可被AP内切核酸酶转化成适用于DNA聚合酶延伸的带切口的底物。在MutS蛋白质的实例中，蛋白质-异源双链体DNA复合体可由此直接形成，或者可在核苷酸类似物例如生物素或其类似物掺入含有链的异源双链体中并随后使生物素或生物素类似物与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合之后间接形成。

其他错误校正方法可依赖于转座酶，如MuA转座酶，转座酶通过链转移反应，优先地将含有转座酶DNA结合位点的预切割形式的标记DNA，例如生物素或生物素类似物标记的DNA，在体外插入到错配DNA位点中或附近。体外MuA转座酶引导的链转移是本领域技术人员所知的，并且因对错配DNA特异的转座酶活性而被人熟悉。在该方法中，预切割的MuA结合位点DNA可在分子的5′端生物素化，使得在链转移到含DNA的异源双链体后形成具有链霉亲和素或抗生物素蛋白的蛋白质-生物素-DNA复合体。

蛋白质-DNA复合体的体外分离可通过将含有蛋白质-DNA复合体的溶液与对蛋白质的结合具有高亲和力和能力以及对DNA的结合具有低亲和力的固体基质一起温育而实现。在一些情况下，这类基质可包埋在与本文所述的本发明的多种实施方案有关的微流体装置中。

几大类别的酶优先消化含有错配、缺失或受损碱基的异源双链体多核苷酸，如DNA底物。通常，这些酶用来将它们的受损或错配的底物转化成切口或单碱基对缺口(在一些情况下，在将脱碱基位点转化成切口的AP内切核酸酶的帮助下)。DNA糖基化酶、错配内切核酸酶和MutSLH错配修复蛋白由于其在修饰含有错误的合成片段中的实用性是特别有用的。本发明的方法和组合物可依赖于这些切口或小缺口来鉴别含有错误的DNA分子并将其从克隆过程中去除。

技术的组合可用于去除经处理的含有错误的多核苷酸。DNA糖基化酶是一类去除错配碱基并在一些情况下在所产生的无嘌呤/无嘧啶(AP)位点进行切割的酶。胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)可用于从复合体混合物中富集含有错配的或完美匹配的DNA群体(X.Pan和S.Weissman,"Anapproachforglobalscanningofsinglenucleotidevariations"2002PNAS99:9346-9351)。DNA糖基化酶可用于水解脱氧核糖与DNA中的一个碱基之间的键，无需切割DNA的糖磷酸骨架而产生脱碱基位点。所有四组的单碱基错配和一些其他的错配可被两种TDG的混合物水解。此外，在不存在镁时该酶对脱碱基位点的高亲和力可用于将DNA分子分离成富含异源双链体或排除了异源双链体的群体。已经确定了非常大量的DNA糖基化酶，并且非限制性实例可见于美国专利公开2006/0134638，其通过引用以其全文并入本文。DNA糖基化酶通常作用于非天然、受损或错配的碱基子集，去除该碱基并留下底物以用于后续的修复。作为一类，DNA糖基化酶对将被其从DNA中去除的化学底物具有广泛、独特且重叠的特异性。糖基化酶处理对于将碱基置换的错误率降至低水平可能特别有用。离开AP位点的糖基化酶与AP内切核酸酶如大肠杆菌内切核酸酶IV或ExoIII组合以在DNA中产生切口。

用于在错配或受损的DNA区域中对DNA产生切口的错配内切核酸酶的非限制性实例包括T7内切核酸酶I、大肠杆菌内切核酸酶V、T4内切核酸酶VII、绿豆核酸酶、细胞、大肠杆菌内切核酸酶IV和UVDE。

MutSLH复合体用于从PCR片段中去除大多数错误的应用由Smith等人(J.Smith和P.Modrich,"Removalofpolymerase-producedmutantsequencesfromPCRproducts."1997,PNAS94:6847-6850)描述，其通过引用以其全文并入本文。在不存在DAM甲基化时，MutSLH复合体可用于催化在(GATC)位点的双链切割。PCR产物可在ATP的存在下用MutSLH处理。

关于合成多核苷酸中错误校正的更加详细的公开内容可见于美国专利公开2006/0134638和美国专利号6664112，这两者通过引用以其全文并入本文。

根据本发明的方法和组合物在合成的多核苷酸的错误校正中使用的酶、结合配偶体和其他试剂可固定在本文所述的支持物和基底的表面如涂覆的或功能化的表面上。反应可以以一个或多个组分固定的方式原位进行。利用在合适表面上的这类组分以较少错误或无错误地富集多核苷酸的纯化方案应理解为在本发明的范围内。

最后，用于基因组装的策略依赖于高质量寡核苷酸以实现以低错误率从头合成多核苷酸。本文所述的方法和组合物允许在多种实施方案中合成这类高质量寡核苷酸。

核酸的扩增

在一些实施方案中，扩增本文所述的核酸。扩增可通过任何本领域已知的方法进行。在一些情况下，核酸通过聚合酶链反应(PCR)扩增。如在例如美国专利号5,928,907和6,015,674中描述的，多种PCR方法是本领域已知的，其完整的公开内容为了任何目的通过引用并入本文。其他核酸扩增方法包括，例如，连接酶链反应、寡核苷酸连接试验和杂交试验。这些和其他方法在美国专利号5,928,907和6,015,674中更详细地描述。如同也在例如上述并入本文的美国专利号5,928,907和6,015,674中更详细描述的，实时光学检测系统是本领域已知的。其他可在本文中使用的扩增方法包括在美国专利号5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的那些方法，所有这些专利均通过引用以其全文并入本文。

在本发明的一些方面中，采用核酸或多核苷酸的指数扩增。这些方法常取决于多拷贝的核酸或多核苷酸分子或其互补体的产物催化形成。扩增产物有时被称为“扩增子”。一种这样的用于DNA的特异性双链序列的酶促扩增的方法是聚合酶链反应(PCR)。该体外扩增程序基于变性、寡核苷酸引物退火和通过嗜热性模板依赖性多核苷酸聚合酶的引物延伸的重复循环，导致侧翼为引物的多核苷酸分析物的期望序列的拷贝指数增加。两种与DNA的相反链退火的不同PCR引物被定位为使得一条引物的聚合酶催化的延伸产物可充当另一个的模板链，从而导致离散的双链片段的积累，该双链片段的长度由寡核苷酸引物的5′端之间的距离决定。可在本发明的方法中使用的其他扩增技术包括，例如，AFLP(扩增片段长度多态性)PCR(见例如：Vos等人1995.AFLP:anewtechniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsResearch23:4407-14)、等位基因特异性PCR(见例如，SaikiRK,BugawanTL,HornGT,MullisKB,ErlichHA(1986).Analysisofenzymaticallyamplifiedbeta-globinandHLA-DQalphaDNAwithallele-specificoligonucleotideprobesNature324:163-166)、AluPCR、组装PCR(见例如，StemmerWP,CrameriA,HaKD,BrennanTM,HeynekerHL(1995).Single-stepassemblyofageneandentireplasmidfromlargenumbersofoligodeoxyribonucleotidesGene164:49-53)、不对称PCR(见例如，SaikiRKsupra)、菌落PCR、解旋酶依赖性PCR(见例如，MyriamVincent,YanXu和HuiminKong(2004).Helicase-dependentisothermalDNAamplificationEMBOreports5(8):795-800)、热启动PCR、反向PCR(见例如，OchmanH,GerberAS,HartlDL.Genetics.1988November；120(3):621-3)、原位PCR、序列间特异性PCR或ISSRPCR、数字PCR、指数后线性PCR或LatePCR(见例如，ierceKE和WanghLT(2007).Linear-after-the-exponentialpolymerasechainreactionandalliedtechnologiesReal-timedetectionstrategiesforrapid,reliablediagnosisfromsinglecellsMethodsMol.Med.132:65-85)、长距离PCR、巢式PCR、实时PCR、双重PCR、多重PCR、定量PCR、定量荧光PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)、PCK-RFLPIRT-PCR-IRFLP、聚合酶群落PCR(polononyPCR)、原位滚环扩增(RCA)、桥式PCR、皮滴定PCR(picotiterPCR)和乳液PCR或单细胞PCR。其他合适的扩增方法包括转录扩增、自我持续序列复制、靶多核苷酸序列的选择性扩增、共有序列引发的聚合酶链反应(CP-PCR)、任意引发的聚合酶链反应(AP-PCR)和简并寡核苷酸引发的PCR(DOP-PCR)。另一种用于扩增的方法包括采用单个寡核苷酸引物的单链多核苷酸的扩增。待扩增的单链多核苷酸含有两个彼此基本上或完全互补的非连续序列，因此能够杂交在一起以形成茎环结构。该单链多核苷酸可以已经是多核苷酸分析物的一部分，或者可由于多核苷酸分析物的存在而产生。

另一种用于实现核酸扩增的结果的方法被称为连接酶链反应(LCR)。该方法用连接酶将预形成的核酸探针对接合。如果存在核酸分析物，该探针与核酸分析物的每条互补链杂交，并且使用连接酶将每对探针结合在一起，产生两种可在下个循环中用于重复合成特定核酸序列的模板。

另一种用于实现核酸扩增的方法是基于核酸序列的扩增(NASBA)。该方法是启动子引导的酶促过程，其体外诱导特定核酸的连续、均匀的等温扩增，以提供核酸的RNA拷贝。用于进行NASBA的试剂包括具有包含启动子的5′-尾的第一DNA引物、第二引物、逆转录酶、RNA酶-H、T7RNA聚合酶、NTP和dNTP。

另一种用于扩增特定组的核酸的方法是Q-β-复制酶方法，其依赖于Q-β-复制酶指数扩增其RNA底物的能力。用于进行该扩增的试剂包括“微变异RNA(midi-variantRNA)”(可扩增的杂交探针)、NTP和Q-β-复制酶。

另一种用于扩增核酸的方法被称为3SR，并且除了在逆转录酶中存在RNA酶-H活性之外与NASBA相似。通过3SR扩增是一种RNA特异性靶向方法，由此RNA在将启动子引导的RNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶H与靶RNA结合的等温过程中扩增。参见例如Fahy等人PCRMethodsAppl.1:25-33(1991)。

另一种用于扩增核酸的方法是由Gen-Probe使用的转录介导的扩增(TMA)。该方法在自我持续序列复制中使用两种酶方面与NASBA相似。参见通过引用并入本文的美国专利号5,299,491。

另一种用于核酸的扩增的方法是链置换扩增(SDA)(Westin等人2000,NatureBiotechnology,18,199-202；Walker等人1992,NucleicAcidsResearch,20,7,1691-1696)，其为一种等温扩增技术，基于限制性内切核酸酶如HincII或BsoBI在其识别位点的半硫代磷酸形式的未修饰链上形成切口的能力，以及外切核酸酶缺陷的DNA聚合酶如Klenowexo-聚合酶或Bst聚合酶在切口处延伸3′-端并置换下游DNA链的能力。指数扩增由组合的有义和反义反应造成，其中从有义反应置换的链充当反义反应的靶标，反之亦然。

另一种核酸扩增方法是滚环扩增(RCA)(Lizardi等人1998,NatureGenetics,19:225-232)。RCA可用于以核酸的环的形式来扩增单链分子。在其最简单的形式中，RCA包括单个引物与环状核酸的杂交。引物通过具有链置换活性的DNA聚合酶的延伸导致产生多拷贝的环状核酸，该多拷贝的环状核酸浓缩至单个DNA链中。

在本发明的一些实施方案中，RCA与连接法结合。例如，单个寡核苷酸可既用于连接又用作RCA的环状模板。该类型的多核苷酸可以指“扣锁探针”或“RCA探针”。对于扣锁探针，寡核苷酸的两个末端均含有与感兴趣的核酸序列内的结构域互补的序列。扣锁探针的第一端与感兴趣的核酸序列上的第一结构域基本互补，并且扣锁探针的第二端与邻近或靠近第一结构域的第二结构域基本互补。寡核苷酸与靶核酸的杂交导致杂交复合体的形成。扣锁探针的末端的连接导致含有环状多核苷酸的修饰的杂交复合体的形成。在一些情况下，在连接前，聚合酶可通过延伸扣锁探针的一端而补平缺口。由此形成的环状多核苷酸可充当RCA的模板，RCA通过聚合酶的添加导致扩增的产物核酸的形成。本文所述的本发明的方法可产生在5′-和3′-端都具有确定序列的扩增产物。这类扩增产物可用作扣锁探针。

本发明的一些方面采用核酸或多核苷酸的线性扩增。线性扩增通常指一种涉及形成核酸或多核苷酸分子(通常是核酸或多核苷酸分析物)的仅一条链的互补序列的一个或多个拷贝的方法。因此，线性扩增与指数扩增之间的主要区别是在后一个过程中，产物充当形成更多产物的底物，而在前一个过程中，起始序列是形成产物的底物，但是反应的产物，即起始模板的复制物，不是产生产物的底物。在线性扩增中，所形成的产物的量作为时间的线性函数而增加，这与指数扩增不同，在指数扩增中，所形成的产物的量是时间的指数函数。

在一些实施方案中，扩增方法可以是本领域技术人员将认识到的固相扩增、聚合酶群落扩增、菌落扩增、乳液PCR、珠子RCA、表面RCA、表面SDA等。在一些实施方案中，可以使用导致溶液中的游离DNA分子或通过DNA分子的仅一端拴在合适的基质上的DNA分子扩增的扩增方法。可以使用依赖于桥式PCR的方法，其中两种PCR引物均附接至表面(见例如，WO2000/018957和Adessi等人,NucleicAcidsResearch(2000):28(20):E87)。在一些情况下，本发明的方法可创建“聚合酶群落技术”或“聚合酶群落”，其是指维持相同扩增子的空间聚簇的多重扩增(见HarvardMolecularTechnologyGroupandLipperCenterforComputationalGenetics网页)。这些包括，例如，原位聚合酶群落(Mitra和Church,NucleicAcidResearch27,e34,1999年12月15日)、原位滚环扩增(RCA)(Lizardi等人,NatureGenetics19,225,1998年7月)、桥式PCR(美国专利号5,641,658)、皮滴定PCR(Leamon等人,Electrophoresis24,3769,2003年11月)和乳液PCR(Dressman等人,PNAS100,8817,2003年7月22日)。本发明的方法提供了用于产生和使用聚合酶群落的新方法。

扩增可通过靶序列的拷贝数增加的任何方法(例如PCR)实现。对通过PCR扩增靶序列有利的条件是本领域已知的，可在本方法中的多个步骤处优化，并且取决于反应中要素的特征，如靶标类型、靶标浓度、待扩增的序列长度、靶标和/或一个或多个引物的序列、引物长度、引物浓度、所使用的聚合酶、反应体积、一个或多个要素与另外一个或多个要素的比例，等等，其中的一些或全部可以被改变。通常，PCR包括以下步骤：待扩增的靶标(如果是双链的)的变性，一个或多个引物与靶标的杂交，和引物通过DNA聚合酶的延伸，重复(或“循环”)这些步骤以扩增靶序列。可为了多种结果而优化该方法中的步骤，如为了增加产率、减少假产物的形成和/或增加或减少引物退火的特异性。优化方法是本领域公知的，并且包括对扩增反应中的要素的类型或量的调整和/或对该方法中给定步骤的条件的调整，如特定步骤的温度、特定步骤的持续时间和/或循环数。在一些实施方案中，扩增反应包括至少5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。在一些实施方案中，扩增反应包括不超过5、10、15、20、25、35、50个或更多个循环。循环可含有任意数目的步骤，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个步骤。步骤可包括适合于实现给定步骤的目的的任何温度或温度梯度，该给定步骤包括但不限于3'端延伸(例如衔接子补平)、引物退火、引物延伸和链变性。步骤可具有任意的持续时间，包括但不限于约、少于约或多于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、180、240、300、360、420、480、540、600秒或更多秒，包括在手动中止前无限期地进行。包含不同步骤的任意数目的循环可以任意的顺序组合。在一些实施方案中，将包含不同步骤的不同循环组合，使得该组合中循环的总数为约、少于约或多于约5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。扩增可在使用本发明的方法和组合物的多反应程序中的任意点进行，例如，在将测序文库从独立的反应体积合并之前或之后，并且可用于扩增本文所述的任何合适的靶分子。

连接反应

在一些实施方案中，寡核苷酸可与衔接子或条形码连接或连结。连接剂可以是连接酶。在一些实施方案中，连接酶是使用众所周知的程序的T4DNA连接酶(Maniatis,T.,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1982))。其他DNA连接酶也可使用。关于连接，可使用其他连接酶，如来源于嗜热生物的那些，由此允许在更高温度下连接，从而允许使用可在通常可允许这类寡核苷酸退火的该更高温度下同时退火且连接的更长的寡核苷酸(其具有增加的特异性)。

如本文所用的术语“接合”和“连接”，就两个多核苷酸而言，是指将两个单独的多核苷酸共价附接以产生单个更大的具有连续骨架的多核苷酸。用于接合两个多核苷酸的方法是本领域已知的，且包括但不限于酶促和非酶促(例如化学的)方法。非酶促连接反应的实例包括在美国专利号5,780,613和5,476,930中描述的非酶促连接技术，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸通过连接酶例如DNA连接酶或RNA连接酶接合至靶多核苷酸。各自具有特征反应条件的多种连接酶是本领域已知的，包括但不限于：NAD⁺依赖性连接酶，其包括tRNA连接酶、TaqDNA连接酶、丝状栖热菌DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TthDNA连接酶、水管致黑栖热菌DNA连接酶(I和II)、热稳定连接酶、Ampligase热稳定DNA连接酶、VanC型连接酶、9°NDNA连接酶、TspDNA连接酶以及通过生物勘测发现的新连接酶；ATP依赖性连接酶，其包括T4RNA连接酶、T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、PfuDNA连接酶、DNA连接酶1、DNA连接酶III、DNA连接酶IV以及通过生物勘测发现的新连接酶；以及野生型、突变同种型及其遗传工程变体。连接可以在具有可杂交序列如互补突出端的多核苷酸之间。连接还可在两个平端之间。通常，在连接反应中使用5'磷酸。5'磷酸可由靶多核苷酸、衔接子寡核苷酸或这两者提供。如需要，5'磷酸可添加至待接合的多核苷酸或从其中去除。用于添加或去除5'磷酸的方法是本领域已知的，且包括但不限于酶促和化学方法。在5'磷酸的添加和/或去除中有用的酶包括激酶、磷酸酶和聚合酶。在一些实施方案中，在连接反应中接合的两端(例如衔接子末端和靶多核苷酸末端)均提供5'磷酸，使得在使两端接合时形成两个共价键。在一些实施方案中，在连接反应中接合的两端(例如只有衔接子末端和靶多核苷酸末端中的一个)中仅一端提供5'磷酸，使得在使两端接合时仅形成一个共价键。在一些实施方案中，靶多核苷酸的一端或两端处仅一条链与衔接子寡核苷酸接合。在一些实施方案中，靶多核苷酸的一端或两端处的两条链均与衔接子寡核苷酸接合。在一些实施方案中，在连接前将3'磷酸去除。在一些实施方案中，将衔接子寡核苷酸添加至靶多核苷酸的两端，其中在每一端的一条或两条链均与一个或多个衔接子寡核苷酸接合。当两端的两条链均与衔接子寡核苷酸接合时，接合之后可以是留下5'突出端的切割反应，该5'突出端可充当相应3'端的延伸的模板，该3'端可包括或可以不包括一个或多个来源于衔接子寡核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中，靶多核苷酸在一端接合第一衔接子寡核苷酸且在另一端接合第二衔接子寡核苷酸。在一些实施方案中，靶多核苷酸和其结合的衔接子包括平端。在一些实施方案中，可对每个样品进行单独的连接反应，针对每个样品使用包含至少一个条形码序列的不同第一衔接子寡核苷酸，使得没有条形码序列与一个以上的样品的靶多核苷酸接合。接合有衔接子/引物寡核苷酸的靶多核苷酸被认为是被该接合的衔接子“标记的”。

在一些实施方案中，本文所述的核酸采用点击化学法连接。采用点击化学法连接不同分子的合适方法是本领域已知的(关于寡核苷酸的点击化学法连接，参见例如El-Sagheer等人(PNAS,108:28,11338-11343,2011))。点击化学法可在Cu1的存在下进行。

条形码

条形码为通常已知的核酸序列，其允许鉴别与该条形码相关联的多核苷酸的一些特征。在一些实施方案中，条形码包含核酸序列，该核酸序列在连接到靶多核苷酸时用作该靶多核苷酸所源自的样品的标识物。

条形码可设计成合适的长度，以允许足够的识别度，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55个或更多个核苷酸的长度。同一个分子上可使用多个条形码，如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个条形码，这些条形码任选地由非条形码序列隔开。在一些实施方案中，条形码的长度短于10、9、8、7、6、5或4个核苷酸。在一些实施方案中，与一些多核苷酸关联的条形码和与其他多核苷酸关联的条形码具有不同的长度。通常，条形码足够长且包含足够不同的序列，以使得能够根据其关联的条形码鉴别样品。在一些实施方案中，条形码和其关联的样品来源可在条形码序列中的一个或多个核苷酸的突变、插入或缺失(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸的突变、插入或缺失)之后准确确定。在一些实施方案中，多个条形码中的每一个条形码与所述多个条形码中的所有其他条形码在至少3个核苷酸位置上不同，例如在至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位置上不同。

测序

本文所述的从头合成的寡核苷酸和较长的多核苷酸产物可在继续进行程序如多反应程序的后续步骤前受到质量控制。可在保持单个产物在单独的体积内，如在本文所述的基底的解析特征上的同时施加采用质量控制。可等分一部分以用于质量控制，而划分每种产物的体积的剩余部分保持可单独接近。

图17示出了包括下一代测序的示例质量控制程序。将靶向特定产物的基因特异性扣锁探针设计为覆盖所测试的产物的重叠序列区段。可将对于基因产物是特异性的单个扣锁探针的末端设计成可与沿基因产物散布的区域杂交，以用于在测序期间适当地覆盖。所有对于该相同基因产物是特异性的探针可包括与该基因产物关联的条形码序列。合适的聚合酶和/或连接酶可用于沿基因产物靶标填充扣锁探针的末端之间。在一些情况下，扣锁探针将形成环状单链DNA。例如在将基因产物体积的一部分等分后，通常为线性的基因产物可被消化。或者，可在添加扣锁探针之前将基因产物体积的一部分等分。可扩增携带基因产物区段的扣锁探针，例如，采用PCR。可在扩增期间靶向扣锁探针上的通用或特异性引物结合区域。测序引物结合区域可最初存在于扣锁探针中，或可在后续步骤期间添加，例如通过在扩增之前、期间或之后利用测序衔接子添加。

在多个实施方案中，基因产物特异性扣锁探针将在初始测序文库步骤后合并。在这些情况下，可使用基因产物特异性条形码将序列信息追溯到单个基因产物。通过本文所述的或本领域已知的任何适合的手段获得的测序信息可通过例如基于条形码信息分箱(binning)成单独的序列池而去卷积。本领域已知的合适的比对和序列确认算法可用于完成质量控制。错误率和位置可通过序列座位、通过基因产物、通过文库或通过文库子区段进行分析。错误分析可告知产物被接受或被拒绝用于后续步骤或用于递送至请求者。

在任意的实施方案中，寡核苷酸的检测或定量分析可通过测序实现。亚单位或整个合成的寡核苷酸可通过本领域已知的任何合适的方法，例如，IlluminaHiSeq2500，包括本文所述的测序方法，经由所有寡核苷酸的完整测序进行检测。

可通过本领域公知的经典Sanger测序方法实现测序。还可采用高通量系统实现测序，其中一些高通量系统允许对测序的核苷酸在其掺入生长链时或之后立即进行检测，即序列的实时检测或基本实时的检测。在一些情况下，高通量测序每小时产生至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少100,000或至少500,000个序列读取结果；其中每次读取每个读取结果为至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120或至少150个碱基。

在一些实施方案中，高通量测序包括使用可通过Illumina的基因组分析仪IIX、MiSeq个人测序仪或HiSeq系统获得的技术，如采用HiSeq2500、HiSeq1500、HiSeq2000或HiSeq1000的那些。这些机器采用基于可逆终止子的合成测序化学法。这些机器可在八天内进行2000亿次或更多的DNA读取。可采用较小的系统在3、2、1天或更短的时间内运行。可采用短合成循环来使获得测序结果的耗时最小化。

在一些实施方案中，高通量测序包括可通过ABISolidSystem获得的技术的使用。该基因分析平台使得能够对连接至珠子的克隆扩增的DNA片段进行大规模平行测序。该测序技术基于与染料标记的寡核苷酸的连续连接。

下一代测序可包括离子半导体测序(例如，采用来自LifeTechnologies(IonTorrent)的技术)。离子半导体测序可利用当核苷酸掺入DNA的链时离子可被释放这一事实。为进行离子半导体测序，可形成微加工的孔的高密度阵列。每个孔可容纳一个DNA模板。该孔的下方可以是离子敏感层，且离子敏感层的下方可以是离子传感器。当核苷酸添加至DNA时，可释放H+，这可作为pH的变化而测量。H+离子可被转化成电压并由半导体传感器记录。阵列芯片可依次用一个接一个的核苷酸充溢。可能不需要扫描、光或相机。在一些情况下，使用IONPROTON^TM测序仪对核酸进行测序。在一些情况下，使用IONPGM^TM测序仪。IonTorrentPersonalGenomeMachine(PGM)可在两小时内进行1000万次读取。

在一些实施方案中，高通量测序包括使用可通过HelicosBioSciencesCorporation(Cambridge,Massachusetts)获得的技术，如单分子合成测序(SMSS)法。SMSS是独特的，因为其允许在至多24小时内对整个人类基因组进行测序。最后，SMS是强有力的，因为其像MIP技术一样，它在杂交前不需要预扩增步骤。实际上，SMSS不需要任何扩增。SMSS在美国公开申请号2006002471I、20060024678、20060012793、20060012784和20050100932中部分描述。

在一些实施方案中，高通量测序包括使用可通过454Lifesciences,Inc.(Branford,Connecticut)获得的技术，如皮滴定板(PicoTiterPlate)装置，该装置包括传输通过测序反应产生的化学发光信号以被仪器中的CCD相机记录的光纤板。光纤的这种使用允许在4.5小时内检测最少2000万个碱基对。

采用珠子扩增及随后的光纤检测的方法在Marguiles,M.等人"Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactors",Nature,doi:10.1038/nature03959中；以及在美国公开申请号20020012930、20030058629、20030100102、20030148344、20040248161、20050079510、20050124022和20060078909中描述。

在一些实施方案中，高通量测序采用克隆单分子阵列(ClonalSingleMoleculeArray，Solexa,Inc.)或利用可逆终止子化学法的合成测序(SBS)来进行。这些技术在美国专利号6,969,488、6,897,023、6,833,246、6,787,308和美国公开申请号20040106130、20030064398、20030022207以及Constans,A.,TheScientist2003,17(13):36中部分描述。寡核苷酸的高通量测序可采用本领域已知的任何合适的测序方法实现，如被PacificBiosciences、CompleteGenomics、GeniaTechnologies、HalcyonMolecular、OxfordNanoporeTechnologies等商业化的那些。其他高通量测序系统包括在Venter,J.等人Science2001年2月16日；Adams,M.等人,Science2000年3月24日；和M.J,Levene,等人Science299:682-686,2003年1月；以及美国公开申请号20030044781和2006/0078937中公开的那些。总的来说，这类系统包括通过经由聚合反应暂时添加碱基来对具有多个碱基的靶寡核苷酸分子进行测序，这在寡核苷酸分子上测量，即实时跟踪核酸聚合酶在待测序的模板寡核苷酸分子上的活性。然后可通过确定在碱基添加顺序中的每一步，哪个碱基经由核酸聚合酶的催化活性被掺入靶寡核苷酸的生长的互补链中，来推导出序列。将靶多核苷酸分子复合体上的聚合酶提供在适合于沿着靶寡核苷酸分子移动并在活性位点延伸寡核苷酸引物的位置。在邻近活性位点处提供多种标记类型的核苷酸类似物，其中每个可区分类型的核苷酸类似物与靶寡核苷酸序列中的不同核苷酸互补。通过采用聚合酶将核苷酸类似物添加到寡核苷酸链的活性位点处而延伸生长的寡核苷酸链，其中所添加的核苷酸类似物与靶寡核苷酸在活性位点处的核苷酸互补。对由于聚合步骤而添加至寡核苷酸引物的核苷酸类似物进行鉴别。重复进行提供标记的核苷酸类似物、使生长的寡核苷酸链聚合和鉴别添加的核苷酸类似物的步骤，使得寡核苷酸链进一步延伸且靶寡核苷酸的序列得到确定。

下一代测序技术可包括来自PacificBiosciences的实时(SMRT^TM)技术。在SMRT中，可将四种DNA碱基中的每一种与四种不同的荧光染料中的一种附接。这些染料可以是磷酸连接的。可将单种DNA聚合酶与模板单链DNA的单分子固定在零模式波导(ZMW)的底部。ZMW可以是约束结构，其使得能够对比可快速扩散进入和离开ZWM(在微秒内)的荧光核苷酸的背景，观察单个核苷酸被DNA聚合酶的掺入。核苷酸掺入生长链中可耗费数毫秒。在这段时间内，荧光标记物可被激发并产生荧光信号，并且可将该荧光标记物切除。ZMW可从下方照射。来自激发束的衰减光可透过每个ZMW的下部20-30nm。可创建具有20仄升(10"升)的检测极限的显微镜。这种微小的检测体积可提供背景噪声减少的1000倍改善。对染料的相应荧光的检测可指示掺入了哪个碱基。可以重复该过程。

在一些情况下，下一代测序是纳米孔测序{参见例如,SoniGV和MellerA.(2007)ClinChem53:1996-2001)。纳米孔可以是较小的孔穴，其直径为约一纳米的数量级。纳米孔在导电流体中的浸没和跨纳米孔施加电势可由于离子通过纳米孔的传导产生微弱的电流。流过的电流的量对纳米孔的大小可能是敏感的。当DNA分子穿过纳米孔时，DNA分子上的每个核苷酸均可在不同程度上阻塞纳米孔。因此，当DNA分子穿过纳米孔时经过纳米孔的电流的变化可代表DNA序列的读取。纳米孔测序技术可来自OxfordNanoporeTechnologies；例如，GridlON系统。可将单个纳米孔插入跨越微孔顶部的聚合物膜中。每个微孔均可具有用于单独感测的电极。可将微孔制作于阵列芯片内，每个芯片具有100,000个或更多个微孔(例如，超过200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000个)。仪器(或节点)可用于对芯片进行分析。可对数据进行实时分析。一次可操作一个或多个仪器。纳米孔可以是蛋白质纳米孔，例如，一种七聚体蛋白质孔——蛋白α-溶血素。纳米孔可以是制备的固态纳米孔，例如，在合成膜(例如，SiNx或SiO₂)中形成的纳米尺寸的孔穴。纳米孔可以是杂合的孔(例如，蛋白质孔整合到固态膜中)。纳米孔可以是具有集成的传感器(例如，隧道电极检测器、电容检测器或基于石墨烯纳米间隙或边缘状态探测器(参见例如,Garaj等人(2010)Naturevol.67,doi:10.1038/nature09379))的纳米孔。可对纳米孔进行功能化以用于分析特定类型的分子(例如，DNA、RNA或蛋白质)。纳米孔测序可包括“链测序”，其中完整的DNA聚合物可穿过蛋白质纳米孔，且当DNA使孔易位时实时测序。酶可将双链DNA的链分开，并将链输送通过纳米孔。DNA可在一端具有发夹结构，且系统可读取两条链。在一些情况下，纳米孔测序是“外切核酸酶测序”，其中可通过持续性的外切核酸酶从DNA链上切下单个核苷酸，并且该核苷酸可穿过蛋白质纳米孔。该核苷酸可与孔中的分子(例如，环糊精)瞬时结合。电流的特征性中断可用来鉴别碱基。

可使用来自GENIA的纳米孔测序技术。工程蛋白质孔可包埋在脂双层膜中。可使用“主动控制”技术来实现有效的纳米孔-膜组装和对DNA通过通道的移动的控制。在一些情况下，纳米孔测序技术来自NABsys。基因组DNA可被片段化成具有约100kb的平均长度的链。可将该l00kb片段制成单链且随后与6-聚体探针杂交。可驱使具有探针的基因组片段通过纳米孔，这可产生电流-时间示踪。电流示踪可提供探针在每个基因组片段上的位置。可将基因组片段排列起来以产生基因组的探针图。可对探针的文库平行进行该过程。可产生每个探针的基因组长度探针图。错误可通过名为“移动窗口杂交测序(movingwindowSequencingByHybridization，mwSBH)”的方法修正。在一些情况下，纳米孔测序技术来自IBM/Roche。可利用电子束在微芯片中制作纳米孔尺寸的开口。可使用电场将DNA推过或使其穿过纳米孔。在纳米孔中的DNA晶体管装置可包括交替的纳米尺寸的金属和电介质层。DNA骨架中的离散电荷可被电场在DNA纳米孔内捕获。关闭和打开门电压可使得DNA序列能够被读取。

下一代测序可包括DNA纳米球测序(如由例如CompleteGenomics进行的；参见例如,Drmanac等人(2010)Science327:78-81)。可将DNA分离、片段化并进行大小选择。例如，DNA可被片段化(例如，通过超声处理)为约500bp的平均长度。可将衔接子(Adl)附接至片段的末端。该衔接子可用来与锚定子杂交，以用于测序反应。可PCR扩增在每一端上结合有衔接子的DNA。可对衔接子序列进行修饰，使得互补的单链末端彼此结合，形成环状DNA。可对该DNA进行甲基化以保护其免受在后续步骤中使用的IIS型限制酶的切割。衔接子(例如，右侧衔接子)可具有限制性识别位点，并且该限制性识别位点可保持未甲基化。衔接子中的未甲基化的限制性识别位点可被限制酶(例如，Acul)识别，并且该DNA可被Acul从右侧衔接子右侧的13bp处切割，以形成线性双链DNA。可将第二轮的右侧和左侧衔接子(Ad2)连接至该线性DNA的任一端上，并且可PCR扩增(例如，通过PCR)结合有两个衔接子的所有DNA。可对Ad2序列进行修饰以使得它们能够彼此结合并形成环状DNA。可对该DNA进行甲基化，但在左侧Adl衔接子上的限制酶识别位点可保持未甲基化。可施加限制酶(例如，Acul)，并且该DNA可从Adl左侧的13bp处切割，以形成线性的DNA片段。可将第三轮的右侧和左侧衔接子(Ad3)连接至线性DNA的右翼和左翼，并且可对所得的片段进行PCR扩增。可对衔接子进行修饰，使得它们可彼此结合并形成环状DNA。可添加III型限制酶(例如，EcoP15)；EcoP15可在Ad3左侧的26bp处和Ad2右侧的26bp处切割DNA。该切割可去除DNA的大区段并使DNA再次线性化。可将第四轮的右侧和左侧衔接子(Ad4)连接至线性DNA，并且可扩增(例如，通过PCR)该DNA并修饰，使得它们彼此结合并形成完整的环状DNA模板。

滚环复制(例如，使用Phi29DNA聚合酶)可用来扩增DNA的小片段。四个衔接子序列可含有可杂交的回文序列，且单链可折叠到其自身之上，以形成直径平均可为约200-300纳米的DNA纳米球(DNB^TM)。DNA纳米球可附接(例如，通过吸附)至微阵列(测序流动池)。该流动池可以是涂覆有二氧化硅、钛和六甲基二硅氮烷(HMDS)以及光致抗蚀剂材料的硅片。可以通过将荧光探针连接至DNA，经由非链式测序进行测序。探询位置的荧光的颜色可通过高分辨率相机来可视化。可确定在衔接子序列之间的核苷酸序列的身份。

喷墨沉积

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物利用将组合物沉积、定位或放置在支持物表面之上或之内的特定位置处。沉积可包括使一种组合物与另一种组合物相接触。沉积可以是手动的或自动的，例如，沉积可通过自动化的机器人装置来完成。脉冲喷射或喷墨可用于将流体组合物的液滴分配到支持物上。脉冲喷射通常通过将压力脉冲(例如通过压电或热电元件)递送到与出口或孔口相邻的液体，从而使液滴可由此进行分配来运行。

可使用本领域已知的多种方法或系统将试剂液体沉积到在本文其他部分进一步详细描述的基底的解析座位上。流体的微滴可以以亚微米精度递送至在本发明描述的基底之上或之内的表面或解析座位上。可使用将喷墨技术用作以下流体体积的微分配方法的可商购的分配装备。采用喷墨技术产生的小滴是高度可重现的，并且可受到控制以使得可以根据数字储存的图像数据在特定时间将小滴放置在特定位置。需求模式喷墨装置的典型小滴直径可以为30-100μm，其相当于小滴体积为14-520pl。需求模式喷墨装置的小滴产生速率可以是2000-5000个小滴每秒。需求模式喷墨装置微分配可以以合适的分辨率和通量使用，以为基底提供高密度的本文其他部分更详细描述的解析座位。用于沉积或递送试剂的方法和系统在美国专利号5,843,767和6,893,816中进一步描述，这两者通过引用以其全部并入本文。

用于将试剂沉积或递送至解析座位的系统可包含一个或多个子系统，包括但不限于：微型喷射分配头、流体递送系统或喷墨泵、X-Y定位系统、视觉系统或系统控制器。微型喷射分配头可以是多个微型喷射(MicroJet)装置(例如，8个微型喷射装置)和所需要的驱动电子设备的组装件。通过使用驱动电子设备的单一通道来多路复用8或10个分配装置可使系统的复杂度最小化。针对每个单独装置的驱动波形的要求可从系统控制器下载。驱动电子设备可使用本领域已知的常规方法构建。流体递送系统或喷墨泵可以是经过改进以充当多试剂输入系统的BeckmanBiomec。在流体递送系统和微型喷射分配头之间可以是电磁阀系统，其由系统控制器控制。它们提供加压冲洗流体和空气以从系统中排除试剂，并且提供真空以将试剂加载到系统内。X-Y定位系统可以是任何市售的带有控制器的精确X-Y定位系统。定位系统的尺寸可设置为容纳多个传感器。视觉系统可用于校准每个微型喷射装置相对于定位系统的“着陆区(landingzone)”。校准可发生在每个试剂加载循环之后。此外，当传感器托盘通过传感器上的基准标记首次加载时，该视觉系统可以定位每个传感器上的各个分配位点。可使用基于软件的系统或基于硬件的视觉系统。系统控制器可以是用作总体系统控制器的标准计算机系统。视觉系统的图像捕捉和处理也存在于系统控制器上。用于将试剂沉积或递送至解析座位的系统进一步详细描述于PCT公布号WO2000039344，其通过引用以其全文并入本文。

图18示出了喷墨组装件的一个实例。在一些实施方案中，喷墨组装件可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、45、48、50、56、60、64、72、75、80、85、90、95、100个或更多个喷墨头。喷墨头可各自沉积不同的密码子(三核苷酸)结构单元。在一个示例性的实施方案中，喷墨头可具有硅孔板，该硅孔板在254μm中心上具有256个喷嘴，并且具有100μm的飞移高度。每个喷墨头可接近每个贯穿的孔。喷墨组装件可具有约100mm/s的扫描速度，其在移动(x，y)平面内的精度约为2μm。在一些情况下，喷墨组装件在晶片以上的扫描高度可以约为100μm，且具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μm的平整度跳动(flatnessrunout)。在一些情况下，喷墨组装件可包含用以将喷墨打印机与吸持在真空吸盘上的基底例如硅晶片对准的视觉系统，在某些情况下作为流通池组装件的一部分。

在一些情况下，将试剂沉积至多个本文所述的解析座位的方法和系统可包括通过喷墨泵将第一试剂的至少一个微滴施加至多个座位的第一座位，以及通过喷墨泵将第二试剂的至少一个微滴施加至多个解析座位的第二座位。在一些实施方案中，第二座位可以与第一座位相邻，并且第一和第二试剂可以不同。第一和第二座位可位于制作于支持物表面内的微结构上，并且该微结构可包含至少一个通道。在一些情况下，该至少一个通道超过100μm深。在一些实施方案中，第一和第二试剂可以相同。在一些情况下，微结构包含较大的微通道和一个或多个与第一微通道流体连接的微通道。该较大的初始微通道在开始时接收沉积的液体，通常减少试剂对相邻微结构的任何交叉污染和来自相邻微结构的试剂的任何交叉污染。小滴的内容物可随后流入一个或多个较小的微通道中，该较小的微通道可具有适合于本文所述的反应如寡核苷酸合成的表面。

所述至少一个通道可具有可以为约、至少约或小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μm的深度。在一些实施方案中，该至少一个通道可具有可以在约50-100、50-150、50-200、100-200、100-300、20-300或20-100μm之间的深度。在一些实施方案中，该至少一个通道可超过100μm深。

每个试剂小滴可具有可穿过微通道的深度而不损失动量的合适体积。该合适的体积可包含所需量的用于寡核苷酸合成的试剂。例如，非限制性地，每个包含试剂的小滴可具有约为或至少约4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500pl、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100、200、500nl或更大的体积。在多个实施方案中，对系统进行调整以使得尾随沉积的小滴的任何附属小滴小到足以使交叉污染最小化。在喷墨的情况下，可使打印头与基底足够靠近，例如在100μm以内，使得气溶胶移动前沉积的小滴及其附属小滴基本在基底的通道内。附属小滴可具有小于0.5、1、1.5或2μm的直径。在多个实施方案中，参与气溶胶移动的附属小滴按体积计的比例小于沉积的小滴的5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少。

如在本文其他部分所描述的，微结构可包含彼此流体连通的多个通道。在一些情况下，微结构可包含至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个流体连通的通道。如在本文其他部分进一步详细描述的，这些通道可具有不同的尺寸，例如宽度或长度。在一些实施方案中，微结构的流体连接的通道可包含两个或更多个具有相同的宽度、长度和/或其他维度的通道。

可在最小的交叉污染下以高精度将流体的微滴递送至如本文其他部分所述的基底内的表面或解析座位。在一些情况下，第一座位可接收少于0.1％的意图沉积到第二座位的第二试剂，且相似地，第二座位可接收少于0.1％的第一试剂。在一些情况下，第一座位可接收少于约0.5％、0.45％、0.4％、0.35％、0.3％、0.25％、0.2％、0.15％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％的第二试剂。第二座位可接收少于约0.5％、0.45％、0.4％、0.35％、0.3％、0.25％、0.2％、0.15％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％的第一试剂。

在一些情况下，试剂可以以直径约为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm的小滴递送。试剂的小滴可具有至少约2μm的直径。试剂可以以直径小于约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm的小滴递送。试剂可以以直径在2-10、2-5、10-200、10-150、10-100、10-500、20-200、20-150、20-100、30-100、30-200、30-150、40-100、40-80或50-60μm之间的小滴递送。

试剂的小滴可以以约或至少约1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个小滴每秒的速率沉积。

软着陆

用于将小滴沉积至多个微孔的系统和方法也在本文中描述。在一个方面，可将小滴沉积到包含具有多个微孔的第一表面的微流体系统的微孔中。小滴可具有合适的雷诺数，例如约1-1000、1-2000、1-3000、0.5-1000、0.5-2000、0.5-3000、0.5-4000、0.5-5000、1-500、2-500、1-100、2-100、5-100、1-50、2-50、5-50或10-50，使得到达微孔的底部时小滴的弹跳最小化。本领域技术人员理解，雷诺数可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内(例如，约0.5到约500)。用于在流体系统中精确估计雷诺数的合适方法在Clift等人(Clift,Roland,JohnR.Grace和MartinE.Weber,Bubbles,DropsandParticles,2005.DoverPublications)和Happel等人(Happel,John和HowardBrenner,1965.Prentice-Hall)中描述，这两篇文献通过引用以其全文并入本文。

所述多个微孔的密度可超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、1000或更多个/mm²。依照本文所述的方法，液体的小滴可流畅地流过微孔并轻轻地着陆在微孔的底部。

可采用任何本领域已知的方法和系统沉积液体小滴。在一些实施方案中，所述微流体系统还可包含喷墨泵。该喷墨泵可用于将液体小滴沉积到多个微孔中的一个。液体沉积系统的多个实施方案在本说明书的其他部分描述。

在一些情况下，在基底的子区域内，微孔可以具有不同的宽度、相同的宽度或相同或不同宽度的组合。微孔可具有任意不同的宽度。例如，非限制性地，微孔的宽度可以为约、宽于约或窄于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm。

微孔可具有任意不同的长度。例如，非限制性地，微孔的长度可以为约、长于约或短于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900或1000μm。

微孔可以与至少一个微通道流体连接。微孔可具有约、至少约或小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm的表面积与长度之比或周长。

液体的小滴可具有适合于本文所述的方法的体积。在一些实施方案中，小滴可具有小于约0.5微升(μl)、小于约1μl、小于约1.5μl、小于约2μl、小于约2.5μl、小于约3μl、小于约3.5μl、小于约4μl、小于约4.5μl、小于约5μl、小于约5.5μl、小于约6μl、小于约6.5μl、小于约7μl、小于约7.5μl、小于约8μl、小于约8.5μl、小于约9μl、小于约9.5μl、小于约10μl、小于约11μl、小于约12μl、小于约13μl、小于约14μl、小于约15μl、小于约16μl、小于约17μl、小于约18μl、小于约19μl、小于约20μl、小于约25μl、小于约30μl、小于约35μl、小于约40μl、小于约45μl、小于约50μl、小于约55μl、小于约60μl、小于约65μl、小于约70μl、小于约75μl、小于约80μl、小于约85μl、小于约90μl、小于约95μl或小于约100μl的体积。在一些实施方案中，小滴可具有约0.5微升(μl)、约1μl、约1.5μl、约2μl、约2.5μl、约3μl、约3.5μl、约4μl、约4.5μl、约5μl、约5.5μl、约6μl、约6.5μl、约7μl、约7.5μl、约8μl、约8.5μl、约9μl、约9.5μl、约10μl、约11μl、约12μl、约13μl、约14μl、约15μl、约16μl、约17μl、约18μl、约19μl、约20μl、约25μl、约30μl、约35μl、约40μl、约45μl、约50μl、约55μl、约60μl、约65μl、约70μl、约75μl、约80μl、约85μl、约90μl、约95μl或约100μl的体积。

在一些情况下，微通道可涂覆有提高表面能的部分，如化学惰性的部分。该类型的合适的化学惰性或反应性部分在本说明书的其他部分描述。

小滴的雷诺数可以在使得液体流畅地流过如本文所述的微孔和/或微通道的雷诺数的范围内。在一些实施方案中，小滴的雷诺数可以小于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一些实施方案中，小滴的雷诺数可以大于约0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一些情况下，小滴可以以层流或近似于层流流过微孔。

小滴可以以至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100m/sec或更高的速度施加或沉积。

可编程的拆分(split)

本文所描述的系统可包含多个解析座位和多个解析反应器帽，它们可密封在一起以形成多个解析反应器。所述多个解析反应器可含有试剂。该密封可以是可逆的或松动的，并且所述多个解析反应器帽可从所述多个解析座位上释放。一旦从包含多个解析座位的第一表面上释放，所述反应器帽可保留至少一部分试剂。通过控制反应器帽从所述多个解析座位上的释放，可以控制液体或试剂的划分。在本发明的一个方面，本文描述了划分方法。该方法可包括使包含第一多个解析座位处的液体的第一表面与包含第二多个解析座位的第二表面如反应器帽相接触，其中第一表面可包含就该液体而言的第一表面张力，第二表面可包含就该液体而言的第二表面张力，并且确定释放速度，以使所需比例的该液体可从所述第一多个解析座位转移到所述第二多个解析座位。一旦第二表面以这种计算出的速度从第一表面上脱离，所需比例的反应器内容物可保留在反应器中。包含第一多个解析座位的第一表面可包含涂覆有寡核苷酸的多个解析座位。包含第二多个解析座位的第二表面可以是包含多个反应器帽的加帽元件。在一些情况下，该方法可进一步包括接触具有第三多个解析座位的第三表面。本文中描述了各个方面或实施方案。

保留在第二表面上的液体可通过本领域已知的任何方法来保持。在一些情况下，第一或第二表面可包含保持至少一部分液体的微通道。在一些情况下，第一或第二表面可包含保持至少一部分液体的纳米反应器。在一些情况下，液体可由于第一和第二表面之间的表面张力差而得到保留。不受理论制约，对于基于水的液体，较高比例的液体可保留在具有较高表面能或较低疏水性的表面上。

可对液体进行划分，以使所需比例的试剂在释放后可以保留到第一或第二表面上。例如，非限制性地，所需比例可以为约、至少约或大于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

平行的微流体混合方法

在本发明的另一个方面，本文中描述了混合液体的方法。该方法可包括：提供第一基底，其包含多个在其上制作的微结构；提供第二基底，其包含多个解析反应器帽；将第一基底与第二基底对准，以使所述多个反应器帽中的第一反应器帽被配置为从第一基底中的n个微结构接收液体；以及将液体从所述n个微结构递送至第一反应器帽内，从而混合来自所述n个微结构的液体，形成混合物。本文中描述了各种实施方案和变化形式。

解析反应器帽的密度可以是使第一基底的微结构与第二基底的反应器帽达到所需要的对准的任何合适的密度。在一些情况下，解析反应器帽的密度可以是至少1个/mm²。在一些情况下，解析反应器的密度可以是每1mm²约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500或约2000个位点。在一些实施方案中，解析反应器的密度可以是每1mm²至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约75、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1500、至少约2000或至少约3000个位点。

微结构可以处于根据本发明的方法和组合物可行的任何密度。在一些情况下，微结构可以处于每1mm²约、至少约或小于约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约75、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1500、约2000或约3000个位点的密度。在一些实施方案中，微结构可以处于每1mm²至少100个的密度。在一些情况下，微结构可具有与解析反应器的密度大致相同的表面密度。

在一些情况下，在将第一基底与第二基底对准后可使第一基底和第二基底之间存在间隙，例如小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μm的间隙，以使所述多个反应器帽中的第一反应器帽被配置为从第一基底中的n个微结构接收液体。

在一些情况下，在将第一基底与第二基底对准后，混合物或液体可部分地扩散到第一基底与第二基底之间的间隙中，以使所述多个反应器帽中的第一反应器帽被配置为从第一基底中的n个微结构接收液体。部分扩散到间隙中的液体或混合物可形成毛细管被动阀。该混合方法可进一步包括通过使第一与第二基底更加紧靠在一起来密封该间隙。在一些情况下，所述第一和第二基底可直接物理接触。

如在本文其他部分进一步详细描述的，所述多个微结构和反应器帽可具有任何合适的设计或尺寸。至少一个通道可具有圆形形状的横截面，其可包含约为、至少约、小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μm的横截面半径。

在一些情况下，通道可涂覆有提高表面能的部分，如化学惰性的部分，该表面能对应于小于90°的水接触角。表面能或表面的疏水性可通过测量水接触角来评估或测量。水接触角小于90°则可以以相对亲水的方式将固体表面功能化。水接触角大于90°则可以以相对疏水的方式将固体表面功能化。具有低表面能的高度疏水表面可具有大于120°的水接触角。在一些情况下，可将通道或如本文所述的两个通道中的一个的表面功能化或修饰成疏水的，具有低表面能，或具有如在非弯曲表面上测量的可大于约90°、95°、100°、105°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°或150°的水接触角。在一些情况下，可将本发明中的通道或如本文所述的两个通道中的一个的表面功能化或修饰成亲水的，具有高表面能，或具有如在非弯曲表面上测量的可小于约90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°或10°的水接触角。可将通道或两个通道中的一个的表面功能化或修饰成更加亲水或疏水的。在一些情况下，第一和第二基底的表面可包括不同的就给定液体(如水)而言的表面能。在一些情况下，第一和第二基底的表面可包括在约5°、10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°、90°之间的差异的水接触角。其他表面功能化方法在美国专利号6,028,189中描述，其通过引用以全文并入本文。

在一些实施方案中，可通过压力进行递送。将液体从n个微结构递送到第一反应器帽中可导致混合来自n个微结构的液体并形成混合物。

在一些情况下，总混合液的体积可大于反应器帽的容积。全部或部分反应器帽表面，如边缘表面，可利用本文其他部分进一步详细描述的以及本领域已知的合适的表面修饰方法进行修饰。在一些情况下，工程构建表面不规则性。化学表面修饰和不规则性可用于调节边缘的水接触角。类似的表面处理也可应用于基底的表面上，该基底表面紧靠反应器帽，从而形成密封，例如可逆密封。如本文其他部分进一步详细描述的，可在两个表面之间使用毛细管被动阀。表面处理在对此类包含毛细管被动阀的密封的精确控制中可能是有用的。

在一些情况下，加帽元件从第一表面上的释放和加帽元件从第二表面上的释放可以以不同的速度进行。从相应的表面上释放加帽元件时保留的部分试剂的量可以通过速度或者加帽元件与相应表面的表面能来控制。加帽元件和相应表面的表面能或疏水性的差异可以是用来控制在释放时保留的试剂的部分的参数。第一和第二反应的容积可以不同。

下游应用

本发明的方法和组合物可用于核酸杂交研究，如基因表达分析，基因分型，异源双链体分析，基于杂交的核酸测序确定，DNA、RNA、肽、蛋白质或其他寡聚或非寡聚分子的合成，用于候选药物评价的组合文库。

根据本发明合成的DNA和RNA可用于任何应用，包括，例如，用于杂交方法如基因表达分析、通过杂交的基因分型(竞争性杂交和异源双链体分析)、杂交测序的探针，用于Southern印迹分析的探针(标记的引物)，用于阵列(微阵列或过滤器阵列)杂交的探针，可与能量转移染料一起用来在基因分型或表达分析中检测杂交的“扣锁”探针，以及其他类型的探针。根据本发明制备的DNA和RNA还可用于基于酶的反应，如聚合酶链反应(PCR)，作为引物用于PCR，作为模板用于PCR、等位基因特异性PCR(基因分型/单体型分型)技术、实时PCR、定量PCR、逆转录酶PCR以及其他PCR技术。DNA和RNA可用于多种连接技术，包括基于连接的基因分型、寡核苷酸连接试验(OLA)、基于连接的扩增、用于克隆实验的衔接子序列的连接、Sanger双脱氧测序(引物、标记的引物)、高通量测序(采用电泳分离或其他分离方法)、引物延伸、迷你测序和单碱基延伸(SBE)。根据本发明产生的DNA和RNA可用于诱变研究(通过寡核苷酸向已知序列中引入突变)、逆转录(制备RNA转录物的cDNA拷贝)、基因合成、限制性位点的引入(诱变的一种形式)、蛋白质-DNA结合研究及类似的实验。通过本方法产生的DNA和RNA的多种其他用途将会被本领域技术人员想到，并且这些用途也被认为处于本公开内容的范围内。

计算机系统

在多个实施方案中，本发明的方法和系统可进一步包括计算机系统上的软件程序及其使用。相应地，对于分配/抽真空/再填充功能的同步如编排和同步打印头运动、分配动作和真空致动的计算机化控制处于本发明的范围内。计算机系统可被编程为在用户指定的碱基序列与分配器头的位置之间接合，以将正确的试剂递送至基底的指定区域。

图19中示出的计算机系统1900可被理解为能够从介质1911和/或网络端口1905读取指令的逻辑设备，其可任选地连接至具有固定介质1912的服务器1909。诸如图19示出的系统可包括CPU1901、磁盘驱动器1903、任选的输入设备如键盘1915和/或鼠标1916以及任选的监视器1907。可通过示出的通信媒介实现与本地或远程位置处的服务器的数据通信。通信媒介可包括传输和/或接收数据的任何手段。例如，通信媒介可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可提供经由万维网的通信。可以预期有关本公开内容的数据可经过这样的网络或连接而传输，以便由图19所示的用户方1922接收和/或审阅。

图20是示出可与本发明的示例实施方案结合使用的计算机系统2000的第一示例架构的框图。如图20所示，该示例计算机系统可包括用于处理指令的处理器2002。处理器的非限制性实例包括：IntelXeon^TM处理器、AMDOpteron^TM处理器、Samsung32-bitRISCARM1176JZ(F)-Sv1.0^TM处理器、ARMCortex-A8SamsungS5PC100^TM处理器、ARMCortex-A8AppleA4^TM处理器、MarvellPXA930^TM处理器或功能上等效的处理器。多个执行线程可用于并行处理。在一些实施方案中，也可以使用多个处理器或具有多核的处理器，无论是在单一计算机系统中，在群集中，还是通过包含多个计算机、蜂窝电话和/或个人数据助理设备的网络跨系统分布。

如图20所示，高速缓冲存储器2004可连接至或并入处理器2002，以提供由处理器2002新近或频繁使用的指令或数据的高速存储器。处理器2002通过处理器总线2008连接至北桥2006。北桥2006通过存储器总线2012连接至随机存取存储器(RAM)2010，并管理处理器2002对RAM2010的访问。北桥2006还通过芯片集总线2016连接至南桥2014。南桥2014又连接至外围总线2018。外围总线可以是例如PCI、PCI-X、PCIExpress或其他外围总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片集，并管理在处理器、RAM与外围总线2018上的外围组件之间的数据传送。在一些供选择的架构中，北桥的功能性可以并入处理器，而不是使用单独的北桥芯片。

在一些实施方案中，系统2000可包括附接至外围总线2018的加速器卡2022。加速器可包括现场可编程门阵列(FPGA)或用于加速某个处理的其他硬件。例如，加速器可用于适应性数据重建或用来评估在扩展集处理中使用的代数表达式。

软件和数据存储在外部存储器2024中并可加载至RAM2010和/或高速缓冲存储器2004中，以供处理器使用。系统2000包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、Windows^TM、MACOS^TM、BlackBerryOS^TM、iOS^TM和其他功能上等效的操作系统，以及在操作系统顶部运行的、用于根据本发明的示例实施方案管理数据存储和优化的应用软件。

在该实例中，系统2000还包括与外围总线连接的网络接口卡(NIC)2020和2021，以提供与外部存储如网络附加存储(NAS)和可用于分布式并行处理的其他计算机系统的网络接口。

图21是显示了具有多个计算机系统2102a和2102b、多个蜂窝电话和个人数据助理2102c以及网络附加存储(NAS)2104a和2104b的网络2100的示图。在示例实施方案中，系统2102a、2102b和2102c可管理数据存储并优化对存储在网络附加存储(NAS)2104a和2104b中的数据的数据访问。数学模型可用于该数据并使用跨计算机系统2102a和2102b和蜂窝电话以及个人数据助理系统2102c的分布式并行处理进行评估。计算机系统2102a和2102b和蜂窝电话以及个人数据助理系统2102c也可提供对存储在网络附加存储(NAS)2104a和2104b中的数据的适应性数据重建的并行处理。图21仅示出了一个实例，而多种多样的其他计算机架构和系统可与本发明的多个实施方案一起使用。例如，刀片式服务器可用来提供并行处理。处理器刀片可通过背板连接，以提供并行处理。存储还可通过单独的网络接口连接至背板或作为网络附加存储(NAS)。

在一些示例实施方案中，处理器可维持单独的存储空间并通过网络接口、背板或其他连接器传输数据以便由其他处理器并行处理。在其他实施方案中，部分或全部的处理器可使用共享的虚拟地址存储空间。

图22是根据示例实施方案使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统2200的框图。该系统包括可访问共享的存储器子系统2204的多个处理器2202a-f。该系统中并入存储器子系统2204中的多个可编程硬件存储算法处理器(MAP)2206a-f。MAP2206a-f中的每一个可包括存储器2208a-f和一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)2210a-f。MAP提供了可配置的功能单元，并且可向FPGA2210a-f提供特定算法或算法的部分，以便与各自的处理器密切协调处理。例如，在示例实施方案中，MAP可用来评估与数据模型相关的代数表达式以及用来进行适应性数据重建。在该实例中，每一个MAP可被用于这些目的的所有处理器全局访问。在一种配置中，每一个MAP可使用直接存储器访问(DMA)以访问相关联的存储器2208a-f，使其独立于且异步于各自的微处理器2202a-f而执行任务。在这一配置中，MAP可将结果直接提供给另一MAP以用于流水处理和并行执行算法。

以上计算机架构和系统仅为实例，并且多种多样的其他计算机、蜂窝电话和个人数据助理架构和系统可与示例实施方案结合使用，其包括使用普通处理器、协处理器、FPGA和其他可编程逻辑设备、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)和其他处理和逻辑元件的任何组合的系统。在一些实施方案中，全部或部分计算机系统可用软件或硬件来实现。任何种类的数据存储介质可与示例实施方案结合使用，其包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附加存储(NAS)和其他的本地或分布式数据存储设备和系统。

在示例实施方案中，计算机系统可使用在任何上述或其他计算机架构和系统上执行的软件模块来实现。在其他实施方案中，系统的功能可部分或完全地在固件、可编程逻辑设备如图22所示的现场可编程门阵列(FPGA)、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件中实现。例如，集处理器(SetProcessor)和优化器可通过使用硬件加速器卡如图20示出的加速器卡122用硬件加速方式实现。

实施例1：硅片的前端处理，以创建微孔

硅片使用如图23所示的前端处理方法进行刻蚀以创建包含多个微孔的示例性基底。以在基底的两个表面上具有氧化物层的SOI基底开始，使用光刻方法在基底的处理侧的优选位置上涂覆一层光致抗蚀剂。涂覆光致抗蚀剂后，在处理侧上进行DRIE直到达到晶片中部的氧化物层。随后，剥离光致抗蚀剂的涂层，以使下面的氧化物层暴露。类似地，使用光刻方法以合适的直径在基底的装置侧的优选位置上涂覆第二层光致抗蚀剂。涂覆第二层光致抗蚀剂后，在硅片的装置侧上再次进行DRIE直到达到硅片中部的氧化物层。随后，剥离光致抗蚀剂和在晶片中部的氧化物层。最后，在晶片的全部表面上涂覆氧化物，以创建具有多个微结构的硅片，每一个微结构包含较大的微孔和与微孔流体连接的一个或多个微通道。

实施例2：硅片的后端处理，以对选择的微孔的表面进行功能化

进一步处理具有刻蚀的微孔的硅片，以使用如图24所示的后端处理方法对选择的微孔的部分进行功能化。为了用提高表面能的活性功能化剂仅涂覆微孔内的较小微孔的表面，使用来自实施例1的产物作为起始材料。如本文所述使用喷墨打印机使光致抗蚀剂的小滴沉积在微通道内。光致抗蚀剂的小滴扩散到与微孔流体连接的微通道内。光致抗蚀剂沉积后，进行氧等离子体刻蚀以回刻蚀过量的光致抗蚀剂，留下如图24所示的较光滑的光致抗蚀剂表面。向硅片的所有暴露的表面上涂覆一层化学惰性部分，以创建具有低表面能的钝化功能化层。然后，剥离光致抗蚀剂，以暴露与微孔流体连通的较小微通道的表面。去除光致抗蚀剂后，向较小的微通道的表面上涂覆一层活化功能化剂，以提高微孔表面的表面能和/或提供用于寡核苷酸生长的表面化学。先前功能化的表面保持基本上未受表面功能化的第二次施用的影响。结果，在固体基底上制作具有第一表面功能化的多个微孔，每个微孔与一个或多个具有第二表面功能化的微通道流体连通。

实施例3：微流体装置

如图25D中所示，根据本发明的方法和组合物制造出包含基本上为平面的基底部分的微流体装置。图25E中示出了该基底的横截面。该基底包含108个聚簇，其中每个聚簇包含109个流体连接分组。每个分组包含从第一通道延伸的5个第二通道。图25A为各自包含109个分组的聚簇的装置视图。图25C为图25A的聚簇的处理视图。图25B为图25A的剖面图，图中示出一行11个分组。图25F为图25D中所示基底的另一视图，其中可见标签的位置。图25G为图25A的放大图，图中指示出聚簇的109个分组。

如图25A和图25C中所示，109个分组布置成偏移的行，以形成圈状图案的聚簇，其中各个区域彼此不重叠。单个分组形成圈。如2503所表示的，这些分组的3个行之间的距离为0.254mm。如2506所示，一行分组中的两个分组之间的距离为0.0978mm。如2504所示，分组中的第一通道的横截面为0.075mm。如2505所示，分组中的每个第二通道的横截面为0.020mm。如2502所示，分组中的第一通道的长度为0.400mm。如2501所示，分组中的每个第二通道的长度为0.030mm。

图25A和图25C中所示的109个分组的聚簇布置成适合于在可放置于图25A和图25C中的聚簇附近的单一反应孔中放置的构型。图25D中的其余聚簇类似地以促进向诸如图26和实施例4中所述纳米反应器板等多个反应孔中递送的方式布置。该基底包含108个聚簇，从而提供11772个分组。

如2508所指示，该基底沿着一个维度的宽度为32.000mm。如2519所指示，该基底沿着另一维度的宽度为32.000mm。

如图25D中所示，基本上为平面的基底部分包含108个分组聚簇。聚簇布置成行，从而形成正方形形状。如2518所指示，在一个维度上从聚簇的中心到原点的最远距离为24.467mm。如2509所指示，在另一维度上从聚簇的中心到原点的最远距离为23.620mm。如2517所示，在一个维度上从聚簇的中心到原点的最近距离为7.533。如2512所示，在另一维度上从聚簇的中心到原点的最近距离为8.380。如2507和2522所示，同一行中两个聚簇的中心之间的距离为1.69334mm。

该基底包含3个基准标记，以促进微流体装置与系统的其他组件的对准。第一基准标记位于原点附近，其中该基准标记比任一聚簇都更为靠近原点。第一基准标记在一个维度上位于离原点5.840mm处(2516)并且在另一维度上位于离原点6.687mm处(2513)。第一基准标记在一个维度上位于离聚簇1.69334mm处(2515)并且在另一维度上位于离同一聚簇1.69344mm处(2514)。另外两个基准标记各自位于离基底边缘0.500mm处(2510和2520)以及离原点16.000mm处(2511和2521)。

图25E中示出了基底的横截面，其中如2523所指示，分组的总长度为0.430mm。

图25F中示出了基底的另一视图，图中示出108个聚簇的布置和标签的位置。标签位于离基底边缘1.5mm处(2603)。如从原点所测量的，标签位于4.0mm(2602)至9.0mm(2601)之间的距离处。

实施例4：纳米反应器。

如图26B和图26C中所示，根据本发明的方法和组合物制造出纳米反应器。图26A中示出纳米反应器的横截面。该纳米反应器包含108个孔。图26D为该纳米反应器的处理视图。图26E为图26B中所示纳米反应器的另一视图，其中可见标签的位置。

如图26B中所示，108个孔布置成行以形成正方形图案，其中各个孔在纳米反应器基底上凸起。如2711所示，一行孔中的两个孔的中心之间的距离为1.69334mm。如2721所示，孔的内部的横截面为1.15mm。如2720所示，包括孔的边缘在内，孔的横截面为1.450mm。如2702所示，纳米反应器中的孔的高度为0.450mm。如2701所示，纳米反应器的总高度为0.725mm。

图26B中的孔以促进从如图26所示例说明的具有108个孔的微流体装置向纳米反应器的108个反应孔中的递送的方式布置。

如2703所指示，纳米反应器沿着一个维度的宽度为24.000mm。如2704所指示，纳米反应器沿着另一维度的宽度为24.000mm。

如图26B中所示，纳米反应器包含108个孔。孔布置成行从而形成正方形形状。如2706所指示，在一个维度上从孔的中心到原点的最远距离为20.467mm。如2705所指示，在另一维度上从孔的中心到原点的最远距离为19.620mm。如2710所示，在一个维度上从孔的中心到原点的最近距离为3.533mm。如2709所示，在另一维度上从孔的中心到原点的最近距离为4.380mm。如2711和2712所示，同一行中两个孔的中心之间的距离为1.69334mm。如2707所示，在一个维度上从孔的中心到纳米反应器的边缘的距离为3.387mm。如2708所示，在另一维度上从孔的中心到纳米反应器的边缘的距离为2.540mm。

该纳米反应器包含位于装置面上的3个基准标记，以促进纳米反应器与系统的其他组件(例如，实施例3中所描述的微流体装置)的对准。第一基准标记位于原点附近，其中该基准标记比任一孔都更为靠近原点。第一基准标记在一个维度上位于离原点1.840mm处(2717)并且在另一维度上位于离原点2.687mm处(2716)。第一基准标记在一个维度上位于离孔1.6933mm处(2719)并且在另一维度上位于离同一孔1.6934mm处(2718)。另外两个基准标记各自位于离纳米反应器的边缘0.500mm处(2714和2715)以及离原点12.000mm处(2713)。

如图26D中所示，该纳米反应器包含位于处理面上的4个基准标记。在一个维度上从基准标记的中心到纳米反应器的最近边角的距离为1.000mm(2722和2723)。基准标记在一个维度上的长度为1.000mm(2724和2725)。如2726所示，基准标记的宽度为0.050mm。

图26E中示出该纳米反应器的另一视图，图中示出108个孔的布置和标签的位置。标签位于离纳米反应器的边缘1.5mm处(2728)。标签位于离纳米反应器的边角1.0mm处(2727)。标签的长度为9.0mm(2726)。

实施例5：寡核苷酸合成装置的制备。

使用如图28中所示的前端处理方法刻蚀出具有夹着二氧化硅电绝缘体层的约30um厚装置层和约400um厚处理层的绝缘体上硅(SOI)晶片，以创造出实施例3中所描述的包含具有三维微流体连接的多个特征的示例性基底。图27详细图示了该装置的设计特征。对SOI晶片进行氧化，以在两个表面上用热氧化物将其覆盖(图28A)。如图28B中所示，对装置侧施加光刻术，以创造出光致抗蚀剂掩模(红色)。使用深反应离子刻蚀(DRIE)步骤来将垂直侧壁刻蚀到约30um的深度，直至位于没有光致抗蚀剂的位置上的SOI氧化物层(图28C)。使用本领域中已知的标准抗蚀剂剥离工艺来剥离光致抗蚀剂。

在处理侧上重复进行光刻术、DRIE和光致抗蚀剂剥离(图28E-图28G)，以生成根据实施例3中所述装置的所需图案。使用湿法刻蚀工艺来移除隐埋的氧化物(BOX)(图28G)。通过热氧化来移除可能已经沉积在微流体特征的侧壁上的污染含氟聚合物。使用湿法刻蚀工艺来剥离热氧化。

经刻蚀的SOI晶片经历如图29中所描述的处理步骤。

首先，通过使用水虎鱼溶液(piranhasolution)的湿法清洗步骤以及随后的干O₂等离子体暴露来清洗晶片。在受向约20um宽的装置层通道中芯吸所支配的工艺中，用光致抗蚀剂涂覆芯片的装置层(在图29B的顶部)。使用光刻术来对光致抗蚀剂进行图案化，以暴露期望为纯化(passive)(将来无寡核苷酸合成)的区域。该工艺通过将抗蚀剂经具有感兴趣的图案的二元掩模暴露于光而工作。在暴露之后，在显影液中移除暴露区域中的抗蚀剂(图29C)。

通过化学汽相沉积(CVD)将无光致抗蚀剂的表面暴露于氟硅烷气体。这导致碳氟化合物在无光致抗蚀剂的表面上的沉积。在替代的应用中，将烃硅烷用于该步骤。经硅烷化的表面对附加的硅烷层无反应，从而在表面上创造出单层。然后在有机溶剂中溶解光致抗蚀剂，从而在表面上留下氟化并暴露处于光致抗蚀剂下面的硅/二氧化硅。进行最后的活化功能化步骤，以准备用于寡核苷酸生长的表面(图29F)。

通过使用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺在乙醇和乙酸中的1％溶液进行4小时的湿法工艺，及随后将芯片置于150℃的热板上达14小时，从而在表面上获得受控的羟基表面密度(图30)。在替代的应用中，通过向表面递送气态硅烷并施加约200毫托(mTor)的受控沉积压强和约150℃的受控温度来进行CVD工艺。CVD工艺允许原位等离子体清洗，并且非常适合于产生高度有序的自组装单层(SAM)。

图31示出根据上述方法制造的装置的图像。

实施例6.纳米反应器装置的制造。

制造出如图32中所描述的具有纳米孔的纳米反应器芯片。对尺寸合适的硅晶片进行氧化，以在两个表面上用热氧化物将其覆盖(图33A)。

如图33B中所示，向背侧施加光刻术以创造出光致抗蚀剂掩模(红色)。背侧在没有光致抗蚀剂的位置上进行刻蚀，超出热氧化物层，从而创造出浅孔(图33C)。使用本领域中已知的标准抗蚀剂剥离工艺来剥离光致抗蚀剂(图33D)。

根据图33E中的图案在前侧上重复光刻步骤。通过使用定时刻蚀，使用深反应离子刻蚀(DRIE)步骤来将垂直侧壁刻蚀至约450um的深度。在其他情况下，使用SOI晶片，并将处理层向下刻蚀至BOX，其中BOX可充当刻蚀终止物(图33F)。剥离前侧上的光致抗蚀剂(图33G)，从而生成根据图32中所描述的装置的所需图案。通过热氧化来移除可能已经沉积在微流体特征的侧壁上的污染含氟聚合物，并且使用湿法刻蚀工艺来剥离热氧化部分(图33H)。

接下来，通过使用水虎鱼溶液的湿法清洗步骤以及随后的干O₂等离子体暴露来清洗晶片(图34A)。然后使用小滴沉积系统向单个孔中沉积抗蚀剂(图34B中的顶部)。通过化学汽相沉积(CVD；图34C)将无抗蚀剂的表面暴露于氟硅烷气体。这导致碳氟化合物在无抗蚀剂的表面上的沉积。在替代的应用中，将烃硅烷或其他类型的硅烷用于该步骤。经硅烷化的表面对附加的硅烷层无反应，从而在表面上创造出单层。然后在有机溶剂中溶解抗蚀剂，从而在表面上留下氟化并暴露处于抗蚀剂下面的硅表面。

图35A-图35B图示了如上所述制造的纳米反应器装置中的纳米孔。

实施例7-在二维寡核苷酸合成装置上合成50-聚体序列

将二维寡核苷酸合成装置组装至流动池中，其与流动池(AppliedBiosystems(ABI394DNA合成仪")连接。该二维寡核苷酸合成装置用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺(Gelest,shop.gelest.com/Product.aspx？catnum＝SIT8189.5&Index＝0& TotalCount＝1)均匀地功能化，其用来使用本文所述的寡核苷酸合成方法合成50bp的示例性寡核苷酸(““例性聚体寡核苷酸”)。

该50-聚体的序列如SEQIDNO.:1所述。

5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3'(SEQIDNO.:1)，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)，它是能够在脱保护过程中使寡核苷酸从表面上释放的可切割的连接体。

根据表3中的方案和ABI合成仪，使用标准DNA合成化学法(偶联、加帽、氧化和解封闭)完成合成。

表3：

亚磷酰胺/活化剂组合以类似于本体试剂通过流动池的递送的方式进行递送。由于在整个时间中环境保持被试剂“润湿”，不进行干燥步骤。

从ABI394合成仪中去除限流器，以使得能够更快速流动。在没有限流器的情况下，酰胺类(amidites)(在ACN中0.1M)、活化剂(在ACN中的0.25M苯甲酰基硫基四唑(“BTT”；来自GlenResearch的30-3070-xx))和Ox(在20％吡啶、10％水和70％THF中的0.02MI2)的流速大致为～100uL/sec，乙腈(“ACN”)和加帽试剂(帽A和帽B的1:1混合物，其中帽A是在THF/吡啶中的乙酸酐，帽B是在THF中的16％1-甲基咪唑(1-methylimidizole))的流速大致为～200uL/sec，解封闭剂(在甲苯中的3％二氯乙酸)的流速大致为～300uL/sec(与之相比，在有限流器的情况下所有试剂均为～50uL/sec)。

观测完全排出氧化剂的时间，相应地调节化学品流动时间的时间选择，并在不同的化学品之间引入额外的ACN洗涤。

寡核苷酸合成之后，芯片在75psi下在气态氨中脱保护过夜。将五滴水施加到表面上以回收寡核苷酸(图45A)。随后在BioAnalyzer小RNA芯片上分析回收的寡核苷酸(图45B)。

实施例8：在二维寡核苷酸合成装置上合成100-聚体序列

使用在实施例7中描述的用于合成50-聚体序列的相同过程，在两个不同的硅芯片上合成100-聚体寡核苷酸(“100-聚体寡核苷酸”；5'CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3'，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)；SEQIDNO.:2)，第一个用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺均匀地功能化，而第二个用11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷和正癸基三乙氧基硅烷的5/95混合物功能化，并在BioAnalyzer仪器上分析从表面提取的寡核苷酸(图46)。

在50uLPCR混合物(25uLNEBQ5主混合物，2.5uL10uM正向引物，2.5uL10uM反向引物，从表面提取的1uL寡核苷酸，和加至50uL的水)中使用正向(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'；SEQIDNO.:3)和反向(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'；SEQIDNO.:4)引物，使用下列热循环程序，进一步PCR扩增来自两个芯片的全部十个样品：

98C,30sec

98C,10sec；63C,10sec；72C,10sec；重复12个循环

72C,2min

PCR产物还在BioAnalyzer上运行(图47)，在100-聚体位置处显示尖锐峰。

然后，对PCR扩增的样品进行克隆，并进行Sanger测序。表4总结了从来自芯片1的斑点1-5采集的样品和从来自芯片2的斑点6-10采集的样品的Sanger测序结果。

表4：

因此，合成的寡核苷酸的高质量和均匀性在具有不同表面化学的两个芯片上重复。总体上，89％，相当于被测序的262个100-聚体中的233个，是没有错误的完美序列。

图48和49分别显示了从斑点8和7采集的样品的比对图，其中“x”表示单碱基缺失，“星号”表示单碱基突变，而“+”表示在Sanger测序中的低质量斑点。图48中比对的序列共同表示约97％的错误率，其中29个读数中的28个对应于完美序列。图49中比对的序列共同表示约81％的错误率，其中27个读数中的22个对应于完美序列。

最后，表5总结了从来自斑点1-10的寡核苷酸样品中获得的序列的关键错误特征。

表5：

实施例9：在三维寡核苷酸合成装置上合成100-聚体序列

将在用于合成的活性区域上用11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷和正癸基三乙氧基硅烷的5/95混合物差异功能化的、如实施例3中所述的三维寡核苷酸合成装置组装至流动池中，以使用此处所述的寡核苷酸合成方法合成实施例8的100-聚体寡核苷酸。按照表3中的方案，使用如实施例7中所述的标准DNA合成化学法(偶联、加帽、氧化和解封闭)完成合成。芯片在75psi下在气态氨中脱保护过夜，并将寡核苷酸在500uL水中洗脱。蒸发后，所有的寡核苷酸重悬于20uL水中，以供下游分析。在BioAnalzyer仪器上分析重悬的样品(图50A)。

也在50uLPCR混合物(其包含25uLNEBQ5主混合物，2.5uL10uM正向引物，2.5uL10uM反向引物，从表面提取的1uL寡核苷酸，和加至50uL的水)中使用正向(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'；SEQIDNO.:5)和反向(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'；SEQIDNO.:6)引物，按照下列热循环程序，PCR扩增重悬的样品：

1个循环：98C,30sec

12个循环：98C,10sec；63C,10sec；72C,10sec

1个循环：72C,2min

PCR产物还在BioAnalyzer上运行(图50B)，在100-聚体位置处显示尖锐峰。

PCR产物的测序结果显示，29个序列中的23个是完美的，并且如图51中的比对图所示，错误率为～1/600bp，其中“x”表示单碱基缺失，“星号”表示单碱基突变，而“+”表示在Sanger测序中的低质量斑点。

实施例10：在三维微流体寡核苷酸合成装置上的平行寡核苷酸合成

使用内部(house)设置修改实施例7的合成方案，以在实施例9的三维微流体装置上进行平行寡核苷酸合成。

表6显示了两个方案的并排比较。

表6：

乙腈(ACN)穿过串联脱气器(in-linedegasser，型号403-0202-1；RandomTechnologies)，使液体沿着非常疏水的膜的一侧流过，该膜先前显示在50-400uL/sec的流速下起作用，并在不受理论束缚的情况下有可能通过使气泡溶解在未饱和的溶剂中而消除在流动池上形成的气泡。

试剂如下所述在流动池中与不同的试剂进行交换：

1)开始试剂向流动池的流动。

2)通过将阀设置为用新试剂将先前的试剂“推”出递送线而起动。该阀的状态保持3.75sec。

3)2D阀状态：将阀设置为用新试剂替换位于流动池表面上的先前的试剂。这发生在当步骤2已运行3.75sec的时候。步骤2和3同时运行0.25sec，此后起动阀状态关闭。

4)3D阀状态：将阀切换到允许试剂流过流动池中的硅的三维微流体特征，这在步骤3中的2D阀状态已经流过0.75sec之后开始。

5)试剂的流动：2D阀状态和3D阀状态保持开启一段指定的时间，以允许足够剂量的试剂到达芯片中的硅表面。

因此，在试剂交换的5秒循环期间，进行流体递送，即在跨越0-4秒的初始时间段期间启动，在跨越3.75-5秒的时间段期间打开2D阀状态，以及在跨越4.5-5秒的时间段期间打开3D阀状态。

使用喷墨打印步骤递送亚磷酰胺/活化剂组合。递送可为1:1，逐滴沉积到硅表面上。小滴尺寸可为约10pL。在一些实施方案中，小滴尺寸为至少或至少约0.1、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500皮升或更大。在一些实施方案中，小滴尺寸为至多或至多约500、400、300、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、5、4、3、2、1、0.1皮升或更小。小滴尺寸可为0.1-50、1-150或5-75皮升。小滴尺寸可处于由这些值中的任何值所限定的范围内，例如2-50皮升。小滴可以以1-100m/sec的初始速度沉积。在一些情况下，小滴可以以至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、35、40、45、50、75、100m/sec或更高的初始速度沉积。在一些情况下，小滴可以以至多或至多约100、75、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1m/sec或更低的初始速度沉积。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、35、40、45、50、75、100或更高。小滴可以以处于约1-50m/sec、5-15m/sec、5-30m/sec或1-30m/sec之间的初始速度沉积。本领域技术人员知晓，小滴可以以处于由这些值中的任何值所限定的范围内的初始速度沉积。

干燥步骤使硅表面为本体试剂序列后的打印步骤做好准备。为了实现促进打印的试剂起反应的干燥条件，将流动池用N₂气以约5PSI冲洗约19.5秒，在流动池区室上抽低真空持续10秒，并将流动池再次用N₂气冲洗另外19.5秒。所有试剂均以约200-400uL/sec流动。

可使用变化的压力在内部系统中控制流速。流速是商购可得的合成仪的限制因素之一。在内部机器设置中，流速可与它们在实施例7中的值相匹配，或视情况而定与增加或减小的流速相匹配，从而改善合成过程。通常，较快的流动呈现出优势，因为与较慢的流速相比，它允许更加有效地排除气泡并允许在给定时间间隔内新鲜试剂向表面上的更多交换。

实施例11：从寡核苷酸合成装置到纳米反应器装置的基于印迹的寡核苷酸转移

如实施例9所述在3-D寡核苷酸合成装置上合成50-聚体寡核苷酸。不施加活化功能化。图53A-B示出了在寡核苷酸合成装置的装置侧上的聚簇中的寡核苷酸合成通道分布，并且图53C示出了表面功能化。通过在气态氨区室中在75psi下处理14小时，使寡核苷酸从表面上释放。

根据实施例4制造的、具有亲水内壁和疏水顶唇的纳米反应器装置的孔(图54)首先被PCA合适的缓冲液(5XQ5缓冲液；NewEnglandBiolabs)充满作为阴性对照。手动移取200-300nL等份加至BioAnalyzer中，以显示在单独的纳米反应器中不存在任何污染核酸(图55)。

接下来向纳米反应器中充满约650nL的PCA缓冲液，以形成轻微鼓起的新月形(图53)。纳米反应器装置与寡核苷酸相配合，以使寡核苷酸合成通道(“转轮”)以约5mm/sec的速度浸入PCA缓冲液中。在其他情况下，用于使两个装置配合的覆盖(mantling)速度如本文所述可以变化，以便尤其实现在装置之间或多或少的有效液体转移，导致受控等分所需的液体体积或控制蒸发。寡核苷酸装置与纳米反应器保持配合，在两个装置之间具有约50um的间隙，保持约10分钟，从而允许寡核苷酸扩散到溶液中(图57)。在一些情况下，单独的组装件或寡核苷酸合成装置可振动或振荡以促进更快的扩散。长于10min的扩散时间，诸如至少或至少约11、12、13、14、15、20、25min或更长，可用来促进更高的产率。将纳米反应器装置以约5mm/sec的速度从寡核苷酸装置上释放，以在单独的纳米反应器中捕获释放的寡核苷酸。在其他情况下，用于使两个装置配合的拆卸(dismantling)速度如本文所述可以变化，以便尤其实现在装置之间或多或少的有效液体转移，导致受控等分所需的液体体积。观测到微小量的液体留在寡核苷酸装置上。

从纳米反应器装置中的若干单独的纳米反应器中移出约300nL的样品，并稀释至1uL的体积，确立4.3X的稀释度。稀释的样品在BioAnalyzer中单独运行，以确定寡核苷酸向纳米反应器中的释放(图55)。

使用手动注射器采集额外的样品作为阳性对照。使用Tygon管创建与寡核苷酸合成装置的面密封。利用充有500ul水的注射器穿过一整个聚簇以及来自处理侧的相邻聚簇的部分冲洗液体。将冲洗的液体收集在装置侧上的1.5mlEppendorf管中。将样品真空干燥，随后重悬于10uL水中。随后在BioAnalyzer中类似地分析样品。当考虑到稀释速率时，使用阳性对照方法和纳米反应器印迹方法释放浓度相当的寡核苷酸。

实施例12：从寡核苷酸合成装置到纳米反应器的基于注射的寡核苷酸转移

如实施例9所述在3-D寡核苷酸合成装置上合成50-聚体寡核苷酸。通过在氨区室中在约75psi下处理约14小时，使寡核苷酸从表面上释放。或者，可使用20-120psi的压力持续1-48小时或更长，以释放寡核苷酸。温度为室温。在一些情况下，可通过使温度提高到例如至少或至少约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或更高来提高脱保护率。气态甲胺也可用来在室温或在至少或至少约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或更高的升高的温度下脱保护。在甲胺中脱保护通常比在气态氨中进行得快。

将寡核苷酸合成装置组装至具有单一入口和单一出口的HeleShaw流动池中。使用经由Tygon管连接至流动池且手动控制的注射器生成流(图57)。图56示出了流动池中流体的示意图。流体回路用来使流体从处理侧流入第一通道(或通孔)中，并且将流体进一步吸入第二通道中，例如，构成包含寡核苷酸合成位点的转轮图案的那些通道中。流体从单点入口递送并从单点出口收集(图56B)。在其他情况下，线源和线排可用来流过流体(图56A)。不受理论的束缚，预计点源/点排组合构成均匀的气锋(airfront)，这可更有效地将所有液体从Hele-Shaw流动池中推出。从流动池中清除液体后，液体仅包含在处理侧上的通孔内和装置侧上例如转轮图案的第二通道或寡核苷酸合成通道中。估计该体积为每个通孔(或第一通道)聚簇300nL。这样包含流体可促进在寡核苷酸合成装置的装置层表面上形成均匀的固着小滴。

对于此步骤，选择合适的释放缓冲液，如PCA相容的缓冲液，使释放的寡核苷酸溶解在溶液中。填充通孔和第二通道后，使用约500-1000Pa将液体从寡核苷酸合成芯片的处理表面上的Hele-shaw流动池中冲洗出，从而使液体仅留在该装置的滞留区(处理和转轮)，估计每一组装件聚簇具有300nL(图56C)。堵塞单点出口并且使加压空气以约3000-5000Pa在处理层表面上流动，以将小滴喷射到装置层表面上(图56D)。将充足的释放缓冲液推压通过流动池，以形成座滴(sessiledrop)，座滴从第二通道(或寡核苷酸合成通道)涌出至寡核苷酸合成装置的装置侧表面上。固着滴大小可为约300-400nL，但可根据寡核苷酸合成聚簇和/或纳米反应器的特定尺寸以及根据寡核苷酸的所需浓度而改变为合适的大小。例如，可形成约500nL的固着滴大小。固着滴的形成任选地用显微镜监测，以确保跨寡核苷酸合成装置完成滴的形成。在一些情况下，形成固着滴的液体可由组分的混合物制备，使得在装置层上获得所需的接触角。因此，溶液中可补充有组分，诸如去污剂，例如聚山梨醇酯20(聚氧化乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯，亦称吐温-20)。

或者，使适量的释放缓冲液从处理侧沉积至单独的孔/第一通道中并将其推压穿过寡核苷酸合成通道，例如通过经由在处理侧上形成Hele-shaw流动池而从处理侧施加压力。纳米反应器装置以合适的速率例如约1-10mm/s和距离例如约50um抵靠着寡核苷酸合成装置的装置侧而被覆盖。所述覆盖可在滴形成之后快速进行以避免蒸发。一旦两个装置(纳米反应器和寡核苷酸合成反应器)被覆盖，蒸发也就成为最小的。

实施例13：使用PCA在纳米反应器中由从寡核苷酸合成的装置侧转移的反应混合物进行的基因组装

使用来自表8的SEQIDNO.:7-66，如表7所述制备PCA反应混合物，以组装3075bpLacZ基因(SEQIDNO.:67；表8)。

表7：

表8：

使用Mantis分配器(Formulatrix,MA)将约400nL的滴分配在寡核苷酸合成装置的装置侧上的转轮(寡核苷酸合成通道)的顶部。纳米反应器芯片与寡核苷酸装置手动配合，以拾取具有PCA反应混合物的小滴。通过在拾取后立即将纳米反应器从寡核苷酸合成装置上释放，将小滴拾取至纳米反应器芯片中的单独的纳米反应器中(图59)。

纳米反应器用热密封膜/带遮盖物(Eppendorf,eshop.eppendorfna.com/ products/Eppendorf_Heat_Sealing_PCR_Film_and_Foil)进行密封并放置在使用热循环仪试剂盒(OpenPCR)构建的适当配置的热循环仪中。

在热循环仪上使用下列温度方案：

1个循环：98C,45秒

40个循环：98C,15秒；63C,45秒；72C,60秒；

1个循环：72C,5分钟

1个循环：4C,保持

从如图60所示的单独的孔1-10中收集0.50ul的等份，并在塑料管中，在PCR反应混合物(表9)中根据下列热循环仪程序，使用正向(F-引物；5'ATGACCATGATTACGGATTCACTGGCC3'；SEQIDNO:68)和反向(R-引物；5'TTATTTTTGACACCAGACCAACTGGTAATGG3'；SEQIDNO:69)引物扩增该等份：

热循环仪：

1个循环：98C,30秒

30个循环：98C,7秒；63C,30秒；72C,90秒

1个循环：72C,5分钟

1个循环：4C,保持

表9：

所得扩增产物在BioAnalyzer仪器(图60B，小图1-10)上以及在凝胶(图60C)上运行，显示出略大于3000bp的产物。第11个PCR反应使用在塑料管中进行的PCA反应来运行，作为阳性对照(图60B，小图11，和图60C)。第12个PCR反应在没有PCA模板的情况下运行，作为显示没有产物的阴性对照(图60B，小图12，和图60C)。

实施例14：组装的核酸的错误校正

表10

约1kb的基因(SEQIDNO.:70；表10)使用6种购买的寡核苷酸(在PCA期间各5nM)(Ultramer；SEQIDNO.:71-76；表10)组装，并在PCA反应中使用具有0.02U/uLQ5热启动高保真度聚合酶和100uMdNTP的1xNEBQ5缓冲液如下进行组装：

1个循环：98C,30sec

15个循环：98C,7sec；62C30sec；72C,30sec

1个循环：72C,5min

预计Ultramer寡核苷酸具有至少1/500个核苷酸的错误率，更有可能至少1/200个核苷酸或更大。

在PCR反应中，使用正向引物(5'ATGACCATGATTACGGATTCACTGGCC3'SEQIDNO.:77)和

反向引物(5'GATAGAGATTCGGGATTTCGGCGCTCC3'SEQIDNO.:78)，使用具有0.02U/uLQ5热启动高保真度聚合酶、200uMdNTP和0.5uM引物的1xNEBQ5缓冲液如下扩增组装的基因：

1个循环：98C,30sec

30个循环：98C,7sec；65C30sec；72C,45sec

1个循环：72C,5min

在BioAnalyzer中分析扩增的组装基因(图52A)并克隆。对来自约24个克隆的小量制备物进行Sanger测序。BioAnalyzer分析提供了未校正的基因的宽峰和尾，表示高错误率。测序显示出1/789的错误率(数据未示出)。随后使用CorrectASE(LifeTechnologies,www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A14972)根据厂商的说明书进行两轮错误校正。在第一轮(图60B)和第二轮(图60C)之后在BioAnalyzer中类似地分析所得基因样品并进行克隆。挑取24个菌落以供测序。测序结果表明，在第一轮和第二轮的错误校正之后，错误率分别为1/5190bp和1/6315bp。

实施例15：大量无引物的单链寡核苷酸的生成

试剂。除了phi29DNA聚合酶之外的所有酶和缓冲液均购自NEB，除非另有说明。Phi29DNA聚合酶购自Enzymatics。

寡核苷酸的生成。具有所需寡核苷酸的反向互补序列的扣锁寡核苷酸(OS_1518)由IDT合成(表1)。还合成了另外的扣锁寡核苷酸OS_1515、OS_1516、OS_1517、OS_1519，以与衔接子/辅助寡核苷酸组合一起使用，该组合与不同的限制酶组一起使用。通过使5μL扣锁(200nM)与5μLT4PNK缓冲液、0.5μLATP(100mM)、2μLT4PNK(10U/μL)、1μLBSA(100μg/μL)、2μLDTT(100mM)和32.5μL水混合，并将混合物在37℃下温育60min，然后在65℃下温育20min，对扣锁寡核苷酸进行磷酸化。具有扣锁寡核苷酸的互补序列的衔接子寡核苷酸由IDT合成(表11)。具有衔接子寡核苷酸的互补序列的辅助寡核苷酸由IDT合成并生物素化。

表11寡核苷酸序列。

杂交和连接。48μL扣锁磷酸化反应混合物与1.5μL衔接子寡核苷酸(2μM)和0.5μLT4连接酶合并。该反应在37℃下温育60min，然后在65℃下温育20min。5μL反应样品与5μL2X加样缓冲液混合并在15％TBE-脲凝胶(180V，75min)上进行分析。

如下进行任选的外切核酸酶处理。将10μL连接产物用0.15μLExoI和ExoIII(NEB或Enzymatics)在37℃下处理60min，然后在95℃下处理20min。温育后，向各10μL溶液中添加0.3μL衔接子寡核苷酸(2μM)，加热至95℃持续5min，并缓慢冷却。5μL反应样品与5μL2X加样缓冲液混合并在15％TBE-脲凝胶(180V，75min)上进行分析。

滚环扩增。通过在冰上合并0.6μLphi29DNA聚合酶(低浓度，Enzymatics)、0.5μL10mMdNTP、1μLT4PNK缓冲液、0.2μL100xBSA、0.5μL100mMDTT和7.2μL水来制备10μL2XRCA主混合物。在一些情况下，PCR添加剂，诸如甜菜碱，例如5M甜菜碱，可用来减小扩增偏倚。10μL的RCA主混合物与10μL连接产物合并(在进行或不进行外切核酸酶处理的情况下)，并在40℃下温育90min或4hr。该反应随后在70℃下温育10min，以将phi29DNA聚合酶灭活。0.1μL反应样品与4.9μL水和5μL2X加样缓冲液混合，并在15％TBE-脲凝胶(180V，75min)上分析该混合物。

限制性内切核酸酶消化。2μL的RCA产物样品与2μL10xCutSmart、2μL生物素化的辅助寡核苷酸(20μM)和12μL水混合。将混合物加热至98℃并缓慢冷却至室温。向混合物中添加BciVI和MlyI各1μL，然后在37℃下温育1hr，随后在80℃下温育20min。1μL反应样品与4μL水和5μL2X加样缓冲液混合，并在15％TBE-脲凝胶(180V，75min)上分析该混合物。

如下进行任选的纯化步骤。1μL限制性内切核酸酶消化样品作为纯化前的样品保留。NanoLink珠子(Solulink)通过剧烈涡旋而重悬。向1.5mL管中添加珠子的5μL等份。向该管中添加核酸结合和洗涤缓冲液或NABWB(50mMTris-HCl、150mMNaCl、0.05％吐温20，pH8.0)至最终体积为250μL，并使该管混合以重悬。将该管放置在磁力架上2min，然后去除上清液。将管从磁体中取出，并用180μLNABWB使珠子重悬。将180μL重悬的珠子添加至20μL限制性内切核酸酶消化反应中，并使混合物涡旋。将混合物在平台摇床上在40℃下温育60min，使得珠子不沉降。随后将管放置在磁体上2min，并将包含纯化的产物的上清液转移至新管中。10μL纯化的产物的样品与5μL2X加样缓冲液混合并在15％TBE-脲凝胶(180V，75min)上进行分析。使用QubitssDNA试剂盒测定纯化的RCA产物的浓度。

备选的纯化。在一些工作流程中，消化的寡核苷酸可使用(高效液相色谱法)HPLC进行纯化。

图63描绘了限制酶切割的扩增产物的分离，其中每一个单链扩增产物在酶切之前已与互补于扩增产物的辅助寡核苷酸在衔接子拷贝位点杂交。还显示了关于使用扣锁探针OS_1515、OS_1516、OS_1517、OS_1518、OS_1519扩增单链核酸的数据，其中使用不同组限制酶。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是这些实施方案仅通过举例的方式提供对于本领域技术人员来说是显而易见的。在不脱离本发明的情况下本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。其意图在于下列权利要求限定本发明的范围并且由此覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。

Claims

1.一种基因文库，其包含基因的集合，其中所述集合包含至少50种不同的预选合成基因，这些预选合成基因各自具有至少0.5kb的长度，并且相比于包含这些基因的预定序列具有小于1/3000bp的错误率。

2.一种基因文库，其包含基因的集合，其中所述集合包含各自具有至少0.5kb长度的至少50种不同的预选合成基因，其中至少90％的预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/3000bp的错误率。

3.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中至少90％的预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/5000bp的错误率。

4.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中至少0.05％的预选合成基因无错误。

5.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中所述集合包含至少75种不同的预选合成基因。

6.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中所述集合包含至少100种不同的预选合成基因。

7.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中所述预选合成基因相比于包含这些基因的预定序列包含小于1/3000bp的缺失率。

8.根据权利要求1或2所述的基因文库，其进一步包含每一种合成基因的至少1000000个拷贝。

9.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中所述集合包含至少500种基因。

10.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中所述预选合成基因为至少1kb。

11.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中所述合成基因中的每一种与任何其他合成基因至少1％不同。

12.根据权利要求1或2所述的基因文库，其中所述基因文库在小于10cm³的空间中。

13.一种构建基因文库的方法，其包括：

(a)在第一时间点之前在计算机可读非暂时性介质中输入至少第一基因列表和第二基因列表，其中所述基因为至少500bp并且其中当编译成联合列表时，该联合列表包含至少100种基因；

(b)在第二时间点之前合成所述联合列表中超过90％的基因，从而构建具有可传送基因的基因文库；

其中所述第二时间点与第一时间点相隔少于一个月。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括在第二时间点传送至少一种基因。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述基因中的每一种与所述基因文库中的任何其他基因至少1％不同。

16.根据权利要求13所述的方法，其中至少90％的可传送基因包含小于1/3000bp的错误率，这导致生成偏离联合基因列表中的基因序列的序列。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述联合列表包含至少500种基因。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述基因为至少1kb。

19.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二时间点与第一时间点相隔少于5天。

20.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二时间点与第一时间点相隔少于2天。

21.一种构建基因文库的方法，其包括：

(a)在第一时间点在计算机可读非暂时性介质中输入基因列表，其中所述列表包含至少100种基因并且其中所述基因为至少500bp；

(b)合成所述基因列表中超过90％的基因，从而构建具有可传送基因的基因文库；以及

(c)在第二时间点传送所述可传送基因，其中所述第二时间点与第一时间点相隔少于一个月。

22.一种在基底上合成n-聚体寡核苷酸的方法，其包括：

(a)提供具有解析座位的基底，该解析座位用适合于核苷酸偶联的化学部分功能化；以及

(b)根据座位特异性预定序列，使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少10个核苷酸的速率偶联，从而合成n个碱基对长的多个寡核苷酸。

23.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少12个核苷酸的速率偶联。

24.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括使至少两个结构单元与各自位于其中一个解析座位上的多个生长寡核苷酸链以每小时至少15个核苷酸的速率偶联。

25.根据权利要求22所述的方法，其中至少一个解析座位包含以小于1/500bp的错误率偏离座位特异性预定序列的n-聚体寡核苷酸。

26.根据权利要求22所述的方法，其中所述基底上的多个寡核苷酸以小于1/500bp的错误率偏离各自的座位特异性预定序列。

27.根据权利要求22所述的方法，其中所述结构单元包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿苷基团或修饰的核苷酸。

28.根据权利要求22所述的方法，其中n为至少100。

29.根据权利要求22所述的方法，其中所述基底包含至少100个解析座位，并且其中所述多个生长寡核苷酸中的至少两个彼此不同。

30.根据权利要求22所述的方法，其进一步包括在偶联之前真空干燥所述基底。

31.根据权利要求22所述的方法，其中所述结构单元包含封闭基团。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述封闭基团包含酸不稳定的DMT。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述酸不稳定的DMT包含4,4'-二甲氧基三苯甲基。

34.根据权利要求29所述的方法，其中所述基底包含提供所述基底的第一表面与所述基底的第二表面之间流体连通的至少1000个通孔。

35.根据权利要求29所述的方法，其中所述基底包含提供所述基底的第一表面与所述基底的第二表面之间流体连通的至少10,000个通孔。

36.一种在具有功能化表面的基底上合成寡核苷酸的方法，其包括：

(a)通过至少一个喷墨泵向多个座位中的第一座位施加至少一滴第一试剂；

(b)向所述基底施加负压；以及

(c)通过至少一个喷墨泵向所述第一座位施加至少一滴第二试剂。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述基底周围的压力可降至小于1毫托。

38.一种构建基因文库的方法，其包括：

(b)合成所述基因列表中超过90％的基因，从而构建具有可传送基因的基因文库；

(c)制备代表所述基因文库的测序文库；

(d)获得序列信息；

(e)基于所述序列信息选择所述可传送基因的至少一个子集；以及

(f)在第二时间点传送所选择的可传送基因，其中所述第二时间点与第一时间点相隔少于一个月。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第二时间点与第一时间点相隔少于5天。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述第二时间点与第一时间点相隔少于2天。

41.一种核酸扩增方法，其包括：

(a)提供包含n个环化单链核酸的样品，所述n个环化单链核酸各自包含不同的靶序列；

(b)提供可与所述n个环化单链核酸中的m个上的至少一个衔接子杂交序列杂交的第一衔接子；

(c)提供适合于使用所述m个环化单链核酸作为模板延伸第一衔接子的条件，从而生成m个单链扩增子核酸，其中所述m个单链扩增子核酸中的每一个均包含来自其模板的靶序列的多个复制物；

(d)提供可与第一衔接子杂交的第一辅助寡核苷酸；以及

(e)在适合于第一作用物在多个切割位点处切割所述m个单链扩增子核酸的条件下提供第一作用物，从而生成所述m个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中n或m至少为2。

43.根据权利要求41所述的方法，其中n或m至少为25。

44.根据权利要求41所述的方法，其中m小于n。

45.根据权利要求41所述的方法，其中包含所述n个环化单链核酸的样品通过以下步骤形成：提供各自包含不同靶序列中的一个的至少n个线性单链核酸，并使所述n个线性单链核酸环化，从而生成所述n个环化单链核酸。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述第一衔接子可与所述n个线性单链核酸的两端同时杂交。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述n个线性单链核酸中的不同靶序列的侧翼为第一和第二衔接子杂交序列。

48.根据权利要求45所述的方法，其中所述至少n个线性单链核酸通过从头寡核苷酸合成而生成。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述n个线性单链核酸中的每一个中的第一衔接子杂交序列相差不超过两个核苷酸碱基。

50.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一或第二衔接子杂交序列为至少5个核苷酸长。

51.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一或第二衔接子杂交序列为至多75个核苷酸长。

52.根据权利要求46所述的方法，其中当第一衔接子与所述线性单链核酸的两端同时杂交时，所述n个线性单链核酸的末端与第一衔接子上的相邻碱基配对。

53.根据权利要求41所述的方法，其中所述多个切割位点的位置使得所述衔接子杂交序列从m个环化单链核酸复制物的至少5％的剩余序列部分上断裂下来。

54.根据权利要求41所述的方法，其中除了至少一个衔接子杂交序列，所述m个环化单链核酸复制物的至少5％的序列保持未切割。

55.根据权利要求41所述的方法，其中所述多个切割位点的位置在所述至少一个衔接子杂交序列的外部。

56.根据权利要求41所述的方法，其中所述多个切割位点的位置不依赖于所述靶序列。

57.根据权利要求41所述的方法，其中所述多个切割位点的位置由第一衔接子或第一辅助寡核苷酸的序列内的至少一个序列元件来决定。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述序列元件包含限制性内切核酸酶的识别位点。

59.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一辅助寡核苷酸或第一衔接子寡核苷酸包含IIS型限制性内切核酸酶的识别位点。

60.根据权利要求41所述的方法，其中所述识别位点远离所述切割位点至少3个核苷酸。

61.根据权利要求41所述的方法，其中所述多个切割位点在单链和双链核酸的连接处。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述双链核酸包含第一衔接子和第一辅助寡核苷酸。

63.根据权利要求61所述的方法，其中所述单链核酸基本由m个不同的靶序列组成。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述m个不同的靶序列具有至多95％的逐对相似性。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述m个不同的靶序列具有至多90％的逐对相似性。

66.根据权利要求63所述的方法，其中所述m个不同的靶序列具有至多80％的逐对相似性。

67.根据权利要求63所述的方法，其中所述m个不同的靶序列具有至多50％的逐对相似性。

68.根据权利要求41所述的方法，其中生成m个单链扩增子核酸包括链置换扩增。

69.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一辅助寡核苷酸包含亲和标记物。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述亲和标记物包括生物素或生物素衍生物。

71.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括从所述样品中分离双链核酸。

72.根据权利要求71所述的方法，其中所述分离包括亲和纯化、层析或凝胶纯化。

73.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一作用物包括限制性内切核酸酶。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述第一作用物包括至少两种限制性内切核酸酶。

75.根据权利要求73或74所述的方法，其中所述第一作用物包括IIS型限制性内切核酸酶。

76.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一作用物包括切口内切核酸酶。

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述第一作用物包括至少两种切口内切核酸酶。

78.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一作用物包括至少一种选自下组的酶：MlyI、SchI、AlwI、BccI、BceAI、BsmAI、BsmFI、FokI、HgaI、PleI、SfaNI、BfuAI、BsaI、BspMI、BtgZI、EarI、BspQI、SapI、SgeI、BceFI、BslFI、BsoMAI、Bst71I、FaqI、AceIII、BbvII、BveI、LguI、BfuCI、DpnII、FatI、MboI、MluCI、Sau3AI、Tsp509I、BssKI、PspGI、StyD4I、Tsp45I、AoxI、BscFI、Bsp143I、BssMI、BseENII、BstMBI、Kzo9I、NedII、Sse9I、TasI、TspEI、AjnI、BstSCI、EcoRII、MaeIII、NmuCI、Psp6I、MnlI、BspCNI、BsrI、BtsCI、HphI、HpyAV、MboII、AcuI、BciVI、BmrI、BpmI、BpuEI、BseRI、BsgI、BsmI、BsrDI、BtsI、EciI、MmeI、NmeAIII、Hin4II、TscAI、Bce83I、BmuI、BsbI、BscCI、NlaIII、Hpy99I、TspRI、FaeI、Hin1II、Hsp92II、SetI、TaiI、TscI、TscAI、TseFI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、AspCNI、BscGI、BspNCI、EcoHI、FinI、TsuI、UbaF11I、UnbI、Vpak11AI、BspGI、DrdII、Pfl1108I、UbaPI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI和Nt.BspQI。

79.根据权利要求74所述的方法，其中所述至少两种限制性内切核酸酶包括MlyI和BciVI，或BfuCI和MlyI。

80.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括：

(a)将所述样品划分为多个部分；

(b)提供至少一个具有第二衔接子的部分，所述第二衔接子可与n个不同环化单链核酸中的k个上的至少一个衔接子杂交序列杂交；

(c)提供适合于使用所述k个环化单链核酸作为模板延伸第二衔接子的条件，从而生成k个单链扩增子核酸，其中第二单链扩增子核酸包含来自其模板的靶序列的多个复制物；

(d)提供可与第二衔接子杂交的第二辅助寡核苷酸；以及

(e)在适合于所述作用物在第二多个切割位点处切割所述k个单链扩增子核酸的条件下提供第二作用物，从而生成所述k个环化单链核酸中的靶序列的多个单链复制物。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一和第二衔接子是相同的。

82.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一和第二辅助寡核苷酸是相同的。

83.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一和第二作用物是相同的。

84.根据权利要求80所述的方法，其中k+m小于n。

85.根据权利要求80所述的方法，其中k至少为2。

86.根据权利要求41所述的方法，其中所述包含n个环化单链核酸的样品通过单链核酸扩增形成。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述单链核酸扩增包括：

(a)提供包含至少m个环化单链前体核酸的样品；

(b)提供可与所述m个环化单链前体核酸杂交的第一前体衔接子；

(c)提供适合于使用所述m个环化单链前体核酸作为模板延伸第一前体衔接子的条件，从而生成m个单链前体扩增子核酸，其中所述单链扩增子核酸包含所述m个环化单链前体核酸的多个复制物；

(d)提供可与第一前体衔接子杂交的第一前体辅助寡核苷酸；以及

(e)在适合于第一前体作用物在多个切割位点处切割第一单链前体扩增子核酸的条件下提供第一前体作用物，从而生成m个线性前体核酸。

88.根据权利要求87所述的方法，其进一步包括使所述m个线性前体核酸环化，从而形成所述m个环化单链前体核酸的复制物。

89.根据权利要求87所述的方法，其中所述m个环化单链前体核酸在单链复制物中扩增至少10倍。

90.根据权利要求41所述的方法，其中所述m个环化单链核酸中的至少一个的浓度为1nM或更小。

91.根据权利要求45或88所述的方法，其中环化包括连接。

92.根据权利要求90所述的方法，其中连接包括使用选自T4DNA连接酶、T3DNA连接酶、T7DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TaqDNA连接酶和9NDNA连接酶的连接酶。

93.一种用于核酸合成的微流体装置，其包含基本上为平面的基底部分，该基底部分在相对的表面之间包含n个分组的m个微流体连接，

其中n*m个微流体连接中的每一个包含第一通道和第二通道，

其中所述n个分组中的每个分组内的第一通道为所有m个微流体连接所共用，

其中所述多个微流体连接沿着所述基底的最小维度跨越所述基本上为平面的基底部分，并且

其中n和m至少为2。

94.一种用于进行一组平行反应的系统，其包括：

(a)具有多个解析座位的第一表面；

(b)具有多个解析反应器帽的加帽元件；

其中所述系统使所述多个解析反应器帽与第一表面上的多个解析座位对准，以在第一表面与加帽元件之间形成暂时的密封，从而将第一表面上的座位物理地分成至少两个座位的组，分至与每一个反应器帽相关联的反应器内，并且其中每一个反应器容纳第一组试剂。

95.根据权利要求94所述的系统，其中所述多个解析座位的密度为每mm²至少1个。

96.根据权利要求94所述的系统，其中从第一表面释放时，所述反应器帽保留第一组试剂的至少一部分。

97.根据权利要求96所述的系统，其中所述至少一部分为至少30％。

98.根据权利要求94所述的系统，其中所述多个解析座位位于被制作于支持表面内的微结构上。

99.根据权利要求98所述的系统，其中所述微结构包含至少两个彼此流体连通的通道。

100.根据权利要求99所述的系统，其中所述至少两个通道包含具有不同宽度的两个通道。

101.根据权利要求99所述的系统，其中所述至少两个通道包含具有不同长度的两个通道。

102.根据权利要求99所述的系统，其中至少一个通道长于100μm。

103.根据权利要求99所述的系统，其中至少一个通道的直径窄于100μm。

104.根据权利要求94所述的系统，其进一步包含具有密度为每mm²至少0.1个的多个解析座位的第二表面。

105.根据权利要求94所述的系统，其中所述第一表面的解析座位包含试剂的涂层。

106.根据权利要求104所述的系统，其中所述第二表面的解析座位包含试剂的涂层。

107.根据权利要求105或106所述的系统，其中所述试剂的涂层包含寡核苷酸。

108.根据权利要求107所述的系统，其中所述试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1μm²的表面积。

109.根据权利要求94所述的系统，其中所述多个解析座位包含密度为至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长。

110.根据权利要求94所述的系统，其中所述第一表面的多个解析座位包含对应于小于20度的水接触角的高能表面。

111.一种包围体阵列，其包含：

(a)多个解析反应器，其包含第一基底和含有反应器帽的第二基底；以及

(b)在每一个反应器中的至少2个解析座位；

其中所述解析反应器用可释放的密封隔开，并且其中从第一基底上释放第二基底时，所述反应器帽保留所述反应器的内容物的至少一部分。

112.一种进行一组平行反应的方法，其包括：

(a)提供具有多个解析座位的第一表面；

(b)提供具有多个解析反应器帽的加帽元件；

(c)使所述多个解析反应器帽与第一表面上的多个解析座位对准，并在第一表面与加帽元件之间形成暂时的密封，从而将第一表面上的座位物理地分成至少两个座位的组；

(d)进行第一反应，从而形成第一组试剂；以及

(e)从第一表面上释放加帽元件，其中每一个反应器帽保留第一反应容积中的第一组试剂的至少一部分。

113.根据权利要求112所述的方法，其进一步包括：

(a)提供具有多个解析座位的第二表面；

(b)使所述多个解析反应器帽与第二表面上的多个解析座位对准，并在第二表面与加帽元件之间形成暂时的密封，从而物理地划分第二表面上的座位；

(c)使用第一组试剂的一部分进行第二反应，从而形成第二组试剂；以及

(d)从第二表面上释放加帽元件，其中每一个反应器帽保留第二反应容积中的第二组试剂的至少一部分。

114.根据权利要求112所述的系统，其中所述多个解析座位具有在第一表面上每mm²至少1个的密度。

115.根据权利要求112所述的方法，其中所述多个解析反应器帽具有在加帽元件上每mm²至少0.1个的密度。

116.根据权利要求113所述的方法，其中步骤e)和i)中的释放以不同的速度进行。

117.根据权利要求112所述的方法，其中所述第一表面的解析座位包含用于第一反应的试剂的涂层。

118.根据权利要求112所述的方法，其中所述第二表面的解析座位包含用于第二反应的试剂的涂层。

119.根据权利要求112所述的方法，其中所述试剂的涂层包含寡核苷酸。

120.根据权利要求119所述的方法，其中所述试剂的涂层具有每1.0μm²的平面表面积至少1μm²的表面积。

121.根据权利要求112所述的方法，其中所述寡核苷酸为至少25bp。

122.根据权利要求112所述的方法，其中所述第一表面的解析座位包含对应于小于20度的水接触角的高能表面。

123.一种具有功能化表面的基底，其包含：

(a)具有多个解析座位的固体支持物，其中所述解析座位用提高固体支持物的表面能的部分进行功能化，其中所述解析座位位于微通道上。

124.根据权利要求123所述的基底，其中所述部分是化学惰性部分。

125.根据权利要求123所述的基底，其中所述微通道包含小于1nl的容积。

126.根据权利要求123所述的基底，其中所述微通道包含至少0.01μm/μm²的周长的标称弧长的密度。

127.根据权利要求123所述的基底，其中所述微通道包含至少0.001μm/μm²的周长的标称弧长的密度。

128.根据权利要求123所述的基底，其中所述功能化表面包含每1.0μm²的基底平面表面积至少1μm²的标称表面积。

129.根据权利要求123所述的基底，其中至少一个微通道长于100μm。

130.一种使试剂沉积至多个解析座位的方法，其包括：

(a)通过喷墨泵向所述多个座位的第一座位施加至少一滴第一试剂；

(b)通过喷墨泵向所述多个解析座位的第二座位施加至少一滴第二试剂，其中所述第二座位与第一座位相邻；

其中所述第一和第二试剂是不同的，其中所述第一和第二座位位于被制作于支持表面内的微结构上，并且其中所述微结构包含至少一个深度大于100μm的通道。

131.根据权利要求130所述的方法，其中所述微结构包含至少两个彼此流体连通的通道。

132.根据权利要求131所述的方法，其中所述至少两个通道包含具有不同宽度的两个通道。

133.根据权利要求131所述的方法，其中所述至少两个通道包含具有不同长度的两个通道。

134.根据权利要求130所述的方法，其中所述第一座位接收少于0.1％的第二试剂，并且其中所述第二座位接收少于0.1％的第一试剂。

135.根据权利要求130所述的方法，其中所述多个解析座位的密度为至少1个/mm²。

136.根据权利要求130所述的方法，其中所述多个解析座位的密度为至少100个/mm²。

137.根据权利要求130所述的方法，其中所述滴的体积为至少2pl。

138.根据权利要求130所述的方法，其中所述滴的体积为约40pl。

139.根据权利要求130所述的方法，其中所述滴的体积为至多100pl。

140.一种微流体系统，其包含：

(a)具有多个微孔的第一表面；以及

(b)在所述多个微孔中的一个的内部的小滴；

其中在所述多个微孔中的一个的内部的小滴具有约1-1000范围内的雷诺数。

141.根据权利要求140所述的微流体系统，其中所述微孔长于100μm。

142.根据权利要求140所述的微流体系统，其中所述小滴的体积为至少2pl。

143.根据权利要求140所述的微流体系统，其中所述小滴包含能够进行寡核苷酸合成的试剂。

144.根据权利要求143所述的微流体系统，其中所述试剂为核苷酸或核苷酸类似物。

145.一种使小滴沉积至多个微孔的方法，其包括：

通过喷墨泵向所述多个微孔的第一微孔施加至少一个小滴；

146.一种划分方法，其包括：

(a)使在第一多个解析座位处包含液体的第一表面与包含第二多个解析座位的第二表面接触，其中所述第一表面包含就所述液体而言的第一表面张力，而所述第二表面包含就所述液体而言的第二表面张力；

(b)确定释放的速度，使得所需部分的所述液体从所述第一多个解析座位转移到所述第二多个解析座位；以及

(c)使第二表面以所述速度从第一表面上脱离。

147.根据权利要求146所述的方法，其中所述第一表面的表面张力对应于小于20度的水接触角。

148.根据权利要求146所述的方法，其中所述第二表面的表面张力对应于大于90度的水接触角。

149.一种混合方法，其包括：

(a)提供第一基底，该第一基底包含在其上制作的多个微结构；

(b)提供包含多个解析反应器帽的第二基底；

(c)使第一和第二基底对准，使得所述多个解析反应器帽中的第一反应器帽被配置为接收来自第一基底中的n个微结构的液体；以及

(d)将来自所述n个微结构的液体传送至第一反应器帽，从而混合来自所述n个微结构的液体以形成混合物。

150.根据权利要求149所述的方法，其中n至少为10。

151.一种核酸扩增方法，其包括：

(d)在所述m个单链扩增子核酸上生成针对第一作用物的双链识别位点；以及

152.根据权利要求151所述的方法，其中所述双链识别位点包括所述双链识别位点的第一链上的第一衔接子的第一部分和所述双链识别位点的第二链上的第一衔接子的第二链。

153.根据权利要求152所述的方法，其中所述衔接子包含回文序列。

154.根据权利要求152所述的方法，其中所述双链识别位点通过使第一衔接子的第一和第二部分彼此杂交而生成。

155.根据权利要求151所述的方法，其中所述m个单链扩增子核酸包含多个双链自杂交区。

156.一种用于生成长核酸分子的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供固定在表面上的多个核酸，其中所述多个核酸包括具有重叠互补序列的核酸；

(b)将所述多个核酸释放至溶液中；以及

(c)提供促进下述的条件：

(i)杂交所述重叠互补序列以形成多个杂交的核酸；和

(ii)延伸或连接所述杂交的核酸以合成长核酸分子。