JPH08504170A - 進行性免疫抑制症患者の評価と治療 - Google Patents
進行性免疫抑制症患者の評価と治療Info
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Abstract
(57)【要約】
腫瘍を持つ哺乳動物から得る血清には溶解性の免疫抑制因子が存在していて、TCRサブユニットタンパク質のレベルや、Tリンパ球シグナル変換経路が変化するのに関係している。この変化を利用して、少なくとも一種の選択されたTCRサブユニットタンパク質またはTリンパ球変換経路のタンパク質のレベル、あるいはNF-kB/rel系のパターンを測定して、免疫抑制がない生体のレベルおよびパターンと比較することによる免疫抑制の重篤度判定法が生まれている。この方法は、免疫療法が施術できる程度まで患者のTリンパ球が活性化できることを確認したり、免疫抑制を起こす薬剤またはこれを逆転する薬剤を決定するのに有用である。免疫抑制因子を単離してタンパク質の発現レベルと組み合わせると、例えば臓器移植の場合に免疫反応を抑制するのに有用である。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称
進行性免疫抑制症患者の評価と治療
本願は、1992年4月6日付け米国特許出願第07/863,262号、および、1992年1
2月11日付け米国特許出願第07/987,966号の一部継続出願である。
発明の背景
本発明は、腫瘍を持つ哺乳動物の細胞が産生する可溶性免疫抑制因子と、この
因子をコード化する遺伝子とに関する。この因子の作用を阻止または逆転させる
薬剤のスクリーニング方法が特定される。また、本発明を利用して、免疫抑制剤
や対抗剤を認識することができる。この因子は、免疫抑制を誘発するのに用いる
ことができる。さらに、本発明は進行性免疫抑制症を併発する疾患患者の評価、
選別および治療に関する。免疫療法に反応する疾患の患者、特に癌患者について
、免疫抑制に冒されたタンパク質類の発現度を基準にして、病期判定と評価がな
される。病期判定と評価の結果から免疫療法の成否を予見することができる。
患者に進行性免疫抑制症を合併することを特徴とする疾患は多い。免疫反応障
害をもつ悪性腫瘍患者の症例は、数多く記録されている。癌患者や腫瘍を持つマ
ウスについて、遅延型過敏性の減少、細胞溶解機能の
低下や、リンパ球の繁殖反応など、実に様々な免疫機能異常が報告されている。
S.Broder et al.,N.Engl.J.Med.,299:1281(1978);E.M.Hersh et al
.,N.Engl.J.Med.,273:1006(1965);North and Burnauker(1984)。
この他にも免疫反応異常の発生を特徴とする多くの疾患がある。例えば、後天
性免疫不全症候群(AIDS)、敗血症、らい病、シトメガロウイルス感染症などの
患者に進行性免疫抑制症が観察されている。免疫反応の調節が衰えるメカニズム
はまだ解明されていない。
免疫反応は複雑な現象である。すべての免疫反応には細胞が介在しているが、
その発現にはTリンパ球(T細胞)が重要である。ヘルパーT細胞が免疫反応の進
行の管理調節を行う。細胞毒性T細胞(キラーT細胞)は、感染標的細胞を溶解す
ることにより細胞内寄生体やウイルスに対する免疫反応において重要な役割を果
たすエフェクター細胞である。また、細胞毒性T細胞は、免疫監視メカニズムに
よって、癌の発症から体をまもる役割も担っているとされている。サプレッサー
T細胞は、ヘルパーT細胞の誘導および/または作用を妨害する。一般に、T細胞
は遊離抗原を認識しないが、他の細胞の表面上では抗原を認識することができる
。ここで云う他の細胞とは抗原の提供に特異性を持っている細胞であるかもしれ
ないし、あるいは体内でウイルスに感染してしまった細胞毒性T細胞の標的細胞
であるかもしれ
ない。
普通、細胞毒性T細胞や、サプレッサーT細胞は、すべての有核細胞に発現され
ているクラスIの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)成生物と関連して抗原を認
識する。ヘルパーT細胞や、生体内で抗原に反応して増加するほとんどのT細胞は
、クラスIIのMHC成生物と関連して抗原を認識する。クラスII成生物は、ほとん
どの場合、抗原提示細胞や、いくつかのリンパ球において発現する。モノクロナ
ール抗体により定義される細胞膜糖タンパク質を基準にしてT細胞をさらに二つ
の主要細区分に分類することができる。普通、62 KDの糖タンパク質を発現するC
D4+サブセットはクラスII抗原範囲内の抗原を認識し、CD8+サブセットは76Kdの
糖タンパク質を発現し、クラスIのMHC範囲内だけの抗原を認識する。
CD4+サブセットは、さらに、機能が異なる2つのグループに分けることができ
る。一つのグループは、T細胞とB細胞の免疫反応に正の影響を与える。もう一つ
のグループは、CD8+細胞におけるサプレッサー/細胞毒性機能を誘発する。
最も確実なT細胞標識は、T細胞抗原レセプター(TCR)である。TCR-2はジスル
フィドと結合しているポリペプチド2種(αとβ)からなるヘテロダイマーであ
る。TCR-1の構造はTCR-2に似ているが、TCR-2はCD3複合体からなるポリペプチド
複合体と結び付いている。
すべてのT細胞の表面に見いだされるTCRは、異なる3つのサブグループのタン
パク質に分類することができる相異なる少なくとも6個のサブユニットからなる
。R.D.Klausner et al.,Annu.Rev.Cell Biol.,6:403(1990)。
Tiサブユニットは、抗原結合の原因となるもので、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ
鎖を含んでいる。レセプター複合体内のαβヘテロダイマーやγδヘテロダイマ
ーは、リガンド結合の原因となる。αβヘテロダイマーは、最も成熟したT細胞
に見いだされ、γδヘテロダイマーはおもに上皮のT細胞に見いだされる。
TCRを形成するもう一つのタンパク質サブグループは、相異なるが密接な関係
を持つ少なくとも4個のサブユニットからなるCD3鎖である。これらのサブユニ
ットとしては、γ、δ、εおよびζが挙げられる。F.Koning et al.,Eur.J.
Immunology,20:299(1990);R.S.Blumberg et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,87:7220(1990)。レセプターのタイプが多様化しているのは、TCR複
合体の鎖を複数のサブユニットに分離した結果である。不完全なアセンブリーの
複合体は劣悪化し、完全なアセンブリーのエフェクターのみが表面発現する。R
.D.Klausner,New Biol.,1:3(1989)。
TCRサブユニットタンパク質の関与に加えて、さらにT細胞の認識イベントによ
り、シグナル変換(signal transduction)が行われ、細胞の反応を管理する適
切な
生化学シグナルが発生する。TCRがシグナルを変換して、多重生化学カスケード
を発生させることができることは、免疫細胞活性化の中枢的イベントである。し
かし、このシグナル変換の経路(signal transduction path-way)は、まだほと
んど分かっていない。TCRのうち、一以上のチロシン(Tyr)キナーゼがT細胞の
活性化に重要な役割を持っている可能性が高い。R.D.Klausner et al.,Cell
,64:875(1991)。CD3あるいはαβヘテロダイマーの何れかに対するモノクロ
ナール抗体または抗原によってTCRが刺激されると、少なくとも二つのシグナル
変換経路が活性化する。
TCRが刺激されるとチロシンキナーゼが活性化する。L.E.Samelson et al.,
Cell,46:1083(1986);M.D.Patel et al.,J.Biol.Chem.,262:5831(1
987);E.D.Hsi et al.,J.Biol.Chem.,264:10836(1989)。TCRが刺激を
うけると、数秒以内に数個のタンパク質がチロシン残基によってリン酸化される
。C.H.June et al.,J.Immunol.,144:1591(1990)。TCR鎖の何れも固有の
キナーゼ活性を有していない。ただ、チロシンキナーゼのSrc系のFynと呼ぶ物質
がCD3複合体と共に共同沈降する。L.E.Samelson et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,87:4358(1990)。チロシンキナーゼ類のSrc系のT細胞に特異性のあ
るメンバーLckは、CD4あるいCD8いずれかの分子の細胞質領域と、共有結合では
ないが、密に結合する。CD4とCD8の細胞外領域は、
それぞれMHCクラスIとクラスIIの分子に結合する。提示細胞上でTCRが抗原-MHC
複合体に結合すると、このTCRは、適切なMHC分子と独立して結合出来るCD4ある
いはCD8のいずれかの分子に近づくと信じられている。
また、TCRは、ホスファチジルイノシトールに特異性を持つホスホリパーゼを
活性化して、ホスファチジルイノシトール-4,5-ビス-ホスフェイトを加水分
解する。A.Weiss et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:4169(1984);J
.B.Imboden et al.,J.Exp.Med.,161:446(1985)。これにより二つの第
二のメッセンジャーが遊離する。すなわち、1)一過性のCa2+可動化を実現する
イントシトール-1,4,5-トリス-ホスフェート、および、2)プロテインキ
ナーゼの強力な活性化物質であるジアシルグリセロールである。C.B.Berridge
et al.,Nature,341:197(1989)。
TCRζ鎖の細胞質領域によって、レセプターの刺激をシグナル変換経路に充分
につなぐことができる。B.A.Irving et al.,Cell,64:891(1991)。CD8の
細胞外領域および膜内外領域とζ鎖の細胞質領域とをキメラタンパク質によって
つなぐと、キメラタンパク質はCD3 γ、δおよびεの不存在下で適切なシグナ
ル変換経路を活性化させた。したがって、ζの役割は明かにTCRを細胞内シグナ
ル変換メカニズムにつなぐことにある。
シグナル変換に関連するもう一組のタンパク質として、NF-κB/rel転写活性
化因子がある。NF-κB転写活性
化物質は、複タンパク質複合体(multiprotein complex)である。NF-κB/rel
転写活性化因子は、生体内で細胞がサイトカイン類、二重鎖RNA、T細胞マイトジ
ェン類、DNA破壊物質類、タンパク質合成インヒビター類、寄生体類、ウイルス
類やウイルストランス活性化物質類など極めて多種の物質に暴露されたときに、
直ちに防衛シグナル発現タンパク質の合成を誘導することに専門化されているよ
うに見える。NF-κBを活性化する物質は、細胞や生体にシグナルを送るか、ある
いは脅威を与えると言う共通の特徴を備えている。
NF-κBは急速に形質発現を活性化するのに特に適している。その理由は、(i
)新しくタンパク質を合成する必要がない、(ii)簡単な解離反応で活性化を開
始する、(iii)NF-κBは細胞質−核シグナルに有効に参加している、そして、
(iv)強力なトランス活性化物質であることである。
NF-κBは、T細胞成長因子であるインターロキン2とその高親和性レセプター
の成分の誘導可能な発現に関与しており、NF-κBが成長調節因子であることを示
唆している。事実、T細胞の繁殖状態とNF-κBの活性状態との間にはかなりの相
関関係がある。
三つのタンパク質サブユニット、即ち、IkBとp50とp65が、NF-kBの生物機能を
管理している。IkBは、NF-κBのDNA結合を抑制し、刺激されていない細胞の細胞
質において誘導可能の形でNF-κBを保持する35〜43kDaの
サブユニットである。細胞が刺激されると、p65およびp50との不活性複合体から
、IkBが解離する。遊離したp50-p65複合体ヘテロダイマーは、核に移行して遺伝
子をトランス活性化する。T細胞系と骨髄腫(myeloma)細胞系のハイブリッドに
おける、IL-2レセプターα遺伝子の構造性発現(constitutive expression)は
、ヘテロダイマーの存在にのみ依存する。p65だけがIkBを結合するようである。
細胞内で、IkB、p65、またはその両方のうちどれかを修飾することにより、IkB
を遊離させることができた。
Relタンパク質は、転写活性化物質であると考えられ、またp50とヘテロダイマ
ーを形成することができ、さらに、kBモチーフを認識する配列特異性のDNA結合
タンパク質である。IkBは、たがいに相同性を持ち、細胞内で類似する役割を果
たしているタンパク質群の一物質である。p50とp65とは両方とも、relタンパク
質および背(dorsal)タンパク質と相同である。IkB群とrel群は、細胞質または
核のシグナルに関与することで知られている互いに関連するタンパク質からなっ
ている。
転写活性化物質NF-κBと、この物質とrelタンパク質の関係についての資料は
、 Baeuerie,P.A.(1991)”The inducible transcription activator NF-k
B regulation by distinct protein subunits”,Biophysica Acta 1072:63-80
を参照されたい。
治療の一形態としての化学療法は、癌の全てのタイ
プには効果をもつことはできなかった。これに代わる形態の治療としての免疫療
法の臨床実験において、最も興味の対象となったのは免疫反応の仲介因子の同定
と単離であった。例えば、インターロイキン2(IL-2)やヘルパーT細胞が産生
するリンフォカインなどの生物反応仲介因子は、生体内でも、また生体外でもIL
-2レセプターを保持するT細胞の成長を刺激する。さらに、ナチュラルキラー(N
K)細胞の抗腫瘍機能を活性化(増進)する(Lotze et al.1981)。また、NK細
胞は、ζ鎖を発現する。IL-2を含有する上澄み液中で静止リンパ球を3ないし4
日間インキュベートすると、健康細胞を損なわないで、新鮮な腫瘍細胞の溶解を
仲介することができるリンパ球が生成する。この溶菌細胞はリンフォカイン活性
化キラー(LAK)細胞と名付けられている。I.Yron et al.,J.Immunol.,125
:238(1980);M.T.Lotze et al.,Cancer Res.,41:4420(1981);および
S.A.Rosenberg et al.,J.Natl.Cancer Inst.,75:595(1985)。
Tリンパ球を活性化してT活性化キラー細胞(T-AK)を生成する方法は、白血
球泳動(Ieukophoresis)または末梢血液からリンパ球を採取し、モノクロナー
ル抗体(MAb)により抗CD3などのT細胞表面レセプター(可溶または固相結合)
に対してこの細胞を刺激することよりなる。T細胞はIL-2などのサイトカイン類
一種以上を添加して刺激することができるし、また添加しなくとも刺激す
ることができる。別法として、先ずT細胞を精製してから、MAbにより表面レセプ
ターに対して刺激することもできる。T-AK細胞の実験結果では、CD8+細胞のため
培養基中にMHCに制限されない細胞溶解作用が認められることが立証されている
。P.M.Anderson et al.,J.Immunol.,142:1383(1989);C.M.Loeffler
et al.,Cancer Res.,51:2127(1991)。Tリンパ球を改良して免疫反応性をも
たせることができる能力、および、新鮮な自己由来、同系(syngeneic)、また
は同種異系のナチュラルキラー(NK)細胞耐性腫瘍細胞は溶解するが正常な細胞
は溶解しない能力をIL-2が持っていることから、自己由来養子免疫療法(autolo
gous adoptive immunotherapy)などの細胞移行療法が開発されることとなった
。
代表的な養子免疫療法としては、免疫活性細胞を個体に投与して癌の縮小ある
いは管理などの有益な免疫効果を与えようするものが挙げられる。免疫活性細胞
の代表的な採取方法は、自己由来療法の場合は患者本人から、同種異系療法の場
合は患者以外の人から静脈穿刺法、あるいは白血球泳動法で採取する。このよう
にして採取したリンパ球を培養して数を増やし、抗腫瘍作用を活性化してから、
注入により患者に戻してやる。現在のところ養子免疫療法では、試験管内で細胞
数を増加させた後に、注入により患者に戻すことに大きな努力が払われている。
健康な実験動物から癌性腫瘍を持つ動物に免疫活性細胞を移行する実験を行っ
たが、養子免疫療法は一部の腫瘍モデルで高い奏効率で抗腫瘍効果を認めた。ネ
ズミを用いる動物実験において、IL-2とLAKとを併用したところ各種の悪性腫瘍
の治療に効果が認められた。また、IL-2で治療後LAK細胞を移行すると生体内で
繁殖する。確認されている転移癌を持つ患者を選別して行った臨床実験では、LA
KとIL-2との併用、あるいはIL-2の単独投与で疾患の回帰の仲介に効果があるこ
とが立証されている。S.A.Rosenberg,”Immunotherapy of Patients with Ad
vanced Cancer Using Interleukin-2 Alone or in Combination With Lymphokin
e Activated Killer Cells,”in Important Advances in OncoIogy 1988:J.B
.Lippincott Co.,217,(1988)。
しかしながら、療法に多数の細胞が必要であること、細胞を培養してLAK活性
を発現するためには大量の培養基と多大の時間を必要とすること、所望の治療効
果のためには充分なLAK活性を長時間維持しなければならないこと、さらには治
療による副作用のため、養子免疫療法は限られた成功しか収めることができなか
った。養子免疫療法の効率増進のため、試験管内培養方法が改良されてきた。抗
原レセプター複合体CD3(抗CD3 MAb)に対してIL-2および/またはモノクロナー
ル抗体中で細胞を培養すると、多数のT細胞の繁殖が誘導されて抗腫瘍活性が増
殖することが分かった。P.M.Anderso
n et al.,J.Immunol.,27:82(1988);P.M.Anderson et al.,J.Immunol
.,142:1383(1989);およびA.C.Ochoa et al.,Cancer Res.,49:963(19
89)。
腎臓線癌のネズミRENCAモデルにおいて、IL-2活性化キラー細胞と化学療法を
併用してある程度の腫瘍の縮小効果を挙げたが、この効果はサイトカインが仲介
したことが疑われた。Wiltrout,Progress in Neuro Endocrin Immunology,4:
154(1991)。
生体内で抗腫瘍メカニズムを活性化しようとして、限られた成功を収めた。高
い投与量のIL-2を服用した小数の患者に治療効果があったが、著しい毒性が認め
られた。抗腫瘍CD3モノクロナール抗体単独をマウスに直接注入すると、非特異
性の抗腫瘍機能が抑制される。D.W.Hoskin etal.,Cancer Immunol Immunothe
r.,29:226(1989)。ネズミモデルで肯定的な成績を得たので、人に抗CD3の直
接注入を行った。OKT3と名付けられている抗CD3 MAbを投与された患者は、生体
内で若干のT細胞の活性化を経験したが、この静注OKT3の毒性は、免疫効果を示
し始める前の低用量で最高耐薬量(MTD)に達してしまった。W.Urba et al.,C ancer Res.
,March 1991。この毒性の大部分は遊離OKT3に原因があると信じられ
ている。
単独投与形態の治療が適切でないので、相乗作用を検索した。フラボン酢酸(
Flavone acetic acid:FAA)は、サイトカイン誘導の合成薬剤で、IL-2との併用
で
ネズミのRENCA腫瘍を縮小する相乗効果が認められている。したがって、サイト
カイン誘導物質であるフラボノイドをIL-2と併用することによる抗腫瘍効果に期
待することができる。FAAは生物反応モデファイアー(BRM)で、全身的にナチュ
ラルキラー(NK)細胞の作用を増強し、IL-2との相乗効果によって進行したRENC
Aの治療に効果があることが証明されている。Wiltrout et al.,J.Immunol.,1
40:3261(1988);U.S.Patent No.5,096,707およびNo.5,061,488。FAAに
よって誘導されたサイトカイン類(TNF、α-IFN、およびγ-IFN)は、治療上、r
IL-2との相乗効果に関与しているとされてきた。CD8+-Tリンパ球は、この相乗効
果を仲介する上で重要である。FAAは試験管内でサイトカイン遺伝子を誘発する
。このモデルでは、RENCA腫瘍の進行中に免疫抑制性T細胞が誘導されている。Gr
egarian et al.,Cancer Immunol.Immuother 31:325,31:335(1990)。
各種のin vitro試験によると、腫瘍を持つ宿主のTリンパ球は免疫機能が低下
している。R.Lafreniere et al.,J.Surg.Oncol.,43:8(1990);R.J.No
rth et al.,J.Exp.Med.,159:1295(1984);M.Sarzotti et al.,Int.J
.Cancer,39:118(1987)。末梢血液リンパ球の免疫感度が低下する前に、腫
瘍に浸潤しているTリンパ球が自系または同種異系のいずれの腫瘍細胞に対して
も乏しい細胞毒性しか示していないことが観察されている。E.F.Klein et al.
,1980,In:C
ontemporary Topics in Immunology,I.P.Witz and M.G.Hanna,Jr.,eds.
Plenum Press,N.Y.,p 79-107;B.M.Vose et al.,J.Cancer,44:846(19
81)。
腫瘍を持つ宿主由来のT細胞免疫感度が低下している分子的な根拠は、明白で
はない。サプレッサーリンパ球が発生するのでT細胞の免疫感度が低下すると提
案されたことがあった。S.B Mizel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77
:2205(1980);C.C.Ting et al.,Int.J.Cancer,24:644(1979)。感度
が高いT細胞クローンの欠失が原因であると言われたこともあった。S.Webb et
al.,Cell,63:1249(1990)。さらに、T細胞のアネルギーが誘導される結果と
して、T細胞の免疫感度が低下すると提案されたこともあった。M.K.Jenkins e
t al.,J.Exp.Med.,165:302(1987)。さらにまた、抗原提示の変更によっ
て免疫反応に大きな変化が起こり、その結果CD4+ヘルパーTリンパ球の反応が適
正でなくなることも示唆された。上記の諸説に加えてその後、サイトカイン遺伝
子によりトランスフェクトされた腫瘍細胞は、抗腫瘍保護反応を誘導し、その結
果免疫学上の記憶反応となることが観察されるようになった。E.R.Fearon et
al.,Cell,60:397(1990)。
in vivo腫瘍モデルにおいて、名称をMCA-38としたネズミ結腸癌を皮下に埋没
したところ、移植片が進行的に成長し(>26日)、CD8+Tリンパ球の溶解機能とm
RNAの
腫瘍壊死因子α(TNF-α)、グランザイムB(granzyme B)に対する発現とが互
いに結び付きながら低下し、移行した養子細胞のin vivo抗腫瘍効果を仲介する
能力も失われてしまった。(Loeffler et al.,1992,J.Immunol.,149:949)
。しかしながら、CD4+の繁殖、リンフォカイン産生、およびリンフォカインレセ
プターの調節のグレードアップについては、健康ネズミと腫瘍を持つネズミとの
間に差はなかった。サプレッサー機能を有する細胞は検出されなかったし、また
腫瘍を持つネズミとMCA-38腫瘍細胞から採取したリンパ球の何れからも形質転換
成長因子β(TGF-B)の産生が検出されなかった。
リンフォカイン類の注入および/またま養子免疫療法によって免疫異常患者の
免疫反応を増大させようとする試みは、不安定で限られたものではあるが一応の
成功を収めteきた。このタイプの治療は、方法を改良する必要がある。免疫抑制
症患者の免疫系を効果的なタイミングで増強することができるように、免疫抑制
の進行を測定する効果的な方法が必要である。また、患者の免疫抑制の程度を見
積って、治療に対する患者の反応を正確に予想する方法が必要である。こうする
と、系統立った患者の療法を開発することができる。さらにまた、臨床医が患者
のTリンパ球は活性化できるものであるか、そうだとすれば、自系の養子免疫療
法が効果的であるのかを決定する方法が必要である。
また、疾患の進行中にTリンパ球の免疫抑制状態を回避あるいは逆転して、患
者にT細胞免疫反応を発生させたり、増強する方法の必要がある。免疫抑制剤お
よび免疫抑制を逆転したり、阻害する薬剤のスクリーニング方法の必要がある。
腫瘍の存在、特に癌の発生を初期段階で検出し、治療効果を増進する方法の必
要がある。疾患の病期を判定する改良法があれば、容易に最適のタイプの治療を
選択することができる。また、臨床実験開始前、さらに開始後も臨床実験の補助
手段として治療タイプの効果をチェックする必要がある。
本発明は、免疫抑制および例えば癌といった一般に免疫抑制を特徴とする疾患
の検出、モニターリング、及び逆転の技術における制限を解消しようとするもの
である。
発明の概要
本発明は、部分的には、TCRサブユニットに関連する各種タンパク質類の発現
の水準や、Tリンパ球シグナル変換経路(signal transduction pathway)、NF-κ
B/relを変化させることができる可溶性免疫抑制因子の同定に関する。発現の
パターンには、存在の減少(reduced presence)、切断(truncation)などのタ
ンパク質構造の改変を含み、細胞または一以上の無細胞系中にタンパク質が存在
すること、不存在であることを含むものとする。
「因子」とは、免疫抑制を持つ哺乳動物由来の血清中に存在し、TCR関連タン
パク質類の発現を変えることができる組成物である。因子は腫瘍細胞培養物の一
部の上澄み液中に存在する。「因子」なる語には、上記の血清または上澄み液か
ら単離または精製したために、本明細書で説明する免疫を抑制する性質とTCRタ
ンパク質を改変する性質を持っているサブコンポーネント(subcomponent)を含
めるものとする。タンパク質発現のパターンは、TCRレセプター、Tリンパ球シグ
ナル変換経路、およびNF-κB/relを弱体化している一種以上のタンパク質類にお
いて改変される。
免疫が抑制されていない哺乳動物や、免疫が抑制されていない哺乳動物の細胞
培養物、あるいは免疫が抑制されていない哺乳動物の特徴であるタンパク質水準
を特徴としている細胞の培養物から由来する細胞培養物におけるタンパク質の特
徴的なレベルと比較して、TCRレセプターを含む特定のタンパク質や、シグナル
変換経路の特定のタンパク質の発現レベルは、免疫抑制哺乳動物において、低下
しているのが普通である。しかしながら、本発明の一態様であるこれらのタンパ
ク質の発現は、相互に関連している複雑な免疫システムの一部である。このシス
テムのタンパク質一個が混乱しても、他のタンパク質のレベルに色々な態様で影
響し、つまり、やがて特定の時点でこのレベルを上昇させたり、低下させたりす
ることがある。
重要なのは、免疫システムの少なくとも一つのタンパク質レベルがこのシステ
ムの作用を混乱させる程度まで低下すると、システムが抑制される、つまり健康
な哺乳動物が特徴とする免疫機能を達成するのに必要な作用ができなくなってし
まう。抑制の程度はいろいろあるが、普通、抑制が著しくなるにつれて、より重
篤な臨床上の問題に結び付いて行く。さらに、免疫抑制が進行して行くにつれて
、ますます多くのタンパク質レベルが変化して行く。本発明においていは、免疫
抑制進行の指標として、一個の特定タンパク質が相対応して減少する反面、複数
のタンパク質は免疫が抑制されていない状態から脱却する。普通、一部のタンパ
ク質レベルが上昇して、一部のタンパク質レベルが低下する。例えば、CD3ζが
減少し、FCεγが増加する。
本発明において免疫抑制因子の存在下で増加するタンパク質の例として、TCR
のサブユニットが挙げられる。これらのタンパク質にはCD3ζとCD3γがある。
CD3ζレベルが低下するにつれて上昇するタンパク質、発現が逆の相関関係に
あるものの例としては、IgEレセプターに関連したタンパク質であるFcεγが挙
げられる。本発明の方法によるFcεγタンパク質のコントロールによって、増加
したFcεγをスクリーニングしたり、この増加を抑制する薬剤の選択に有用であ
り、したがって、アレルギー反応をコントロールできるようになりうる。
免疫抑制因子の存在下で減少するタンパク質のもう一つの例として、シグナル
変換経路タンパク質が挙げられる。このタンパク質には、Src系酵素などのチロ
シンキナーゼ、特にFynとlckならびにPLCγおよびGAPタンパク質がある。
NK-κB/rel系のTCRサブユニットタンパク質、シグナル変換経路タンパク質、
あるいはタンパク質転写因子のパターンは、腫瘍、すなわち免疫抑制状態と結び
ついた疾患の存在下で変化する。これに関連するパターンとしては、腫瘍がなく
免疫が抑制されていない状態の哺乳動物に見いだされる異なるタンパク質成分の
存在、不存在、および免疫が抑制されておらず、腫瘍もない状態の特性とは異な
る、分子量などの特性によって特徴づけられた各種関連化合物の存在、不存在が
挙げられる。NF-κB/rel因子と分子量などの特性の存在、不存在は、当業者に知
られている方法により測定する。これらの方法には、ウェスターン法、ゲルシフ
ト分析およびUV架橋分析(UV-crosslinking analysis)がある検定に、例えば脾
臓から採取したリンパ球製剤を使用する場合には、短時間培養することが好まし
い。本発明の可溶性免疫抑制因子は、腫瘍を持つ哺乳動物の血清に存在すること
を、もう一つの特性とする。
腫瘍細胞を培養した上澄み液が、正常リンパ球のin vitro細胞毒性作用を抑制
することが証明されている。この培養物の例としてはMCA-38とMBL-2をあげるこ
とが
できる。したがって、この因子が腫瘍保持源から誘導される哺乳動物細胞製剤か
ら単離精製されたものでありうる。この因子は、腫瘍発生後一定期間を置いてか
ら採取することが可能である。腫瘍発生後の期間が長ければ長いほど、因子採取
の可能性が高い。腫瘍は一以上発生している場合もある。どのくらいの期間を置
けば因子採取が可能となるかについては、哺乳動物のタイプ、腫瘍のタイプ、お
よび悪性腫瘍の状態に関連する要因によって異なる。例えば、本明細書で説明す
る腫瘍系の場合、発生後少なくとも26日で、可溶性因子をマウスから採取するこ
とが可能である。
可溶性因子は、哺乳動物の血清を含む生物標本からも採取することができる。
さらに、細胞、例えばMCA-38系、あるいはMBL-2系の細胞を培養した上澄み液か
らも採取することができる。これらの細胞系は本明細書で説明する用途について
、入手可能である。
哺乳動物の免疫抑制のレベルを測定する一般的方法は、TCRサブユニットタン
パク質、またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパク質を少なくとも一種選択
して、これから哺乳動物リンパ球製剤を精製し、この製剤の発現のレベルを測定
し、同一の種類の哺乳動物の健康な、即ち免疫が抑制されていない個体のタンパ
ク質を選択し、これに特徴的な発現のレベルと試験サンプルの発現のレベルとを
比較する各ステップからなる。本発明の実施に好適なTCRサブユニットタンパク
質は、
CD3ζとCD3γである。また、本発明の実施に好適なシグナル変換経路のタンパク
質は、Src系のチロシンキナーゼp56lckおよびp59fynとPLCγおよびGAPのタンパ
ク質を含む。
正常状態から悪性状態までの進行と直接に結び付くタンパク質発現のレベルの
変化の例としては、CD3γが減少し、CD3ζ鎖を完全に欠失するT細胞抗原レセプ
ター(TCR)が挙げられる。後者の鎖はFcεγ鎖に変えられる。
正常状態から悪性状態までの進行と結び付くリンパ球シグナル変換経路のタン
パク質発現のレベルの変化の例としては、チロシンキナーゼ発現の減少を含める
ものとする。代表的な一態様においては、p56lck、p59fyn、PLCγおよびGAPは、
正常レベルと比較して減少する。どの個体においても、一以上のタンパク質レベ
ルが変化することがある。悪性が進行するにつれて、一般に、より多くのタンパ
ク質レベルが変わって行くようになる。疾患が異なると、変化の出現順序も変わ
る。
この例で見いだされる変化は、腫瘍を持たない実験動物またはヒトと比較して
、腫瘍を持つマウス、およびヒトの両方に観察される。一般に、相関関係を持つ
反応、即ち、パターンが悪性状態の進行と結び付いているものであるが、正常な
TCR複合タンパク質発現レベルの変化が少なくとも一つ観察される。
免疫抑制状態、即ち腫瘍を持っている状態に関する検定方法として、NF-kB/re
l系の転写因子のパターンがある。この例で対象とするタンパク質類は、c-rel、
p65、およびp50である。ある異常な条件下では、これら三つタンパク質の全てが
存在しない。他の条件下では、一つか、二つだけが存在しない。さらに他の異常
条件下では、新しい形態のタンパク質が正常状態の形態にとってかわる。哺乳動
物の一種から採取した比較ができる細胞サンプルとの間で比較することが好まし
い。p50は、腫瘍を持たない哺乳動物のTリンパ球製剤の核成分であるが、例えば
、マウスのRENCA腫瘍の存在下では、このp50は姿を消してしまい、(ウエスタン
法による測定で、分子量おのおの48及び44KDと見積られているタンパク質)p48
とp44とにとって代わられる。新しい形態のタンパク質は、単に大型の形態のも
のをN末端で切断しただけで、置き換えられる分子量の大きな形態と互いに類縁
関係にあるように見える。
免疫抑制によって影響された発現のレベルとタンパク質のパターンによって、
癌患者の病期判定と評価を行う。病期判定と評価の結果から免疫療法の成否を予
想する。TCRサブユニットのタンパク質レベル、シグナル変換経路、およびNF-κ
B/relタンパク質類によって、この目的に必要な情報が提供される。また、療法
に対する細胞のin vitro反応によって、治療効果、あるいは細胞の免疫強度、あ
るいはこの両者の相関関係を予
想することができる。
本発明の一態様は、TCRレセプター、シグナル変換、またはNF-κB/relタンパ
ク質類の変化を検定することにより、患者が自系養子免疫療法(autologous ada
ptive immunotherapy)を活性化できるTリンパ球を持っていることを確認する方
法を提供することにある。この方法は、免疫抑制評価の対象患者から得たリンパ
球調製物を用いて、TCRサブユニットタンパク質から選ばれる少なくとも一種ま
たはTリンパ球シグナル変換経路内のあるタンパク質の発現レベル、あるいはNF-κ
B/relタンパク質の少なくとも一種のパターンを測定することを含む。
本発明によるタンパク質の発現レベルの定量法は、発現比率よりなる。但し、
これに類似する方法は、本発明の一部とする。発現比率とは、計測したTリンパ
球の総数に対する特定タンパク質を発現するTリンパ球の数の比率のことをいう
。タンパク質発現のレベルを、健康な、即ち免疫が抑制されていないヒトの正常
な特定タンパク質発現レベルと比較する。本発明のもう一つのタンパク質発現レ
ベル定量法は、例えばTリンパ球の、生物標本から単離した総タンパク質量中に
存在するタンパク質の量を数式で表示するものである。
NF-κB/rel系の転写因子のパターンについては、分子量成分の存在、不存在は
、核抽出物中で測定する。この場合、少なくとも一つの成分の検定を行う。但し
、
異常状態が異なるとパターンも異なる特徴があるため、複数の成分を検定するこ
とが好ましい。
さらに、リンパ球の刺激と相容できるタンパク質の最低濃度を、しきい値と定
める。また、リンパ球の刺激と相容できるNF-κB/relタンパク質のパターンをし
きい値とする。相容性とは、リンパ球の注入を伴う療法において臨床改善に一般
に必要とされる抗CD3などの薬剤が与えるレベルの刺激であると定義する。言い
替えると、免疫反応に干渉しないタンパク質レベルおよび/またはパターンをし
きい値のレベルとする。
本発明の方法を免疫療法に反応する疾患患者の治療に適用することにより、リ
ンパ球が刺激に反応して、免疫療法が成功するであろうと考えられる患者を選択
することが可能となる。また、特定タンパク質の発現レベルとタンパク質のパタ
ーンがしきい値以上で、リンパ球の刺激に反応できる患者は、免疫療法に適合す
る。
本発明の他の態様は、哺乳動物のTリンパ球の免疫抑制を起こす薬剤の選別方
法に関する。この方法は、健康な、即ち免疫が抑制されていない同一の哺乳動物
種の個体の特徴である発現レベルのTCRサブュニットタンパク質から選ばれる少
なくとも一種、またはシグナル変換経路内のあるタンパク質および/またはNF-κ
B/re1タンパク質のパターンからなる哺乳動物のTリンパ球調製物を用意し、免
疫抑制を起こすと考えられる薬剤
の存在下でこのリンパ球調製物を培養し、選ばれたタンパク質の発現レベル、お
よび/またはパターンを測定し、選ばれたタンパク質の発現レベルを顕著に低下
させるか、あるいはパターンを変化させて正常とはことなるものにする薬剤を選
別する各ステップよりなる。この場合正常とは免疫が抑制されていない状態であ
ると測定されるしきい値レベルとする。最後の選別ステップは強力な免疫欲製剤
を投与した後in vivoで実施する。例えば、器官移植に伴う免疫抑制誘導方法と
しては、本発明の溶解性免疫抑制因子を患者に投与する。
同様にして、哺乳動物のTリンパ球の免疫抑制を逆転させる薬剤の確認方法は
、次の各ステップからなっている。即ち、免疫が抑制されている哺乳動物から得
た哺乳動物のTリンパ球調製物を用意し、ここで、少なくとも一つの選ばれたTCR
サブユニットタンパク質またはシグナル変換経路のタンパク質が、免疫が抑制さ
れていない、すなわち健康な同一哺乳動物種の個体の特徴であるしきい値以下の
発現レベルとなっているか、あるいは、NF-κB/relタンパク質の改変されたパタ
ーンを示しているか、あるいは、これら変化のいずれかが合併している。そして
、免疫抑制を逆転すると疑われている薬剤の存在下でこのリンパ球調製物を培養
する。さらに、選ばれたタンパク質の発現レベルを測定する。そして、選ばれた
タンパク質の発現レベルを顕著に増加させる薬剤を選別するものである。この方
法は、免
疫抑制を逆転する可能性のある薬剤を投与した後、in vivoで実施する。
本発明のTCRサブユニット、シグナル変換のタンパク質、またはNF-κB/relタ
ンパク質の変化を検出する方法を利用して、腫瘍を減少させたり、除去したりす
る治療方法を評価することができる。この評価のためには、治療開始前に腫瘍を
持つ哺乳動物のタンパク質濃度を測定する。治療後、同じタンパク質について、
レベルまたはパターン、あるいのその両方を測定し、治療前と比較して、変化の
有無を判定する。一般には、変化の有無の判定には、統計的に意味があるデータ
が必要である。また、腫瘍を持たない哺乳動物のタンパク質レベルを比較してお
いて、将来の治療効果比較に役立ても良い。
一態様において、サイトカインを誘導するフラボノイドとIL-2の併用により、
確立した腫瘍を持つ哺乳動物の治療を行う。チロシンのリン酸化パターンの変化
を検討したところ、マウスの腫瘍では、この腫瘍の存在に関連してp56pck、p59f yn
、PLCγlとCD3複合体のゼータ鎖の濃度が低下していたものが治療後逆転し、
また、腫瘍が縮小していた。腫瘍を持つマウスでは、NF-κG/rel系のc-relとp65
が存在せず、p50の代わりにp44とp48が出現していた。治療後、このパターンは
、ほぼ正常状態に戻っていた。この結果は、フラボノイド、サイトカインおよび
IL-2の併用により、正常な免疫機
能に必要な成分、例えばシグナル変換経路が回復され、このためT細胞が効果的
な抗腫瘍反応を展開できるようになったと解釈できる。
腫瘍を持つ哺乳動物においてCD3ζタンパク質の発現レベルが一旦低下した後
、発現の回復を誘導する薬剤の例として含まれるのは、イオノマイシン(ionomy
cin)、または、イオノマイシンと次のいずれかの併用である。すなわち、フォ
ーボルミリスティックアセテート(phorbol miristic acetate)、IL-2、PMAとI
L-2、抗CD3とIL-2、そしてモノクロナール抗体、抗CD3のうちのいずれかである
。
次に、本発明による免疫抑制因子を抑制する薬剤のスクリーニングを下記のよ
うにして実施する。先ず、ある系にこの薬剤を添加した後、免疫抑制の程度を測
定し、添加前の免疫抑制の程度と比較する。この態様の一つは、次のステップか
らなっている。
1.この薬剤に対するモノクロナール抗体を形成し、この薬剤を含有する調製
物にこの抗体を添加すると複合体が形成されるようにする。これによって、薬剤
の作用を抑制すると共に、当業者に周知の方法によりこの抗原−抗体複合体を標
識して、複合体の形成が検出できるようにする。このことから、薬剤が製剤中に
存在することが推論できる。
2.第一の細胞系にこの免疫抑制因子を含有させておき、試験すべき薬剤を添
加する。
3.第二の細胞系にもこの免疫抑制因子を含有させておき、薬剤と薬剤に対す
る抗体とを一緒に添加する。
4.本発明による検定方法を用いて、例えばTCRサブユニットおよびシグナル
変換経路のタンパク質発現レベル、および/または、NF-kB/relタンパク質のパ
ターンを測定して、免疫抑制の程度を測定する。
5.第一の細胞系の免疫抑制の程度と、第二の細胞系のそれとを比較して、モ
ノクロナール抗体を含有する系が免疫抑制を逆転させたか、否かを判定する。タ
ンパク質レベルにより、および/または、第二の細胞系のパターンが第一の細胞
系のレベルより上位にあることにより、逆転したことが分かる。このレベルまた
はパターンは、免疫が抑制されていない同様の細胞系の特徴となっているレベル
またはパターンと一致することが好ましい。同様の細胞系とは、同一の哺乳動物
種から誘導される系で、同一のタイプの細胞からなり、その他の類似した免疫特
性を有するものを含む。
さらに、本発明は、免疫抑制を阻害する、すなわち悪性状態またはその他の免
疫抑制を誘発する異常状態により発生する免疫抑制を防止あるいは逆転するもの
として、本発明の方法により決定された薬剤に関する。化学的療法を原因とする
免疫抑制も、上記の免疫抑制の定義に含まれるものである。
さらにまた、免疫抑制因子に対する抗体も本発明の一部である。この抗体は当
業者に周知のポリクロナー
ルおよびモノクロナール抗体の製法により、本発明の免疫抑制因子を単離し、こ
の免疫抑制因子から単離精製したエピトープを用いて製造する。
免疫抑制因子は、腫瘍を持つ哺乳動物の血清、腫瘍または腫瘍を持つ哺乳動物
の細胞、または免疫が抑制されていない系に対して用いると免疫抑制を発生させ
る他の生物源から、単離精製する。本発明の一態様では、この因子は、溶解性の
、タンパク質様の化合物である。単離精製した因子を使用して、免疫抑制因子を
コード化している遺伝子のクローンを作り、ヌクレオチドのコード化配列を決定
する。
当業者に周知の方法により、本発明の免疫抑制因子をコード化するからクロー
ンが作られる。この因子、または少なくとも免疫抑制に必要なセグメントは、因
子またはエピトープセグメントに対するモノクロナール抗体を用いるか、あるい
は標準生化学精製法によって精製することができる。精製因子にはアミノ酸配列
を決定し、縮退(degenerate)オリゴヌクレオチドを形成してヌクレオチド配列
ライブラリーをスクリーンするのに使用する。
本発明の免疫抑制因子の発現に対抗するアンチセンス構成物は、この因子の作
用を抑制するのに有用である。哺乳動物にアンチセンス構成物を投与して、免疫
抑制状態に進行するのを抑止することができる。アンチセンス構築物は、一般に
細胞内へとトランスフェク
トさせて、その細胞を哺乳動物に投与する。
また、当業者に周知の方法により、溶解性因子の遺伝子を哺乳動物の細胞にト
ランスフェクトさせることができる。
本発明の一態様は、本発明の溶解性免疫抑制因子の少なくとも免疫的に活性で
ある部分から製造するワクチンに関する。このワクチンは当業者に周知の方法に
より製造する。
さらに、本発明は、免疫抑制のレベルを測定するキットを提供する。このキッ
トは、TCRサブユニット、シグナル変換経路、およびNFκB/rel系の一群からのタ
ンパク質に対する抗体を含む。別々の容器に、本発明の各々のタンパク質に対す
る一個以上の抗体を入れる。さらに、キット中には抗原−抗体複合体の形成を検
出する手段があり、この形成検出により特定のタンパク質が存在することを推論
できるようになっている。配列は、正常状態と異常状態とでは異なる配列に対し
て特異性を有する抗体は、劣化タンパク質の検出に有用である。
また、本発明は、免疫抑制・腫瘍進行逆転用治療剤の効果判定キットを提供す
る。これはリンパ球調製物を数種、一種づつそれぞれの容器にいれて、キットに
したものである。第一の調製物は、レベルとパターンについて対照として用いる
ものである。第一調製物は、一般的には、治療対象と同一の哺乳動物種であって
、
免疫障害がなく、腫瘍もない哺乳動物の脾臓から採取したリンパ球の調製物であ
る。第二の調製物は、免疫抑制されたか、腫瘍を有する哺乳動物には由来するが
、同様な細胞および哺乳動物から得た細胞調製物である。一般に、細胞は、キッ
トの到着時から使用時まで液体窒素で凍結しておかなければならない。調製物が
核抽出物であるか、あるいは、キット中に溶解手段を入れてあるので、核を使っ
てNF-kB/relのパターンを分析することができる。治療薬の効果判定は、その治
療薬を第二の調製物に添加し、ある適当な時間を置いて、当業者に周知の方法に
より、タンパク質のレベルとパターンを比較して行う。適当な時間とは、細胞の
タイプ、細胞検定毎に定める。
哺乳動物の細胞を免疫抑制因子を阻害する薬剤で処理したもの、そして、哺乳
動物の細胞を免疫抑制因子で処理したものは、疾患の性質、治療条件に応じて免
疫抑制作用を上昇させたり、低下させたりすることができ、治療上有用である。
処理された細胞は、養子免疫療法に用いることができる。
本発明の方法により免疫抑制を逆転させることができると判定された薬剤の治
療有効量を、製薬的に許容できる希釈剤に入れて投与し、免疫抑制された哺乳動
物を治療する。治療有効量は、特定疾患、特定条件毎に経験的に定める。治療対
象の哺乳動物にはヒトも含む。
本発明の他の目的、特性、および長所は、以下に述べる詳細な説明により明ら
かとなる。ここで用いる用語を、次のように定義する。
Tリンパ球またはT細胞は、T細胞抗原レセプターを持つすべてのリンパ球サブ
セットを含めるものとする。これらのサブセットには、次のリンパ球がある。
CD3+CD4(αβ+)、CD3+CD8+(αβ+)、CD3+CD4-CD8f+(γδ+)、CD3+CD56+で
ある。
免疫療法とは、細胞養子免疫療法を含む養子免疫療法を含むものとする。細胞
養子免疫療法は、個体に免疫的に活性(免疫上有効な)を有する細胞を投与して
、癌組織または疾患組織の減少あるいはコントロールなどの、有益な免疫的効果
を挙げようとするものである。
本発明で言う、免疫治療活性または免疫反応または免疫的に活性または免疫的 に有効
といった表現には、白血球の抗腫瘍作用、抗感染細胞作用、疾患治療作用
、キラー作用を含めるものとする。
培養とは、成長に必要なすべての栄養剤からなる組織培養基(TCM)にT細胞を
置く工程をいう。刺激とは、一以上のサイトカイン、またはその代わりに一以上
のT細胞抗表面レセプター抗体、あるいはこれに一以上のサイトカインを併用し
たものを配合して、TCMによりT細胞を培養することをいう。この工程は、細胞や
組織の培養に適するものであれば、如何なる容器、如何なる装置を用いて行って
もよい。さらに、この工程は、
異なる段階を幾つか用いる培養および継代培養からなっていてもよいが、刺激を
する段階は、典型的には、一つのみにとどめることが好ましい。
シグナル変換経路は、リガンドまたは抗体が何れかのT細胞表面レセプターに
結合することにより、発現が誘導、リンク、あるいは調節されるすべてのタンパ
ク質を含むものとする。これらのタンパク質としては、Jun、Fos、Myc、GAP、Ra
fl、c-rel、NFκB、Plcγ、タンパク質G、イノシトールホスフェート、タンパク
質キナーゼC、Maplキナーゼ、CD45ホスファターゼ、およびLck、Fyn、YesとLyn
を含むSrc系が挙げられる。
抗体は、特異的にT細胞の適当なエピトープに結合して刺激を与えるすべての
タンパク質またはタンパク質類縁物質を含むものとする。抗体はまた、TCRサブ
ユニットタンパク質、Fcεγ、またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパク質
と特異的にに結合するすべてのタンパク質またはタンパク質類縁物質を含むもの
とする。さらにまた、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、またはそれら
のフラグメントを始めとする従来の方法により形成する抗体、ならびに遺伝子工
学、または合成による化合物、例えば機能的には抗体と同等の結合特異性を有す
る結合領域を含有している単鎖抗体もこれに含める。
サイトカインは、多くの細胞内シグナルに関与して、外部からの各種刺激に対
する総合的な反応を行うタン
パク質である。サイトカイン類は、細胞表面の高い親和力を持つ特定のレセプタ
ーと相互作用を行う強力な媒介物質である。また、サイトカイン類は、免疫反応
に関係があるすべてのタイプの細胞の機能に影響し、さらにリンパ球新生や、造
血にも関与し、多くの疾患の病態生理に関係があることが証明されている。リン
ホカイン類は、本発明の好ましいサイトカイン類である。
NFκB転写活性化因子は、遺伝子転写を活性化する複タンパク質複合体である
。三つのタンパク質サブユニット、IKB,p50とp65が、NFκBの生理機能をコント
ロールしている。Relタンパク質は、転写活性化因子であり、p50とヘテロダイマ
ーを形成することができ、さらにKBモチーフを認識することができる、配列特異
性のDNA結合タンパク質である。
図面の簡単な説明
図1は、次の三群のマウスから採取したT-AK細胞で処理した実験結果を示して
いる。(1)腫瘍を持たない(健康な)マウス、(2)<21日の腫瘍マウス(初
期TBM)、(3)>30日の腫瘍マウス(後期TBM)。腫瘍接種後12日で肝臓に
転移しているのが認められた。これら三群をスチューデント式テストで比較した
。*は、P<0.001、対照群に対する処理群を示す。横棒はS.D.(標準偏差)
である。(TBM:腫瘍を持ったマウス(tumor-bearing mouse))
図2は、(A)MCA-38(結腸癌)に対する健康、初期、お
よび後期TBM T-AK細胞の細胞溶解作用、(B)MBL2(リンパ腫)に対する健康、
初期および後期のTBM T-AK細胞の細胞溶解作用、および、(C)RENCA(腎臓細胞
癌)腫瘍細胞系に対する健康、初期および後期のTBM T-AK細胞の細胞溶解作用を
示している。濃縮T細胞を抗CD3で活性化し、組替えインターロイキン2(rIL-2
)を100U/ml含有する組織培養基(TCM)で培養した。溶解機能は培養第二日目に
試験した。
図3は、MBL2に対する健康、初期、および、後期TBM T-AK細胞の細胞溶解作用
を示している。濃縮T細胞を抗CD3で活性化し、組替えrIL-2を100U/ml含有するTC
Mで培養した。培養第2、4および7日目において、4時間のクロム・リリース
・アッセイ(chromium release assay)を行って溶解機能を試験した。
図4は、流動細胞計測法によって測定したTCR-CD3複合体の表面発現である。
健康マウスおよび腫瘍マウス(点線および長点線)からT細胞を単離して、フル
オレセインでラベルしたIgG2Aを対照として、(A)マウスTCRαβ(クローン H5
7-597 Pharminngen)、または(B)抗CD3ε(145-2C11)と共に培養した。健康
マウス(影付部分)、腫瘍マウス(影のない部分)。
最良の実施態様の説明
腫瘍を持つマウス(tumor-bearing mouce:TBM)、特に長期間腫瘍を持つマウ
スのT−リンパ球は、TCR関連タンパク質の性質が変化しているのが認められる。
癌
患者にも同様の変化が認められる。このことは、TCRサブユニットとシグナル変
換経路のタンパク質、およびNF-kB/rel系の作用が阻害されているために、腫瘍
が増殖することを示唆している。反対に、これらのタンパク質の変化を逆転させ
る、例えばこれらのタンパク質の発現が欠失あるいは低下しているのを逆転させ
て、正常レベルの存在に戻してやると抗腫瘍治療が成功することになる。
これらの観察に基づいて、哺乳動物の免疫抑制検定法を開発した。この検定法
は、TCRサブユニットのタンパク質、シグナル変換経路のタンパク質、およびNF-k
B/relの変化を対象としている。これらの検定法には、臨床面で多くの用途が
ある。
本発明のTCR関連タンパク質に対する効果およびこの効果が進行性免疫抑制と
関係があることを基準にして、腫瘍を持つ哺乳動物に存在している溶解性免疫抑
制因子を決定した。
本発明の方法は、治療の評価、さらには免疫系の機能不全を特徴とする多種の
疾患の治療方法に適している。これら疾患のうちに、進行性免疫抑制を伴う疾患
、さらに「自己」が異種として認識されて、自己免疫反応が確立されてしまう疾
患も数えることができる。
進行性免疫抑制を合併する疾患には、多くの異なる組織の癌、例えば白血病、
ホジキン病、肺癌、結腸癌、グリオーム、腎臓細胞腫などがある。また、進行性
免
疫抑制は多種の感染症、例えば、らい病、結核、リーシュマニアなどの細胞内感
染症、敗血症や、HIV、サイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルスなど
のウイルスを病因とする細胞外感染症、住血吸虫症、マラリアなどの寄生虫感染
症などにも観察される。
自己免疫を伴う疾患としては、狼瘡、自己免疫甲状腺炎、硬皮症、リウマチ様
関節炎などのリウマチ様疾患が挙げられる。
器官移植には免疫抑制を誘導することが必要である。本発明の溶解性因子は、
この状態にするのに有用である。また、免疫抑制剤の評価に本発明の検定法を用
いることができる。
本発明の検定法によって免疫抑制剤が免疫抑制を逆転させることを確認してか
ら治療法を決定する。治療は、癌あるいは免疫系障害を伴う他の疾患を持つ哺乳
動物に免疫刺激薬を直接投与して行っても良いし、また養子免疫療法を使っても
良い。
効果のある免疫療法剤をリポゾームでデリバリー(送達)する。効果がある免
疫療法剤は、TCRサブユニットとシグナル変換経路のタンパク質のレベルを腫瘍
出現前のレベル、あるいは疾患の発症前のレベルにまで回復させる。効果がある
免疫療法剤は、NF-κB/rel系の転写因子を発病前の状態に回復する。
腫瘍を持つマウスのTリンパ球(TBM)の特性
1.治療効果の低下
26日より長い間腫瘍を持っているネズミ宿主(以下、この宿主を後期腫瘍を持
つマウスまたは後期TBMと称す。)から養子移植したTリンパ球の治療効果は顕著
に低下した。これは、健康マウスや、21日未満の間腫瘍を持っているマウス(初
期腫瘍を持つマウスまたは初期TBMという。)と区別できる低下であった。
後期TBMのTリンパ球の機能のin vitro分析を行ったところ、抗CD3とIL-2には
正常と思われる増殖反応を示し、CD4+からはリンホカインが正常に形成されてい
ることを認めた。しかしながら、CD8+細胞の細胞毒性機能が著しく低下している
ことが観察された。この細胞毒性低下は、細胞が介在して抑制されたものではな
かった。TNFαやグランザイムBなどの溶解性分子をコード化する遺伝子の発現が
顕著に減少していたのである。
後期TBMのTリンパ球からCD3ζおよびCD3γ鎖を検出することはできなかった。
ζ鎖は、ζ鎖系の一種であるFcεγ鎖の発現に置き換えられていた。TBMのリン
パ球では、さらにLckとFynタンパク質が顕著に減少しているのが認められた。こ
れと平行して、Ca2+を動員する能力が低下し、チロシンリン酸化のパターンも変
化していた。
腫瘍を持つマウスのCD8+Tリンパ球により、溶解および治療機能が低下し(Loe
ffler et al.,1992)、シグナル発生分子の発現と機能の変化が劣化した。CD3
ζ鎖は、TCRの重要なシグナル変換成分であるばかりでなく
(Romeo and Seed,Cell 64,1037,1991)、T細胞ハイブリドーマにおけるTCR-
CD3複合体の組立発現および膜発現を制限するサブユニットでもある(Weissman
et al.,Science 239:1018,1988)。TCR-α鎖またはCD3-δ鎖を欠失した細胞
では溶解機能が低下する。Schmitt,Verhuisi et al.,Nature 325:628(1987
)。腫瘍を持つマウスのT細胞にCD3ζあるいはCD3γが不存在であることの影響
は明かではない。
CD3+、NK1.1+、CD16+、CD4-およびCD8-としての特徴を持ち、ζ鎖の代わりにF
cεγ鎖を発現する大型粒子のTリンパ球(Iarge granular T-Iymphocytes:LGLs
)の細区分については、既に説明がなされている(Koyasu,J.Exp.Med.175:
203,1992)。これらのリンパ球は、発現型から見ると、腫瘍を持つマウスのも
のとは異なっている。しかしながら、これらのLGLsは、溶解機能を持っている。
したがって、標的細胞の溶解は、CD3ζ鎖の存在に依存するものではない。さら
に、細胞毒性T細胞系中で発現したFcεγによって形成されるキメラ分子も、独
自の溶解機能を持っている。このことから、特に二つの鎖の相同性の程度からみ
て、Fcεγとζとは、溶解メカニズムに結合する場合、相互に交換できることが
示唆される(Romeo et al.,Cell 68:,899(1992))。
2.腫瘍を持つ哺乳動物のPLCγとGAPの発現低下
ウェスターン法により、PLC-γに対する抗体(Upsta
te Biotechnologies Inc.,Lake Placid,N.Y.,1:5000で希釈)と抗GAP(同
社,1:2000で希釈)を用いて行った実験データでは、腫瘍を持つマウスでは両
抗体ともに発現が低下したことを示している。さらに、これらのシグナル変換媒
介物質を癌患者において試験したところ、PLC-γは低下したが、GAPは必ずしも
低下することはなかった。
3.腫瘍を持つマウス(TBM)のキナーゼ機能の低下
LckとFynのキナーゼ機能(リン酸化能力)の試験を行ったところ、腫瘍を持つ
マウスにおいて二つながらキナーゼ機能が低下したことを認めた。
癌患者のTリンパ球の特性とタンパク質発現のレベル
同様に、ヒト癌患者においては、健康な、即ち腫瘍を持たない対照と比較して
、CD3ζタンパク質の発現が検出できないか、顕著に低下していた。ヒト癌患者
におけるCD3ζタンパク質の発現の分析も、ウェスターン法によって行った。例
えば、腎臓細胞腫患者二名、眼のメラノーマから肝臓に転移している患者一名、
および健康な対照一名から末梢血液を採取し、先ずリンパ球を単離、さらにこれ
から同数の細胞と等量のタンパク質を単離した。健康な対照では、CD3ζタンパ
ク質の発現が検出された。対照的に、腎臓細胞腫患者一名、および眼のメラノー
マから肝臓に転移している患者一名のサンプルからはCD3ζの発現は検出されな
かった。第二の腎臓細胞腫患者では、CD3ζタンパク質の発現は、
95%低下していた。これらの患者各々の癌存続期間は、30日以上であった。
癌が進行すると、Tリンパ球の免疫抑制につながって行く。養子免疫療法にお
けるT細胞の抗腫瘍効果の喪失は、CD8+の細胞毒性機能の顕著な低下およびタン
パク質の発現の変化と相関関係がある。
メラノーマ、腎臓細胞腫、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫患者のデータで
は、抗ζ抗血清387を用いて測定したところ、若干の患者でCD3ζ鎖の発現が著し
く低下したことが認められている(データは、Dr.Alan Weissman,NCIより恵贈
された)。さらに、Fyn(UBI)、Lck(UBI)、およびPLC-γ(UBI)の低下も認
められている。
免疫が抑制されたT細胞のタンパク質発現の変化としては、TCRサブユニットタ
ンパク質であるCD3ζとCD3γの発現が完全に欠失したか、顕著に低下したこと、
Fcεγが出現したこと、シグナル変換経路のタンパク質、特にLck、Fyn、PLC-γ
およびGAPの発現が低下したことが挙げられる。これらの変化と相関関係を持ち
ながら、Ca2+を動員する能力が失われ、チロシンリン酸化のパターンが変化する
のである。
30日より長期にわたって腫瘍を持っているヒト癌患者三名においても、CD3ζ
の発現が完全に欠失するか、顕著に低下したことが観察されている。CD3ζや、C
D3γなどのTCRサブユニットタンパク質の発現が低下した、
Tリンパ球にFcεγが発現した、Lckや、Fynなどのシグナル変換経路タンパク質
の発現が低下した。これらと相関関係を持ちながら、T細胞の機能も同様に変化
し、細胞毒性が失われ、刺激を受けるべき能力も失われた。通常はCD3ζをも発
現するNK細胞が、CD3ζの発現が失われるのとともに、免疫反応性の低下を示す
ことがありそうである。
メラノーマ患者では、NFκB/relタンパク質のパターンが非癌状態のパターン
とは異なっており、c-relとc65とが核調製物から姿を消していた。この結果は、
癌検出のためにNF-kB/relパターンの分析の使用を裏付けるものである。動物モ
デルでは、このパターンの変化は、CD3ゼータの発現レベルよりも早く検出でき
るので、ヒト癌患者においてもこのパターンの分析によって、本発明のその他の
検定法よりも早期検出が可能となりうる。臨床徴候前に検出すること、即ちスク
リーニング検定法が考えられる。
免疫抑制検定法
本発明の一態様は、免疫抑制のレベルを測定する検定法を提供することである
。これらの検定法は、例えば養子免疫療法、あるいは器官移植について患者の適
否を評価する上で有用である。検定は、Tリンパ球の免疫抑制のレベルを予告す
ることで知られているタンパク質を選んで、このタンパク質の発現の変化を測定
する。検定対象として選択するタンパク質としては、
TCRサブユニットまたはシグナル変換経路のタンパク質一個、あるいは両タンパ
ク質の組合せ一セットなどが挙げられる。こうして選んだCD3ζやCD3γなどのTC
Rサブユニットタンパク質の発現が低下したり、あるいは、Lck、Fyn、PLC-γま
たはGAPなどのT細胞シグナル変換経路タンパク質の発現が低下したり、あるいは
、T細胞またはT細胞サブセットでFcεγの発現が増加したりすることは、免疫が
抑制されている状態を示すものである。Tリンパ球またはT細胞サブセットでのタ
ンパク質の発現の変化は、効果的な養子免疫療法に必要とされるT細胞を刺激す
る能力の喪失に関連している。
一般に、TCRタンパク質の発現と、免疫抑制との間には明確な関係がある。す
なわち、タンパク質の発現が低下するにつれて、免疫療法に対する細胞の反応も
低下する。悪性腫瘍の進行に対するヒトやその他の動物の反応は、ネズミの体内
で観察されたのと同じ方向に反応する。
また、TCRサブユニットタンパク質、シグナル変換経路タンパク質、あるいはN
FκB/relタンパク質系の転写因子のパターンを分析して、免疫抑制検定を行う
。パターンとしては、タンパク質少なくとも一個の存在の有無を挙げることがで
きる。また、パターンが、ウェスターン法または同様の方法によって測定して、
存在、不存在それぞれ0または1のベクトル量であることもある。この系の成分
に対する抗体は、タンパク質の存在、
不存在を測定するのに有用である。正常状態では存在していなければならないタ
ンパク質が、異常状態では一以上の分子量が異なるものに置き代わっている場合
がある。このような場合、置き代わったタンパク質中には存在してないタンパク
質に対する抗体は、置換が既に行われてしまったか、否かを確かめるために使用
することができ、このとき置換が行われてしまっていたら、複合体は形成されな
い。
タンパク質発現のレベルの測定方法
TCRサブユニットタンパク質、Fcεγ、あるいはT細胞シグナル変換経路の発現
レベルは、免疫抑制検定に用いるのに好適である。これには、タンパク質一種を
単独使用しても良いし、一種以上を併用しても良い。従来の方法、よく知られて
いる方法のうち、多くの方法がTリンパ球のタンパク質の発現レベルを評価する
のに適している。患者から組織あるいは血液などの体液のサンプルを採取し、TC
Rサブユニットタンパク質、Fcεγ、またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパ
ク質の発現レベルを測定する。サンンプルは、腫瘍組織、脾臓組織、リンパ系組
織、末梢血液細胞、能脊髄液、胸膜滲出液、および腹水など各種の組織から採取
する。
組織サンプルや、細胞サンプルからタンパク質抽出物を作って、これを分析し
て直接タンパク質の発現レベルを測定する。これとは別に、T細胞、あるいはT細
胞サブセットを精製した後、タンパク質の発現レベル
を測定する方法もある。T細胞やT細胞サブセットの精製は、ロゼット形成といっ
た従来からある技術のいずれかと、それに続くフィコール−ハイパック(Ficoll
-Hypaque)勾配遠心法、間接パンニング法、抗体/補体媒介細胞毒性法、免疫磁
気精製法、流動細胞計測法その他同様の方法などによって行う。さらにCD3εな
どの抗体を使って、TCRの免疫沈降(immunoprecipitation)を行うことができる
。TCRからなるサブユニットタンパク質は、当業者に周知の方法によるウェスタ
ーン法を用いて分析する。
タンパク質発現のレベルは、免疫蛍光法、ELISA、ウェスターン法その他同様
の技術など周知の方法を使って測定する。これら周知の方法でタンパク質を分析
する場合、組織サンプル、体液サンプル、あるいはこれらのサンプルから採取し
たT細胞や、T細胞サブセットから抽出物を作成する。既知のラベルと共役させて
、当業者に周知の方法により特定のタンパク質検出に特異性を持つ抗体を作るこ
とができる。
タンパク質発現検定法による器官移植の臨床分析
本発明の方法は、器官組織の移植のモニターリング、および促進に有用である
と考えられる。現在のところ、移植に予定されている患者には、術前に各種の治
療を実施して免疫寛容のレベルを上昇させようとする。これら治療のうちには、
白血細胞や、全血を反復輸血することがある。
本発明の溶解性免疫抑制因子を製薬的に許容できる賦形剤に配合して、患者に
投与すれば、免疫抑制が誘導される。有効量は経験的に決定される。
移植手術の準備段階で、特定TCRサブユニットタンパク質、Fcεγ、およびTリ
ンパ球シグナル変換経路のタンパク質をモニターし、患者の免疫抑制のレベルを
測定、したがって移植が実施出来る程度まで患者の免疫系が抑制されたことを確
認することができる。
本発明の方法により患者の免疫抑制のレベルを測定し、その情報が提供される
ので、免疫寛容を維持するための施術をタイミング良く行うことができる。本発
明のスクリーニング法により免疫抑制を増進する薬剤が開発されている。この薬
剤は、移植患者の術前準備と管理に有用性があると期待されている。
免疫療法対象患者の選別
医師が治療戦略を決める場合、患者自身のTリンパ球のTCR関連タンパク質の発
現を検定し、患者の免疫抑制のレベルを分析して、細胞を刺激して効果のある免
疫療法を行うことができるか、成否を予測する。この予測は、患者自身の細胞を
使用する療法、例えばサイトカイン療法や、自系養子療法の場合に有用である。
さらに、患者自身のT細胞の免疫が抑制されている場合、本発明によりT細胞を分
析されたT細胞を、同種異系または同系治療プロトコルのために、選択すること
が考えられる。養子免疫療法が考慮されない場合であって
も、免疫抑制のレベルを分析していれば、抗菌剤、免疫刺激剤などの投与時期の
決定において医師の役に立つことが期待される。もう一つの用途として、自己免
疫の場合または移植手術前、免疫抑制をモニターして置いて、投与しようとする
抑制剤の至適濃度を決定すること、および移植のタイミングを決定することがあ
る。
特定タンパク質の発現のレベルあるいはパターンによって免疫療法、例えば自
系養子免疫療法の患者を選別する。選別基準は、発現のレベルおよび/またはパ
ターンがリンパ球の刺激に対する反応のしきい値以下であってはならないことで
ある。リンパ球の刺激に対する反応のしきい値のレベルは、疾患と特定タンパク
質の組合せ毎に経験的に誘導し、さらに正常な免疫反応を示すと考えられる個体
とも関連させる。例えば、特定タンパク質と特定疾患のある組合せにおいて、自
系免疫療法を効果あるものにするためには、健康な個体と実質的に同等なレベル
でこの特定タンパク質が生成されなければならないとされる場合もあろう。ある
いはまた、特定タンパク質と疾患の別の組合せにおいて、この特定タンパク質の
比較的に低いレベルでも、自系養子免疫療法が効果あるものとなることもあろう
。
さらに、ノザンハイブリッド形成法(Northern hybridization)またはin sit
uハイブリッド形成法(in situ hybridization)を含む各種方法によって、T細
胞や、
T細胞サブセット中の特定タンパク質をコード化している遺伝子を確認する方法
もある。この遺伝子がTリンパ球でのみ発現することが分かっていれば、組織サ
ンプルや、細胞サンプルからRNAを単離する。さらにまた、従来法を用いてこれ
らのサンプルからT細胞あるいはT細胞サブセットを作り、これを精製することに
よってRNAを得ることができる。RNAは、標識DNAまたはハイブリッド形成プロー
ブとハイブリッドを形成し、特定タンパク質をコード化しているmRNAを特異的に
検出する。
さらにまた、養子免疫療法の患者の選別は、その患者の発現率を基準にして行
う。発現率(E.R.)は、特定TCRサブユニットタンパク質、またはTリンパ球シ
グナル変換経路タンパク質を発現するT細胞の数を、計測したT細胞の全数で割っ
たものである。発現率は、例えば次の文献において説明されている方法により、
二色または三色流動細胞計測計(two-color or three-color flow cytometry)
を用いて測定することができる。Current Protocols in Immunology,Vol.I,J
.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach and W.Str
ober(eds.),Green Publishing Associates and wiley-Interscience,5.1.1
-5.4.15(1991)、この文献は引用することにより本明細書の一部とする。
膜の内側にあるTCRの成分、またはシグナル変換経路の成分については、細胞
が標識まで透過できるように
してある。例えば、患者から単離されたリンパ球は、各々異なる染料と共役して
いる、二つの異なる抗体に暴露される。そのうち、一つの抗体は、特定のTCRサ
ブユニットタンパク質あるいはTリンパ球シグナル変換経路タンパク質を発現す
る細胞を検出するために用いられるもので、フルオレセインイソチオシアネート
(FITC)などの染料と共役している。第二の抗体は、CD3などすべてのT細胞中の
タンパク質と結合するもので、フィコエリトリンなどの第二の染料と共役してい
る。特定TCRサブユニットタンパク質またはTリンパ球シグナル変換経路タンパク
質を発現するT細胞のフラグメントは、流動細胞計測計を使い、サンプルを分析
して測定する。
上記のように、タンパク質の発現のレベルあるいはパターンによって、自系養
子免疫療法の患者を選別する。選別基準は、発現がリンパ球の刺激に対する反応
のしきい値以下であってはならないことである。リンパ球の刺激に対する反応の
しきい値のレベルは、疾患と特定タンパク質の組合せ毎に経験的に誘導する。
例えば、特定タンパク質と疾患のある組合せにおいて、自系免疫療法を効果あ
るものにするためには、少なくとも50%のT細胞がこの特定タンパク質を発現(E
.R.=0.5)しなければならないとされる場合もあろう。あるいはまた、特定タ
ンパク質と疾患の別の組合せにおいては、この特定タンパク質は少なくとも70%
のT細胞によって発現(E.R.=0.7)されなければ自系養子免疫療法
が効果あるものとはならないこともあろう。特定タンパク質と疾患のさらに他の
組合せでは、p65の存在が必要となる場合もあろう。
化学療法と放射線療法の効果および
癌手術のモニタリング
化学療法、放射線療法、あるいは手術が効果があって、腫瘍の大部分を取り除
くことができる場合には、免疫抑制されていたタンパク質は正常なレベルとパタ
ーンに戻る。このような改善を本発明の方法によってモニターする。
従来の治療方法とプロトコルを使用して、本発明の方法を補完することが考え
られる。非生物治療法、例えば化学療法を用いて、腫瘍の大きさ、患者の負荷が
減少するにつれて、免疫抑制のレベルも低下する。さらに、本発明の方法により
免疫抑制を逆転する薬剤を決定する。これらの治療を実施し、薬剤を投与した後
で、自系養子免疫療法によって補完する。本発明の方法により患者の免疫抑制の
レベルを測定、例えば特定のTCRサブユニットタンパク質、Tリンパ球のFcεγ、
およびNF-kB/rel系のタンパク質を測定して自系養子免疫療法の効果的なタイミ
ングを予測する。
自系養子免疫療法を補完するのに好適な方法としては、手術、放射線、あるい
は化学療法剤や、一般医薬品による治療を挙げることができる。化学療法剤、一
般医薬品の例としては、すべてのサイトカイン類、シ
クロホスファミド、アドリアマイシン、ステロイド類、フラボノイド類、および
IL-2、成長ホルモン類、シメチジン、クロロキン、アスピリン、イブプロフェン
、インドメタシン、およびレバミゾールなどの腫瘍の大きさや、負荷を縮小する
薬剤がある。
Tリンパ球の免疫抑制を阻止する異なる幾つかの方策がある。組替え法でTリン
パ球の免疫療法活性を回復する。また、免疫抑制されている細胞に特定タンパク
質をコード化している遺伝子からなる発現ベクターを導入すると、免疫抑制細胞
の特定TCRサブユニットタンパク質や、Tリンパ球シグナル変換経路タンパク質の
発現レベル、あるいはNF-κB/relが回復する。組替え加工された細胞で遺伝子
が発現すると、リンパ球に正常レベルのタンパク質が回復する。これらの組替え
加工されたリンパ球を刺激して、ここで説明する補完方法の何れかを併用する養
子免疫療法を実施する。
リポゾームデリバリーシステム
IL-2などの遊離サイトカイン類は、本発明の方法に好適であるが、サイトカイ
ンをリポゾーム中に組み入れてデリバリー(送達)システムとすることが好まし
い。リポゾームはリン脂質賦形剤で、リポゾーム製造に用いた溶質とリン脂質の
相互作用如何ではあるが、サイトカインその他の生活性化合物の指定量を収容す
ることができる。リポゾーム埋封サイトカイン類の製造方法はアメリカ合衆国同
時係属出願第07/382,778号
において開示されている。この開示すべてを引用することにより本明細書の一部
とする。
リポゾームに好適な投与経路はいくつかあり、例として静脈注射、皮下注射、
腹腔内投与、経口投与を挙げることができる。生活性成分の遊離剤形と比較して
、リポゾームデリバリーには組織分布と結合特性が優れていると言う長所があり
、治療指標は上昇し、毒性は低下する。
IL-2リポゾームによるマウスの治療
(14日に渡って腫瘍を持つ)マウスにIL2-リポゾームを腹腔内投与(50,000U
/マウス/1日×5日間)して、二つの実験を行った。マウスを腫瘍注入後32日
目に殺して、脾臓リンパ球のζ発現を検討した。IL2-リポゾームを投与したマウ
スにおいて、ζ鎖は正常レベルであったが、無処置のマウスでは、この鎖の発現
は完全に欠失していた。したがって、IL2-リポゾームは、ζが腫瘍に誘発されて
欠失するのを防止している可能性がある。しかしながら、リポゾームがT細胞を
非特異的に膨張させるため、膨張した集団によってζの欠失が隠されている可能
性も否定できない。
刺激したT細胞の臨床使用
本発明の一態様では、刺激したT細胞を採取し、有機体の本体、好ましくはマ
ウス、ヒトなどの哺乳動物中にこのT細胞を入れた後、IL-2を投与すると、免疫
療法の作用、例えば細胞毒性作用や、リンホカインの生成
が推進される。より好ましくは、この細胞を人体中に入れて免疫療法で治療する
。この細胞は、S.A.Rosenbergのアメリカ合衆国特許第4,690,915号で開示され
ているものを含む従来から周知の方法と経路の何れを用いても、患者に投与する
ことができる。上記の特許は引用することにより本明細書の一部とする。経路の
例としては、静脈内、動脈内、腔内(intracavitary)の投与があり、胸膜腔内
、腹腔内、鞘内、嚢内などの投与を含む。
一般に、in vivoでIL-2の有効量を投与すると、細胞の増殖と抗腫瘍活性が昂
進する。IL-2の投与期間は、好ましくは約7日間である。in vlvoで細胞増殖と
免疫療法活性を昂進させる有効量は、治療を受けている哺乳動物如何にかかって
いる。例えば、マウスの投与量は、IL-2 10,000〜70,000単位/1日、好ましく
はIL-2約50,000単位/1日であるが、ヒトの投与量は、約1×106ないし6×106
国際単位/m2/1日である。
前章で説明した通り、T細胞は、始めにIL-2の有無にかかわらず抗CD3 MAbで24
時間以下刺激することが好ましい。所望の場合、IL-2と抗CD3 MAbとを初度培養
に入れることを本発明の一部とする。ただし、このことは適当であり、同様の結
果を得ることができるが、少なくともIL-2のため望ましくない費用がかかるので
必ずしも好ましくはない。むしろ、細胞を抗CD3 MAbだけでで刺激し、刺激した
細胞を採取して、免疫抑制された
哺乳動物に注入し、その後IL-2を哺乳動物に投与することが好ましい。
インターロイキン2は、市場から入手できるT細胞成長因子である。ラットス
プレノサイテス(rat splenocytes)の培養物、あるいはジャーカット細胞系(J
urkacell line)から誘導される天然産IL-2でも、また組替えIL-2(rIL-2)のど
ちらでも好適である。本発明においては、この他のサイトカインを用いて、サイ
トカイン-活性化細胞を生成することができるをと信じられている。これには、
天然サイトカイン、組替えで生成したサイトカインのどちらを用いても良い。こ
れらのものの例としては、IL-1、IL-4、IL-6、IL-12、TNF、GM-CSFインターフェ
ロンなどがある。使用方法としては、サイトカイン一種の単独使用、IL-2を含む
他のサイトカインとの併用で、併用するサイトカインを培養基に添加したり、患
者に投与するなどがある。rIL-2、フラボノイドと化学療法剤の併用は、少なく
とも動物モデルにおいて腫瘍を縮小するのに有効である(Wiltroutetal.,1991
)。この抗腫瘍反応にはT細胞を欠くことはできない。Current Protocols in Im
munology,Vol.I,J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M
.Shevach and W.Strober(eds.),Green Publishing Associates and Wiley
-Interscience,2.4.1-2.10.3(1991)。
免疫回復剤の使用
本発明の方法を用いて決定した免疫回復剤は、免疫抑制を逆転することができ
るので、進行性免疫抑制を特徴とする疾患の治療に有用であると考えられる。こ
れは、先ず哺乳動物のTリンパ球標本を用意する。ただし、この標本は、TCRサブ
ユニットとシグナル変換経路の特定タンパク質うち少なくとも一種の発現レベル
またはNF-kB/relタンパク質のパターンが、健康な、免疫抑制がない同一の哺乳
動物種個体と比較して正常値以下である。このリンパ球標本を試験対象薬剤、一
般には免疫抑制を逆転すると思われている薬剤の存在下で培養する。その後特定
タンパク質の発現レベルおよび/またはパターンを測定する。また、TCTサブユ
ニットタンパク質、またはTリンパ球シグナル変換経路タンパク質の発現が正常
値以下の患者にこの薬剤を投与し、治療後にこの患者からサンプルを採取して前
記のタンパク質の発現レベルを測定する方法をとっても良い。
このようにして得た薬剤は、TCRサブユニットあるいはTリンパ球シグナル変換
経路の特定タンパク質の発現のレベルを顕著に増加させ、および/または、NF-κ
B/rel系のタンパク質の存在を回復することができる。したかって、この薬剤
は病気の動物あるいは人間の免疫抑制を逆転する方法となる。投与方法としては
、任意にこの薬剤を単独投与するか、あるいはT細胞表面レセプター抗体および
/またはサイトカインと併用投与して、リンパ球を刺激して患者の免疫抑制を逆
転させ
る。また、患者からリンパ球を単離してin vitroで薬剤により処理し、養子免疫
療法として患者に投与しても良い。例えば、リンパ球をフラボノイドの存在下で
培養することもできる。このようにして得たリンパ球は、in vitroまたはin viv
oで刺激する。この場合、リンパ球の単独使用でも良いし、T細胞表面レセプター
抗体および/またはサイトカインと併用しても良い。
患者によっては薬剤のある組合せには反応しないが、他の組合せには反応する
ことがあるので、この点を確認評価する。例えば、抗CD3に反応しない患者が、
フラボノイドとIL-2を加えることにより反応するかも知れない。難治であった患
者が、薬剤を追加することで救われることもある。
組替え技術による免疫機能の回復
当業者に周知の方法を用いることによって、特定の遺伝子を担持するベクター
を形成し、このベクターを免疫抑制されているT細胞に導入することができる。
免疫機能を回復するため、免疫回復剤をコード化している遺伝子をベクターに含
ませる。この遺伝子は本発明の免疫抑制因子に対するアンチセンス遺伝子にもな
り得る。遺伝子はプロモーターに結合する。このプロモーターは一般に調節可能
なプロモーターである。リン酸カルシウムトランスフェクション、あるいはエレ
クトロポーレーション(electroporation)によるトランスフェクションなどの
周知のトランスフェクションプロ
トコルを用いて、ベクターをTリンパ球内に導入する。この特定遺伝子は、周知
のベクター、例えばレトロウイルスベクターを使って、T細胞内に導入されて、
発現する。Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.
(eds.),Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience,9.0.1-9.
14.3(1989)。
CD3ζ鎖の再発現
下記の併用剤の何れかを含有する組織培養基(RPMI1640+添加剤、ただしウシ
胎児血清は加えていない)により、腫瘍を持つマウスから採取したリンパ球を48
時間培養したところ、CD3ζ鎖が再発現した。
A.イノマイシン(1μg/ml)
(Calbiochem,La Jolla,CA)
B.イノマイシン+ホーボルミリスティックアセテート
(10ng/ml)(Phorbol Miristic Acetate)
(Chemsyn Science Labs.,Lenexa,Kansas)
C.イノマイシン+IL2(300U/ml)
D.イノマイシン+PMA+IL2
E.イノマイシン+抗CD3+IL2
F.抗CD3モノクロナール抗体(10mg/ml)
G.フラボノイド類+IL-2
H.抗CD3+フラボノイド類
免疫抑制剤の使用
本発明の方法により決定された免疫抑制剤は、自己
免疫性疾患の治療に有用であると考えられる。この点で特に興味のあるものは、
T細胞の免疫抑制の原因である腫瘍から形成した溶解性因子である。これらの薬
剤の決定方法は、次の通りである。先ず、哺乳動物のリンパ球の標本を用意する
。この標本では、少なくとも一種のTCRサブユニットの特定タンパク質またはシ
グナル変換経路のタンパク質が健康な同一の哺乳動物種個体と比較して正常であ
る。また別に、NF-kB/relのパターンが変化したか、否かの検定を行う。このリ
ンパ球標本を、免疫抑制を起こすと考えられる薬剤の存在下で培養し、前記タン
パク質の発現のレベルおよび/またはパターンを測定する。あるいは、この薬剤
を健康な個体に投与し、TCRサブユニットの特定タンパク質のうち少なくとも一
種、またはリンパ球シグナル変換経路のタンパク質の発現のレベルを測定する方
法によっても良い。薬剤を単離した後、免疫抑制している上澄み液を分画して活
性画分を探すことによりさらに精製し、定量分析法を適用して因子の特性を同定
する。
このようにして得た薬剤は、TCRサブユニットの特定タンパク質またはTリンパ
球シグナル変換経路のタンパク質の発現のレベル、および/またはNF-kB/relの
パターンを低下させることができる。したがって、これらの薬剤は、動物または
ヒトにおいて免疫抑制を誘導する方法となる。これらの薬剤、すなわち本発明の
溶解性免疫抑制因子は哺乳動物に投与する。あるいは、
少なくとも溶解性因子の免疫抑制を起こす部位をコード化するヌクレオチッド配
列を、一般には服用動物の細胞にトランスフェクトした後、哺乳動物に投与して
も良い。
本発明の特異性があり、且つ最良の実施態様を次の実施例により説明する。こ
れらの実施例は、如何なる方法においても本発明を限定するものと解釈してはな
らない。さらにまた、本発明の精神と範囲内に留まりながら多くの変化または変
更が可能であることを理解すべきである。
実施例1
長期腫瘍を持つマウスから単離した
T細胞の抗腫瘍効果の欠失
長期TBMからT細胞を単離して、養子免疫療法に使用しても何らの抗腫瘍効果も
検出することはできない(本発明に言う「長期」は「後期」と互換できるものと
する)。C.M.Loeffler et al.,Cancer Res.,51:2127(1991)で説明されて
いるように、T活性化キラー(T-AK)細胞の世代は立証されている。この文献は
引用することにより本明細書の一部とする。C57BL/6ネズミスプレノサイト(m
urine splenocytes)をフィコール−パック勾配遠心法(Ficoll-Paque Gradient
)により処理して、リンパ球を単離した。HBSS(GIBCO,Grand Island,NY)で
二回洗った後赤血球(RBC)を蒸留水で溶解し、残りの単核細胞数を計算した。
その後、細胞をマウスT細
胞急速アフィニテイクロマトグラフィカラム(Biotex Laboratories Inc.,Edmo
nton,Canada)に置いて、T細胞を濃縮した。細胞はHBSSで二回洗い、抗CD3 MAb
(145-2Cll)とIL-2(比活性1.5×107U/mg;Hoffmann-LaRoche Inc.,Nutley,
NJ)で活性化した。T濃縮細胞は、濃度1.5×106細胞/mlのRosewell Park Memor
ial Institute(RPMl)1640(GIBCO,Grand Island,NYから入手)からなるTCM
、これにHEPES[N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸
)]25mM、L-グルタミン 2mM、ウシ胎児血清 5%、ペニシリン100U/ml、スト
レプトマイシン 100μg/ml、非必須アミノ酸 10mM、ピルビン酸ナトリウム
100mM、および2-メルカプトエタノール 25μMを添加してある培養フラスコで
、インキュベートした。T-AK細胞を発生させるため、TCM 1mlにつき145-2Cll M
Ab 25μgを加えた。細胞は5%CO2の気流下37℃で一晩インキュベートした後、採
取して、HBSSで二回洗い、IL-2 30U/mlを含むHBSS中に再懸濁し、細胞数を計算
して、マウスに注射した。
リポゾームに包埋したIL-2(IL-2リポゾーム)と併用するT-AK細胞の治療効果
の判定方法を、C.M.Loeffler et al.,Cancer Res.,51:2127(1991)で説明
されている通りに作成した。この文献を引用することにより本明細書の一部とす
る。
MCA-38細胞約3.0×105個をHBSS 0.5m1に懸濁したものを、30ゲージの注射針を
用いて生後6〜8週のC57BL/
6マウスの脾臓内に注射した。C57BL/6マウス少なくとも10匹により各群を構
成した。3日後、健康マウス、初期TBM(14〜21日間存続の皮下腫瘍)、後期TBM
(30日間以上存続の皮下腫瘍)、それぞれに由来するT-AK 4.0×107をマウスの
静脈内に一回投与した。さらに、腫瘍接種後3〜7日間、1日1回IL-2リポゾー
ム(1日当り50,000U)をマウスに腹腔内投与した。腫瘍接種後12日目に各群の
肝臓転移数を評価した。マウスに麻酔を施し腸間膜静脈に15%墨汁(India ink s
olution)2m1を注射した。肝臓を摘出してFekete液(70%エタノール300m1中に
ホルマリン30m1および氷酢酸15m1を配合)中にいれた。肝臓転移数を計算した後
、スチューデント法により動物群間の差異の意味を評価した。
図1のデータは、三つの異なる実験の代表的な成績を示している。未処置のマ
ウスでは、11日目までに236±30の肝臓転移が起こっていた。腫瘍を持たないマ
ウス(「健康」)のT-AK細胞で処置したマウスでは、99±23の肝臓転移があった
反面、初期TBMから形成したT-AKではさらに大きく減少し、48±16の転移であっ
た。後期TBMからのT-AK細胞は、何らの治療効果を示すことが出来ず、転移数は2
229±41であった。T-AK細胞は、後期TBMから形成すると、治療効果が劇的に低下
する。
実施例2
長期TBM由来Tリンパ球の
In Vitro細胞毒性の著しい低下
長期TBM由来リンパ球のin vitro細胞毒性が、非悪性状態から著しく低下して
いる。このため、T-AK細胞をエフェクターとする標準クロムリリースアッセイ(
chromium release assay)を行った。このT-AK細胞を、先ず抗CD3で刺激した後
、rIL-2 100Uと共に培養基中に保持した。検定は、培養第2日目、第4日目、第
7日目に実施した。標的腫瘍(4×106/ml)は、Na51CrO4(1000μCi/ml;New
England Nuclear Products,Boston,MA)150μCiと共に37℃で60分間インキュ
ベートした。標的腫瘍はTCMで二回洗い、培養基中に再懸濁し、細胞数を計算し
た。T-AKエフェクター細胞を二回洗い、U型底マイクロタイタープレート(Costa
r)中で三個づつアリコートを生成した後、二倍の連続希釈を行って、エフェク
ター:標的細胞の比率が24:1〜3:1となるように連続して二倍に希釈した。
ウェル1個につき標的細胞5,000個を加えた。自発リリースウェル(spontaneous
release well)には、培養基中の標的細胞のみを入れた。最大リリースウェル
(maximum release well)には、洗剤中の標的細胞を入れた。プレートは、5%C
O2の気流下で37℃で4時間インキュベートした。上澄み液を採取して、ガンマー
カウンター(LKB 1272)で放射能を測定した。比細胞毒性は、次の式によりパー
センテージを計算した。
培養第2日目では、細胞毒性活性は初期TBM細胞が一貫して最も高く(図2)
、腫瘍なし細胞(健康)、あるいは後期TBM細胞のそれは低かった。培養第4日
目において、健康マウス由来細胞の溶解機能が顕著に増加したが、それでも初期
TBMの溶解機能が最高であった(図3)。後期TBMリンパ球の溶解機能が最低であ
った。
培養開始後7日で後期TBMリンパ球の溶解機能が、とにかく著しいと言える程
度増加した(図3)。同系の標的細胞MBL2(リンパ腫)、および同種異系の標的
細胞RENCA(腎臓細胞腫)に対しても溶解活性を示すのが観察された。細胞毒性
の絶対レベルは標的によって異なっていたが、初期TBM細胞が一貫して最も効果
が高く、後期TBMの活性が常に最低であった。
初期および後期TBM由来のCD8+-濃縮標本を作成し、これを用いて細胞毒性の検
定を行った。濃縮T細胞標本は、キットのマニュアルに従って、T細胞カラム(Bi
otex Laboratory Inc.,Edmonton,Canada)を経由して、単個細胞スプレノサイ
ト(splenocyte)懸濁液を通過させて作成した。CD8+細胞に対して濃縮するため
に、T濃縮細胞を抗L3T4(500μg/ml;Becton Dickinson,Mountain View,CA)
1μg/1.0x106個と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞は、HBSSで二
回洗った。FC-特異性ヤギ抗マウスIgGを塗布した磁気ビーズ(Advanced Magneti
cs Inc.,Cambridge,MA)をPBSで二回洗い、PBSと共にインキュベートし、ビー
ズ:細胞比率を
25:1として、4℃で30分間T濃縮細胞と混合した後、磁気分離機(Advanced Ma
gnetics)で分離した。最後のステップは二回繰り返した。結合していない細胞
を除き、HBSSで二回洗った。CD8+濃縮細胞には、汚染細胞であるCD4+が2%含ま
れていた。濃縮細胞標本の発現型を分析した結果ではCD8+含量は95%以上であっ
た。
CD8+濃縮細胞は、非分離のリンパ球と同様の溶解活性を示した(表1)。ごく
小数の汚染細胞の効果との混同を避けるため、さらにCD8+細胞をFACSによって正
の分別を行い、抗CD3+IL-2と共に培養し、溶解機能を試験した。さらに、新鮮
はスプレノサイト(splenocyte)標本(Thy1.2+細胞95%以上)のT濃縮細胞からF
ACSにより正の細胞選択(positive cell selecion)を行った。これにより得た
細胞を、抗Lyt.2 FITCおよび抗L3T4(500μg/ml;Becton Dickinson)1μg
/1.0×106個と共に4℃で30分間インキュベートした。これらの細胞をFACStar
Plus流動細胞計測計(Becton Dickinson)上でFITC+(CD8+細胞)とPE+(CD4+細
胞)とに分別した。
初期TBMCD8+リンパ球の溶解活性は、やはり最高で、後期TBM細胞のそれは、最
低であった(表1)。すべての実験において、エフェクター細胞が濃縮T細胞で
あっても、濃縮CD8+であっても、あるいはまた純粋なCD8+であっても、同様な成
績であった。培養開始の7日後、後期TBMCD8+細胞の細胞毒性が増加したが、こ
れはもともと抑制されていたCD8+の溶解機能が増加したためか、
あるいは抑制されることがなかったCD8+の小さなサブセットが大きくなったため
であると思われる。
実施例3
健康マウス、初期TBMおよび後期TBM
の新鮮なスプレノサイト(splenocyte)から形成した
T濃縮細胞の発現型分析
後期TBM細胞の活性が異常であることと、T細胞のサブセットまたは分布が大き
く変化していることとは関連性がない。溶解機能が異なるのはTリンパ球のサブ
セットのパーセントが互いに異なっているのが原因であるか、否かを確認するた
め、次の方法により発現型を分析した。マウス各群から採取した新鮮なスプレノ
サイトをT細胞に対して濃縮し、精製して汚染腫瘍細胞を取り除いた。Thy 1.2+
含量が95%以上の細胞標本からデータを得た。
後期TBMから常にL3T4+集団が減少していたが、顕著には減少していなかった(
表2)。これらのマウスのCD4/CD8比は正常範囲内であった。同一マウス群から
採取して、T細胞に対して濃縮しなかった新鮮スプレノサイトの発現型は、細胞
のサブセット間で顕著な変化があることを示さなかった。したがって、T細胞の
サブセットに大きな差異があることと、後期TBMの異常な活性とは関連性がない
。
実施例4
健康マウス、初期TBMおよび後期TBMの活性化T濃縮細胞
の上澄み液中のリンパ球濃度に大きな差異が観察され
なかったこと
CD4+ヘルパー細胞のサブセットの機能が充分でないことが後期TBMの免疫感度
低下の主たる原因であるか、否かを判定するため、健康マウス、初期TBMおよび
後期TBMの活性化T濃縮細胞の上澄み液中のリンパ球濃度を比較した。上澄み液
のサンプルは、24時間目、48時間目および72時間目で採取した。IL-1αはmouse
Interest I-α ELISA(Genzyme,Cambridge,MA)を用いて測定した。生物活性
タンパク質はIL-1マウス胸腺リンパ
球バイオアッセイを用いて確認した。IL-2濃度はIL-2エライザキット(Elisa Ki
t;Collaborative Research,Inc.,Bedford,MA)により試験し、IL-2-依存性
細胞系であるCTLL-2(ATCC)を用いるIL-2バイオアッセイによって確認した。IL
-6濃度はネズミIL-6エライザキット(Endogen Inc.,Boston,MA)で測定し、多
発性骨髄腫細胞系T1165(Genetics Institute)を用いるネズミバイオアッセイ
で確認した。総ネズミインターフェロンはL929(ATCC)ウイルスバイオアッセイ
のより測定した。TNF-α濃度は1929マウス繊維芽細胞細胞系(ATCC)によって測
定した。
三つの異なる実験において、初期および後期T-AK培養物で測定したリンパ球濃
度に大きな差異はなかった。三つの内の二つの実験の培養開始48時間後のデータ
を表3に示す。これら二つの実験においても、溶解機能に顕著な差異が認められ
た。したがって、健康マウス、初期TBMおよび後期TBMの活性化T濃縮細胞の上澄
み液でのリンホカインの生成は、定量的にも、定性的にも同様であった。
実施例5
後期TBM由来のCD4+細胞
が充分なヘルパー機能をもっていること
後期TBMのCD4+リンパ球はヘルパー細胞としては、健康動物由来のCD4+よりも
活性である。後期TBM由来CD4
細胞は、健康CD8+細胞の溶解機能を増進するのか、あるいは抑制するのかを試験
するため混合実験を行った。精製したCD4+およびCD8+リンパ球を、サイズ4μmの
細孔を有する膜で分離した24mmウェルで一緒に培養した。このサイズの細孔では
溶解性成分が自由に交換できる。培養2日目に細胞毒性の検定を行った。
健康動物のCD8+細胞の溶解活性は、後期TBM由来のCD4+細胞と共に培養した時
には、CD4+細胞の存在下であった時の溶解活性(204L.U.)と比較して、増加
している(655L.U.)のが認められた(表4)。さらに、後期TBM由来のCD4+細
胞は初期TBMCD8+リンパ球の高い溶解機能(1075L.U.)を補助する上で、むし
ろ健康CD4+細胞(482L.U.)よりも優れていた。後期TBMでは、CD4+リンパ球は
ヘルパー細胞として健康動物由来のCD4+細胞よりも活性か高く、CD8+細胞の機能
を抑制する原因とはなり得ない。
実施例6
後期TBM由来のCD8+細胞が、他のCD8+細胞を
抑制しないこと
後期TBM由来のCD8+細胞には欠陥がある。後期TBM由来のCD8+細胞は、どの起源
のCD4+細胞と共に培養しても溶解機能が劣っている。最も活性が高い初期TBMのC
D4+細胞と共に培養したときでさえも、後期TBM由来のCD8+細胞は、健康マウスま
たは初期TBMのCD8+の総溶解機能の1/3〜1/4でしかなかった。CD4+とCD8+
とが細胞同士で接触できる標準24mmウェルで培養する実験においても、結果は同
様で、ここでもまた後期TBM由来のCD8+細胞は、健康マウスまたは初期TBMのCD8+
の総溶解機能の1/3〜1/4でしかなかった。初期および後期TBMのCD8+両方
を用いる混合実験では、CD8+の溶解活性が他のCD8+サプレッサー細胞によって阻
害されていることを示すものは何もなかった。後期TBM由来のCD8+細胞の細胞毒
性はヘルパー機能が充分に存在する場合でも劣っており、CD8+細胞が腫瘍が媒介
する免疫抑制の標的となっていることを窺わせる。
実施例7
MCA-38細胞培養物の上澄み液による
健康細胞の細胞毒性活性の抑制
後期TBM由来のリンパ球サブセット中で抑制作用がないことは、抑制シグナル
が腫瘍そのものを起源としていることを示唆している。そこで、IL-2の濃度は一
定とし、MCA-38細胞培養物の上澄み液の濃度を上げてゆく滴定試験を行った。リ
ンパ球は、抗CD3で活性化し、
IL-2 100U/mlと共に培養した。培養は濃度1.5×106細胞から始め、細胞数の計
算と細胞毒性の検定は培養3日目に行った。
MCA-38細胞の上澄み液を30%しか含まない培養基で培養したリンパ球の細胞活
性は30〜45%低下した(表5)。
TGF-βは、腫瘍が媒介する免疫抑制に関与していた腫瘍関連サイトカインである
。しかしながら、TGF-βに対する抗体は腫瘍上澄み液の抑制効果を低下させなか
った。バイオアッセイを二回繰り返したが、腫瘍上澄み液にTGF-βの作用を検出
することはできなかった。
MBL-2リンパ腫の上澄み液も同様の抑制効果を媒介していた。したがって、腫
瘍に抑制効果があるのはMCA-38モデル系に限らず、溶解性の腫瘍産物が後期TBM
のCD8+の細胞毒性機能の発現を抑制するのである。
実施例8
細胞毒性タンパク質グランザイムBおよびTNF-β
をコード化するRNAの発現
後期TBM由来T-AKの溶解機能が低下するのは細胞毒性エフェクター分子の生成
と関連するのか、否か検討することを目的として、健康マウス、初期および後期
TBMの濃縮Tリンパ球を起源とする全細胞RNAを分析した。
さらに、除去(depletion)によって得たCD4+とCD8+のサブセットを分析した
。TNF-α、グランザイムB、IL-2、IL-2R、IFN-γおよびIL-6をコード化するRNA
の発現を測定した。18s RNAを用いてゲルに負荷するRNAの相対数量を測定した。
負荷の際の差異を補償するため、18sの発現とTNF-αのグランザイムBとの間のデ
ンシメトリー比率を計算した。
IL-2、IL-2R、IFN-γ、IL-6およびRNAの発現は、初期TBMリンパ球と後期TBMリ
ンパ球との間で差異はなかった。しかしながら、グランザイムB mRNAのレベルは
、培養36時間目において、初期TBMのCD8+細胞が後期TBMのCD8+細胞より10倍高か
った。デンシメトリーの測定によると、後期TBMのCD8+細胞におけるグランザイ
ムB
mRNAのレベルは、培養36時間で健康CD8+細胞よりも著しく低かった。後期TBM
のCD8+細胞におけるグランザムBをコード化するmRNAの発現は、培養8日目にな
って初めて培養36時間の初期TBMのレベルにまで増加した。後期TBMで8日目にな
ってグランザイムBを発現した細胞が小さなフラブメントで、検出可能となるま
でに増殖するのに8日間を必要としたのか、あるいはこの日数があったためにCD
8+が回復して再び細胞毒性機能を持てるようになったのかは不明である。
培養36時間で測定したTNF-α mRNAの発現もまた、健康マウスあるいは後期TBM
と比較して、初期TBMのTリンパ球において最高であった。後期TBMのTリンパ球に
おけるTNF-α mRNAの発現は、培養8日目になって初めて培養36時間の初期TBMの
レベルにまで増加した。
実施例9
後期TBMのTリンパ球におけるCD3ζとCD3γの
発現の著しい変化
対照フレオレセン標識IgG2A、抗マウス αβ(Pharmigen)または抗CD3(145
-2Cll)で標識した後、蛍光強度によりTCR-CD3複合体を測定した。発現型分析結
果では、精製された後期TBM由来T細胞は、CD3+(97%)、Thy1.2+(98%)、αβ
(9(%)およびNK.1-(<1%)であって、正常なCD4(L3T4)/CD8(Lyt2+)
比率を持つことが認められた。健康マウスのT細胞TCR-CD3複合体と後期TBMのそ
れとを比較すると、蛍光強度で見るかぎりTCR-CD3複合体の発
現は両者の間にはっきりとした差異はなかった。しかしながら、TCR発現型分析
に使用した抗体は、TCR-CDS複合体にある鎖7本のうち1本づつにしか結合する
に過ぎなかった。
さらに、125ヨウ素による表面標識、抗CD3(145-2Cll)による免疫沈降(immu
noprecipitation)および二次元非還元性SDS-PAGE(2D non-reducing SDS-PAGE
)による分割を使ってTCR-CD3複合体の分析を続けた。健康マウスと後期TBMそれ
ぞれのTリンパ球約5×107個にラクトペロキシダーゼーグルコースにより125ヨ
ウ素で標識した。 CurrentProtocols in Immunology, Vol. I, J.E. Colig
an,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies, E.M.Sheval and W.Strober (eds
.), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience,8.11.1-8.11.4
(1991)。標識後、TCR複合体を145-2C11 MAbで析出させ、タンパク質G-セファ
ロースに吸収させて、二次元非還元性14% SDS-PAGEで分割した。この結果、後期
TBM由来T細胞のTCR-CD3複合体が大きく変化していることが明かに認められた。
すなわち、CD3ζサブセットが姿を消し、CD3γは著しく減少していた。さらに、
小さなタンパク質に対応する対角線の下に微かなスポットが現れていて、Fcεγ
がTCR-CD3複合体に結び付いたことを示唆している。E.Reinhers,J.Exp.Med.
,175:203(1992)。
さらにまた、健康マウスおよび後期TBMそれぞれのT
リンパ球のTCR-CD3複合体について、表面発現を分析した。健康マウスのTリンパ
球は、αβTi複合体、CD3のδ、εおよびγ鎖、それにζホモダイマーを発現し
た。しかしながら、後期TBMのTリンパ球はCD3ζまたはCD3γ鎖を発現しなかった
。
抗ζまたは抗Fcεγを用いるウェスターン法によってもこの観察が確認されて
いる。すなわち、健康マウスと後期TBMそれぞれのT細胞約2×107個を溶菌バッ
ファー(トリスpH7.4 1mM,NaCl150mM, 0.5%トリトン×100,オルトバナジン
酸ナトリウム1mM,アプロプチニン(aproptinin)10μg/ml,ロイペプチン10
μg/ml,およびEDTA5mM)中で可溶化した。ライゼートを遠心分離し、上澄み液
をウサギ抗ζ抗血清、対照として健康なウサギ血清、抗CD3ε(145-2Cl1 MAb)
または対照抗ヒトCD4(OKT4)と共に免疫沈降(immunoprecipitate)させた。免
疫析出物をSDS-PAGEで分割し、抗ζウサギ血清でブロッテングさせた。後期TBM
のT細胞ではζ鎖を発現しないで、普通T細胞ではみられないFcεγを発現してい
た。したがって、後期TBMのT細胞のTCRは、通常Tリンパ球で見られるαβ、γδ
εζではなく、αβ、δε、Fcεγになってしまっていた。後期TBMのTリンパ球
については、そのTCR-CD3構造の分析は行わなかった。
後期TBMのTリンパ球のウェスターン法分析の結果では、この細胞において、ζ
タンパク質の発現を検出す
ることができなかった。健康マウスや、初期TBMから同一条件で単離したTリンパ
球は正常レベルでζタンパク質を発現した。後期TBM由来Tリンパ球のTCRでは、
重要なTCR成分が欠けている。後期TBM由来Tリンパ球でζタンパク質が発現しな
いことと、in vitroでは細胞毒性活性が、in vivoでは免疫資料活性ないことと
は相関している。
しかしながら、抗αβと抗εを用いる免疫蛍光法の測定結果では、後期TBM由
来Tリンパ球は正常レベルのTCRを発現している。抗Fcεγを用いるウェスターン
法でも、ζ系の一種がユニークな発現をしていることが明らかなった。後期TBM
由来Tリンパ球の膜にFcεγが発現しているが、このために正常レベルのTCRがこ
の細胞に存在しているのかもしれない。
実施例10
後期TBM由来リンパ球の異常なシグナル変換
後期TBM由来リンパ球では、変わった形でシグナル変換が行われている。この
ことは、後期TBM由来リンパ球が、健康マウスあるいは初期TBMのTリンパ球と比
較して、Ca2+動員能力が著しく低下していることから明かである。カルシウムの
流れは、Tリンパ球のものをカルシウム感受性蛍光分光法により測定し、カルシ
ウム濃度は次の文献にしたがって推定した。Current Protocol in Immunology,
Vol.I,J.E.Coligan,A.E.Kruistbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevath and
W.Str
ober(eds.), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience,5.5.
1-5.5.15 (1991)。この文献は引用することにより本明細書の一部とする。T
細胞約1×107個をインド1(Indo1)に負荷し、抗CD3 MAb(145-2Cll)10ng/
mlで刺激した。流れはカルシウムイオノホアで溶解した後で最大となった。蛍光
分光はトリトン×100と溶解した時に最大となり、EGTAによりカルシウムがキレ
ート化した時に最小となった。
後期TBM由来リンパ球を抗CD3で刺激したところ、健康マウスあるいは初期TBM
のTリンパ球と比較してCa2+動員能力が著しく低下していることを認めた。抗CD3
とのインキュベート時間を長くしても(400秒)、健康マウスまたは初期TBMのT
細胞でみられるCa2+の流れのレベルに達することはできなかった。しかしながら
、後期TBM由来リンパ球をカルシウムイオノファ(ionophore)で刺激したところ
、同等の最大Ca2+の流れを確保することができ、細胞内でも充分な貯蔵が行われ
ていることを示している。
さらに、後期TBM由来リンパ球のチロシン残基のリン酸化のパターンも、健康
マウスあるいは初期TBMの細胞の場合と著しく異なっていた。抗CD3(145-2Cll)
10ng/mlを含んでいる無血清培地でこの細胞約1×107を2分間刺激した。オル
トバナジン酸ナトリウム400μMとEDTA1mMを含む氷冷のリン酸塩緩衝食塩水でこ
の細胞を二回洗った。細胞を溶菌緩衝駅(トリスpH7.4 25mM,NaCl
150mM,0.5%トリトン×100、オルトバナジン酸ナトリウム1mM、アプロプチニン
(aproptinin)10μg/ml、ロイペプチン10μg/m,およびEDTA5mM)で5分間
溶菌した。溶菌液を遠心分離し、上澄み液を10.5%SDS-PAGEにより還元条件で分
析した。タンパク質は電気泳動によりPVDFフィルター(Imobilon-P)に移行し、
TBST緩衝液(トリスpH7.4 20mM,NaCl135mM,0.1%ツイーン20)中で5%ゼラチン
でブロックし、ホスホチロシンMAb(40ng/ml)と共にイキュベートした。洗っ
た後、ブロットをペロキシダーゼと共役している抗マウスIg MAbと共にインキュ
ベートし、ECLキット(Amersham)で処理して、x線フィルムに暴露した。
後期TBM由来Tリンパ球のリン酸化チロシン残基の基礎パターンは、他の2群と
は著しく異なっていた。三つの実験では、残基が一貫して分子量比40〜52の範囲
(Mr=molecular weight ratio)で異なっているのが見受けられた。しかしなが
ら、抗CD3で刺激するとチロシン残滓のリン酸化が誘導されて、効果的にシグナ
ル変換ができるようになった。
健康マウスと腫瘍マウスのそれぞれから採取し、精製した脾臓T細胞の、蛍光
強度(レセプター数のインジケーターである)あるいはTCRαBヘテロダイマー(
図4A)またはCD3複合体(図4B)を発現する細胞のパーセンテージは、互いに差
異はなかった。流動細胞計測法では、腫瘍マウス由来の脾臓T細胞は、THy 1.2(
98%)とCRαB
(98%)を発現し、CD4/CD8比率も正常であったことを示している。脾臓T細胞に
おいてVβ遺伝子の使用を検討した際には、T細胞レセプターレパートリーに支障
を認めなかった。リガンドがTCRと結び付くとCa2+の動員が起こる。Weiss,(19
90),J.Clin.Invest.86,1015。健康マウス由来のT細胞とは対照的に、腫瘍
由来のものは、CD3に対する(抗CD3)モノクロナール抗体で刺激を受けると、カ
ルシウム反応が鈍化する。この反応はインキュベートを長くしても改善されない
(400s)(図4A)。
しかしながら、カルシウムイオノホファ(Indo-1)で刺激すると、健康マウス由
来T細胞と腫瘍由来T細胞双方とも、同等で最高のCa2+の流れを達成することがで
きた。したがって、腫瘍由来細胞は細胞内に充分なCa2+の貯蔵を持って、Indo-1
に充分負荷することができた。精製されたCD4+とCD4+のT細胞サブセットを分析
した結果では、サブセット各々定量的に同じ欠点を持っていることが認められた
。これらのT細胞は、TCRの表面密度が正常であっても、必ずしもTCRを経由して
与えられるシグナルに反応して、細胞内のCa2+貯蔵を放出するとは限らない。
実施例11
後期TBM由来Tリンパ球ではLckとFynの発現は
検出不能であるか、または低減している
TCRがシグナルに媒介すると、最も早くタンパク質チロシンのリン酸化が始ま
る。ついで、ホスファチジル
イノシトールの加水分解、Ca2+の動員化、そしてこの後でサイトカインの分泌、
サイトカインレセプターの発現などの機能にかんするステップが続く。(June e
t al.,1990 P.N.A.S.87:7722,J.Immunol.144:1591;Mmustelin at al.,
Science 1990,247:2584)。TCR-依存性のCa2+の流れに支障があったため、TCR
-依存性のタンパク質チロシンリン酸化を調べた結果、これを変更することとし
た。腫瘍由来T細胞のタンパク質チロシンリン酸化の基礎パターンを、健康マウ
ス由来のものと比較して次のように変更した。
腫瘍マウス由来Tリンパ球のTCRが媒介するシグナルを測定した。(A)TCR-依
存性Ca2+の動員を次のようにして測定した。T細胞(1×107個)をIndo-1により
負荷し、抗CD3(1μg/ml)で刺激した。最大Ca2+放出は、カルシウムイノマイ
シンで刺激した細胞中で測定した。最大蛍光強度は、トリトン×100で溶菌した
細胞において測定し、最小蛍光強度は、EGTAによりCa2+がキレート化した後に測
定した。遊離細胞内Ca2+、[Ca2+]i、の濃度は、Grynkiewicz et al.Biol.Ch
em.,260:3440 (1985)が開示した方法によって測定した。(B)タンパク質チ
ロシンリン酸化は次のようにして測定した。健康マウス由来(N)または腫瘍マ
ウス由来(T)の精製T細胞(10×106個)を、精製抗CD3 10μg/mlを含む無血
清培地中で2分間刺激するか、無処理の儘入れておいた。オルトバナジン酸ナト
リウム400μMとEDTA1mMを含む氷冷のリ
ン酸塩−緩衝食塩水で、細胞を二回洗って反応を止めた。T細胞は、溶菌した後
、遠心分離して核を除いた。上澄み液中のタンパク質は、SDS-PAGEで分離して、
イモビロンPフィルター(Immobilon P filters:Millipore)に移行、ホスホチ
ロシンに対する抗体、MAb-4G10(40ng/ml)で免疫ブロットした。(C)健康マ
ウスと腫瘍マウスそれぞれのTリンパ球におけるP56kkおよびp59fynの発現を次の
ようにして測定した。細胞溶菌液中のタンパク質をSDS-PAGE(14%ゲル)で分離
、イモビロンPに移行して、LckおよびFynペプチド(UBI)に対する抗体で免疫ブ
ロットした。
抗CD3の刺激によってタンパク質チロシンリン酸化が誘導されたが、リン酸化
されたタンパク質のパターンは異常であった。これらのT細胞において基礎タン
パク質チロシンリン酸化のパターンが異常であるのは、細胞タンパク質チロシン
キナーゼの発現に変化があったためかも知れないし、あるいは基質が合成されて
いるためかも知れない。したがって、Tリンパ球で発現した二つのSrc系タンパク
質チロシンキナーゼであるp56kkとp59fynの発現を検討した(Varonova and Seft
on,1986,Nature 319:682;Rudd et al.,P.N.A.S.1988,85:5190;Samuels
on et al.,1990,P.N.A.S.87:4358)。
全細胞抽出物のタンパク質を免疫ブロッテイングしたところ、健康マウス由来
と比較して、腫瘍マウス由来T細胞ではp56kkとp59fynとが減っているのが認めら
れた。後期TBM由来Tリンパ球におけるリン酸化のパターンが変化しているのと平
行して、この同じ細胞内でLckの発現も顕著に減少していた。前記と同様にして
細胞溶菌液のサンプルを作成し、8%SDS-PAGEで処理の後、ウサギ抗Lckまたは抗
Fyn血清によりブロッテイングした。ζがなくなり、Lckが減少するために、シグ
ナル変換のプロセスが変わり、このために溶菌メカニズムの活性化を阻害したり
、遅延させたりする。Tリンパ球でζや、CD3γや、Lckの発現レベルが変化する
ことは、養子免疫療法に必要な活性化ができる細胞を確認するマーカーとなる。
腫瘍マウス由来T細胞では、TCRの構造が変化するばかりでなく、p56kkとp59fy n
も減少する。PTK阻害剤の研究で、TCRがシグナル変換に媒介するときにこれら
の酵素が果たすべき機能が明らかになっている(June et al.,1980 Ioc.cit.
)。しかしながら、腫瘍マウス由来T細胞では、抗CD3、インターロイキン2 レ
セプターの調製、さらにはリンホカインの生成(インターロイキン2、インター
ロイキン6、インターフェロン)に反応して正常に増殖が行われている。これか
ら見ると、溶菌機能は、他のリンパ球機能に比べて、PTKの作用に対するより高
い依存度を持っているのかも知れない。インターロイキン2は、TCR依存性のCa2 +
流がなくても正常に分泌する。
各種腫瘍細胞系の上澄み液は、抗CD3に誘発された健
康マウス由来細胞の細胞毒性をin vitroで抑制する。もっと正確に言うと、これ
らと全く同じ機能の異常、TCR構造の異常は、RENCA腎臓細胞腺癌を持つBALB/c系
マウスにも起こっていることが観察されている。したがって、これらの所見は、
MCA-38を持つマウスだけに当てはまるものではない。実験動物の内部で起こる腫
瘍と宿主の相互作用が、これらの所見に関連している可能性が高い。また、悪液
質または瀕死の状態ではないとき、MCA-38腫瘍マウスでも、RENCA腫瘍マウスで
も、疾患の各段階でここに説明したような分子変化が起きているのである。
実施例12
TCAサブユニットの発現
健康マウス、腫瘍マウスそれぞれのT細胞を精製し、これをヨウ素化してTCR構
造を検討した。TCR複合体のタンパク質は抗CD3で免疫沈降してから、二次元非還
元-還元SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離した(Samuel
son et al.,1985 Cell,43:223)。
腫瘍マウス由来Tリンパ球のTCRの構造を次のようにして測定した。Tリンパ球
五千万個に、ラクトペロキシダーゼーグルコースオキシダーゼ法によりNa125Iの
標識をつけた。その後、氷上の溶菌緩衝液[トリス(pH7.4)25mM;NaCl 300mM
、0.5%トリトン×100、オルトバナジン酸ナトリウム1mM、アプロプチニン10μg
/ml、ロイペプチン10μg/ml、EDTA5mM]1ml中で5分間溶菌し
た。この細胞溶菌液では抗CD3がタンパク質G-セファロースに吸収されている。
この細胞溶菌液の上澄み液からTCR複合体を免疫沈降させ、二次元非還元(NR)-
還元(R)SDS-PAGE(15%ゲル)により分離した。こうして免疫沈降させたサブユ
ニットを細胞系(BW5147)で処理したところ、TCRがないと言う特異性が確認さ
れた。
TCRζとFcεγの発現を免疫ボロット法により次のように分析した。健康マウ
ス由来、腫瘍マウス由来それぞれのT細胞(20×106)、BW5147、および2B4.11を
可溶化し、細胞溶菌液から上澄み液を採取した。CD3ζに対するウサギ抗血清(3
87)または健康ウサギ血清(NRS)により、上澄み液からタンパク質を免疫沈降
させた。TCRなし、BW5147胸腺腫からなる溶菌液を用いた。2B4.11ハイブリドー
マはFCεγに対する正の対照として用いた。免疫沈降物中のタンパク質は、CD3
ζペプチドに対するウサギ抗血清(387)(NICHDのR.Klausner氏提供)とFcε
に対する抗血清(NIAIDのJ.P.Kinet氏提供)によってブロッテイングした。こ
のブロットをマウスIgGに対するペロキシダーゼ共役抗体により、化学ルミネセ
ンスに助けられながら展開した。
腫瘍マウス由来Tリンパ球には、TCRαβヘテロダイマー(ジスルフィド結合が
鎖間にあるため対角線の下を移動)とCD3ε鎖(ジスルフィド結合が鎖内にある
ため対角線の上を移動)とがお互いにほぼ等量で存在していた。
これとは対照的に、腫瘍マウス由来T細胞のTCR-CD3
複合体で、他の成分がはっきりと変化していた。先ず、CD3ζ鎖が無くなってお
り、CD3γ鎖の量が減っていた。
ζ鎖を検出できなかったこと、およびTCRが細胞表面に発現していたことを一
緒にして考えると、CD3ζの安定しいる状態が量的に減ってきている、アセンブ
リーと輸送とが正常ではなかった、洗剤で可溶化されたレセプター複合体が不安
定であることが原因ではないかとも思われる。CD3ζタンパク質なんとか検出し
ようとして、脾臓T細胞の全細胞溶菌液からタンパク質を免疫ブロッテイングさ
せようとした。ここでも、健康マウス由来T細胞とは対照的に、腫瘍マウス由来T
細胞にはCD3ζ鎖は存在しなかった。これは皮肉な結果で、CD3ζ鎖がないために
TCRは苦労して細胞表面まで運ばれた筈である。(Sussman et al.,1989)。し
かしながら、TCRは、ζ系の他のものと結び付くことができる(Orloff et al.,
1990)。Fcε γ鎖は、ζ関連タンパク質で、Fcレセプターアセンブリと輸送、
さらにはシグナル変換のζ機能に役立つことができる。実験標識をつけている表
面にζ鎖よりサイズが小さいタンパク質が存在していたが、このタンパク質はFc
εγとほぼ同じサイズであった。この鎖が腫瘍マウス由来T細胞に存在すること
は、Fcεγに対する抗体(抗Fcεγ)を用いる免疫ブロッテイング法によって確
認されている。
このようにして、腫瘍マウス由来Tリンパ球はCD3ζ鎖が欠けている異常なTCR
複合体を発現したが、大多数
のT細胞にFCεγ鎖を含有していた。異常のTCR複合体はCD4+とCD8+の両方に認め
られた。lckとCD3ζ鎖のmRNAのレベルは安定で、正常で、むしろ上昇している感
じがあり、転写以降のレベルで欠陥が発生していることを示唆している。
実施例13
フラボノイドとIL-2による腫瘍治療後TCRサブユニット
およびTリンパ球シグナル変換経路のタンパク質分析
ある種の癌は治療にたいして依然として難治である。例えば、腎臓細胞癌(腺
癌)は従来の化学療法剤に耐性である。腎臓細胞癌は多くの場合、診断を得たと
きには既に転移しているなど、悲惨な病気である。ほとんどの治療方法は腎臓細
胞癌に効果がないが、生物反応モデフイアー(BRM)を用いてある種の抗腫瘍効
果が認められてはいる。この生物反応モデフイアーは、薬剤(α-IFN、IL-2)毎
に少なくとも従来の化学療法剤と同等の効果を上げているので、BRM/BRMやBRM
/化学療法剤を含め併用療法によりより高い効果を上げようとして研究が行われ
ている。
治療法の効果的な組み合わせを作る上で齧歯動物モデルは有用である。治療薬
、用量、投与計画を各種組み合わせた複雑な実験を速やかに、比較的に安価に、
しかも患者にリスクがなく実施すことができる。編歯動物モデルの一例として、
RENCAシステム挙げることができる。これはBalb/c起源のRENCA腎臓腺癌を正常
位
に移植して、そこから転移させようとするもである。Murphy and Hrushesky,J
.Natl.Cancer Inst.,50:1013(1990)。
ほとんどのサイトカインは、単独使用の場合、効果がない。この腫瘍に対して
最も効果のある治療方法は併用薬剤にIL-2がある場合である。特に、IL-2とIFN
またはフラボノイドを含むサイトカインとの併用が最も効果的である。
腫瘍が縮小した実験動物では、T細胞は抗腫瘍反応に必須であったことが認め
られている。さらに、腫瘍のためにシグナル変換が変化していたが、治療によっ
てこれが逆転した。T細胞のチロシンリン酸化のパターンが変わっていたが、ウ
ェスターン法測定によると、これが正常に戻っっていた。腫瘍を注射した後僅か
7週間(治療開始後3〜4週間)で、lckとゼータ(zeta)が再び発現し始めた
。TCRおよびCD3複合体は変化しなかった。
実施例14
養子免疫療法患者の評価
腎臓癌を有する患者を選択し、末梢血液からリンパ球標本を作り、CD3ζの発
現を分析する。健康なヒトからもリンパ球を得、同様にして標本を作成し、分析
する。末梢血液リンパ球は、静脈せん刺、またはリンホフレイセス(Iymphopher
esis)によって単離する。細胞はフィコール/ヒパック勾配遠心分離をして、単
核細胞を得る。このようにして得た単核細胞の密度を測定
し、患者、上記健康なヒトそれぞれ毎に同数の細胞からタンパク質を抽出する。
同数の細胞を溶菌緩衝液(トリスpH7.4 25mM、NaCl150mM、0.5%トリトン×100
、オルトバナジン酸ナトリウム1mM、アプロプチニン10μg/lm)ロイペプチン1
0μg/m)およびEDTA5mM)中に溶解する。溶菌液を遠心分離し、上澄み液をウ
サギ抗ζ抗血清で免疫沈降させる。対照溶菌液は、通常のウサギ血清で免疫沈降
させる。免疫沈降物はSDS-PAGEで再分割し、ナイロン膜(Imobilon-P)に移行し
、抗ζラビット血清でブロットする。対照と比較して、患者のζタンパク質の発
現が著しく減少している時には、免疫抑制であって、自分のTリンパ球を使って
自系養子免疫療法を実施することできない。
実施例15
癌患者のタンパク質発現の減少
ヒト癌患者12名の内7名の末梢血液T細胞が、C3ζ鎖の発現が全くなくなって
いるか、減少していることが認められた。数名ではLckとPLCγの発現が減少して
いた。したがって、ヒト腫瘍患者のT細胞シグナル変換分子に、構造上機能上の
変化が認められた。
実施例16
ワクチン
他の実施態様において、本発明の免疫抑制因子を製薬上許容し得る組成物とし
て使用し、有効量を投与す
るとき免疫抑制に対して防御免疫で対抗することができる。
主成分としてタンパク質を含有するワクチン製剤は当業者によく理解されてい
る。通常、ワクチンは溶液、または懸濁液、さらには溶液、懸濁液、または液剤
に好適であり、これらによって注射薬に形成する固体などの注射薬として製造さ
れる。乳剤でも良い。免疫原生を有する主成分に製薬上許容し得、且つ主成分と
相容性がある賦形剤を配合することができる。好適な賦形剤としては、水、食塩
水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらのものの混合物
などを挙げることができる。必要ある場合、ワクチンに、少量の補助剤、例えば
湿潤剤、乳化剤、アジュバント、あるいはワクチンの効力を増進する増強剤等を
配合することができる。
従来、ワクチンは皮下あるいは筋肉内などに注射するように、非経口的に投与
されてきた。さらに、処方によっては他の投与経路が好適である。このような剤
形としては、座薬がある。場合によっては、経口薬を加えても良い。従来から、
座薬にはポリアルキレングルコース、トリグリセライドなどからなるバインダー
と担体が含まれている。座薬の主成分の含量は0.5%〜10%の範囲、好ましくは1.2
%である。経口薬は従来から使用されている製薬グレードのサッカリン、セルロ
ース、炭酸マグネシウムなどからなる賦形剤が配合され
ていてもよい。経口薬の剤形は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、などの
剤形をとることができる。経口薬主成分に製薬上許容し得、且つ主成分と相容性
がある賦形剤を配合することができる。好適な賦形剤としては、水、食塩水、デ
キストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらのものの混合物などを
挙げることができる。必要ある場合、ワクチンに、少量の補助剤、例えば湿潤剤
、乳化剤、アジュバント、あるいはワクチンの効力を増進する増強剤等を配合す
ることができる。
タンパク質様-粒子から中性剤または塩剤としてワクチンを製造することがで
きる。これは酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基から製造)を含む製薬的に許容
し得る塩であって、例えば塩酸、リン酸、などの無機酸、あるいは例えば酢酸、
シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される。遊離カルボキシ
ル基と共に形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル
シウム、またま水酸化鉄(ferric hydroxide)などの有機塩基、およびイソプロ
ピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノ エタノール、ヒスチジン、
プロカインなどから誘導されるもので良い。
「単位用量」なる語は、所要の希釈剤、即ち担体または賦形剤と共に所定量の
主成分を含有する、ヒトに好適なように物理的に分割されている単位を言う。
ワクチンの投与は、製剤処方に適合する方法で、且つ治療するのに充分に有効
でであり、免疫原生である用量を投与する。投与量は、治療を受ける患者、抗体
を産生する患者の免疫系の能力、および所望の防御の程度によって異なる。しか
しながら、患者一人当り主成分として1マイクログラムから数百マイクログラム
の範囲が適当である。初回投与量とブースター量も一定ではないが、初回投与後
一週間〜二週間おいて次の注射あるいは次の治療を行うのが典型的である。
実施例17
診断システム(キット)
生体サンプル中で本発明のタンパク質が存在するの検出したり、このサンプル
中のタンパク質に対する抗体の存在を検出するのに有用な、好ましくはキットの
診断システムである。内容は複数の容器の各々に次のものを含む。
(a) 抗原性を示す本発明のタンパク質。
(b) 本発明のタンパク質と抗体との間に免疫反応が存在していることをシグ
ナルする標識した特異的な結合剤。
「特異的な結合剤」とは、本発明のタンパク質などのリガンド、あるいは本発
明のタンパク質と免疫反応する抗体と選択的に結合できる分子化合物である。
特異的な結合剤の例としては、Fab’やF(ab’)2補体フラグメント、タンパ
ク質Aなどの抗体、または抗体
フラグメントなどを挙げることができる。
本発明の説明に言う「標識(label)」なる語はあらゆる場合において、免疫
反応物の存在を示す検出可能なシグナルの産生に直接または間接に関与する単一
の原子または分子のことを言う。
どのような標識手段(labeling means)も、特異的な結合剤に、結合させたり
、または組み込んだり、あるいは別個に利用したりすることができる。前記の原
子や分子は、単独で使われたり、あるいは追加試薬と一緒に使われたりする。前
記の標識は、免疫化学ではよく知られているが、本発明の新規なタンパク質法お
よび/または系で使用されている限り、本発明の一部とする。
本発明のキットの代表的な使用方法は、エライザ(ELISA)法で使って血清や
プラズマなどの生体サンプル中で多量の抗体が存在することを検出することにあ
る。エライザは、enzyme-linked immunosorbent assayと言い、固相に結び付い
た抗体、抗原を使い、酵素‐抗原、酵素-抗体共役によってサンプル中の抗原や
抗体の量を検出定量する。エライザ法の説明はChapter 22 of BASIC AND CLINIC
AL IMMUNOLOGY (4TH ed.1982)by D.P.Sites et al.,published by Lange
Medical Publications of Los Angeles,California,and in U.S. Patent Nos
.3,654,090,No.3,850,752 and No.4,016,043にある。この文献各々は引用す
ることにより本
明細書の一部とする。
このようにして、本発明の最良の実施態様において、抗原性を示すタンパク質
が固体マトリックスに付着して固体支持部材となっている。タンパク質は水性培
地から吸収されて固体マトリックスに付着する。水性培地からの吸収には数種の
方法があり、さらに当業者に周知の他の方法もあるが、すべて使用可能である。
これらの方法の内代表例としては、架橋結合しているデキストロースやセルロー
スのようなグルコースを含有しているマトリックス、あるいはラテックス粒子と
共同作業をしている結合性グルタルアルデヒトと臭化シアンとが反応して、反応
性カルボキシル官能価が作り出され、これとレセプターまたは抗原する方式であ
る。グルタルアルデヒトについては、後で再び説明する。
有用な固体は当業者に周知である。例としては、Pharmacia Fine Chemicals
(Piscataway,NY)がSEPHADEXなる商標で市販している架橋結合しているデキス
トラン、アガラーゼ(agarase)、Abbott Laboratories(North Chicago,IL)
から得られる直径1ミクロン〜5ミリのポリスチレンビーズ、塩化ポリビニール
、ポリスチレン、架橋結合ポリアクリルアミド、シートや細片や棒などのナイロ
ン系ウェブのニトロセルロース、ポリスチレンまたは塩化ポリビニール製のチュ
ーブやプレートやマイクロタイタープレートのウェルなどが挙げられる。
最良の実施態様では、キットにはさらに別の容器があって、モルモット補体、
抗イムノグロブリン、あるいはS.aureus cowan菌株、タンパク質Aなど検出すべ
き抗原や抗体と反応する補体からなる増幅試薬を提供している。これらの実施態
様では、標識特異性を持つ結合剤は、増幅手段がタンパク質や抗体の方向へ移動
すると特異的にこの増幅手段に結合する。
本発明で説明している標識特異性をもつ結合剤や、上記の増幅試薬は、液体分
散剤、乾燥どの高い粉末、例えば乾燥凍結品として供給し、これをようえきにす
る。指示手段が酵素である場合には、酵素の基質も別包装で供給する。マイクロ
タイタープレートなどの固体支持部材、一以上の緩衝液も追加包装としてこの診
断検定システムの一部とすることが出来る。
診断システムに関連させて説明した包装は、診断制度では慣習的に使用されて
いるものである。したがって、このような包装ではガラス、プラスチック(例え
ば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート)、ビン、バイアル、プ
ラスチックトプラスチック膜、積層封筒などをいれてあるものである。
実施例18
動物腫瘍モデルにおいてNF-kB/rel転写因子の
パターンが変化したが、治療によって逆転したこと
ヒト癌患者と腫瘍マウスについて免疫系障害が報告されている。免疫不全の原
因では、T細胞の機能が重要
な役割を果たしている。腫瘍哺乳動物のT細胞の状態を調査する目的を持って、B
alb/cマウスの自然発生腎臓細胞癌(spontaneously arising renal cell carc
inoma:Renca)をモデルとして使用した。この腫瘍モデルには二つの重要な特徴
がある。(1)Rencaが示す転移パターンがヒト腎臓細胞癌と似ている。Golumbe
k et al.(1991)”Treatment of Established RenalCancer by Tumor Cells a
nd Engineered to Secrete Interleukin-4”、さらに、(2)このネズミモデル
において、樹立Renca腫瘍をもつマウスに対して、実験化合物フラボン-8-酢酸
(FAA)とrIL-2の併用により80%の治癒率の成績をおさめたこと、そしてこのう
ちの三匹がその後の免疫テストに良好な反応を呈したことである。Wiltrout et
al.,(1988)”Flavone-8-Acetic Acid Augments Systemkc Natural Cell Act
ivity and Synergizes with IL-2 for Treatment of Murine Renal Cancer,”
(1988)J.Immunol.140(9):3261。
ウェスターン法により、抗c-rel、抗p65、および抗p50抗血清を用いて健康マ
ウス由来脾臓T細胞の核抽出物を調べたところ、三つのタンパク質すべてが正常
のレベルであった。対照的に、腫瘍マウス由来脾臓T細胞の核抽出物では、c-rel
とp65が欠けていた。意外なことに、p50の代わりに二つの短縮型(shorter form
)のタンパク質(P48とp44)が核に出現していた。この”48”と”44”はこの二
つのタンパク質の大体の分子量を電気泳
動により測定して48kDと44kDと見積つたものであった。
c-rel、p65、およびp50の各々に対する抗血清の特異性は、それぞれのペプチ
ドとの競合により明らかになった。p50の短縮型は、専ら核に存在していたが、
正常サイズのタンパク質は細胞質に存在していた。p50のN-タ-ミナルペプチドに
対して抗血清を作り、この抗血清を用いて同じ抽出物中でp50を分析したところ
、p50の短縮型を検出しないで、正常なp50を検出することができた。これらの結
果は、p50の短縮型は、p50のN末端の端を切ったものであることを示すと解釈さ
れる。さらに、スプライシングもp50の新型出現の原因であるかも知れない。た
だし、先駆物質であるp105の短縮型が腫瘍サンプルの細胞質フラクションで観察
されることはなかった。
腫瘍マウス由来の脾臓T細胞において、核にc-rekとp65が存在していないのに
、p50の変型が出現したことが腫瘍の存在と関連があるのか、否かを判断するた
め、FAA/IL-2治療マウスから治療後各種時点で脾臓T細胞のサンプルを採取して
、ウェスターン法で分析した。腫瘍マウスのFAAによる治療は7日目に開始した
。IL-2は8〜10日間毎日投与した。11日後、脾臓T細胞の核c-rel、p65およびp50
が無処置腫瘍マウスと同様のパターンを示すようになった。対照的に、FAAとIL-
2を投与されているグループの脾臓T細胞では、核のc-rel、p65およびp50の三つ
ともほぼ正常レベルであった。おもしろ
いことに、p50の短縮型は治療群中ではもはや見られなくなった。腫瘍接種後4
週目、即ち治療後3週目に、処置したグループについては、肉眼による観察ある
いは顕微鏡による観察の何れによっても癌の徴候を見い出すことはできなかった
。無処置の腫瘍マウス群では、通常約35日で死亡する。
第7週までの生存を長期生存と定義して、その長期生存マウス群の脾臓T細胞
の分析では、rel系マウスの核レベルは正常であった。
健康動物と腫瘍動物の脾臓T細胞の核抽出物を用いて、電気泳動移動度検定(E
MSA)(Tan,T.H.et al.,”Purification and characterization of multiple
nuclear factors that bind to the TAX-inducible enhancer within the huma
n T-cell leukemla virustype 1 long terminal repeat”(1989) Mol.Cell.
Biol.)をおこなった。この検定では免疫グロブリン重鎖遺伝子のオリゴヌクレ
チドを使用したが、腫瘍サンプルのDNA-タンパク質複合体のパターンが、腫瘍が
ないサンプルと比較して、異なっていた。健康パターンに較べて、早く移動する
二つの複合体が観察された。特異性と非特異性のオリゴヌクレチドによる競合分
析の結果、これらの複合体は何れもヌクレオチドプローブに特異性を持っていた
。腫瘍発症後4週目で評価した群のサンプルで正常なパターンが再び見られたこ
とから、これらのDNA-タンパク質複合体は腫瘍の状態と相
関関係があった。
腫瘍サンプル中のDNA-タンパク質複合体の特性を決定するため、UV-架橋(UV-
crosslinking)(Kochel et a1.,”V-rel and C-rel-Protain Complexes Bind
to the NF-kB site In Vitro”,Oncogene (1992)7:567-572)および架橋生
成物の免疫沈降(immunoprecipitation)(Rice et al.,(1992) Cell,71:2
43-263)を行った。正常サンプルでは、p50とp65の組合せに対応する二つのタン
パク質からなる移動速度の遅いDNA-タンパク質複合体がある、一方、p50に対応
する一個のタンパク質からなる早く移動する複合体があること立証された。Sang
-Mo Kang et al.,”NF-kB Subunit Regulation in Nontransformed CD4+T Lymp
hocytes”(1992) Science 256:1452。腫瘍サンプルでは、上部のDNA-タンパ
ク質複合体は、p50より短いタンパク質一個からなり、下部の複合体は、p50の短
い誘導体二個に相当するタンパク質二個からなっていた。UV架橋生成物は、相異
なる抗p50抗血清と共に免疫沈降した。正常サンプルを免疫沈降させたときには
、移動の遅かった複合体は、二つの異なる抗p50抗血清と一個の抗p65抗血清を沈
殿した。これらの結果から、上部の複合体はp50とp65からなっていたことを示し
ている。移動が早かった複合体は、三つの異なるp50抗血清で沈殿させうること
が分かったが、このことは下部の複合体はp50からなっていたことを示していた
。
腫瘍サンプルを分析したとき、移動速度の遅い複合体は、二つの異なる抗p50
抗血清で沈殿したことが認められたが、N末端ペプチドに対してつくられた第三
の抗血清は必要がなかった。また、沈殿した分子の分子量から判断すると。上部
複合体はp48からなっていたと結論される。同様にして、移動速度が早かった複
合体は、上部複合体と同じ抗p50抗血清によって沈殿したが、N末端ペプチドに対
してつくられた抗血清は必要がなかったことが認められる。この場合、抗ペプチ
ド抗血清に対応し、p48とp44に対応する二つタンパク質がえられた。前免疫(pr
eimmune)血清で免疫沈降を行った場合には、タンパク質バンドは得られなかっ
た。
試験方法
Tリンパ球の刺激
一実施態様においては、in vitroでTリンパ球表面レセプターに対する抗体と
共に、Tリンパ球を短時間刺激した。刺激している間、任意に一以上のサイトカ
インを存在させても良い。刺激時間は、最長24時間以下、最短30分以上、通常12
〜18時間である。このようにして刺激した細胞をin vivo注射すると、高い治療
効果がある。抗CD3によって刺激するとIL-2レセプターの発現が誘導される。抗C
D3刺激細胞は肺に対する急性毒性が少なく、IL-2中で数日間培養した細胞より毒
性が低い。同様に、抗CD3刺激細胞はIL-2の存在下では数を増やすことができる
ので、小数の抗CD3を注射しただけでも、
in vivoでIL-2に暴露されると大きな数に増殖することができる。したがって、I
L-2が存在するときには抗CD3刺激細胞の投与量をより少なくしても、充分な数の
抗CD3刺激細胞を得ることができる。
また、一以上のリンパ球表面レセプターに対する抗体と共にin vitroでTリン
パ球を刺激してもよい。任意に、刺激する間、一以上のサイトカインを存在させ
ておいても良い。Tリンパ球のin vivo刺激を、一以上のリンパ球表面レセプター
に対する抗体と共に、または、一以上のサイトカインを併用するか、あるいは抗
体とサイトカインを組み合わせたものを併用して行うことができる。
キナーゼ反応検定
常法により107個の細胞を溶解する。
抗Fyn Ab(6μl)または抗Lck Ab(3μl)と共
に免疫沈降する。
EDTAを入れていない洗浄緩衝液で3回洗う。
ATPを入れていないキナーゼ緩衝液で3回洗う。
[γ‐32P] ATP (3300Ci/mmol)(3〜5μl)および
1μ M ATP10〜20μCiを配合したキナーゼ緩衝液
30μlを加える。
R/Tを10分間インキュベートする。
EDTA 20mMを含有する洗浄緩衝液で3回洗う。
1.5倍のサンプル緩衝液を溶出する。
8%のゲルで試験する。
酢酸10%とメタノール50%で30分間ゲルを固定す
る。
3%のグリセロールで置換えて20分間固定を続け
る。
ゲルドライヤーで1.5時間かけてゲルを乾燥する。
ゲルをX線フィルムに暴露する。
抗体調製法
Tリンパ球表面レセプタータンパク質、または溶解性免疫抑制因子に対する
抗体は、周知の常法を用いて作ることができる。例えば、Current Protocols in Immunology
,Vol.I,J.E.Coligen,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.
Shevach and W.Strober(eds.),Green Publishing Associaes and Wiley-In
terscience,2.4.1-2.10.3(1991),この文献は引用す
ることにより本明細書の一部とする。
モノクロナール抗体が調製されるが、これは因子に対するものである。抗体は
免疫源としての腫瘍の標本の上澄み液を使って作る。製法は当業者に周知である
。モノクロナール抗体はアフィニテイクロマトグラフィを用いて因子を精製する
ときに有用である。(Marlow and Lane Antibodies Manual)。
表面レセプターに対する抗体は単独で使用してもよいし、異なるT細胞表面レ
セプターに対する他の抗体と併用してもよい。いずれの場合でも、Tリンパ球を
活性化することができる。好適な抗体としては、抗CD2、抗CD3、抗CD4、抗CD5、
抗CD6、抗CD7、抗CD8、抗CD28、抗CD29、および抗CD45Rが挙げられる。好ましい
抗体としては、抗CD3およびモノクロナール抗体(MAb)が挙げられる。抗CD3 MA
bにはOKT3、WT32、Leu-4、SPV-T3Ck、RIV9、64.1および145-2Cllなどか含まれて
いる。より好ましくは抗CD3 MAbが抗ネズミMAb 145-2Cllであることである。こ
の抗体は、Leoら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、B4、1374 (1978))によって
同定されたもので、the American Type Culture Collecion (ATCC)から入手す
ることができる。マウス抗ヒトOKT3は、Johnson and Johnson社のOrtho Divisio
nから入手することができる。ヒトから誘導される各種の抗体は、in vivoで処理
中にT細胞を活性化する際に有用である。抗CD3 MAbにより約24時間以下で処理さ
れたTリンパ球は、総投与
量約10ng/ml以下で処理するのが好ましい。
溶解性免疫抑制因子の単離と精製
免疫抑制因子は、腫瘍細胞標本の上澄み液から連続ゲル濾過、アニオン・カチ
オン交換、およびFPLCによって精製される。これらの精製方法は、当業者にとっ
て周知である。最終精製工程では、イオン交換によるHPLC、あるいは逆相クロマ
トグラフィが必要である。単離された因子のポリペプチドフラグメントの試験を
して、どのフラグメントかまだ免疫抑制活性を保持しているかを確かめなくては
ならない。その後アミノ酸配列から縮合オリゴヌクレオチドを形成して、Maniat
is(1992)が開示した技術を使って因子のクローンを作る。(Molecular Cloni
ng,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York)。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
A61K 35/16 7431−4C
38/00 ABB
39/00 H 9284−4C
48/00 8314−4C
49/00 Z 7431−4C
C07H 21/04 B 8615−4C
C07K 16/18
C12N 5/10
15/09
C12Q 1/02 6807−4B
1/48 Z 6807−4B
1/68 A 9453−4B
// A61K 35/24 7431−4C
35/26 7431−4C
35/28 7431−4C
35/30 7431−4C
39/395 D 9284−4C
G01N 33/574 A 8310−2J
9455−4C A61K 37/02 ABB
(31)優先権主張番号 08/031,434
(32)優先日 1993年3月15日
(33)優先権主張国 米国(US)
(31)優先権主張番号 08/034,832
(32)優先日 1993年3月17日
(33)優先権主張国 米国(US)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,CA,
CH,CZ,DE,DK,ES,FI,GB,HU,J
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,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,
SK,UA,US,VN
(71)出願人 ロンゴ,ダン・エル
アメリカ合衆国、20895 メリーランド、
ケンジントン、バロル・レイン 9610
(71)出願人 ルーフラー,シンシア・エム
アメリカ合衆国、32513 フロリダ、ペン
サコラ、ノース・ナインス・アヴェニュー
5151
(71)出願人 ゴーシュ,パリトシュ
アメリカ合衆国、21702 メリーランド、
フレデリック、アシュフォード・コート
200
(71)出願人 ヤング,ハワード・エイ
アメリカ合衆国、20878 メリーランド、
ゲイザーズバーグ、ストーンブリッジ・ヴ
ュー・ドライヴ 14520
(72)発明者 オチョア,アウグスト・シー
アメリカ合衆国、21702 メリーランド、
フレデリック、アレッサンドラ・コート
102、アパートメント 180
(72)発明者 溝口 博本
アメリカ合衆国、21702 メリーランド、
フレデリック、ウィロウデイル・ドライヴ
149、アパートメント 44
(72)発明者 オシェア,ジョン・ジェイ
アメリカ合衆国、メリーランド、シルヴァ
ー・スプリング、ダブリン・ドライヴ
1721
(72)発明者 ロンゴ,ダン・エル
アメリカ合衆国、20895 メリーランド、
ケンジントン、バロル・レイン 9610
(72)発明者 ルーフラー,シンシア・エム
アメリカ合衆国、32513 フロリダ、ペン
サコラ、ノース・ナインス・アヴェニュー
5151
(72)発明者 ゴーシュ,パリトシュ
アメリカ合衆国、21702 メリーランド、
フレデリック、アシュフォード・コート
200
(72)発明者 ヤング,ハワード・エイ
アメリカ合衆国、20878 メリーランド、
ゲイザーズバーグ、ストーンブリッジ・ヴ
ュー・ドライヴ 14520
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下の性質を有する溶解性免疫抑制因子。 a)哺乳動物の生物標本おけるTCRサブユニットタンパク質のレベルを、免疫抑 制されていない哺乳動物の同様の生物標本のサブセットのレベルと比較して、低 下させることができる。 b)哺乳動物の生物標本におけるTリンパ球シグナル変換経路のタンパク質のレ ベルを、免疫抑制されていない哺乳動物の同様の生物標本のタンパク質のレベル と比較して、低下させることができる。 c)免疫抑制された哺乳動物から得られる血清中に存在する。 2.腫瘍細胞培養物の上澄み液中に存在するものとしてさらに定義される請求 項1に記載の因子。 3.上記腫瘍細胞培養物がリンパ種のMCA-38またはMBL-2である請求項2に記 載の因子。 4.上記免疫抑制哺乳動物が約26日以上存在しているMCA-38系の腫瘍を有する 請求項3に記載の因子。 5.上記TCRサブセットタンパク質が、CD3ζである請求項1に記載の因子。 6.上記TCRサブセットタンパク質が、CD3γである請求項1に記載の因子。 7.上記Tリンパ球シグナル変換経路タンパク質が、Src系のチロシンキナーゼ である請求項1に記載の因子。 8.上記Src系のチロシンキナーゼが、Fynまたはlck である請求項7に記載の因子。 9.シグナル変換経路タンパク質が、PLCγまたはGAPである請求項1に記載の 因子。 10.哺乳動物の細胞サンプルの免疫抑制のレベルを測定する方法であって、 a)TCRサブセットタンパク質またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパク質 の発現のレベルを測定するステップと、 b)前記タンパク質の発現レベルと同一種の哺乳動物の免疫抑制されていない 個体を特徴づける前記タンパク質の発現レベルとを比較するステップと、 を含む方法。 11.上記サンプルがリンパ球調製物である請求項10に記載の方法。 12.発現のレベルの測定結果が、タンパク質を発現するTリンパ球の数を測定 対象となったTリンパ球の総数で割った発現率である請求項10に記載の方法。 13.上記リンパ球調製物が、脾臓組織、末梢血液、腫瘍組織、リンパ節組織、 脳脊髄液、胸膜滲出液、および腹水を含む組織から調製されるものである請求項 11に記載の方法。 14.上記TCRサブユニットタンパク質が、CD3ζを含む請求項10に記載の方法。 15.上記シグナル変換経路タンパク質が、src系のチロシンキナーゼを含む請 求項10に記載の方法。 16.上記チロシンキナーゼが、Fynまたは1ckである請求項15に記載の方法。 17.上記シグナル変換経路タンパク質が、PLCγまたはGAPである請求項10に記 載の方法。 18.免疫療法に適する程度に活性化できるTリンパ球を持った患者の確認方法 であって、 a)TCRサブセットタンパク質またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパク質 の発現のレベルを測定するステップと、 b)上記タンパク質の発現レベルと免疫抑制されていないヒトに特有の上記タ ンパク質の発現レベルとを比較するステップと、 c)免疫抑制されていないヒトの治療に有効なしきい値以上の上記タンパク質 の発現レベルを有する患者を選択するステップと、 を含む方法。 19.上記発現レベルの測定結果が、タンパク質を発現するTリンパ球の数を測 定対象となったTリンパ球の総数で割った発現率である請求項18に記載の方法。 20.上記発現レベルが、リンパ球調製物から単離した総タンパク質のマイクロ グラム当りの上記タンパク質の量として定義される請求項18に記載の方法。 21.上記リンパ球が、脾臓組織、末梢血液、腫瘍組織、リンパ節組織、脳脊髄 液、胸膜滲出液、および腹水を含む組織から得られるものである請求項18に記載 の方法。 22.上記TCRサブユニットタンパク質が、CD3ζタンパク質を含む請求項18に記 載の方法。 23.上記シグナル変換経路タンパク質が、src系のチロシンキナーゼである請 求項18に記載の方法。 24.上記チロシンキナーゼが、Fynまたは1ckである請求項23に記載の方法。 25.上記シグナル変換経路タンパク質が、PLCγまたはGAPである請求項18に記 載の方法。 26.刺激したTリンパ球により治療する、免疫療法に反応する疾患を有する患 者の治療方法であって、患者を請求項18に記載の方法により選択するすることを 特徴とする治療方法。 27.上記疾患が癌である請求項26に記載の方法。 28.上記癌が黒色腫である請求項27に記載の方法。 29.哺乳動物のTリンパ球の免疫抑制を起こす薬剤の決定方法であって、 a)TCRサブユニットタンパク質またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパク 質の発現レベルが同一種の哺乳動物の免疫抑制がない個体の特徴となっているレ ベルと同等である哺乳動物Tリンパ球調製物を得るステップと、 b)上記リンパ球調製物を、免疫抑制すると考えられる薬剤の存在下で培養す るステップと、 c)上記タンパク質の発現のレベルを測定するステッ プと、 d)上記薬剤の存在下で培養しなかったTリンパ球調製物中の上記タンパク質の 発現のレベルよりも顕著に低いレベルへの低下を引き起こす薬剤を決定するステ ップと、 を含む方法。 30.哺乳動物のTリンパ球の免疫抑制を逆転する薬剤の決定方法であって、 a)TCRサブユニットタンパク質またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパク 質の発現レベルが、同一種の哺乳動物の免疫抑制がない個体のレベルよりも低い 免疫抑制された哺乳動物から、Tリンパ球調製物を得るステップと、 b)上記リンパ球調製物を免疫抑制を逆転すると考えられる薬剤の存在下で培 養するステップと、 c)上記タンパク質の発現のレベルを測定するステップと、 d)上記タンパク質の発現レベルを顕著に上昇させる薬剤を決定するステップ と、 を含む方法。 31.上記薬剤がin vivoで存在する請求項30に記載の方法。 32.溶解性免疫抑制因子を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、 a)請求項1に記載の因子を含む系に薬剤を加えること と、 b)上記系の免疫抑制を、 i)TCRサブユニットタンパク質またはTリンパ球シグナル変換経路のタンパ ク質の発現レベルを測定し、 ii)タンパク質発現の上記レベルと、同一種の哺乳動物の免疫抑制がない個 体の特徴である上記タンパク質の発現と比較することと、 c)上記系が免疫抑制の逆転を示すかを判定することと、 を含む方法。 33.免疫抑制の治療方法であって、請求項30に記載の決定済み薬剤を製薬的に 許容できる希釈剤に配合したものの治療有効量を投与することよりなる方法。 34.上記哺乳動物がヒトである請求項33に記載の方法。 35.請求項1に記載の免疫抑制因子またはそのエピトープ部分に対する抗体。 36.請求項1に記載の因子を阻害する薬剤。 37.抗CD3とIL-2を含む請求項36に記載の薬剤。 38.請求項1に記載の因子の発現に対するアンチセンス構成物。 39.請求項1に記載の因子をコード化する遺伝子。 40.請求項1に記載の因子からなるワクチン。 41.免疫抑制モニター用キットであって、TCRサブユニットタンパク質または シグナル変換経路のタンパク 質に対する抗体と、抗体-抗原複合体の形成検出手段とを、各々別個の容器に収 容してなるキット。 42.請求項1に記載の溶解性因子で処理した哺乳動物の細胞。 43.製薬的に許容し得る担体に担持させて請求項1に記載の因子を有効量を哺 乳動物に投与して、自己免疫を誘発するためまたは臓器移植を容易にするために 必要な免疫抑制を引き起こす哺乳動物の治療方法。 44.請求項32に記載の方法により製造した薬剤に製薬的に許容し得る希釈剤を 配合し、治療有効量を投与することを含む免疫抑制された哺乳動物の治療法。 45.哺乳動物の免疫抑制のレベルを測定する方法であって、 a)哺乳動物の細胞サンプルから核抽出物を作り、NF-kB/rel系の転写因子の レベルを測定するステップと、 b)上記パターンを、同一種の哺乳動物の免疫抑制されていない個体から採取 した同様の細胞サンプルを特徴づけるパターンと比較し、免疫抑制されていない 個体のパターンと顕著な差異があれば、これを哺乳動物の顕著な程度の免疫抑制 を示すものとするステップと、 を含む方法。 46.哺乳動物の細胞サンプルがリンパ球調製物である請求項45に記載の方法。 47.c-rel,p65,p50,p48,およびp44の存在または不存在によりパターンを 測定する請求項45に記載の方 法。 48.上記リンパ球調製物が、脾臓組織、末梢血液、腫瘍組織、リンパ節組織、 脳脊髄液、胸膜滲出液、および腹水を含む組織から調製されるものである請求項 46に記載の方法。 49.免疫療法に適する程度まで活性化できるTリンパ球を持つ患者の決定方法 であって、 a)患者のTリンパ球から得た核抽出物中のNF-κB/rel系の転写因子のパター ンを測定するステップと、 b)上記パターンを、免疫抑制されていない個体を特徴づけるパターンと比較 するステップと、 c)免疫抑制されていないヒトの治療に有効なしきい値以上の上記タンパク質 の発現レベルを有する患者を選択するステップと、 を含む方法。 50.上記リンパ球が、脾臓組織、末梢血液、腫瘍組織、リンパ節組織、脳脊髄 液、胸膜滲出液、および腹水を含む組織から誘導されるものである請求項49に記 載の方法。 51.刺激したTリンパ球により治療する、免疫療法に反応する疾患を持つ患者 の治療方法であって、請求項49に記載の方法により患者を選択する方法。 52.上記疾患が癌である請求項51に記載の方法。 53.上記癌が黒色腫である請求項52に記載の方法。 54.哺乳動物のTリンパ球の免疫抑制を起こす薬剤の 決定方法であって、 a)標本から作った核抽出物のNF-κB/relのパターンが同一種の哺乳動物の免 疫抑制がない個体の特徴を備えている哺乳動物Tリンパ球調製物を得るステップ と、 b)上記リンパ球調製物を免疫抑制すると考えられる薬剤の存在下で培養する ステップと、 c)培養した標本から得た核抽出物中のNF-κB/rel系の転写因子のパターンを 測定するステップと、 d)薬剤の存在下で培養しなかった標本中のパターンと比較して、パターンに 顕著な変化を起こす薬剤を決定するステップと、 を含む方法。 55.哺乳動物のTリンパ球の免疫抑制を逆転する薬剤の決定方法であって、 a)標本から作った核抽出物のNF-κB/rel系の転写因子のパターンが、同一種 の哺乳動物の免疫抑制がない個体の同様の標本を特徴づけるパターンとは顕著に 異なる免疫抑制がない哺乳動物のTリンパ球調製物を用意するステップと、 b)上記リンパ球調製物を免疫抑制を逆転すると考えられる薬剤の存在下で培 養するステップと、 c)培養物から核抽出物を作りNF-κB/relの転写因子のパターンを測定するス テップと、 d)パターンを顕著に変化させて、同一種の哺乳動物の免疫抑制がない個体の 同様の標本を特徴づけるパタ ーンとはあまり大きな差異がないようにする薬剤を決定するステップと、 を含む方法。 56.上記薬剤がin vivoに存在する請求項55に記載の方法。 57.製薬的に許容し得る希釈剤中の請求項55に記載の薬剤の治療有効量を投与 することよりなる免疫抑制された哺乳動物の治療方法。 58.上記哺乳動物がヒトである請求項57に記載の方法。 59.免疫抑制モニター用キットにおいて、NF-κB/rel系転写因子に対する抗 体と、抗体-抗原複合体の形成検出手段とをそれぞれの容器に収容してなるキッ ト。 60.免疫抑制または腫瘍を持つ哺乳動物の生体内においてNH-κB転写因子系の p50の分解により形成される実質的に純粋なポリペプチド。 61.p44とp48とからなる群より選ばれる請求項60に記載のポリペプチド。 62.免疫抑制を持つ哺乳動物から採取するTリンパ球の核抽出物中のp50には存 在するが、p50に置き変わるタンパク質には存在しないアミノ酸配列に対する抗 体。 63.上記抗体が請求項62による抗体である請求項60に記載のキット。
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