BR112021008169A2 - Domínio de ligação - Google Patents

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BR112021008169A2
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Anna Bulek
Martin Pulé
Shaun Cordoba
Simon Thomas
Shimobi Onuoha
Mathieu Ferrari
Vania Baldan
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Abstract

domínio de ligação. a presente invenção fornece um domínio de ligação ao antígeno variante que compreende pelo menos uma mutação no domínio vh, em comparação com um anticorpo de referência, e exibindo uma afinidade aumentada para trbc2 em relação ao anticorpo de referência. fornece ainda um anticorpo, um receptor de antígeno quimérico (car) e um engajador de células t biespecíficas (bite), uma célula que compreende o referido car e um conjugado compreendendo o referido domínio de ligação ao antígeno variante ou o referido anticorpo. além disso, fornece usos médicos, métodos de diagnóstico e métodos de medicina personalizada que exploram os produtos da invenção.

Description

DOMÍNIO DE LIGAÇÃO CAMPO DE INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a domínios de ligação a variantes de antígeno que se ligam especificamente a TRBC2. Também se refere a células e agentes úteis no tratamento e diagnóstico de doenças malignas de células T.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] As malignidades linfóides podem ser amplamente divididas naquelas que são derivadas de células T ou células B. As malignidades de células T são um grupo de doenças clínica e biologicamente heterogênea, juntas compreendendo 10 - 20% dos linfomas não-Hodgkin e 20% das leucemias agudas. Os subtipos histológicos mais comumente identificados são linfoma de células T periférico, sem outra especificação (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL) e linfoma anaplásico de células grandes (ALCL). De todas as leucemias linfoblásticas agudas (LLA), cerca de 20% são de um fenótipo de células T.
[003] Essas condições normalmente se comportam de forma agressiva, em comparação, por exemplo, com doenças malignas de células B, com sobrevida estimada em 5 anos de apenas 30%. No caso do linfoma de células T, estão associados a uma alta proporção de pacientes que apresentam doença disseminada, escore do Indicador Prognóstico Internacional (IPI) desfavorável e prevalência de doença extranodal. A quimioterapia sozinha geralmente não é eficaz e menos de 30% dos pacientes são curados com os tratamentos atuais.
[004] Além disso, ao contrário de malignidades de células B, onde imunoterapias como o anticorpo monoclonal anti-CD20 rituximabe melhoraram dramaticamente os resultados, não há atualmente nenhum imunoterapêutico equivalente eficaz e minimamente tóxico disponível para o tratamento de doenças malignas de células T. Uma dificuldade importante no desenvolvimento da imunoterapia para distúrbios de células T é a sobreposição considerável na expressão de marcadores de células T clonais e normais, sem um único antígeno claramente capaz de identificar células clonais (malignas).
[005] Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) de células T têm se mostrado promissoras no tratamento de malignidades de células B refratárias. O direcionamento de malignidades de células T é provavelmente igualmente eficaz, mas a aplicação de CARs em doenças como o linfoma de células T tem sido dificultada por uma escassez de antígenos alvo adequados. Ao contrário dos linfomas de células B, em que a ablação do compartimento de células B é uma toxicidade controlável e pode ser tratada com a administração de imunoglobulina intravenosa, a destruição do compartimento de células T não será bem tolerada e levará a complicações associadas à supressão da imunidade mediada por células.
[006] Um método para tratar linfomas de células T e leucemias consistindo em direcionar a região constante da cadeia beta de TCR (TRBC) foi previamente descrito no documento WO 2015/132598. Esta abordagem é baseada em uma característica única do receptor de células T, isto é, que cada TCR codifica TRBC1 ou TRBC2 de uma forma mutuamente exclusiva. Como os linfomas de células T e as leucemias são uma população clonal de células, cada linfoma expressará um
TCR, com TRBC1 ou TRBC2, na superfície.
[007] O anticorpo monoclonal Jovi-1 se liga especificamente a TRBC1 e tem sido usado como o domínio de ligação CAR para uma terapia que trata linfomas de células T (Maciocia et al., 2017, Nat Med 23: 1416-23; WO 2015/132598). Essa terapia proposta permite o tratamento de um subconjunto de pacientes que expressam um TCR com a região constante do TRBC1.
[008] A fim de tratar toda a população de pacientes, um ligante/CAR direcionado a TRBC2 é necessário. Um método para obter anticorpos que são específicos para TRBC2 é por seleções de fago em uma biblioteca de exibição de fago humano. Outro método consiste em imunizar animais com peptídeos derivados de TRBC2 e, posteriormente, selecionar anticorpos específicos. Ambas as abordagens foram realizadas com sucesso e vários ligantes específicos de TRBC2 foram gerados, conforme divulgado no documento WO 2015/132598.
[009] A presente invenção fornece ligantes alternativos que são específicos para TRBC2 e que são potenciais agentes terapêuticos para o tratamento de linfomas ou leucemias TRBC2+.
SUMÁRIO DOS ASPECTOS DA INVENÇÃO
[0010] Os presentes inventores resolveram a estrutura cristalina de JOVI-1 (Viney et al., 1992, Hybridoma 11: 701-13), um anticorpo monoclonal específico para TRBC1, em complexo com um TRBC1-TCR de 2,4Å (Figura 3). A partir da estrutura cristalina, foi possível projetar o anticorpo Jovi-1 original para se ligar ao TRBC2. Este método é particularmente atraente porque uma série de aminoácidos dentro do anticorpo formam o paratopo que fornece complementaridade de forma para permitir o engajamento do TCR, enquanto apenas alguns serão necessários para a especificidade para TRBC1. Por meio da biologia computacional e da engenharia de proteínas, os inventores projetaram racionalmente versões mutantes de ligantes TRBC1 que são específicos para TRBC2 e têm uma afinidade diminuída para TRBC1.
[0011] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um domínio de ligação ao antígeno variante que compreende pelo menos uma mutação no domínio VH em comparação com um anticorpo de referência tendo um domínio VH com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 e um domínio VL com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2, em que pelo menos uma mutação no domínio VH é selecionada a partir de T28K, Y32K e A100N, e, em que o domínio de ligação ao antígeno variante exibe uma afinidade aumentada para TRBC2 sobre o anticorpo de referência.
[0012] O domínio de ligação ao antígeno variante pode compreender pelo menos duas mutações no domínio VH selecionadas a partir de T28K, Y32K e A100N. Por exemplo, pode compreender mutações Y32K e A100N. O domínio de ligação ao antígeno variante pode compreender ainda a mutação T28R no domínio VH ou, alternativamente, a mutação G31K no domínio VH.
[0013] O domínio de ligação ao antígeno variante pode compreender mutações T28K, Y32K e A100N.
[0014] O domínio de ligação ao antígeno variante pode compreender ainda pelo menos uma mutação em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 e A107 no domínio VH, N35 no domínio VL e R55 em o domínio VL. A pelo menos uma outra mutação pode ser selecionada a partir de: a) no domínio VH: - V2K, V2R, - Y27F, Y27M, Y27N, Y27W, - G31K, G31R, G31S, - R98K, - Y102F, Y102L, - N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y, - A107S, e b) no domínio VL: - N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R e - R55K.
[0015] O domínio de ligação ao antígeno variante pode ser selecionado a partir de um domínio de ligação ao antígeno variante compreendendo as seguintes combinações de mutação: - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y27N no domínio VH - T28K, Y32F, A100N, G31K no domínio VH - T28K, Y32F, A100N, Y27M no domínio VH - T28K, Y32F, A100N, Y27W no domínio VH - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e R55K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103H no domínio VH - T28K, Y32F, A100N, N103A no domínio VH - T28K, Y32F, A100N, N103Y no domínio VH
- T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M, no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, R98K no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35K no domínio VL,
[0016] - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35K no domínio VL,
- T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y27F no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103Q no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, G31R no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, V2R no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, G31S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, A107S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103E no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, V2K no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103E no domínio VH - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35F no domínio VL,
- T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F no domínio VH, e - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL.
[0017] O domínio de ligação ao antígeno variante pode compreender mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH e mutação N35K no domínio VL.
[0018] O domínio de ligação ao antígeno variante pode compreender mutações T28K, Y32F e A100N no domínio VH.
[0019] O domínio de ligação ao antígeno variante pode ainda exibir uma afinidade diminuída para TRBC1 sobre o anticorpo de referência.
[0020] A razão das afinidades do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 e TRBC1 é de pelo menos 2.
[0021] A razão das afinidades do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 e TRBC1 é de pelo menos 5.
[0022] A razão das afinidades do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 e TRBC1 é de pelo menos 10.
[0023] O domínio de ligação ao antígeno variante pode compreender ainda um domínio de oligomerização.
[0024] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante de acordo com o primeiro aspecto da invenção.
[0025] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante de acordo com o primeiro aspecto da invenção, um espaçador, um domínio transmembrana e um endodomínio.
[0026] O espaçador pode ser selecionado a partir de uma haste CD8 humana como mostrado na SEQ ID NO: 7 e um espaçador COMP como mostrado na SEQ ID NO: 19.
[0027] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um engajador de células T biespecífico (BiTE) compreendendo um domínio de ligação ao antígeno variante de acordo com o primeiro aspecto da invenção e um domínio de ativação de células T.
[0028] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao antígeno variante de acordo com o primeiro aspecto da invenção, um anticorpo de acordo com o segundo aspecto da invenção, um CAR de acordo com o terceiro aspecto da invenção ou um BiTE, de acordo com o quarto aspecto da invenção.
[0029] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece um vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico de acordo com o quinto aspecto da invenção.
[0030] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma célula que compreende um CAR de acordo com o terceiro aspecto da invenção.
[0031] Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma célula, de acordo com o sétimo aspecto da invenção, que compreende a etapa de transdução ou transfecção de uma célula com um vetor de acordo com o sexto aspecto da invenção que compreende uma sequência de ácido nucleico codificação do CAR.
[0032] Em um nono aspecto, a presente invenção fornece um conjugado que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante de acordo com o primeiro aspecto da invenção, ou um anticorpo de acordo com o segundo aspecto da invenção e uma entidade detectável ou uma entidade quimioterapêutica.
[0033] O conjugado pode compreender uma entidade quimioterapêutica.
[0034] Em um décimo aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento de um linfoma de células T ou leucemia em um sujeito que compreende a etapa de administração de uma célula de acordo com o sétimo aspecto da invenção, ou um anticorpo de acordo com o segundo aspecto do invenção, ou um BiTE de acordo com o quarto aspecto da invenção, ou um conjugado de acordo com o nono aspecto da invenção a um sujeito, em que as células T malignas expressam
TRBC2.
[0035] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[0036] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma célula, de acordo com o sétimo aspecto da invenção, ou um anticorpo, de acordo com o segundo aspecto da invenção, ou um BiTE, de acordo com o quarto aspecto da invenção, ou um conjugado, de acordo com o nono aspecto da invenção para uso em medicina.
[0037] Em um décimo segundo aspecto, a presente invenção fornece uma célula de acordo com o sétimo aspecto da invenção, ou um anticorpo de acordo com o segundo aspecto da invenção, ou um BiTE de acordo com o quarto aspecto da invenção, ou um conjugado de acordo com o nono aspecto da invenção para uso no tratamento de um linfoma de células T ou leucemia, em que as células T malignas expressam TRBC2.
[0038] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[0039] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma célula, de acordo com o sétimo aspecto da invenção, ou um anticorpo, de acordo com o segundo aspecto da invenção, ou um BiTE, de acordo com o quarto aspecto da invenção, ou um conjugado, de acordo com o nono aspecto da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de um linfoma de células T ou leucemia, em que as células T malignas expressam TRBC2.
[0040] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[0041] Em um décimo quarto aspecto, a presente invenção fornece um agente de diagnóstico que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante de acordo com o primeiro aspecto da invenção, ou um anticorpo de acordo com o segundo aspecto da invenção.
[0042] O agente de diagnóstico pode ser para diagnosticar um linfoma de células T ou leucemia.
[0043] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[0044] Em um décimo quinto aspecto, a presente invenção fornece um método para diagnosticar um linfoma de células T ou leucemia em um sujeito que compreende a etapa de contatar um domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, ou um anticorpo, de acordo com o segundo aspecto da invenção, a uma amostra compreendendo células T do sujeito.
[0045] O método para diagnosticar um linfoma de células T ou leucemia em um sujeito pode compreender ainda uma etapa de determinação da porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra.
[0046] Uma porcentagem de 70% ou mais de células T positivas para TRBC2 na amostra pode ser indicativo da presença de um linfoma de células T ou leucemia.
[0047] A amostra pode ser, ou pode ser derivada de, uma amostra de sangue.
[0048] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[0049] Em um décimo sexto aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar indivíduos com um linfoma de células T ou leucemia elegíveis para tratamento com uma célula, de acordo com o sétimo aspecto da invenção, ou um anticorpo, de acordo com o segundo aspecto da invenção, ou um BiTE, de acordo com o quarto aspecto da invenção, ou um conjugado, de acordo com o nono aspecto da invenção, compreendendo a determinação da porcentagem de células T positivas para TRBC2 em uma amostra compreendendo células T do sujeito.
[0050] O sujeito pode ser elegível para o referido tratamento com uma célula de acordo com o sétimo aspecto da invenção, ou um anticorpo de acordo com o segundo aspecto da invenção, ou um BiTE de acordo com o quarto aspecto da invenção, ou um conjugado de acordo com o nono aspecto da invenção se a porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra for 70% ou mais.
[0051] A amostra pode ser, ou pode ser derivada de, uma amostra de sangue.
[0052] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[0053] Em um décimo sétimo aspecto, a presente invenção fornece um método para selecionar uma terapia compreendendo uma célula, de acordo com o sétimo aspecto da invenção, ou um anticorpo, de acordo com o segundo aspecto da invenção, ou um BiTE, de acordo com o quarto aspecto da invenção, ou um conjugado, de acordo com o nono aspecto da invenção para o tratamento de um sujeito compreendendo a determinação da porcentagem de células T positivas para TRBC2 em uma amostra compreendendo células T do sujeito.
[0054] A referida terapia pode ser selecionada para tratar o referido sujeito se a porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra for de 70% ou mais.
[0055] A amostra pode ser, ou pode ser derivada de, uma amostra de sangue.
[0056] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal,
cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0057] A Figura 1 mostra um diagrama do complexo receptor de células T αβ / CD3. O receptor de células T é formado por 6 cadeias de proteínas diferentes que devem se reunir no retículo endoplasmático para serem expressas na superfície celular. As quatro proteínas do complexo CD3 (CD3ζ, CD3γ, CD3ε e CD3δ) revestem o receptor de células T (TCR). Este TCR imbui o complexo com a especificidade de um antígeno particular e é composto de duas cadeias: TCRα e TCRβ. Cada cadeia de TCR tem um componente variável distal à membrana e um componente constante próximo à membrana. Quase todos os linfomas de células T e muitas leucemias de células T expressam o complexo TCR / CD3.
[0058] A Figura 2 mostra a segregação da região constante β do receptor de células T (TRBC)-1 e TRBC2 durante o rearranjo do receptor de células T. Cada cadeia beta de TCR é formada a partir da recombinação genômica de uma determinada variável beta (V), diversidade (D), junção (J) e regiões constantes (TRBC). O genoma humano contém dois loci TRBC muito semelhantes e funcionalmente equivalentes, conhecidos como TRBC1 e TRBC2. Durante o rearranjo do gene TCR, uma região J se recombina com TRBC1 ou TRBC2. Esse rearranjo é permanente. As células T expressam muitas cópias de um único TCR em sua superfície, portanto, cada célula T expressará um TCR cuja região constante da cadeia β é codificada por TRBC1 ou TRBC2.
[0059] A Figura 3 mostra a interface estrutural entre o TCR Beta e o fragmento Fab do anticorpo específico para TRBC1 Jovi-1.
[0060] A Figura 4. Mostra o diagrama da estrutura dos receptores de antígenos quiméricos específicos para TRBC1 e TRBC2 (CARs).
[0061] A Figura 5 mostra a caracterização funcional de um CAR anti-TRBC2. Produção de IFN-γ por (A) o CAR mutante triplo anti-TRBC2, e (B) o CAR anti-TRBC1, incubado na presença de TRBC1 ou TRBC2.
[0062] A Figura 6 mostra a atividade citotóxica de (A) as células CAR-T mutantes triplo anti-TRBC2, e (B) as células CAR-T anti-TRBC1, co-incubadas com células Raji WT, Raji TRBC1 + ou Raji TRBC2+.
[0063] A Figura 7 mostra a ativação específica do antígeno de células Jurkat transduzidas com CARs anti-TRBC2 que foram co-incubados com células HPB TRBC1 e HPB TRBC2. Células Jurkat (TRBC1 +) foram transduzidas com construtos de CAR anti-TRBC2 de segunda geração e co-incubadas com células HPB TRBC1 e HPB TRBC2 em uma razão E: T de 1:1. Os controles incluíram células Jurkat não transduzidas (NT), células HPB-ALL com um TCR nocauteado (denominado HPB KO) e células Jurkat transduzidas plaqueadas por conta própria como controles negativos ou com anticorpos αCD3 / αCD28 como controle de ensaio positivo, respectivamente . N35K: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35K no domínio VL de hJovi-1; N103L: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH de hJovi-1; N103M-N35Y: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35Y no domínio VL de hJovi-1; Y102F-N103M-N35R: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL de hJovi-1; e Y102L-N103M-N35R: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL de hJovi-1.
[0064] A Figura 8 mostra a atividade citotóxica de células T anti-TRBC2 CAR-T co-incubadas com células TRBC1 + HPB-ALL e TRBC2 + HPB-ALL. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram transduzidas com construções de CAR anti-TRBC2 de segunda geração. PBMCs transduzidos foram co- incubados com células TRBC1 + HPB-ALL e TRBC2 + HPB-ALL em uma razão E:T de 1:2. Os controles incluíram células não transduzidas (NT), células transduzidas com anti-TRBC1 hJovi-1 CAR (JOVI) e células HPB-ALL com um TCR nocauteado (HPB-KO). N35K: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35K no domínio VL de hJovi-1; N103L: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH de hJovi- 1; N103M-N35Y: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35Y no domínio VL de hJovi-1; Y102F-N103M- N35R: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL de hJovi-1; e Y102L-N103M- N35R: ligante com mutações T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL de hJovi-1.
[0065] A Figura 9 mostra a análise do efeito de diferentes formatos de anticorpos na ligação de anticorpos anti-TRBC2 por ressonância plasmônica de superfície (SPR).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0066] Os presentes inventores resolveram a estrutura cristalina de Jovi-1, que serviu para identificar dois resíduos-chave que são essenciais para a especificidade de TRBC1 (Figura 1). Curiosamente, esses resíduos se encontram em CDR 1 em oposição a CDR 3, que geralmente conduz a especificidade do anticorpo. Além disso, outros resíduos que se encontram em estreita proximidade com o epítopo TRBC1 serão provavelmente essenciais para projetar a especificidade de TRBC1 para TRBC2. Resíduos em Jovi-1 que estão envolvidos na ligação de TRBC1 ou que são importantes para gerar especificidade de TRBC2 são aqui descritos.
[0067] A presente invenção fornece variantes do domínio de ligação ao antígeno de JOVI-1 com uma afinidade aumentada para a região constante 2 de TCR beta (TRBC2) do que JOVI-1.
1. Região constante TCR β (TRBC)
[0068] O receptor de células T (TCR) é expresso na superfície dos linfócitos T e é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Quando o TCR se engaja com o peptídeo antigênico e MHC (peptídeo / MHC), o linfócito T é ativado por meio de uma série de eventos bioquímicos mediados por enzimas associadas, co-receptores, moléculas adaptadoras especializadas e fatores de transcrição ativados ou liberados.
[0069] O TCR é um heterodímero ancorado à membrana ligado por dissulfeto normalmente consistindo nas cadeias alfa (α) e beta (β) altamente variáveis expressas como parte de um complexo com as moléculas de cadeia CD3 invariantes. As células T que expressam este receptor são referidas como células T α: β (ou αβ) (~ 95% do total de células T). Uma minoria de células T expressa um receptor alternativo, formado por cadeias gama (γ) e delta (δ) variáveis, e são referidas como células T γδ (~ 5% do total de células T).
[0070] Cada cadeia α e β é composta por dois domínios extracelulares: região variável (V) e região constante (C), ambas do domínio da superfamília de imunoglobulinas (IgSF) formando folhas β antiparalelas. A região constante é proximal à membrana celular, seguida por uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática curta, enquanto a região variável se liga ao complexo peptídeo / MHC. A região constante do TCR consiste em sequências de conexão curtas nas quais um resíduo de cisteína forma ligações dissulfeto, que formam uma ligação entre as duas cadeias.
[0071] Os domínios variáveis de ambas as cadeias TCR α e β têm três regiões hipervariáveis ou determinantes de complementaridade (CDRs). A região variável da cadeia β também tem uma área adicional de hipervariabilidade (HV4), no entanto, isso normalmente não entra em contato com o antígeno e, portanto, não é considerado um CDR.
[0072] O TCR também compreende até cinco cadeias invariantes γ, δ, ε (denominadas coletivamente CD3) e ζ. As subunidades CD3 e ζ medeiam a sinalização de TCR através de domínios citoplasmáticos específicos que interagem com o segundo mensageiro e moléculas adaptadoras após o reconhecimento do antígeno por αβ ou γδ. A expressão da superfície celular do complexo de TCR é precedida pela montagem de pares de subunidades nas quais os domínios transmembrana e extracelular de TCR α e β e CD3 γ e δ desempenham um papel.
[0073] Os TCRs são, portanto, comumente compostos pelo complexo CD3 e pelas cadeias α e β do TCR, que, por sua vez, são compostas por regiões variáveis e constantes (Figura 1).
[0074] O locus (Chr7:q34) que fornece a região constante β do TCR (TRBC) se duplicou na história evolutiva para produzir dois genes quase idênticos e funcionalmente equivalentes: TRBC1 e TRBC2 (Figura 2). Cada TCR compreenderá, de forma mutuamente exclusiva, TRBC1 ou TRBC2 e, como tal, cada célula T αβ expressará TRBC1 ou TRBC2, de forma mutuamente exclusiva.
[0075] Os presentes inventores determinaram previamente que, apesar da semelhança entre a sequência do TRBC1 e do TRBC2, é possível discriminar entre eles. Os inventores também determinaram previamente que as sequências de aminoácidos de TRBC1 e TRBC2 podem ser discriminadas, enquanto in situ na superfície de uma célula, por exemplo, uma célula T (WO 2015/132598).
2. Domínio de ligação ao antígeno variante
[0076] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um domínio de ligação ao antígeno variante, doravante "o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção", que compreende pelo menos uma mutação no domínio VH em comparação com um anticorpo de referência tendo um domínio VH com o sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 e um domínio VL com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2, em que pelo menos uma mutação no domínio VH é selecionada a partir de T28K, Y32F e A100N, e, em que o domínio de ligação ao antígeno variante exibe uma afinidade aumentada para TRBC2 em relação ao anticorpo de referência.
[0077] O termo "variante" ou "mutante", tal como aqui utilizado, se refere a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo especificamente recitado, ou seja, polipeptídeo de referência ou parental por inserções, deleções e / ou substituições de aminoácidos, criado usando, por exemplo, Técnicas de DNA recombinante ou por síntese de novo. Variante e mutante são usados indistintamente no contexto da presente invenção. Os domínios de ligação ao antígeno variante da presente invenção incluem moléculas de ligação ao antígeno, em que um ou vários dos resíduos de aminoácidos são modificados por substituição, adição e / ou deleção, de tal maneira que afeta substancialmente a afinidade de ligação ao domínio de ligação ao antígeno de referência ou parental.
[0078] O termo "domínio de ligação ao antígeno", tal como aqui utilizado, se refere às regiões variáveis de cada par de cadeias leves e pesadas do anticorpo, ou seja, os domínios VL e VH, respectivamente, que formam seu local de ligação. Eles são caracterizados pela mesma estrutura geral constituída por regiões relativamente preservadas chamadas frameworks (FR) unidas por três regiões hiper-variáveis chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR) (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. , NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD; Chothia & Lesk, 1987, J Mol Biol 196: 901-17). O termo "região determinante de complementaridade" ou "CDR", tal como aqui utilizado, se refere à região dentro de um anticorpo que complementa a forma de um antígeno. Assim, os CDRs determinam a afinidade da proteína (aproximadamente,
força de ligação) e especificidade para antígenos específicos. Os CDRs das duas cadeias de cada par são alinhados pelas regiões de framework, adquirindo a função de ligação a um epítopo específico.
[0079] O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende pelo menos uma mutação no domínio VH em comparação com um anticorpo de referência. Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo de referência" se refere a um anticorpo JOVI-1 humanizado, ou seja, hJOVI-1, que compreende um domínio VH com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 e um domínio VL com a sequência mostrada na SEQ ID NO:
2. Murine JOVI-1 foi previamente divulgado por Viney et al. (1992; como acima) e está disponível comercialmente (Abcam, ab5465). Foi previamente determinado que JOVI-1 é capaz de discriminar células com base na expressão específica de TRBC1 ou TRBC2 ligando-se especificamente apenas a TRBC1 (WO 2015/132598).
[0080] SEQ ID NO: 1 (Domínio VH de hJOVI-1):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSS
[0081] SEQ ID NO: 2 (Domínio VL de hJOVI-1):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNR FPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIK
[0082] Doravante, qualquer referência ao domínio VH significa o domínio VH de hJOVI-1 mostrado na SEQ ID NO: 1, a menos que estipulado de outra forma, e qualquer referência ao domínio VL significa o domínio VL de hJOVI-1 mostrado na SEQ ID NO: 2, a menos que estipulado de outra forma.
[0083] Os presentes inventores determinaram que a presença de pelo menos uma mutação selecionada a partir de T28K, Y32F e A100N no domínio VH do anticorpo de referência desencadeia um aumento na afinidade para TRBC2 do domínio de ligação ao antígeno variante da invenção sobre o anticorpo de referência (Exemplo 1).
[0084] O termo "afinidade", tal como aqui utilizado, se refere à força de interação entre o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo e um epítopo. Os anticorpos de alta afinidade se ligam a uma quantidade maior de antígeno em um período mais curto de tempo do que os anticorpos de baixa afinidade. A afinidade é geralmente medida como a constante de dissociação de equilíbrio (KD), que é uma razão de koff / kon, entre o anticorpo e o antígeno. A afinidade de um domínio de ligação ao antígeno para qualquer determinado antígeno pode ser quantificada usando qualquer método convencional, incluindo, sem limitação, métodos dependentes de marcação, tais como ELISA direto e indireto e métodos de radioimunoensaio, bem como métodos livres de marcação que permitem uma detecção e medição de interações em tempo real, como ressonância de plasmon de superfície e interferência de bio-camada.
[0085] A afinidade do domínio de ligação ao antígeno variante da invenção para TRBC2 é aumentada em relação ao anticorpo de referência. A afinidade do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 pode ser aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900%, pelo menos 1.000%, pelo menos 5.000% ou pelo menos 10.000% sobre a afinidade do anticorpo de referência para TRBC2.
[0086] O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender a mutação T28K no domínio VH. O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender a mutação Y32F no domínio VH. O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender a mutação A100N no domínio VH.
[0087] O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender pelo menos duas mutações no domínio VH selecionadas a partir de T28K, Y32F e A100N. As pelo menos duas mutações podem ser Y32F e A100N. Em uma concretização, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender mutações Y32F e A100N e ainda compreender a mutação T28R no domínio VH. Em outra concretização, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender mutações Y32F e A100N e ainda compreender a mutação G31R no domínio VH.
[0088] O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender mutações T28K, Y32F e A100N no domínio VH.
[0089] Em outra concretização, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K,
Y32F e A100N no domínio VH e compreende ainda pelo menos uma mutação em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 e A107 no domínio VH, e N35 e R55 no domínio VL.
[0090] O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou sete mutações em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 e A107 no Domínio VH e N35 e R55 no domínio VL. O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender mutações T28K, Y32F e A100N no domínio VH e pode compreender ainda uma mutação na posição V2 no domínio VH, uma mutação na posição Y27 no domínio VH, uma mutação na posição G31 no domínio VH, uma mutação na posição R98 no domínio VH, uma mutação na posição Y102 no domínio VH, uma mutação na posição N103 no domínio VH, uma mutação na posição A107 no domínio VH, uma mutação na posição N35 no domínio VL, e uma mutação na posição R55 no domínio VL.
[0091] O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender mutações T28K, Y32F e A100N no domínio VH e compreende ainda pelo menos uma mutação selecionada a partir de: a) no domínio VH: - V2K, V2R, - Y27F, Y27M, Y27N, Y27W, - G31K, G31R, G31S, - R98K, - Y102F, Y102L, - N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q,
N103S, N103W, N103Y e - A107S, e b) no domínio VL: - N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R e - R55K.
[0092] O domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode ser selecionado a partir de um domínio de ligação ao antígeno variante compreendendo as seguintes combinações de mutação: - T28K, Y32F, A100N, Y27N no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, G31K no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y27M no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y27W no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e R55K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103H no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103A no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103Y no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M, no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35K no domínio VL,
[0093] - T28K, Y32F, A100N, R98K no domínio VH,
- T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH,
[0094] - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y27F no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103Q no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, G31R no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, V2R no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, G31S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, A107S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103E no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, V2K no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103E no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL,
- T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F no domínio VH, e - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL.
[0095] Demonstrou-se que essas mutações combinadas específicas alteram a ligação a TRBC2 e TRBC1 de uma maneira que é útil para o direcionamento de TRBC2 (ver Tabela 1).
[0096] Tabela 1: Afinidades dos domínios de ligação ao antígeno variantes da invenção para TRBC2 e TRBC1. Razão Mutação(s) KD TRBC1 KD TRBC2: KD TRBC2 Mutação(s) no domínio no domínio (M) KD TRBC1 (M) VH VL T28K, Y32F, A100N, - N/A 2.61E-06 - Y102F T28K, Y32F, A100N, N35R N/A 1.90E-06 - Y102L, N103M T28K, Y32F, A100N, N35K N/A 1.72E-06 - Y102L, N103W N/A - 1.51E-06 T28K, Y32F, A100N, N35R Y102L, N103W T28K, Y32F, A100N, -
2.93E-06 1.30E-06
2.255778 N103E
3.14E-06 2.310066 1.36E-06 G31R, Y32F, A100N -
1.44E-06 2.483233 5.82E-07 T28R, Y32F, A100N - V2K, T28K, Y32F, -
2.40E-06 8.83E-07
2.718831 A100N
N103E, T28K, Y32F, N35M
5.83E-06 2.13E-06
2.735336 A100N
8.81E-07 2.994222 2.94E-07 T28K, Y32F, A100N, N35K N103F T28K, Y32F, A100N, -
3.59E-06
3.094047 1.16E-06 A107S G31S, T28K, Y32F, -
3.68E-06 1.17E-06
3.149100 A100N V2R, T28K, Y32F, -
5.11E-06
3.193125 1.60E-06 A100N
2.902E-07 3.213376 9.031E-08 T28K, Y32F, A100N, N35R N103M N103W, T28K, Y32F, N35F
1.68E-06 5.10E-07
3.301942 A100N T28K, G31R, Y32F, -
1.74E-05 4.95E-06
3.506467 A100N N103F, T28K, Y32F, N35F
1.61E-06
3.513396 4.59E-07 A100N N103F, T28K, Y32F, N35M
4.59E-07 1.30E-07
3.524942 A100N N103M, T28K, Y32F, N35F
4.59E-07 1.30E-07
3.524942 A100N T28K, Y32F, A100N, -
3.54E-06 9.83E-07
3.596054 N103S T28K, Y32F, A100N, -
1.77E-06
3.664737 4.84E-07 N103Q Y27F, T28K, Y32F, -
1.21E-06
4.48E-06 3.690025 A100N N103F, T28K, Y32F, N35Y
5.01E-07
1.86E-06 3.715825 A100N N103W, T28K, Y32F, N35M
2.28E-06 6.11E-07
3.733421 A100N
N103L, T28K, Y32F, N35F
1.38E-06 3.69E-07
3.743229 A100N N103L, T28K, Y32F, N35K
7.07E-07 1.87E-07
3.775107 A100N T28K, Y32F, A100N, -
1.65E-06 4.25E-07
3.884706 N103W T28K, Y32F, A100N, -
1.06E-06 2.70E-07
3.920770 N103F N103L, T28K, Y32F, N35Y
1.93E-06 4.80E-07
4.012925 A100N N103W, T28K, Y32F, N35K
1.68E-06 4.17E-07
4.031175 A100N N103L, T28K, Y32F, N35R
8.10E-07
4.038404 2.01E-07 A100N N103L, T28K, Y32F, N35M
1.50E-06 3.64E-07
4.114898 A100N N103S, T28K, Y32F, N35Y
7.83E-06 1.88E-06
4.167642 A100N N103S, T28K, Y32F, N35F
6.58E-06 1.56E-06
4.227506 A100N T28K, Y32F, A100N, -
1.28E-06 3.02E-07
4.227966 N103L
7.328E-07 4.248116 1.725E-07 T28K, Y32F, A100N, N35Y N103M N103S, T28K, Y32F, N35R
3.93E-06 9.17E-07
4.289299 A100N T28K, Y32F, R98K, -
4.66E-06 1.08E-06
4.317593 A100N N103S, T28K, Y32F, N35K
3.68E-06 8.51E-07
4.321147 A100N
2.81E-06 4.355638 6.46E-07 T28K, Y32F, A100N N35F N103W, T28K, Y32F, N35R
3.90E-07
1.73E-06 4.428205 A100N
3.76E-07 4.498924 8.36E-08 T28K, Y32F, A100N, - N103M N103S, T28K, Y32F, N35M
8.22E-06 1.83E-06
4.503834 A100N
9.29E-07 4.596239 2.02E-07 T28K, Y32F, A100N N35R T28K, Y32F, A100N, -
1.58E-06 3.39E-07
4.655835 N103Y T28K, Y32F, A100N, -
3.39E-06 4.746499 7.14E-07 N103A T28K, Y32F, A100N, -
2.02E-06 4.847246 4.16E-07 N103H
6.48E-07 4.963247 1.31E-07 T28K, Y32F, A100N, N35M N103M
1.00E-06 5.231892 1.92E-07 T28K, Y32F, A100N N35K
9.62E-07 5.835558 1.65E-07 T28K Y32F A100N R55K
2.73E-06 6.317740 4.32E-07 T28K, Y32F, A100N - Y27W, T28K, Y32F, -
2.10E-05 3.06E-06
6.850702 A100N
1.89E-05 6.973733 2.70E-06 T28K, Y32F, A100N, N35R Y102F
7.91E-06 8.171210 9.68E-07 T28K, Y32F, A100N, N35R Y102F, N103M
1.13E-05 8.580106 1.32E-06 T28K, Y32F, A100N, N35F Y102F, N103M Y27M, T28K, Y32F, -
1.81E-05 2.09E-06
8.672100 A100N T28K, G31K, Y32F, -
3.11E-05 3.24E-06
9.620019 A100N T28K, Y32F, A100N, N35K
9.31E-06 9.09E-07
10.244171 Y102F, N103M Y27N, T28K, Y32F, -
7.43E-05 6.95E-06
10.702664 A100N N / A: não disponível; a ligação ao TRBC1 é praticamente zero e está fora dos limites de detecção do aparelho.
[0097] Em uma concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH.
[0098] Em outra concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N e Y27N no domínio VH.
[0099] Em outra concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N e N103M no domínio VH.
[00100] Em outra concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35K no domínio VL.
[00101] Em outra concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH.
[00102] Em outra concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e mutação N35Y no domínio VL.
[00103] Em outra concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e mutação N35R no domínio VL.
[00104] Em outra concretização particular, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção compreende mutações T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M no domínio VH e mutação N35R no domínio VL.
[00105] Seria particularmente vantajoso que o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção não apenas exibisse uma afinidade aumentada para TRBC2 em relação ao anticorpo de referência, mas também que sua afinidade para TRBC1 fosse diminuída em comparação com a do anticorpo de referência. Esta mudança na especificidade do antígeno permitiria que o domínio de ligação ao antígeno variante discriminasse entre TRBC2 e TRBC1, mostrando ligação preferencial a TRBC2. Assim, em outra concretização, o domínio de ligação ao antígeno variante exibe ainda uma afinidade diminuída para TRBC1 em relação ao anticorpo de referência.
[00106] A afinidade do domínio de ligação ao antígeno variante da invenção para TRBC1 é diminuída em relação ao anticorpo de referência. A afinidade do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 pode ser aumentada em pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900%, pelo menos 1.000%, pelo menos 5.000% ou pelo menos 10.000% sobre a afinidade do anticorpo de referência para TRBC1.
[00107] A razão das afinidades do domínio de ligação ao antígeno variante da invenção para TRBC2 e para TRBC1 pode ser pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6, ou pelo menos 7 , ou pelo menos 8, ou pelo menos 9, ou pelo menos 10, ou pelo menos 15, ou pelo menos 20, ou pelo menos 25, ou pelo menos 50, ou pelo menos 100, ou pelo menos 500, ou pelo menos 1.000 ou mais.
[00108] Ao aumentar a avidez do domínio de ligação ao antígeno variante da invenção no Exemplo 6, os presentes inventores descobriram inesperadamente que não apenas a avidez do domínio de ligação ao antígeno variante da invenção para TRBC2 foi aumentada, mas também que sua baixa afinidade para O TRBC1 foi mantido e, consequentemente, a especificidade do domínio de ligação do antígeno variante da invenção para o TRBC2 foi dramaticamente melhorada.
[00109] A avidez do domínio de ligação do antígeno variante da invenção para TRBC2 pode ser aumentada usando um domínio com a capacidade de formar oligômeros ou multímeros. Assim, o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção pode compreender ainda um domínio de oligomerização. O termo "domínio de oligomerização", tal como aqui utilizado, se refere a um domínio que se autoassocia para formar um oligômero, como um dímero ou trímero ou um multímero. Assim, como aqui utilizado, o termo domínio de oligomerização também se refere a um domínio de multimerização. Os domínios de oligomerização são bem conhecidos pelos versados na técnica e qualquer domínio de oligomerização pode ser usado com o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção, desde que o oligômero resultante mantenha ou melhore a afinidade do domínio de ligação ao antígeno variante do monômero para TRBC2. Exemplos de domínios de oligomerização incluem, sem limitação, a região Fc, espaçador COMP de SEQ ID NO: 18 ou um COMP truncado como descrito abaixo no contexto do receptor de antígeno quimérico (CAR) da invenção.
[00110] A presente invenção também contempla diferentes formatos para o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção incluindo, sem limitação, um scFv, diacorpo, trímero, minicorpo, fragmentos F(ab) e F(ab')2 e anticorpo inteiro, ou seja, IgG , IgM, IgA, IgD, IgE.
[00111] Assim, outro aspecto da invenção se refere a um anticorpo, doravante denominado "o anticorpo da invenção", que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante da invenção.
3. Receptores de antígenos quiméricos
[00112] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um receptor de antígeno quimérico (CAR), doravante "o CAR da invenção", compreendendo um domínio de ligação ao antígeno variante da invenção, um domínio transmembrana e um endodomínio.
[00113] O termo "domínio de ligação ao antígeno variante da invenção" foi descrito em detalhes no contexto do primeiro aspecto da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a este aspecto da invenção.
[00114] O termo "receptor de antígeno quimérico" ou "CAR" ou "receptor de células T quiméricas" ou "receptores de células T artificiais" ou "imunorreceptores quiméricos", como aqui utilizado, SE refere a uma proteína transmembrana quimérica tipo I que conecta um antígeno extracelular - domínio de reconhecimento (ligante) para um domínio de sinalização intracelular (endodomínio). O ligante é tipicamente um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal (mAb), mas pode ser baseado em outros formatos que compreendem um local de ligação ao antígeno. Um domínio espaçador é geralmente necessário para separar o ligante da membrana e para permitir uma orientação adequada. Um domínio espaçador comum usado é o Fc de IgG1. Espaçadores mais compactos podem ser suficientes, e. o talo de CD8α e mesmo apenas a dobradiça de IgG1 sozinha, dependendo do antígeno. Um domínio transmembranar ancora a proteína na membrana celular e conecta o espaçador ao endodomínio.
[00115] Os primeiros projetos de CAR tinham endodomínios derivados das partes intracelulares da cadeia γ do FcεR1 ou CD3ζ. Consequentemente, esses receptores de primeira geração transmitiram o sinal imunológico 1, que foi suficiente para desencadear a morte de células T de células- alvo cognatas, mas falhou em ativar totalmente a célula T para proliferar e sobreviver. Para superar esta limitação, endodomínios compostos foram construídos: a fusão da parte intracelular de uma molécula coestimuladora de células T à de CD3ζ resulta em receptores de segunda geração que podem transmitir um sinal de ativação e coestimulador simultaneamente após o reconhecimento do antígeno. O domínio coestimulatório mais comumente usado é o do CD28. Isso fornece o sinal co-estimulador mais potente - ou seja, o sinal imunológico 2, que dispara a proliferação de células T. Alguns receptores também foram descritos, os quais incluem endodomínios da família de receptores de TNF, como os intimamente relacionados OX40 e 4-1BB que transmitem sinais de sobrevivência. CARs de terceira geração ainda mais potentes foram agora descritos, os quais têm endodomínios capazes de transmitir sinais de ativação, proliferação e sobrevivência.
[00116] Quando o CAR se liga ao antígeno-alvo, isso resulta na transmissão de um sinal de ativação para a célula T na qual é expresso. Assim, o CAR direciona a especificidade e citotoxicidade da célula T para as células tumorais que expressam o antígeno alvo.
[00117] CARs tipicamente, portanto, compreendem: (i) um domínio de ligação ao antígeno; (ii) um espaçador; (iii) um domínio transmembranar; e (iii) um domínio intracelular que compreende ou se associa a um domínio de sinalização (ver Figura 4).
[00118] Um CAR pode ter a estrutura geral: Domínio de ligação ao antígeno - domínio espaçador - domínio transmembranar - domínio de sinalização intracelular (endodomínio).
3.1. Peptídeo sinal
[00119] O CAR da presente invenção pode compreender um peptídeo sinal de modo que quando o CAR é expresso dentro de uma célula, como uma célula T, a proteína nascente é direcionada para o retículo endoplasmático e, subsequentemente, para a superfície da célula, onde é expressa.
[00120] O núcleo do peptídeo sinal pode conter um longo trecho de aminoácidos hidrofóbicos que têm tendência a formar uma única alfa-hélice. O peptídeo sinal pode começar com um pequeno trecho de aminoácidos carregados positivamente, o que ajuda a reforçar a topologia adequada do polipeptídeo durante a translocação. No final do peptídeo sinal, há tipicamente um trecho de aminoácidos que é reconhecido e clivado pela peptidase sinal. A peptidase de sinal pode clivar durante ou após a conclusão da translocação para gerar um peptídeo sinal livre e uma proteína madura. Os peptídeos sinal livres são então digeridos por proteases específicas.
[00121] O peptídeo sinal pode estar no terminal amino da molécula.
[00122] O peptídeo sinal pode compreender a SEQ ID NO: 3 a 5 ou uma variante da mesma com 5, 4, 3, 2 ou 1 mutações de aminoácidos (inserções, substituições ou adições), desde que o peptídeo sinal ainda funcione para causar a expressão da superfície celular da proteína.
[00123] SEQ ID NO: 3: MGTSLLCWMALCLLGADHADG
[00124] O peptídeo sinal de SEQ ID NO: 3 é compacto e altamente eficiente. Prevê-se que ocorra uma clivagem de cerca de 95% após a glicina terminal, proporcionando uma remoção eficiente pela peptidase de sinal.
[00125] SEQ ID NO: 4: MSLPVTALLLPLALLLHAARP
[00126] O peptídeo sinal de SEQ ID NO: 4 é derivado de IgG1.
[00127] SEQ ID NO: 5: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
[00128] O peptídeo sinal de SEQ ID NO: 5 é derivado de CD8.
3.2. Domínio espaçador
[00129] CARs compreendem uma sequência espaçadora para conectar o domínio de ligação ao antígeno com o domínio transmembranar e separar espacialmente o domínio de ligação ao antígeno do endodomínio. Um espaçador flexível permite que o domínio de ligação ao antígeno se oriente em diferentes direções para facilitar a ligação.
[00130] No CAR da presente invenção, a sequência espaçadora pode, por exemplo, compreender uma região Fc de IgG1, uma dobradiça de IgG1 ou uma haste de CD8 humana ou a haste de CD8 de camundongo. O espaçador pode, alternativamente, compreender uma sequência de ligante alternativa que tem propriedades de espaçamento de comprimento e / ou domínio semelhantes a uma região Fc de IgG1, uma dobradiça de IgG1 ou uma haste de CD8. Um espaçador de IgG1 humana pode ser alterado para remover motivos de ligação Fc. O espaçador pode compreender um domínio de bobina em espiral, por exemplo, conforme descrito no documento WO 2016/151315.
[00131] O CAR da presente invenção pode compreender uma sequência selecionada a partir das sequências mostradas como SEQ ID NOs: 6 a 10 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 80% de identidade de sequência.
[00132] SEQ ID NO: 6 (Dobradiça-CH2CH3 de IgG1 humana)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
[00133] SEQ ID NO: 7 (Haste CD8 humana):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
[00134] SEQ ID NO: 8 (Dobradiça IgG1 humana):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
[00135] SEQ ID NO: 9 (Ectodomínio CD2)
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDT YKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINT TLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPV SCPEKGLD
[00136] SEQ ID NO: 10 (Ectodomínio CD34)
SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETT VKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTT STSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGE GLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDL KKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT
[00137] SEQ ID NO: 19 (COMP)
DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG
[00138] É possível truncar o domínio espiral enrolado COMP no terminal N e reter a expressão de superfície. O espaçador do espiral enrolado COMP pode, portanto, compreender ou consistir em uma versão truncada de SEQ ID NO: 18, que é truncada no terminal N. O COMP truncado pode compreender os 5 aminoácidos C-terminais de SEQ ID NO: 19, isto é, a sequência CDACG (SEQ ID NO: 20). O COMP truncado pode compreender 5 a 44 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 aminoácidos. O COMP truncado pode corresponder ao terminal C da SEQ ID NO: 19. Por exemplo, um COMP truncado compreendendo 20 aminoácidos pode compreender a sequência QQVREITFLKNTVMECDACG (SEQ ID NO: 21). O COMP truncado pode reter o (s) resíduo (s) de cisteína envolvido (s) na multimerização. COMP truncado pode reter a capacidade de formar multímeros.
3.3. Domínio transmembranar
[00139] O domínio transmembrana é a sequência do CAR que abrange a membrana.
[00140] Um domínio transmembranar pode ser qualquer estrutura de proteína que seja termodinamicamente estável em uma membrana. Esta é tipicamente uma hélice alfa composta por vários resíduos hidrofóbicos. O domínio transmembranar de qualquer proteína transmembranar pode ser usado para fornecer a porção transmembranar da invenção. A presença e extensão de um domínio transmembranar de uma proteína podem ser determinadas por aqueles versados na técnica usando o algoritmo TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-
2.0/). Além disso, dado que o domínio transmembranar de uma proteína é uma estrutura relativamente simples, ou seja, uma sequência polipeptídica prevista para formar uma hélice alfa hidrofóbica de comprimento suficiente para abranger a membrana, um domínio TM artificialmente projetado também pode ser usado (US 7,052,906 B1 descreve os componentes sintéticos transmembranares).
[00141] O domínio transmembranar pode ser derivado de CD28, CD8a ou TYRP-1, que proporcionam boa estabilidade do receptor. Em uma concretização, o domínio transmembranar é derivado de CD8a.
[00142] SEQ ID NO: 11: Domínio transmembranar CD8a IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT .
[00143] Em outra concretização, o domínio transmembranar é derivado de TYRP-1.
[00144] SEQ ID NO: 12: Domínio transmembranar TYRP-1
IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI
3.4. Endodomínio
[00145] O endodomínio é a parte de transmissão de sinal do CAR. Após o reconhecimento do antígeno, o agrupamento de receptores, CD45 e CD148 nativos são excluídos da sinapse e um sinal é transmitido para a célula. O componente endodomínio mais comumente usado é o do CD3ζ, que contém 3 ITAMs. Isso transmite um sinal de ativação para a célula T após a ligação do antígeno. O CD3ζ pode não fornecer um sinal de ativação totalmente competente e uma sinalização coestimulatória adicional pode ser necessária. Exemplos de domínios co-estimuladores incluem os endodomínios de CD28, OX40, 4-1BB, CD27 e ICOS, que podem ser usados com CD3ζ para transmitir um sinal proliferativo / de sobrevivência.
[00146] Em uma concretização, pelo menos um endodomínio coestimulador é usado com CD3ζ. Em uma concretização particular, o endodomínio co-estimulador é selecionado a partir do grupo que consiste nos endodomínios de CD28, OX40, 4-1BB, CD27 e ICOS.
[00147] Em outra concretização, pelo menos dois endodomínios coestimuladores são usados com CD3ζ. Em uma concretização particular, os dois endodomínios coestimuladores são selecionados do grupo que consiste nos endodomínios de CD28, OX40, 4-1BB, CD27 e ICOS, em qualquer combinação e ordem. Combinações particularmente adequadas incluem os endodomínios de CD28 e CD3ζ, os endodomínios de OX40 e CD3ζ, os endodomínios de 4-1BB e CD3ζ, os endodomínios de CD28, OX40 e CD3ζ e os endodomínios de CD28, 4-1BB e CD3ζ.
[00148] O domínio de sinalização de células T transmembrana e intracelular (endodomínio) de um CAR com um endodomínio de ativação pode compreender a sequência mostrada como SEQ ID NO: 13 a 18 ou uma variante desta tendo pelo menos 80% de identidade de sequência.
[00149] SEQ ID NO: 13 compreendendo o domínio transmembranar CD28 e o endodomínio CD3ζ.
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00150] SEQ ID NO: 14 compreendendo o domínio transmembranar CD28 e endodomínio CD3ζ
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL PPR
[00151] SEQ ID NO: 15 compreendendo o domínio transmembranar CD28, e endodomínios CD28, OX40 e CD3ζ
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE IGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00152] SEQ ID NO: 16 compreendendo o domínio transmembranar CD8a e endodomínio CD3ζ
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRVLYCKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLS TATKDTYDALHMQALPPR
[00153] SEQ ID NO: 17 compreendendo o domínio transmembranar CD8a e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
[00154] IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ
TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTA TKDTYDALHMQALPPR
[00155] SEQ ID NO: 18 compreendendo o domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
IAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEE EGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00156] Uma sequência variante pode ter pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13 a 18, desde que a sequência forneça um domínio transmembranar eficaz e um eficaz domínio intracelular de sinalização de célula T.
[00157] O CAR da invenção pode compreender uma sequência do grupo de sequências mostradas como SEQ ID NO: 25 a 36.
[00158] SEQ ID NO: 25: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH, mutação N35K no domínio VL, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00159] SEQ ID NO: 26: CAR compreendendo mutações
T28K, Y32F, A100N no domínio VH, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00160] SEQ ID NO: 27: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYLFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00161] SEQ ID NO: 28: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH, mutação N35Y no domínio VL, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYMFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGYTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00162] SEQ ID NO: 29: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH, mutação N35R no domínio VL, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGFMFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00163] SEQ ID NO: 30: CAR compreendendo T28K, Y32F, A100N, Y102L, mutações N103M no domínio VH, mutação N35R no domínio VL, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios 4-1BB e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00164] SEQ ID NO: 31: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH, espaçador de haste CD8, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínio 4-1BB e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCS CRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL HMQALPPR
[00165] SEQ ID NO: 32: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH, espaçador de haste CD8, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínio CD28 e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR
[00166] SEQ ID NO: 33: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínios CD28 e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYS EIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00167] SEQ ID NO: 34: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH, mutação N35K no domínio VL, espaçador de dobradiça IgG1, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínio CD28 e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTA SYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYS EIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00168] SEQ ID NO: 35: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH, mutação N35K no domínio VL, espaçador de haste CD8, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínio 4-1BB e CD3ζ
[00169] QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQG
LEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYN FDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQP FMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRRE EYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[00170] SEQ ID NO: 36: CAR compreendendo mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH, mutação N35K no domínio VL, espaçador de haste CD8, domínio transmembranar TYRP-1 e endodomínio CD28 e CD3ζ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR
4. Engajador de células T biespecíficas
[00171] Foi desenvolvida uma grande variedade de moléculas que se baseiam no conceito básico de ter dois domínios de ligação semelhantes a anticorpos.
[00172] As moléculas que envolvem células T biespecíficas são uma classe de moléculas do tipo anticorpo biespecíficas que foram desenvolvidas, principalmente, para uso como fármacos anticâncer. Elas dirigem o sistema imunológico do hospedeiro, mais especificamente, a atividade citotóxica das células T, contra uma célula-alvo, como uma célula cancerosa. Nessas moléculas, um domínio de ligação se liga a uma célula T por meio do receptor CD3 e o outro a uma célula alvo, como uma célula tumoral (por meio de uma molécula específica de tumor). Uma vez que a molécula biespecífica se liga à célula alvo e à célula T, ela traz a célula alvo para a proximidade da célula T, de modo que a célula T pode exercer seu efeito, por exemplo, um efeito citotóxico em uma célula cancerosa. A formação do complexo célula T: Ab biespecífico: célula cancerosa induz a sinalização na célula T levando, por exemplo, à liberação de mediadores citotóxicos. Idealmente, o agente apenas induz a sinalização desejada na presença da célula-alvo, levando à morte seletiva.
[00173] As moléculas que envolvem células T biespecíficas foram desenvolvidas em vários formatos diferentes, mas um dos mais comuns é uma fusão que consiste em dois fragmentos variáveis de cadeia única arranjadas em tandem (scFvs) de anticorpos diferentes. Às vezes, são conhecidos como BiTEs (Bi-specific T-cell Engagers).
[00174] A presente invenção também contempla uma molécula bi-específica que reconhece seletivamente TRBC2 e é capaz de ativar uma célula T. Por exemplo, a molécula pode ser um BiTE.
[00175] Assim, em outro aspecto, a presente invenção fornece um engajador de células T biespecífico (BiTE), "doravante o BiTE da invenção", compreendendo um domínio de ligação ao antígeno variante da invenção e um domínio de ativação de células T.
[00176] O termo "domínio de ligação ao antígeno variante da invenção" foi descrito em detalhes no contexto do primeiro aspecto da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a este aspecto da invenção.
[00177] O termo "domínio de ativação de células T", tal como aqui utilizado, se refere a um segundo domínio capaz de ativar uma célula T. O domínio de ativação de células T pode ser um scFv que se liga especificamente a CD3. Exemplos de scFv anti-CD3 que são adequados para os fins da presente invenção são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, o scFv derivado de OKT3.
[00178] A molécula bi-específica pode compreender um peptídeo sinal para auxiliar na sua produção. O peptídeo sinal pode fazer com que a molécula bi-específica seja segregada por uma célula hospedeira, de modo que a molécula bi-específica possa ser colhida do sobrenadante da célula hospedeira.
[00179] O peptídeo sinal pode estar no terminal amino da molécula. A molécula bi-específica pode ter a fórmula geral: Peptídeo sinal - domínio de ligação a antígeno variante da invenção - domínio de ativação de células T.
[00180] A molécula bi-específica pode compreender uma sequência espaçadora para conectar o domínio de ligação ao antígeno variante da invenção e um domínio de ativação de células T e separar espacialmente os dois domínios.
[00181] A sequência espaçadora pode, por exemplo, compreender uma dobradiça de IgG1 ou uma haste de CD8. O ligante pode, alternativamente, compreender uma sequência de ligante alternativa que tem propriedades de comprimento e / ou espaçamento de domínio semelhantes como uma dobradiça de IgG1 ou uma haste de CD8.
5. Ácido nucléico
[00182] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao antígeno variante da invenção, doravante "o primeiro ácido nucleico da invenção".
[00183] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo da invenção, a seguir denominado "o segundo ácido nucleico da invenção".
[00184] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR da invenção, a seguir denominado "o terceiro ácido nucleico da invenção".
[00185] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece uma sequência de ácido nucleico que codifica um BiTE da invenção, a seguir denominado "o quarto ácido nucleico da invenção".
[00186] Os termos "domínio de ligação ao antígeno variante da invenção", "anticorpo da invenção" e "BiTE da invenção" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a estes aspectos da invenção.
[00187] Conforme usado neste relatório descritivo, os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo" e "ácido nucleico" destinam-se a ser sinônimos.
[00188] Será entendido por um técnico versado no assunto que vários polinucleotídeos e ácidos nucleicos diferentes podem codificar o mesmo polipeptídeo como resultado da degenerescência do código genético. Além disso, deve ser entendido que os técnicos versados no assunto podem,
usando técnicas de rotina, fazer substituições de nucleotídeos que não afetam a sequência polipeptídica codificada pelos polinucleotídeos descritos aqui para refletir a utilização de códons de qualquer organismo hospedeiro particular no qual os polipeptídeos devem ser expresso.
[00189] As sequências de ácido nucleico e construtos da invenção podem conter códons alternativos em regiões de sequência que codificam as mesmas sequências de aminoácidos ou semelhantes, a fim de evitar recombinação homóloga.
[00190] Os ácidos nucleicos, de acordo com a invenção, podem compreender DNA ou RNA. Eles podem ser de fita simples ou dupla. Eles também podem ser polinucleotídeos que incluem dentro deles nucleotídeos sintéticos ou modificados. Vários tipos diferentes de modificação de oligonucleotídeos são conhecidos na técnica. Estes incluem estruturas de metilfosfonato e fosforotioato, adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3' e / ou 5' da molécula. Para os fins do uso como aqui descrito, deve ser entendido que os polinucleotídeos podem ser modificados por qualquer método disponível no estado da técnica. Tais modificações podem ser realizadas a fim de aumentar a atividade in vivo ou a expectativa de vida dos polinucleotídeos de interesse.
[00191] Os termos "variante", "homólogo" ou "derivado" em relação a uma sequência de nucleotídeos incluem qualquer substituição, variação, modificação, substituição, deleção ou adição de um (ou mais) ácido nucleico de ou para a sequência.
6. Vetor
[00192] A presente invenção também fornece um vetor, ou kit de vetores, que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico da invenção. Tal vetor pode ser usado para introduzir a sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira, de modo que expresse uma molécula de ligação ao antígeno variante, ou um anticorpo, ou um CAR, ou um BiTE da invenção.
[00193] Os termos "domínio de ligação ao antígeno variante da invenção", "anticorpo da invenção" e "BiTE da invenção" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a estes aspectos da invenção.
[00194] O vetor pode, por exemplo, ser um plasmídeo ou um vetor viral, como um vetor retroviral ou um vetor lentiviral, ou um vetor baseado em transposon ou mRNA sintético.
[00195] O vetor pode ser capaz de transfectar ou transduzir uma célula imune citolítica, como células T ou células NK.
7. Célula
[00196] Outro aspecto da presente invenção se refere a uma célula, doravante denominada “a célula da invenção”, que compreende um CAR da invenção.
[00197] A célula pode compreender um ácido nucleico ou um vetor da presente invenção.
[00198] Os termos "CAR da invenção", "ácido nucleico da invenção", "vetor da invenção" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a esses aspectos da invenção.
[00199] A célula pode ser uma célula imune citolítica, como uma célula T ou uma célula NK.
[00200] As células T ou linfócitos T são um tipo de linfócito que desempenha um papel central na imunidade mediada por células. Eles podem ser distinguidos de outros linfócitos, como células B e células natural killer (células NK), pela presença de um receptor de células T (TCR) na superfície celular. Existem vários tipos de células T, conforme resumido a seguir.
[00201] As células auxiliares T Helper (células TH) auxiliam outras células brancas do sangue em processos imunológicos, incluindo a maturação de células B em células plasmáticas e células B de memória e ativação de células T citotóxicas e macrófagos. As células TH expressam CD4 em sua superfície. As células TH tornam-se ativadas quando são apresentadas a antígenos peptídicos por moléculas MHC de classe II na superfície das células apresentadoras de antígenos (APCs). Essas células podem se diferenciar em um de vários subtipos, incluindo TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 ou TFH, que secretam diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respostas imunes.
[00202] As células T citolíticas (células TC ou CTLs) destroem as células infectadas por vírus e as células tumorais e também estão implicadas na rejeição do transplante. Os CTLs expressam o CD8 em sua superfície. Essas células reconhecem seus alvos ligando-se ao antígeno associado ao MHC classe I, que está presente na superfície de todas as células nucleadas. Por meio de IL-10, adenosina e outras moléculas secretadas por células T reguladoras, as células CD8 + podem ser inativadas a um estado anérgico, o que previne doenças autoimunes como a encefalomielite autoimune experimental.
[00203] As células T de memória são um subconjunto de células T específicas do antígeno que persistem por longo prazo após a resolução de uma infecção. Eles se expandem rapidamente para um grande número de células T efetoras após a reexposição ao seu antígeno cognato, fornecendo, assim, ao sistema imunológico "memória" contra infecções anteriores. As células T de memória compreendem três subtipos: células T de memória central (células TCM) e dois tipos de células T efetoras de memória (células TEM e células TEMRA). As células de memória podem ser CD4 + ou CD8 +. As células T de memória normalmente expressam a proteína de superfície celular CD45RO.
[00204] As células T reguladoras (células Treg), anteriormente conhecidas como células T supressoras, são cruciais para a manutenção da tolerância imunológica. Seu papel principal é desligar a imunidade mediada por células T no final de uma reação imune e suprimir as células T auto- reativas que escaparam do processo de seleção negativa no timo.
[00205] Duas classes principais de células Treg CD4 + foram descritas - células Treg de ocorrência natural e células Treg adaptativas.
[00206] Células Treg de ocorrência natural (também conhecidas como células Treg CD4 + CD25 + FoxP3 +) surgem no timo e têm sido associadas a interações entre células T em desenvolvimento com células dendríticas mieloides (CD11c +) e plasmocitoides (CD123 +) que foram ativadas com TSLP. As células Treg de ocorrência natural podem ser distinguidas de outras células T pela presença de uma molécula intracelular chamada FoxP3. Mutações no gene FOXP3 podem prevenir o desenvolvimento de células T regulatórias, causando a doença autoimune fatal IPEX.
[00207] As células Treg adaptativas (também conhecidas como células Tr1 ou células Th3) podem se originar durante uma resposta imunológica normal.
[00208] A célula pode ser uma célula Natural Killer (ou célula NK). As células NK fazem parte do sistema imunológico inato. As células NK fornecem respostas rápidas aos sinais inatos de células infectadas por vírus de uma maneira independente do MHC.
[00209] As células NK (pertencentes ao grupo das células linfoides inatas) são definidas como grandes linfócitos granulares (LGL) e constituem o terceiro tipo de células diferenciadas do progenitor linfoide comum, gerando linfócitos B e T. As células NK são conhecidas por se diferenciar e amadurecer na medula óssea, nódulo linfático, baço, amígdalas e timo, onde então entram na circulação.
[00210] A célula da invenção pode ser qualquer um dos tipos de células mencionados acima. Em uma concretização, a célula da invenção é uma célula T. Em outra concretização, a célula da invenção é uma célula NK.
[00211] As células, de acordo com este aspecto da invenção, podem ser criadas ex vivo a partir do próprio sangue periférico de um paciente (1ª parte), ou no contexto de um transplante de células-tronco hematopoiéticas de sangue periférico de doador (2ª parte), ou sangue periférico de um doador não conectado (terceiro).
[00212] Alternativamente, as células de acordo com este aspecto da invenção podem ser derivadas da diferenciação ex vivo de células progenitoras indutíveis ou células progenitoras embrionárias em células citolíticas. Alternativamente, uma linhagem de células citolíticas imortalizadas, como uma célula T ou NK, que retém sua função lítica e pode atuar como um terapêutico pode ser usada.
[00213] Em todas essas concretizações, as células que expressam CAR são geradas pela introdução de DNA ou RNA que codifica para o polipeptídeo quimérico por um de muitos meios, incluindo transdução com um vetor viral, transfecção com DNA ou RNA.
[00214] A célula da invenção pode ser uma célula ex vivo de um sujeito. A célula pode ser de uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). A célula, em particular, uma célula citolítica, como uma célula T ou NK, pode ser ativada e / ou expandida antes de ser transduzida com ácido nucleico que codifica as moléculas que fornecem o CAR da invenção, por exemplo, por tratamento com um anti-CD3 anticorpo monoclonal.
[00215] A célula da invenção pode ser feita por um método que compreende uma etapa de transdução ou transfecção de uma célula com um vetor da invenção que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR.
[00216] O método para fazer uma célula da invenção pode compreender ainda uma etapa de isolamento da célula de uma amostra contendo células de um sujeito ou de outras fontes listadas acima, antes da etapa de transdução ou transfecção. Quando a célula é uma célula citolítica, a amostra é uma amostra contendo uma célula citolítica do sujeito.
[00217] O termo "sujeito" ou "indivíduo", conforme usado no contexto da presente invenção, se refere a membros de espécies de mamíferos, de preferência um ser humano do sexo masculino ou feminino de qualquer idade ou raça.
[00218] A célula da invenção pode então ser purificada, por exemplo, por seleção com base na expressão do domínio de ligação ao antígeno do CAR.
8. Conjugado
[00219] O domínio de ligação ao antígeno variante ou o anticorpo da invenção pode ser um conjugado do domínio de ligação ao antígeno variante ou o anticorpo, por exemplo, o conjugado pode ser uma entidade detectável ou uma entidade quimioterapêutica.
[00220] Os termos "domínio de ligação ao antígeno variante da invenção" e "anticorpo da invenção" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a esses aspectos da invenção.
[00221] A entidade detectável pode ser uma porção fluorescente, por exemplo, um peptídeo fluorescente. O termo "peptídeo fluorescente", tal como aqui utilizado, se refere a um polipeptídeo que, após a excitação, emite luz em um comprimento de onda detectável. Exemplos de proteínas fluorescentes incluem, mas não estão limitados a, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), proteína fluorescente verde (GFP), GFP melhorado, proteína fluorescente vermelha (RFP), proteína fluorescente azul (BFP) e mCherry.
[00222] Um domínio de ligação ao antígeno variante ou anticorpo da invenção conjugado a uma entidade detectável pode ser usado para determinar o TRBC de uma célula T maligna.
[00223] O termo "entidade quimioterapêutica", tal como aqui utilizado, se refere a uma entidade que é destrutiva para uma célula, ou seja, a entidade reduz a viabilidade da célula. Os conjugados resultantes são doravante referidos como "o conjugado quimioterapêutico da invenção". A entidade quimioterapêutica pode ser uma droga citotóxica. Uma entidade quimioterapêutica contemplada inclui, sem limitação, agentes alquilantes, nitrosoureias, etileniminas / metilmelamina, alquilsulfonatos, antimetabólitos, análogos de pirimidina, epipodofilotoxinas, enzimas como L-asparaginase; modificadores da resposta biológica, tais como IFNα, IL-2, G-CSF e GM-CSF; complexos de coordenação de platínio como cisplatina e carboplatina, antracenedionas, ureia substituída como hidroxiureia, derivados de metil-hidrazina incluindo N-metil-hidrazina (MIH) e procarbazina, supressores adrenocorticais como mitotano (o, p'-DDD) e aminoglutetimida; hormônios e antagonistas incluindo antagonistas adrenocorticosteroides, tais como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; progestina, tais como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona e acetato de megestrol; estrogénio, tais como dietilestilbestrol e equivalentes de etinilestradiol; antiestrogênio como tamoxifeno; andrógenos incluindo propionato de testosterona e fluoximesterona / equivalentes; antiandrogénios, tais como flutamida, análogos da hormona libertadora de gonadotropina e leuprolida; e, antiandrogênios não esteróides, como flutamida.
[00224] Um domínio de ligação ao antígeno variante ou anticorpo da invenção conjugado a uma entidade quimioterapêutica permite a distribuição direcionada da entidade quimioterapêutica às células que expressam TRBC2.
9. Composição farmacêutica
[00225] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica contendo uma célula ou uma pluralidade de células, ou um anticorpo, ou um BiTE, ou um conjugado quimioterápico da invenção, doravante "a composição farmacêutica da invenção".
[00226] A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender opcionalmente um ou mais outros polipeptídeos e / ou compostos farmaceuticamente ativos. Tal formulação pode, por exemplo, estar em uma forma adequada para infusão intravenosa.
[00227] Os termos "célula da invenção", "anticorpo da invenção", "BiTE da invenção" e "conjugado quimioterápico da invenção" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações aplicam-se igualmente a estes aspectos da invenção.
ADMINISTRAÇÃO
[00228] A administração de uma célula ou uma pluralidade de células, ou um anticorpo, ou um BiTE, ou um conjugado quimioterápico da invenção, pode ser realizada usando qualquer uma de uma variedade de vias que tornam o ingrediente ativo biodisponível. Por exemplo, o agente pode ser administrado pelas vias oral e parenteral, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, transcutânea, intramuscular, por meio de distribuição local, por exemplo, por cateter ou stent.
[00229] Normalmente, um médico determinará a dosagem real que será mais adequada para um sujeito individual e irá variar com a idade, peso e resposta do paciente em particular. A dosagem é tal que é suficiente para reduzir ou esgotar o número de células T clonais que expressam TRBC1 ou TRBC2.
10. Método de tratamento
[00230] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma célula, ou um anticorpo, ou um BiTE, ou um conjugado quimioterápico da invenção para uso em medicina.
[00231] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um linfoma de células T ou leucemia em um sujeito, a seguir denominado "o método de tratamento da invenção", que compreende a etapa de administração de uma célula, ou um anticorpo, ou um BiTE ou um conjugado quimioterápico da invenção a um sujeito, em que as células
T malignas expressam TRBC2. A etapa de administração pode ser na forma de uma composição farmacêutica conforme descrito acima.
[00232] Este aspecto da invenção pode ser alternativamente formulado como uma célula, ou um anticorpo, ou um BiTE, ou um conjugado quimioterápico da invenção para uso no tratamento de um linfoma de células T ou leucemia, doravante denominada “a célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico para uso da invenção”, em que as células T malignas expressam TRBC2.
[00233] Este aspecto da invenção pode ser alternativamente formulado como o uso de uma célula, ou um anticorpo, ou um BiTE, ou um conjugado quimioterapêutico da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de um linfoma de células T ou leucemia, em que o As células T expressam TRBC2.
[00234] Os termos "célula da invenção", "anticorpo da invenção", "BiTE da invenção", "sujeito" e "conjugado quimioterápico da invenção" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a esses aspectos da invenção.
[00235] Um método para tratar um linfoma de células T e / ou leucemia se refere ao uso terapêutico da célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico da invenção. Aqui, a célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico da invenção podem ser administrados a um sujeito com um linfoma de células T existente e / ou leucemia a fim de diminuir, reduzir ou melhorar pelo menos um sintoma associado à doença e / ou para abrandar, reduzir ou bloquear a progressão da doença.
[00236] O método para prevenir um linfoma de células T e / ou leucemia se refere ao uso profilático da célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico da presente invenção. Aqui, tal célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico pode ser administrado a um sujeito que ainda não contraiu o linfoma de células T e / ou leucemia e / ou que não está apresentando quaisquer sintomas de linfoma de células T e / ou leucemia para prevenir ou prejudicar a causa da doença ou para reduzir ou prevenir o desenvolvimento de pelo menos um sintoma associado à doença. O sujeito pode ter uma predisposição ou ser considerado em risco de desenvolver o linfoma de células T e / ou leucemia.
[00237] O método pode envolver as etapas de: (i) isolar uma amostra contendo células citotóxicas; (ii) transduzir ou transfectar tal célula com uma sequência de ácido nucleico ou vetor fornecido pela presente invenção; e (iii) administrar a célula de (ii) a um sujeito.
[00238] A amostra contendo células citotóxicas pode ser isolada do sujeito ou de outras fontes, por exemplo, como descrito acima. A célula citotóxica, como uma T ou NK pode ser isolada do próprio sangue periférico de um sujeito (1ª parte), ou no contexto de um transplante de células- tronco hematopoiéticas de sangue periférico de doador (2ª parte) ou sangue periférico de um doador não conectado (3ª parte).
[00239] Um método para o tratamento de um linfoma de células T e / ou leucemia se refere ao uso terapêutico de um agente. Aqui, o agente pode ser administrado a um sujeito com uma doença existente de linfoma de células T e / ou leucemia, a fim de diminuir, reduzir ou melhorar pelo menos um sintoma associado à doença e / ou para desacelerar, reduzir ou bloquear a progressão da doença.
[00240] Estas aplicações terapêuticas compreenderão a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterapêutico da presente invenção.
[00241] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, se refere à quantidade da célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterapêutico da presente invenção que é necessária para atingir uma prevenção, cura, retardo, redução apreciável da gravidade de, ou melhora de um ou mais sintomas de um linfoma de células T TRBC2 positivo e / ou leucemia.
[00242] O método da presente invenção pode ser usado para o tratamento de qualquer linfoma e / ou leucemia associado à expansão clonal de uma célula que expressa um receptor de células T (TCR) compreendendo TRBC2. Como tal, a presente invenção se refere a um método para o tratamento de uma doença que envolve células T malignas que expressam um TCR compreendendo um TRBC2.
[00243] O método da presente invenção pode ser usado para tratar um linfoma de células T em que a célula T maligna expressa um TCR compreendendo um TRBC2. "Linfoma" é usado neste relatório descritivo de acordo com seu significado padrão para se referir a um câncer que normalmente se desenvolve nos gânglios linfáticos, mas também pode afetar o baço, a medula óssea, o sangue e outros órgãos. O linfoma geralmente se apresenta como um tumor sólido de células linfóides. O principal sintoma associado ao linfoma é a linfadenopatia, embora os sintomas secundários (B) possam incluir febre, suores noturnos, perda de peso, perda de apetite, fadiga, dificuldade respiratória e coceira.
[00244] O método da presente invenção pode ser usado para tratar uma leucemia de células T na qual a célula T maligna expressa um TCR compreendendo um TRBC2. "Leucemia" é usado neste documento de acordo com seu significado padrão para se referir a um câncer de sangue ou medula óssea.
[00245] O que se segue é uma lista ilustrativa e não exaustiva de doenças que podem ser tratadas pelo método da presente invenção.
LINFOMA DE CÉLULAS T PERIFÉRICO
[00246] Os linfomas de células T periférico são linfomas relativamente incomuns e representam menos de 10% de todos os linfomas não-Hodgkin (LNH). No entanto, estão associados a um curso clínico agressivo e as causas e origens celulares precisas da maioria dos linfomas de células T ainda não estão bem definidas.
[00247] O linfoma geralmente se apresenta como inchaço no pescoço, nas axilas ou na virilha. Pode ocorrer inchaço adicional onde outros gânglios linfáticos estão localizados, como no baço. Em geral, os linfonodos aumentados podem invadir o espaço dos vasos sanguíneos, nervos ou estômago, causando inchaço nos braços e pernas, formigamento e dormência ou sensação de saciedade, respectivamente. Os sintomas do linfoma também incluem sintomas inespecíficos, como febre, calafrios, perda de peso inexplicada, suores noturnos, letargia e coceira.
[00248] A classificação da OMS utiliza características morfológicas e imunofenotípicas em conjunto com aspectos clínicos e, em alguns casos, genética para delinear uma categorização prognóstica e terapeuticamente significativa para linfomas de células T periféricos (Swerdlow et al.; Classificação da OMS de tumores de tecidos hematopoiéticos e linfoides. 4a ed. .; Lyon: IARC Press; 2008). A localização anatômica de células T neoplásicas é paralela em parte às suas contrapartes e funções celulares normais propostas e, como tal, os linfomas de células T estão associados a nódulos linfáticos e sangue periférico. Essa abordagem permite um melhor entendimento de algumas das manifestações dos linfomas de células T, incluindo sua distribuição celular, alguns aspectos da morfologia e até mesmo achados clínicos associados.
[00249] O mais comum dos linfomas de células T é o linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS) compreendendo 25% do total, seguido por linfoma de células T angioimunoblástico (AITL) (18,5%) LINFOMA DE CÉLULAS T PERIFÉRICAS, NÃO ESPECIFICADO DE OUTRO MODO (PTCL-NOS)
[00250] PTCL-NOS compreende mais de 25% de todos os linfomas de células T periféricos e linfomas de células NK / T e é o subtipo mais comum. É determinado por um diagnóstico de exclusão, não correspondendo a nenhuma das entidades específicas de linfoma de células T maduras listadas na atual
OMS 2008. Como tal, é análogo ao linfoma difuso de grandes células B, não especificado de outra forma (DLBCL-NOS).
[00251] A maioria dos pacientes são adultos com idade mediana de 60 anos e proporção entre homens e mulheres de 2:1. A maioria dos casos é de origem nodal; no entanto, as apresentações extranodais ocorrem em aproximadamente 13% dos pacientes e mais comumente envolvem a pele e o trato gastrointestinal.
[00252] O espectro citológico é muito amplo, variando de polimorfo a monomorfo. Foram descritas três variantes morfologicamente definidas, incluindo a variante linfoepitelióide (Lennert), a variante da zona T e a variante folicular. A variante linfoepitelioide de PTCL contém abundantes histiócitos epitelioides de fundo e é comumente positiva para CD8. Tem sido associado a um melhor prognóstico. A variante folicular de PTCL-NOS está emergindo como uma entidade clínico-patológica potencialmente distinta.
[00253] A maioria dos PTCL-NOS tem um fenótipo de células T maduras e a maioria dos casos são positivos para CD4. 75% dos casos mostram perda variável de pelo menos um marcador de células T pan (CD3, CD2, CD5 ou CD7), com CD7 e CD5 sendo mais frequentemente regulados para baixo. CD30 e raramente CD15 podem ser expressos, com CD15 sendo uma característica prognóstica adversa. A expressão de CD56, embora incomum, também tem impacto prognóstico negativo. Fatores prognósticos patológicos adversos adicionais incluem uma taxa de proliferação maior que 25% com base na expressão de KI-67 e presença de mais de 70% de células transformadas.
A análise imunofenotípica desses linfomas ofereceu poucas informações sobre sua biologia. LINFOMA DE CÉLULAS T ANGIOIMUNOBLÁSTICAS (AITL)
[00254] AITL é uma doença sistêmica caracterizada por um infiltrado polimorfo envolvendo linfonodos, vênulas endoteliais altas proeminentes (HEV) e expansão peri- vascular das células dendríticas foliculares (FDC). O AITL é considerado um linfoma de novo de células T derivado de células T αβ do tipo folicular auxiliar (TFH), normalmente encontrado nos centros germinativos.
[00255] AITL é a segunda entidade mais comum entre o linfoma periférico de células T e os linfomas de células NK / T, compreendendo cerca de 18,5% dos casos. Ocorre em adultos de meia-idade a idosos, com mediana de idade de 65 anos e uma incidência aproximadamente igual em homens e mulheres. Clinicamente, os pacientes geralmente apresentam doença em estágio avançado, com linfadenopatia generalizada, hepatoesplenomegalia e sintomas constitucionais proeminentes. Erupção cutânea com prurido associado está comumente presente. Freqüentemente, há hipergamaglobulinemia policlonal, associada a fenômenos autoimunes.
[00256] Três padrões morfológicos diferentes são descritos em AITL. A lesão inicial de AITL (Padrão I) geralmente mostra arquitetura preservada com folículos hiperplásicos característicos. A proliferação neoplásica está localizada na periferia dos folículos. No Padrão II, a arquitetura nodal é parcialmente apagada com a retenção de alguns folículos regredidos. Os seios subcapsulares estão preservados e até dilatados. O paracórtex contém HEV arborizante e há uma proliferação de FDC além do folículo de células B. As células neoplásicas são de tamanho pequeno a médio, com atipia citológica mínima. Eles geralmente têm citoplasma claro a pálido e podem mostrar membranas de células T distintas. Um fundo inflamatório polimorfo geralmente é evidente.
[00257] Embora AITL seja uma doença maligna de células T, há uma expansão característica de células B e plasmócitos, que provavelmente reflete a função das células neoplásicas como células TFH. Estão presentes células B EBV-positivas e EBV-negativas. Ocasionalmente, as células B atípicas podem se assemelhar a células semelhantes a Hodgkin / Reed- Sternberg morfológica e imunofenotipicamente, às vezes levando a uma confusão diagnóstica com essa entidade. A proliferação de células B em AITL pode ser extensa e alguns pacientes desenvolvem linfomas difusos de grandes células B secundários positivos para EBV (DLBCL) ou - mais raramente - tumores de células B negativos para EBV, frequentemente com diferenciação plasmocítica.
[00258] As células T neoplásicas CD4-positivas de AITL mostram forte expressão de CD10 e CD279 (PD-1) e são positivas para CXCL13. CXCL13 leva a um recrutamento aumentado de células B para os linfonodos por meio da adesão ao HEV, ativação de células B, diferenciação plasmocítica e expansão da rede FDC, todos contribuindo para as características morfológicas e clínicas de AITL. A expressão intensa de PD-1 nas células tumorais perifoliculares é particularmente útil para distinguir AITL Padrão I da hiperplasia folicular e paracortical reativa.
[00259] A variante folicular de PTCL-NOS é outra entidade com um fenótipo TFH. Em contraste com AITL, não tem HEV proeminente ou expansão extra-folicular das malhas FDC. As células neoplásicas podem formar agregados intrafoliculares, mimetizando o linfoma folicular de células B, mas também podem ter padrão de crescimento interfolicular ou envolver zonas do manto expandido. Clinicamente, a variante folicular de PTCL-NOS é distinta de AITL, pois os pacientes mais frequentemente apresentam doença em estágio inicial com envolvimento parcial de linfonodos e podem não apresentar os sintomas constitucionais associados a AITL. LINFOMA ANAPLÁSTICO DE CÉLULAS GRANDES (ALCL)
[00260] O ALCL pode ser subdividido em ALCL-linfoma cinase anaplásico (ALK)+ ou ALCL-ALK−.
[00261] ALCL-ALK+ é uma das entidades mais bem definidas dentro dos linfomas de células T periféricas, com "células marcantes" características com núcleos em forma de ferradura e expressando ALK e CD30. É responsável por cerca de 7% de todos os linfomas de células T e NK periféricos e é mais comum nas primeiras três décadas de vida. Os pacientes frequentemente apresentam linfadenopatia, mas o envolvimento de locais extranodais (pele, osso, tecidos moles, pulmão, fígado) e sintomas B são comuns.
[00262] ALCL, ALK+ mostra um amplo espectro morfológico, com 5 padrões diferentes descritos, mas todas as variantes contêm algumas células marcantes. Células Hallmark têm núcleos excêntricos em forma de ferradura ou rim e uma região de Golgi perinuclear eosinofílica proeminente. As células tumorais crescem em um padrão coeso com predileção por envolvimento dos seios da face. As células tumorais menores predominam na variante de células pequenas, e na variante linfo-histiocítica os histiócitos abundantes mascaram a presença de células tumorais, muitas das quais são pequenas.
[00263] Por definição, todos os casos apresentam positividade para ALK e CD30, com expressão geralmente mais fraca nas células tumorais menores. Freqüentemente, há perda de marcadores de células pan-T, com 75% dos casos sem expressão de superfície de CD3.
[00264] A expressão de ALK é o resultado de uma alteração genética recorrente característica que consiste em um rearranjo do gene ALK no cromossomo 2p23 para um dos muitos genes parceiros, resultando em uma expressão de proteína quimérica. O gene parceiro mais comum, ocorrendo em 75% dos casos, é a Nucleofosmina (NPM1) no cromossomo 5q35, resultando em t (2; 5) (p23; q35). A distribuição celular de ALK em diferentes variantes de translocação pode variar dependendo do gene parceiro.
[00265] ALCL-ALK− está incluída como uma categoria provisória na classificação de 2008 da OMS. É definido como um linfoma de células T CD30 positivo que é morfologicamente indistinguível de ALCL-ALK + com um padrão de crescimento coeso e presença de células marcadas, mas sem expressão da proteína ALK.
[00266] Os pacientes geralmente são adultos com idades entre 40 e 65 anos, em contraste com ALCL-ALK +, que é mais comum em crianças e adultos jovens. O ALCL-ALK− pode envolver tanto os linfonodos quanto os tecidos extranodais,
embora o último seja visto menos comumente do que no ALCL- ALK +. A maioria dos casos de ALCL-ALK– demonstra apagamento da arquitetura do linfonodo por camadas de células neoplásicas coesivas com características típicas de “marca registrada”. Em contraste com o ALCL-ALK+, a variante morfológica de pequenas células não é reconhecida.
[00267] Ao contrário de sua contraparte ALK +, ALCL- ALK− mostra uma maior preservação da expressão de marcadores de células T de superfície, enquanto a expressão de marcadores citotóxicos e antígeno de membrana epitelial (EMA) é menos provável. As assinaturas de expressão gênica e os desequilíbrios cromossômicos recorrentes são diferentes em ALCL-ALK− e ALCL-ALK +, confirmando que são entidades distintas em nível molecular e genético.
[00268] ALCL-ALK− é clinicamente distinto de ALCL- ALK+ e PTCL-NOS, com diferenças significativas no prognóstico entre essas três entidades diferentes. A sobrevida global de 5 anos de ALCL-ALK− é relatada como 49%, que não é tão boa quanto a de ALCL-ALK + (a 70%), mas ao mesmo tempo é significativamente melhor do que a de PTCL-NOS (32%). LINFOMA DE CÉLULAS T ASSOCIADO À ENTEROPATIA (EATL)
[00269] EATL é uma neoplasia agressiva que se pensa ser derivada das células T intraepiteliais do intestino. Dois tipos de EATL morfologicamente, imunohistoquimicamente e geneticamente distintos são reconhecidos na classificação da OMS de 2008: Tipo I (representando a maioria de EATL) e Tipo II (compreendendo 10–20% dos casos).
[00270] O EATL tipo I geralmente está associado a enteropatia sensível ao glúten evidente ou clinicamente silenciosa e é mais frequentemente observada em pacientes de origem norte-europeia devido à alta prevalência de doença celíaca nessa população.
[00271] Mais comumente, as lesões de EATL são encontradas no jejuno ou íleo (90% dos casos), com apresentações raras no duodeno, cólon, estômago ou áreas fora do trato gastrointestinal. As lesões intestinais são geralmente multifocais com ulceração da mucosa. O curso clínico de EATL é agressivo, com a maioria dos pacientes morrendo devido à doença ou complicações da doença em 1 ano.
[00272] O espectro citológico de EATL tipo I é amplo e alguns casos podem conter células anaplásicas. Apresenta fundo inflamatório polimorfo, que pode obscurecer o componente neoplásico em alguns casos. A mucosa intestinal em regiões adjacentes ao tumor frequentemente mostra características de doença celíaca com embotamento das vilosidades e aumento do número de linfócitos intraepiteliais (IEL), que podem representar células precursoras lesionais.
[00273] Por imuno-histoquímica, as células neoplásicas são frequentemente CD3 + CD4 − CD8 − CD7 + CD5 − CD56 − βF1 + e contêm proteínas citotóxicas associadas a grânulos (TIA-1, granzima B, perforina). CD30 é parcialmente expresso em quase todos os casos. O CD103, que é um receptor de homing da mucosa, pode ser expresso em EATL.
[00274] O EATL tipo II, também conhecido como linfoma intestinal de células T CD56 + monomórfico, é definido como um tumor intestinal composto por células T monomórficas de pequeno a médio porte que expressam CD8 e CD56. Freqüentemente, há uma disseminação lateral do tumor dentro da mucosa e ausência de um fundo inflamatório. A maioria dos casos expressa o TCR γδ, porém há casos associados ao TCR αβ.
[00275] O EATL do tipo II tem uma distribuição mais mundial do que o EATL do tipo I e é freqüentemente visto em populações asiáticas ou hispânicas, nas quais a doença celíaca é rara. Em indivíduos de ascendência europeia EATL, II representa cerca de 20% dos linfomas de células T intestinais, com história de doença celíaca em pelo menos um subconjunto de casos. O curso clínico é agressivo. LINFOMA DE CÉLULAS T HEPATOSPLÊNICO (HSTL)
[00276] HSTL é uma neoplasia sistêmica agressiva geralmente derivada de células T citotóxicas γδ do sistema imune inato, no entanto, também pode ser derivada de células T αβ em casos raros. É um dos linfomas de células T mais raros e geralmente afeta adolescentes e adultos jovens (idade média, 35 anos), com forte predominância do sexo masculino. LINFOMA EXTRANODAL DE CÉLULAS T / NK DO TIPO NASAL
[00277] O linfoma extranodal de células NK / T, tipo nasal, é uma doença agressiva, frequentemente com lesões destrutivas na linha média e necrose. A maioria dos casos é derivada de células NK, mas alguns casos são derivados de células T citotóxicas. Está universalmente associado ao vírus Epstein-Barr (EBV).
LINFOMA CUTÂNEO DE CÉLULAS T
[00278] O método da presente invenção também pode ser usado para tratar o linfoma cutâneo de células T.
[00279] O linfoma cutâneo de células T (LCCT) é caracterizado pela migração de células T malignas para a pele, causando o aparecimento de várias lesões. Essas lesões mudam de forma à medida que a doença progride, geralmente começando como o que parece ser uma erupção cutânea e, eventualmente, formando placas e tumores antes de metastatizar para outras partes do corpo.
[00280] Os linfomas cutâneos de células T incluem aqueles mencionados na seguinte lista ilustrativa não exaustiva; micose fungóide, reticulose pagetoide, síndrome de Sézary, pele flácida granulomatosa, papulose linfomatóide, pitiríase liquenoide crônica, linfoma cutâneo de células T CD30 +, linfoma cutâneo secundário de células T CD30 +, linfoma cutâneo de grandes células não micose CD30- linfoma cutâneo de células T grandes linfoma de células, linfoma de Lennert, linfoma de células T subcutâneo e linfoma angiocêntrico.
[00281] Os sinais e sintomas do LCCT variam de acordo com a doença específica, dos quais os dois tipos mais comuns são a micose fungóide e a síndrome de Sézary. A micose fungóide clássica é dividida em três fases: - Mancha (atrófica ou não atrófica): dermatite inespecífica, manchas na parte inferior do tronco e nádegas; prurido mínimo / ausente; - Placa: placas intensamente pruriginosas, linfadenopatia; e - Tumor: propenso a ulceração.
[00282] A síndrome de Sézary é definida por eritrodermia e leucemia. Os sinais e sintomas incluem pele edematosa, linfadenopatia, hiperceratose palmar e / ou plantar, alopecia, distrofia ungueal, ectrópio e hepatoesplenomegalia.
[00283] De todos os linfomas cutâneos primários, 65% são do tipo de células T. O imunofenótipo mais comum é CD4 positivo. Não existe uma fisiopatologia comum para essas doenças, pois o termo linfoma cutâneo de células T engloba uma ampla variedade de distúrbios.
[00284] Os principais mecanismos etiológicos para o desenvolvimento de linfoma cutâneo de células T (ou seja, micose fungóide) não foram elucidados. A micose fungóide pode ser precedida por uma doença inflamatória crônica da pele mediada por células T, que pode ocasionalmente progredir para um linfoma fatal.
[00285] ALCL CUTÂNEO PRIMÁRIO (C-ALCL)
[00286] C-ALCL é frequentemente indistinguível de ALC-ALK- pela morfologia. É definido como um tumor cutâneo de grandes células com morfologia anaplásica, pleomórfica ou imunoblástica com mais de 75% das células expressando CD30. Juntamente com a papulose linfomatóide (LyP), C-ALCL pertence ao espectro de doenças linfoproliferativas de células T CD30-CD30 cutâneas primárias, que, como um grupo, constituem o segundo grupo mais comum de linfoproliferações cutâneas de células T após a micose fungoide.
[00287] O perfil de coloração imuno-histoquímica é bastante semelhante ao ALCL-ALK−, com maior proporção de casos com coloração positiva para marcadores citotóxicos. Pelo menos 75% das células tumorais devem ser positivas para CD30. O CD15 também pode ser expresso e, quando ocorre o envolvimento dos linfonodos, o diferencial com o linfoma de Hodgkin clássico pode ser difícil. Casos raros de ALCL-ALK + podem se apresentar com lesões cutâneas localizadas e podem se assemelhar a C-ALCL.
LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA DE CÉLULAS T
[00288] A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) é responsável por cerca de 15% e 25% de LLA em coortes pediátricas e adultas, respectivamente. Os pacientes geralmente apresentam contagens altas de leucócitos e podem apresentar organomegalia, particularmente aumento do mediastino e envolvimento do SNC.
[00289] O método da presente invenção pode ser usado para tratar T-ALL que está associada a uma célula T maligna que expressa um TCR compreendendo um TRBC.
LEUCEMIA PROLIFOCÍTICA DE CÉLULAS T
[00290] A leucemia prolinfocítica de células T (T- PLL) é uma leucemia de células T maduras com comportamento agressivo e predileção por sangue, medula óssea, linfonodos, fígado, baço e envolvimento da pele. T-PLL afeta principalmente adultos com mais de 30 anos. Outros nomes incluem leucemia linfocítica crônica de células T, tipo "nodoso" de leucemia de células T e leucemia prolinfocítica T / leucemia linfocítica de células T.
[00291] No sangue periférico, o T-PLL consiste em linfócitos de tamanho médio com nucléolo único e citoplasma basofílico com bolhas ou projeções ocasionais. Os núcleos são geralmente de formato redondo a oval, com pacientes ocasionais apresentando células com contorno nuclear mais irregular que é semelhante ao formato nuclear cerebriforme visto na síndrome de Sézary. Uma variante de células pequenas compreende 20% de todos os casos de T-PLL, e a variante semelhante a células de Sézary (cerebriforme) é observada em 5% dos casos.
[00292] O T-PLL tem o imunofenótipo de um linfócito T maduro (pós-tímico) e as células neoplásicas são tipicamente positivas para antígenos pan-T CD2, CD3 e CD7 e negativas para TdT e CD1a. O imunofenótipo CD4 + / CD8- está presente em 60% dos casos, o imunofenótipo CD4 + / CD8 + está presente em 25% e o imunofenótipo CD4- / CD8 + está presente em 15% dos casos.
[00293] O linfoma de células T ou leucemia a ser tratado ou prevenido pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL- NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[00294] O método de tratamento pode compreender uma etapa de administração de uma quantidade terapêutica de uma célula ou uma pluralidade de células, ou um anticorpo, ou um BiTE, ou um conjugado quimioterápico da invenção. O técnico versado no assunto será capaz de determinar a quantidade de uma célula ou uma pluralidade de células, ou um anticorpo, ou um BiTE, ou um conjugado quimioterápico da invenção que são capazes de exercer um efeito terapêutico no paciente por métodos convencionais.
11. Agente de diagnóstico
[00295] Foi previamente determinado que a proporção de células T de doadores saudáveis que são TRBC1 + versus TRBC2 + é de 35% versus 65%, ou seja, a porcentagem média de células T totais que expressam TRBC1 foi de 35% (intervalo, 25-47%) (Maciocia et al., 2017, Nat Med 23: 1416-23). Uma vez que os linfomas de células T ou leucemias são cânceres clonais (Maciocia et al., 2017; como acima), a proliferação desregulada de células T malignas características de um linfoma de células T ou leucemia resultará em uma proporção de tanto células T TRBC1 + quanto TRBC2 + (isto é, células- T TRBC2- ou TRBC1-) que estão significativamente distorcidas. Consequentemente, ao se ligar especificamente a TRBC2 e, portanto, ser capaz de discriminar entre TRBC1 e TRBC2, o domínio de ligação ao antígeno variante e o anticorpo da invenção constituem agentes úteis para o diagnóstico de linfomas de células T ou leucemias.
[00296] Assim, em outro aspecto, a presente invenção fornece um agente de diagnóstico, doravante "o primeiro agente de diagnóstico da invenção", que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante da invenção.
[00297] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um agente de diagnóstico, a seguir denominado "o segundo agente de diagnóstico da invenção", que compreende um anticorpo da invenção. Os termos "domínio de ligação ao antígeno variante da invenção" e "anticorpo da invenção" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a esses aspectos da invenção.
[00298] O domínio de ligação ao antígeno variante ou anticorpo da invenção a ser usado nestes ensaios pode ser marcado ou não marcado. O termo "marcador detectável" ou "agente de marcação", tal como aqui utilizado, se refere a um marcador molecular que permite a detecção, localização e / ou identificação da molécula à qual está ligado, usando procedimentos e equipamentos adequados para detecção, por exemplo por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Os agentes de marcação que são adequados para marcar os anticorpos incluem radionuclídeos, enzimas, fluoróforos, reagentes quimioluminescentes, substratos ou cofatores de enzimas, inibidores de enzimas, partículas, corantes e derivados e semelhantes. Como o técnico versado no assunto apreciará, os domínios de ligação ao antígeno variante e os anticorpos que não são marcados precisam ser detectados com um reagente adicional, por exemplo, um anticorpo secundário que é marcado. Isso é particularmente útil para aumentar a sensibilidade do método de detecção, uma vez que permite que o sinal seja amplificado. Existe uma grande variedade de ensaios convencionais que podem ser usados na presente invenção que usam um anticorpo da invenção que não é marcado (anticorpo primário) e um anticorpo da invenção que é marcado (anticorpo secundário); essas técnicas incluem Western blotting ou immunoblot, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radioimmunoassay), EIA competitivo (Competitive Enzyme Immunoassay), DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich-
ELISA), técnicas de imunocitoquímica e imunohistoquímica, citometria de fluxo ou multiplex técnicas de detecção baseadas no uso de microesferas de proteína, biochips ou microarrays que incluem o anticorpo da invenção. Outras maneiras de detectar e quantificar TRBC2 usando o domínio de ligação ao antígeno variante ou anticorpo da invenção incluem técnicas de cromatografia de afinidade ou ensaios de ligação de ligante.
[00299] O agente de diagnóstico pode ser usado para diagnosticar um linfoma de células T ou leucemia.
[00300] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
12. Método de diagnóstico
[00301] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para diagnosticar um linfoma de células T ou leucemia em um sujeito, doravante "o método de diagnóstico da invenção", que compreende a etapa de contatar um domínio de ligação ao antígeno variante ou um anticorpo do invenção a uma amostra compreendendo células T do sujeito.
[00302] Os termos "domínio de ligação ao antígeno variante da invenção", "anticorpo da invenção" e "sujeito"
foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a este aspecto do invenção.
[00303] O método de diagnóstico da invenção pode compreender ainda um passo de determinação da percentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra.
[00304] Para colocar o primeiro método da invenção em prática, uma amostra compreendendo células T, tal como uma amostra biológica, é obtida do sujeito a ser estudado. O termo "amostra" ou "amostra biológica", tal como aqui utilizado, inclui diferentes tipos de fluidos biológicos ou seções de tecidos dos órgãos afetados que compreendem células T. Exemplos ilustrativos e não limitativos de amostras úteis no método de diagnóstico da invenção incluem diferentes tipos de fluidos biológicos compreendendo células T, tais como sangue, linfa e fluidos espinhais. Estas amostras de fluido biológico podem ser obtidas por qualquer método convencional conhecido pelo especialista. Alternativamente, a referida amostra também pode ser uma seção de uma amostra de tecido de órgão afetado, por exemplo, de um gânglio linfático, baço, amígdala ou timo, que pode ser obtida por qualquer método convencional, por exemplo, por meio de biópsia ou ressecção cirúrgica também a partir de cortes de congelação obtidos para fins histológicos.
[00305] De acordo com a primeira etapa do método de diagnóstico da invenção, o domínio de ligação ao antígeno variante ou anticorpo da invenção é colocado em contato com uma amostra do sujeito em estudo sob condições adequadas conhecidas pelo técnico versado no assunto.
[00306] O técnico versado no assunto pode usar uma série de métodos convencionais para detectar TRBC2 na amostra, que são adequados para realizar a segunda etapa do método de diagnóstico da invenção. Particularmente úteis são os métodos imunológicos. Assim, a utilização do primeiro ou do segundo agente de diagnóstico da invenção pode ser particularmente útil para realizar o método de diagnóstico de acordo com a invenção. As características e concretizações particulares dos agentes de diagnóstico da invenção foram previamente definidas e se aplicam igualmente ao método de diagnóstico da invenção.
[00307] No método de diagnóstico da invenção, uma porcentagem de 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 96%, ou 97%, ou 98%, ou 99%, ou mais células T positivas para TRBC2 na amostra podem ser indicativos da presença de um linfoma de células T ou leucemia.
[00308] Como será entendido pelos técnicos versados no assunto, a previsão, embora preferida, não precisa ser correta para 100% dos indivíduos a serem diagnosticados ou avaliados. O termo, no entanto, requer que uma parte estatisticamente significativa dos indivíduos possa ser identificada como tendo uma probabilidade aumentada de ter um determinado resultado. Se os dados obtidos de um sujeito são estatisticamente significativos podem ser determinados sem mais delongas pelo especialista na técnica usando várias ferramentas de avaliação estatística bem conhecidas, por exemplo, determinação de intervalos de confiança, determinação de valor p, taxas de classificação com validação cruzada e semelhantes etc. Os detalhes são encontrados em Dowdy e Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Os intervalos de confiança preferidos são de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, em pelo menos 90% ou pelo menos 95%. Os valores de p são, preferencialmente, 0,01 ou 0,005 ou inferior.
[00309] Além disso, o domínio de ligação ao antígeno variante ou anticorpo da invenção, em vista da sua capacidade de ligar especificamente células T positivas para TRBC2, também pode ser usado para o diagnóstico in vivo de linfoma de células T ou leucemia. Por exemplo, eles podem ser usados em imagens médicas, ou seja, um conjunto de técnicas e processos usados para criar imagens de um corpo (ou partes e funções do mesmo), por exemplo, um corpo humano, para fins clínicos, como procedimentos médicos que procuram revelar, diagnosticar ou examinar uma doença.
[00310] Para este fim, o domínio de ligação ao antígeno variante ou anticorpo da invenção são marcados por métodos adequados conhecidos na técnica e são fornecidos como agentes para métodos de imagem de diagnóstico, tais como radioimunodiagnóstico, tomografia por emissão de pósitrons (PET), métodos de imunofluorescência endoscópica, etc., por exemplo, por meio de acoplamento e / ou carregamento com moléculas apropriadas, por exemplo, isótopos radioativos ou corantes fluorescentes. O domínio de ligação ao antígeno variante e o anticorpo da invenção podem ser acoplados a isótopos emissores de gama e usados em radioimunocintigrafia usando câmeras gama ou tomografia computadorizada de emissão de fóton único. O domínio de ligação ao antígeno variante e o anticorpo da invenção podem ser acoplados a emissores de pósitrons e usados em PET. O domínio de ligação ao antígeno variante e o anticorpo da invenção podem ser acoplados a corantes fluorescentes, como Cy3, Cy2, Cy5 ou FITC, e usados em métodos de imunofluorescência por endoscopia. O domínio de ligação ao antígeno variante e o anticorpo da invenção que são modificados conforme descrito são administrados por qualquer via adequada, por exemplo, por via intravenosa, em uma dose apropriada para o indivíduo e a localização de células T positivas para TRBC2 é detectada, determinada ou medida por processos bem conhecidos no estado da técnica. Os métodos e tecnologias usados neste documento, incluindo imagens de diagnóstico, são conhecidos dos técnicos versados no assunto, que também pode fornecer formulações de doses adequadas.
[00311] O linfoma de células T ou leucemia a ser diagnosticado pode ser selecionado a partir de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL- NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[00312] A amostra pode ser, ou pode ser derivada de, uma amostra de sangue.
13. Métodos de medicina personalizada
[00313] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar indivíduos com um linfoma de células T ou leucemia elegíveis para tratamento com uma célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico da invenção, doravante denominado "o primeiro método de medicina personalizada da invenção”, compreendendo a determinação da porcentagem de células T positivas para TRBC2 em uma amostra que compreende células T do sujeito.
[00314] Os termos "célula da invenção", "anticorpo da invenção", "BiTE da invenção", "agente quimioterapêutico da invenção", "sujeito" e "amostra compreendendo células T" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a este aspecto da invenção.
[00315] No primeiro método de medicina personalizada da invenção, o sujeito é elegível para o referido tratamento com uma célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico da invenção se a porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra for 70%, ou 75 %, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 96%, ou 97%, ou 98%, ou 99%, ou mais.
[00316] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para selecionar uma terapia compreendendo uma célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico da invenção para o tratamento de um sujeito, doravante denominado "o segundo método de medicina personalizada da invenção", compreendendo a determinação a porcentagem de células T positivas para TRBC2 em uma amostra que compreende células T do sujeito.
[00317] Os termos "célula da invenção", "anticorpo da invenção", "BiTE da invenção", "agente quimioterapêutico da invenção", "sujeito" e "amostra compreendendo células T" foram descritos em detalhes no contexto de aspectos anteriores da invenção e suas características e concretizações se aplicam igualmente a este aspecto da invenção.
[00318] No segundo método de medicina personalizada da invenção, a terapia compreendendo uma célula, anticorpo, BiTE ou conjugado quimioterápico da invenção é selecionada para tratar o referido sujeito se a porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra for 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 96%, ou 97%, ou 98%, ou 99%, ou mais.
[00319] A amostra pode ser, ou pode ser derivada de, uma amostra de sangue.
[00320] O linfoma de células T ou leucemia pode ser selecionado de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, cutâneo Linfoma de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
[00321] A invenção será agora descrita mais detalhadamente por meio de Exemplos, que se destinam a servir para ajudar um técnico versado no assunto a realizar a invenção e não se destinam de forma alguma a limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1: Análise da ligação de anticorpos anti-TRBC2 por ressonância plasmônica de superfície (SPR)
[00322] A estrutura cristalina do anticorpo monoclonal específico para TRBC1 hJovi-1 foi resolvida em complexo com um TRBC1-TCR para 2,4Å (Figura 3). Por meio da biologia computacional e da engenharia de proteínas, várias versões mutantes do ligante anti-TRBC1 foram racionalmente projetadas para mudar a especificidade de TRBC1 para TRBC2. Vários ligantes anti-TRBC2 foram gerados no formato IgG. A Tabela 1 mostra detalhes das mutações incluídas nos domínios VH e VL de hJovi-1.
[00323] Um chip sensor CM5 série S foi imobilizado via acoplamento de amina, com um anticorpo de captura de Fc anti-humano a uma densidade de 9000-10000 RU, usando um instrumento Biacore T200. O tampão HBS-P + foi usado como tampão de corrida em todas as condições experimentais. Os anticorpos anti-TRBC2 de teste (Tabela 1) foram capturados nas células de fluxo 2, 3 e 4 a uma densidade de 100 - 300 RU. TRBC1 ou TRBC2 purificado recombinante em concentrações conhecidas foram usados como o "analito" e injetados sobre as respectivas células de fluxo com tempo de contato de 150s e dissociação de 300s a 30 µl / minuto de taxa de fluxo. Em cada experiência, a célula de fluxo 1 não foi modificada e usada para subtração de referência. Um sensorgrama de 'concentração 0' de tampão sozinho foi usado como uma subtração de referência dupla para fatorar para deriva. Os dados foram ajustados a um modelo de ligação Langmuir 1:1. Como um sistema de captura foi usado, um parâmetro Rmax local foi usado para o ajuste dos dados em cada caso.
[00324] Os resultados das afinidades para TRBC1 e TRBC2 obtidos para cada um dos anticorpos anti-TRBC2 são mostrados na Tabela 1. Os anticorpos anti-TRBC2 de teste mostraram uma ligação preferencial para TRBC2, geralmente na faixa de nM, com propriedades cinéticas variando ka e kd. A ligação ao TRBC1 foi avaliada como > 1 µM na maioria dos casos, com valores próximos ao limite de sensibilidade do instrumento. Exemplo 2: Geração de um CAR anti-TRBC2 com base no ligante
KFN
[00325] Construções de CAR de segunda geração foram gerados com base em um mutante triplo anti-TRBC2 (mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH de hJovi-1, SEQ ID NO: 26) e Jovi-1 humanizado (hJovi-1) (Figura 4) . Essas construções CAR foram clonadas em um vetor retroviral e usadas para transduzir PBMCs ativados obtidos de doadores saudáveis. Exemplo 3: Caracterização funcional de um CAR anti-TRBC2: produção de citocina
[00326] Para avaliar a capacidade funcional das células CAR-T mutantes triplas anti-TRBC2 em relação a TRBC2, foi utilizado um ensaio ligado a placa em que TRBC1 ou TRBC2 são imobilizados antes da adição de células CAR-T. Após 72 horas, os sobrenadantes da cultura foram coletados e a produção de IFN-γ medida por ELISA. Na Figura 5A, as células CAR-T mutantes triplo anti-TRBC2 mostraram maior liberação de IFN-γ na presença do ligante TRBC2 em comparação com TRBC1. Em contraste, as células hJovi-1 CAR-T mostraram alta produção de IFN-γ apenas quando cultivadas com o ligante TRBC1 (Figura 5B). Estes resultados demonstram que as células CAR-T transduzidas com o mutante triplo anti-TRBC2 têm maior ativação e liberação de citocinas para TRBC2, mas não quando expostas a TRBC1. Exemplo 4: Caracterização funcional de um CAR anti-TRBC2: Ensaio de citotoxicidade
[00327] Para determinar a capacidade do mutante triplo anti-TRBC2 para direcionar TRBC2, os ensaios de citotoxicidade foram configurados usando células Raji transduzidas para expressar TRBC1 ou TRBC2 como células alvo e co-cultivadas com células CAR-T. Células hJovi-1 CAR-T ou células CAR-T mutantes triplas anti-TRBC2 foram cultivadas em uma proporção de 1:1 (E: T) com células Raji WT, Raji TRBC1 + ou Raji TRBC2+. A recuperação das células alvo foi medida 72 horas após a cultura por citometria de fluxo e usada para estabelecer a capacidade citotóxica das células CAR-T. As culturas contendo células CAR-T mutantes triplo anti-TRBC2 mostraram sobrevivência limitada de células alvo Raji TRBC2+ (Figura 6). Em contraste, as células CAR-T mutantes triplas anti-TRBC2 não eliminaram as células-alvo Raji TRBC1+, indicando sua maior proficiência no direcionamento de células TRBC2+.
[00328] Usamos o anticorpo monoclonal projetado para gerar um CAR anti-TRBC2 de 2ª geração. Demonstramos que nosso CAR anti-TRBC2 apresentou especificidade, liberação de citocinas e citotoxicidade em coculturas de 72h contra linhagens celulares TRBC2 +, mas não linhagens celulares TRBC1 + ou linhagens celulares que não expressaram TCR na superfície. As células T anti-TRBC2 CAR também demonstraram capacidade proliferativa em ensaios de co-cultura de longo prazo. Exemplo 5: Caracterização funcional de CARs anti-TRBC2: Ensaio de morte
[00329] Construções de CAR de segunda geração adicionais foram gerados com base em ligantes anti-TRBC2 da Tabela 1 com as seguintes mutações: - T28K, Y32F, mutações A100N no domínio VH e N35K no domínio VL de hJovi-1 (denominado N35K, SEQ ID NO: 25), - mutações T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH de hJovi-1 (denominado N103L, SEQ ID NO: 27), - mutações T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35Y no domínio VL de hJovi-1 (denominado N103M-N35Y, SEQ ID NO: 28), - mutações T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL de hJovi-1 (denominado Y102F-N103M- N35R, SEQ ID NO: 29), - Mutações T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL de hJovi-1 (denominado Y102L-N103M- N35R, SEQ ID NO: 30).
[00330] Estas construções CAR e o mutante triplo anti- TRBC2 (mutações T28K, Y32F, A100N no domínio VH de hJovi-1, denominado KFN, SEQ ID NO: 26), foram clonados em um vetor retroviral e usados para transduzir (a) Jurkat células, ou (b) PBMCs ativados obtidos de doadores saudáveis. Um CAR de controle anti-TRBC1, isto é, contrução hJovi-1 CAR, foi usada como controle no ensaio de morte usando PBMCs ativados. a) Células Jurkat
[00331] Para avaliar se os ligantes gerados eram específicos para o antígeno TRBC2, as células Jurkat, que são TRBC1 +, foram transduzidas com os construtos de CAR anti-TRBC2 acima. Co-culturas de células Jurkat transduzidas foram estabelecidas em uma proporção de 1:1 efetor para alvo (E: T) usando células HPB-ALL transduzidas para expressar TRBC1 ou TRBC2 apenas (denominado HPB TRBC1 e HPB TRBC2, respectivamente) como células alvo, com células HPB-ALL tendo um TCR nocauteado (denominado HPB KO) como controle negativo. As células Jurkat transduzidas foram semeadas sozinhas ou com anticorpos αCD3 / αCD28 para serem usados como controle de ensaio negativo ou positivo, respectivamente. A ativação específica do antígeno foi avaliada através da coloração de CD69 por citometria de fluxo após 24 h.
[00332] Os resultados mostrados na Figura 7 revelaram que todas as células Jurkat transduzidas foram seletivamente ativadas após a co-incubação com células HPB TRBC2. Estes resultados demonstram que todos os CARs testados exibiram especificidade para alvos TRBC2, uma vez que a regulação positiva de CD69 não foi observada quando Jurkat foi co- cultivado com alvos TRBC1+ ou HPB KO. b) PBMCs
[00333] Em primeiro lugar, PBMCs foram separados em células TRBC1 + e TRBC2 + usando esferas magnéticas revestidas com antibiotina após coloração com 10ug / ml de anticorpo JOVI-1 murino biotinilado, que se liga apenas a
TRBC1. A população TRBC2 + foi transduzida com hJovi-1 CAR (JOVI) e a população TRBC1 + com os CARs anti-TRBC2 acima. Esta transdução diferencial garantiu que a ativação do antígeno e a morte do alvo só fossem desencadeadas quando os alvos fossem adicionados em condições de cultura controladas (por exemplo, razões efetoras para alvo e pontos de tempo) em vez de em uma população mista onde as condições são diferentes para cada doador de PBMC.
[00334] Em segundo lugar, os ensaios de morte foram configurados usando células HPB-ALL transduzidas para expressar TRBC1 ou TRBC2 apenas (denominado TRBC1 + HPB-ALL e TRBC2 + HPB-ALL, respectivamente) como células alvo, com células HPB-ALL tendo um TCR nocauteado (denominado HPB-KO) como controle. As células foram co-cultivadas na proporção E: T de 1: 2 10 dias após a transdução. A morte celular foi avaliada por citometria de fluxo 72 h após a configuração do ensaio.
[00335] Os resultados demonstraram que as células HJovi-1 CAR-T mataram apenas as células TRBC1 + HPB-ALL e que todas as células anti-TRBC2 CAR-T mataram apenas as células TRBC2 + HPB-ALL (Fig. 8). Níveis semelhantes de morte de fundo foram observados para todas as células CAR-T específicas de TRBC1 e TRBC2 em células de controle HPB-KO, indicando que todos os CARs testados eram específicos para seu antígeno cognato. Exemplo 6: Análise do efeito de diferentes formatos de anticorpos na ligação de anticorpos anti-TRBC2 por ressonância plasmônica de superfície (SPR)
[00336] O efeito da multimerização nos ligantes anti-
TRBC2 foi analisado por SPR. Para este fim, o anti-TRBC2 com mutações T28K, Y32F, A100N, Y102L e N103M no domínio VH e mutação N35R no domínio VL do anticorpo hJovi-1 foi usado em três formatos diferentes, ou seja, formatos de anticorpos scFv (SEQ ID NO: 22), scFv-Fc (SEQ ID NO: 23) e scFv-COMP (SEQ ID NO: 24).
[00337] SEQ ID NO: 22
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKR
[00338] SEQ ID NO: 23
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSDPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLS PIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMS GKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMP EDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLH NHHTTKSFSRTPGK
[00339] SEQ ID NO: 24
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQ SNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGT MVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYL HWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQST HVPYTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSAGSDLGPQMLRELQETNAALQDVRELL RQQVREITFLKNTVMECDACGSGKKDPKSGGGGSYPYDVPDYA
[00340] Para testar a interação de ligação 1:1 do anti-TRBC2 scFv, um chip sensor série S CM5 foi imobilizado via acoplamento de amina, com um anticorpo de captura de Fc anti-humano a uma densidade de 9000-10000 RU, usando um instrumento Biacore T200. O tampão HBS-P + foi usado como tampão de corrida em todas as condições experimentais. O anticorpo anti-TRBC2 de teste foi capturado no fluxo 4 a uma densidade de 200-250 RU. TRBC1 ou TRBC2 purificado recombinante em concentrações conhecidas foram usados como o "analito" e injetados sobre as respectivas células de fluxo com tempo de contato de 150s e dissociação de 300s a 30 µl / minuto de taxa de fluxo. A célula de fluxo 1 não foi modificada e usada para subtração de referência. Um sensorgrama de 'concentração 0' de tampão sozinho foi usado como uma subtração de referência dupla para fatorar para deriva. Os dados foram ajustados a um modelo de ligação Langmuir 1:1. Como um sistema de captura foi usado, um parâmetro Rmax local foi usado para o ajuste dos dados em cada caso. O valor da taxa de exclusão foi determinado e a meia-vida calculada de acordo com: t½ = ln2 / kd.
[00341] Os resultados mostrados na Figura 9A revelaram que este ligante anti-TRBC2 scFv tem meia-vida de 8 s. A afinidade de ligação deste ligante é mostrada na Tabela 1.
[00342] Para testar a interação multivalente dos formatos de anticorpos scFv-Fc e scFv-COMP, um chip da série S CAP foi imobilizado com reagente de captura de biotina para 2500-5000 RU. TRBC1 e TRBC2 biotinilados recombinantes solúveis foram capturados em células de fluxo 3, em ciclos experimentais independentes, a uma densidade de 90-110 RU. Os anticorpos purificados anti-TRBC2 scFv-Fc ou scFv-COMP foram injetados sobre a célula de fluxo com 150s de tempo de contato e 300s de dissociação a 30 µl / minuto de taxa de fluxo. Na célula de fluxo 1, a proteína biotinilada foi omitida e usada para a subtração de referência. Um sensorgrama de 'concentração 0' de tampão sozinho foi usado como uma subtração de referência dupla para fatorar para deriva. Os dados foram ajustados a um modelo de ligação Langmuir 1:1. Como um sistema de captura foi usado, um parâmetro Rmax local foi usado para o ajuste dos dados em cada caso. O valor da taxa de exclusão foi determinado e a meia-vida calculada de acordo com: t½ = ln2 / kd.
[00343] Os resultados mostrados nas Figuras 9B e 9C revelaram que as meias-vidas dos formatos de anticorpo scFv- Fc e scFv-COMP são 16,2 se 7,3 min, respectivamente.
[00344] Portanto, estes resultados demonstram que a multimerização melhora a ligação de anticorpos TRBC2 de baixa afinidade / alta especificidade.
[00345] Este pedido reivindica o benefício do pedido do Reino Unido nº 1817822.8, depositado em 31 de outubro de
2018. Este pedido é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00346] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistema da invenção serão evidentes para os técnicos versados no assunto sem se afastar do escopo e do espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com concretizações preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção conforme reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais concretizações específicas.
Na verdade, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para os técnicos versados em biologia molecular ou campos relacionados pretendem estar dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Domínio de ligação ao antígeno variante caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma mutação no domínio VH em comparação com um anticorpo de referência tendo um domínio VH com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 e um domínio VL com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2, em que pelo menos uma mutação no domínio VH é selecionada a partir de T28K, Y32K e A100N, e, em que o domínio de ligação ao antígeno variante exibe uma afinidade aumentada para TRBC2 sobre o anticorpo de referência.
2. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos duas mutações no domínio VH selecionadas a partir de T28K, Y32K e A100N.
3. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas mutações no domínio VH são Y32K e A100N.
4. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a mutação T28R no domínio VH.
5. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a mutação G31K no domínio VH.
6. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende as mutações T28K, Y32K e A100N.
7. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma mutação em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em V2, Y27, G31, R98, Y102, N103 e A107 no domínio VH, N35 no Domínio VL e R55 no domínio VL.
8. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma outra mutação é selecionada a partir de: a) no domínio VH: - V2K, V2R, - Y27F, Y27M, Y27N, Y27W, - G31K, G31R, G31S, - R98K, - Y102F, Y102L, - N103A, N103E, N103F, N103H, N103L, N103M, N103Q, N103S, N103W, N103Y, - A107S, e b) no domínio VL: - N35M, N35F, N35Y, N35K, N35R e - R55K.
9. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir de um domínio de ligação ao antígeno variante compreendendo as seguintes combinações de mutação: - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y27N no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, G31K no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y27M no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y27W no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e R55K no domínio VL,
- T28K, Y32F, A100N, N103H no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103A no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103Y no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, R98K no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH,
- T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103L no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y27F no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103Q no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, G31R no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103W no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, V2R no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, G31S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, A107S no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103E no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, V2K no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, N103E no domínio VH, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35F no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35M no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35Y no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, N103F no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W no domínio VH e N35R no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103W no domínio VH e N35K no domínio VL, - T28K, Y32F, A100N, Y102F no domínio VH, e - T28K, Y32F, A100N, Y102L, N103M no domínio VH e N35R no domínio VL.
10. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende mutações T28K, Y32F e A100N no domínio VH e mutação N35K no domínio VL.
11. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende as mutações T28K, Y32F e A100N no domínio VH.
12. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno variante exibe ainda uma afinidade diminuída para TRBC1 em relação ao anticorpo de referência.
13. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a razão das afinidades do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 e TRBC1 é de pelo menos 2.
14. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a razão das afinidades do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 e TRBC1 é de pelo menos 5.
15. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a razão das afinidades do domínio de ligação ao antígeno variante para TRBC2 e TRBC1 é de pelo menos 10.
16. Domínio de ligação ao antígeno variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um domínio de oligomerização.
17. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
18. Receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 15, um espaçador, um domínio transmembranar e um endodomínio.
19. CAR, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o espaçador é selecionado a partir de uma haste CD8 humana como estabelecida na SEQ ID NO: 7 e um espaçador COMP como estabelecido na SEQ ID NO: 19.
20. Engajador biespecífico de células T (BiTE), caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um domínio de ativação de células T.
21. Sequência de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica um domínio de ligação ao antígeno variante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 16, um anticorpo, conforme definido pela reivindicação 17, um CAR conforme definido pela reivindicação 18 ou 19, ou um BiTE, conforme definido pela reivindicação 20.
22. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico, conforme definida pela reivindicação 21.
23. Célula caracterizada pelo fato de que compreende um CAR, conforme definido pela reivindicação 18 ou 19.
24. Método para produzir uma célula, conforme definido pela reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de transdução ou transfecção de uma célula com um vetor conforme definido pela reivindicação 22, que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR.
25. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou um anticorpo,
conforme definido pela reivindicação 17, e uma entidade detectável ou uma entidade quimioterápica.
26. Conjugado, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende uma entidade quimioterapêutica.
27. Método para tratar um linfoma de células T ou leucemia em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administração de uma célula, conforme definido pela reivindicação 23, ou um anticorpo, conforme definido pela reivindicação 17, ou um BiTE, conforme definido pela reivindicação 20, ou um conjugado, conforme definido pela reivindicação 25 ou 26 a um sujeito, em que as células T malignas expressam TRBC2.
28. Célula, de acordo com a reivindicação 23, ou anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, ou BiTE, de acordo com a reivindicação 20, ou um conjugado, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que é para uso em medicina.
29. Célula, de acordo com a reivindicação 23, ou um anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, ou um BiTE, de acordo com a reivindicação 20, ou um conjugado, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um linfoma de células T ou leucemia, em que o as células T malignas expressam TRBC2.
30. Uso de uma célula, conforme definido pela reivindicação 23, ou um anticorpo, conforme definido pela reivindicação 17, ou um BiTE, conforme definido pela reivindicação 20, ou um conjugado, conforme definido pela reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um linfoma de células T ou leucemia, em que as células T malignas expressam TRBC2.
31. Agente de diagnóstico caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno variante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou um anticorpo, conforme definido pela reivindicação
17.
32. Agente de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que é para diagnosticar um linfoma de células T ou leucemia.
33. Método para diagnosticar um linfoma de células T ou leucemia em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar um domínio de ligação ao antígeno variante, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou um anticorpo, conforme definido pela reivindicação 17, a uma amostra compreendendo células T do sujeito.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de determinação da porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que uma porcentagem de 70% ou mais de células T positivas para TRBC2 na amostra é indicativo da presença de um linfoma de células T ou leucemia.
36. Método para identificar indivíduos com linfoma de células T ou leucemia elegíveis para tratamento com uma célula, conforme definido pela reivindicação 23, ou um anticorpo, conforme definido pela reivindicação 17, ou um BiTE, conforme definido pela reivindicação 20, ou um conjugado, conforme definido pela reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que compreende a determinação da porcentagem de células T positivas para TRBC2 em uma amostra que compreende células T do sujeito.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o sujeito é elegível para o referido tratamento com uma célula, conforme definido pela reivindicação 23, ou um anticorpo conforme definido pela reivindicação 17, ou um BiTE, conforme definido pela reivindicação 20, ou um conjugado, conforme definido pela reivindicação 25 ou 26, se a porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra for 70% ou mais.
38. Método para selecionar uma terapia caracterizado pelo fato de que compreende uma célula, conforme definido pela reivindicação 23, ou um anticorpo, conforme definido pela reivindicação 17, ou um BiTE, conforme definido pela reivindicação 20, ou um conjugado, conforme definido pela reivindicação 25 ou 26, para o tratamento de um sujeito, compreendendo a determinação a porcentagem de células T positivas para TRBC2 em uma amostra que compreende células T do sujeito.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a referida terapia é selecionada para tratar o referido sujeito se a porcentagem de células T positivas para TRBC2 na amostra for de 70% ou mais.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 39, caracterizado pelo fato de que a amostra é, ou é derivada de, uma amostra de sangue.
41. Método, de acordo com a reivindicação 27, ou célula ou anticorpo ou BiTE ou conjugado de fármaco para uso de acordo com a reivindicação 29, ou uso de acordo com a reivindicação 30, ou agente de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 ou 32, ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 40, em que o linfoma de células T ou leucemia é selecionado a partir de linfoma de células T periférico, não especificado de outra forma (PTCL-NOS); linfoma angioimunoblástico de células T (AITL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma de células T associado a enteropatia (EATL), linfoma hepatoesplênico de células T (HSTL), linfoma de células T / NK extranodal tipo nasal, Linfoma cutâneo de células T, ALCL cutâneo primário, leucemia prolinfocítica de células T e leucemia linfoblástica aguda de células T.
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