CN112969713A - 结合结构域 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了变体抗原结合结构域，其与参考抗体相比在VH结构域中包含至少一个突变，并且相对于参考抗体显示出对TRBC2的增加的亲和力。还提供了抗体、嵌合抗原受体(CAR)和双特异性T细胞衔接物(BiTE)、包含所述CAR的细胞、以及包含所述变体抗原结合结构域或所述抗体的缀合物。另外，本发明提供了利用本发明产品的医疗用途、诊断方法和个性化医疗方法。

Description

结合结构域
发明领域
本发明涉及特异性结合TRBC2的变体抗原结合结构域。其还涉及可用于治疗和诊断T细胞恶性肿瘤的细胞和试剂。
发明背景
淋巴样恶性肿瘤可以大致分为源自T细胞或B细胞的那些。T细胞恶性肿瘤是一组临床和生物学上异质的病症，总共包含10-20％的非霍奇金淋巴瘤和20％的急性白血病。最常鉴定的组织学亚型是外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。在所有急性淋巴母细胞性白血病(ALL)中，约20％是T细胞表型。
这些状况与例如B细胞恶性肿瘤相比通常表现出侵略性，其中估算的5年生存率仅为30％。在T细胞淋巴瘤的情况下，它们与高比例的的患者呈现有播散性疾病、不利的国际预后指标(IPI)得分和结外疾病的流行相关。单独的化学疗法通常无效，并且小于30％的患者通过当前的治疗方法得以治愈。
此外，不像在B细胞恶性肿瘤中(其中免疫疗法如抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)具有显著改善的结果)，目前尚无可用于治疗T细胞恶性肿瘤的等同有效、毒性最小的免疫疗法。开发针对T细胞病症的免疫疗法的一个重要困难是克隆T细胞和正常T细胞的标志物表达中有相当大的重叠，没有单一抗原能够清楚地鉴别克隆(恶性)细胞。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞在治疗难治性B细胞恶性肿瘤方面已显示出前景。靶向T细胞恶性肿瘤可能同样有效，但是由于缺乏合适的靶抗原，CAR在例如T细胞淋巴瘤的疾病中的应用受到了阻碍。与B细胞淋巴瘤不同，其中B细胞区室的消融是可控的毒性并且可以通过静脉注射免疫球蛋白来治疗，破坏T细胞区室的耐受性不佳，并且会导致与抑制细胞介导的免疫力相关的并发症。
先前在WO2015/132598中描述了治疗T细胞淋巴瘤和白血病的方法，该方法包括靶向TCRβ链的恒定区(TRBC)。该方法基于T细胞受体的独特特征，即每个TCR以互斥方式编码TRBC1或TRBC2。因为T细胞淋巴瘤和白血病是细胞的克隆群，所以每个淋巴瘤将会在表面上表达一种TCR，其具有TRBC1或TRBC2。
单克隆抗体Jovi-1与TRBC1特异性结合，并已被用作CAR结合结构域，用于治疗T细胞淋巴瘤的疗法(Maciocia et al.,2017,Nat Med 23:1416-23；WO2015/132598)。该提议的疗法允许治疗表达具有TRBC1恒定区的TCR的患者子集。
为了治疗全部的患者群体，靶向TRBC2的结合物/CAR是必需的。获得对TRBC2特异的抗体的一种方法是通过针对人噬菌体展示文库进行噬菌体选择。另一种方法在于用TRBC2衍生的肽来免疫动物并随后选择特异性抗体。如WO2015/132598中所公开的，已经成功地执行了这两种方法，并且产生了各种TRBC2特异性结合物。
本发明提供了对TRBC2具有特异性的替代结合物，其是用于治疗TRBC2+淋巴瘤或白血病的潜在治疗剂。
发明概述
本发明人已经解析了与TRBC1-TCR复合的TRBC1特异性单克隆抗体JOVI-1(Vineyet al.,1992,Hybridoma 11:701-13)的晶体结构至
Figure BDA0003046871960000021
(图3)。根据该晶体结构，可以对原始的Jovi-1抗体进行改造，以使其与TRBC2结合。该方法特别有吸引力，因为抗体中的许多氨基酸形成互补位，从而提供形状互补性以实现TCR的结合，而只有少数氨基酸是TRBC1的特异性所需的。通过计算生物学和蛋白质工程，发明人合理设计了TRBC1结合物的突变形式，其对TRBC2具有特异性并且对TRBC1具有降低的亲和力。
因此，在第一方面，本发明提供了变体抗原结合结构域，其与参考抗体相比包含VH结构域中的至少一个突变，所述参考抗体具有以下VH结构域和VL结构域：具有SEQ ID NO:1所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:2所示的序列的VL结构域，其中所述VH结构域中的至少一个突变选自T28K、Y32K和A100N，并且其中所述变体抗原结合结构域相对于所述参考抗体显示出对TRBC2的增加的亲和力。
变体抗原结合结构域可以包含选自T28K、Y32K和A100N的VH结构域中的至少两个突变。例如，其可以包含突变Y32K和A100N。变体抗原结合结构域还可以包含VH结构域中的突变T28R或替代地VL结构域中的突变G31K。
变体抗原结合结构域可以包含T28K、Y32K和A100N突变。
变体抗原结合结构域可以在选自VH结构域中的V2、Y27、G31、R98、Y102、N103和A107、VL结构域中的N35和VL结构域中的R55的位置处还包含至少一个突变。该至少一个其他的突变可选自：
a)VH结构域中的：
-V2K、V2R，
-Y27F、Y27M、Y27N、Y27W，
-G31K、G31R、G31S，
-R98K，
-Y102F、Y102L，
-N103A、N103E、N103F、N103H、N103L、N103M、N103Q、N103S、N103W、N103Y，
-A107S，
和
b)VL结构域中的：
-N35M、N35F、N35Y、N35K、N35R，和
-R55K。
变体抗原结合结构域可以选自包含以下突变组合的变体抗原结合结构域：
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27N，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27W，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的R55K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103H，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103A，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、R98K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103Q，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、V2R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、A107S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103E和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、V2K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103E，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103W和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103W和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F，和，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M和VL结构域中的N35R。
变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变以及VL结构域中的N35K突变。
变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的T28K、Y32F和A100N突变。
与参考抗体相比，变体抗原结合结构域可以进一步显示出对TRBC1的亲和力降低。
变体抗原结合结构域对TRBC2和TRBC1的亲和力的比率为至少2。
变体抗原结合结构域对TRBC2和TRBC1的亲和力的比率为至少5。
变体抗原结合结构域对TRBC2和TRBC1的亲和力的比率为至少10。
变体抗原结合结构域还可以包含寡聚化结构域。
在第二方面,本发明提供了包含根据本发明第一方面的变体抗原结合结构域的抗体。
在第三方面，本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据本发明第一方面的变体抗原结合结构域、间隔区、跨膜结构域和胞内域。
间隔区可以选自如SEQ ID NO:7所示的人CD8茎部和如SEQ ID NO:19所示的COMP间隔区。
在第四方面，本发明提供了双特异性T细胞衔接物(BiTE)，其包含根据本发明第一方面的变体抗原结合结构域和T细胞激活结构域。
在第五方面,本发明提供了核酸序列，其编码根据本发明第一方面的变体抗原结合结构域、根据本发明第二方面的抗体、根据本发明第三方面的CAR、或根据本发明第四方面的BiTE。
在第六方面,本发明提供了包含根据本发明第五方面的核酸序列的载体。
在第七方面,本发明提供了包含根据本发明第三方面的CAR的细胞。
在第八方面，本发明提供了用于制备根据本发明第七方面的细胞的方法，其包括用包含编码CAR的核酸序列的根据本发明第六方面的载体转导或转染细胞的步骤。
在第九方面,本发明提供了缀合物，其包含根据本发明第一方面的变体抗原结合结构域、或根据本发明第二方面的抗体，和可检测实体或化学治疗实体。
缀合物可以包含化学治疗实体。
在第十方面，本发明提供了用于治疗受试者的T细胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括向受试者施用根据本发明第七方面的细胞、或根据本发明第二方面的抗体、或根据本发明第四方面的BiTE、或根据本发明第九方面的缀合物的步骤，其中恶性T细胞表达TRBC2。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
在第十一方面,本发明提供了根据本发明第七方面的细胞、或根据本发明第二方面的抗体、或根据本发明第四方面的BiTE、或根据本发明第九方面的缀合物，其用于药物。
在第十二方面，本发明提供了根据本发明第七方面的细胞、或根据本发明第二方面的抗体、或根据本发明第四方面的BiTE、或根据本发明第九方面的缀合物，其用于T细胞淋巴瘤或白血病的治疗，其中恶性T细胞表达TRBC2。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
在第十三方面,本发明提供了根据本发明第七方面的细胞、或根据本发明第二方面的抗体、或根据本发明第四方面的BiTE、或根据本发明第九方面的缀合物在制备用于治疗T细胞淋巴瘤或白血病的药物中的用途，其中恶性T细胞表达TRBC2。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
在第十四方面,本发明提供了诊断剂，其包含根据本发明第一方面的变体抗原结合结构域或根据本发明第二方面的抗体。
诊断剂可以用于诊断T细胞淋巴瘤或白血病。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
在第十五方面，本发明提供了用于诊断受试者的T细胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括使根据本发明第一方面的变体抗原结合结构域或根据本发明第二方面的抗体与来自所述受试者的包含T细胞的样品接触的步骤。
所述用于诊断受试者的T细胞淋巴瘤或白血病的方法还包括确定样品中TRBC2阳性T细胞的百分比的步骤。
样品中70％或更高的TRBC2阳性T细胞的百分比可以指示T细胞淋巴瘤或白血病的存在。
样品可以是血液样品或可以衍生自血液样品。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
在第十六方面，本发明提供了用于鉴定适合用根据本发明第七方面的细胞、或根据本发明第二方面的抗体、或根据本发明第四方面的BiTE、或根据本发明第九方面的缀合物治疗的的具有T细胞淋巴瘤或白血病的受试者的方法，包括确定来自所述受试者的包含T细胞的样品中TRBC2阳性T细胞的百分比。
如果样品中TRBC2阳性T细胞的百分比为70％或更高，则受试者适合所述用根据本发明第七方面的细胞、或根据本发明第二方面的抗体、或根据本发明第四方面的BiTE、或根据本发明第九方面的缀合物治疗。
样品可以是血液样品或可以衍生自血液样品。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
在第十七方面，本发明提供了用于选择包含根据本发明第七方面的细胞、或根据本发明第二方面的抗体、或根据本发明第四方面的BiTE、或根据本发明第九方面的缀合物的疗法来治疗受试者的方法，其包括确定来自所述受试者的包含T细胞的样品中TRBC2阳性T细胞的百分比。
如果所述样品中TRBC2阳性T细胞的百分比为70％或更高，则选择所述疗法来治疗所述受试者。
样品可以是或可以衍生自血液样品。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
附图说明
图1.αβT细胞受体/CD3复合物的示意图。T细胞受体由6条不同的蛋白质链形成，所述蛋白质链必须在内质网中组装以在细胞表面表达。CD3复合物的四种蛋白质(CD3z、CD3g、CD3e和CD3δ)覆盖T细胞受体(TCR)。该TCR使复合物具有特定抗原的特异性并由两条链组成：TCRa和TCRβ。每条TCR链在膜的远侧具有可变组分以及在膜的近侧具有恒定组分。几乎所有的T细胞淋巴瘤和许多T细胞白血病都表达TCR/CD3复合物。
图2：T细胞受体重排期间T细胞受体β恒定区(TRBC)-1和TRBC2的分离。每条TCRβ链均由特定β可变区(V)、多样性区(D)、接合区(J)和恒定区(TRBC)的基因组重组形成。人基因组含有两个非常相似且功能等同的TRBC基因座，称为TRBC1和TRBC2。在TCR基因重排期间，J区与TRBC1或TRBC2之一重组。这种重排是永久的。T细胞在其表面上表达单个TCR的许多拷贝，因此每个T细胞将表达其β链恒定区由TRBC1或TRBC2编码的TCR。
图3.TCRβ和TRBC1特异性抗体Jovi-1的Fab片段之间的结构界面。
图4.TRBC1和TRBC2特异性嵌合抗原受体(CAR)的结构图。
图5.抗TRBC2 CAR的功能表征。
在TRBC1或TRBC2存在下孵育(A)抗TRBC2三重突变CAR和(B)抗TRBC1 CAR的IFN-γ产生。
图6.与Raji WT、Raji TRBC1+或Raji TRBC2+细胞共孵育的(A)抗TRBC2三重突变CAR-T细胞和(B)抗TRBC1 CAR-T细胞的细胞毒性活性。
图7.与HPB TRBC1和HPB TRBC2细胞共孵育的、用抗TRBC2 CAR转导的Jurkat细胞的抗原特异性激活。用第二代抗TRBC2 CAR构建体转导Jurkat细胞(TRBC1+)，并与HPBTRBC1和HPB TRBC2细胞以1:1的E:T比例共孵育。对照包括未转导的Jurkat细胞(NT)、具有敲除的TCR的HPB-ALL细胞(称为HPB KO)以及转导的Jurkat细胞单独铺板作为阴性对照，或与αCD3/αCD28抗体一起铺板作为阳性测定对照。N35K：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变和VL结构域中的N35K的结合物；N103L：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L突变的结合物；N103M-N35Y：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M突变和VL结构域中的N35Y的结合物；Y102F-N103M-N35R：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M突变和VL结构域中的N35R的结合物；以及Y102L-N103M-N35R：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M突变和VL结构域中的N35R的结合物。
图8.与TRBC1+HPB-ALL和TRBC2+HPB-ALL细胞共同孵育的抗TRBC2CAR-T细胞的细胞毒活性。用第二代抗TRBC2 CAR构建体转导外周血单核细胞(PBMC)。将转导的PBMC与TRBC1+HPB-ALL和TRBC2+HPB-ALL细胞以1:2的E:T比例共孵育。对照包括未转导的细胞(NT)、用抗TRBC1 hJovi-1CAR(JOVI)转导的细胞和具有敲除的TCR的HPB-ALL细胞(HPB-KO)。N35K：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变和VL结构域中的N35K的结合物；N103L：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L突变的结合物；N103M-N35Y：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M突变和VL结构域中的N35Y的结合物；Y102F-N103M-N35R：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M突变和VL结构域中的N35R的结合物；以及Y102L-N103M-N35R：具有hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M突变和VL结构域中的N35R的结合物。
图9：通过表面等离振子共振(SPR)分析不同抗体形式对抗TRBC2抗体结合的影响。
发明详述
本发明人已经解析了Jovi-1的晶体结构，其已经用于鉴定对于TRBC1特异性必不可少的两个关键残基(图1)。有趣的是，这些残基位于CDR 1而不是CDR 3中，而CDR 3通常驱动抗体特异性。另外，非常接近TRBC1表位的其他残基可能对于改造从TRBC1到TRBC2的特异性是必不可少的。本文描述了Jovi-1中参与TRBC1结合或对产生TRBC2特异性十分重要的残基。
本发明提供了JOVI-1的抗原结合结构域的变体，其相比于JOVI-1对TCRβ恒定区2(TRBC2)的亲和力增加。
1.TCRβ恒定区(TRBC)
T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面上表达，并负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC)衔接时，T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、特化衔接分子以及激活或释放的转录因子介导的生化事件得以活化。
TCR是二硫键连接的膜锚定的异二聚体，通常由高度可变的alpha(α)和beta(β)链组成，表达为具有不变CD3链分子的复合物的一部分。表达该受体的T细胞称为α:β(或αβ)T细胞(约95％总T细胞)。少数T细胞表达由可变的gamma(γ)和delta(δ)链形成的替代受体，并称为γδT细胞(约5％总T细胞)。
每条α和β链均由两个细胞外结构域组成：可变(V)区和恒定(C)区，这两个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域形成反平行的β-折叠。恒定区接近细胞膜，随后是跨膜区和短的细胞质尾，而可变区则与肽/MHC复合物结合。TCR的恒定区由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，其形成两条链之间的连接。
TCRα链和β链两者的可变结构域均具有三个高变或互补决定区(CDR)。β链的可变区还具有一个另外的高变区(HV4)，但是，该区通常不接触抗原，因此不视为CDR。
TCR还包含多达五条不变链γ、δ、ε(统称为CD3)和ζ。CD3和ζ亚基通过特定的细胞质结构域介导TCR信号传导，在αβ或γδ识别抗原后，所述细胞质结构域与第二信使和衔接分子相互作用。TCR复合物的细胞表面表达之前是亚基的成对组装，其中TCRα和β的跨膜结构域和细胞外结构域两者以及CD3γ和δ均发挥作用。
因此，TCR通常由CD3复合物以及TCRα和β链组成，而TCRα和β链继而由可变区和恒定区组成(图1)。
供应TCRβ恒定区(TRBC)的基因座(Chr7:q34)在进化史上已经复制以产生两个几乎相同且功能等同的基因：TRBC1和TRBC2(图2)。每个TCR将以互斥方式包含TRBC1或TRBC2，并因此每个αβT细胞将以互斥方式表达TRBC1或TRBC2。
本发明人先前已经确定,尽管TRBC1和TRBC2的序列之间存在相似性，仍有可能在它们之间进行区分。本发明人先前还已经确定,TRBC1和TRBC2的氨基酸序列可以在细胞如T细胞的表面上原位区分(WO2015/132598)。
2.变体抗原结合结构域
在第一方面，本发明提供了变体抗原结合结构域，以下称为“本发明的变体抗原结 合结构域”，其与参考抗体相比包含VH结构域中的至少一个突变，所述参考抗体具有以下VH结构域和VL结构域：具有SEQ ID NO:1所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:2所示的序列的VL结构域，其中VH结构域中的至少一个突变选自T28K、Y32F和A100N，并且其中变体抗原结合结构域相对于参考抗体显示出对TRBC2的增加的亲和力。
如本文所用，术语“变体”或“突变体”是指使用例如重组DNA技术或从头合成产生的通过氨基酸插入、缺失和/或取代而与具体列举的多肽(即参考或亲本多肽)不同的多肽。变体和突变体在本发明的上下文中不区分地使用。本发明的变体抗原结合结构域包括抗原结合分子，其中一个或几个氨基酸残基通过取代、添加和/或缺失而被修饰，从而使得实质影响参考或亲本抗原结合结构域的抗原结合亲和力。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指抗体的每对轻链和重链的可变区，即形成其结合位点的VL和VH结构域。它们的特征在于由被称为框架(FR)的相对保留的区域与被称为互补决定区(CDR)的三个高变区连接而成的相同一般结构(Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication No.91-3242,Bethesda,MD.；Chothia&Lesk,1987,J Mol Biol 196:901-17)。如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体内与抗原形状互补的区域。因此，CDR决定了蛋白质对特定抗原的亲和力(大致是结合强度)和特异性。每对两条链的CDR通过框架区排列，从而获得结合特定表位的功能。
与参考抗体相比，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的至少一个突变。如本文所用，术语“参考抗体”是指人源化的JOVI-1抗体，即hJOVI-1，其包含具有SEQ IDNO：1所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID NO：2所示的序列的VL结构域。鼠JOVI-1已由Viney等人(1992；如上)描述，并且可商购获得(Abcam,ab5465)。先前已经确定，JOVI-1能够通过仅特异性结合TRBC1而基于TRBC1或TRBC2的特异性表达来区分细胞(WO 2015/132598)。
SEQ ID NO:1(hJOVI-1的VH结构域):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:2(hJOVI-1的VL结构域):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIK
在下文中，除非另有说明，否则对VH结构域的任何引用均指SEQ ID NO：1所示的hJOVI-1的VH结构域；并且除非另有说明，否则对VL结构域的任何引用均指SEQ ID NO：2所示的hJOVI-1的VL结构域。
本发明人已经确定，在参考抗体的VH结构域中选自T28K、Y32F和A100N的至少一个突变的存在触发了本发明的变体抗原结合结构域相对于参考抗体对TRBC2的亲和力增加(实施例1)。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体的抗原结合位点与表位之间相互作用的强度。与低亲和力的抗体相比，高亲和力的抗体将在更短的时间内结合更多的抗原。亲和力通常用抗体和抗原之间的平衡解离常数(KD)来度量，该常数是koff/kon的比值。抗原结合结构域对任何给定抗原的亲和力可以使用任何常规方法进行定量，包括但不限于标记依赖性方法，例如直接和间接ELISA和放射免疫测定方法，以及能够直接实时检测和测量相互作用的无标记方法，例如表面等离振子共振和生物层干扰。
本发明的变体抗原结合结构域相比于参考抗体对TRBC2的亲和力增加。变体抗原结合结构域对TRBC2的亲和力相比于参考抗体对TRBC2的亲和力可以增加至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1,000％、至少5,000％或至少10,000％。
本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的T28K突变。本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的Y32F突变。本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的A100N突变。
本发明的变体抗原结合结构域可以包含选自T28K、Y32F和A100N的VH结构域中的至少两个突变。至少两个突变可以是Y32F和A100N。在实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的突变Y32F和A100N并且还包含突变T28R。在实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的突变Y32F和A100N并且还包含突变G31R。
本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的突变T28K、Y32F和A100N。
在另一个实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的突变T28K、Y32F和A100N，并且还在选自VH结构域中的V2、Y27、G31、R98、Y102、N103和A107以及VL结构域中的N35和R55的位置处包含至少一个突变。本发明的变体抗原结合结构域可以在选自VH结构域中的V2、Y27、G31、R98、Y102、N103和A107以及VL结构域中的N35和R55的位置处包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个突变。
本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的突变T28K、Y32F和A100N，并且还可以包含VH结构域中V2位置处的突变、VH结构域中Y27位置处的突变、VH结构域中G31位置处的突变、VH结构域中R98位置处的突变、VH结构域中Y102位置处的突变、VH结构域中N103位处的突变、VH结构域中A107位置处的突变、VL结构域中N35位置处的突变和VL结构域中R55位置处的突变。
本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的突变T28K、Y32F和A100N，并且还包括至少一个选自以下的突变：
a)VH结构域中的：
-V2K、V2R，
-Y27F、Y27M、Y27N、Y27W，
-G31K、G31R、G31S，
-R98K，
-Y102F、Y102L，
-N103A、N103E、N103F、N103H、N103L、N103M、N103Q、N103S、N103W、N103Y，和
-A107S，
和
b)VL结构域中的：
-N35M、N35F、N35Y、N35K、N35R，和
-R55K。
本发明的变体抗原结合结构域可以选自包含以下突变组合的变体抗原结合结构域：
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27N，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27W，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的R55K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103H，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103A，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、R98K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103Q，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、V2R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、A107S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103E和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、V2K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103E，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103W和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103W和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F，和，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M和VL结构域中的N35R。
这些特定的组合突变已显示出以对TRBC2靶向有用的方式改变与TRBC2和TRBC1的结合(参见表1)。
表1：本发明的变体抗原结合结构域对TRBC2和TRBC1的亲和力。
Figure BDA0003046871960000171
Figure BDA0003046871960000181
Figure BDA0003046871960000191
N/A：未获得；与TRBC1的结合实际上为零，并且超出了设备的检测限。
在特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的T28K、Y32F和A100N突变。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和Y27N突变。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域可以包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和N103M突变。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变和VL结构域中的N35K突变。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和N103L突变。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M突变和VL结构域中的N35Y突变。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M突变和VL结构域中的N35R突变。
在另一个特定的实施方案中，本发明的变体抗原结合结构域包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M突变和VL结构域中的N35R突变。
特别有利的是，本发明的变体抗原结合结构域不仅显示出相对于参考抗体对TRBC2的亲和力增加，而且与参考抗体相比，其对TRBC1的亲和力降低。抗原特异性的这种改变将允许变体抗原结合结构域通过显示与TRBC2的优先结合来区分TRBC2和TRBC1。因此，在另一个实施方案中，与参考抗体相比，变体抗原结合结构域进一步显示出对TRBC1的亲和力降低。
本发明的变体抗原结合结构域相比于参考抗体对TRBC1的亲和力降低。变体抗原结合结构域对TRBC2的亲和力相比于参考抗体对TRBC1的亲和力可以增加至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1,000％、至少5,000％或至少10,000％。
本发明的变体抗原结合结构域对TRBC2和对TRBC1的亲和力的比率可以是至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少15、或至少20、或至少25、或至少50、或至少100、或至少500、或至少1,000或更大。
通过在实施例6中增加本发明的变体抗原结合结构域的亲和力，本发明人出人意料地发现，不仅本发明的变体抗原结合结构域对TRBC2的亲和力增加，而且其对TRBC1的低亲和力得以维持，因此，显著提高了本发明的变体抗原结合结构域对TRBC2的特异性。
可以使用具有形成寡聚体或多聚体的能力的结构域来增加本发明的变体抗原结合结构域对TRBC2的亲和力。因此，本发明的变体抗原结合结构域可以进一步包含寡聚化(oligomerisation)结构域。如本文所用，术语“寡聚化结构域”是指自缔合以形成寡聚体(如二聚体或三聚体)或多聚体的结构域。因此，如本文所用，术语寡聚化结构域也指多聚化结构域。寡聚化结构域是技术人员众所周知的，并且任何寡聚化结构域可与本发明的变体抗原结合结构域一起使用，只要所得的寡聚体维持或改善单体变体抗原结合结构域对TRBC2的亲和力即可。寡聚化结构域的实例包括但不限于Fc区、SEQ ID NO：18的COMP间隔区、或如以下本发明的嵌合抗原受体(CAR)的语境中所述的截短的COMP。
本发明还考虑了本发明的变体抗原结合结构域的不同形式，包括但不限于scFv、双抗体(diabody)、三聚体(trimerbody)、小抗体(minibody)、F(ab)和F(ab')2片段、以及完整抗体，即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。
因此，本发明的另一方面涉及包含本发明的变体抗原结合结构域的抗体，下文称为“本发明的抗体”。
3.嵌合抗原受体
在另一方面，本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，下文称为“本发明的CAR”，其包含本发明的变体抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内域。
在本发明第一方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的变体抗原结合结构域”，其特征和实施方案同样适用于本发明的此方面。
如本文所使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”或“嵌合T细胞受体”或“人工T细胞 受体”或“嵌合免疫受体”是指嵌合I型跨膜蛋白质，其将细胞外抗原识别结构域(结合物)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。结合物通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗原结合位点的其他形式。间隔区结构域通常是必要的以将结合物与膜分离并允许其呈合适的定向。使用的常见间隔区结构域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以满足，例如来自CD8α的茎部和甚至仅仅是IgG1铰链。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中并将间隔区连接至胞内域。
早期的CAR设计具有衍生自FcεR1或CD3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。结果，这些第一代受体传输免疫信号1，其足够触发T细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全活化T细胞以增殖和存活。为了克服这一限制，构建了复合胞内域：将T细胞共刺激分子的细胞内部分融合至CD3ζ的细胞内部分，产生了第二代受体，其能够在抗原识别后同时传输活化和共刺激信号。最通常使用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号，即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还已经描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如紧密相关的OX40和4-1BB，其传输存活信号。现在已经描述甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输活化、增殖和存活信号的胞内域。
当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输至上面有其表达的T细胞。因此CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引向表达靶向抗原的肿瘤细胞。
因此，CAR通常包含：(i)抗原结合结构域；(ii)间隔区；(iii)跨膜结构域；和(iii)细胞内结构域，其包含信号传导结构域或与信号传导结构域缔合(参见图4)。
CAR可具有以下一般结构：
抗原结合结构域-间隔区结构域-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域(胞内域)。
3.1.信号肽
本发明的CAR可以包含信号肽，使得当CAR在细胞如T细胞内表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后被引导至其得以表达的细胞表面。
信号肽的核心可以含有长段的疏水性氨基酸，其倾向于形成单个α螺旋。信号肽可以以短的带正电荷的氨基酸段开始，这有助于在移位过程中实施多肽的正确拓扑。在信号肽的末端，典型地存在一段由信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可在移位过程中或完成后切割，以生成游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特异性蛋白酶消化。
信号肽可以处于分子的氨基末端。
信号肽可包含SEQ ID NO：3至5或其具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入、取代或添加)的变体，条件是信号肽仍具有引起蛋白质的细胞表面表达的功能。
SEQ ID NO:3:MGTSLLCWMALCLLGADHADG
SEQ ID NO:3的信号肽是紧凑的且高效的。预计在末端甘氨酸后产生约95％的切割，从而通过信号肽酶有效去除。
SEQ ID NO:4:MSLPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:4的信号肽衍生自IgG1。
SEQ ID NO:5:MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
SEQ ID NO:5的信号肽衍生自CD8。
3.2.间隔区结构域
CAR包含间隔区序列以连接抗原结合结构域和跨膜结构域并在空间上将抗原结合结构域与胞内域分开。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原结合。
在本发明的CAR中，间隔区序列可以例如包含IgG1 Fc区、IgG1铰链或人CD8茎部或小鼠CD8茎部。或者，间隔区可以包含备选接头序列，其具有与IgG1 Fc区、IgG1铰链或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。间隔区可以包括卷曲螺旋结构域，例如如WO2016/151315中所述。
本发明的CAR可以包含选自如SEQ ID NO：6至10所示的序列或其具有至少80％序列同一性的变体的序列。
SEQ ID NO:6(人IgG1的铰链-CH2CH3)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
SEQ ID NO:7(人CD8茎部):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
SEQ ID NO:8(人IgG1铰链):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
SEQ ID NO:9(CD2胞外域)
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCP
EKGLD
SEQ ID NO:10(CD34胞外域)
SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT
SEQ ID NO:19(COMP)
DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG
可以在N末端截短COMP卷曲螺旋结构域并保留表面表达。因此，卷曲螺旋COMP间隔区可以包含或组成为在N末端被截短的SEQ ID NO:18的截短形式。截短的COMP可以包含SEQID NO:19的5个C末端氨基酸，即序列CDACG(SEQ ID NO:20)。截短的COMP可以包含5至44个氨基酸，例如至少5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。截短的COMP可以对应于SEQ ID NO:19的C末端。例如，包含20个氨基酸的截短的COMP可以包含序列QQVREITFLKNTVMECDACG(SEQID NO:21)。截短的COMP可以保留参与多聚化的半胱氨酸残基。截短的COMP可以保留形成多聚体的能力。
3.3.跨膜结构域
跨膜结构域是跨越膜的CAR的序列。
跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的α螺旋。任何跨膜蛋白的跨膜结构域可用于提供本发明的跨膜部分。蛋白质的跨膜结构域的存在和跨度可以由本领域技术人员使用TMHMM算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)确定。此外，考虑到蛋白质的跨膜结构域是相对简单的结构，即预测形成足够长的疏水α螺旋以跨越膜的多肽序列，也可以使用人工设计的TM结构域(US7052906 B1描述了合成的跨膜组分)。
跨膜结构域可以衍生自CD28、CD8a或TYRP-1，其提供良好的受体稳定性。
在一个实施方案中，跨膜结构域衍生自CD8a。
SEQ ID NO:11:CD8a跨膜结构域
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
在另一个实施方案中，跨膜结构域衍生自TYRP-1。
SEQ ID NO:12:TYRP-1跨膜结构域
IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI
3.4.胞内域
胞内域是CAR的信号传输部分。抗原识别后，受体簇、天然CD45和CD148从突触排出，并将信号传输至细胞。最常用的胞内域组分是包含3个ITAM的CD3ζ的胞内域组分。抗原结合后，其向T细胞传递激活信号。CD3ζ可能无法提供完全有效的激活信号，因此可能需要其他共刺激信号传导。共刺激结构域的实例包括来自CD28、OX40、4-1BB、CD27和ICOS的胞内域，它们可与CD3ζ一起使用以传递增殖/存活信号。
在一个实施方案中，至少一个共刺激胞内域与CD3ζ一起使用。在特定的实施方案中，共刺激胞内域选自CD28、OX40、4-1BB、CD27和ICOS的胞内域。
在另一个实施方案中，至少两个共刺激胞内域与CD3ζ一起使用。在特定的实施方案中，两个共刺激胞内域以任何组合和顺序选自CD28、OX40、4-1BB、CD27和ICOS的胞内域。特别合适的组合包括CD28和CD3ζ的胞内域，OX40和CD3ζ的胞内域，4-1BB和CD3ζ的胞内域，CD28、OX40和CD3ζ的胞内域，以及CD28、4-1BB和CD3ζ的胞内域。
具有活化的胞内域的CAR的跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域(胞内域)可以包含如SEQ ID NO:13至18所示的序列或其具有至少80％序列同一性的变体。
SEQ ID NO:13包含CD28跨膜结构域和CD3ζ胞内域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:14包含CD28跨膜结构域以及CD28和CD3ζ胞内域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:15包含CD28跨膜结构域以及CD28、OX40和CD3ζ胞内域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:16包含CD8a跨膜结构域和CD3ζ胞内域
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITRVLYCKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:17包含CD8a跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:18包含TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域
IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
变体序列可以与SEQ ID NO:13至18具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，条件是该序列提供有效的跨膜结构域和有效的细胞内T细胞信号传导结构域。
本发明的CAR可以包含选自如SEQ ID NO:25至36所示的序列的序列。
SEQ ID NO:25:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，VL结构域中的N35K突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGKTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:26:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:27:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYLFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:28:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M突变，VL结构域中的N35Y突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGYTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:29:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M突变，VL结构域中的N35R突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGFMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:30:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M突变，VL结构域中的N35R突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:31:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，CD8茎部间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:32:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，CD8茎部间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及CD28和CD3ζ胞内域的CAR
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGYNFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIIAIAVVGALLLVALIFGTASYLIRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:33:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及CD28和CD3ζ胞内域的CAR
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SEQ ID NO:34:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，VL结构域中的N35K突变，IgG1铰链间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及CD28和CD3ζ胞内域的CAR
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SEQ ID NO:35:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，VL结构域中的N35K突变，CD8茎部间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ胞内域的CAR
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SEQ ID NO:36:包含VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，VL结构域中的N35K突变，CD8茎部间隔区，TYRP-1跨膜结构域以及CD28和CD3ζ胞内域的CAR
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4.双特异性T细胞衔接物
基于具有两个抗体样结合结构域的基本概念，已经开发了各种各样的分子。
双特异性T细胞衔接分子是已经开发出的一类双特异性抗体型分子，主要用作抗癌药物。它们将宿主的免疫系统，更具体地将T细胞的细胞毒活性引导至针对靶细胞，例如癌细胞。在这些分子中，一个结合结构域经由CD3受体与T细胞结合，而另一个(经由肿瘤特异性分子)与靶细胞(例如肿瘤细胞)结合。由于双特异性分子同时结合靶细胞和T细胞两者，因此使靶细胞与T细胞接近，使得T细胞可以发挥其作用，例如对癌细胞的细胞毒性作用。T细胞:双特异性Ab:癌细胞复合物的形成在T细胞中诱导信号传导，导致例如细胞毒性介质的释放。理想地，试剂仅在存在靶细胞的情况下诱导期望的信号传导，从而导致选择性杀伤。
已经开发出多种不同形式的双特异性T细胞衔接分子，但最常见的一种是由不同抗体的两个串联排列的单链可变片段(scFv)组成的融合物。这些有时称为BiTE(双特异性T细胞衔接物)。
本发明还考虑了选择性识别TRBC2并且能够激活T细胞的双特异性分子。例如，该分子可以是BiTE。
因此，在另一方面，本发明提供了双特异性T细胞衔接物(BiTE)，下文称为“本发明 的BiTE”，其包含本发明的变体抗原结合结构域和T细胞激活结构域。
在本发明第一方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的变体抗原结合结构域”，其特征和实施方案同样适用于本发明的该方面。
如本文所用，术语“T细胞激活结构域”是指能够激活T细胞的第二结构域。T细胞激活结构域可以是与CD3特异性结合的scFv。适用于本发明目的的抗CD3 scFv的实例是本领域众所周知的，并且包括但不限于衍生自OKT3的scFv。
双特异性分子可以包含信号肽以帮助其产生。信号肽可以导致双特异性分子由宿主细胞分泌，使得可以从宿主细胞上清液收获双特异性分子。
信号肽可以处于分子的氨基末端。双特异性分子可以具有通式：信号肽-本发明的变体抗原结合结构域-T细胞激活结构域。
双特异性分子可以包含间隔区序列以将本发明的变体抗原结合结构域与T细胞激活结构域连接并且在空间上分开两个结构域。
间隔区序列可以例如包含IgG1铰链或CD8茎部。接头可以替代地包含具有与IgG1铰链或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔性质的替代接头序列。
5.核酸
在另一方面，本发明还提供了编码本发明的变体抗原结合结构域的核酸序列，以下称为“本发明的第一核酸”。
在另一方面，本发明还提供了编码本发明的抗体的核酸序列，以下称为“本发明的 第二核酸”。
在另一方面，本发明还提供了编码本发明的CAR的核酸序列，以下称为“本发明的 第三核酸”。
在另一方面，本发明还提供了编码本发明的BiTE的核酸序列，以下称为“本发明的 第四核酸”。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的变体抗原结合结构域”、“本发明的抗体”和“本发明的BiTE”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的这些方面。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解的是，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸取代，其不影响此处描述的多核苷酸编码的多肽序列，以反映多肽在其中表达的任何特定宿主生物体的密码子使用。
为了避免同源重组，本发明的核酸序列和构建体可以在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中包含替代密码子。
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3'和/或5'末端处添加吖啶或多聚赖氨酸链。为了如本文所述的用途的目的，应当理解可以通过本领域可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
与核苷酸序列有关的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括对序列的一个(或多个)核酸的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或添加。
6.载体
本发明还提供了载体，或载体的试剂盒，其包含本发明的一种或多种核酸序列。这样的载体可以用于将核酸序列引入到宿主细胞中，使得其表达本发明的变体抗原结合分子或抗体或CAR或BiTE。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的变体抗原结合结构域”、“本发明的抗体”和“本发明的BiTE”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的这些方面。
载体可以例如是质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。
载体可以能够转染或转导溶细胞性免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。
7.细胞
本发明的另一方面涉及细胞，下文称为“本发明的细胞”，其包含本发明的CAR。
细胞可以包含本发明的核酸或载体。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的CAR”、“本发明的核酸”、“本发明的载体”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的这些方面。
细胞可以是溶细胞性免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在，它们可以与其他淋巴细胞例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分。存在多种类型的T细胞，如下文总结的。
辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面表达CD4。当它们通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，TH细胞得以活化。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
溶细胞性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面处表达CD8。这些细胞通过与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类缔合的抗原结合而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，可以使CD8+细胞失活至无能力状态，这防止自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是在感染已经解决之后长期持续的抗原特异性T细胞的亚组。它们在再次暴露于其同源抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包含三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
以前称为抑制性T细胞的调节性T细胞(Treg细胞)对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫以朝向免疫反应的结束，和抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞。
已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞，即天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。
天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并且已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞两者之间的相互作用相关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其他T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以防止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间起源。
细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统的一部分。NK细胞以不依赖于MHC的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。
NK细胞(属于先天性淋巴样细胞的组)定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从生成B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那里它们进入循环。
本发明的细胞可以是上述任何细胞类型。在一个实施方案中，本发明的细胞是T细胞。在另一个实施方案中，本发明的细胞是NK细胞。
根据本发明该方面的细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体创建，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的环境中创建，或来自不相关供体的外周血(第三方)。
或者，根据本发明该方面的细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为溶细胞性细胞。或者，可以使用保留其裂解功能并且可以充当治疗剂的永生化溶细胞性细胞系，例如T或NK细胞。
在所有这些实施方案中，通过包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染的许多方式之一引入编码嵌合多肽的DNA或RNA来生成表达CAR细胞。
本发明的细胞可以是来自受试者的离体细胞。细胞可以来自外周血单个核细胞(PBMC)样品。细胞，特别是溶细胞性细胞，例如T或NK细胞可以在用编码提供本发明CAR的分子的核酸转导之前活化和/或扩增，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。
本发明的细胞可以通过以下方法制备，该方法包括用包含编码CAR的核酸序列的本发明的载体转导或转染细胞的步骤。
在转导或转染步骤之前，用于制备本发明细胞的方法可以进一步包括从来自受试者或上文列举的其他来源的含细胞样品分离细胞的步骤。在细胞是溶细胞性细胞的情况下，样品是来自受试者的含溶细胞性细胞的样品。
在本发明的上下文中使用的术语“受试者”或“个体”是指哺乳动物物种的成员，优选任何年龄或种族的雄性或雌性。
然后可以例如通过基于CAR的抗原结合结构域的表达进行选择来纯化本发明的细胞。
8.缀合物
本发明的变体抗原结合结构域或抗体可以是变体抗原结合结构域或抗体的缀合物，例如该缀合物可以是可检测的实体或化学治疗实体。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的变体抗原结合结构域”和“本发明的抗体”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的这些方面。
可检测的实体可以是荧光部分，例如荧光肽。如本文所用，术语“荧光肽”是指在激发后在可检测的波长下发射光的多肽。荧光蛋白的实例包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型GFP、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)和mCherry。
与可检测实体缀合的本发明的变体抗原结合结构域或抗体可以用于确定恶性T细胞的TRBC。
如本文所用，术语“化学治疗实体”是指对细胞具有破坏性的实体，即该实体降低细胞的活力。以下将所得的缀合物称为“本发明的化学治疗性缀合物”。化学治疗实体可以是细胞毒性药物。考虑的化学治疗实体包括但不限于烷基化剂，亚硝基脲，亚乙基亚胺/甲基三聚氰胺，烷基磺酸盐，抗代谢物，嘧啶类似物，表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)，酶如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，例如IFNα、IL-2、G-CSF和GM-CSF；铂配位配合物，例如顺铂和卡铂，蒽二酮，经取代的尿素如羟基脲，甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼，肾上腺皮质激素抑制剂，例如米托坦(o,p'-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，如泼尼松及其等效物，地塞米松和氨鲁米特；孕酮，如己酸羟孕酮，乙酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素，如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素，如氟他胺，促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；和非甾体类抗雄激素，如氟他胺。
与化学治疗实体缀合的本发明的变体抗原结合结构域或抗体使得能够将化学治疗实体靶向递送至表达TRBC2的细胞。
9.药物组合物
本发明还涉及包含本发明的细胞或多个细胞、或抗体、或BiTE或化学治疗性缀合物的药物组合物，以下称为“本发明的药物组合物”。
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是例如以适合用于静脉输注的形式。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的细胞”、“本发明的抗体”、“本发明的BiTE”和“本发明的化学治疗性缀合物”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的这些方面。
施用
可以使用使活性成分可生物利用的多种途径中的任一种来完成本发明的一个或多个细胞、或抗体、或BiTE或化学治疗性缀合物的施用。例如，可以通过口服和肠胃外途径、腹膜内、静脉内、皮下、经皮、肌肉内、经由局部递送例如通过导管或内支架(stent)施用试剂。
通常，医师将确定最适合单个受试者的实际剂量，并且该剂量将随特定患者的年龄、体重和反应而变化。剂量足以减少或消耗表达TRBC1或TRBC2的克隆T细胞的数目。
10.治疗方法
在另一方面，本发明提供了本发明的细胞、或抗体、或BiTE或化学治疗性缀合物，其用于药物中。
在另一方面，本发明提供了用于治疗受试者的T细胞淋巴瘤或白血病的方法，以下称为“本发明的治疗方法”，其包括向受试者施用本发明的细胞、或抗体、或BiTE、或化学治疗性缀合物的步骤，其中恶性T细胞表达TRBC2。施用步骤可以是如上所述的药物组合物的形式。
本发明的该方面可以备选地配制为本发明的细胞、或抗体、或BiTE、或化学治疗性缀合物，其用于治疗T细胞淋巴瘤或白血病，以下称为“用于本发明的细胞、抗体、BiTE、或化 学治疗性缀合物”，其中恶性T细胞表达TRBC2。
本发明的该方面可以备选地配制为本发明的细胞、或抗体、或BiTE、或化学治疗性缀合物在制备用于治疗T细胞淋巴瘤或白血病的药物中的用途，其中恶性T细胞表达TRBC2。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的细胞”、“本发明的抗体”、“本发明的BiTE”、“受试者”和“本发明的化学治疗性缀合物”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的这些方面。
治疗T细胞淋巴瘤和/或白血病的方法涉及本发明的细胞、抗体、BiTE或化学治疗剂缀合物的治疗用途。在本文中，可以将本发明的细胞、抗体、BiTE或化学治疗剂缀合物施用于患有T细胞淋巴瘤和/或白血病的现有疾病的受试者，以减轻、减少或改善与该疾病相关的至少一种症状和/或减慢、减少或阻止疾病的发展。
预防T细胞淋巴瘤和/或白血病的方法涉及本发明的细胞、抗体、BiTE或化学治疗剂缀合物的预防用途。在本文中，可以向尚未患有T细胞淋巴瘤和/或白血病和/或未表现出T细胞淋巴瘤和/或白血病的任何症状的受试者施用此类细胞、抗体、BiTE、或化学治疗性缀合物，以预防或削弱疾病的原因，或者减少或预防与疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可具有T细胞淋巴瘤和/或白血病的易感性，或被认为具有发展成T细胞淋巴瘤和/或白血病的风险。
所述方法可涉及以下步骤：
(i)分离含有细胞毒性细胞的样品；
(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染该细胞；和
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
含细胞毒性细胞的样品可以从受试者或例如如上所述的其他来源分离。细胞毒性细胞如T细胞或NK细胞可以从患者自己的外周血(第一方)分离，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的环境中分离，或从来自不相关供体的外周血(第三方)分离。
用于治疗T细胞淋巴瘤和/或白血病的方法涉及试剂的治疗用途。在本文中，可以将试剂施用于患有T细胞淋巴瘤和/或白血病的现有疾病的受试者，以减轻、减少或改善与该疾病相关的至少一种症状和/或减慢、减少或阻止疾病的发展。
这些治疗应用将包括施用治疗有效量的本发明的细胞、抗体、BiTE或化学治疗性缀合物。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指本发明的细胞、抗体、BiTE或化学治疗性缀合物实现明显预防、治愈、延缓、降低TRBC2阳性T细胞淋巴瘤和/或白血病的严重程度或改善TRBC2阳性T细胞淋巴瘤和/或白血病的一种或多种症状所需的量。
本发明的方法可以用于治疗与表达包含TRBC2的T细胞受体(TCR)的细胞的克隆扩增相关的任何淋巴瘤和/或白血病。因此，本发明涉及用于治疗涉及恶性T细胞的疾病的方法，所述恶性T细胞表达包含TRBC2的TCR。
本发明的方法可以用于治疗其中恶性T细胞表达包含TRBC2的TCR的T细胞淋巴瘤。“淋巴瘤”根据其标准含义在本文中使用，是指通常在淋巴结中发展但也可以影响脾、骨髓，血液和其他器官的癌症。淋巴瘤通常表现为淋巴样细胞的实体瘤。与淋巴瘤相关的主要症状是淋巴腺病变，尽管继发性(B)症状可以包括发烧、盗汗、体重减轻、食欲不振、疲劳、呼吸窘迫和发痒。
本发明的方法可以用于治疗其中恶性T细胞表达包含TRBC2的TCR的T细胞白血病。“白血病”根据其标准含义在本文中使用以指血液或骨髓的癌症。
以下是可以通过本发明的方法治疗的疾病的说明性、非详尽性列表。
外周T细胞淋巴瘤
外周T细胞淋巴瘤是相对罕见的淋巴瘤，并占所有非霍奇金淋巴瘤(NHL)的不到10％。然而，它们与侵略性临床过程有关，并且大多数T细胞淋巴瘤的病因和确切的细胞起源仍然没有明确定义。
淋巴瘤通常首先表现为颈部、腋下或腹股沟中肿胀。在其他淋巴结位于的地方如脾中可以发生另外的肿胀。通常，淋巴结肿大可以侵犯血管、神经或胃部的空间，从而分别导致肿胀的手臂和腿，导致麻刺感和麻木，或导致饱腹感。淋巴瘤症状还包括非特异性症状，例如发烧、发冷、无法解释的体重减轻、盗汗、嗜睡和发痒。
WHO分类利用形态学和免疫表型特征联合临床方面以及在一些情况下的遗传学来描述外周T细胞淋巴瘤的在预后和治疗上有意义的分类(Swerdlow et al.；WHOclassification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues.4th ed.；Lyon:IARC Press；2008)。赘生性T细胞的解剖学定位部分平行于它们提议的正常细胞对应物和功能，并因此T细胞淋巴瘤与淋巴结和外周血有关。这种方法允许更好地理解T细胞淋巴瘤的一些表现，包括它们的细胞分布、形态学的一些方面以及甚至是相关的临床发现。
T细胞淋巴瘤中最常见的是包含总体的25％的外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)，其次是血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)(18.5％)。
外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)
PTCL-NOS包含所有外周T细胞淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤的25％以上，并且是最常见的亚型。它是通过排除诊断来确定的，与当前WHO 2008中列出的任何特定成熟T细胞淋巴瘤实体均不对应。因此，它类似于弥漫性大B细胞淋巴瘤非特指型(DLBCL-NOS)。
大多数患者是成年人，其中中位年龄为60，男性与女性比为2:1。大多数病例起源于淋巴结，然而，结外呈现在约13％的患者中发生并且最常涉及皮肤和胃肠道。
细胞学谱非常广泛，范围从多态到单态。已经描述了三种形态学定义的变体，包括淋巴上皮样(Lennert)变体、T区变体和滤泡性变体。PTCL的淋巴上皮样变体含有丰富的背景上皮样组织细胞，并且通常对CD8呈阳性。它与更好的预后相关。PTCL-NOS的滤泡性变体正作为潜在的独特临床病理实体出现。
大部分PTCL-NOS具有成熟的T细胞表型，并且大多数情况是CD4阳性。75％的病例显示出至少一种全T细胞标志物(CD3、CD2、CD5或CD7)的可变损失，其中CD7和CD5最常下调。可以表达CD30并且很少表达CD15，其中CD15是不利的预后特征。CD56表达虽然不常见，但也具有负面预后影响。另外的不利病理预后因素包括基于KI-67表达的大于25％的增殖率，以及存在超过70％的转化细胞。这些淋巴瘤的免疫表型分析几乎未提供对其生物学的了解。血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)
AITL是系统性疾病，其特征在于涉及淋巴结、明显的高内皮微静脉(HEV)和滤泡树突状细胞(FDC)网格的血管外周扩张的多态性浸润。AITL被认为是衍生自滤泡辅助类型(TFH)的αβT细胞的重新T细胞淋巴瘤，通常在生发中心中发现。
AITL是外周T细胞淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤中第二最常见的实体，包含约18.5％的病例。它发生在中年至老年人之间，其中中位年龄为65岁，男性和女性的发病率大致相等。临床上，患者通常患有晚期疾病，伴有全身性淋巴腺病变、肝脾肿大和明显的体质症状。皮疹伴有瘙痒症通常存在。经常有多克隆高丙种球蛋白血症，与自身免疫现象有关。
AITL中描述了三种不同的形态学模式。AITL的早期病变(模式I)通常显示保存的结构及特征性的增生性滤泡。赘生性增殖局限于滤泡的周围。在模式II中，结的结构部分消除，其中保存了少量的退行滤泡。囊下窦得以保留并且甚至扩张。皮层旁含有树枝状HEV并且存在超过B细胞滤泡的FDC的增殖。赘生性细胞为小至中等大小，其中细胞学异型性极小。它们通常具有透明至淡白色的细胞质，并可以显示出明显的T细胞膜。多态炎性背景通常是明显的。
尽管AITL是T细胞恶性肿瘤，但存在B细胞和浆细胞的特征性扩张，这可能反映了赘生性细胞作为TFH细胞的功能。EBV阳性和EBV阴性B细胞两者均存在。偶尔，非典型B细胞在形态和免疫表型上可以类似于霍奇金/里德-斯特恩伯格样细胞，有时导致对该实体的诊断混乱。AITL中的B细胞增殖可以是广泛的，并且有些患者发展继发性EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，或者更少见地EBV阴性B细胞肿瘤，通常伴浆细胞分化。
AITL的赘生性CD4阳性T细胞显示CD10和CD279(PD-1)的强表达，并且呈CXCL13阳性。CXCL13经由粘附于HEV、B细胞活化、浆细胞分化和FDC网格的扩张导致增加B细胞募集到淋巴结，其所有有助于AITL的形态和临床特征。滤泡外周肿瘤细胞中强烈的PD-1表达特别有助于将AITL模式I与反应性滤泡和皮层旁增生区分开。
PTCL-NOS的滤泡性变体是另一个具有TFH表型的实体。与AITL相对比，它不具有显著的HEV或FDC网格的滤泡外扩张。赘生性细胞可以形成滤泡内聚集体，模仿B细胞滤泡性淋巴瘤，但也可以具有滤泡间生长模式或涉及扩大的套区(mantle zone)。在临床上，PTCL-NOS的滤泡性变体与AITL不同，因为患者更常出现早期疾病，伴部分淋巴结受累，并且可以缺少与AITL相关的体质症状。
间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)
ALCL可以细分为ALCL-“间变性淋巴瘤激酶”(ALK)+或ALCL-ALK-。
ALCL-ALK+是外周T细胞淋巴瘤内定义最明确的实体之一，具有带有马蹄形核并表达ALK和CD30的特征性的“标志细胞”。它占所有外周T细胞和NK细胞淋巴瘤的约7％，并在生命的前三十年中最常见。患者常表现为淋巴腺病变，但结外部位(皮肤、骨、软组织、肺、肝)的受累和B症状是常见的。
ALCL、ALK+显示很宽的形态谱，其中5种不同的模式得以描述，但是所有变体都含有一些标志细胞。标志细胞具有偏心的马蹄形或肾形核，以及显著的核周嗜酸性高尔基体区域。肿瘤细胞以内聚性模式生长，具有窦受累的偏好。较小的肿瘤细胞在小细胞变体中占优势，而在淋巴组织细胞变体中，丰富的组织细胞掩盖了肿瘤细胞的存在，其中许多是小的。
根据定义，所有病例均显示ALK和CD30阳性，其中在较小的肿瘤细胞中表达通常较弱。全T细胞标志物常丢失，其中75％的病例缺少CD3的表面表达。
ALK表达是特征性复发性遗传改变的结果，该改变由将染色体2p23上的ALK基因重排至许多伴侣基因之一组成，从而导致嵌合蛋白的表达。出现在75％的病例中的最常见的伴侣基因是染色体5q35上的核磷蛋白(NPM1)，导致t(2；5)(p23；q35)。ALK在不同易位变体中的细胞分布可以取决于伴侣基因。
ALCL-ALK-作为临时类别包括在2008WHO分类中。它定义为CD30阳性T细胞淋巴瘤，其在形态学上与ALCL-ALK+具有内聚性生长模式和标志细胞的存在不能区分开，但缺少ALK蛋白表达。
患者通常是年龄为40和65之间的成年人，这与ALCL-ALK+(在儿童和年轻人中更为常见)相反。ALCL-ALK-可以累及淋巴结和结外组织两者，尽管后者比ALCL-ALK+更少见。大多数ALCL-ALK-的病例表现出具有典型“标志”特征的内聚性赘生性细胞的片层淋巴结结构消除。与ALCL-ALK+相反，未识别出小细胞形态变异。
与其ALK+对应物不同，ALCL-ALK-显示出更多的表面T细胞标记物表达的保存，而细胞毒性标记物和上皮膜抗原(EMA)的表达可能性较小。在ALCL-ALK-和ALCL-ALK+中，基因表达特征和复发性染色体失衡是不同的，这证实了它们在分子和遗传水平上是不同的实体。
ALCL-ALK-在临床上不同于ALCL-ALK+和PTCL-NOS两者，其中这三个不同实体之间的预后差异显著。ALCL-ALK-的5年总生存率据报道为49％，其不及ALCL-ALK+(70％)，但同时显著优于PTCL-NOS(32％)。
肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)
EATL是侵略性肿瘤，其认为是衍生自肠的上皮内T细胞。EATL的两种在形态、免疫组织化学和遗传上不同的类型在2008WHO分类中得以识别：I型(代表EATL的大部分)和II型(包含10–20％的病例)。
I型EATL通常与明显的或临床上沉默的对麸质敏感的肠病变有关，并且由于该群体乳糜泻的高流行性，因此在北欧患者中更常见。
EATL的病变最常见于空肠或回肠(90％的病例)，很少见于十二指肠、结肠、胃或胃肠道以外的区域。肠病变通常是多灶性伴粘膜溃疡。EATL的临床过程是侵略性的，其中大多数患者在1年内死于疾病或疾病的并发症。
I型EATL的细胞学谱很广，并且一些情况下可以含有间变性细胞。存在多态性炎性背景，其在一些情况下可以掩盖赘生性组分。邻近肿瘤的区域中肠粘膜常表现出乳糜泻的特征，伴绒毛变钝和上皮内淋巴细胞(IEL)的数目增加，这可能代表病变的前体细胞。
通过免疫组织化学，赘生性细胞通常是CD3+CD4-CD8-CD7+CD5-CD56-βF1+，并含有细胞毒性颗粒相关蛋白(TIA-1、颗粒酶B、穿孔素)。CD30在几乎所有情况下均部分表达。CD103是粘膜归巢受体，可以在EATL中表达。
II型EATL，也称为单态CD56+肠T细胞淋巴瘤，定义为由表达CD8和CD56两者的小至中等大小的单态T细胞组成的肠肿瘤。粘膜内常有肿瘤的横向扩散，并且不存在炎性背景。大多数病例表达γδTCR，但是也存在与αβTCR相关的病例。
II型EATL的分布比I型EATL更为广泛，并且经常出现在其中乳糜泻罕见的亚洲人或西班牙裔群体中。在欧洲人血统EATL的个体中，II代表约20％的肠T细胞淋巴瘤，其中至少在一定亚组的病例中有乳糜泻的病史。临床过程是侵略性的。
肝脾T细胞淋巴瘤(HSTL)
HSTL是侵略性系统性赘生物，通常衍生自先天免疫系统的γδ细胞毒性T细胞，然而在极少数情况下，它也可能衍生自αβT细胞。它是最罕见的T细胞淋巴瘤之一，通常影响以男性为主的青少年和年轻人(中位年龄为35岁)。
结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型
结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型是侵略性疾病，通常具有破坏性的中线病变和坏死。大多数病例是NK细胞衍生的，但一些病例衍生自细胞毒性T细胞。它普遍与Epstein-Barr病毒(EBV)相关。
皮肤T细胞淋巴瘤
本发明的方法还可以用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤。
皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的特征是恶性T细胞向皮肤的迁移，其导致各种病变出现。这些病变随着疾病的发展而改变形状，通常从出现皮疹开始，并最终形成斑块和肿瘤，然后转移到身体的其他部位。
皮肤T细胞淋巴瘤包括以下说明性、非详尽性列表中提到的那些；蕈样真菌病(mycosis fungoide)、帕哲样网状细胞增生症(pagetoid reticulosis)、Sézary综合征、肉芽肿性皮肤松弛症、淋巴瘤样丘疹、慢性苔藓样糠疹(pityriasis lichenoideschronica)、CD30+皮肤T细胞淋巴瘤、继发性皮肤CD30+大细胞淋巴瘤、非蕈样真菌病CD30-皮肤大T细胞淋巴瘤、多形性T细胞淋巴瘤、Lennert淋巴瘤、皮下T细胞淋巴瘤和血管中心性淋巴瘤。
CTCL的体征和症状根据具体疾病而异，其中两种最常见的类型是蕈样真菌病和Sézary综合征。经典的蕈样真菌病分为三个阶段：
-斑片(patch)(萎缩性或非萎缩性)：非特异性皮炎、下躯干和臀部上的斑片；最小/无瘙痒症；
-斑块(plaque)：严重瘙痒性斑块，淋巴腺病变；和
-肿瘤：容易溃疡
Sézary综合征由红皮病和白血病定义。体征和症状包括皮肤水肿、淋巴腺病变、手掌和/或足底角化过度、脱发、指甲营养不良、外翻和肝脾肿大。
在所有原发性皮肤淋巴瘤中，65％是T细胞型的。最常见的免疫表型是CD4阳性。这些疾病没有共同的病理生理学，因为术语皮肤T细胞淋巴瘤涵盖多种病症。
皮肤T细胞淋巴瘤(即蕈样真菌病)的发展的主要病因机制尚未阐明。蕈样真菌病可能在T细胞介导的慢性炎性皮肤病之前，其偶尔可以发展为致命性淋巴瘤。
原发性皮肤ALCL(C-ALCL)
在形态上，C-ALCL与ALC-ALK-通常是无法区分的。它定义为具有间变性、多形或免疫母细胞性形态的大细胞的皮肤肿瘤，其中超过75％的细胞表达CD30。C-ALCL连同淋巴瘤样丘疹(LyP)属于原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴组织增生性病症的谱，其作为组包含继蕈样真菌病后第二最常见的皮肤T细胞淋巴组织增生症的组。
免疫组织化学染色概况与ALCL-ALK-非常相似，其中较大部分情况下细胞毒性标记物染色呈阳性。至少75％的肿瘤细胞应对CD30呈阳性。CD15也可以表达，并当淋巴结受累发生时，与经典霍奇金淋巴瘤可以难以区分。少见的ALCL-ALK+的病例可能表现为局部皮肤病变，并且可能类似于C-ALCL。
T细胞急性淋巴母细胞性白血病
T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)分别占儿科和成人群体中ALL的约15％和25％。患者通常具有高的白细胞计数，并可能表现为器官肿大，尤其是纵隔扩大和CNS受累。
本发明的方法可以用于治疗与表达包含TRBC的TCR的恶性T细胞相关的T-ALL。
T细胞幼淋巴细胞性白血病
T细胞幼淋巴细胞性白血病(T-PLL)是成熟的T细胞白血病，具有侵略性行为并偏好血液、骨髓、淋巴结、肝、脾和皮肤受累。T-PLL主要影响30岁以上的成年人。其他名称包括T细胞慢性淋巴细胞性白血病，“多节(knobby)”型T细胞白血病和T幼淋巴细胞性白血病/T细胞淋巴细胞性白血病。
在外周血中，T-PLL由具有单个核仁的中等大小的淋巴细胞和偶有气泡或突起的嗜碱性细胞质组成。细胞核通常为圆形至椭圆形，其中偶尔患者具有更不规则的核轮廓的细胞，类似于Sézary综合征中所见的脑形核形状。小细胞变体包含所有T-PLL病例的20％，而Sézary细胞杨(脑形)变体见于5％的病例中。
T-PLL具有成熟(胸腺后)T淋巴细胞的免疫表型，并且赘生性细胞通常对全T抗原CD2、CD3和CD7呈阳性，而对TdT和CD1a呈阴性。60％的病例中存在免疫表型CD4+/CD8-，25％中存在CD4+/CD8+免疫表型，而15％的病例中存在CD4-/CD8+免疫表型。
待治疗或预防的T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
治疗方法可包括施用治疗量的本发明的细胞或多个细胞、或抗体、或BiTE或化学治疗性缀合物的步骤。技术人员将能够通过常规方法确定能够对患者发挥治疗作用的本发明的细胞或多个细胞、或抗体、或BiTE或化学治疗性缀合物的量。
11.诊断剂
先前已经确定，来自健康供体的TRBC1+与TRBC2+T细胞的比例分别为35％和65％，即表达TRBC1的T细胞总数的中位数百分比为35％(范围为25-47％)(Maciocia et al.,2017,Nat Med 23:1416-23)。由于T细胞淋巴瘤或白血病是克隆性癌症(Maciocia et al.,2017；如上)，因此以T细胞淋巴瘤或白血病为特征的恶性T细胞增殖失调将导致TRBC1+或TRBC2+T细胞(即TRBC2-或TRBC1-T细胞)的比例严重倾斜。因此，通过特异性结合TRBC2并因此能够区分TRBC1和TRBC2，本发明的变体抗原结合结构域和抗体构成了用于诊断T细胞淋巴瘤或白血病的有用试剂。
因此，在另一方面，本发明提供了诊断剂，下文称为“本发明的第一诊断剂”，其包含本发明的变体抗原结合结构域。
在另一方面，本发明提供了诊断剂，下文称为“本发明的第二诊断剂”，其包含本发明的变抗体。在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的变体抗原结合结构域”和“本发明的抗体”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的这些方面。
用于这些测定中的本发明的变体抗原结合结构域或抗体可以是标记的或未标记的。本文所使用的术语“可检测标记”或“标记剂”是指分子标记，其允许使用用于检测的合适程序和设备(例如通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法)来检测、定位和/或鉴别其所连接的分子。适于标记抗体的标记剂包括放射性核素、酶、荧光团、化学发光剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、粒子、染料和衍生物等。如本领域技术人员将理解的，未标记的变体抗原结合结构域和抗体需要用附加试剂，例如，标记的二抗来检测。这对于提高检测方法的灵敏度特别有用，因为它允许信号被放大。存在多种可用于本发明中的常规测定，其使用未标记的本发明抗体(一抗)和标记的本发明的抗体(二抗)；这些技术包括蛋白质印迹或免疫印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、竞争性EIA(竞争性酶免疫测定)、DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术，基于使用包括本发明抗体的蛋白质微球、生物芯片或微阵列的流式细胞术或多重检测技术。使用本发明的变体抗原结合结构域或抗体检测和定量TRBC2的其他方法包括亲和层析技术或配体结合测定。
诊断剂可用于诊断T细胞淋巴瘤或白血病。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
12.诊断方法
在另一方面，本发明提供了用于诊断受试者的T细胞淋巴瘤或白血病的方法，以下称为“本发明的诊断方法”，其包括使本发明的变体抗原结合结构域或抗体与来自受试者的包含T细胞的样品接触的步骤。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的变体抗原结合结构域”、“本发明的抗体”和“受试者”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的该方面。
本发明的诊断方法还可包括确定样品中TRBC2阳性T细胞的百分比的步骤。
为了将本发明的第一方法付诸实践，从待研究的受试者获得包含T细胞的样品，例如生物样品。如本文所用，术语“样品”或“生物样品”包括不同类型的包含T细胞的受影响器官的生物流体或组织切片。可用于本发明的诊断方法中的样品的说明性非限制性实例包括包含T细胞的不同类型的生物流体，例如血液，淋巴液和脊髓液。这些生物流体样品可以通过技术人员已知的任何常规方法获得。备选地，所述样品也可以是例如来自淋巴腺、脾、扁桃体或胸腺的受影响器官组织样品的切片，其可以通过任何常规方法获得，例如可以通过活检或手术切除来获得，以及来自用于组织学目的的冷冻切片。
根据本发明的诊断方法的第一步，在本领域技术人员已知的合适条件下，使本发明的变体抗原结合结构域或抗体与来自所研究受试者的样品接触。
本领域技术人员可以使用许多常规方法来检测样品中的TRBC2，这些方法适合于进行本发明的诊断方法的第二步。特别有用的是免疫方法。因此，本发明的第一或第二诊断剂的使用对于执行根据本发明的诊断方法可以是特别有用的。先前已经限定了本发明的诊断剂的特征和特定实施方案，其同样适用于本发明的诊断方法。
在本发明的诊断方法中，样品中TRBC2阳性T细胞的70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％或更高的百分比可以指示T细胞淋巴瘤或白血病的存在。
如本领域技术人员将理解的，该预测尽管优选地但不需要对于100％的待诊断或评估的受试者是正确的。但是，该术语要求可以将受试者的统计学上显著的部分鉴别为具有给定结果的可能性增加。本领域技术人员可以使用各种众所周知的统计评估工具不费力地确定从受试者获得的数据是否是统计学上显著的，例如，使用置信区间的确定、p值确定、交叉验证的分类率等。详细信息参见Dowdy and Wearden,Statistics for Research,JohnWiley&Sons,New York 1983。优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。p值优选为0.01或0.005或更小。
另外，考虑到本发明的变体抗原结合结构域或抗体特异性结合TRBC2阳性T细胞的能力，它们也可以用于体内诊断T细胞淋巴瘤或白血病。例如，它们可以用于医学成像，即，用于创建身体(或其部分和功能)如人体的图像的一组技术和方法，以用于临床目的，例如寻求揭示、诊断或检查疾病的医学程序。
为此，本发明的变体抗原结合结构域或抗体通过本领域已知的合适方法进行标记，并且例如通过偶联和/或负载适当的分子如放射性同位素或荧光染料而作为用于诊断性成像方法的试剂提供，该诊断性成像方法例如为放射免疫诊断、正电子发射断层扫描(PET)、内窥镜检查免疫荧光方法等。本发明的变体抗原结合结构域和抗体可以与发射γ的同位素偶联，并用于使用γ相机的放射免疫闪烁扫描术或单光子发射计算机断层扫描术中。本发明的变体抗原结合结构域和抗体可以与正电子发射体偶联并用于PET中。本发明的变体抗原结合结构域和抗体可以与荧光染料例如Cy3、Cy2、Cy5或FITC偶联，并用于内窥镜免疫荧光方法中。通过任何合适的途径如静脉内、以适合个体的剂量施用如所述进行修饰的本发明的变体抗原结合结构域和抗体，并通过本领域众所周知的方法检测、确定或测量TRBC2阳性T细胞的位置。包括诊断性成像在内的本文所用的方法和技术是本领域技术人员已知的，本领域技术人员还可以提供合适剂量的制剂。
待诊断的T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
样品可以是血液样品或可以衍生自血液样品。
13.个性化医疗的方法
在另一方面，本发明提供了用于鉴别受试者具有适合用本发明的细胞、抗体、BiTE、或缀合物治疗的T细胞淋巴瘤或白血病的方法，下文称为“本发明的个性化医疗的第 一方法”，其包括确定来自受试者的包含T细胞的样品中TRBC2阳性T细胞的百分比。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的细胞”、“本发明的抗体”、“本发明的BiTE”“本发明的化学治疗剂”、“受试者”和“包含T细胞的样品”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的该方面。
在本发明的个性化医疗的第一方法中，如果样品中TRBC2阳性T细胞的百分比为70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或更高，则受试者适合用本发明的细胞、抗体、BiTE或化学治疗性缀合物进行所述治疗。
在另一方面，本发明提供了用于选择包含本发明的细胞、抗体、BiTE、或化学治疗性缀合物的疗法来治疗受试者的方法，下文称为“本发明的个性化医疗的第二方法”，其包括确定来自受试者的包含T细胞的样品中TRBC2阳性T细胞的百分比。
在本发明先前方面的上下文中已经详细描述了术语“本发明的细胞”、“本发明的抗体”、“本发明的BiTE”“本发明的化学治疗剂”、“受试者”和“包含T细胞的样品”，它们的特征和实施方案同样适用于本发明的该方面。
在本发明的个性化医疗的第二方法中，如果样品中TRBC2阳性T细胞的百分比为70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％、或更高，则选择包含本发明的细胞、抗体、BiTE或化学治疗性缀合物的疗法来治疗所述受试者。
样品可以是血液样品或可以衍生自血液样品。
T细胞淋巴瘤或白血病可以选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
现在将通过实施例的方式进一步描述本发明，所述实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，而无意于以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：通过表面等离振子共振(SPR)分析抗TRBC2抗体的结合
TRBC1特异性单克隆抗体hJovi-1的晶体结构以TRBC1-TCR的复合物被解析至
Figure BDA0003046871960000501
(图3)。通过计算生物学和蛋白质工程，合理设计了抗TRBC1结合物的几种突变形式，以将特异性从TRBC1转换至TRBC2。以IgG形式产生了许多抗TRBC2结合物。表1显示了hJovi-1的VH和VL结构域中包括的突变的细节。
使用Biacore T200仪器，通过胺偶联将S系列CM5传感器芯片与抗人Fc捕获抗体固定化，密度达到9000-10000RU。在所有实验条件下，将HBS-P+缓冲液用作运行缓冲液。将测试的抗TRBC2抗体(表1)捕获在流通池2、3和4中，密度为100-300RU。将已知浓度的重组纯化的TRBC1或TRBC2用作“分析物”，并以150s的接触时间和300s的解离时间以30μl/min的流速注入各个流通池中。在每个实验中，流通池1未经修饰，并用于参考减除。单独缓冲液的“0浓度”传感图用作双重参考减除以考虑漂移的影响。将数据拟合至1:1Langmuir结合模型。由于使用了捕获系统，因此在每种情况下都使用局部Rmax参数进行数据拟合。
表1显示了每种抗TRBC2抗体所获得的对TRBC1和TRBC2的亲和力的结果。测试的抗TRBC2抗体通常在nM范围内显示出与TRBC2的优先结合，且具有不同的ka和kd动力学特性。在绝大多数情况下，与TRBC1的结合被评估为>1μM，其值接近仪器的灵敏度极限。
实施例2：基于KFN结合物产生抗TRBC2 CAR
基于抗TRBC2三重突变体(hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，SEQ IDNO:26)和人源化Jovi-1(hJovi-1)产生了第二代CAR构建体(图4)。将这些CAR构建体克隆到逆转录病毒载体中，并用于转导从健康供体获得的活化PBMC。
实施例3：抗TRBC2CAR的功能性表征：细胞因子产生
为了评估抗TRBC2三重突变体CAR-T细胞对TRBC2的功能能力，使用了板结合测定，其中在添加CAR-T细胞之前固定化TRBC1或TRBC2。72小时后，收集培养上清液，并通过ELISA测量IFN-γ的产生。在图5A中，与TRBC1相比，在TRBC2配体存在下，抗TRBC2三重突变体CAR-T细胞显示出更多的IFN-γ释放。相比之下，hJovi-1 CAR-T细胞仅在与TRBC1配体一起培养时才显示高IFN-γ产生(图5B)。这些结果表明，用抗TRBC2三重突变体转导的CAR-T细胞具有更高的针对TRBC2的活化和细胞因子释放，但当暴露于TRBC1时则没有。
实施例4：抗TRBC2 CAR的功能性表征：细胞毒性测定
为了确定抗TRBC2三重突变体靶向TRBC2的能力，使用被转导以表达TRBC1或TRBC2的Raji细胞作为靶细胞并与CAR-T细胞共培养来建立细胞毒性测定。将hJovi-1 CAR-T细胞或抗TRBC2三重突变CAR-T细胞与Raji WT、Raji TRBC1+或Raji TRBC2+细胞以1:1(E:T)的比例一起培养。培养后72小时通过流式细胞术测量靶细胞的恢复，并用于建立CAR-T细胞的细胞毒性能力。含有抗TRBC2三重突变CAR-T细胞的培养物显示出Raji TRBC2+靶细胞的有限存活率(图6)。相比之下，抗TRBC2三重突变CAR-T细胞没有清除Raji TRBC1+靶细胞，这表明了它们增强的靶向TRBC2+细胞的能力。
我们使用工程化单克隆抗体来生成第二代抗TRBC2 CAR。我们证明了我们的抗TRBC2 CAR在72小时共培养中针对TRBC2+细胞系显示出特异性、细胞因子释放和细胞毒性，但对TRBC1+细胞系或表面不表达TCR的细胞系不显示。抗TRBC2 CAR T细胞在长期共培养测定中也显示出增殖能力。
实施例5：抗TRBC2 CAR的功能性表征：杀伤测定
基于具有以下突变的表1中的抗TRBC2结合物产生了另外的第二代CAR构建体：
-hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变和VL结构域中的N35K(称为N35K，SEQ ID NO:25)，
-hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L突变(称为N103L，SEQ ID NO:27)，
-hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M突变和VL结构域中的N35Y(称为N103M-N35Y，SEQ ID NO:28)，
-hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M突变和VL结构域中的N35R(称为Y102F-N103M-N35R，SEQ ID NO:29)，
-hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M突变和VL结构域中的N35R(称为Y102L-N103M-N35R，SEQ ID NO:30)。
将这些CAR构建体和抗TRBC2三重突变体(hJovi-1的VH结构域中的T28K、Y32F、A100N突变，称为KFN，SEQ ID NO:26)克隆到逆转录病毒载体中，并用于转导(a)Jurkat细胞或(b)从健康供体获得的活化的PBMC。在使用活化的PBMC的杀伤测定中，抗TRBC1对照CAR(即hJovi-1 CAR)构建体用作对照。
a)Jurkat细胞
为了评估所产生的结合物是否对TRBC2抗原具有特异性，用上述抗TRBC2 CAR构建体转导TRBC1+的Jurkat细胞。使用被转导以仅表达TRBC1或TRBC2的HPB-ALL细胞(分别称为HPB TRBC1和HPB TRBC2)作为靶细胞，以1:1的效应细胞与靶标(E:T)比例建立转导的Jurkat细胞的共培养，其中以具有敲除的TCR的HPB-ALL细胞(称为HPB KO)作为阴性对照。将转导的Jurkat细胞分别单独铺板或与αCD3/αCD28抗体一起铺板，分别用作阴性或阳性测定对照的。24小时后通过流式细胞术经由CD69染色来评估抗原特异性激活。
图7中显示的结果表明，与HPB TRBC2细胞共孵育后，所有转导的Jurkat细胞均被选择性激活。这些结果表明，所有测试的CAR均显示出对TRBC2靶标的特异性，因为当Jurkat与TRBC1+或HPB KO靶标共培养时未观察到CD69上调。
b)PBMC
首先，在用10ug/ml仅与TRBC1结合的生物素化鼠JOVI-1抗体染色后，使用磁性抗生物素包被的磁珠将PBMC分为TRBC1+和TRBC2+细胞。用hJovi-1CAR(JOVI)转导TRBC2+群体，并用上述抗TRBC2 CAR转导TRBC1+群体。这种差异转导确保仅在受控培养条件下添加靶标时(例如效应细胞与靶标的比例和时间点)而不是在对每个PBMC供体的条件不同的混合群体中才触发抗原激活和靶标杀伤。
其次，使用被转导以仅表达TRBC1或TRBC2的HPB-ALL细胞(分别称为TRBC1+HPB-ALL和TRBC2+HPB-ALL)作为靶细胞建立杀伤试验，其中具有敲除的TCR(称为HPB-KO)的HPB-ALL细胞作为对照。转导后10天，将细胞以1:2的E:T比例共培养。在测定建立后72小时，通过流式细胞术评估细胞杀伤。
结果表明，hJovi-1 CAR-T细胞仅杀伤TRBC1+HPB-ALL细胞，而所有抗TRBC2 CAR-T细胞仅杀伤TRBC2+HPB-ALL细胞(图8)。对HPB-KO对照细胞上的所有TRBC1和TRBC2特异性CAR-T细胞，观察到相似的背景杀伤水平，这表明所有测试的CAR对其同源抗原均具有特异性。
实施例6：通过表面等离振子共振(SPR)分析不同抗体形式对抗TRBC2抗体结合的 影响
通过SPR分析了抗TRBC2结合物中的多聚化作用。为此，以三种不同形式，即scFv(SEQ ID NO：22)、scFv-Fc(SEQ ID NO：23)和scFv-COMP(SEQ ID NO：24)抗体形式使用了在hJovi-1抗体的VH结构域中具有T28K、Y32F、A100N、Y102L和N103M突变以及在VL结构域中具有N35R突变的抗TRBC2。
SEQ ID NO:22
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO:23
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSDPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO:24
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTGFVMHWVRQAPGQGLEWMGFINPYNDDIQSNERFRGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGNGLMFDGAYRFFDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQRLVHSNGRTYLHWYLQKPGQSPRLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPYTFGQGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSAGSDLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACGSGKKDPKSGGGGSYPYDVPDYA
为了测试抗TRBC2 scFv的1:1结合相互作用，使用Biacore T200仪器通过胺偶联将S系列CM5传感器芯片与抗人Fc捕获抗体固定化，密度为9000-10000RU。在所有实验条件下，将HBS-P+缓冲液用作运行缓冲液。将测试的抗TRBC2抗体捕获在流通池4上至200-250RU的密度。将已知浓度的重组纯化的TRBC1或TRBC2用作“分析物”，并以150s的接触时间和300s的解离时间以30μl/min的流速注入各个流通池中。流通池1未经修饰，并用于参考减除。单独缓冲液的“0浓度”传感图用作双重参考减除以考虑漂移的影响。将数据拟合至1:1Langmuir结合模型。由于使用了捕获系统，因此在每种情况下都使用局部Rmax参数进行数据拟合。确定解离速率，并根据以下公式计算半衰期：t1/2＝ln2/kd。
图9A中显示的结果表明，该抗TRBC2 scFv结合物的半衰期为8s。该结合物的结合亲和力示于表1中。
为了测试scFv-Fc和scFv-COMP抗体形式的多价相互作用，将S系列CAP芯片与生物素捕获试剂固定化至2500-5000RU。在独立的实验周期中，将可溶性重组生物素化TRBC1和TRBC2捕获在流通池3上，密度为90-110RU。将纯化的抗TRBC2 scFv-Fc或scFv-COMP抗体以150s的接触时间和300s的解离时间以30μl/分钟的流速注入流通池中。在流通池1上，生物素化的蛋白被省略，并用于参考减除。单独缓冲液的“0浓度”传感图用作双重参考减除以考虑漂移的影响。将数据拟合至1:1Langmuir结合模型。由于使用了捕获系统，因此在每种情况下使用局部Rmax参数进行数据拟合。确定解离速率，并根据以下公式计算半衰期：t1/2＝ln2/kd。
图9B和9C所示的结果表明，scFv-Fc和scFv-COMP抗体形式的半衰期分别为16.2s和7.3min。
因此，这些结果证明，多聚化改善了低亲和力/高特异性TRBC2抗体的结合。
本申请要求2018年10月31日提交的英国申请号1817822.8的权益。该申请通过引用整体并入本文。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的是描述的用于实施本发明的方式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 英美烟草（投资）有限公司
<120> 方法
<130> P115516
<150> GB1817971.3
<151> 2018-11-02
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10864
<212> DNA
<213> 烟草
<400> 1
attcatcacc taaattttgc caaagctaag aatattaagc aaagcaaaaa aaaaagggga 60
atgtaattag cacgcaaaaa aagcagatcg aagataagca gatccacgtc aacttgactg 120
tgccaattaa aatcccacct ttaccccgag tcaaaaaagg gttatacaat acatacatac 180
atgattcatt tcatgtaccc acccccccca cacacagaga gagggaaaaa cgatatgacc 240
aatgggaatg aaaccttcct caaaaccact ccccccaccg ccatttgttt cttaataatt 300
cttctcagtt ttctttcaca aattaaacat gcatctttga tataaagtag aatttgaatt 360
ctgtaatttt ccatctccat aacgaagatt cactttacgt aaactgcacc gcggccatta 420
tttttcattc cggaggaatt taagactagt gagagaggtg aaatggcgat agaggataac 480
gagagttgtg ggagtagagt ggtggattcg gcgactacca gtggtcgtca tcagagaaaa 540
aaattggagg tctacaatga ggttttacgg aggcttaagg aatcaaacaa cgtcgaggct 600
ttagaacctg gatttgacga tgaactttgg gctcacttca atcgtctacc tactcggtaa 660
ctttaccttt ctacctctct ctatgtatta atccgtacaa ttatatacgt tttatgcggt 720
tttctataga cgataatata tgactactga catatgatct caaatgtacc gttgtcgttc 780
gcatttgttg tgcctttggg agattggatt atttttggtc gacagtttca atcttcttat 840
caagttagaa gtcgataatg ccagttatcg tttccagctt cctcttctgg tcttaaattt 900
ttaggtttta cttgccgaaa agtttgctat cttagcttgt taaaatttcg atgaaccagt 960
tgaatttgct aagcagttca catttgtgca gatgtattaa tgtgcgtgtt ttagatgcac 1020
gacgttgcga aacgctgaat actttttttt tttggagaag tgcatactta tgtgccgcca 1080
aaattgattg atcaataaac gaatacctta tttttgcatt taaggtacgc aatagatgtg 1140
aatgtcgaaa gggcagaaga tgtactcaca cacaagcgat tgctacatct tgcacatgtt 1200
ccagctaata gacctgcctt tgatgtccgg ttggtgcagg taattaaact actcttgcaa 1260
gataacacct tttagttgct ttgctcttga tatcgcatac atttaaatca agcatgcctt 1320
tttctggagt taaggaggat attttagatg ttcgttcact ctgactagct agttcaatag 1380
accaacacat ctccgtgtaa tcttggtcct ttgtattttt tgtttattgt tgcttgtcca 1440
gtacctaatt attcccagta tatgctagtt atggattgaa tcaaacttgg cattgtgcag 1500
gttgcttcgg ttcctgatgg aaacttaaga gattcttttc attcgagctt tgcaaagaag 1560
gaagttagca gaaggtatca ccttcgtgac attctacctg aaaacgattt cccataggac 1620
gctgtatttc tttggttact tagtgattca ttgaagcctt tttctgttgt ttaatataat 1680
cttgaattct tacttgtcat tgactgtgct aaataaccgc ttccattttg atacatagtg 1740
tccatcctcc acctgccttt ggttcttctc ctaatctcga agcccttgct tgtgaagcaa 1800
tcaaatctga agttcaagac gaagatactg ctgctccttg tgcaaatttt tcgcggtata 1860
gaattttttt tctttttgtg cattccgctt cgacgagtat atattatgaa gcataaaatt 1920
gtaaataatt ttgcaggccc atgcatgaaa ttacattttc aacagatgac aagccaaagc 1980
ttcttagcca ggtaattgat gtgcttattt attcaataca ctatctgctt gatagaaatg 2040
tactctatct gttggcagag gtgggatgtg gtaagctttt tatttgacat tgaaaaaatg 2100
tccatttatt attgaaacca attgttgacc catgaacatg tataatattt aattctttat 2160
gtagaaatgt aattcaggga ccttgatgta tgaagggctg aggcttttgt ctgttccttt 2220
gtttcatgaa agaacacaac tctcatcttg ctgcagattt caaaatgatg catgatttgg 2280
aatgtgcaag taaaacagac ataattgtat ttggtgacac caaaattgat aaatattgcc 2340
tgcctacttg gcattgtgat gcagtgagaa aggattgtgt attgcaagaa aagaagtagt 2400
tctttatatc agtttatatc tcatgataag gaaatctgag acaataatga acctttgaat 2460
atgacagtta acttcattac tagctgagct tgggctgaac atccaggaag cgcatgcctt 2520
ttccactgtg gatggctact ccctagatgt ctttgttgtt gatggttggc cctatgaggt 2580
acatctctga cgttatatcc tcactttgat ctgggttcgc ttaggtgcct gttatatttt 2640
gtgacctaac atcaagaagt gacagataat gtatgcatgg tttaaagttc tgtattatgg 2700
tcgctttcag ctcaactaaa aattgagtaa ccacttttaa actatgtaaa gtttatgaga 2760
atttcatcaa attatttagg ctacataatt taaaaggaat ttgataattc tgattaaaaa 2820
ataatataaa ggatttgtac ttgtacatct agaaaattca gttataaata cttttaacat 2880
taagatttca ataaatcaaa gtgcataaag gtttacgtat gacaatcgac tatgataaaa 2940
catattggag tataactatg ttgaattcaa tgagagtata tcatacactt tcatttaact 3000
attattatgt cattaggttt ttgttttgtt tttttgttat ttcgtaagaa aaaatgtgac 3060
ataaatttaa taagagtgtc ccgctttcag cttaccttgg gaaatgatta tgtcttgctt 3120
tcttgattat tactttgtat atatcacagt catgattctc tacttcactt attaggaaat 3180
gagttttaaa aggtctacag taaaataatc tttttgaagt gttggttcgc caattaactt 3240
tttccggcat aggaatcctt tctgtagttg gcttgttgag ttctaggcta cactgttgca 3300
cctctaaatt cagtgcataa actgggagta ttttacattt caaacagaag tgaatgaaat 3360
tctgtgctcc aatgcttcat atttgtagca ccaattccag cattcagtgt gagccccatg 3420
gtaggtgcca atttttattt ttttttctaa ttgaaaaagt aaaatcactc tgttatggtt 3480
tctcggtcat ggtcggggtt gtctattata ttccttctga tgtcatgtgt ccaatggaac 3540
atttatttct gtttcttatc aggaagttgt gcgacttcga actgcattgg agagggaaat 3600
cttgagaaat gaggtacttt cctgttattt tgttctatat aatgacattt gatattctgc 3660
cgagatttct ggatatgttt tttctgcact agttaaatcc caactaatgt acaaaggact 3720
ttggtaagaa cagatttctg gtcgttttct gaatgattat acttttggag ttactaggat 3780
tagtcatttc cttgttctcc tcgacgagca atataagatt tagccagttg tctgtaagtt 3840
ttgtgtactt atcatttaac gaggtgtagc tccattcaga aatcatggcc aagcccgtca 3900
caatcgttca taaagcagga gcaagacttg atcaaacgtg aatttgacca tttgacaata 3960
ccttttgatg gcattgacgt ctgggaaatt gatcatcagc ttttaaaatt tgaatacaag 4020
attgcatctg gttcatatgg tgacttgtaa gtttgttatg agctatatca ttcctctgac 4080
cattttagtt tcctggagac ttaattaatt aggtaattgt ttcagataca aaggtacata 4140
ctgcagtcag gatgtagcta tcaaaatcct aaaatctgag cgcttgaaca cagaattgca 4200
gacggagttt gcccaagaag tgtatatcat gaggtctgtc tggttatacc tccctatgaa 4260
gcttatggct attatctttg atttctttct ctatgcttaa aatatgttca gacaatatat 4320
ggtattattg tcacattgct atatccttta cttttcagga caagtataag attacacacc 4380
atgtcaagtc gttatctttc ctctgatact gtatttcttt tgtacttgca gaaaagttcg 4440
tcacaaaaat gttgtccaat tcataggggc ttgtaccagg cctcccaact tgtgtatagt 4500
aacaggtagt aaatgtcgta ttcagatcac ccaacttgca gaattgtttc aaaatcgccg 4560
actatcactg ttttcaaaac catttcctgt atcagtttca gtaggagttc acttaatgtt 4620
tatttatctt tcatttcttt gactgtagag tacatgtctg ggggaagcgt atatgactat 4680
ttacacaaac gaaagggcag ttttaaacta cctaccctgc ttaaagtagc gattgatgta 4740
gctaaaggga tgaactacct gcatcaaaat aatattatac atagggactt gaaggctgcc 4800
aatctactga tggatgaaaa tgaagtaaga cgcaattttc agtaaggctg aaaatcttat 4860
actttgtgtg ctgtcttatt gctagatgtt tttagtcgct gatgttacgt atattgatga 4920
ttgatcaact ttctagagta atttttatca tgtccaacta actatgcttg taaatattga 4980
tttcccattt tcatttgcaa atgtagaacc attagctagt acacaaggcc ctaccacatg 5040
aaagaggttt atttctgaac gactataggg aagttattgg agatgccacc acaggatacg 5100
gagcgctgcg tattttatat accactgata acattttgtt atcactcttt tgcttagcga 5160
taatgggctg cttgaacttt gggacatttt ccaaagtttt tattatcagc ctataggaaa 5220
tctgctaaag gcaaatcatt gtggttgcat tagatctatg aaataggata tgactgtgtt 5280
ttatttcgag tccgtgaaaa acatattgct tttcttgaaa atattgagaa cacaagcagg 5340
ttgaaacaca ctgacgatct gtcctcatcg tggtctttta gtgatagaac caggatggaa 5400
agaactgaga ggcacttaag gctatttttg tataaagata ggaaagaatt aaatgctaaa 5460
gcggaagtaa caaaacatta gcaagtccaa agcctccttg actgaaaaac agtgtctaaa 5520
aggcagacat gatgtaattc aatttgtagt ttctgttacc tccgtgtctg agattgtaga 5580
acgactccac ttctccctta cagccagatt ctaatattgg tgaccaaatt gcgcgaaatg 5640
cattaatgat gcaattgcca tcttttatcc caaaatttca ttgttgtagc tttcaattaa 5700
gcttcagctt gaaattcagt tcataacagt ggagttcaaa gtgtgccaaa ttaagggtgt 5760
aatctttcat tcatcccatg ttctttcaat tgtactctag ttttcaacta agtttcactt 5820
tgaaatccct tttaatttga cttaaatcat ttggttagtg tacttagaca taataaaata 5880
tgtgttgtag gcatgtgtgg gttcattagt ccttcatcca ccttatgttc tgaatcagtt 5940
agtggtaaat tttgagtcta aaattagttt tcagctgttt gtaatcaata gtttgctata 6000
attttctcgc agaatatatc gatcatgtta ttttttcaac tgagaattac tcattgatgc 6060
ttcactatgg gttaaattac ccaatacacc tttttatccg cttttatttt cttaagtggg 6120
tttcaaaaat aattatattc aagctctctt ttgttagttt agtctaggcc aatcttaacc 6180
caaattagtt ggttgcttat caagttttac ctaatgtctt ttttcaggtc attaaagtgg 6240
ctgattttgg tgttgccaga gtgaaggcac aaacaggtgt aatgacggca gaaaccggga 6300
cttatagatg gatggccccg gaggtaggcc tatcattcaa atcttaagat aggaaattta 6360
atccgaaatc tcccaaacca ggcttaagcc ttaagataga agttagttat gagtgagcag 6420
aattttggtg cagatcttaa atttagccat ctatattgtt taggatttag gcggtattaa 6480
ttgattgtac acacagtagt gagtagactg ttgaaggtga tttaagagaa ggaagggatg 6540
gaagaagagg aatagagaga gggagcagtc cttatgtcaa gagggtggag tcttaactaa 6600
gatttgttca ttataagaat tatataatac aaagacgtgt agactctatt tgatctctca 6660
aagaattcga tagcttgtgg taccaattat gaatccattc aaggtaacag cagttgttac 6720
aatggaggct gaaggtacta aagttatgtg tgaaggcaga ccaatacgaa agcaatatgc 6780
gacatggttc ctctaaatag atacagaaag agctacatac atatgatagg tgtagtatca 6840
gaggtatatg ttgcatcata tttaccaaga actagatagc tagtactacc aatcatgact 6900
tgtgttaggt aagagagtct gcaattactg acacaagctt tccttctgga cctccccatc 6960
caaataactc gcgtgagtcc tagataatgt gccgagatgt tacgttatta aattgctgca 7020
tggcaagtct ctagtgatct tggcaaagga tattttgttt ttttagtacc agaattgtgt 7080
gttactagaa tcagagagct gactgtgggg taccttactg caccattttg ggctgcaact 7140
gcataaggga tgagtatcag aaaaagtttt gtgctttcta aagctctaat atcctttctt 7200
gtagattcta gatacaaact tatcaaaaat ggttaaattg ggaacaaaac acagtttatg 7260
atggagcatg agttttctca tatttccata actggaatta gaggcaattg aaactgtacc 7320
ttttagcttt ttcttgtttg aattttgttt cattggagtg ttgtgagata caagcactga 7380
tatcaactct ctgcccagtt gattgatgca caacaacaac aaacccagtg aaggtgtggg 7440
gaggataatg tgtacacaga ccttacccct accccggaag gtcagagagg gagaggttgt 7500
ttctgataga ccctcgacta gagagtagat gaaatgcgct ttataggaat atcacatata 7560
cataaagaag cataggccac aagtagtaac aacaacagta tattaaaaaa ccaaagcgaa 7620
agatgccaat caaacaacaa gtaaagatag cagtctatga gtaaaaggga taccatacta 7680
atactaatgc tataggtctg gaaaagaaag agcagcgcgc tcgactaccc actagccttc 7740
taccctaata ctcgacctcc acaacctcct atcaagggac atgtccgcag taagctccag 7800
ctgcgtcata tcctgcctaa tcacctctcc ccgatacttc ttcggcatgc tactaccctt 7860
cctcataccc attgttgcta acctctcaca catcataact ggggcatcaa tgtttctcct 7920
ttgtccgaac catctcagac tcgcctcccg catattatcc tccacggagg ccactttcgc 7980
cttttctcaa ataactccat tcctaatctt atcaaatcgg gtatgcccgc acatccattg 8040
caatattctt atttcagcta cttttatctt ttggacatga gagttcttga ctggccaaca 8100
ctctactcca tacaacatag tcggtctaac caccactcta tagaacttac ctttaagttt 8160
taatggaata ttcttattac acaagacacc ggaagcgaac tccatttcat ccaccctgac 8220
acgatacgat gtgtgacatc ctcatcaacc tccctatttc tttgtattat tgacccaaga 8280
tacctaaaac ttactctctt ggggatgact tgtgtatcaa gcctcacctc catgtccgct 8340
tcctgggtta cgtcgttgaa tttgcactct aagtattccg tcttggtcct gctcaacttg 8400
aaacctttag actccagggt ctccctccaa acctacagtc tcttgttaac acctcccaac 8460
gtctcatcaa tcagaacttt gtcattagca aataacatac accatgacac ctcccttgaa 8520
tgtgtcgcgt aggtgcgtct atcaccaagg aaaatagaaa cgggctaaga gctgatccct 8580
ggtgcaactc tatcacaacc agaaagtgtt ccgagtctcc tcccgttgtc ctaaccaggg 8640
tattacctct atcatacatg tccttaatca ccctaatata ggctaccgtg acccctttag 8700
cctccaagca tctccatagc acctccctcg ggactttgtc gtatactttt tctaggtcaa 8760
tgaacatcat atgcaagtcc tttatctccc tatacctctc caccaatctc ctcacgaggt 8820
gagtggcttc cgtagtcgaa cgacccgaca tgaaaccgaa ctggttctca aaaatagata 8880
caactctcct caccctcact tcaaccatcc tctcccaaac tttcatcgta tggctggctc 8940
ttaatatgtt gactatagtg gtgatatctt gtgtttttgt tgtttggagt ggcttagaat 9000
tgaggtattt cattggttgt tactggccaa gaggatccag atgtgttagg taactcctag 9060
gtgtcagtgg tgattgatga aatttaatga ggttgagctt atttagtggg tacacgcaat 9120
gctgatcaat gattttatga ctgcttgtat aagatttgtg ttaaaaactc cctgttattt 9180
tgtataagat ttgtgtcatt gtaagcatca ctgcagttgc ttgaatagta attgaactag 9240
atggagcatg ggaagggtta tagaaactcg gccaaaaaca atcagttagt tatttgtgac 9300
agttacttaa atcagttaat gtgcgagtta cttccgttat tttctcaatg agattttata 9360
taactagttg tgcagttagc atggctgcat tggcttattt cagatctttc ttcttgaagg 9420
taatagaaca caagccctac gatcacaaag cagatgtatt cagttttggg gttgtgctat 9480
gggagttgct gacagggaag gtactgatat gtgattggaa atttttgggt tagcccgttt 9540
ttgttggttg ttttcttggt atatacttat attcacttga ttttgtttaa ccagcttcca 9600
tatgagtact tgaccccatt gcaagctgct attggagtgg tccagaaggt aatgcttctt 9660
ttatttgatt ttattttatt tgtaatatcg tatgaccata atggttgatt gcatattgcg 9720
cgctcatcac atgcatgcgg gcgcacatag aaaagatatg cacaaatgat ttgatattaa 9780
ttttctaatt gctgccaggg tttgcgacca actataccca agcacactcc tcccagactt 9840
gctgagctgc tagagacatg ctggcaacaa gacccgacat ccaggcctga cttttctgaa 9900
atagtagata ttttgcagca aatagcaaaa gaggtatttg tctctgctca ggcattggcc 9960
agttaataat tatttttctt ggtgataaat gtacagtaca cgtcacaaat tggatttact 10020
gggatttaaa agggtattga ttttctttgg ccgaacatct tttggtcacg atttacaatt 10080
ttctgtcaaa ttgccacctc atgccgataa tataaattgt attaatggct ggggaaaaaa 10140
gagttcactc tccttgaact tcttaagagt tggcagtccc ttcttcagct tccctagaat 10200
aataactatc ctcatttgtg ctttgctttt aattttcata atttctctgc acacaaagat 10260
ggatttaaat agtactctca taacataaac tgtaacaaag gaagtagttt attaactcgg 10320
caacactcga catgtgggtc aggttggaga tgaaagagca gatcgttgca aggagaagtc 10380
agctggagga ttcttttcag cccttagacg tggacatcat tgagtagatg cacacataca 10440
gaatgttgat aaagttttga tttttagcct catttatcca gactgtacag tttttttcca 10500
gatcaatgtt cccatggtca aaaggaagtt attatttcca attctttgaa caaattcctt 10560
ttataagcaa ctttcttttg gcagctccgt cagaagcttt cggagttgga tcaaattaga 10620
ttaatataat tttgcgacta ctccatcaac atcaacatcc acatccacat cattattcat 10680
tccccacgat cacgatatgt ttcgtattcc ctgaaagtaa tggtaggttt cccgtatatt 10740
gttgtttccg ctttctagtt gttttgcgtg tgtttcactg tttatgtgat atttgacctt 10800
tatatcgtgg ttttaggttt atggcatcga ttatgtgcgc tatgaaagaa tgaattttaa 10860
actt 10864
<210> 2
<211> 1689
<212> DNA
<213> 烟草
<400> 2
atggcgatag aggataacga gagttgtggg agtagagtgg tggattcggc gactaccagt 60
ggtcgtcatc agagaaaaaa attggaggtc tacaatgagg ttttacggag gcttaaggaa 120
tcaaacaacg tcgaggcttt agaacctgga tttgacgatg aactttgggc tcacttcaat 180
cgtctaccta ctcggtacgc aatagatgtg aatgtcgaaa gggcagaaga tgtactcaca 240
cacaagcgat tgctacatct tgcacatgtt ccagctaata gacctgcctt tgatgtccgg 300
ttggtgcagg ttgcttcggt tcctgatgga aacttaagag attcttttca ttcgagcttt 360
gcaaagaagg aagttagcag aagtgtccat cctccacctg cctttggttc ttctcctaat 420
ctcgaagccc ttgcttgtga agcaatcaaa tctgaagttc aagacgaaga tactgctgct 480
ccttgtgcaa atttttcgcg gcccatgcat gaaattacat tttcaacaga tgacaagcca 540
aagcttctta gccagttaac ttcattacta gctgagcttg ggctgaacat ccaggaagcg 600
catgcctttt ccactgtgga tggctactcc ctagatgtct ttgttgttga tggttggccc 660
tatgaggaag ttgtgcgact tcgaactgca ttggagaggg aaatcttgag aaatgagaaa 720
tcatggccaa gcccgtcaca atcgttcata aagcaggagc aagacttgat caaacgtgaa 780
tttgaccatt tgacaatacc ttttgatggc attgacgtct gggaaattga tcatcagctt 840
ttaaaatttg aatacaagat tgcatctggt tcatatggtg acttatacaa aggtacatac 900
tgcagtcagg atgtagctat caaaatccta aaatctgagc gcttgaacac agaattgcag 960
acggagtttg cccaagaagt gtatatcatg agaaaagttc gtcacaaaaa tgttgtccaa 1020
ttcatagggg cttgtaccag gcctcccaac ttgtgtatag taacagagta catgtctggg 1080
ggaagcgtat atgactattt acacaaacga aagggcagtt ttaaactacc taccctgctt 1140
aaagtagcga ttgatgtagc taaagggatg aactacctgc atcaaaataa tattatacat 1200
agggacttga aggctgccaa tctactgatg gatgaaaatg aagtcattaa agtggctgat 1260
tttggtgttg ccagagtgaa ggcacaaaca ggtgtaatga cggcagaaac cgggacttat 1320
agatggatgg ccccggaggt aatagaacac aagccctacg atcacaaagc agatgtattc 1380
agttttgggg ttgtgctatg ggagttgctg acagggaagc ttccatatga gtacttgacc 1440
ccattgcaag ctgctattgg agtggtccag aagggtttgc gaccaactat acccaagcac 1500
actcctccca gacttgctga gctgctagag acatgctggc aacaagaccc gacatccagg 1560
cctgactttt ctgaaatagt agatattttg cagcaaatag caaaagaggt tggagatgaa 1620
agagcagatc gttgcaagga gaagtcagct ggaggattct tttcagccct tagacgtgga 1680
catcattga 1689
<210> 3
<211> 562
<212> PRT
<213> 红花烟草（Nicoiana tabacum）
<400> 3
Met Ala Ile Glu Asp Asn Glu Ser Cys Gly Ser Arg Val Val Asp Ser
1 5 10 15
Ala Thr Thr Ser Gly Arg His Gln Arg Lys Lys Leu Glu Val Tyr Asn
20 25 30
Glu Val Leu Arg Arg Leu Lys Glu Ser Asn Asn Val Glu Ala Leu Glu
35 40 45
Pro Gly Phe Asp Asp Glu Leu Trp Ala His Phe Asn Arg Leu Pro Thr
50 55 60
Arg Tyr Ala Ile Asp Val Asn Val Glu Arg Ala Glu Asp Val Leu Thr
65 70 75 80
His Lys Arg Leu Leu His Leu Ala His Val Pro Ala Asn Arg Pro Ala
85 90 95
Phe Asp Val Arg Leu Val Gln Val Ala Ser Val Pro Asp Gly Asn Leu
100 105 110
Arg Asp Ser Phe His Ser Ser Phe Ala Lys Lys Glu Val Ser Arg Ser
115 120 125
Val His Pro Pro Pro Ala Phe Gly Ser Ser Pro Asn Leu Glu Ala Leu
130 135 140
Ala Cys Glu Ala Ile Lys Ser Glu Val Gln Asp Glu Asp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Pro Cys Ala Asn Phe Ser Arg Pro Met His Glu Ile Thr Phe Ser Thr
165 170 175
Asp Asp Lys Pro Lys Leu Leu Ser Gln Leu Thr Ser Leu Leu Ala Glu
180 185 190
Leu Gly Leu Asn Ile Gln Glu Ala His Ala Phe Ser Thr Val Asp Gly
195 200 205
Tyr Ser Leu Asp Val Phe Val Val Asp Gly Trp Pro Tyr Glu Glu Val
210 215 220
Val Arg Leu Arg Thr Ala Leu Glu Arg Glu Ile Leu Arg Asn Glu Lys
225 230 235 240
Ser Trp Pro Ser Pro Ser Gln Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gln Asp Leu
245 250 255
Ile Lys Arg Glu Phe Asp His Leu Thr Ile Pro Phe Asp Gly Ile Asp
260 265 270
Val Trp Glu Ile Asp His Gln Leu Leu Lys Phe Glu Tyr Lys Ile Ala
275 280 285
Ser Gly Ser Tyr Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Thr Tyr Cys Ser Gln Asp
290 295 300
Val Ala Ile Lys Ile Leu Lys Ser Glu Arg Leu Asn Thr Glu Leu Gln
305 310 315 320
Thr Glu Phe Ala Gln Glu Val Tyr Ile Met Arg Lys Val Arg His Lys
325 330 335
Asn Val Val Gln Phe Ile Gly Ala Cys Thr Arg Pro Pro Asn Leu Cys
340 345 350
Ile Val Thr Glu Tyr Met Ser Gly Gly Ser Val Tyr Asp Tyr Leu His
355 360 365
Lys Arg Lys Gly Ser Phe Lys Leu Pro Thr Leu Leu Lys Val Ala Ile
370 375 380
Asp Val Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu His Gln Asn Asn Ile Ile His
385 390 395 400
Arg Asp Leu Lys Ala Ala Asn Leu Leu Met Asp Glu Asn Glu Val Ile
405 410 415
Lys Val Ala Asp Phe Gly Val Ala Arg Val Lys Ala Gln Thr Gly Val
420 425 430
Met Thr Ala Glu Thr Gly Thr Tyr Arg Trp Met Ala Pro Glu Val Ile
435 440 445
Glu His Lys Pro Tyr Asp His Lys Ala Asp Val Phe Ser Phe Gly Val
450 455 460
Val Leu Trp Glu Leu Leu Thr Gly Lys Leu Pro Tyr Glu Tyr Leu Thr
465 470 475 480
Pro Leu Gln Ala Ala Ile Gly Val Val Gln Lys Gly Leu Arg Pro Thr
485 490 495
Ile Pro Lys His Thr Pro Pro Arg Leu Ala Glu Leu Leu Glu Thr Cys
500 505 510
Trp Gln Gln Asp Pro Thr Ser Arg Pro Asp Phe Ser Glu Ile Val Asp
515 520 525
Ile Leu Gln Gln Ile Ala Lys Glu Val Gly Asp Glu Arg Ala Asp Arg
530 535 540
Cys Lys Glu Lys Ser Ala Gly Gly Phe Phe Ser Ala Leu Arg Arg Gly
545 550 555 560
His His
<210> 4
<211> 300
<212> DNA
<213> 烟草
<400> 4
aacaggtgta atgacggcag aaaccgggac ttatagatgg atggccccgg aggtaataga 60
acacaagccc tacgatcaca aagcagatgt attcagtttt ggggttgtgc tatgggagtt 120
gctgacaggg aagcttccat atgagtactt gaccccattg caagctgcta ttggagtggt 180
ccagaagggt ttgcgaccaa ctatacccaa gcacactcct cccagacttg ctgagctgct 240
agagacatgc tggcaacaag acccgacatc caggcctgac ttttctgaaa tagtagatat 300
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 5
tgagtaaggt taccgaattc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 6
ctcgaggccc gggcatgtcc 20

Claims (41)

1.一种变体抗原结合结构域，其与参考抗体相比包含VH结构域中的至少一个突变，所述参考抗体具有以下VH结构域和VL结构域：具有SEQ ID NO:1所示的序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:2所示的序列的VL结构域，其中所述VH结构域中的至少一个突变选自T28K、Y32K和A100N，并且其中所述变体抗原结合结构域相对于所述参考抗体显示出对TRBC2的增加的亲和力。
2.根据权利要求1的变体抗原结合结构域，其包含选自T28K、Y32K和A100N的VH结构域中的至少两个突变。
3.根据权利要求2的变体抗原结合结构域，其中所述VH结构域中的至少两个突变是Y32K和A100N。
4.根据权利要求3的变体抗原结合结构域，其还包含VH结构域中的突变T28R。
5.根据权利要求3的变体抗原结合结构域，其还包含VH结构域中的突变G31K。
6.根据权利要求1至3中任一项的变体抗原结合结构域，其包含T28K、Y32K和A100N突变。
7.根据权利要求6的变体抗原结合结构域，其在选自VH结构域中的V2、Y27、G31、R98、Y102、N103和A107、VL结构域中的N35和VL结构域中的R55的位置处还包含至少一个突变。
8.根据权利要求7的变体抗原结合结构域，其中至少一个另外的突变选自：
a)VH结构域中的：
-V2K、V2R，
-Y27F、Y27M、Y27N、Y27W，
-G31K、G31R、G31S，
-R98K，
-Y102F、Y102L，
-N103A、N103E、N103F、N103H、N103L、N103M、N103Q、N103S、N103W、N103Y，
-A107S，
和
b)VL结构域中的：
-N35M、N35F、N35Y、N35K、N35R，和
-R55K。
9.根据权利要求8的变体抗原结合结构域，其选自包含以下突变组合的变体抗原结合结构域：
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27N，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27W，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的R55K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103H，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103A，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、R98K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103L和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y27F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103Q，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103W和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、V2R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、G31S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、A107S，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103E和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、V2K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103E，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35F，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F、N103M和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35M，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35Y，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103M和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、N103F和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103W和VL结构域中的N35R，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103W和VL结构域中的N35K，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102F，和，
-VH结构域中的T28K、Y32F、A100N、Y102L、N103M和VL结构域中的N35R。
10.根据权利要求9的变体抗原结合结构域，其包含VH结构域中的T28K、Y32F和A100N突变以及VL结构域中的N35K突变。
11.根据权利要求9的变体抗原结合结构域，其包含VH结构域中的T28K、Y32F和A100N突变。
12.根据权利要求1至11中任一项的变体抗原结合结构域，其中所述变体抗原结合结构域与所述参考抗体相比还显示出对TRBC1的降低的亲和力。
13.根据权利要求12的变体抗原结合结构域，其中所述变体抗原结合结构域对TRBC2和TRBC1的亲和力的比率为至少2。
14.根据权利要求12或13中任一项的变体抗原结合结构域，其中所述变体抗原结合结构域对TRBC2和TRBC1的亲和力的比率为至少5。
15.根据权利要求12至14中任一项的变体抗原结合结构域，其中所述变体抗原结合结构域对TRBC2和TRBC1的亲和力的比率为至少10。
16.根据权利要求1至15中任一项的变体抗原结合结构域，其还包含寡聚化结构域。
17.一种抗体，其包含根据权利要求1至15中任一项的变体抗原结合结构域。
18.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据权利要求1至15中任一项的变体抗原结合结构域、间隔区、跨膜结构域和胞内域。
19.根据权利要求18的CAR，其中所述间隔区选自如SEQ ID NO:7所示的人CD8茎部和如SEQ ID NO:19所示的COMP间隔区。
20.一种双特异性T细胞衔接物(BiTE)，其包含根据权利要求1至15中任一项的变体抗原结合结构域和T细胞激活结构域。
21.一种核酸序列，其编码根据权利要求1至16中任一项的变体抗原结合结构域、根据权利要求17的抗体、根据权利要求18或19的CAR、或根据权利要求20的BiTE。
22.一种载体，其包含根据权利要求21的核酸序列。
23.一种细胞，其包含根据权利要求18或19的CAR。
24.一种用于制备根据权利要求23的细胞的方法，其包括用包含编码所述CAR的核酸序列的根据权利要求22的载体转导或转染细胞的步骤。
25.一种缀合物，其包含根据权利要求1至16中任一项的变体抗原结合结构域或根据权利要求17的抗体，和可检测实体或化学治疗实体。
26.根据权利要求25的缀合物，其包含化学治疗实体。
27.一种用于治疗受试者的T细胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括向受试者施用根据权利要求2023的细胞、或根据权利要求17的抗体、或根据权利要求20的BiTE、或根据权利要求25或26的缀合物，其中恶性T细胞表达TRBC2。
28.根据权利要求23的细胞、或根据权利要求17的抗体、或根据权利要求20的BiTE、或根据权利要求25或26的缀合物，其用于药物中。
29.根据权利要求23的细胞、或根据权利要求17的抗体、或根据权利要求20的BiTE、或根据权利要求25或26的缀合物，其用于T细胞淋巴瘤或白血病的治疗，其中恶性T细胞表达TRBC2。
30.根据权利要求23的细胞、或根据权利要求17的抗体、或根据权利要求20的BiTE、或根据权利要求25或26的缀合物在制备用于治疗T细胞淋巴瘤或白血病的药物中的用途，其中恶性T细胞表达TRBC2。
31.一种诊断剂，其包含根据权利要求1至16中任一项的变体抗原结合结构域，或根据权利要求17的抗体。
32.根据权利要求31的诊断剂，其用于诊断T细胞淋巴瘤或白血病。
33.一种用于诊断受试者的T细胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括使根据权利要求1至16中任一项的变体抗原结合结构域或根据权利要求17的抗体与来自所述受试者的包含T细胞的样品接触的步骤。
34.根据权利要求33的方法，其还包括确定所述样品中TRBC2阳性T细胞的百分比的步骤。
35.根据权利要求34的方法，其中所述样品中70％或更高的TRBC2阳性T细胞的百分比指示T细胞淋巴瘤或白血病的存在。
36.一种用于鉴定适合用根据权利要求23的细胞、或根据权利要求17的抗体、或根据权利要求20的BiTE、或根据权利要求25或26的缀合物治疗的具有T细胞淋巴瘤或白血病的受试者的方法，包括确定来自所述受试者的包含T细胞的样品中TRBC2阳性T细胞的百分比。
37.根据权利要求36的方法，其中如果所述样品中TRBC2阳性T细胞的百分比为70％或更高，则所述受试者适合所述用根据权利要求23的细胞、或根据权利要求17的抗体、或根据权利要求20的BiTE、或根据权利要求25或26的缀合物治疗。
38.一种用于选择包含根据权利要求23的细胞、或根据权利要求17的抗体、或根据权利要求20的BiTE、或根据权利要求25或26的缀合物的疗法来治疗受试者的方法，包括确定来自所述受试者的包含T细胞的样品中TRBC2阳性T细胞的百分比。
39.根据权利要求38的方法，其中如果所述样品中TRBC2阳性T细胞的百分比为70％或更高，则选择所述疗法来治疗所述受试者。
40.根据权利要求33至39中任一项的方法，其中所述样品是血液样品或衍生自血液样品。
41.根据权利要求27的方法、或根据权利要求29使用的细胞或抗体或BiTE或药物缀合物、或根据权利要求30的用途、或根据权利要求31或32中任一项的诊断剂、或根据权利要求33至40中任一项的方法，其中所述T细胞淋巴瘤或白血病选自外周T细胞淋巴瘤非特指型(PTCL-NOS)；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、肠病变相关T细胞淋巴瘤(EATL)、肝脾性T细胞淋巴瘤(HSTL)、结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性皮肤ALCL、T细胞幼淋巴细胞性白血病和T细胞急性淋巴母细胞性白血病。
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