JP2024040410A - 結合ドメイン - Google Patents

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Abstract

【課題】結合ドメインの提供。【解決手段】本発明は、参照抗体と比較してＶＨドメインに少なくとも１つの変異を含み、参照抗体と比較してＴＲＢＣ２への増加した親和性を提示するバリアント抗原結合ドメインを提供する。それは、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、前記ＣＡＲを含む細胞、および前記バリアント抗原結合ドメインまたは前記抗体を含むコンジュゲートをさらに提供する。さらに、それは、本発明の生成物を活用する医学的使用、診断方法およびパーソナライズされた薬の方法を提供する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、ＴＲＢＣ２に特異的に結合するバリアント抗原結合ドメインに関する。それは、Ｔ細胞悪性腫瘍の処置および診断で有益な細胞および薬剤にも関する。
発明の背景
リンパ系悪性腫瘍は、Ｔ細胞に由来するものまたはＢ細胞に由来するもののいずれかに大きく分けることができる。Ｔ細胞悪性腫瘍は、臨床的かつ生物学的に不均一な障害の群であり、合わせて非ホジキンリンパ腫の１０～２０％および急性白血病の２０％を占める。最も一般的に同定される組織学的サブタイプは、他に特定されない（not otherwise specified）末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞性リン
パ腫（ＡＩＴＬ）および未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。全ての急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のうちの一部２０％がＴ細胞表現型である。
これらの状態は、一般には、例えばＢ細胞悪性腫瘍と比較して攻撃的に挙動し、推定５年生存率はわずか３０％である。Ｔ細胞リンパ腫の場合では、播種性疾患、好ましくない国際予後指標（ＩＰＩ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）スコアおよび節外性疾患の罹患率を示す患者の高い割合を伴う。化学療法単独では通常は有効ではなく、現行の処置で治癒する患者は３０％未満である。
さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブなどの免疫療法によって転帰が劇的に改善されるのとは異なり、Ｔ細胞悪性腫瘍を処置するために利用可能な、同等に有効であり、毒性が最小である免疫療法薬は現在存在しない。Ｔ細胞障害に対する免疫療法の開発における重要な難しさは、クローンＴ細胞と正常Ｔ細胞のマーカー発現がかなり重複しており、クローン（悪性）細胞を同定することが明白に可能な単一の抗原が存在しないことである。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、難治性のＢ細胞悪性腫瘍の処置で有望さを示した。Ｔ細胞悪性腫瘍を標的にすることは等しく効果的なようであるが、Ｔ細胞リンパ腫などの疾患でのＣＡＲの適用は好適な標的抗原の欠乏によって妨げられている。Ｂ細胞コンパートメントのアブレーションが対処可能な毒性であり、静脈内免疫グロブリンの投与で処置することができるＢ細胞リンパ腫と違って、Ｔ細胞コンパートメントを破壊することはあまり良く耐えられず、細胞媒介性免疫の抑制と関連した合併症につながる。
ＴＣＲベータ鎖（ＴＲＢＣ）の定常領域を標的にすることからなるＴ細胞リンパ腫および白血病を処置するための方法は、ＷＯ２０１５／１３２５９８に以前に記載されている。このアプローチはＴ細胞受容体の特異な特色、すなわち各ＴＣＲが排他的な方法でＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２をコードすることに基づく。Ｔ細胞リンパ腫および白血病は細胞のクローン集団であるので、各リンパ腫は表面上にＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを有する１つのＴＣＲを発現する。
モノクローナル抗体Ｊｏｖｉ－１はＴＲＢＣ１に特異的に結合し、Ｔ細胞リンパ腫を処置する療法のためのＣＡＲ結合ドメインとして使用されている（Maciocia et al., 2017, Nat Med 23:1416-23；ＷＯ２０１５／１３２５９８）。この提案された療法は、ＴＲＢＣ１定常領域を有するＴＣＲを発現する患者のサブセットの処置を可能にする。
全体の患者集団を処置するために、ＴＲＢＣ２を標的にする結合剤／ＣＡＲが必要である。ＴＲＢＣ２に特異的である抗体を得るための１つの方法は、ヒトファージ提示ライブラリーの上でのファージ選択による。別の方法は、ＴＲＢＣ２由来のペプチドで動物を免疫化し、その後特異的抗体を選択することからなる。両方のアプローチの実行は奏効し、ＷＯ２０１５／１３２５９８に開示されるように様々なＴＲＢＣ２特異的結合剤が生成された。
本発明は、ＴＲＢＣ２に特異的であり、ＴＲＢＣ２＋リンパ腫または白血病の処置のための潜在的治療剤である代わりの結合剤を提供する。
国際公開第２０１５／１３２５９８号
Maciocia et al., 2017, Nat Med 23:1416-23
発明の局面の要旨
本発明者らは、ＴＲＢＣ１－ＴＣＲと複合体を形成している、ＴＲＢＣ１特異的モノクローナル抗体ＪＯＶＩ－１の結晶構造を２．４Åまで解明した（Viney et al., 1992,
Hybridoma 11:701-13）（図３）。結晶構造から、元のＪｏｖｉ－１抗体がＴＲＢＣ２に結合するように操作することが可能であった。抗体の中のいくつかのアミノ酸がＴＣＲの係合を可能にするための形状相補性を提供するパラトープを形成し、ＴＲＢＣ１への特異性のためにわずかな数だけが必要とされるので、この方法は特に魅力的である。コンピュータ生物学およびタンパク質工学を通して、発明者らは、ＴＲＢＣ２に特異的であり、ＴＲＢＣ１に対する低下した親和性を有するＴＲＢＣ１結合剤の変異バージョンを合理的に設計した。
したがって、第１の態様では、本発明は、配列番号１に示す配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示す配列を有するＶＬドメインを有する参照抗体と比較してＶＨドメインに少なくとも１つの変異を含むバリアント抗原結合ドメインであって、ＶＨドメインにおける少なくとも１つの変異はＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＫおよびＡ１００Ｎから選択され、バリアント抗原結合ドメインは、参照抗体と比較してＴＲＢＣ２への増加した親和性を提示する、バリアント抗原結合ドメインを提供する。
バリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＫおよびＡ１００Ｎから選択される少なくとも２つの変異を含むことができる。例えば、それは変異Ｙ３２ＫおよびＡ１００Ｎを含むことができる。バリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインに変異Ｔ２８Ｒを、あるいはＶＨドメインに変異Ｇ３１Ｋを含むことができる。
バリアント抗原結合ドメインは、Ｔ２８Ｋ、Ｙ３２ＫおよびＡ１００Ｎ変異を含むことができる。
バリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにおけるＶ２、Ｙ２７、Ｇ３１、Ｒ９８、Ｙ１０２、Ｎ１０３およびＡ１０７、ＶＬドメインにおけるＮ３５ならびにＶＬドメインにおけるＲ５５からなる群から選択される位置に少なくとも１つの変異をさらに含むことができる。少なくとも１つのさらなる変異は、以下から選択することができる：
ａ）ＶＨドメインにおける
－ Ｖ２Ｋ、Ｖ２Ｒ、
－ Ｙ２７Ｆ、Ｙ２７Ｍ、Ｙ２７Ｎ、Ｙ２７Ｗ、
－ Ｇ３１Ｋ、Ｇ３１Ｒ、Ｇ３１Ｓ、
－ Ｒ９８Ｋ、
－ Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ｌ、
－ Ｎ１０３Ａ、Ｎ１０３Ｅ、Ｎ１０３Ｆ、Ｎ１０３Ｈ、Ｎ１０３Ｌ、Ｎ１０３Ｍ、Ｎ１０３Ｑ、Ｎ１０３Ｓ、Ｎ１０３Ｗ、Ｎ１０３Ｙ、
－ Ａ１０７Ｓ、
ならびに
ｂ）ＶＬドメインにおける
－ Ｎ３５Ｍ、Ｎ３５Ｆ、Ｎ３５Ｙ、Ｎ３５Ｋ、Ｎ３５Ｒ、および
－ Ｒ５５Ｋ。
バリアント抗原結合ドメインは、以下の変異の組合せを含むバリアント抗原結合ドメインから選択することができる：
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｎ
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｇ３１Ｋ
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｍ
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｗ
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＲ５５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｈ
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ａ
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｙ
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｒ９８Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｌ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｗ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｑ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｓ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｇ３１Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｖ２Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｇ３１Ｓ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ａ１０７Ｓ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＥおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｖ２Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｅ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、ならびに
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ。
バリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ変異を含むことができる。
バリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎ変異を含むことができる。
バリアント抗原結合ドメインは、参照抗体と比較してＴＲＢＣ１への低下した親和性をさらに提示することができる。
ＴＲＢＣ２およびＴＲＢＣ１へのバリアント抗原結合ドメインの親和性の比は、少なくとも２であってよい。
ＴＲＢＣ２およびＴＲＢＣ１へのバリアント抗原結合ドメインの親和性の比は、少なくとも５であってよい。
ＴＲＢＣ２およびＴＲＢＣ１へのバリアント抗原結合ドメインの親和性の比は、少なくとも１０であってよい。
バリアント抗原結合ドメインは、オリゴマー化ドメインをさらに含むことができる。
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうバリアント抗原結合ドメインを含む抗体を提供する。
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうバリアント抗原結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
スペーサーは、配列番号７に示すヒトＣＤ８ストークおよび配列番号１９に示すＣＯＭＰスペーサーから選択することができる。
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうバリアント抗原結合ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を提供する。
第５の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうバリアント抗原結合ドメイン、本発明の第２の態様にしたがう抗体、本発明の第３の態様にしたがうＣＡＲ、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥをコードする核酸配列を提供する。
第６の態様では、本発明は、本発明の第５の態様にしたがう核酸配列を含むベクターを提供する。
第７の態様では、本発明は、本発明の第３の態様にしたがうＣＡＲを含む細胞を提供する。
第８の態様では、本発明は、本発明の第７の態様にしたがう細胞を作製するための方法であって、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む本発明の第６の態様にしたがうベクターで細胞を形質導入またはトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。
第９の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうバリアント抗原結合ドメインまたは本発明の第２の態様にしたがう抗体および検出可能な実体または化学療法用実体を含むコンジュゲートを提供する。
コンジュゲートは、化学療法用実体を含むことができる。
第１０の態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法であって、本発明の第７の態様にしたがう細胞、または本発明の第２の態様にしたがう抗体、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥ、または本発明の第９の態様にしたがうコンジュゲートを対象に投与するステップを含み、悪性Ｔ細胞はＴＲＢＣ２を発現する方法を提供する。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
第１１の態様では、本発明は、薬で使用するための本発明の第７の態様にしたがう細胞、または本発明の第２の態様にしたがう抗体、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥ、または本発明の第９の態様にしたがうコンジュゲートを提供する。
第１２の態様では、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置で使用するための、本発明の第７の態様にしたがう細胞、または本発明の第２の態様にしたがう抗体、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥ、または本発明の第９の態様にしたがうコンジュゲートを提供し、ここで、悪性Ｔ細胞はＴＲＢＣ２を発現する。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
第１３の態様では、本発明は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病を処置するための医薬の製造における、本発明の第７の態様にしたがう細胞、または本発明の第２の態様にしたがう抗体、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥ、または本発明の第９の態様にしたがうコンジュゲートの使用を提供し、ここで、悪性Ｔ細胞は、ＴＲＢＣ２を発現する。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
第１４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがうバリアント抗原結合ドメインまたは本発明の第２の態様にしたがう抗体を含む診断剤を提供する。
診断剤は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病を診断するためのものであってよい。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
第１５の態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を診断するための方法であって、本発明の第１の態様にしたがうバリアント抗原結合ドメインまたは本発明の第２の態様にしたがう抗体を対象からのＴ細胞を含む試料と接触させるステップを含む方法を提供する。
対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を診断するための方法は、試料中のＴＲＢＣ２陽性のＴ細胞の百分率を決定するステップをさらに含むことができる。
試料中の７０％またはそれよりも高い百分率のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の存在を示すことができる。
試料は血液試料であってよいか、またはそれに由来してもよい。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
第１６の態様では、本発明は、本発明の第７の態様にしたがう細胞、または本発明の第２の態様にしたがう抗体、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥ、または本発明の第９の態様にしたがうコンジュゲートによる処置に適格であるＴ細胞リンパ腫または白血病の対象を同定するための方法であって、対象からのＴ細胞を含む試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率を決定するステップを含む方法を提供する。
対象は、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率が７０％またはそれよりも高い場合、本発明の第７の態様にしたがう細胞、または本発明の第２の態様にしたがう抗体、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥ、または本発明の第９の態様にしたがうコンジュゲートによる前記処置に適格であることができる。
試料は血液試料であってよいか、またはそれに由来してもよい。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
第１７の態様では、本発明は、対象の処置のための、本発明の第７の態様にしたがう細胞、または本発明の第２の態様にしたがう抗体、または本発明の第４の態様にしたがうＢｉＴＥ、または本発明の第９の態様にしたがうコンジュゲートを含む療法を選択するための方法であって、対象からのＴ細胞を含む試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率を決定するステップを含む方法を提供する。
前記療法は、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率が７０％またはそれよりも高い場合、前記対象を処置するために選択することができる。
試料は血液試料であってよいか、またはそれに由来してもよい。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
図１は、αβＴ細胞受容体／ＣＤ３複合体の図である。Ｔ細胞受容体は、細胞表面上で発現されるために小胞体の中で組み立てられなければならない６つの異なるタンパク質鎖から形成される。ＣＤ３複合体の４つのタンパク質（ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３εおよびＣＤ３δ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を包む。このＴＣＲは複合体に特定の抗原の特異性を吹き込み、２つの鎖：ＴＣＲαおよびＴＣＲβで構成される。各ＴＣＲ鎖は、膜に遠位の可変構成要素および膜に近位の定常構成要素を有する。ほとんど全てのＴ細胞リンパ腫および多くのＴ細胞白血病は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を発現する。 図２は、Ｔ細胞受容体再構成の間のＴ細胞受容体β－定常領域（ＴＲＢＣ）－１およびＴＲＢＣ２の分離を示す。各ＴＣＲベータ鎖は、特定のベータ可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（ＴＲＢＣ）領域のゲノム組換えから形成される。ヒトゲノムは、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２として公知の２つの非常に類似した、機能的に同等のＴＲＢＣ遺伝子座を含有する。ＴＣＲ遺伝子再構成の間、Ｊ領域はＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかと再結合する。この再構成は恒久的である。Ｔ細胞はそれらの表面上に単一のＴＣＲの多くのコピーを発現するので、各Ｔ細胞はそのβ鎖定常領域がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかによってコードされるＴＣＲを発現する。 図３は、ＴＲＢＣ１特異的抗体Ｊｏｖｉ－１のＴＣＲベータとＦａｂ断片の間の構造的インターフェイスを示す。 図４は、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構造の図を示す。 図５は、抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲの機能的特徴付けを示す。ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２の存在下でインキュベートした（Ａ）抗ＴＲＢＣ２三重変異体ＣＡＲおよび（Ｂ）抗ＴＲＢＣ１ ＣＡＲによるＩＦＮ－γの生成。 図６は、Ｒａｊｉ ＷＴ、Ｒａｊｉ ＴＲＢＣ１＋またはＲａｊｉ ＴＲＢＣ２＋細胞と同時インキュベートした（Ａ）抗ＴＲＢＣ２三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞、および（Ｂ）抗ＴＲＢＣ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。 図７は、ＨＰＢ ＴＲＢＣ１およびＨＰＢ ＴＲＢＣ２細胞と同時インキュベートした抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲで形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞の抗原特異的活性化を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＴＲＢＣ１＋）を第２世代抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲ構築物で形質導入し、ＨＰＢ ＴＲＢＣ１およびＨＰＢ ＴＲＢＣ２細胞と１：１のＥ：Ｔ比で同時インキュベートした。対照には、非形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＮＴ）、ノックアウトＴＣＲを有するＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（ＨＰＢ ＫＯと呼ぶ）および陰性対照としてそれだけで、または陽性アッセイ対照としてαＣＤ３／αＣＤ２８抗体とそれぞれプレーティングした形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞が含まれた。Ｎ３５Ｋ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋを有する結合剤；Ｎ１０３Ｌ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｌ変異を有する結合剤；Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｙ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙを有する結合剤；Ｙ１０２Ｆ－Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｒ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒを有する結合剤；ならびにＹ１０２Ｌ－Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｒ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒを有する結合剤。 図８は、ＴＲＢＣ１＋ＨＰＢ－ＡＬＬおよびＴＲＢＣ２＋ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞と同時インキュベートした抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を第２世代抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲ構築物で形質導入した。形質導入したＰＢＭＣは、ＴＲＢＣ１＋ＨＰＢ－ＡＬＬおよびＴＲＢＣ２＋ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞と１：２のＥ：Ｔ比で同時インキュベートした。対照には、非形質導入細胞（ＮＴ）、抗ＴＲＢＣ１ｈＪｏｖｉ－１ＣＡＲで形質導入した細胞（ＪＯＶＩ）およびノックアウトしたＴＣＲを有するＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（ＨＰＢ－ＫＯ）が含まれた。Ｎ３５Ｋ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋを有する結合剤；Ｎ１０３Ｌ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｌ変異を有する結合剤；Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｙ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙを有する結合剤；Ｙ１０２Ｆ－Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｒ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒを有する結合剤；ならびにＹ１０２Ｌ－Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｒ：ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒを有する結合剤。 図９は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ＴＲＢＣ２抗体の結合における異なる抗体フォーマットの影響の分析を示す。 図９は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ＴＲＢＣ２抗体の結合における異なる抗体フォーマットの影響の分析を示す。 図９は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ＴＲＢＣ２抗体の結合における異なる抗体フォーマットの影響の分析を示す。
発明の詳細な説明
本発明者らはＪｏｖｉ－１の結晶構造を解明し、それは、ＴＲＢＣ１特異性のために必須である２つの鍵残基の同定に役立った（図１）。興味深いことに、これらの残基は、通常抗体特異性を促進するＣＤＲ３と対照的にＣＤＲ１の中にある。さらに、ＴＲＢＣ１エピトープに近接して存在する他の残基が、ＴＲＢＣ１からＴＲＢＣ２に特異性を操作するためにおそらく必須である。ＴＲＢＣ１の結合に関与するかまたはＴＲＢＣ２特異性を生成するのに重要であるＪｏｖｉ－１の中の残基が、本明細書に記載される。
本発明は、ＴＣＲベータ定常領域２（ＴＲＢＣ２）に対してＪＯＶＩ－１より高い親和性を有するＪＯＶＩ－１の抗原結合ドメインのバリアントを提供する。
１．ＴＣＲβ定常領域（ＴＲＢＣ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴリンパ球の表面上に発現され、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識する役割を担う。ＴＣＲが抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と係合するとき、Ｔリンパ球は関連酵素、補助受容体、専門化したアダプター分子および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通して活性化される。
ＴＣＲは、通常、不変のＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される高度に可変性のアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖からなるジスルフィド連結した膜係留型ヘテロ二量体である。この受容体を発現するＴ細胞はα：β（またはαβ）Ｔ細胞と称される（総Ｔ細胞の約９５％）。少数のＴ細胞は、可変性のガンマ（γ）鎖およびデルタ（δ）鎖によって形成される代替の受容体を発現し、これらはγδ Ｔ細胞と称される（総Ｔ細胞の約５％）。
各α鎖およびβ鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域で構成され、これらはどちらも、逆平行β－シートを形成する免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインである。定常領域は細胞膜に対して近位にあり、その後ろに膜貫通領域および短い細胞質尾部があり、可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲの定常領域は、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それにより２つの鎖間に連結が形成される、短い接続配列からなる。
ＴＣＲ α鎖およびβ鎖の可変ドメインはどちらも３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。β鎖の可変領域は、追加的な領域の超可変性（ＨＶ４）も有するが、これは通常は抗原と接触せず、したがって、ＣＤＲとはみなされない。
ＴＣＲはまた、最大５つの不変鎖γ、δ、ε（集合的にＣＤ３と称される）およびζも含む。ＣＤ３およびζサブユニットは、αβまたはγδによる抗原の認識後に第２のメッセンジャーおよびアダプター分子と相互作用する特異的な細胞質ドメインを通じてＴＣＲシグナル伝達を媒介する。ＴＣＲ複合体の細胞表面発現の前に、サブユニットが対で集合し、そこではＴＣＲ αおよびβならびにＣＤ３ γおよびδの膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの両方が役割を果たす。
したがって、ＴＣＲは、一般にＣＤ３複合体と、ＴＣＲ α鎖およびβ鎖とで構成され可、それが今度は変領域および定常領域で構成される（図１）。
ＴＣＲβ定常領域（ＴＲＢＣ）を供給する遺伝子座（Ｃｈｒ７：ｑ３４）は進化の歴史の中で二倍になり、２つのほとんど同一で機能的に同等の遺伝子：ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２を生成した（図２）。各ＴＣＲはＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを排他的に含み、このように、各αβＴ細胞はＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを排他的に発現する。
本発明者らは、ＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２の配列の間の類似性にもかかわらず、それらを区別することが可能であると以前に決定した。発明者らは、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２のアミノ酸配列は、細胞、例えばＴ細胞の表面上でｉｎ ｓｉｔｕで区別することができることも以前に決定した（ＷＯ２０１５／１３２５９８）。
２．バリアント抗原結合ドメイン
第１の態様では、本発明は、配列番号１に示す配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示す配列を有するＶＬドメインを有する参照抗体と比較してＶＨドメインに少なくとも１つの変異を含むバリアント抗原結合ドメイン、以降「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」であって、ＶＨドメインにおける少なくとも１つの変異はＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎから選択され、バリアント抗原結合ドメインは、参照抗体と比較してＴＲＢＣ２への増加した親和性を提示する、バリアント抗原結合ドメインを提供する。
本明細書で使用される用語「バリアント」または「変異体」は、具体的に列挙されるポリペプチド、すなわち参照または親ポリペプチドと、例えば組換えＤＮＡ技術を使用して、または新規合成によって作製されるアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって異なるポリペプチドを指す。バリアントおよび変異体は、本発明との関連で区別なく使用される。本発明のバリアント抗原結合ドメインには、アミノ酸残基の１つまたはいくつかが、参照または親の抗原結合ドメインの抗原結合親和性に実質的に影響する方法で置換、付加および／または欠失によって改変される抗原結合性分子が含まれる。
本明細書で使用される用語「抗原結合ドメイン」は、その結合部位を形成する、抗体の軽鎖および重鎖の各対の可変領域、すなわちＶＬおよびＶＨドメインをそれぞれ指す。それらは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域に連結するフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存された領域によって構成される同じ一般構造によって特徴付けられる（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5th Ed., NIH Publication No. 91-3242, Bethesda, MD.；Chothia
& Lesk, 1987, J Mol Biol 196:901-17）。本明細書で使用される用語「相補性
決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原の形状を補足する抗体内の領域を指す。したがって、ＣＤＲは特異的抗原に対するタンパク質の親和性（大雑把には、結合強度）および特異性を決定する。各対の２つの鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープに結合する機能を獲得する。
本発明のバリアント抗原結合ドメインは、参照抗体と比較してＶＨドメインに少なくとも１つの変異を含む。本明細書で使用されるように、用語「参照抗体」は、ヒト化ＪＯＶＩ－１抗体、すなわちｈＪＯＶＩ－１を指し、それは、配列番号１に示す配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２に示す配列を有するＶＬドメインを含む。マウスのＪＯＶＩ－１はViney et al.（1992；上記）によって以前に開示され、市販されている（Ａｂｃａｍ， ａｂ５４６５）。ＪＯＶＩ－１は、ＴＲＢＣ１だけに特異的に結合することによってＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２の特異的発現に基づいて細胞を識別することができると以前に決定されている（ＷＯ２０１５／１３２５９８）。
Figure 2024040410000001
以降、明記されない限り、ＶＨドメインへのいかなる言及も配列番号１に示すｈＪＯＶＩ－１のＶＨドメインを意味し、明記されない限り、ＶＬドメインへのいかなる言及も配列番号２に示すｈＪＯＶＩ－１のＶＬドメインを意味する。
本発明者らは、参照抗体のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎから選択される少なくとも１つの変異の存在は、参照抗体と比較した、本発明のバリアント抗原結合ドメインのＴＲＢＣ２への親和性の増加を誘発すると決定した（実施例１）。
本明細書で使用される用語「親和性」は、抗体の抗原結合部位とエピトープの間の相互作用の強度を指す。高親和性抗体は、低親和性抗体より短い時間でより多い量の抗原に結合する。親和性は、抗体と抗原の間のｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である平衡解離定数（ＫＤ）で通常測定される。任意の所与の抗原への抗原結合ドメインの親和性は、標識依存性の方法、例えば直接的および間接的ＥＬＩＳＡならびにラジオイムノアッセイ方法、ならびに表面プラスモン共鳴および生体層干渉などの相互作用のリアルタイムでの直接検出および測定を可能にする無標識方法を限定されずに含む、任意の従来の方法を使用して定量化することができる。
ＴＲＢＣ２への本発明のバリアント抗原結合ドメインの親和性は、参照抗体のそれに対して増加する。ＴＲＢＣ２へのバリアント抗原結合ドメインの親和性は、ＴＲＢＣ２への参照抗体の親和性に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１，０００％、少なくとも５，０００％または少なくとも１０，０００％増加することができる。
本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ変異を含むことができる。本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＹ３２Ｆ変異を含むことができる。本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＡ１００Ｎ変異を含むことができる。
本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎから選択される少なくとも２つの変異を含むことができる。少なくとも２つの変異は、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎであってよい。一実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインに変異Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎならびに変異Ｔ２８Ｒをさらに含むことができる。別の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインに変異Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎならびに変異Ｇ３１Ｒをさらに含むことができる。
本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインに変異Ｔ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎを含むことができる。
別の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインに変異Ｔ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎを含み、さらに、ＶＨドメインにおけるＶ２、Ｙ２７、Ｇ３１、Ｒ９８、Ｙ１０２、Ｎ１０３およびＡ１０７、ならびにＶＬドメインにおけるＮ３５およびＲ５５からなる群から選択される位置に少なくとも１つの変異を含む。本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにおけるＶ２、Ｙ２７、Ｇ３１、Ｒ９８、Ｙ１０２、Ｎ１０３およびＡ１０７、ならびにＶＬドメインにおけるＮ３５およびＲ５５からなる群から選択される位置に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの変異を含むことができる。
本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインに変異Ｔ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎを含むことができ、ＶＨドメインにおけるＶ２位の変異、ＶＨドメインにおけるＹ２７位の変異、ＶＨドメインにおけるＧ３１位の変異、ＶＨドメインにおけるＲ９８位の変異、ＶＨドメインにおけるＹ１０２位の変異、ＶＨドメインにおけるＮ１０３位の変異、ＶＨドメインにおけるＡ１０７位の変異、ＶＬドメインにおけるＮ３５位の変異、およびＶＬドメインにおけるＲ５５位の変異をさらに含むことができる。
本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインに変異Ｔ２８Ｋ、Ｙ３２ＦおよびＡ１００Ｎを含むことができ、以下から選択される少なくとも１つの変異をさらに含む：
ａ）ＶＨドメインにおける
－ Ｖ２Ｋ、Ｖ２Ｒ、
－ Ｙ２７Ｆ、Ｙ２７Ｍ、Ｙ２７Ｎ、Ｙ２７Ｗ、
－ Ｇ３１Ｋ、Ｇ３１Ｒ、Ｇ３１Ｓ、
－ Ｒ９８Ｋ、
－ Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ｌ、
－ Ｎ１０３Ａ、Ｎ１０３Ｅ、Ｎ１０３Ｆ、Ｎ１０３Ｈ、Ｎ１０３Ｌ、Ｎ１０３Ｍ、Ｎ１０３Ｑ、Ｎ１０３Ｓ、Ｎ１０３Ｗ、Ｎ１０３Ｙ、および
－ Ａ１０７Ｓ、
ならびに
ｂ）ＶＬドメインにおける
－ Ｎ３５Ｍ、Ｎ３５Ｆ、Ｎ３５Ｙ、Ｎ３５Ｋ、Ｎ３５Ｒ、および
－ Ｒ５５Ｋ。
本発明のバリアント抗原結合ドメインは、以下の変異の組合せを含むバリアント抗原結合ドメインから選択することができる：
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｎ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｇ３１Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｗ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＲ５５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｈ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ａ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｒ９８Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｌ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＳおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｗ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＬおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ２７Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｑ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｓ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｇ３１Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｖ２Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｇ３１Ｓ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ａ１０７Ｓ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＥおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｖ２Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｅ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｆ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｍ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３ＦおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３ＷおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ、
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、ならびに
－ ＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３ＭおよびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ。
これらの特異的な組合せ変異は、ＴＲＢＣ２標的化に有益であるようにＴＲＢＣ２およびＴＲＢＣ１への結合を変更することが示されている（表１参照）。
Figure 2024040410000002
Figure 2024040410000003
Figure 2024040410000004
特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎの変異を含む。
別の特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＹ２７Ｎの変異を含む。
別の特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００ＮおよびＮ１０３Ｍの変異を含む。
別の特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎの変異およびＶＬドメインにＮ３５Ｋを含む。
別の特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｌの変異を含む。
別の特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｍの変異およびＶＬドメインにＮ３５Ｙの変異を含む。
別の特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３Ｍの変異およびＶＬドメインにＮ３５Ｒの変異を含む。
別の特定の実施形態では、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、ＶＨドメインにＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３Ｍの変異およびＶＬドメインにＮ３５Ｒの変異を含む。
本発明のバリアント抗原結合ドメインが、参照抗体と比較してＴＲＢＣ２への増加した親和性を提示することだけでなく、ＴＲＢＣ１対するその親和性が参照抗体のそれと比較して減少することも特に有利だろう。抗原特異性におけるこの変化は、バリアント抗原結合ドメインがＴＲＢＣ２への優先的結合を示すことによってＴＲＢＣ２とＴＲＢＣ１を区別することを可能にするだろう。したがって、別の実施形態では、バリアント抗原結合ドメインは、参照抗体と比較してＴＲＢＣ１への低下した親和性をさらに提示する。
ＴＲＢＣ１への本発明のバリアント抗原結合ドメインの親和性は、参照抗体のそれに対して低下する。ＴＲＢＣ２へのバリアント抗原結合ドメインの親和性は、ＴＲＢＣ１への参照抗体の親和性に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１，０００％、少なくとも５，０００％または少なくとも１０，０００％増加することができる。
ＴＲＢＣ２およびＴＲＢＣ１への本発明のバリアント抗原結合ドメインの親和性の比は、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０、または少なくとも１５、または少なくとも２０、または少なくとも２５、または少なくとも５０、または少なくとも１００、または少なくとも５００、または少なくとも１，０００、またはそれよりも大きくてもよい。
実施例６で本発明のバリアント抗原結合ドメインの結合力を高めることによって、本発明者らは、ＴＲＢＣ２への本発明のバリアント抗原結合ドメインの結合力が増加するだけでなく、ＴＲＢＣ１へのその低い親和性が維持され、その結果として、ＴＲＢＣ２への本発明のバリアント抗原結合ドメインの特異性が劇的に向上することを予想外に発見した。
ＴＲＢＣ２への本発明のバリアント抗原結合ドメインの結合力は、オリゴマーまたは多量体を形成する能力を有するドメインを使用することによって増加させることができる。したがって、本発明のバリアント抗原結合ドメインは、オリゴマー化ドメインをさらに含むことができる。本明細書で使用される用語「オリゴマー化ドメイン」は、自己会合してオリゴマー、例えば二量体または三量体または多量体を形成するドメインを指す。したがって、本明細書で使用されるように、用語オリゴマー化ドメインは、多量体化ドメインも指す。オリゴマー化ドメインは当業者に周知であり、生じるオリゴマーが単量体バリアント抗原結合ドメインのＴＲＢＣ２への親和性を維持するかまたは向上させるならば、任意のオリゴマー化ドメインを本発明のバリアント抗原結合ドメインと使用することができる。オリゴマー化ドメインの例には、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）との関連で下に記載されるように、Ｆｃ領域、配列番号１８のＣＯＭＰスペーサーまたはトランケーションされたＣＯＭＰが限定されずに含まれる。
本発明は、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリマーボディ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに完全抗体、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥを限定されずに含む、本発明のバリアント抗原結合ドメインのための異なるフォーマットも企図する。
したがって、本発明の別の態様は、本発明のバリアント抗原結合ドメインを含む抗体、以降「本発明の抗体」に関する。
３．キメラ抗原受容体
別の態様では、本発明は、本発明のバリアント抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、以降「本発明のＣＡＲ」を提供する。
用語「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」は、本発明の第１の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこの態様に等しく適用される。
本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「キメラＴ細胞受容体」または「人工Ｔ細胞受容体」または「キメラ免疫受容体」は、細胞外抗原認識ドメイン（結合剤）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に連結するキメラＩ型膜貫通タンパク質を指す。結合剤は一般的にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、それは抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。スペーサードメインは、結合剤を膜から分離して、好適な配向をそれに許すのに通常必要である。使用する一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。よりコンパクトなスペーサーは、例えばＣＤ８αからのストークに、および抗原によってはＩｇＧ１ヒンジだけにも十分である。膜貫通ドメインは細胞膜の中にタンパク質を固着させ、スペーサーをエンドドメインに連結する。
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖の細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。その結果として、これらの第一世代受容体は免疫シグナル１を伝達し、それはコグネイト標的細胞のＴ細胞殺滅を誘発するのに十分だったが、Ｔ細胞が増殖して生存するように完全に活性化することができなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインを構築した：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分のＣＤ３ζのそれへの融合は、抗原認識の後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体をもたらす。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８のそれである。これは、最も強力な共刺激シグナル－すなわち、Ｔ細胞増殖を誘発する免疫シグナル２を供給する。ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン、例えば生存シグナルを伝達する緊密に関係したＯＸ４０および４－１ＢＢを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することが可能なエンドドメインを有する、さらに強力な第三世代ＣＡＲが今では記載されている。
ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、これは活性化シグナルのそれが発現されるＴ細胞への伝達をもたらす。したがって、ＣＡＲはＴ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的抗原を発現する腫瘍細胞に導く。
したがって、ＣＡＲは以下を一般的に含む：（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むかまたはそれと会合する細胞内ドメイン（図４参照）。
ＣＡＲは、以下の一般構造を有することができる：
抗原結合ドメイン－スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）。
３．１．シグナルペプチド
本発明のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞の中で発現されるとき、発生期のタンパク質が小胞体に、その後それが発現される細胞表面に導かれるように、シグナルペプチドを含むことができる。
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向のある長いひと続きの疎水性アミノ酸を含有することができる。シグナルペプチドは短い正に荷電したひと続きのアミノ酸で開始することができ、それは転位の間、ポリペプチドの適切なトポロジーを強制するのを助ける。シグナルペプチドの終わりには、シグナルペプチダーゼによって認識され、切断されるひと続きのアミノ酸が一般的にある。シグナルペプチダーゼは、転位の間または完了後に切断して、遊離のシグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成することができる。遊離のシグナルペプチドは、特異的プロテアーゼによってその後消化される。
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあることができる。
シグナルペプチドは配列番号３～５、または、シグナルペプチドがタンパク質の細胞表面発現を引き起こす機能がなおあるならば、５つ、４つ、３つ、２つもしくは１つのアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するそのバリアントを含むことができる。
配列番号３：MGTSLLCWMALCLLGADHADG
配列番号３のシグナルペプチドはコンパクトであり、高度に効率的である。それは末端グリシンの後ろで約９５％の切断を与えることが予測され、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去を与える。
配列番号４：MSLPVTALLLPLALLLHAARP
配列番号４のシグナルペプチドはＩｇＧ１に由来する。
配列番号５：MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
配列番号５のシグナルペプチドはＣＤ８に由来する。
３．２．スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含む。柔軟なスペーサーは、結合を容易にするために抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを可能にする。
本発明のＣＡＲでは、スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含むことができる。スペーサーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域に類似した長さおよび／またはドメイン間隔特性を有する代わりのリンカー配列、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを代わりに含むことができる。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを取り除くように改変することができる。スペーサーは、例えばＷＯ２０１６／１５１３１５に記載されるように、コイルドコイルドメインを含むことができる。
本発明のＣＡＲは、配列番号６～１０で示す配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントから選択される配列を含むことができる。
Figure 2024040410000005
Figure 2024040410000006
Ｎ末端でＣＯＭＰコイルドコイルドメインをトランケーションし、表面発現を保持することが可能である。したがって、コイルドコイルＣＯＭＰスペーサーは、Ｎ末端でトランケーションされる、配列番号１９のトランケーションされたバージョンを含むかそれからなることができる。トランケーションされたＣＯＭＰは、配列番号１９の５つのＣ末端アミノ酸、すなわち配列ＣＤＡＣＧ（配列番号２０）を含むことができる。トランケーションされたＣＯＭＰは、５～４４アミノ酸、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０アミノ酸を含むことができる。トランケーションされたＣＯＭＰは、配列番号１９のＣ末端に対応することができる。例えば、２０アミノ酸を含むトランケーションされたＣＯＭＰは、配列ＱＱＶＲＥＩＴＦＬＫＮＴＶＭＥＣＤＡＣＧ（配列番号２１）を含むことができる。トランケーションされたＣＯＭＰは、多量体化に関与するシステイン残基（複数可）を保持することができる。トランケーションされたＣＯＭＰは、多量体を形成する能力を保持することができる。
３．３．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。
膜貫通ドメインは、膜の中で熱力学的に安定している任意のタンパク質構造であってよい。これは、一般的にいくつかの疎水性残基を含むアルファヘリックスである。本発明の膜貫通部分を供給するために、任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを使用することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在およびスパンは、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）を使用して当業者が決定することがで
きる。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインは比較的単純な構造、すなわち、膜をまたぐのに十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であることを考えると、人工的に設計されたＴＭドメインを使用することもできる（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は合成膜貫通構成要素を記載する）。
膜貫通ドメインは、優れた受容体安定性を与えるＣＤ２８、ＣＤ８ａまたはＴＹＲＰ－１に由来することができる。
一実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８ａに由来する。
配列番号１１：ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
別の実施形態では、膜貫通ドメインはＴＹＲＰ－１に由来する。
配列番号１２：ＴＹＲＰ－１膜貫通ドメイン
IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI
３．４．エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原認識の後、受容体クラスター、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８はシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζのそれである。これは、抗原に結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３ζは完全にコンピテントな活性化シグナルを提供することができないので、追加の共刺激シグナル伝達が必要かもしれない。共刺激ドメインの例には、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７およびＩＣＯＳからのエンドドメインが含まれ、それらは増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３ζと使用することができる。
一実施形態では、少なくとも１つの共刺激エンドドメインがＣＤ３ζと使用される。特定の実施形態では、共刺激エンドドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７およびＩＣＯＳからのエンドドメインからなる群から選択される。
別の実施形態では、少なくとも２つの共刺激エンドドメインがＣＤ３ζと使用される。特定の実施形態では、２つの共刺激エンドドメインは、任意の組合せおよび順番で、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７およびＩＣＯＳからのエンドドメインからなる群から選択される。特に好適な組合せには、ＣＤ２８およびＣＤ３ζからのエンドドメイン、ＯＸ４０およびＣＤ３ζのエンドドメイン、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζのエンドドメイン、ＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ζからのエンドドメイン、ならびにＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζからのエンドドメインが含まれる。
活性化エンドドメインを有するＣＡＲの膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、配列番号１３～１８で示す配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むことができる。
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Figure 2024040410000008
Figure 2024040410000009
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バリアント配列は、その配列が有効な膜貫通ドメインおよび有効な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供するならば、配列番号１３～１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有することができる。
本発明のＣＡＲは、配列番号２５～３６で示す配列の群からの配列を含むことができる。
Figure 2024040410000014
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４．二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
２つの抗体様結合ドメインを有する基本概念に基づいて、多種多様な分子が開発されている。
二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子は、主に抗がん薬としての使用のために開発された二重特異性抗体型分子のクラスである。それらは宿主の免疫系、より具体的にはＴ細胞の細胞傷害活性を、がん細胞などの標的細胞に対して導く。これらの分子では、一方の結合ドメインがＣＤ３受容体を経てＴ細胞に結合し、他方が腫瘍細胞などの標的細胞に結合する（腫瘍特異的分子を通して）。二重特異性分子は標的細胞およびＴ細胞の両方に結合するので、それは標的細胞をＴ細胞と近接させ、そのためＴ細胞はその効果、例えばがん細胞への細胞傷害効果を発揮することができる。Ｔ細胞：二重特異性抗体：がん細胞複合体の形成はＴ細胞でシグナル伝達を誘導し、例えば細胞傷害性メディエーターの放出につながる。理想的には、本剤は標的細胞の存在下で所望のシグナル伝達を誘導するだけであり、選択的殺傷につながる。
二重特異性Ｔ細胞エンゲージ分子はいくつかの異なるフォーマットで開発されたが、最も一般的なものの１つは、異なる抗体の２つの縦列配置された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合体である。これらは、時にはＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）として公知である。
本発明は、ＴＲＢＣ２を選択的に認識し、Ｔ細胞を活性化することが可能である二重特異性分子も企図する。例えば、分子はＢｉＴＥであってよい。
したがって別の態様では、本発明は、本発明のバリアント抗原結合ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、以降「本発明のＢｉＴＥ」を提供する。
用語「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」は、本発明の第１の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこの態様に等しく適用される。
本明細書で使用される用語「Ｔ細胞活性化ドメイン」は、Ｔ細胞を活性化することが可能な第２のドメインを指す。Ｔ細胞活性化ドメインは、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖであってよい。本発明のために好適である抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの例は当技術分野で周知であり、ＯＫＴ３に由来するｓｃＦｖが限定されずに含まれる。
二重特異性分子は、その生成を助けるシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは宿主細胞による二重特異性分子の分泌を引き起こすことができ、そのため、二重特異性分子は宿主細胞の上清から採取することができる。
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあることができる。二重特異性分子は次の一般式を有することができる：シグナルペプチド－本発明のバリアント抗原結合ドメインＴ細胞活性化ドメイン。
本発明のバリアント抗原結合ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインを連結し、２つのドメインを空間的に分離するために、二重特異性分子はスペーサー配列を含むことができる。
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含むことができる。リンカーは、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークに類似した長さおよび／またはドメイン間隔特性を有する代わりのリンカー配列を代わりに含むことができる。
５．核酸
別の態様では、本発明は、本発明のバリアント抗原結合ドメインをコードする核酸配列、以降「本発明の第１の核酸」も提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸配列、以降「本発明の第２の核酸」も提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のＣＡＲをコードする核酸配列、以降「本発明の第３の核酸」も提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のＢｉＴＥをコードする核酸配列、以降「本発明の第４の核酸」も提供する。
用語「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」、「本発明の抗体」および「本発明のＢｉＴＥ」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこれらの態様に等しく適用される。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であるものとする。
遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードする可能性があることが当業者には理解される。さらに、当業者は、ポリペプチドを発現する任意の特定の宿主生物体のコドン使用を反映するために、常套的な技法を使用して本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行うことができることが理解されるべきである。
本発明の核酸配列および構築物は、相同組換えを回避するために、同じかまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域に、代わりのコドンを含有することができる。
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。それは、合成または修飾されたヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつもの異なる型の修飾が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端へのアクリジン鎖またはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書に記載の通り使用するために、当技術分野において利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを修飾できることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏにおける活性または寿命を増強するために行うことができる。
ヌクレオチド配列と関連した「バリアント」、「相同体」または「誘導体」という用語は、配列からまたは配列への１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変動、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。
６．ベクター
本発明は、本発明の１つまたは複数の核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットも提供する。そのようなベクターは、それが本発明のバリアント抗原結合分子、または抗体、またはＣＡＲ、またはＢｉＴＥを発現するように、核酸配列を宿主細胞に導入するために使用することができる。
用語「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」、「本発明の抗体」および「本発明のＢｉＴＥ」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこれらの態様に等しく適用される。
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターもしくは合成ｍＲＮＡであってよい。
ベクターは、細胞溶解性免疫細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができるものであってよい。
７．細胞
本発明の別の態様は、本発明のＣＡＲを含む細胞、以降「本発明の細胞」に関する。
細胞は、本発明の核酸またはベクターを含むことができる。
用語「本発明のＣＡＲ」、「本発明の核酸」、「本発明のベクター」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこれらの態様に等しく適用される。
細胞は、細胞溶解性免疫細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞であってよい。
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫で中心的な役割を演ずるタイプのリンパ球である。それらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球、例えばＢ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）から区別することができる。下で要約される通り、各種のＴ細胞がある。
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟化、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含めた免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。これらの細胞は、異なる型の免疫応答を促進するような異なるサイトカインを分泌する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含めたいくつかの亜型のうちの１つに分化し得る。
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関係づけられる。ＣＴＬは、表面上にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに付随する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞から分泌されるＩＬ－１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞を不活性化してアネルギーの状態にすることができ、それにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。
メモリーＴ細胞は、感染が消散した後、長期間存続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。これらは、同族抗原に再曝露されると直ちに増大して多数のエフェクターＴ細胞になり、そうすることで、過去の感染に対する「メモリー」による免疫系をもたらす。メモリーＴ細胞は、３つの亜型：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）およびエフェクターメモリーＴ細胞の２つの型（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、一般には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として公知であり、免疫寛容を維持するために極めて重要である。それらの主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫をシャットダウンして免疫反応の終わりに向かわせること、および胸腺における負の選択のプロセスを免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
２種の主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が記載されている－天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞。
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様樹状細胞（ＣＤ１２３＋）との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と称される細胞内分子が存在することにより、他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異により、調節性Ｔ細胞の発生が妨げられ、それにより、致死的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされる可能性がある。
適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答の間に生じる可能性がある。
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であってよい。ＮＫ細胞は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞により、ウイルス感染細胞からの生得的なシグナルに対する迅速な応答がＭＨＣ非依存的にもたらされる。
ＮＫ細胞（生得的なリンパ系細胞の群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ系前駆細胞から分化する第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、次いでそこから循環中に入ることが公知である。
本発明の細胞は、上で指摘した細胞型のいずれかであってよい。一実施形態では、本発明の細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、本発明の細胞はＮＫ細胞である。
本発明のこの態様にしたがう細胞は、患者自身の末梢血（第一者）から、または造血幹細胞移植の状況ではドナー末梢血（第二者）から、または無関係のドナー（第三者）からの末梢血からｅｘ ｖｉｖｏで作製することができる。
あるいは、本発明のこの態様にしたがう細胞は、誘導可能な前駆体細胞または胚性前駆体細胞の細胞溶解性細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ分化に由来してもよい。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる不死化された細胞溶解細胞系、例えばＴまたはＮＫ細胞を使用することができる。
全てのこれらの実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、ウイルスベクターの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによって、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
本発明の細胞は、対象からのｅｘ ｖｉｖｏ細胞であってよい。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料からのものであってよい。細胞、特にＴまたはＮＫ細胞などの細胞溶解性細胞は、本発明のＣＡＲを提供する分子をコードする核酸が形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体による処理によって活性化および／または増量することができる。
本発明の細胞は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む本発明のベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップを含む方法によって作製することができる。
本発明の細胞を作製するための方法は、形質導入またはトランスフェクションステップの前に、対象または上記の他の供与源からの細胞含有試料から細胞を単離するステップをさらに含むことができる。細胞が細胞溶解性細胞である場合、試料は対象からの細胞溶解性細胞含有試料である。
本発明との関連で使用される用語「対象」または「個体」は、哺乳動物種のメンバー、好ましくは任意の年齢または人種の雄または雌のヒトを指す。
本発明の細胞は、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインの発現に基づく選択によって次に精製することができる。
８．コンジュゲート
本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体は、バリアント抗原結合ドメインまたは抗体のコンジュゲートであってよく、例えば、コンジュゲートは検出可能な実体または化学療法用実体であってよい。
用語「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」および「本発明の抗体」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこれらの態様に等しく適用される。
検出可能な実体は、蛍光部分、例えば蛍光ペプチドであってよい。本明細書で使用される用語「蛍光ペプチド」は、励起の後に検出可能な波長の光を放出するポリペプチドを指す。蛍光タンパク質の例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびｍＣｈｅｒｒｙが限定されずに含まれる。
検出可能な実体とコンジュゲートされる本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体は、悪性Ｔ細胞のＴＲＢＣを決定するために使用することができる。
本明細書で使用される用語「化学療法用実体」は細胞に破壊的である実体を指し、すなわちその実体は細胞の生存能力を低減する。生じるコンジュゲートは、以降「本発明の化学療法用コンジュゲート」と呼ばれる。化学療法用実体は、細胞傷害性薬物であってよい。企図される化学療法剤には、アルキル化剤、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、スルホン酸アルキル、代謝拮抗薬、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン、Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素；生物学的反応修飾物質、例えばＩＦＮα、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦ；白金配位錯体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン、アントラセンジオン、ヒドロキシウレアなどの置換尿素、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬、例えばミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、例えばプレドニゾンおよび等価物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミドを含むホルモンおよびアンタゴニスト；プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン薬、例えばタモキシフェン；アンドロゲン、例えばプロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物；抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリド；ならびに非ステロイド性抗アンドロゲン薬、例えばフルタミドが限定されずに含まれる。
化学療法用実体とコンジュゲートされる本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体は、ＴＲＢＣ２を発現する細胞への化学療法用実体の標的化送達を可能にする。
９．医薬組成物
本発明は、本発明の細胞または複数の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲートを含有する医薬組成物、以降「本発明の医薬組成物」にも関する。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことができる。医薬組成物は、１つまたは複数のさらなる薬学活性ポリペプチドおよび／または化合物を必要に応じて含むことができる。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形であってよい。
用語「本発明の細胞」、「本発明の抗体」、「本発明のＢｉＴＥ」および「本発明の化学療法用コンジュゲート」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこれらの態様に等しく適用される。
投与
本発明の細胞または複数の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲートの投与は、活性成分を生物的に利用可能にする様々な経路のいずれかを使用して達成することができる。例えば、薬剤は、経口および非経口経路により、腹腔内、静脈内、皮下、経皮的、筋肉内に局所送達を通して、例えば、カテーテルまたはステントによって投与することができる。
一般的に、医師は個々の対象のために最も好適である実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重および応答によって異なる。投与量は、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するクローンＴ細胞の数を低減または減少させるのに十分であるようなものである。
１０．処置の方法
別の態様では、本発明は、薬で使用するための本発明の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲートを提供する。
別の態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を処置するための方法、以降「本発明の処置方法」であって、本発明の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲートを対象に投与するステップを含み、悪性Ｔ細胞はＴＲＢＣ２を発現する方法を提供する。投与ステップは、前記のように医薬組成物の形であってよい。
本発明のこの態様は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の処置で使用するための本発明の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲート、以降「本発明の使用のための細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲート」として代わりに製剤化することができ、ここで、悪性Ｔ細胞はＴＲＢＣ２を発現する。
本発明のこの態様は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病を処置するための薬の製造における、本発明の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲートの使用として代わりに製剤化することができ、ここで、悪性Ｔ細胞はＴＲＢＣ２を発現する。
用語「本発明の細胞」、「本発明の抗体」、「本発明のＢｉＴＥ」、「対象」および「本発明の化学療法用コンジュゲート」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこれらの態様に等しく適用される。
Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための方法は、本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートの治療的使用に関する。本明細書において、本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートは、疾患に関連した少なくとも１つの症状を軽くするか、低減するか、向上させるために、および／または疾患の進行を遅くするか、低減するか、ブロックするために、既存のＴ細胞リンパ腫および／または白血病を有する対象に投与することができる。
Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を予防するための方法は、本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートの予防的使用に関する。本明細書において、そのような細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートは、疾患の原因を阻止するか減じるために、または疾患に関連した少なくとも１つの症状の発生を低減するか阻止するために、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病にまだかかっていない対象に、および／またはＴ細胞リンパ腫および／または白血病のいかなる症状も示していない対象に投与することができる。対象は、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病の素因を有してもよいか、それを起こす危険があると考えることができる。
方法は、以下のステップを含むことができる：
（ｉ）細胞傷害性細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）本発明によって提供される核酸配列またはベクターをそのような細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップ。
細胞傷害性細胞含有試料は、対象からまたは例えば前記のように他の供与源から単離することができる。ＴまたはＮＫなどの細胞傷害性細胞は、対象自身の末梢血（第一者）から、または造血幹細胞移植の状況ではドナー末梢血（第二者）から、または無関係のドナー（第三者）からの末梢血から単離することができる。
Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病を処置するための方法は、薬剤の治療的使用に関する。本明細書において、薬剤は、疾患に関連した少なくとも１つの症状を軽くするか、低減するか、向上させるために、および／または疾患の進行を遅くするか、低減するか、ブロックするために、Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病の既存の疾患を有する対象に投与することができる。
これらの治療的適用は、本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートの治療有効量の投与を含む。
本明細書で使用される用語「治療有効量」は、本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートの、ＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病の１つまたは複数の症状の評価可能な予防、治癒、遅延、その重症度の低減、または改善を達成するのに必要とされる量を指す。
本発明の方法は、ＴＲＢＣ２を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞のクローン増大に関連した任意のリンパ腫および／または白血病の処置のために使用することができる。このように、本発明は、ＴＲＢＣ２を含むＴＣＲを発現する悪性Ｔ細胞が関与する疾患を処置するための方法に関する。
本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ２を含むＴＣＲを発現するＴ細胞リンパ腫を処置するために使用することができる。「リンパ腫」はその標準の意味によって本明細書で使用され、リンパ節で一般的に発生するが、脾臓、骨髄、血液および他の臓器を侵すこともできるがんを指す。リンパ腫は、リンパ細胞の固形腫瘍として一般的に現れる。リンパ腫に関連した一次症状はリンパ節腫大であるが、二次性の（Ｂ）症状は、発熱、寝汗、体重減少、食欲不振、疲労、呼吸困難およびかゆみを含むことができる。
本発明の方法は、悪性Ｔ細胞がＴＲＢＣ２を含むＴＣＲを発現するＴ細胞白血病を処置するために使用することができる。「白血病」は本明細書でその標準の意味によって使用され、血液または骨髄のがんを指す。
以下は、本発明の方法によって処置することができる疾患の例示的な、包括的ではない一覧である。
末梢性Ｔ細胞リンパ腫
末梢性Ｔ細胞リンパ腫は、比較的稀なリンパ腫であり、全ての非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の１０％未満を占める。しかし、それらは侵攻性の臨床経過を伴い、大多数のＴ細胞リンパ腫の原因および正確な細胞起源は未だ十分に定義されていない。
リンパ腫は、通常、まず頸部、脇の下または鼠径部の腫脹として現れる。例えば脾臓内など、他のリンパ節が位置する場所に追加的な腫脹が生じる可能性がある。一般に、腫大したリンパ節は、血管、神経、または胃の空間を侵害し、それぞれ腕および脚の膨張、刺痛およびしびれ、または満腹感が生じる可能性がある。リンパ腫の症状としては、発熱、悪寒、不明の体重減少、寝汗、嗜眠、およびそう痒などの非特異的な症状も挙げられる。
ＷＨＯ分類では、末梢性Ｔ細胞リンパ腫に関して予後および治療に意味のあるカテゴリー化を詳細に説明するために、形態的特徴および免疫表現型特徴と、臨床的態様およびいくつかの症例では遺伝学を併せて利用する（Ｓｗｅｒｄｌｏｗら；ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ． 第４版；Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ Ｐｒｅｓｓ；２００８年）。腫瘍性Ｔ細胞の解剖学的局在化は、一部において、それらの提唱された正常細胞対応物および機能と並行し、そのため、Ｔ細胞リンパ腫はリンパ節および末梢血に関連する。この手法により、細胞分布、形態のいくつかの態様、さらには関連する臨床所見を含めた、Ｔ細胞リンパ腫の顕在化のいくつかをよりよく理解することが可能になる。
最も一般的なＴ細胞リンパ腫は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）であり、これが全体の２５％を占め、その次に血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）（１８．５％）が続く。
他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）
ＰＴＣＬ－ＮＯＳは、全ての末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の２５％超を占め、最も一般的な亜型である。これは、除外診断によって決定され、現行のＷＨＯ ２００８に列挙されている特定の成熟Ｔ細胞リンパ腫実体のいずれにも対応しない。そのため、これは、他に特定されないびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ－ＮＯＳ）と類似している。
大多数の患者は成人であり、年齢の中央値は６０歳であり、男女比は２：１である。大多数の症例は結節起源であるが、患者のおよそ１３％で結節外症状が生じ、最も一般的には皮膚および胃腸管が関与する。
細胞学的スペクトルは非常に広範であり、多形から単一形までにわたる。リンパ類上皮（レンネルト）バリアント、Ｔゾーンバリアントおよび濾胞バリアントを含めた、３つの形態学的に定義されたバリアントが記載されている。ＰＴＣＬのリンパ類上皮バリアントは、豊富なバックグラウンド類上皮細胞組織球を含有し、一般にＣＤ８について陽性である。それは、より良い予後と関連付けられている。ＰＴＣＬ－ＮＯＳの濾胞バリアントは、潜在的に別個の臨床病理学的実体として出現し始めている。
大多数のＰＴＣＬ－ＮＯＳは成熟Ｔ細胞表現型を有し、大多数の症例はＣＤ４陽性である。症例の７５％で少なくとも１つの汎Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５またはＣＤ７）の可変性の喪失が示され、ＣＤ７およびＣＤ５は、最もしばしば下方制御される。ＣＤ３０および稀にＣＤ１５が発現する場合があり、ＣＤ１５は有害な予後の特徴である。ＣＤ５６発現も、稀であるが、負の予後の影響を有する。追加的な有害な病理的予後因子としては、ＫＩ－６７発現に基づいて増殖率が２５％を超えること、および形質転換された細胞が７０％超存在することが挙げられる。これらのリンパ腫の免疫表現分析からもたらされるそれらの生物学への洞察はわずかである。
血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）
ＡＩＴＬは、リンパ節が関与する多形浸潤、顕著な高内皮細静脈（ＨＥＶ）および濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）網目構造の血管周囲増大を特徴とする全身性疾患である。ＡＩＴＬは、通常は胚中心において見いだされる、濾胞ヘルパー型のαβ Ｔ細胞（ＴＦＨ）に由来するデノボのＴ細胞リンパ腫と考えられる。
ＡＩＴＬは、末梢性Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫の中で２番目に一般的な実体であり、症例の約１８．５％を占める。それは、中年～高齢の成人において生じ、年齢の中央値は６５歳であり、発生率は男性と女性でほぼ同等である。臨床的に、患者は、通常、全身リンパ節腫脹、肝脾腫および顕著な体質性症状を伴う進行期疾患を有する。そう痒を伴う皮疹が一般に存在する。多くの場合、自己免疫性現象に関連したポリクローナル高ガンマグロブリン血症が存在する。
ＡＩＴＬでは３つの異なる形態的パターンが記載されている。ＡＩＴＬの初期病変（パターンＩ）では、通常、特徴的な過形成性卵胞を伴う保存されたアーキテクチャが示される。腫瘍性増殖が卵胞の末梢に局在している。パターンＩＩでは、結節のアーキテクチャが部分的に消滅し、わずかに退行した卵胞が保持される。被膜下洞は保存され、さらには拡大する。傍皮質は分枝ＨＥＶを含有し、Ｂ細胞卵胞を超えてＦＤＣが増殖する。新生物細胞は小～中サイズであり、細胞学的な非定型性は最小である。それは、多くの場合、澄明～ぼんやりした細胞質を有し、はっきりした細胞膜を示し得る。通常は多形炎症性バックグラウンドが明らかである。
ＡＩＴＬはＴ細胞悪性腫瘍であるが、Ｂ細胞および形質細胞が特徴的に増大し、これは、新生物細胞のＴＦＨ細胞としての機能を反映すると思われる。ＥＢＶ陽性Ｂ細胞およびＥＢＶ陰性Ｂ細胞が両方存在する。場合によって、非定型Ｂ細胞はホジキン／リード・シュテルンベルク様細胞と形態学的におよび免疫表現型的に類似するときがあり、時には、その実体との診断的錯乱が生じる。ＡＩＴＬにおけるＢ細胞増殖は広範囲にわたる可能性があり、一部の患者では二次性ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）またはより稀にＥＢＶ陰性Ｂ細胞腫瘍が発生し、多くの場合、形質細胞性分化を伴う。
ＡＩＴＬの腫瘍性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＤ１０およびＣＤ２７９（ＰＤ－１）の強力な発現を示し、そして、ＣＸＣＬ１３について陽性である。ＣＸＣＬ１３により、ＨＥＶへの接着を介したリンパ節へのＢ細胞動員の増加、Ｂ細胞活性化、形質細胞性分化およびＦＤＣ網目構造の増大が導かれ、これらは全て、ＡＩＴＬの形態的特徴および臨床的特徴に寄与する。濾胞周囲の腫瘍細胞における強いＰＤ－１発現が、ＡＩＴＬパターンＩと反応性濾胞および傍皮質過形成との区別に特に役立つ。
ＰＴＣＬ－ＮＯＳの濾胞バリアントは、ＴＦＨ表現型を有する別の実体である。ＡＩＴＬと対比して、それは、顕著なＨＥＶまたはＦＤＣ網目構造の濾胞外増大を有しない。新生物細胞が、Ｂ細胞濾胞性リンパ腫を模倣する濾胞内凝集体を形成する可能性があるが、濾胞間の成長パターンを有するまたは外套帯の増大を伴う可能性もある。臨床的に、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの濾胞バリアントは、患者が部分的なリンパ節の関与を伴う初期疾患を示す頻度がより多く、そしてＡＩＴＬに関連する体質性症状がない場合があるので、ＡＩＴＬとは別個のものである。
未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）
ＡＬＣＬは、ＡＬＣＬ－「未分化リンパ腫キナーゼ」（ＡＬＫ）＋またはＡＬＣＬ－ＡＬＫ－に細分され得る。
ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の中で最もよく定義された実体の１つであり、蹄鉄形の核を有し、ＡＬＫおよびＣＤ３０を発現する特徴的な「特質細胞」を有する。それは、全ての末梢性Ｔ細胞およびＮＫ－細胞リンパ腫の約７％を占め、人生の最初の３０年で最も一般的なものである。患者は、多くの場合リンパ節腫脹を示すが、結節外の部位（皮膚、骨、軟部組織、肺、肝臓）への関与およびＢ症状が一般的である。
ＡＬＣＬ、ＡＬＫ＋は広い形態スペクトルを示し、５つの異なるパターンが記載されているが、全てのバリアントが何らかの特質細胞を含有する。特質細胞は偏心性の蹄鉄形または腎臓形の核、および顕著な核周囲の好酸性ゴルジ領域を有する。腫瘍細胞は、洞関与に偏好した粘着性パターンで成長する。小細胞バリアントではより小さな腫瘍細胞が優性であり、リンパ組織球性バリアントでは、豊富な組織球により腫瘍細胞の存在が遮蔽され、その多くが小さなものである。
定義によれば、全症例でＡＬＫおよびＣＤ３０陽性が示され、発現は、通常はより小さな腫瘍細胞においてより弱い。多くの場合、汎Ｔ細胞マーカーが欠如し、症例の７５％でＣＤ３の表面発現が欠如している。
ＡＬＫ発現は、キメラタンパク質の発現をもたらす、第２染色体ｐ２３上のＡＬＫ遺伝子の、多くのパートナー遺伝子のうちの１つへの再構成からなる特徴的な再発性遺伝子変更の結果である。症例の７５％において生じる最も一般的なパートナー遺伝子は、第５染色体ｑ３５上のヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）であり、ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）をもたらす。異なる転座バリアントにおけるＡＬＫの細胞分布は、パートナー遺伝子に応じて変動し得る。
ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－は、２００８ ＷＨＯ分類に暫定的なカテゴリーとして含まれる。それは、粘着性成長パターンおよび特質細胞の存在を伴い、形態学的にはＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋と区別できないが、ＡＬＫタンパク質の発現を欠くＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ腫と定義される。
患者は、通常、４０歳から６５歳の間の成人であり、これは、小児および若年成人においてより一般的であるＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋とは対照的である。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－では、リンパ節および結節外組織のどちらも関与する可能性があるが、後者はＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋において見られるよりも一般的でない。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－の大多数の症例で、典型的な「特質」特徴を有する粘着性新生物細胞のシートによるリンパ節アーキテクチャの消滅が実証される。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋とは対照的に、小細胞形態バリアントは認識されていない。
ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－では、そのＡＬＫ＋対応物とは異なり、表面Ｔ細胞マーカー発現のより大きな保存が示されるが、細胞傷害性マーカーおよび上皮膜抗原（ＥＭＡ）の発現は可能性がより低い。遺伝子発現シグネチャおよび再発性染色体不均衡はＡＬＣＬ－ＡＬＫ－とＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋とで異なり、これらが分子レベルおよび遺伝子レベルで別個の実体であることが確認される。
ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－は、ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋およびＰＴＣＬ－ＮＯＳのどちらとも臨床的に別個のものであり、これらの３つの異なる実体で予後に顕著な差がある。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－の５年全生存率は４９％と報告されており、これはＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋の５年全生存率（７０％）ほど良好ではないが、同時に、ＰＴＣＬ－ＮＯＳの５年全生存率（３２％）よりも顕著に良好である。
腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）
ＥＡＴＬは、腸の上皮内Ｔ細胞に由来すると考えられる侵攻性新生物である。２００８
ＷＨＯ分類ではＥＡＴＬの形態学的、免疫組織化学的かつ遺伝学的に別個の型が２種類認識されている：Ｉ型（大多数のＥＡＴＬを表す）およびＩＩ型（症例の１０～２０％を占める）。
Ｉ型ＥＡＴＬは、通常、顕性または臨床的に無症候性のグルテン過敏性腸症を伴い、北欧人血統の患者において見られることがより多く、これは、この集団ではセリアック症の分布率が高いことに起因する。
最も一般的に、ＥＡＴＬの病変は空腸または回腸において見られ（症例の９０％）、稀に十二指腸、結腸、胃、または胃腸管の外部の領域において現れる。腸の病変は通常は多巣性であり、粘膜の潰瘍形成を伴う。ＥＡＴＬの臨床経過は侵攻性であり、大多数の患者が疾患または疾患の合併症で１年以内に死亡する。
ＥＡＴＬ Ｉ型の細胞学的スペクトルは広範であり、いくつかの症例は未分化の細胞を含有する場合がある。いくつかの症例では、腫瘍性成分を不明瞭にさせ得る多形炎症性バックグラウンドが存在する。腫瘍に隣接する領域内の腸粘膜は、多くの場合、病変性前駆細胞を表し得る絨毛の平滑化および上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の数の増加を伴うセリアック症の特徴を示す。
免疫組織化学によると、新生物細胞は、多くの場合、ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ７＋ＣＤ５－ＣＤ５６－βＦ１＋であり、細胞傷害性顆粒関連タンパク質（ＴＩＡ－１、グランザイムＢ、パーフォリン）を含有する。ほとんど全ての症例でＣＤ３０が部分的に発現される。粘膜ホーミング受容体であるＣＤ１０３がＥＡＴＬで発現される可能性がある。
ＩＩ型ＥＡＴＬは、単形性ＣＤ５６＋腸Ｔ細胞リンパ腫とも称され、ＣＤ８とＣＤ５６との両方を発現する小～中型の単形性Ｔ細胞で構成される腸の腫瘍と定義される。多くの場合、粘膜内で腫瘍が側方拡散し、炎症性バックグラウンドは存在しない。大多数の症例でγδ ＴＣＲが発現されるが、αβ ＴＣＲを伴う症例もある。
ＩＩ型ＥＡＴＬは、Ｉ型ＥＡＴＬよりも世界的に分布しており、多くの場合、セリアック症が稀であるアジア人またはラテンアメリカ系集団において見られる。ヨーロッパ血統の個体では、ＥＡＴＬ、ＩＩは腸Ｔ細胞リンパ腫の約２０％を表し、症例の少なくともサブセットにおいてセリアック症の病歴を伴う。臨床経過は侵攻性である。
肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）
ＨＳＴＬは、一般に自然免疫系のγδ細胞傷害性Ｔ細胞に由来する侵攻性の全身性新生物であるが、稀な症例ではαβ Ｔ細胞に由来することもあり得る。これは最も稀なＴ細胞リンパ腫の１つであり、一般には、青年および若年成人（年齢の中央値、３５歳）に影響を及ぼし、強力に男性優性である。
節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型
節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型は、侵攻性疾患であり、多くの場合、破壊的な正中病変および壊死を伴う。大多数の症例はＮＫ細胞に由来するが、いくつかの症例は細胞傷害性Ｔ細胞に由来する。これは、普遍的にエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する。
皮膚Ｔ細胞リンパ腫
本発明の方法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を処置するためにも使用することができる。
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、悪性Ｔ細胞の皮膚への遊走を特徴とし、これにより種々の病変が出現する。これらの病変は疾患が進行するにつれて形状が変化し、一般には、発疹と思われるもので始まり、最終的にプラークおよび腫瘍が形成された後、体の他の部分に転移する。
皮膚Ｔ細胞リンパ腫としては、以下の例示的な、包括的ではない一覧に記載されるものが挙げられる；菌状息肉腫、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞型リンパ腫、非菌状息肉腫ＣＤ３０－皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫および血管中心性リンパ腫。
ＣＴＣＬの徴候および症状は、特定の疾患に応じて変動し、そのうち２つの最も一般的な型は菌状息肉腫およびセザリー症候群である。古典的な菌状息肉腫は３つの病期：
－斑（萎縮性または非萎縮性）：非特異的皮膚炎、体幹下部および臀部の斑；そう痒が最小／存在しない；
－プラーク：強いそう痒性プラーク、リンパ節腫脹；および
－腫瘍：潰瘍形成易発性
に分けられる。
セザリー症候群は、紅皮症および白血病によって定義される。徴候および症状としては、浮腫状皮膚、リンパ節腫脹、手掌および／または足底の角質増殖、脱毛症、爪ジストロフィー、外反および肝脾腫が挙げられる。
全ての原発性皮膚リンパ腫の中で、６５％がＴ細胞型である。最も一般的な免疫表現型はＣＤ４陽性である。皮膚Ｔ細胞リンパ腫という用語には多種多様な障害が包含されるので、これらの疾患には共通の病態生理は存在しない。
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち、菌状息肉腫）の発生についての一次的な病因機構は解明されていない。菌状息肉腫には、Ｔ細胞媒介性慢性炎症性皮膚疾患が先行する可能性があり、これは、場合によって、致死性リンパ腫に進行する場合がある。
原発性皮膚ＡＬＣＬ（Ｃ－ＡＬＣＬ）
Ｃ－ＡＬＣＬは、多くの場合、形態ではＡＬＣ－ＡＬＫ－と区別できない。これは、細胞の７５％超がＣＤ３０を発現する未分化形態、多形性形態または免疫芽球性形態の大細胞の皮膚腫瘍と定義される。リンパ腫様丘疹症（ＬｙＰ）と共に、Ｃ－ＡＬＣＬは一次皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ球増殖性障害のスペクトルに属し、これは群として、菌状息肉腫の次に２番目に多い皮膚Ｔ細胞リンパ球増殖の群を含む。
免疫組織化学的染色プロファイルは、ＡＬＣＬ－ＡＬＫ－とかなり類似しており、細胞傷害性マーカーについて染色陽性である症例の割合がより大きい。腫瘍細胞の少なくとも７５％がＣＤ３０について陽性のはずである。ＣＤ１５も発現し、そして、リンパ節の関与が生じた場合、古典的なホジキンリンパ腫との弁別が難しい可能性がある。ＡＬＣＬ－ＡＬＫ＋の稀な症例は、局在する皮膚病変を示す可能性があり、そしてＣ－ＡＬＣＬと類似する可能性がある。
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病
Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）は、小児コホートのＡＬＬの約１５％を占め、成人コホートのＡＬＬの約２５％を占める。患者は、通常、高白血球数を有し、そして臓器肥大、特に縦隔肥大およびＣＮＳの関与を示す可能性がある。
本発明の方法は、ＴＲＢＣを含むＴＣＲを発現する悪性Ｔ細胞に関連するＴ－ＡＬＬを処置するために使用することができる。
Ｔ細胞前リンパ球性白血病
Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）は、侵攻性の挙動ならびに血液、骨髄、リンパ節、肝臓、脾臓、および皮膚の関与への偏好を伴う成熟Ｔ細胞白血病である。Ｔ－ＰＬＬは、主に３０歳を超える成人に影響を及ぼす。他の名称として、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病、「こぶ状」型Ｔ細胞白血病、およびＴ前リンパ球性白血病／Ｔ細胞リンパ球性白血病が挙げられる。
末梢血では、Ｔ－ＰＬＬは、場合によってブレブまたは突起を伴う単一の核小体および好塩基性細胞質を有する中型リンパ球からなる。核は、通常、丸形から卵形の形状であり、患者は場合によって、セザリー症候群において見られる大脳様核形状と同様の、核の輪郭がより不規則な細胞を有する。小細胞バリアントは全てのＴ－ＰＬＬ症例の２０％を占め、セザリー細胞様（大脳様）バリアントは症例の５％に見られる。
Ｔ－ＰＬＬは成熟（胸腺後）Ｔリンパ球の免疫表現型を有し、新生物細胞は、一般には汎Ｔ抗原ＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ７について陽性であり、ＴｄＴおよびＣＤ１ａについては陰性である。免疫表現型ＣＤ４＋／ＣＤ８－は症例の６０％に存在し、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋免疫表現型は２５％に存在し、ＣＤ４－／ＣＤ８＋免疫表現型は症例の１５％に存在する。
処置または予防すべきＴ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
処置方法は、本発明の細胞もしくは複数の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲートの治療量を投与するステップを含むことができる。当業者は、従来の方法によって患者に治療効果を発揮することができる、本発明の細胞もしくは複数の細胞、または抗体、またはＢｉＴＥ、または化学療法用コンジュゲートの量を決定することができる。
１１．診断剤
ＴＲＢＣ２＋に対してＴＲＢＣ１＋である健康なドナーからのＴ細胞の割合が６５％に対して３５％であると以前に決定され、すなわち、ＴＲＢＣ１を発現する全体のＴ細胞の中央百分率は３５％（範囲、２５～４７％）であった（Maciocia et al., 2017, Nat
Med 23:1416-23）。Ｔ細胞リンパ腫または白血病はクローンのがんである（Maciocia
et al., 2017；上記）ので、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の特徴である悪性Ｔ細胞の無制限の増殖は、ＴＲＢＣ１＋またはＴＲＢＣ２＋Ｔ細胞（すなわち、ＴＲＢＣ２－またはＴＲＢＣ１－Ｔ細胞）のかなりゆがめられた割合をもたらす。したがって、ＴＲＢＣ２に特異的に結合し、したがってＴＲＢＣ１とＴＲＢＣ２を区別することが可能であることによって、本発明のバリアント抗原結合ドメインおよび抗体は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の診断のための有益な薬剤となる。
したがって、別の態様では、本発明は、本発明のバリアント抗原結合ドメインを含む診断剤、以降「本発明の第１の診断剤」を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体を含む診断剤、以降「本発明の第２の診断剤」を提供する。用語「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」および「本発明の抗体」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこれらの態様に等しく適用される。
これらのアッセイで使用される本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体は、標識されても非標識であってもよい。本明細書で使用される用語「検出可能な標識」または「標識剤」は、検出のための好適な手順および装置を使用した、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段による、それが付着する分子の検出、局在化および／または同定を可能にする分子標識を指す。抗体を標識するのに好適である標識剤には、放射性核種、酵素、蛍光体、化学発光試薬、酵素基質または補因子、酵素阻害物質、粒子、色素および誘導体などが含まれる。当業者が理解するように、標識されないバリアント抗原結合ドメインおよび抗体は、追加の試薬、例えば標識される二次抗体で検出する必要がある。これは検出方法の感度を増加させるために特に有益であるが、その理由はそれがシグナルの増幅を可能にするからである。標識されない本発明の抗体（一次抗体）および標識される本発明の抗体（二次抗体）を使用する、本発明で使用できる多様な従来のアッセイがある；これらの技術には、ウエスタンブロットまたはイムノブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合的ＥＩＡ（競合的酵素免疫検定法）、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチ－ＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的技術、フローサイトメトリー、または本発明の抗体を含むタンパク質マイクロスフェア、バイオチップまたはマイクロアレイの使用に基づく多重検出技術が含まれる。本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体を使用したＴＲＢＣ２を検出および定量化する他の方法には、親和性クロマトグラフィー技術またはリガンド結合アッセイが含まれる。
診断剤は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病を診断するために使用することができる。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
１２．診断の方法
別の態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞リンパ腫または白血病を診断するための方法、以降「本発明の診断方法」であって、本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体を対象からのＴ細胞を含む試料と接触させるステップを含む方法を提供する。
用語「本発明のバリアント抗原結合ドメイン」、「本発明の抗体」および「対象」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこの態様に等しく適用される。
本発明の診断方法は、試料中のＴＲＢＣ２陽性のＴ細胞の百分率を決定するステップをさらに含むことができる。
本発明の第１の方法を実施するために、生体試料などのＴ細胞を含む試料が研究対象から得られる。本明細書で使用される用語「試料」または「生体試料」は、Ｔ細胞を含む侵された臓器の異なるタイプの生体液または組織切片を含む。本発明の診断方法で有益な試料の例示的な非限定的な例には、Ｔ細胞を含む異なるタイプの生体液、例えば血液、リンパおよび髄液が含まれる。これらの生体液試料は、当業者に公知である任意の従来の方法によって得られる。あるいは、前記試料は、例えば生検または外科切除によって任意の従来の方法によって得られる、例えばリンパ腺、脾臓、扁桃または胸腺からの、ならびに組織学目的のためにとられる冷凍切片からの侵された臓器組織試料の切片であってもよい。
本発明の診断方法の第１のステップにより、本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体は、当業者に公知である好適な条件の下で研究対象からの試料と接触させる。
当業者は試料中のＴＲＢＣ２を検出するために、本発明の診断方法の第２のステップを実行するのに好適であるいくつかの従来の方法を使用することができる。免疫学的方法が、特に有益である。したがって、本発明の第１または第２の診断剤の使用は、本発明による診断方法を実行するために特に有益かもしれない。本発明の診断剤の特色および特定の実施形態は前に規定され、本発明の診断方法に等しく適用される。
本発明の診断方法では、試料中の７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれよりも高い百分率のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病の存在を示すことができる。
当業者によって理解される通り、予測は、診断または評価される対象の１００％で正しいことが好ましいがその必要はない。しかしこの用語は、対象の統計的に有意な一部が所与の結果を有する確率が増加したと特定できることを必要とする。対象から得られるデータが統計的に有意かどうかは、様々な周知の統計量評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値決定、交差検証分類評価等を使用して当業者が難なく決定することができる。詳細はDowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０１または０．００５またはそれよりも低い。
さらに、ＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞に特異的に結合するそれらの能力を考慮すると、本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体は、Ｔ細胞リンパ腫または白血病のｉｎ ｖｉｖｏ診断で使用することもできる。例えば、それらは医療用画像化、すなわち臨床目的、例えば疾患を明らかにするか、診断するかまたは検査しようとする医学的手順のために体（または、その部分および機能）、例えばヒトの体の画像を作製するために使用される技術およびプロセスのセットで使用することができる。
この目的のために、本発明のバリアント抗原結合ドメインまたは抗体は、当技術分野で公知である好適な方法によって標識され、例えば、適当な分子、例えば放射性同位体または蛍光色素との結合および／または投入による診断画像化方法、例えば、放射免疫診断、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、内視鏡検査免疫蛍光法等のための薬剤として提供される。本発明のバリアント抗原結合ドメインおよび抗体はガンマ放射同位体に結合させ、ガンマカメラまたは単光子断層撮影を使用した放射免疫シンチグラフィーで使用することができる。本発明のバリアント抗原結合ドメインおよび抗体は、陽電子放射体に結合させてＰＥＴで使用することができる。本発明のバリアント抗原結合ドメインおよび抗体はＣｙ３、Ｃｙ２、Ｃｙ５またはＦＩＴＣなどの蛍光色素に結合させ、内視鏡検査免疫蛍光法で使用することができる。記載される通りに改変される本発明のバリアント抗原結合ドメインおよび抗体は、任意の好適な経路、例えば静脈内に個体に適当な用量で投与され、ＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の位置が当技術分野で周知であるプロセスによって検出、決定または測定される。診断画像化を含む本明細書で使用される方法および技術は当業者に公知であり、彼らは好適な用量製剤を提供することもできる。
診断すべきＴ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
試料は血液試料であってよいか、またはそれに由来してもよい。
１３．パーソナライズされた薬の方法
別の態様では、本発明は、本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートによる処置に適格であるＴ細胞リンパ腫または白血病の対象を同定するための方法、以降「本発明のパーソナライズされた薬の第１の方法」であって、対象からのＴ細胞を含む試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率を決定するステップを含む方法を提供する。
用語「本発明の細胞」、「本発明の抗体」、「本発明のＢｉＴＥ」、「本発明の化学療法剤」、「対象」および「Ｔ細胞を含む試料」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこの態様に等しく適用される。
本発明のパーソナライズされた薬の第１の方法では、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率が７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれよりも高い場合、対象は本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートによる前記処置に適格である。
別の態様では、本発明は、対象の処置のための本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートを含む療法を選択するための方法、以降「本発明のパーソナライズされた薬の第２の方法」であって、対象からのＴ細胞を含む試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率を決定するステップを含む方法を提供する。
用語「本発明の細胞」、「本発明の抗体」、「本発明のＢｉＴＥ」、「本発明の化学療法剤」、「対象」および「Ｔ細胞を含む試料」は、本発明の前の態様との関連で詳細に記載され、その特色および実施形態は本発明のこの態様に等しく適用される。
本発明のパーソナライズされた薬の第２の方法では、試料中のＴＲＢＣ２陽性Ｔ細胞の百分率が７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれよりも高い場合、前記対象を処置するために、本発明の細胞、抗体、ＢｉＴＥまたは化学療法用コンジュゲートを含む療法が選択される。
試料は血液試料であってよいか、またはそれに由来してもよい。
Ｔ細胞リンパ腫または白血病は、他に特定されない末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、肝脾Ｔ細胞リンパ腫（ＨＳＴＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性皮膚ＡＬＣＬ、Ｔ細胞前リンパ球性白血病およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病から選択することができる。
本発明は、実施例として今からさらに記載されるが、それらは、当業者が本発明を実行するのを支援する役目をするものであり、本発明の範囲を限定するものでは決してない。
（実施例１）
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ＴＲＢＣ２抗体の結合の分析
ＴＲＢＣ１特異的モノクローナル抗体ｈＪｏｖｉ－１の結晶構造は、ＴＲＢＣ１－ＴＣＲとの複合体で２．４Åまで解明した（図３）。コンピュータ生物学およびタンパク質工学を通して、抗ＴＲＢＣ１結合剤のいくつかの変異体バージョンを、ＴＲＢＣ１からＴＲＢＣ２に特異性を切り換えるように合理的に設計した。いくつかの抗ＴＲＢＣ２結合剤は、ＩｇＧフォーマットで生成された。表１は、ｈＪｏｖｉ－１のＶＨおよびＶＬドメインに含まれる変異の詳細を示す。
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器を使用して、シリーズＳ ＣＭ５のセンサーチップをアミン結合により固定化し、抗ヒトＦｃ捕捉抗体は９０００～１００００ＲＵの密度にした。全ての実験条件で、ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液を流動緩衝液として使用した。試験用抗ＴＲＢＣ２抗体（表１）を、１００～３００ＲＵの密度までフローセル２、３および４の上に捕捉した。既知濃度の組換え精製ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を「分析物」として使用し、３０μｌ／分の流速で１５０秒の接触時間および３００秒の解離でそれぞれのフローセルの上に注入した。各実験で、フローセル１は未改変であり、参照減算のために使用した。ドリフトを計算に入れるために、緩衝液だけの「０濃度」センサーグラムを二重参照減算として使用した。データは、１：１のラングミュア結合モデルにあてはめた。捕捉系を使用したので、各場合にデータフィッティングのために局所のＲｍａｘパラメータを使用した。
抗ＴＲＢＣ２抗体の各々で得られたＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２への親和性の結果を、表１に示す。試験用抗ＴＲＢＣ２抗体は、一般的にｎＭ範囲のＴＲＢＣ２への優先結合を示し、ｋａおよびｋｄ動態特性は様々であった。ほとんどの場合、ＴＲＢＣ１への結合は＞１μＭと判定され、値は機器の感度限界に接近していた。
（実施例２）
ＫＦＮ結合剤に基づく抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲの生成
第二世代のＣＡＲ構築物を、抗ＴＲＢＣ２三重変異体（ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ変異、配列番号２６）およびヒト化Ｊｏｖｉ－１（ｈＪｏｖｉ－１）に基づいて生成した（図４）。これらのＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、健康なドナーから得られた活性化ＰＢＭＣに形質導入するために使用した。
（実施例３）
抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲの機能的特徴付け：サイトカイン生成
ＴＲＢＣ２に対する抗ＴＲＢＣ２三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的能力を調査するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞の添加の前にＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２が固定化される、プレート結合アッセイが使用された。７２時間後、培養上清を収集し、ＩＦＮ－γ生成をＥＬＩＳＡによって測定した。図５Ａで、抗ＴＲＢＣ２三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＲＢＣ１と比較してＴＲＢＣ２リガンドの存在下でより多くのＩＦＮ－γ放出を示した。対照的に、ｈＪｏｖｉ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＴＲＢＣ１リガンドと培養したときだけ高いＩＦＮ－γ生成を示した（図５Ｂ）。これらの結果は、抗ＴＲＢＣ２三重変異体を形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＲＢＣ２に対してより大きな活性化およびサイトカイン放出を有するが、ＴＲＢＣ１に曝露させたときはそうではないことを実証する。
（実施例４）
抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲの機能的特徴付け：細胞傷害性アッセイ
抗ＴＲＢＣ２三重変異体のＴＲＢＣ２を標的にする能力を決定するために、標的細胞としてＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現するように形質導入し、ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養したＲａｊｉ細胞を使用して、細胞傷害性アッセイを設定した。ｈＪｏｖｉ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞または抗ＴＲＢＣ２三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｒａｊｉ ＷＴ、Ｒａｊｉ ＴＲＢＣ１＋またはＲａｊｉ ＴＲＢＣ２＋細胞のいずれかと１：１（Ｅ：Ｔ）の比で培養した。フローサイトメトリーによって培養の７２時間後に標的細胞の回収を測定し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性能力を確立するために使用した。抗ＴＲＢＣ２三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞を含有する培養は、Ｒａｊｉ ＴＲＢＣ２＋標的細胞の限定的な生存を示した（図６）。対照的に、抗ＴＲＢＣ２三重変異体ＣＡＲ－Ｔ細胞はＲａｊｉ ＴＲＢＣ１＋標的細胞を消去せず、ＴＲＢＣ２＋細胞を標的にするそれらの増加した実力を示している。
我々は、第２世代抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲを生成するために、操作されたモノクローナル抗体を使用した。我々は、我々の抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲが７２時間共培養においてＴＲＢＣ２＋細胞系に対して特異性、サイトカイン放出および細胞傷害性を示すが、ＴＲＢＣ１＋細胞系に対しても表面上にＴＣＲを発現しなかった細胞系に対しても示さないことを実証した。抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、長期共培養アッセイで増殖能力も実証した。
（実施例５）
抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲの機能的特徴付け：殺傷アッセイ
以下の変異を有する表１からの抗ＴＲＢＣ２結合剤に基づいて、追加の第二世代ＣＡＲ構築物を生成した：
－ ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｋ（Ｎ３５Ｋと呼ぶ、配列番号２５）、
－ ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｌ変異（Ｎ１０３Ｌと呼ぶ、配列番号２７）、
－ ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｙ（Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｙと呼ぶ、配列番号２８）、
－ ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｆ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ（Ｙ１０２Ｆ－Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｒと呼ぶ、配列番号２９）、
－ ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２Ｌ、Ｎ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ（Ｙ１０２Ｌ－Ｎ１０３Ｍ－Ｎ３５Ｒと呼ぶ、配列番号３０）。
これらのＣＡＲ構築物および抗ＴＲＢＣ２三重変異体（ｈＪｏｖｉ－１のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ変異、ＫＦＮと呼ぶ、配列番号２６）をレトロウイルスベクターにクローニングし、健康なドナーから得られた（ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞または（ｂ）活性化ＰＢＭＣに形質導入するために使用した。抗ＴＲＢＣ１対照ＣＡＲ、すなわちｈＪｏｖｉ－１ ＣＡＲ構築物は、活性化ＰＢＭＣを使用した殺傷アッセイで対照として使用した。
ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞
生成された結合剤がＴＲＢＣ２抗原に特異的であるかどうか評価するために、ＴＲＢＣ１＋であるＪｕｒｋａｔ細胞に上記の抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲ構築物を形質導入した。標的細胞としてＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２だけを発現するように形質導入したＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（それぞれＨＰＢ ＴＲＢＣ１およびＨＰＢ ＴＲＢＣ２と呼ぶ）を使用し、ノックアウトＴＣＲを有するＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（ＨＰＢ ＫＯと呼ぶ）を陰性対照として、形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞の共培養を１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比で設定した。形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞は、それぞれ陰性または陽性のアッセイ対照として使用するために、単独でまたはαＣＤ３／αＣＤ２８抗体とプレーティングした。２４時間後のフローサイトメトリーにより、抗原特異的活性化をＣＤ６９の染色を通して調査した。
図７に示す結果は、全ての形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞がＨＰＢ ＴＲＢＣ２細胞との同時インキュベーションの後に選択的に活性化されることを明らかにした。ＪｕｒｋａｔをＴＲＢＣ１＋またはＨＰＢ ＫＯ標的と共培養したときにＣＤ６９上方制御が観察されなかったので、これらの結果は、試験した全てのＣＡＲがＴＲＢＣ２標的への特異性を提示したことを実証する。
ｂ）ＰＢＭＣ
第１に、ＴＲＢＣ１だけに結合する１０ｕｇ／ｍｌのビオチン化マウスＪＯＶＩ－１抗体による染色の後、磁気抗ビオチンでコーティングされたビーズを使用してＰＢＭＣをＴＲＢＣ１＋およびＴＲＢＣ２＋細胞に分離した。ＴＲＢＣ２＋集団はｈＪｏｖｉ－１ ＣＡＲ（ＪＯＶＩ）で、およびＴＲＢＣ１＋集団に上記の抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲを形質導入した。この差別的形質導入は、抗原活性化および標的殺傷が、条件が各ＰＢＭＣドナーで異なる混合集団ではなく、制御された培養条件（例えば、エフェクター対標的の比および時点）で標的が加えられるときに誘発されるだけであることを確実にした。
第２に、標的細胞としてＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２だけを発現するように形質導入したＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（それぞれＴＲＢＣ１＋ＨＰＢ－ＡＬＬおよびＴＲＢＣ２＋ＨＰＢ－ＡＬＬと呼ぶ）を使用し、ノックアウトＴＣＲを有するＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（ＨＰＢ－ＫＯと呼ぶ）を陰性対照として殺傷アッセイを設定した。形質導入の１０日後、細胞を１：２のＥ：Ｔ比で共培養した。細胞殺傷は、アッセイセットアップの７２時間後に、フローサイトメトリーによって調査した。
結果は、ｈＪｏｖｉ－１ＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＲＢＣ１＋ ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞だけを死滅させ、全ての抗ＴＲＢＣ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＲＢＣ２＋ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞だけを死滅させることを実証した（図８）。類似のレベルのバックグラウンド殺傷がＨＰＢ－ＫＯ対照細胞で全てのＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞について観察され、試験した全てのＣＡＲがそれらのコグネイト抗原に特異的であったことを示す。
（実施例６）
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ＴＲＢＣ２抗体の結合における異なる抗体フォーマットの影響の分析
抗ＴＲＢＣ２結合剤における多量体化の影響を、ＳＰＲによって分析した。この目的のために、ｈＪｏｖｉ－１抗体のＶＨドメインにおけるＴ２８Ｋ、Ｙ３２Ｆ、Ａ１００Ｎ、Ｙ１０２ＬおよびＮ１０３Ｍ変異およびＶＬドメインにおけるＮ３５Ｒ変異を有する抗ＴＲＢＣ２を３つの異なるフォーマット、すなわちｓｃＦｖ（配列番号２２）、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（配列番号２３）およびｓｃＦｖ－ＣＯＭＰ（配列番号２４）抗体フォーマットで使用した。
Figure 2024040410000028
Figure 2024040410000029
抗ＴＲＢＣ２ ｓｃＦｖの１：１結合相互作用を試験するために、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器を使用して、シリーズＳ ＣＭ５のセンサーチップをアミン結合により固定化し、抗ヒトＦｃ捕捉抗体は９０００～１００００ＲＵの密度にした。全ての実験条件で、ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液を流動緩衝液として使用した。試験用抗ＴＲＢＣ２抗体を、２００～２５０ＲＵの密度までフロー４の上に捕捉した。既知濃度の組換え精製ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を「分析物」として使用し、３０μｌ／分の流速で１５０秒の接触時間および３００秒の解離でそれぞれのフローセルの上に注入した。フローセル１は未改変であり、参照減算のために使用した。ドリフトを計算に入れるために、緩衝液だけの「０濃度」センサーグラムを二重参照減算として使用した。データは、１：１のラングミュア結合モデルにあてはめた。捕捉系を使用したので、各場合にデータフィッティングのために局所のＲｍａｘパラメータを使用した。解離速度値を決定し、半減期をｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｄによって計算した。
図９Ａに示す結果は、この抗ＴＲＢＣ２ ｓｃＦｖ結合剤が８秒の半減期を有することを明らかにした。この結合剤の結合親和性は、表１に示す。
ｓｃＦｖ－ＦｃおよびｓｃＦｖ－ＣＯＭＰ抗体フォーマットの多価相互作用を試験するために、シリーズＳ ＣＡＰチップを２５００～５０００ＲＵまでビオチン捕捉試薬で固定化した。可溶性組換えビオチン化ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２を、独立した実験サイクルで９０～１１０ＲＵの密度までフローセル３の上に捕捉した。精製された抗ＴＲＢＣ２
ｓｃＦｖ－ＦｃまたはｓｃＦｖ－ＣＯＭＰ抗体を、３０μｌ／分の流速で１５０秒の接触時間および３００秒の解離でフローセルの上に注入した。フローセル１では、ビオチン化タンパク質が省略され、参照減算のために使用された。ドリフトを計算に入れるために、緩衝液だけの「０濃度」センサーグラムを二重参照減算として使用した。データは、１：１のラングミュア結合モデルにあてはめた。捕捉系を使用したので、各場合にデータフィッティングのために局所のＲｍａｘパラメータを使用した。解離速度値を決定し、半減期をｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｄによって計算した。
図９Ｂおよび９Ｃに示す結果は、ｓｃＦｖ－ＦｃおよびｓｃＦｖ－ＣＯＭＰ抗体フォーマットの半減期がそれぞれ１６．２秒および７．３分であることを明らかにした。
したがって、これらの結果は、多量体化が低親和性／高特異性ＴＲＢＣ２抗体の結合を向上させることを実証する。
本出願は、２０１８年１０月３１日に出願の英国特許出願第１８１７８２２．８号の権益を主張する。この出願は、参照により本明細書に全体が組み込まれる。
上記の明細書に記載されている全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、当該記載の方法および本発明のシステムの種々の改変および変形が当業者には明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求された本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連する分野の当業者には明らかである本発明を実行するための記載の方式の種々の改変は以下の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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