DE69333760T2

DE69333760T2 - Evaluierung von patienten mit progressiver immunosuppression

Info

Publication number: DE69333760T2
Application number: DE69333760T
Authority: DE
Inventors: Augusto C Ochoa; Hiromoto Mizoguchi; John J O'shea; Dan L Longo; Cynthia M Loeffler; Paritosh Ghosh; Howard A Young
Original assignee: Loeffler Cynthia M Pensacola
Current assignee: Loeffler Cynthia M Pensacola
Priority date: 1992-04-06
Filing date: 1993-04-06
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2013-04-07
Also published as: WO1993019605A1; EP0634896A4; US5889143A; US5556763A; EP0634896B1; JP2005027653A; AU712334B2; ATE289202T1; EP0634896A1; JPH08504170A; CA2133759C; DE69333760D1; AU680193B2; AU4282997A; AU3939593A; CA2133759A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Continuation-in-Part-Anmeldung der U.S.-Seriennr. 07/863,262, eingereicht am 6. April 1992, und U.S.-Seriennr. 07/987,966, eingereicht am 11. Dezember 1992.
Die Erfindung betrifft einen löslichen, durch Zellen eines Tumor-tragenden Säugers hergestellten Immununterdrückungsfaktor und ein den Faktor kodierendes Gen. Durchmusterungsverfahren nach Mitteln, die die Wirkung dieses Faktors hemmen oder umkehren werden identifiziert. Immununterdrückende Mittel und Gegenmittel sind unter Verwendung der Erfindung erkenntlich. Der Faktor kann zum Induzieren von Immununterdrückung verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Beurteilung, Auswahl und Behandlung von Patienten mit eine fortschreitende Immununterdrückung verursachenden Erkrankungen. Patienten mit einer auf Immuntherapie ansprechenden Erkrankung, insbesondere Krebspatienten werden auf der Basis von Expressionsgraden von durch Immununterdrückung beeinträchtigten Proteinen aufgeführt oder beurteilt. Die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs einer solchen Immuntherapie wird durch die Ergebnisse des Aufführens und Beurteilens vorhergesagt.
Viele Erkrankungen sind durch die Entwicklung von fortschreitender Immununterdrückung bei einem Patienten gekennzeichnet. Die Gegenwart einer beeinträchtigten Immunantwort bei Patienten mit bösartigen Tumoren wurde besonders gut dokumentiert. Es zeigte sich, dass Krebspatienten und Tumor-tragende Mäuse eine Vielzahl an abgeänderten Immunfunktionen wie eine Abnahme der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ, eine Abnahme der lytische Funktion und des proliferativen Ansprechverhaltens von Lymphozyten aufweisen. S. Broder et al., N. Engl. J. Med., 299: 1281 (1978); E. M. Hersh et al., N. Engl. J. Med., 273: 1006 (1965); North and Burnauker, (1984).
Viele andere Erkrankungen sind ebenso durch die Entwicklung einer beeinträchtigten Immunantwort gekennzeichnet. Zum Beispiel wurde eine fortschreitende Immununterdrückung bei Patienten mit erworbenem Immundefizientsyndrom (AIDS), Blutvergiftung, Lepra, Cytomegalievirusinfektionen, Malaria und dergleichen beobachtet. Die für die Herabregulierung der Immunantwort verantwortlichen Mechanismen bleiben jedoch noch aufzuklären.
Bei der Immunantwort handelt es sich um ein komplexes Phänomen. T-Lymphozyten (T-Zellen) sind bei der Entwicklung von allen Zell-vermittelnden Immunreaktionen entscheidend. Helfer-T-Zellen steuern und modulieren die Entwicklung von Immunantworten. Bei cytotoxischen T-Zellen (Killer-T-Zellen) handelt es sich um Effektorzellen, die bei Immunreaktionen gegen intrazelluläre Parasiten und Viren durch Lysieren von infizierten Zielzellen eine wichtige Rolle spielen. Cytotoxische T-Zellen wurden auch mit dem Schützen des Körpers vor der Entwicklung von Krebsarten durch einen Immunüberlebensmechanismus in Verbindung gebracht. T-Unterdrückerzellen blockieren die Induktion und/oder Aktivität von T-Helferzellen. T-Zellen erkennen im Allgemeinen kein freies Antigen, erkennen es jedoch auf der Oberfläche von anderen Zellen. Bei diesen anderen Zellen kann es sich um spezialisierte Antigen-darstellende Zellen, die eine Aufspaltung von T-Zellen stimulieren können, oder um mit einem Virus infizierte Zellen im Körper, die zu einem Ziel für cytotoxische T-Zellen werden, handeln.
Cytotoxische T-Zellen oder Unterdrücker-T-Zellen erkennen gewöhnlich ein Antigen in Verbindung mit Produkten des Major-Histokompabilitäts-Komplexes (MHC) der Klasse I, die auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden. Helfer-T-Zellen und die meisten als Antwort auf ein Antigen in vitro wuchernden T-Zellen erkennen ein Antigen in Verbindung mit MHC-Produkten der Klasse II. Produkte der Klasse II werden hauptsächlich auf Antigen-darstellende Zellen und auf einigen Lymphozyten exprimiert. T-Zellen können auf der Basis ihrer wie mit monoklonalen Antikörpern definierten Zellmembranglycoproteine auch in zwei bedeutende Unterpopulationen unterteilt werden. Die ein Glycoprotein mit 62 kD exprimierende CD4⁺-Subpopulation erkennt gewöhnlich ein Antigen im Kontext der Antigene der Klasse II, wohingegen die CD8⁺-Subpopulation ein Glycoprotein mit 76 kD exprimiert und beim Erkennen eines Antigens in Zusammenhang mit MHC der Klasse I eingeschränkt ist.
Die CD4⁺-Subpopulation kann des Weiteren in zwei funktionell unterschiedliche Gruppen unterteilt werden. Eine Zellgruppe beeinflusst die Immunantwort von T-Zellen und B-Zellen positiv. Die zweite Zellgruppe induziert Unterdrücker-/cytotoxische Funktionen in CD8⁺-Zellen.
Bei der maßgeblichen T-Zellenmarkierung handelt es sich um den T-Zellen-Antigenrezeptor (TCR). TCR-2 ist ein Heterodimer aus zwei Disulfid-verknüpften Polypeptiden (α und β). TCR-1 ähnelt strukturell TCR-2, besteht jedoch aus γ- und δ- Polypeptiden. Sowohl TCR-1 als auch TCR-2 sind mit einem Komplex von den CD3-Komplex umfassenden Polypeptiden verbunden.
Der auf der Oberfläche aller T-Zellen zu findende TCR ist aus mindestens sechs verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt, die in drei unterschiedliche Proteinuntergruppen unterteilt werden können. R. D. Klausner et al., Annu. Rev. Cell Biol., 6: 403 (1990).
Die Ti-Untereinheiten sind für die Antigenbindung verantwortlich und schließen die α-, β-, γ- und δ-Ketten ein. Die Heterodimer αβ oder γδ im Rezeptorkomplex sind für die Ligandbindung verantwortlich. Das αβ-Heterodimer ist auf den meisten reifen T-Zellen zu finden, und das γδ-Heterodimer ist überwiegend auf im Epithelium lokalisierten T-Zellen zu finden.
Bei einer anderen Untergruppe von den TCR umfassenden Proteinen handelt es sich um die CD3-Ketten, die mindestens vier unterschiedliche, jedoch eng verwandte Untereinheiten umfassen. Bei diesen Untereinheiten handelt es sich um γ, δ, ε und ζ. F. Koning et al., Eur. J. Immunology, 20: 299 (1990); R. S. Blumberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 7220 (1990). Das Ergebnis der Kettensegregation des TCR-Komplexes in mehrere Untereinheiten ist die Verschiedenheit an Rezeptortypen. Unvollständig zusammengefügte Komplexe werden zersetzt, was zur Oberflächenexpression von nur vollständig zusammengefügten Rezeptoren führt. R. D. Klausner, New Biol., 1: 3 (1989).
Zusätzlich zur Beteiligung der Proteine einer TCR-Untereinheit führen Ereignisse der T-Zellen-Erkennung zur Signalwiedergabe und geeigneten biochemischen Signalen, die Zellantworten steuern. Die Fähigkeit von TCR, Signale an mehrfache biochemische Kaskaden wiederzugeben, ist ein zentrales Ereignis der Immunzellaktivierung. Die Details dieses Signalwiedergabewegs sind jedoch schwer verständlich. Für den TCR spielen wahrscheinlich eine oder mehrere Tyrosin(Tyr)-Kinasen eine wesentliche Rolle bei der T-Zellaktivierung. R. D. Klausner et al., Cell, 64: 875 (1991).
Mindestens zwei Signalwiedergabewege werden durch TCR-Stimulation durch ein Antigen oder durch entweder gegen CD3 oder das αβ-Heterodimer gerichtete monoklonale Antikörper aktiviert.
Eine TCR-Stimulation aktiviert eine Tyrosinkinase. L. E. Samelson et al., Cell, 46: 1083 (1986); M. D. Patel et al. J. Biol. Chem., 262: 5831 (1987); E. D. Hsi et al., J. Biol. Chem., 264: 10836 (1989). Eine Phosphorylierung von verschiedenen Proteinen mit Tyrosinresten wird innerhalb von Sekunden durch eine TCR-Stimulation induziert. C. H. June et al., J. Immunol., 144: 1591 (1990). Keine der TCR-Ketten besitzt eine eigene Kinaseaktivität. Ein Vertreter der Src-Familie von Tyrosinkinasen, bezeichnet als Fyn, fällt jedoch zusammen mit dem CD3-Komplex aus. L. E. Samelson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4358 (1990). Ein für T-Zellen spezifischer Vertreter der Src-Familie von Tyrosinkinasen, Lck, ist mit der cytoplasmatischen Domäne entweder eines CD4- oder eines CD8-Moleküls eng, jedoch nicht kovalent verbunden. Die extrazellulären Domänen von CD4 und CD8 binden sich an Moleküle des MHC der Klasse II bzw. Klasse I. Durch die Bindung von TCR an einen Antigen-MHC-Komplex auf einer vorhandenen Zelle, wird angenommen, dass der TCR entweder mit einem CD4- oder CD8-Molekül, das sich unabhängig an ein geeignetes MHC-Molekül binden kann, in enge Nachbarschaft gebracht wird.
TCR aktiviert auch eine Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C, was zur Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-bis-phosphat führt. A. Weiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4169 (1984); J. B. Imboden et al., J. Exp. Med., 161: 446 (1985). Dies führt zur Freisetzung von zwei sekundären Boten: 1) Inositol-1,4,5-trisphosphat, das für eine vorübergehende Ca²⁺-Mobilisierung verantwortlich ist, und 2) Diacylglycerin, bei welchen es sich um einen wirksamen Aktivator für Proteinkinase handelt. C. B. Berridge et al., Nature, 341: 197 (1989).
Die cytoplastische Domäne der TCRζ-Kette reicht dazu aus, eine Stimulation des Rezeptors mit den Signalwiedergabewegen zu koppeln. B. A. Irving et al., Cell, 64: 891 (1991). Als ein chimäres Protein konstruiert wurde, das die extrazellulären Domänen und Transmembrandomänen von CD8 an die cytoplasmatische Domäne der ζ-Kette knüpfte, aktivierte das chimäre Protein die entsprechenden Signalwiedergabewege in Abwesenheit von CD3γ, -δ und -ε. Deshalb spielt ζ offenbar die Rolle, den TCR an intrazelluläre Signalwiedergabemechanismen zu koppeln.
Eine Chemotherapie als Behandlungsmodalität war nicht für alle Krebsarten erfolgreich. Die Identifikation und Isolierung von löslichen Mediatoren der Immunantwort ist bei der Entwicklung von klinischen Versuchen unter Verwendung von Immuntherapie als alternative Behandlungsform von erhöhtem Interesse. Zum Beispiel stimulieren biologische Ansprechmediatoren (BRM) wie Interleukin-2 (IL-2), ein durch Helfer-T-Zellen hergestelltes Lymphokin, das Wachstum von IL-2-Rezeptor tragenden T-Zellen entweder in vivo oder in vitro. Sie aktivieren (verbessern) auch die Antitumor-Funktion von natürlichen Killer(NK)-Zellen (Lotze et al. 1981). NK-Zellen exprimieren auch die ζ-Kette. Die Inkubation in vitro von ruhenden Lymphozyten in IL-2 enthaltenden Überständen für eine Dauer von drei bis vier Tagen führt zur Bildung von Lymphozyten, die die Lyse von frischen Tumorzellen, jedoch nicht von normalen Zellen vermitteln können. Diese lysierenden Zellen werden als Lymphokin-aktivierte Killer(LAK)-Zellen bezeichnet. I. Yron et al., J. Immunol., 125:238 (1980); M. T. Lotze et al., Cancer Res., 41: 4420 (1981); und S. A. Rosenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 75: 595 (1985).
Ein Verfahren zur Aktivierung von T-Lymphozyten zum Bilden von T-aktivierten Killerzellen (T-AK) wurde beschrieben, wobei Lymphozyten durch Leukophorese oder aus peripherem Blut entnommen und die Zellen mit einem monoklonalen Antikörper (MAb) für einen Oberflächenrezetor einer T-Zelle wie Anti-CD3 (gebundene lösliche oder feste Phase) stimuliert werden. Die T-Zellen können auch mit oder ohne die Zugabe eines oder mehrerer Cytokine wie IL-2 stimuliert werden. In einer anderen Ausführungsform können T-Zellen vor der Stimulation mit dem MAb für einen Oberflächenrezeptor gereinigt werden. Eine Versuchsanordnung mit T-AK-Zellen zeigte, dass CD8⁺-Zellen für die nicht-MHC-eingeschränkte cytolytische Aktivität, die in diesen Kulturen ersichtlich war, verantwortlich sind. P. M. Anderson et al., J. Immunol., 142: 1383 (1989); C. M. Loeffler et al., Cancer Res., 51: 2127 (1991). Die Fähigkeit von IL-2, T-Lymphozyten mit Immunreaktivität zu vermehren und die Fähigkeit, frische autologe, syngene oder allogene, gegen natürliche Killer(NK)-Zellen resistente Tumorzellen, jedoch nicht normale Zellen zu lysieren, führte zur Entwicklung von Zellübertragungstherapien wie autologe Eigenblutimmuntherapie.
Eine typische Eigenblutimmuntherapie beinhaltet die Verabreichung von immunologisch aktiven Zellen an Individuen zum Zwecke des Bereitstellens einer nütz lichen immunologischen Wirkung wie Reduktion oder Steuerung von Krebs. Die immunologisch aktiven Zellen werden typischerweise durch Venenpunktion oder Leukophorese entweder vom zu behandelnden Individuum, bezeichnet als autologe Behandlung, oder von einem anderen Individuum, bezeichnet als allogene Behandlung, entnommen. Die Lymphozyten werden dann zum Erhöhen ihrer Anzahl und Aktivieren ihrer Antitumoraktivität gezüchtet und dann zurück in den Patienten infundiert. Folglich betrifft der Hauptteil herkömmlicher Bemühungen bei der Eigenblutimmuntherapie die Vermehrung der Zellanzahl in vitro, gefolgt von der Rückinfusion in den Patienten.
Tierversuche, die die Übertragung von immunologisch aktiven Zellen von gesunden Tieren in Tiere mit Krebstumoren beinhalten, wiesen darauf hin, dass eine Eigenblutimmuntherapie in bestimmten Tumormodellen eine Antitumorwirkung mit hohem Wirksamkeitsgrad auslösen kann. Die Verabreichung von IL-2 zusammen mit LAK-Zellen erwies sich bei der Behandlung einer Vielzahl an bösartigen Tumoren bei Mäusen als wirksam. Die übertragenen LAK-Zellen wuchern als Ergebnis der IL-2-Behandlung auch in vivo. Klinische Versuche bei Menschen zeigten, dass LAK-Zellen plus IL-2 oder IL-2 alleine beim Vermitteln der Rückentwicklung von etabliertem metastatischem Krebs bei ausgewählten Patienten wirksam sein kann. S. A. Rosenberg, „Immunotherapy of Patients with Advanced Cancer Using Interleukin-2 Alone or in Combination With Lymphokine Activated Killer Cells", in Important Advances in Oncology 1988: J. B. Lippincott Co., 217, (1988).
Jedoch war der Erfolg von Eigenblutimmuntherapie durch die in der Therapie erforderliche große Zellanzahl, die große Menge an Kulturmedium und die beim Züchten der Zellen zum Entwickeln von LAK-Aktivität benötigte große Anzahl an Stunden, die wurde, die ausreichende Zeitdauer, für welche die LAK-Aktivität für die gewünschte therapeutische Wirksamkeit beibehalten werden muss, die bei der klinischen Behandlung benötigte Zeit und die Nebenwirkungen der Behandlung beschränkt. Es wurde nach Verbesserungen des Züchtungsverfahrens in vitro gesucht, um die Wirksamkeit einer Eigenblutimmuntherapie zu verbessern. Es wurde gefunden, dass Zellen, die in IL-2 und/oder monoklonalen Antikörpern gegen den Antigen-Rezeptor-Komplex CD3 (Anti-CD3-MAb) gezüchtet wurden, eine Wucherung einer größeren Anzahl an T-Zellen induzieren, wodurch sich eine erhöhte Antitumoraktivität zeigt. P. M. Anderson et al. Cancer Immunol. Immunother., 27: 82 (1988); P. M. Anderson et al., J. Immunol., 142: 1383 (1989); und A. C. Ochoa et al., Cancer Res., 49: 963 (1989).
Eine Eigenblutimmuntherapie von Nierenadenokarzinomen im RENCA-Mäusemodel unter Verwendung von IL-2-aktivierten Killerzellen zusammen mit Chemotherapie zeigte beim Reduzieren von Tumoren einen gewissen Erfolg, jedoch war die Wirkung mutmaßlich Cytokin-vermittelt. Wiltrout, Progress in Neuro Endocrin Immunology, 4: 154 (1991).
Bemühungen zum Aktivieren von Antitumormechanismen in vivo waren beschränkt erfolgreich. Nur eine Minderheit an Patienten, die eine hohe Dosis an IL-2 erhielten, erlebten therapeutische Wirkungen, und es ist eine beträchtliche Toxizität zu beobachten. Die direkte Infusion von monoklonalen Anti-CD3-Antikörpern allein hemmt eine nicht spezifische Antitumorfunktion bei Mäusen. D. W. Hoskin et al., Cancer Immunol Immunother., 29: 226 (1989). Auf der Basis der positiven Ergebnisse bei Mäusemodellen wurde eine direkte Infusion von Anti-CD3 bei Menschen getestet. Obwohl Patienten, welche direkt den Anti-CD3-MAb, bezeichnet als OKT3, erhielten, die Aktivierung von einigen T-Zellen in vivo erlebten, erreicht die Toxizität von intravenösem OKT3 die tolerierte Höchstdosis (MTD) mit geringen Dosen, bevor er beginnt, eine gewisse Immunwirksamkeit zu zeigen. W. Urba et al., Cancer Res., März 1991. Es wird angenommen, dass der freie OKT3 für den Hauptteil dieser toxischen Wirkungen verantwortlich ist.
Auf Grund der Unzulänglichkeit der Behandlung mit einzelnen Modalitäten wurde der Synergismus gesucht. Flavonessigsäure (FAA) ist ein Cytokin- induzierendes synthetisches Arzneimittel, das mit IL-2 beim Reduzieren von RENCA-Mäusetumoren eine synergistische therapeutische Wirkung zeigte. Antitumorwirkungen von Flavonoiden, ein Cytokin-Induktionsmittel, zusammen mit IL-2 sind deshalb vielversprechend. FAA ist ein biologisches Ansprechmodifikationsmittel (BRM), von welchem es sich zeigte, dass es die systemische natürliche Killer(NK)-Zellaktivität vergrößert und mit IL-2 für die erfolgreiche Behandlung von fortgeschrittenem RENCA synergiert. Wiltrout et al., J. Immunol., 140: 3261 (1988); U.S.-Patentschrift Nr. 5,096,707 und 5,061,488. Cytokine (TNF, α-IFN und γ-IFN), die durch FAA induziert wurden, wurden mit der therapeutischen Synergie mit rIL-2 in Verbindung gebracht. CD8⁺-T-Lymphozyten sind beim Vermitteln dieser synergistischen Wirkung entscheidend. FAA induziert Cytokingene in vitro. In diesem Model werden immununterdrückte T-Zellen während des Fortschreitens des RENCA-Tumors induziert. Gregarian et al., Cancer Immunol Immunother 31: 325, 31: 335 (1990).
T-Lymphozyten von Tumor-tragenden Wirten zeigen in einer Vielzahl von Tests in vitro eine verminderte Immunfunktion. R. Lafreniere et al., J. Surg. Oncol., 43: 8 (1990); R. J. North et al., J. Exp. Med., 159: 1295 (1984); M. Sarzotti et al, Int. J. Cancer, 39: 118 (1987). Es wurde beobachtet, dass vor der Abnahme des Immunansprechverhaltens in Lymphozyten von peripherem Blut, einen Tumor infiltrierende T-Lymphozyten eine schlechte cytotoxische Aktivität gegen autologe oder allogene Tumorzellen zeigen. E. F. Klein et al., 1980, In: Contemporary Topics in Immunobiology, I. P. Witz and M. G. Hanna, Jr., eds. Plenum Press, N. Y., p. 79–107; B. M. Voss et al., J. Cancer, 44: 846 (1981).
Die molekulare Basis für das verminderte Immunansprechverhalten der von Tumor-tragenden Wirten abgeleiteten T-Zellen ist schwer verständlich. Es wurde vorgeschlagen, dass das verminderte Immunansprechverhalten der T-Zellen durch die Entwicklung von Ünterdrückerlymphozyten verursacht wird. S. B. Mizel et al., Proc. Natl. Sci. USA, 77: 2205 (1980); C. C. Ting et al., Int. J. Cancer, 24: 644 (1979). Bei einem anderen Vorschlag handelt es sich darum, ansprechende Klone von T-Zellen zu beseitigen. S. Webb et al., Cell, 63: 1249 (1990). Es wurde auch vorgeschlagen, dass das verminderte Immunansprechverhalten der T-Zellen das Ergebnis der Induktion von T-Zellenanergie ist. M. K. Jenkins et al., J. Exp. Med., 165: 302 (1987). Andere schlugen vor, dass die Hauptabänderung der Immunantwort durch eine Modifikation der Darstellung des Antigens erzeugt wird, was zu einem unzulänglichen Ansprechverhalten der CD4⁺-Helfer-T-Lymphozyten führt. Diese Daten erhärteten sich durch die Beobachtung, dass mit Cytokin-Genen transfektierte Tumorzellen eine förderliche Antitumorantwort induzieren und zu einer immunologischen Gedächtnisantwort führen. E. R. Fearon et al., Cell, 60: 397 (1990).
In einem Tumormodel in vivo führte das fortschreitende Wachstum (> 26 Tage) eines subkutanen Implantats von Mäuse-Darmkarzinomen, bezeichnet als MCA-38, zu einer verminderten lytischen Funktion durch die CD8⁺-T-Lymphozyten, einer Verminderung, die mit der verminderten Expression von mRNA für den Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und Granzym B verbunden war, und dem völligen Verlust der Fähigkeit von übertragenen Eigenzellen zum Vermitteln einer Antitumorwirkung in vivo (Loeffler et al. 1992, J. Immunol. 149: 949). Jedoch waren die Wucherung, die Lymphokinerzeugung und die Heraufregulierung des Lymphokinrezeptors in CD4⁺-T-Zellen in normalen und Tumor-tragenden Mäusen vergleichbar. Weder wurden Zellen mit Unterdrückerfunktion noch wurde die Erzeugung von transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-B) in den Lymphozyten von Tumor-tragenden Mäusen oder den MCA-38-Tumorzellen nachgewiesen.
Eine Vergrößerung der Immunantwort in immunbeeinträchtigten Patienten durch Infusionen von Lymphokinen und/oder Eigenblutimmuntherapie wurden mit unterschiedlichem und beschränktem Erfolg erreicht. Es sind Verfahren zum Verbessern dieses Behandlungstyps erforderlich. Es besteht Bedarf nach wirksamen Verfahren zum Messen des Fortschreitens von Immununterdrückung, damit Versuche zum Verbessern des Immunsystems in einem immununterdrückten Pati enten wirksam zeitlich gesteuert werden können. Es besteht auch Bedarf nach einem Verfahren, durch welches der Immununterdrückungsgrad in einem Patienten bestimmt und zum genauen Vorhersagen der Wahrscheinlichkeit des Ansprechverhaltens eines Patienten auf die Therapie verwendet werden kann. Die Therapie des Patienten kann in systemischer Weise entwickelt werden. Es ist ein Verfahren erforderlich, durch welches ein Kliniker bestimmen kann, ob die T-Lymphozyten eines Patienten zur Aktivierung fähig sind und folglich eine autologe Eigenblutimmuntherapie wahrscheinlich wirksam ist.
Ein Bedarf besteht nach einem Verfahren, durch welches der immununterdrückte Zustand von T-Lymphozyten während des Krankheitsverlaufs derart umgangen oder umgekehrt werden kann, dass die Immunantwort der T-Zellen beim Patienten entwickelt oder erhöht werden kann. Es besteht auch immer noch Bedarf nach einem Verfahren zum Durchmustern nach Immununterdrückungsmitteln und Mitteln, die die Immununterdrückung umkehren oder hemmen.
Es besteht Bedarf zum Nachweis der Gegenwart von Tumoren, insbesondere zu einem derart frühen Zeitpunkt bei der Entwicklung eines Tumors, dass die Behandlungswirksamkeit verbessert wird. Auch würden Verfahren zum Aufführen der Erkrankung die Auswahl der besonders geeigneten Behandlungsmodalitäten erleichtern. Es besteht auch Bedarf zum Testen der Wirksamkeit von Behandlungsmodalitäten vor klinischen Versuchen und zusätzlich zu klinischen Versuchen.
Die vorliegende Erfindung behandelt Beschränkungen auf dem Fachgebiet für den Nachweis, das Überwachen und die Umkehrung von Immununterdrückung und von im Allgemeinen durch eine Immununterdrückung gekennzeichneten Erkrankungen, z.B. von Krebs.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise die Identifikation eines löslichen Immununterdrückungsfaktors, der eine Änderung im Expressionsgrad von verschiedenen Proteinen, die in den TCR-Untereinheiten oder im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten enthalten sind, zu bewirken. Ein Expressionsmuster schließt die Gegenwart oder Abwesenheit des Proteins in der Zelle oder in einer oder mehreren unterzellulären Strukturen, einschließlich die reduzierte Gegenwart sowie Abänderungen der Proteinstrukturen einschließlich Abschneiden, ein.
Der Begriff „Faktor" bedeutet eine Zusammensetzung, die im von einem immununterdrücktem Säuger abgeleiteten Serum vorliegt und die Expression der TCR-verwandten Proteine abändern kann. Der Faktor liegt im Überstand von einigen Tumorzellkulturen vor. Der Begriff „Faktor" schließt einen beliebigen aus dem Serum oder dem Überstand gereinigten Unterbestandteil ein und weist die immununterdrückenden und die hierin beschriebenen das TCR-Protein abändernden Eigenschaften auf. Die Veränderung des Musters der Proteinexpression kann in einem oder mehreren Proteinen, die den TCR-Rezeptor beeinträchtigen oder im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten stattfinden.
Der Expressionsgrad von spezifischen Proteinen, die den TCR-Rezeptor beeinträchtigen, und spezifischen Proteinen im Signalwiedergabeweg ist in immununterdrückten Säugern verglichen mit dem Grad, der für die Proteine in einem Präparat von Zellen, die von einem nicht-immununterdrückten Säuger oder von einer von einem nicht-immununterdrückten Säuger stammenden Zellkultur oder von einer Kultur von Zellen, die durch einen Proteingehalt gekennzeichnet sind, der für einen nicht-immununterdrückten Säuger charakteristisch ist, abgeleitet sind, im Allgemeinen vermindert. Da jedoch die Expression der Proteine, die ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sind, Teil eines verknüpften und komplexen Immunsystems ist, kann eine Störung in einem Protein des Systems andere Protein gehalte auf unterschiedlichen Wegen beeinflussen, d.h. sie zu einem bestimmten Zeitpunkt entweder erhöhen oder vermindern.
Wichtig ist, dass das System bei einer Abnahme mindestens eines Proteingehalts im Immunsystem auf einen die Funktionsfähigkeit des Systems unterbrechenden Grad unterdrückt wird, d.h. nicht so funktionieren kann wie es zum Verrichten der für einen gesunden Säuger charakteristischen immunologischen Funktionen nötig ist. Der Unterdrückungsgrad variiert und ist im Allgemeinen mit einem oder mehreren ernsten klinischen Problemen verbunden, wenn eine Unterdrückung ausgeprägter wird. Auch neigen mehrere Proteingehalte dazu, beim Fortscheiten einer Immununterdrückung Veränderungen zu zeigen. Als Indikator für das Fortschreiten einer Immununterdrückung nimmt der Gehalt eines bestimmten Proteins entsprechend ab, und eine Vielzahl an Proteinen der vorliegenden Erfindung zeigen Abänderungen vom nicht-immununterdrückten Zustand. Im Allgemeinen nehmen die Proteingehalte ab, obwohl einige Gehalte zunehmen. Zum Beispiel nimmt FCεγ zu, wenn CD3ζ abnimmt.
Bei einer Ausführungsform eines in Gegenwart des Immununterdrückungsfaktors der vorliegenden Erfindung abnehmenden Proteins handelt es sich um eine Proteinuntereinheit von TCR. Diese Proteine schließen CD3ζ und CD3γ ein.
Bei einer Ausführungsform eines Proteins, das zunimmt, wenn der CD3ζ-Gehalt abnimmt, d.h. dessen Expression in umgekehrter Beziehung zu der Expression dieses Proteins steht, handelt es sich um FCεγ, ein mit dem IgE-Rezeptor verwandtes Protein. Eine Steuerung des FCεγ-Proteins durch Verfahren der vorliegenden Erfindung kann einen Weg zum Steuern eines allergenen Ansprechverhaltens darstellen, da die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Durchmustern nach erhöhtem FCεγ und zum Auswählen von diese Zunahme hemmenden Mitteln nützlich sind.
Bei einer anderen Ausführungsform eines in Gegenwart des Immununterdrückungsfaktors abnehmenden Proteins handelt es sich um ein Protein im Signalwiedergabeweg. Dieses Protein schließt eine Tyrosinkinase wie diejenige der Src-Familie, vornehmlich Fyn und lck, sowie die Proteine PLCγ und GAP ein.
Das Muster der Proteine einer TCR-Untereinheit oder der Proteine im Signalwiedergabeweg wird in Gegenwart von Tumoren, eines Zustands, der mit dem immununterdrückten Zustand verbunden ist, abgeändert. Ein Muster bedeutet in diesem Zusammenhang die Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Proteinbestandteilen, die in einem nicht-immununterdrückten Zustand in keinen Tumor tragenden Säugern zu finden sind, und die Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen verwandten Komponenten, die durch physikalische Eigenschaften wie Molekulargewicht gekennzeichnet sind, die sich von den Eigenschaften in einem nicht-immununterdrückten keinen Tumor tragenden Zustand unterscheiden.
Andere Eigenschaften des löslichen Immununterdrückungsfaktors der vorliegenden Erfindung schließen seine Gegenwart im Serum von Säugern mit Tumoren ein. Er erscheint auch im Überstand von Kulturen von einigen Tumorzellen.
Es wurde gefunden, dass Überstände von einigen gezüchteten Tumorzellen die cytolytische Aktivität von normalen Lymphozyten unterdrückten. Ausführungsformen der Kulturen schließen MCA-38 und MBL-2 ein. Der Faktor kann deshalb aus Präparaten aus von Tumor-tragenden Quellen abgeleiteten Säugerzellen isoliert und gereinigt werden. Der Faktor kann nach einer bestimmten Zeitdauer, in welcher der Tumor im Säuger vorlag, gewonnen werden. Je länger der Tumor besteht, desto wahrscheinlicher ist der Faktor zu gewinnen. Es ist klar, dass ein oder mehrere Tumore vorliegen können. Die Dauer, nach welcher der Faktor gewonnen werden kann, variiert von dem Säugertyp, dem Tumortyp und anderen mit dem bösartigen Zustand verbundenen Faktoren. Zum Beispiel kann der lösliche Faktor von Mäusen mit einem mindestens etwa 26 Tage bestehenden Tumor in den hier offenbarten Tumorreihen gewonnen werden.
Der lösliche Faktor kann aus biologischen Säugerserum einschließenden Proben gewonnen werden. Der Faktor kann auch aus dem Überstand von einigen gezüchteten Zellen, z.B. von der MCA-38-Reihe oder von der MBL-2-Lymphomreihe gezüchteten Zellen gewonnen werden. Diese Reihen sind zur wie hier beschriebenen Verwendung erhältlich.
Ein allgemeines Verfahren zum Bestimmen des Immununterdrückungsgrads bei einem Säuger schließt die Schritte des Bestimmens des Expressionsgrads in einem Lymphozytenpräparat eines Säugers mindestens eines ausgewählten Proteins einer TCR-Untereinheit oder eines Proteins im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten und Vergleichen des Proteinexpressionsgrad mit dem charakteristischen Expressionsgrad des ausgewählten Proteins das in gesunden, d.h. nicht-immununterdrückten Individuen derselben Säugerspezies zu finden ist, ein. Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteine einer TCR-Untereinheit schließen CD3ζ oder CD3γ ein. Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteine im Signalwiedergabeweg schließen die Tyrosinkinasen der src-Familie p56^lck und p59^fyn und die Proteine PLCγ und GAP ein.
Ausführungsformen der Veränderungen der Proteinexpressionsgrade, die direkt mit dem Fortschreiten vom normalen zum bösartigen Zustand verbunden sind, schließen Antigenrezeptoren von T-Zellen (TCR), die eine Abnahme von CD3γ und ein vollständiges Fehlen einer CD3ζ-Kette zeigen ein. Die letztere Kette ist durch eine Fcεγ-Kette ersetzt.
Ausführungsformen der Veränderungen in den Proteinexpressionsgraden im Signalwiedergabeweg von Lymphozyten, die mit dem Fortschreiten vom normalen zum bösartigen Zustand verbunden sind, schließen eine reduzierte Expression von Tyrosinkinasen ein. In einer veranschaulichten Ausführungsform sind p56^lck p59^fyn, PLCγ und GAP verglichen mit normalen Gehalten reduziert. In einem be liebigen Individuum können ein oder mehrere Proteingehalte verändert werden. Schreitet die Bösartigkeit fort, werden im Allgemeinen mehr Proteingehalte verändert. Die Reihenfolge und das Auftreten der Veränderung können mit verschiedenen Erkrankungen variieren.
Die hier entdeckten Veränderungen werden sowohl bei Tumor-tragenden Mäusen als auch bei Menschen beobachtet, wenn sie mit keinen Tumor tragenden Tieren oder Menschen verglichen werden. Mindestens eine Veränderung vom normalen Proteinexpressionsgrad eines TCR-Komplexes wird beobachtet, obwohl im Allgemeinen ein korrelierende Ansprechverhalten, d.h. ein mit dem Fortschreiten des bösartigen Zustands verbundenes Muster vorliegt.
Krebspatienten werden auf der Basis von Expressionsgraden und -mustern von durch Immununterdrückung beeinträchtigten Proteinen aufgeführt oder beurteilt. Die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs einer solchen Immuntherapie wird durch die Ergebnisse des Aufführens und Beurteilens vorhergesagt. Die Proteingehalte der TCR-Untereinheiten und des Signalwiedergabewegs und das Muster der NF-κB/rel-Proteine sind für diese Zwecke aussagekräftig. Ansprechverhalten in vitro von Zellen auf Therapien können entweder durch die Wirksamkeit der Behandlung oder die immunologische Stärke der Zellen oder eine Beziehung davon vorhergesagt werden.
Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um die Bereitstellung eines Verfahrens zum Identifizieren eines Patienten mit zur Aktivierung für autologe Eigenblutimmuntherapie fähigen T-Lymphozyten durch Testen auf Veränderungen im TCR-Rezeptor oder der Signalwiedergabe. Dieses Verfahren schließt die Schritte des Bestimmens des Expressionsgrad mindestens eines ausgewählten Proteins einer TCR-Untereinheit oder eines Proteins im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten in einem Lymphozytenpräparat von einem auf Immununterdrückung beurteilten Patienten ein.
Bei einem Verfahren zum Quantifizieren des Expressionsgrad der Proteine der vorliegenden Erfindung handelt es sich um das Expressionsverhältnis, obwohl andere vergleichbare Verfahren im Umfang dieser Erfindung liegen. Ein Expressionsverhältnis ist das Verhältnis der Anzahl an das ausgewählte Protein exprimierenden T-Lymphozyten zu der Gesamtanzahl an gezählten T-Lymphozyten. Der Proteinexpressionsgrad wird mit dem normalen Expressionsgrad des im gesunden, d.h. nicht-immununterdrückten Individuum zu findenden ausgewählten Proteins verglichen. Bei einem anderen Verfahren zum Quantifizieren eines Expressionsgrads eines Proteins der vorliegenden Erfindung handelt es sich um die Expression der Menge (des Anteils) des Proteins, das in einer von einer biologischen Probe, z.B. von T-Lymphozyten isolierten Proteingesamtmenge vorliegt.
Ein Grenzwert wird als ein Gehalt definiert, der der mit einer Lymphozytenstimulation kompatible Mindestgehalt eines Proteins ist. Die Kompatibilität wird als der Stimulationsgrad bestimmt, der durch Mittel wie im Allgemeinen für eine klinische Verbesserung erforderliches Anit-CD3 bei eine Lymphozytentransfusionen beinhaltenden Therapien beeinflusst wird. In einer anderen Ausführungsform ist der Grenzwertgehalt als ein die Immunantwort nicht störender Proteingehalt und/oder die Immunantwort nicht störendes Proteinmuster definiert.
Die Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Patienten mit einer auf Immuntherapie ansprechenden Erkrankung gewährt die Auswahl von Patienten, deren Lymphozyten wahrscheinlich auf die Stimulation ansprechen und für welche eine Immuntherapie wahrscheinlich erfolgreich ist. Patienten, deren Expressionsgrad eines ausgewählten Proteins oder von ausgewählten Proteinen und/oder Proteinmustern nicht unter dem Grenzwertgehalt für das Ansprechverhalten auf Lymphozytstimulation liegt, sind wahrscheinlich Kandidaten für eine Immuntherapie.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auswählen von Mitteln, die eine Immununterdrückung von T-Lymphozyten eines Säugers bewirken. Das Verfahren schließt die folgenden Schritten ein: Bereitstellen eines T-Lymphozyten-Präparats eines Säugers, in welchem der Expressionsgrad mindestens eines ausgewählten Proteins einer TCR-Untereinheit oder Proteins im Signalwiedergabeweg für gesunde, d.h. nicht-immununterdrückte Individuen der selben Säugerspezies charakteristisch ist; Züchten des Lymphozytenpräparats in Gegenwart eines Mittels, das mutmaßlich Immununterdrückung bewirkt; Bestimmen des Expressionsgrads und/oder -musters des ausgewählten Proteins; und Auswählen eines Mittels, das eine deutliche Reduktion unter den normalen Expressionsgrad des ausgewählten Proteins oder eine Musterveränderung vom Normalen bewirkt, wobei Normal als Grenzwertgehalt definiert ist, der zum Darstellen des nicht-immununterdrückten Zustands bestimmt ist. Dieses Verfahren wird in vivo nach der Verabreichung eines eventuell immununterdrückenden Arzneimittels durchgeführt. Bei einem Verfahren zum Induzieren einer Immununterdrückung z.B. in Zusammenhang mit einer Organtransplantation handelt es sich um das Verabreichen des löslichen Immununterdrückungsfaktors der vorliegenden Erfindung an einen Patienten.
Gleichermaßen schließt ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das eine Immununterdrückung von T-Lymphozyten eines Säugers umkehrt, die folgenden Schritte ein: Bereitstellen eines T-Lymphozyten-Präparats eines immununterdrückten Säugers, in welchem der Expressionsgrad mindestens eines ausgewählten Proteins einer TCR-Untereinheit oder Proteins im Signalwiedergabeweg unter dem Grenzwertgehalt liegt, der für gesunde, d.h. nicht-immununterdrückte Individuen derselben Spezies charakteristisch ist, oder einer gewissen Kombination von jedem der beiden Änderungstypen; Züchten des Lymphozytenpräparats in Gegenwart eines Mittels, das mutmaßlich Immununterdrückung umkehrt; Bestimmen des Expressionsgrads des ausgewählten Proteins; und Auswahl eines Mittels, das eine deutliche Zunahme im Expressionsgrad des ausgewählten Proteins bewirkt. Dieses Verfahren wird in vivo nach der Verabreichung eines Arzneimittels, das in der Lage ist, die Immununterdrückung umzukehren, durchgeführt.
Unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Veränderungen in Proteinen der TCR-Untereinheiten oder des Signalwiedergabewegs können Behandlungen zum Reduzieren oder Eliminieren von Tumoren beurteilt werden. Für diese Beurteilung werden die Proteingehalte in einem Tumor-tragenden Säuger vor dem Anwenden der Behandlung bestimmt. Nach der Behandlung werden die Gehalte oder Muster oder Beides desselben Proteins bestimmt und mit den Gehalten vor der Behandlung verglichen, um zu bestimmen, ob Veränderungen auftraten. Im Allgemeinen sind statistisch bedeutende Unterschiede erforderlich, um zu bestimmen, dass Veränderungen auftraten. Es können für weitere Beurteilungen der Behandlungswirksamkeit auch Proteingehalte von vergleichbaren nicht-Tumor-tragenden Säugern verglichen werden.
In einer veranschaulichten Ausführungsform werden gebildete Tumore tragende Säuger mit einer Kombination aus Flavonoid, bei welchen es sich um ein Cytokin-Induktionsmittel handelt, zusammen mit IL-2 behandelt. Eine Beurteilung der Abänderungen im Tyrosinphosphorylierungsmuster weist darauf hin, dass reduzierte Gehalte an p56^lck, p59^fyn, PLCγl und der mit der Gegenwart eines Tumors verbundenen Zetakette des CD3-Komplexes nach der Behandlung bei auch eine Tumorreduktion zeigenden Mäusen umgekehrt werden. Bei Tumor-tragenden Mäusen fehlten c-rel und p65 der NF-κB/rel-Familie und erschienen p48 und p44 anstelle von p50. Nach der Behandlung kehrte dieses Muster in etwa zum normalen Zustand zurück. Diese Ergebnisse können derart interpretiert werden, dass die Flavonoid-Cytokin-IL-2-Kombination durch Wiederherstellen der für ein normales immunologisches Funktionieren z.B. der Signalwiedergabewege erforderlichen Bestandteile gegen Tumore wirkt, wodurch gewährt wird, dass die T-Zellen eine wirksame Antitumorantwort aufstellen.
Ausführungsformen von Mitteln, die eine erneute Expression des CD3ζ-Proteins nach der Abnahme seines Gehalts in Tumor-tragenden Säugern induzieren, schließen Ionomyzin; Ionomyzin in Kombination mit einem beliebigen von Fol gendem: Phorbolmiristinacetat, IL-2, PMA und IL-2, Anti-CD3 und IL-2; und den monoklonalen Antikörper Anti-CD3 ein.
Ein Durchmusterungsverfahren nach einem den Immununterdrückungsfaktor der vorliegenden Erfindung hemmenden Mittel wird durch Bestimmen des Immununterdrückungsgrad eines Systems, welchem das Mittel zugesetzt wurde, und Vergleichen des Grads mit Immununterdrückungsgraden vor der Zugabe des Mittels durchgeführt. Ein veranschaulichendes Beispiel schließt die folgenden Schritte ein:

1. Entwickeln eines monoklonalen Antikörpers für das Mittel derart, dass ein Komplex gebildet wird, wenn der Antikörper einem das Mittel enthaltenden Präparat zugesetzt wird, wodurch die Wirkung des Mittels gehemmt wird; der Antigen-Antikörper-Komplex wird durch dem Fachmann bekannte Verfahren markiert, um seine Bildung nachzuweisen, was zum Rückschluss dessen führt, dass das Mittel in einem Präparat vorliegt;
2. Zugabe des zu testenden Mittels zu einem ersten Zellsystem, das den Immununterdrückungsfaktor enthält;
3. Zugabe sowohl des Mittels als auch des auf das Mittel gerichteten Antikörpers zu einem zweiten Zellsystem, das ebenso den Immununterdrückungsfaktor enthält;
4. Bestimmen des Immununterdrückungsgrads unter Verwendung der Tests der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen von Proteinexpressionsgraden, z.B. der TCR-Untereinheiten und des Signalwiedergabewegs;
5. Vergleichen der Immununterdrückungsgrade des ersten Zellsystems mit denjenigen des zweiten zum Bestimmen dessen, ob das den monoklonalen Antikörper enthaltende System eine Umkehrung der Immununterdrückung zeigt; diese Umkehrung wird dadurch angezeigt, dass die Proteingehalte und/oder -muster des zweiten Zellsystems über den Gehalten des ersten Zellsystems liegen, und vorzugsweise die Gehalte oder Muster mit Gehalten oder Mustern übereinstimmen, die für den nicht-immununterdrückten Zustand eines vergleichbaren Zellsystems charakteristisch sind; ein vergleichbares Zellsystem schließt ein System ein, das von derselben Säugerspezies, demselben Zelltyp abgeleitet ist und andere ähnliche immunologisch verwandte Eigenschaften aufweist.

Diese Anmeldung betrifft auch ein Mittel, das derart identifiziert wurde, dass es den Immununterdrückungsfaktor durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hemmt, d.h. die durch einen bösartigen Zustand oder andere eine Immununterdrückung induzierende abnormale Bedingungen beeinflusste Immununterdrückung verhindert oder umkehrt. Eine durch chemische Modalitäten verursachte Immununterdrückung ist in dieser Definition eingeschlossen.
Ein auf den Immununterdrückungsfaktor gerichteter Antikörper wird durch Einsatz eines isolierten und gereinigten Epitops des isolierten Immununterdrückungsfaktors der vorliegenden Erfindung durch dem Fachmann zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern bekannten Verfahren isoliert und gereinigt.
Ein Immununterdrückungsfaktor wird aus Serum von Tumor-tragenden Säugern, aus von Tumoren oder Tumor-tragenden Säugern abgeleiteten Zellen oder aus anderen biologischen Quellen, die eine Immununterdrückung beim Anwenden auf nicht-immununterdrückte Systeme beeinflussen, isoliert und gereinigt. In einer veranschaulichten Ausführungsform ist der Faktor eine lösliche proteinhaltige Verbindung. Unter Verwendung des isolierten und gereinigten Faktors wird (werden) das (die) den Immununterdrückungsfaktor kodiere(n) Gen geklont und werden die Nukleotid-kodierenden Sequenzen bestimmt.
Ein den Immununterdrückungsfaktor kodierendes Gen der vorliegenden Erfindung wird durch dem Fachmann bekannte Verfahren geklont. Der Faktor oder mindestens das für die Immununterdrückung nötige Segment kann durch Verwendung eines gegen den Faktor gerichteten monoklonalen Antikörpers oder epi tope Segmente davon oder durch biochemische Standardreinigung gereinigt werden. Die Aminosäuresequenz wird für den gereinigten Faktor bestimmt, und degenerierte Oligonukleotide werden hergestellt und zum Durchmustern einer Genbank von Nukleotidsequenzen verwendet.
Ein gegen die Expression des Immununterdrückungsfaktors der vorliegenden Erfindung gerichtetes Antisense-Konstrukt ist zum Hemmen der Wirkung des Faktors nützlich. Die Verabreichung des Antisense-Konstrukts an einen Säuger wird zum Hemmen des Fortschreitens zu dem Immununterdrückungszustand verwendet. Das Antisense-Konstrukt wird im Allgemeinen in Zellen transfektiert, und die Zellen werden einem Säuger verabreicht.
Säugerzellen können mit dem Gen für den löslichen Faktor unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren transfektiert werden.
Bei einem Aspekt der vorliegenden Anmeldung handelt es sich um einen Impfstoff der aus mindestens einem immunologisch aktiven Teil des löslichen Immununterdrückungsfaktors der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Der Impfstoff wird durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt.
Ein Kit zum Bestimmen des Immununterdrückungsgrads schließt einen Antikörper ein, der gegen ein Protein von einer eine TCR-Untereinheit einschließenden Gruppe, einem Signalwiedergabeweg, und einer NF-_κB/rel-Familie gerichtet ist. In getrennten Behältern liegen ein oder mehrere Antikörper vor, wobei jeder davon auf ein individuelles Protein der vorliegenden Erfindung gerichtet ist; ebenso im Kit eingeschlossen ist ein Mittel zum Nachweis der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes, wodurch die Gegenwart eines bestimmten Proteins abgeleitet wird. Ein Antikörper, der für die Sequenz spezifisch ist, die sich in abnormalem, verglichen mit normalem Zustand unterscheidet ist zum Nachweis von abgebauten Proteinen nützlich.
Ein Kit zum Bestimmen der Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln zum Umkehren von Immununterdrückung und zum Fortschreiten eines Tumors schließt, jeweils in einem getrennten Behälter, mehrere Lymphozytenpräparate ein. Ein erstes Präparat wird zum Steuern von Gehalten und Mustern bereitgestellt. Bei diesem handelt es sich im Allgemeinen um ein Lymphozytenpräparat von der Milz von einem nicht-immunbeeinträchtigten, keinen Tumor tragenden Säuger derselben Spezies wie der Säuger, auf welchen die Therapie gerichtet ist. Ein zweites Präparat von vergleichbaren Zellen und einer vergleichbaren Säugerquelle stammt von einem immununterdrückten oder Tumor-tragenden Säuger. Im Allgemeinen ist es erforderlich, dass die Zellen beim Erhalt des Kits in flüssigem Stickstoff eingefroren sind, bis der Kit verwendet werden soll. Bei den Präparaten handelt es sich um Kernextrakte. Die Wirksamkeit des eventuell therapeutischen Mittels wird durch Zugabe des Mittels zum zweiten Präparat und Vergleichen der Proteingehalte und/oder -muster durch dem Fachmann bekannte Verfahren nach einer geeigneten Zeitdauer bestimmt. Die geeignete Zeitdauer wird für einen bestimmten Zelltyp und Proteintest bestimmt.
Säugerzellen, die mit einem den Immununterdrückungsfaktor hemmenden Mittel behandelt werden und mit dem Immununterdrückungsfaktor behandelte Säugerzellen sind abhängig von der Natur der zu behandelnden Erkrankung oder des zu behandelnden Zustands entweder zum Vermindern oder Erhöhen der Immununterdrückung therapeutisch nützlich. Die behandelten Zellen können zur Eigenblutimmuntherapie verwendet werden.
Ein immununterdrückter Säuger wird durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels, das durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung als zum Umkehren von Immununterdrückung fähig identifiziert wurde, in einem therapeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel behandelt. Therapeutisch wirksame Mengen werden für eine bestimmte Erkrankung oder einen bestimmten Zustand empirisch bestimmt. Der behandelte Säuger schließt einen Menschen ein. Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung klar, wobei die verschiedenen verwendeten Begriffe wie folgt definiert sind:
T-Lymphozyten oder T-Zellen schließen alle Subpopulationen von Lymphozyten ein, die den T-Zellen-Antigenrezeptor tragen. Diese Subpopulationen schließen Lymphozyten ein, bei welchen es sich um CD3⁺CD4⁺ (αβ⁺); CD3⁺CD8⁺ (αβ⁺); CD3⁺CD4^–CD8^– (γδ⁺); und CD3⁺CD56⁺ handelt.
Immuntherapie schließt Eigenblutimmuntherapie ein, die eine zelluläre Eigenblutimmuntherapie einschließt, die das Verabreichen von immunologisch aktiven (immunokompetenten) Zellen an ein Individuum zum Zwecke des Bereitstellens einer nützlichen immunologischen Wirkung für das Individuum wie eine Reduktion oder Steuerung von krebsartigem oder erkranktem Gewebe beinhaltet.
Wie hier verwendet, schließt immuntherapeutische Aktivität oder Immunantwort oder immunologisch aktiv oder immunokompetent Antitumor-Aktivität, antiinfizierte Zellaktivität, Anti-Krankheitsmittel-Aktivität und Killeraktivität von weißen Blutzellen ein.
Züchten schließt das Verfahren ein, bei welchem T-Zellen in ein die gesamten für das Wachstum erforderlichen Nährstoffe umfassendes Gewebekulturmedium (TCM) gegeben werden. Stimulieren zeigt das Züchten der T-Zellen in einem TCM an, das mit einem oder mehreren Cytokinen oder in einer anderen Ausführungsform mit einem oder mehreren Anti-Oberflächenrezeptor-Antikörpern von T-Zellen mit oder ohne einem oder mehreren Cytokinen ergänzt wurde. Das Verfahren kann in jedem beliebigen Gefäß oder in jeder beliebigen Apparatur, das/die für eine Zell- oder Gewebekultur geeignet ist, stattfinden. Das Verfahren kann verschiedene Stufen des Züchtens und Unterzüchtens beinhalten. Jedoch ist typischerweise nur ein Stimulierungsschritt erwünscht.
Der Signalwiedergabeweg schließt ein beliebiges Protein ein, dessen Expression durch die Bindung eines Liganden oder eines Antikörpers an einen beliebigen Oberflächenrezeptor von T-Zellen induziert, verknüpft oder reguliert wird. Diese Proteine schließen Jun, Fos, Myc, GAP, Rafl, c-rel, NF-_κB, Plcγ, Protein G, Inositolphosphat, Proteinkinase C, Mapl-Kinase, CD45-Phosphatase und die Scr-Familie von Kinasen, einschließlich Lck, Fyn, Yes und Lyn, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Antikörper schließt ein beliebiges Protein oder Proteinanalogon ein, das sich spezifisch an ein geeignetes anregendes Epitop des T-Zellen-Rezeptors bindet. Antikörper schließt auch ein beliebiges sich spezifisch an ein Protein einer TCR-Untereinheit bindendes Protein oder Proteinanalogon, Fcεγ oder ein Protein im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten ein. Der Begriff schließt durch herkömmliche Verfahren hergestellte Antikörper ein, einschließlich polyklonale, monoklonale oder Fragmente davon, sowie genetisch manipulierte oder synthetische Moleküle, z.B. Einzelketten-Antikörper, die eine Bindungsregion enthalten, bei welcher es sich um das funktionelle Äquivalent eines Antikörpers in seiner Bindungsspezifität handelt, ein.
Cytokin schließt diejenigen Proteine ein, die den ein integriertes Ansprechverhalten auf eine Vielzahl von externen Reizen erforderlichen Hauptteil der intrazellulären Signalgebung vermitteln. Bei Cytokinen handelt es sich um starke Mediatoren, die mit spezifischen Rezeptoren mit hoher Affinität an der Zelloberfläche wechselwirken. Es zeigte sich, dass Cytokine die Funktion aller an einer Immunantwort beteiligten Zelltypen beeinflussen, an einer Lymphopoiese und Hämopoiese beteiligt sind und mit der Pathophysiologie einer großen Anzahl an Erkrankungen in Verbindung stehen. Bei Lymphokinen handelt es sich um die bevorzugten Cytokine in der beanspruchten Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Ergebnisse eines Versuchs, in welchem Mäuse mit T-AK-Zellen behandelt wurden, die von drei Mäusegruppen, (1) keinen Tumor tragenden Mäusen (normal), (2) Mäusen, die einen Tumor für eine Dauer < 21 Tagen trugen (Früh-TBM), (3) Mäusen, die einen Tumor für eine Dauer von > 30 Tagen trugen (Spät-TBM), abgeleitet sind. Lebermetastasen wurden 12 Tage nach der Tumorbeimpfung gezählt. Die Gruppen wurden unter Verwendung eines einzelnen Studenten-t-Tests verglichen. * gibt einen P < 0,001, behandelt gegen die Kontrolle, an; die Balken zeigen die S. D. (Standardabweichung).
2 veranschaulicht (A) die cytolytische Aktivität von T-AK-Zellen von Normalen, Früh- und Spät-TBM gegen MCA-38 (Darmkarzinom); (B) die cytolytische Aktivität von T-AK-Zellen von Normalen, Früh- und Spät-TBM gegen MBL2 (Lymphom); und (C) die cytolytische Aktivität von T-AK-Zellen von Normalen, Früh- und Spät-TBM gegen RENCA(Nierenzellkarzinom)-Tumorzellreihen. Angereicherte T-Zellen wurden mit Anti-CD3 aktiviert und in 100 U rekombinantes Interleukin-2/ml (rIL-2/ml) enthaltendem Gewebekulturmedium (TCM) gezüchtet. Die lytische Funktion wurde am Kulturtag 2 getestet.
3 veranschaulicht die cytolytische Aktivität von T-AK-Zellen von Normalen, Früh- und Spät-TBM gegen MBL2. Angereicherte T-Zellen wurden mit Anti-CD3 aktiviert und in 100 U rIL-2/ml enthaltendem TCM gezüchtet. Die lytische Aktivität wurde an den Kulturtagen 2, 4 und 7 in einem 4-stündigen Chromabgabetest getestet.
4. Oberflächenexpression des TCR-CD3-Komplexes, gemessen durch Fließcytometrie. Isolierte T-Zellen von normalen und Tumor-tragenden Mäusen (gepunktete bzw. gestrichelte Linien) wurden mit der Kontrolle Fluoreszein-markiertes IgG_2A und (A) Antikörpern für Mäuse-TCRαβ (Klon H57–597 Pharmingen) oder (B) Anti-CD3ε (145-2C11) inkubiert. Normale Mäuse (schattiert); Tumor-tragende Mäuse (unschattiert).
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
T-Lymphozyten von Tumor-tragenden Mäusen (TBM), insbesondere denjenigen mit Langzeit-Tumoren, zeigen Abänderungen in den Eigenschaften der TCR-verwandten Proteine. Krebspatienten zeigen ähnliche Abänderungen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Wucherung von Tumoren mit dem Versagen des Funktionierens von Proteinen der TCR-Untereinheiten und in den Signalwiedergabewegen in Beziehung steht. Umgekehrt dazu steht eine erfolgreiche Antitumor-Therapie mit der Umkehrung der Abänderungen dieser Proteine, z.B. der Umkehrung des Fehlens von oder einer verminderten Expression dieser Proteine zu ihrer Gegenwart mit normalen Gehalten in Beziehung.
Diese Beobachtungen stellten die Basis zur Entwicklung von Tests zur Immununterdrückung bei Säugern bereit. Die Tests basieren auf den Veränderungen in den Proteinen einer TCR-Untereinheit, in Proteinen im Signalwiedergabeweg und im NF-_κB/rel-System. Klinische Verwendungen dieser Tests sind zahlreich.
Ein in Tumor-tragenden Säugern vorliegender löslicher Immununterdrückungsfaktor wurde durch seine Wirkung auf die TCR-verwandten Proteine der vorliegenden Erfindung und durch seine Verbindung mit dem Fortschreiten von Immununterdrückung identifiziert.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind zur Bewertung von Behandlungen und für Verfahren der Behandlungen einer großen Vielzahl von durch die Fehlfunktion des Immunsystems gekennzeichneten Erkrankungen geeignet. Solche Erkrankungen schließen diejenigen, die zu einer fortschreitenden Immununterdrückung führen, sowie Erkrankungen, in welchen das „Selbst" als fremd erkannt wird und deshalb eine Autoimmunantwort aufgebaut wird, ein.
Zu einer fortschreitenden Immununterdrückung führende Erkrankungen schließen Krebsarten von vielen verschiedenen Geweben, einschließlich Leukämie, Hodgkin-Krankheit, Lungenkrebs, Darmkrebs, Gliome, Nierenzellkrebs und dergleichen ein. Eine fortschreitende Immununterdrückung wird in einer großen Vielzahl von Infektionen, einschließlich diejenigen, die intrazellulär sind, wie Lepra, Tuberkulose, Leishmanie; diejenigen, die extrazellulär sind, wie Blutvergiftung, Erkrankungen von viralen Krankheitsursachen wie diejenigen, die durch HIV, Cytomegalievirus, Epstein-Barr und dergleichen verursacht werden; Parasiteninfektionen wie Schistosomiasis, Malaria und dergleichen ein.
Erkrankungen, die zu dem Aufbau einer Autoimmunantwort führen, schließen Lupus, Autoimmunthyroiditis, Skleroderm, rheumatoide Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis und dergleichen ein.
Eine Organtransplantation erfordert die Induktion von Immununterdrückung. Der lösliche Faktor der vorliegenden Erfindung ist zum Erzielen dieses Zustands nützlich. Die Tests der vorliegenden Erfindung werden zum Beurteilen von Immunterdrückungsmitteln verwendet.
Behandlungsmodalitäten werden aus der Identifikation von Immununterdrückungsmitteln oder die Immununterdrückung umkehrenden Mitteln durch Tests der vorliegenden Erfindung entwickelt. Behandlungen schließen die direkte Verabreichung von immunologischen Stimulanzien an einen Säuger mit Krebs oder einer anderen das Immunsystem beeinträchtigenden Erkrankung oder die Verwendung von Eigenblutimmuntherapie ein.
Bei einem Verfahren zur Abgabe von wirksamen immunotherapeutischen Mitteln handelt es sich um Liposome. Wirksame immunotherapeutische Mittel schließen diejenigen ein, die Gehalte an Proteinen von TCR-Untereinheiten und im Signal wiedergabeweg auf die Gehalte vor dem Auftreten der Tumore oder vor der Induktion des erkrankten Zustands wiederherstellen.
EIGENSCHAFTEN VON T-LYMPHOZYTEN VON (TBM) TUMOR-TRAGENDEN MÄUSEN
1. Abnahme der therapeutischen Effizienz
Es lag eine deutliche Abnahme in der therapeutischen Effizienz von Eigen-übertragenen T-Lymphozyten von einen Tumor für eine Dauer von > 26 Tagen tragenden Mäusewirten (diese Wirte werden als Spät-Tumor-tragende Mäuse oder Spät-TBM bezeichnet) im Unterschied zu normalen Mäusen und einen Tumor für eine Dauer von < 21 Tagen tragenden Mäusen (Früh-Tumor-tragende Mäuse oder Früh-TBM) vor.
Eine Analyse in vitro der Funktionen der T-Lymphozyten von Spät-TBM zeigte ein scheinbar normales Wucheransprechverhalten auf Anti-CD3 und IL-2 und eine adäquate Lymphokin-Produktion von CD4⁺-Zellen. Jedoch wurde eine deutliche Abnahme in der cytotoxischen Funktion von CD8⁺-Zellen beobachtet. Die verminderte Cytotoxizität lag nicht auf Grund von Zell-vermittelter Unterdrückung vor. Die Expression von für lytische Moleküle wie TNFα und Granzym B kodierenden Genen war deutlich vermindert.
Die Expression von CD3ζ- und CD3γ-Ketten war in T-Lymphozyten von Spät-TBM nicht nachweisbar. Die ζ-Kette wurde durch Expression der FCεγ-Kette, eines Vertreters der ζ-Kettenfamilie, ersetzt. Lymphozyten von TBM zeigten auch eine deutliche Abnahme in den Lck- und Fyn-Proteinen. Diese Veränderungen liefen parallel zu einer verminderten Fähigkeit zum Mobilisieren von Ca²⁺ und zu einem abgeänderten Muster der Tyrosinphosphorylierung.
CD8⁺-T-Lymphozyten in Tumor-tragenden Mäusen beeinträchtigten die lytische und therapeutische Funktion (Löffler et al., 1992) und Abwandlungen in der Expression und Funktion von Signalmolekülen. Die CD3ζ-Kette ist nicht nur ein entscheidender Bestandteil für die Signalwiedergabe des TCR (Romeo und Seed, Cell 64, 1037, 1991), sondern auch die begrenzende Untereinheit beim Zusammenschluss und bei der Membranexpression des TCR-CD3-Komplexen in T-Zellen-Hybridomen (Weissman et al., Science 239: 1018, 1988). Die lytische Funktion ist in Zellen, welchen die TCR-α-Kette oder die CD3-δ-Kette fehlt, reduziert. Schmitt, Verhuisi et al., Nature 325: 628 (1987). Die Wirkung der Abwesenheit entweder von CD3ζ oder CD3γ von T-Zellen in Tumor-tragenden Mäusen ist nicht klar.
Die Subpopulation einer großen Anzahl an granulären T-Lymphozyten (LGLs), gekennzeichnet als CD3⁺, NK1.1⁺, CD16⁺, CD4^– und CD8^–, und das Exprimieren der FCεγ-Kette statt der ζ-Kette wurden beschrieben (Koyasu, J. Exp. Med. 175: 203, 1992). Diese Lymphozyten unterscheiden sich phänotypisch von denjenigen, die in Tumor-tragenden Mäusen zu sehen sind. Jedoch weisen diese LGLs keine lytische Funktion auf. Folglich hängt die Zelllyse nicht von der Gegenwart der CD3ζ-Kette ab. Außerdem behalten chimäre Moleküle, die mit in cytotoxischen T-Zellreihen exprimiertem Fcεγ hergestellt wurden, ihre lytische Funktion bei. Dies legt nahe, dass Fcεγ und ζ beim Koppeln mit lytischen Mechanismen, insbesondere im Hinblick auf den Homologiegrad zwischen diesen zwei Ketten austauschbar sein können (Romeo et al., Cell 68: 899 (1992).
2. Verminderte Expression von PLCγ und GAP in Tumor-tragenden Säugern
Versuchsdaten unter Western-Blot-Technik und unter Verwendung des Antikörpers gegen Plc-γ (Upstate Biotechnologies Inc., Lake Placid, N. Y., 1:5000 Verdünnung) und Anti-GAP (gleiche Firma, mit einer Verdünnung von 1:2000) zeig te eine verminderte Expression von beiden Antigenen in Tumor-tragenden Mäusen. Das Testen dieses Signalwiedergabe-Vermittlers in Krebspatienten zeigte eine Verminderung in Plc-γ, jedoch nicht immer in GAP.
3. Verminderte Kinase-Funktion in Tumor-tragenden Mäusen (TBM)
Das Testen der Kinasefunktion (die Fähigkeit zum Phosphorylieren) von Lck und fyn zeigte eine Abnahme in der Kinase-Funktion in beiden dieser Tumor-tragenden Mäuse.
Eigenschaften von T-Lymphozyten und Protein-Expressionsgrade bei Krebspatienten
Gleichermaßen war die Expression von CD3ζ-Protein in einigen menschlichen Krebspatienten nicht nachweisbar oder verglichen mit gesunden, d.h. nicht Tumor-tragenden Kontrollen, deutlich reduziert. Die Expression von CD3ζ-Protein wurde durch Western-Blot in menschlichen Krebspatienten analysiert. Zum Beispiel wurden gleiche Anzahlen an Zellen oder gleiche Mengen an Proteinen, die von den Lymphozyten isoliert wurden, die vom peripheren Blut von zwei Patienten mit Nierenzellkarzinom, einem Patienten mit Lebermetastasen eines Augenmelanoms und einem gesunden Individuum, isoliert wurden, unter Verwendung von Anti-CD3ζ-Kaninchenserum analysiert. Die Expression von CD3ζ-Protein wurde in der gesunden Kontrolle nachgewiesen. Im Gegensatz dazu war die Expression von CD3ζ in der von einem Patienten mit Nierenkarzinom und einem Patienten mit Lebermetastasen eines Augenmelanoms entnommenen Probe nicht nachweisbar. Die Expression von CD3ζ-Protein war in einem zweiten Patienten mit Nierenzellkarzinom um 95% reduziert. Der Krebs in jedem dieser Patienten bestand seit mehr als 30 Tagen.
Das Fortschreiten von Krebs führt zur Immununterdrückung von T-Lymphozyten. Der Verlust der Antitumor-Wirkungen von T-Zellen bei einer Eigenblutimmuntherapie steht mit einer deutlichen Abnahme der cytotoxischen Funktion von CD8⁺-Zellen und Veränderungen in der Proteinexpression in Zusammenhang.
Die von Krebspatienten, einschließlich denjenigen mit Melanom, Nierenzellkarzinom, akuter lymphozytischer Leukämie und multiplem Myelom erhaltenen Daten zeigten, dass einige Patienten eine deutliche Abnahme der Expression der CD3ζ-Kette zeigten, wie bestimmt durch die Verwendung von Anti-ζ-Antiserum 387 (erhalten von Dr. Alan Weissman, NCI). Zusätzliche Abnahmen in Fyn (UBI), Lck (UBI) und PLC-γ (UBI) wurden ebenso beobachtet.
Die beobachteten Veränderungen in der Proteinexpression in den immununterdrückten T-Zellen schließen den vollständigen Verlust oder die deutliche Abnahme in der Expression der Proteine CD3ζ und CD3γ einer TCR-Untereinheit, das Auftreten von Fcεγ und die verminderte Expression der Proteine im Signalwiedergabeweg, insbesondere von Lck, Fyn, PLC-γ und GAP ein. Funktionelle Zusammenhänge davon schließen den Verlust der Fähigkeit der Zellen zum Mobilisieren von Ca²⁺ und ein abgeändertes Muster der Tyrosinphosphorylierung ein.
Eine vollständige oder deutlich verminderte Expression von CD3ζ-Protein wurde in drei menschlichen Krebspatienten beobachtet, die die Gegenwart eines Tumors für eine Dauer von mehr als 30 Tagen zeigten. Die verminderte Expression der Proteine einer TCR-Untereinheit wie CD3ζ und CD3γ, die Expression von Fcεγ in den T-Lymphozyten und die verminderte Expression der Proteine im Signalwiedergabeweg wie Lck und Fyn standen mit ähnlichen Veränderungen in der T-Zellfunktion einschließlich dem Verlust von Cytotoxizität und dem Verlust der Fähigkeit, stimuliert zu werden, in Beziehung. Es ist wahrscheinlich, dass NK-Zellen, die gewöhnlich auch CD3ζ-Protein exprimieren, eine vermindertes Immunansprechverhalten mit dem Verlust der CD3ζ-Expression zeigen.
TESTS AUF IMMUNUNTERDRÜCKUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von für das Bestimmen des Immununterdrückungsgrads vorgesehenen Tests. Diese Tests sind z.B. in einem Patienten, der für eine Eigenblutimmuntherapie oder Organtransplantation beurteilt wird, nützlich. Die Tests werden durch Bestimmen von Veränderungen in der Expression von ausgewählten Proteinen durchgeführt, von welchen es bekannt ist, dass sie für den Immununterdrückungsgrad von T-Lymphozyten ausschlaggebend sind. Ein ausgewähltes in einem Test zu untersuchendes Protein schließt ein beliebiges Protein der TCR-Untereinheiten oder im Signalwiedergabeweg oder eine Kombination der Proteine ein. Eine verminderte Expression von ausgewählten Proteinen einer TCR-Untereinheit wie CD3ζ und CD3γ oder eine verminderte Expression von ausgewählten Proteinen im Signalwiedergabeweg von T-Zellen wie Lck, Fyn, PLC-γ oder GAP oder die erhöhte Expression von Fcεγ in T-Zellen oder Subpopulationen von T-Zellen sind für einen immununterdrückten Zustand diagnostisch. Diese Veränderungen in der Proteinexpression in T-Lymphozyten oder Subpopulationen von T-Zellen sind mit einem Verlust der Fähigkeit zum Stimulieren von für eine wirksame Eigenblutimmuntherapie erforderlichen T-Zellen verbunden.
Im Allgemeinen ist die Verbindung zwischen einer Expression von TCR-Proteinen und Immununterdrückung positiv, d.h., nimmt die Proteinexpression ab, nimmt auch das Ansprechverhalten der Zellen auf Immuntherapie ab. Das Ansprechverhalten bei Menschen und anderen Tieren auf ein bösartiges Fortschreiten verläuft in derselben Richtung, wie dasjenige, das mit dem Mäusesystem zu beobachten ist.
Eine Analyse des Musters von Proteinen einer TCR-UNtereinheit, Proteinen im Signalwiedergabeweg oder von Transkriptionsfaktoren der NF-_κB/rel-Proteinfamilie stellt einen Test zur Immununterdrückung bereit. Das Muster schließt die Gegenwart oder das Fehlen mindestens eines Proteins ein. Bei dem Muster handelt es sich um einen Vektor von 0 oder 1 für die Gegenwart bzw. Abwesenheit, wie bestimmt durch Western Blot oder ähnliche Verfahren. Antikörper, die auf die Bestandteile des Systems gerichtet sind, sind zum Bestimmen dessen nützlich, ob die Proteine vorliegen. In einigen abnormalen Zuständen wurde ein im normalen Zustand vorliegendes Protein durch ein oder mehrere Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten ersetzt. In diesen Situationen kann ein Antikörper, der auf den nicht in den ersetzten Proteinen vorliegenden Teil des Proteins gerichtet ist, zum Feststellen dessen, ob die Substitution stattfand verwendet werden, wobei in diesem Fall kein Komplex gebildet wird.
VERFAHREN ZUM BESTIMMEN VON PROTEINEXPRESSIONSGRADEN
Die Expressionsgrade von Proteinen einer TCR-Untereinheit, von Fcεγ oder ausgewählten Proteinen im Signalwiedergabeweg von T-Zellen sind zur Verwendung in einem Immununterdrückungstest geeignet. Ein Protein oder eine Kombination an Proteinen wird verwendet. Viele verschiedene herkömmliche und bekannte Testverfahren sind zum Beurteilen des Expressionsgrads von ausgewählten Proteinen in T-Lymphozyten geeignet. Proben von Gewebe oder Fluid wie Blut werden von den Patienten isoliert, und der Expressionsgrad des ausgewählten Proteins einer TCR-Untereinheit, von Fcεγ oder des ausgewählten Proteins im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten wird bestimmt. Diese Proben werden von verschiedenen Geweben, einschließlich Tumorgewebe, Milz- oder lymphatischem Gewebe, peripheren Blutzellen, Gehirnflüssigkeit, Pleuralergüssen und Asziten entnommen.
Ein Proteinextrakt der Gewebe- oder Zellprobe wird direkt analysiert, um den Proteinexpressionsgrad zu bestimmen. In einer anderen Ausführungsform werden vor dem Bestimmen des Expressionsgrades des ausgewählten Proteins T-Zellen oder Subpopulationen von T-Zellen gereinigt. T-Zellen und Subpopulationen von T-Zellen werden durch eine beliebige Vielzahl an herkömmlichen Techniken, wie Rosettentest, gefolgt von Ficoll-Hypaque-Gradient-Zentrifugation, indirektes Schwenken, Antikörper/Komplement-vermittelte Cytotoxizität, immunomagnetische Reinigung, Fließcytometrie und ähnliche Techniken gereinigt. Zusätzlich werden die TCR unter Verwendung eines Antikörpers wie Anti-CD3ε immungefällt. Die Proteine einer den TCR umfassenden Subpopulation werden durch Western-Blot durch dem Fachmann bekannte Verfahren analysiert.
Der Expressionsgrad eines Proteins wird unter Verwendung von bekannten Techniken, wie Immunfluoreszenz, ELISA, Western-Blot-Analyse und ähnliche Techniken bestimmt. Ein Extrakt zur Proteinanalyse durch eine beliebige dieser bekannten Techniken wird durch herkömmliche Verfahren aus der Gewebe- oder Fluidprobe oder T-Zellen oder Subpopulationen von T-Zellen, die aus diesen Proben hergestellt sind, hergestellt. Ein das ausgewählte Protein spezifisch nachweisender und an eine bekannte Markierung konjugierter Antikörper wird durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt.
KLINISCHE BEURTEILUNG FÜR EINE ORGANTRANSPLANTATION UNTER VERWENDUNG VON PROTEINEXPRESSIONSTESTS
Es ist vorgesehen, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung beim Überwachen und Erleichtern einer Transplantation von Organen und Geweben nützlich sind. Ein Patient wird gegenwärtig mittels verschiedenen Behandlungen, die für das Erhöhen des Toleranzgrads vorgesehen sind, für ein Transplantat vorbereitet. Diese Behandlungen schließen wiederholte Transfusionen mit weißen Blutzellen oder Vollblut ein.
Eine Immununterdrückung wird durch Verabreichen des löslichen Immununterdrückungsfaktors der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger an einen Patienten induziert. Wirksame Mengen werden empirisch bestimmt.
Es ist möglich, den Expressionsgrad der ausgewählten Proteine einer TCR-Untereinheit, von FCεγ und der Proteine im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten durch Vorbereitung des Patienten zum Bestimmen des Immununterdrückungsgrades beim Patienten und dadurch Feststellen, ob Patienten zum Aufnehmen des Transplantats ausreichend immununterdrückt sind, zu überwachen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden zum Bestimmen des Immununterdrückungsgrades beim Patienten und dadurch Bereitstellen von Information, die zur genauen zeitlichen Behandlung für das Beibehalten der Toleranz benötigt wird, verwendet. Es ist zu erwarten, dass Mittel, die unter Verwendung der Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung, die die Immununterdrückung im Patienten erhöhen können, isoliert wurden, die Nützlichkeit zur erfolgreichen Vorbereitung und Nachsorge des transplantierten Patienten aufweisen.
AUSWAHL VON PATIENTEN FÜR EINE IMMUNTHERAPIE
Beim Bestimmen einer therapeutischen Strategie testet ein Arzt die Expression von TCR-verwandten Proteinen von patienteneigenen T-Lymphozyten zum Beurteilen des Immununterdrückungsgrads des Patienten, um dadurch die Erfolgswahrscheinlichkeit der Stimulation dieser Zellen für eine wirksame Immuntherapie vorherzusagen. Dies ist für jede Therapie, die die patienteneigenen Zellen einsetzt, z.B. Cytokin-Therapie oder autologe Eigenblutimmuntherapie nützlich. Es ist ferner vorgesehen, dass erfindungsgemäß beurteilte T-Zellen für allogene oder syngene Behandlungsprotokolle in Fällen, in welchen patienteneigene T-Zellen immununterdrückt werden, ausgewählt werden. Dennoch ist es in Fällen, in welchen Eigenblutimmuntherapie nicht vorgesehen ist, zu erwarten, dass eine Beurteilung des Immununterdrückungsgrads den Arzt beim Bestimmen dessen unterstützt, ob mit antibakteriellen Mitteln, immunstimulierenden Arzneimitteln oder dergleichen zu behandeln ist. Bei einer anderen Verwendung handelt es sich um die Überwachung von Immununterdrückung bei Autoimmunität oder vor einer Transplantation zur Bestimmung des optimalen Gehalts eines verabreichten Unterdrückungsarzneimittels, sowie das Timing der Transplantation.
Patienten werden für eine Immuntherapie, z.B. für eine autologe Eigenblutimmuntherapie auf der Basis des Expressionsgrads oder des -musters eines ausgewählten Proteins oder von ausgewählten Proteinen ausgewählt. Bei den Auswahlkriterien handelt es sich um diejenigen Expressionsgrade und/oder -muster, die für das Ansprechverhalten auf lymphozytische Stimulation nicht unter dem Grenzwert liegen. Der Grenzwertgrad für das Ansprechverhalten auf lymphozytische Stimulation wird für jede Kombination aus Erkrankung und ausgewähltem Protein empirisch abgeleitet und ist für Individuen, von welchen angenommen wird, dass sie normale immunologische Ansprechverhalten aufweisen, relativ. Zum Beispiel kann mit einer Kombination aus einem ausgewählten Protein und einer bestimmten Erkrankung gefunden werden, dass das ausgewählte Protein mit Gehalten hergestellt werden muss, die im Wesentlichen äquivalent zu denjenigen sind, die in gesunden Individuen zu finden sind, um für eine autologe Eigenblutimmuntherapie wirksam zu sein. Bei noch einer anderen Kombination aus einem ausgewählten Protein und einer Erkrankung kann eine autologe Eigenblutimmuntherapie mit nur einem relativ geringen Expressionsgrad des ausgewählten Proteins immer noch wirksam sein.
In einer anderen Ausführungsform wird die Expression des das ausgewählte Protein in T-Zellen oder Subpopulationen von T-Zellen kodierenden Gens durch ein beliebiges einer Vielzahl an Verfahren, einschließlich Northern-Hybridisierung oder Hybridisierung in situ festgestellt. Ist bekannt, dass das Gen nur in T-Lymphozyten exprimiert wird, wird RNA von den Gewebe- oder Zellproben isoliert. In einer anderen Ausführungsform kann RNA von gereinigten T-Zellen oder aus diesen Proben hergestellten Subpopulationen von T-Zellen unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren erhalten werden. Die RNA wird mit markierter DNA oder einer spezifisch die das ausgewählte Protein kodierende mRNA nachweisenden Hybridsonde hybridisiert.
In einer anderen Ausführungsform werden Patienten auf der Basis ihres Proteinexpressionsverhältnisses für eine Eigenblutimmuntherapie ausgewählt. Bei dem Expressionsverhältnis (E. R.) handelt es sich um die Anzahl an T-Zellen, die ein ausgewähltes Protein einer TCR-Untereinheit oder ein Protein im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten exprimieren, geteilt durch die Gesamtanzahl an gezählten T-Zellen. Zum Beispiel kann das Expressionsverhältnis durch eine Zweifarben- oder Dreifarben-Fließcytometrie gemäß den Verfahren, wie denjenigen beschrieben in Current Protocols in Immunology, Bd. I, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach und W. Strober (Hrsg.), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 5.1.5–5.4.15 (1991), bestimmt werden.
Bei im Inneren der Membran vorliegenden Bestandteilen des TCR oder Bestandteilen des Signalwiedergabewegs ist die Zelle für die Markierung durchlässig hergestellt. Zum Beispiel werden vom Patienten isolierte Lymphozyten mit zwei verschiedenen Antikörpern in Kontakt gebracht, wobei jeder davon an einen unterschiedlichen Farbstoff konjugiert wird. Ein Antikörper wird zum Nachweisen von Zellen, die das ausgewählte Protein einer TCR-Untereinheit oder ein Protein im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten exprimieren, verwendet, und dieser Antikörper ist an einen Farbstoff wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiert. Ein zweiter Antikörper bindet sich an ein in allen T-Zellen zu findendes Protein wie CD3, und dieser Antikörper ist an einen zweiten Farbstoff wie Phycoerythrin konjugiert. Die Fraktion von T-Zellen, die das ausgewählte Protein einer TCR-Untereinheit oder Protein im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten exprimiert, wird durch Analyse der Proben unter Verwendung Fließcytometrie bestimmt.
Wie in den vorstehenden Abschnitten beschrieben, werden die Patienten auf der Basis des Grads und/oder Musters der Proteinexpression für eine autologe Eigenblutimmuntherapie ausgewählt. Bei den Auswahlkriterien handelt es sich darum, dass die Expression nicht unter dem Grenzwertgrad für das Ansprechverhalten auf Lymphozytenstimulation liegt, wobei der Grenzwertgrad für das Ansprechverhalten auf Lymphozytenstimulation für jede Kombination von Erkrankungen und ausgewähltem Protein empirisch abgeleitet ist.
Zum Beispiel kann mit einer Kombination aus ausgewähltem Protein und Erkrankung gefunden werden, dass mindestens 50% der T-Zellen das ausgewählte Protein exprimieren müssen (E. R. = 0,5), wenn eine autologe Eigenblutimmuntherapie wirksam sein soll. Bei noch einer anderen Kombination aus ausgewähltem Protein und Erkrankung kann eine Expression des Proteins in mindestens 70% der T-Zellen (E. R. = 0,7) erforderlich sein, wenn eine autologe Eigenblutimmuntherapie wirksam sein soll. In noch einer anderen Kombination aus ausgewähltem Protein und Erkrankung kann die Gegenwart von p65 erforderlich sein.
ÜBERWACHEN DER WIRKSAMKEIT VON CHEMOTHERAPIE, STRAHLUNGSTHERAPIE UND OPERATION FÜR KREBS
Ist eine Chemotherapie, Strahlungstherapie oder Operation beim Eliminieren des Hauptteils eines Tumors wirksam, sollten die immununterdrückten Proteine dann zu ihren normalen Gehalten und Mustern zurückkehren. Diese Verbesserungen werden durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung überwacht.
Es ist vorgesehen, dass herkömmliche Behandlungen und Protokolle zum Vervollständigen und Ergänzen der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Nimmt die Tumorgröße oder -belastung des Patienten unter Verwendung von nicht-biologischen Behandlungen, z.B. von Chemotherapie ab, verringert sich auch der Immununterdrückungsgrad. Zusätzlich werden die Immununterdrückung umkehrende Mittel durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert. Diese Behandlungen oder Mittel können nach oder zusätzlich zu einer autologen Eigenblutimmuntherapie erfolgen. Ein wirksames Timing einer autologen Eigenblutimmuntherapie wird durch Messen des Immununterdrückungsgrads bei einem Patienten durch Verfahren der vorliegenden Erfindung, z.B. durch Bestimmen des Expressionsgrads von ausgewählten Proteinen einer TCR-Untereinheit, von Fcεγ in T-Lymphozyten und Proteinen im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten vorhergesagt.
Die zum Ergänzen oder Vervollständigen einer autologen Eigenblutimmuntherapie geeigneten Verfahren schließen Operation, Bestrahlung oder Behandlung mit chemotherapeutischen oder pharmakologischen Mitteln ein. Die chemotherapeutischen oder pharmakologischen Mittel schließen alle Cytokine, Mittel, die die Tumorgröße oder -belastung reduzieren, einschließlich Cyclophosphamide, Adriamycin, Steroide, Flavonoide und IL-2, Wachstumshormone, Cimetidine, Chlorochin, nicht-steroide entzündungshemmende Mittel wie Aspirin, Ibuprofen, Indomethacin und Levamisol ein.
Mehrere verschiedene Strategien sind zum Umgehen der Immununterdrückung von T-Lymphozyten verfügbar. Die immuntherapeutische Aktivität von T-Lymphozyten wird durch rekombinante Verfahren ausgebaut. Der Expressionsgrad von ausgewählten Proteinen einer TCR-Untereinheit oder Proteinen im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten werden in immununterdrückte Zellen durch Einbringen eines Expressionsvektors, der das ein ausgewähltes Protein kodierende Gen umfasst, in die Zellen zurückgegeben. Die Expression eines Gens in rekombinant manipulierten Zellen stellt die normalen Gehalte des Proteins für die Lymphozyten wieder her. Diese rekombinant manipulierten Lymphozyten werden für eine Eigenblutimmuntherapie unter Verwendung von beliebigen der hier beschriebenen alternativen Verfahren stimuliert.
LIPOSOMABGABESYSTEM
Obwohl freie Cytokine wie IL-2 für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wird ein Cytokin vorzugsweise als Abgabesystem in Liposome eingebracht. Liposome sind Phospholipid-Vesikulen, die abhängig vom Typ der Wechselwirkung zwischen einem gelösten Stoff und einem zur Herstellung eines Liposoms verwendeten Phospholipid eine bestimmte Menge an Cytokin oder anderen bioaktiven Verbindungen enthalten kann.
Mehrere Verabreichungswege, z.B. intravenöse, subkutane, intraperitoneale und orale Abgaben sind zur Verabreichung von Liposomen geeignet. Wichtige Vorteile für die liposomale Abgabe schließen verglichen mit den freien Formen des bioaktiven Inhaltsstoffes die Gewebeverteilung und Bindungseigenschaften ein, was zu einem verbesserten therapeutischen Index und verminderter Toxizität führt.
BEHANDLUNG VON MÄUSEN MIT IL-2-LIPOSOMEN
Zwei Versuche wurden zur Behandlung von Mäusen (die für eine Dauer von 14 Tage einen Tumor trugen) mit intraperitonealen IL-2-Liposomen (50.000 U/Maus/Tag × 5 Tage) durchgeführt. Die Mäuse wurden dann am Tag 32 nach der Tumorinjektion getötet und die Milz-Lymphozyten auf die Expression von ζ getestet. Mäuse, die IL-2-Liposome erhielten, zeigten normale Gehalte der ζ-Kette, wohingegen unbehandelte Tiere einen vollständigen Verlust der Expression dieser Kette aufwiesen. Es ist deshalb möglich, dass IL-2-Liposome vor dem durch den Tumor induzierten Verlust von ζ schützen. Jedoch handelt es sich bei einer alternativen Möglichkeit darum, dass die Liposome die T-Zellen derart unspezifisch vergrößern, dass der Verlust von ζ durch die vermehrten Populationen überdeckt werden könnte.
KLINISCHE VERWENDUNG VON STIMULIERTEN T-ZELLEN
In einer veranschaulichten Ausführungsform werden stimulierte T-Zellen aufgenommen und im Körper eines Organismus, vorzugsweise eines Säugers wie einer Maus oder eines Menschen, platziert, wo sie durch Verabreichung von IL-2 die immunotherapeutische Aktivität, z.B. die cytotoxische Aktivität oder die Lymphokin-Produktion erleichtern. Stärker bevorzugt werden die Zellen für eine immuntherapeutische Behandlung im Körper eines Menschen platziert. Die Zellen werden einem Patienten unter Verwendung von beliebigen der herkömmlichen und bekannten Verfahren und Wege, z.B. denjenigen, beschrieben in S. A. Rosenberg, US-Patent Nr. 4,690,915, verabreicht. Diese Wege schließen eine intravenöse, intraarterielle oder intrakavitäre Verabreichung, umfassend intrapleural, intraperitoneal, intrathekal, intravesikal und dergleichen ein.
Im Allgemeinen zeigen die Zellen nach der Verabreichung einer wirksamen Menge an IL-2 in vivo eine verbesserte Wucherung und Antitumor-Aktivität. Die Verabreichung von IL-2 findet vorzugsweise über eine Dauer von etwa 7 Tagen statt. Die zum Verbessern der Zellwucherung und immunotherapeutischen Aktivität in vivo wirksame Menge an IL-2 hängt vom zu behandelnden Säuger ab. Zum Beispiel werden Mäusen etwa 10.000 bis 70.000 Einheiten/Tag IL-2, vorzugsweise etwa 50.000 Einheiten/Tag IL-2 und Menschen etwa 1 × 10⁶ bis 6 × 10⁶ Internationale Einheiten/m²/Tag verabreicht.
Wie im vorstehenden Abschnitt erwähnt, ist es bevorzugt, dass die T-Zellen anfänglich für eine Dauer von weniger als 24 Stunden mit Anti-CD3-MAb mit oder ohne jeglichem vorliegenden IL-2 stimuliert werden. Es liegt im Umfang der Erfindung, falls gewünscht, IL-2 mit dem Anti-CD3-MAb in der anfänglichen Kultur einzuschließen. Obwohl dies geeignet ist und ähnliche Ergebnisse erzeugt, ist es zumindest aufgrund der unerwünschten Kosten von IL-2 nicht unbedingt bevorzugt. Eher ist es bevorzugt, Zellen mit Anti-CD3-MAb allein zu stimulieren, die stimulierten Zellen aufzunehmen, die stimulierten Zellen in einen immununterdrückten Säuger zu infundieren und dann dem Säuger IL-2 zu verabreichen.
Interleukin-2 ist ein im Handel erhältlicher Wachstumsfaktor für T-Zellen. Sowohl natürlich vorkommendes IL-2, wie es von gezüchteten Milzzellen von Ratten oder von der Jurkat-Zellreihe abgeleitet werden könnte, als auch rekombinantes IL-2 (rIL-2) sind geeignet. Es wird angenommen, dass in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der Cytokin-aktivierten Zellen auch andere Cytokine verwendet werden können. Ein natürlich vorkommendes Cytokin oder ein rekombinant hergestelltes Cytokin wird verwendet. Diese schließen IL-1, IL-4, IL-6, IL-12, TNF, GM-CSF, Interferon und dergleichen ein. Es ist vorgesehen, dass ein Cytokin allein oder in Kombination mit anderen IL-2 einschließenden Cytokinen, entweder zugesetzt zu dem Kulturmedium oder einem Patienten verabreicht, verwendet werden kann. Kombinationen von rIL-2, Flavonoiden und chemotherapeutischen Mitteln sind beim Reduzieren von Tumoren zumindest in Tiermodellen ebenso wirksam (Wiltrout et al., 1991). T-Zellen sind für dieses Antitumor-Ansprechverhalten wichtig. Kommerzielle Quellen von rekombinanten Cytokinen von Menschen oder Mäusen sind erhältlich. Current Protocols in Immunology, Bd. I, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach und W. Strober (Hrsg.), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 2.4.1–2.10.3 (1991).
VERWENDUNG VON IMMUN-WIEDERHERSTELLBAREN MITTELN
Es ist vorgesehen, dass die immun-wiederherstellbaren Mittel, die durch die Verfahren der beanspruchten Erfindung identifiziert sind, eine Nützlichkeit bei der Behandlung von durch eine fortschreitende Immununterdrückung gekennzeichneten Erkrankungen durch Umkehren von Immununterdrückung nützlich sind. Diese Mittel sind durch Bereitstellen eines T-Lymphozyten-Präparats eines Säugers identifiziert, in welchem der Expressionsgrad von mindestens einem ausgewählten Protein einer TCR-Untereinheit oder Protein im Signalwiedergabeweg oder Muster der NF-_κB/rel-Proteine verglichen mit gesunden, nicht-immununterdrückten Individuen derselben Säugerspezies unter dem Normalen liegt; das Lymphozyten-Präparat wird in Gegenwart eines zu testenden Mittels, im Allgemeinen eines Mittels, das mutmaßlich eine Immununterdrückung umkehrt gezüchtet und der Expressionsgrad und/oder das -muster des ausgewählten Proteins wird bestimmt. In einer anderen Ausführungsform wird das Mittel einem Patienten mit unter dem Normalen liegender Expression eines Proteins einer TCR-Untereinheit oder eines Proteins im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten verabreicht, und der Expressionsgrad des Proteins in einer von dem Patienten nach der Behandlung erhaltenen Probe bestimmt.
Mittel, die den Expressionsgrad von ausgewählten Proteinen einer TCR-Untereinheit oder Proteinen im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten deutlich erhöhen können und/oder die Gegenwart von Proteinen im NF-_κB/rel-System wiederherstellen können, stellen ein Verfahren zum Umkehren von Immununterdrückung in einem erkrankten Tier oder Menschen dar. Das Mittel wird dem Patienten zur Stimulation von Lymphozyten gegebenenfalls mit oder ohne T-Zellen-Oberflächenrezeptor-Antikörper und/oder Cytokinen verabreicht, um die Immununterdrückung im erkrankten Patienten umzukehren. In einer anderen Ausführungsform werden die vom Patienten isolierten Lymphozyten in vitro mit dem Mittel behandelt und dem Patienten für eine Eigenblutimmuntherapie verabreicht. Zum Beispiel könnten die Lymphozyten in Gegenwart von Flavonoiden gezüchtet werden. Diese Lymphozyten werden gegebenenfalls in vitro oder in vivo mit oder ohne T-Zellen-Oberflächenrezeptor-Antikörper und/oder Cytokinen stimuliert.
Untergruppen von Patienten können identifiziert und beurteilt werden, die kein Ansprechverhalten auf eine Kombination von Mitteln, jedoch auf andere zeigen können. Patienten, die z.B. kein Ansprecherhalten auf Anti-CD3 zeigen, können ansprechen, wenn Flavonoide und IL-2 zugesetzt werden. Die zusätzlichen Mittel können vorher für eine Therapie schwer zu handhabende Patienten „retten",
WIEDERHERSTELLUNG VON IMMUNOLOGISCHER FUNKTION UNTER VERWENDUNG VON REKOMBINANTEN TECHNIKEN
Dem Fachmann bekannte Verfahren werden zur Konstruktion eines das ausgewählte Gen von Interesse enthaltenden Expressionsvektors, sowie zur Einbringung des Vektors in immununterdrückte T-Zellen verwendet. Zum Wiederherstellen der immunologischen Funktion ist ein immun-wiederherstellendes Mittel kodierendes Gen im Vektor eingeschlossen. Bei diesem Gen könnte könnte es sich um ein Antisense-Gen für den Immununterdrückungsfaktor der vorliegenden Erfindung handeln. Das Gen ist funktionsfähig an einen Promotor gebunden, bei welchem es sich im Allgemeinen um einen regulierbaren Promotor handelt. Der Vektor wird unter Verwendung von bekannten Transfektionsprotokollen, wie Calciumphosphat-Transfektion oder Transfektion durch Elektrophoration in T-Lymphozyten eingebracht. Das ausgewählte Gen wird eingebracht und in T-Zellen unter Verwendung von bekannten Vektoren, z.B. retroviralen Vektoren exprimiert. Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., (Hrsg.), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 9.0.1–9.14.3 (1989).
ERNEUTE EXPRESSION DER CD3ζ-KETTE

Das Züchten von Lymphozyten von Tumor-tragenden Mäusen für eine Dauer von 48 Stunden in Gewebekulturmedium (RPMI 1640 + Zusätze, jedoch ohne fötales Rinderserum), das beliebige der folgenden Kombinationen enthält, induziert eine erneute Expression der CD3ζ-Kette:

A.	Ionomycin (1 μg/ml) (Calbiochem, La Jolla, CA)
B.	Ionomycin + Phorbolmiristinacetat (10 ng/ml) (Chemsyn Science Labs., Lenexa, Kansas).
C.	Ionomycin + IL2 (300 U/ml).
D.	Ionomycin + PMA + IL2
E.	Ionomycin + Anti-CD3 + IL2
F.	Anti-CD3-monoclonaler Antikörper (10 ng/ml)
G.	Flavonoide + IL-2
H.	Anti-CD3 + Flavonoide

VERWENDUNG VON IMMUNUNTERDRÜCKUNGSMITTELN
Immununterdrückungsmittel, die unter Verwendung der Verfahren der beanspruchten Erfindung identifiziert sind, weisen bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen wahrscheinlich Verwendbarkeit auf. Von besonderem Interesse in diesem Hinblick sind lösliche Faktoren, die durch einen Tumor erzeugt werden, der eine T-Zell-Immununterdrückung verursacht. Diese Mittel werden durch Bereitstellen eines T-Lymphozyten-Präparats eines Säugers identifiziert, in welchem der Expressionsgrad von mindestens einem ausgewählten Protein einer TCR-Untereinheit oder Protein im Signalwiedergabeweg verglichen mit gesunden Individuen derselben Säugerspezies normal ist. Bei einem anderen Test handelt es sich darum, ob Abänderungen im Muster von NF-_κB/rel-Proteinen vorliegen. Das Lymphozyten-Präparat wird in Gegenwart eines mutmaßlich Immununterdrückung verursachenden Mittels gezüchtet und der Expressionsgrad und/oder das -muster des Proteins bestimmt. In einer anderen Ausführungsform wird das Mittel einem gesunden Patienten verabreicht und der Expressionsgrad von mindestens einem ausgewählten Protein einer TCR-Untereinheit oder Protein im Signalwiedergabeweg von Lymphozyten bestimmt. Die Mittel werden isoliert und weiter durch Fraktionieren des Immununterdrückungsüberstands zum Lokalisieren der aktiven Fraktion und Anwenden von Verfahren der qualitativen Analyse zum Identifizieren der Natur des Faktors gereinigt.
Mittel, die den Expressionsgrad von ausgewählten Proteinen einer TCR-Untereinheit oder Proteinen im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten vermindern können, bieten ein Verfahren zum Induzieren von Immununterdrückung bei einem Tier oder Menschen. Die Mittel oder der lösliche Immununterdrückungsfaktor der vorliegenden Erfindung werden dem Patienten verabreicht. In einer anderen Ausführungsform wird eine zumindest die immununterdrückten Stellen des löslichen Faktors kodierende Nukleotidsequenz in Zellen, im Allgemeinen Zellen des Empfängers, transfektiert und dem Säuger verabreicht.
Die folgenden Beispiele sind als Veranschaulichungen der spezifischen und bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargelegt. Diese Beispiele sollen den Umfang der Erfindung in keinster Weise beschränken.
Beispiel 1
Verlust von Antitumorwirkungen von aus Langzeit-Tumor-tragenden Mäusen isolierten T-Zellen.
Aus Langzeit-TBM isolierte T-Zellen weisen bei Verwendung bei einer Eigenblutimmuntherapie keine nachweisbaren Antitumorwirkungen auf („Langzeit" wird hier abwechselnd mit „Spät" verwendet). Die Bildung von T-aktivierten Killer(T-AK)-Zellen wurde wie in C. M. Loeffler et al., Cancer Res., 51: 2127 (1991) beschrieben erzielt. Splenocyten von C57BL/6-Mäusen wurden zur Isolierung von Lymphozyten in einen Ficoll-Paque-Gradienten (Pharmacia) gegeben. Nach zweimaligem Waschen mit HBSS (GIBCO, Grand Island, NY) wurden rote Blutzellen (RBC) mit destilliertem Wasser lysiert und die übrig gebliebenen mononuklearen Zellen gezählt. Die Zellen wurden dann zur Anreicherung der T-Zellen auf eine Schnellaffinitätschromatographiesäule für T-Zellen von Mäusen (Biotex Laboratories Inc., Edmonton Kanada) gegeben. Die Zellen wurden zweimal mit HBSS gewaschen und mit Anti-CD3-MAb (145-2C11) und IL-2 (spezifische Aktivität 1,5 × 10⁷ U/mg, Hoffmann-LaRoch Inc., Nutley, NJ) aktiviert. Die angereicherten T-Zellen wurden mit einer Konzentration von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml TCM, bestehend aus Rosewell Park Memorial Institute (RPM1) 1640 (erhältlich von GIBCO, Grand Island, NY), ergänzt mit 25 mM HEPES [N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)], 2 mM L-Glutamin, 5% fötalem Kalbserum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 10 mM nicht-essenziellen Aminosäuren, 100 mM Natriumpyruvat und 25 μm 2-Mercaptoethanol, in Kulturkolben inkubiert. Zum Bilden von T-AK-Zellen wurden 2 μg 145-2C11 MAb pro ml TCM zugesetzt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert, wonach sie geerntet, zweimal in HBSS gewaschen, in HBSS, enthaltend 30 U/ml IL-2, erneut suspendiert, gezählt und in Mäuse injiziert wurden.
Verfahren zum Aufzeigen der therapeutischen Wirksamkeit von zusammen mit Liposom-eingekapseltem IL-2 (IL-2-Liposome) verwendeten T-AK-Zellen wurden wie in C. M. Loeffler et al., Cancer Res., 51: 2127 (1991) beschrieben durchgeführt. Etwa 3,0 × 10⁵ MCA-38-Zellen in 0,5 ml HBSS wurden unter Verwendung einer Nadel mit 30 Gauge in die Milz in 6–8 Wochen alten C57BL/6-Mäusen injiziert. Jede Versuchsgruppe bestand aus mindestens 10 C57BL/6-Mäusen. Nach drei Tagen erhielten die Mäuse eine einzelne intravenöse Injektion von 4,0 × 10⁷ T-AK-Zellen entweder von normalen Mäusen, Früh-TBM (14–21 Tage bestehender subkutaner Tumor) oder Spät-TBM (mehr als 30 Tage bestehender subkutaner Tumor). Zusätzlich erhielten die Mäuse an den Tagen 3–7 nach der Tumorbeimpfung einmal täglich intraperitoneale Injektionen von IL-2-Liposomen (50.00 U pro Tag). Die Anzahl an Lebermetastasen wurde in jeder therapeutischen Gruppe am Tag 12 nach der Tumorbeimpfung beurteilt. Ein bis 2 ml einer 15%igen India-Tintenlösung wurde in die Arteria mesenterica von anästhesierten Mäusen injiziert. Die Leber wurde entfernt und in Fekete-Lösung (30 ml Formalin und 15 ml Eisessig in 300 ml 70%igem Ethanol) gegeben. Die Lebermetastasen wurden gezählt, und es wurde ein einzelner Studenten-t-Test zum Beurteilen der Deutlichkeit der Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen verwendet.
Die in 1 dargestellten Daten veranschaulichen repräsentative Ergebnisse, die in drei getrennten Versuchen erhalten wurden. Unbehandelte Mäuse wiesen am Tag 11 236 ± 30 Lebermetastasen auf. Mäuse, die mit T-AK-Zellen von einer keinen Tumor tragenden Maus (normal) behandelt wurden, wiesen 99 ± 23 Metastasen auf, während T-AK-Zellen, von Früh-TBM eine noch stärkere Reduktion in der Anzahl an Metastasen auf 48 ± 16 erzeugten. T-AK-Zellen, die von Spät-TBM erhalten wurden, misslang die Erzeugung von jeglicher therapeutischer Wirkung, da Lebermetastasenanzahl 229 ± 41 betrug. Die therapeutische Wirksamkeit von T-AK-Zellen ist deshalb drastisch reduziert, wenn diese Zellen von Spät-TBM erhalten werden.
Beispiel 2
Deutliche Abnahme der Cytotoxizität in vitro in T-Lymphozyten von Langzeit-TBM
Die Cytotoxizität in vitro von Lymphozyten von Langzeit-TBM ist bei einem nicht-bösartigen Zustand deutlich vermindert. Standard-Chromabgabetests wurden unter Verwendung von T-AK-Zellen, die nach anfänglicher Stimulation mit Anti-CD3 mit 100 U rIL-2 in Kultur gehalten wurden, als Effektoren durchgeführt. Die Tests wurden an den Kulturtagen 2, 4 und 7 durchgeführt. Tumorzelle (4 × 10⁶/ml) wurden mit 150 μCi Na₅₁CrO₄ (1000 μCi/ml, New England Nuclear Products, Boston, MA) bei 37°C für eine Dauer von 60 Minuten inkubiert. Die Ziele wurden zweimal mit TCM gewaschen, im Medium erneut suspendiert und gezählt. Die T-AK-Effektorzellen wurden zweimal gewaschen und dann in dreifacher Ausführung in Mikrotiterplatten mit U-förmigem Boden (Costar) aliquotiert und seriell auf das zweifache verdünnt, um Effektor : Zielzell-Verhältnisse im Bereich von 24:1 bis 3:1 zu erhalten. 5000 Ziele wurden pro Mulde zugesetzt. Mulden mit spontaner Abgabe enthielten nur Zielzellen in Kulturmedium. Die Mulde mit maximaler Abgabe enthielt Zielzellen in Detergens. Die Platten wurden für eine Dauer von 4 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und die Radioaktivität in einem Gammazähler (LKB 1272) gezählt. Der Prozentgehalt an spezifischer Cytotoxizität wurde durch die folgende Formel bestimmt: Mittlere Versuchs-cpm – spontane mittlere cpm × 100 = % Cytotoxizität Maximale mittlere cpm – spontane mittlere cpm
Am Kulturtag 2 war die cytotoxische Aktivität in den Früh-TBM-Zellen durchweg am höchsten (2), während sowohl diejenige der keinen Tumor tragenden (normalen) als auch diejenige der Spät-TBM-Zellen niedriger war. Die lytische Funktion der Zellen von normalen Mäusen am Kulturtag 4 war deutlich erhöht, war jedoch in den Früh-TBM am höchsten (3). Spät-TBM-Lymphozyte wiesen die niedrigste lytische Funktion auf.
Nach nur 7 Kulturtagen zeigten die Lymphozyten von Spät-TBM eine deutliche Zunahme der lytischen Funktion (3). Die lytische Aktivität wurde auch gegen das synergene Ziel MBL2 (Lymphom) und ein allogenes Ziel RENCA (Nierenzellkarzinom) beobachtet. Die absoluten Cytotoxitätsgrade variierten mit den Zielen, jedoch waren die Früh-TBM-Zellen durchweg am lytischten und wiesen die Spät-TBM-Zellen die geringste Aktivität auf.
Cytotoxizitätstests wurden unter Verwendung von CD8⁺-angereicherten Präparaten von Früh- und Spät-TBM durchgeführt. Präparate mit angereicherten T-Zellen wurden durch Durchleiten einer einzelnen Zellsplenocytsuspension nach den Anweisungen des Kits durch eine T-Zellsäule (Biotex Laboratory Inc., Edmonton, Kanada) geleitet. Zum Anreichern für CD8⁺-Zellen wurden T-angereicherte Zellen mit 1 μg/1,0 × 10⁶ Zellen von Anti-L3T4 (500 μg/ml, Becton Dickinson, Mountain Viev, CA) für eine Dauer von 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal in HBSS gewaschen. Fc-spezifische beschichtete Magnetperlen aus Ziegen-Anti-Mäuse-IgG (Advanced Magnetics Inc., Cambridge, MA) wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit PBS inkubiert und mit den angereicherten T-Zellen mit einem Perlen-zu-Zellen-Verhältnis von 25:1 bei 4°C für eine Dauer von 30 Minuten gemischt und dann auf einer magnetischen Abtrennvorrichtung (Advanced Magnetics) abgetrennt. Der letzte Schritt wurde zweimal wiederholt. Ungebundene Zellen wurden entfernt und zweimal mit HBSS gewaschen. CD8⁺- angereicherte Zellen wiesen weniger als 2% kontaminierende CD4⁺-Zellen auf. Eine phenotypische Analyse der angereicherten Zellpräparate zeigte mehr als 95% CD8⁺.
CD8⁺-angereicherte Zellen zeigten eine ähnliche lytische Aktivität wie diejenige von nicht abgetrennten Lymphozyten (Tabelle 1). Zum Eliminieren der eventuell zu verwechselnden Wirkungen von noch kleineren Anzahlen an kontaminierenden Zellen wurden CD8⁺-Zellen auch durch FACS positiv sortiert, mit Anti-CD3 + IL-2 gezüchtet und auf lytische Funktion getestet. Eine positive Zellauswahl durch FACS wurde mit T-angereicherten Zellen von frischen Splenocytenpräparaten (mehr als 95% Zellen aus Thy 1.2⁺) durchgeführt. Diese Zellen wurden mit 1 μg/1,0 × 10⁶ Zellen von Anti-Lyt.2 FITC und Anti-L3T4 (500 μg/ml, Becton Dickinson) für eine Dauer von 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann in FITC⁺ (CD8⁺-Zellen) und PE⁺ (CD4⁺-Zellen) auf einem Fließcytometer des Typs FACStar Plus (Becton Dickinson) sortiert.
Die lytische Aktivität der CD8⁺-Lymphozyten von Früh-TBM war wieder die höchste, während diejenige der Spät-TBM-Zellen die niedrigste war (Tabelle 1). In allen Versuchen blieben die Ergebnisse ungeachtet dessen, ob es sich bei den Effektorzellen um angereicherte T-Zellen, angereicherte CD⁺- oder reine CD8⁺-Zellen handelte, ähnlich. Die in den CD8⁺-Zellen von Spät-TBM nach 7 Kulturtagen ersichtliche Zunahme der Cytotoxitität kann auf Grund einer Zunahme der lytischen Funktion der ursprünglich unterdrückten CD8⁺-Zellen oder auf Grund der Vermehrung einer kleinen Subpopulation von nie unterdrückten CD8⁺-Zellen vorliegen. TABELLE 1 Cytotoxische Aktivität von T-Zellen von normalen Mäusen, Früh-TBM und Spät-TBM^a

^aCytolytische Aktivität von T-angereicherten, CD8⁺-Zellen, erhalten durch CD4⁺-Abreicherung oder Zellspeicherung. Die Zellen wurden mit Anti-CD3 aktiviert und in TCM mit 100 U IL-2/ml für eine Dauer von 3 Tagen gezüchtet.

Beispiel 3
Phänotypische Analyse von T-angereicherten Zellpräparaten von frischen Splenocyten von normalen Mäusen, Früh-TBM und Spät-TBM
Die abnormale Aktivität von Spät-TBM-Zellen ist mit keinen großen Abänderungen in den T-Zellsubpopulationen oder -verteilungen verbunden. Zur Bestimmung dessen, ob ein Unterschied im Prozentgehalt an Subpopulationen von T- Lymphozyten den Unterschied in der lytischen Funktion erklären könnte, wurde das Phänotypifizieren in folgender Weise durchgeführt. Frische Splenocyten von den verschiedenen Mäusegruppen wurden für T-Zellen angereichert und zum Entfernen von kontaminierenden Tumorzellen gereinigt. Die Daten wurden von Zellpräparaten erhalten, die größer als oder gleich 95% Thy 1,2⁺ waren.
Es lag eine gleich bleibende jedoch keine deutliche Abnahme in den L3T4⁺-Populationen von Spät-TBM (Tabelle 2) vor. Die CD4/CD8-Verhältnisse in diesen Mäusen blieb jedoch innerhalb der normalen Grenzen. Die Phänotypen von frischen Splenocyten, die nicht für T-Zellen angereichert waren und von denselben Mäusegruppen erhalten wurden, zeigten keine deutliche Veränderung in den Subpopulationen der T-Zellen. Große Abänderungen in den Subpopulationen oder in der Verteilung der T-Zellen sind deshalb nicht mit der abnormalen Aktivität von Spät-TBM verbunden. Tabelle II Phänotypische Analyse von T-angereicherten von normalen Mäusen, Früh-TBM und Spät-TBM^a

^aPhänotypische Analyse von T-angereicherten Zellen von normalen und Tumor-tragenden Mäusen (TBM). Fließcytometrie wurde von aus der Milz von Tumor-tragenden Mäusen isolierten T-Lymphozyten in verschiedenen Zeiträumen durchgeführt. T-Lymphozyten wurden auf einer T-Zellsäule (Cellect, Biotex) unmittelbar nach der Isolierung angereichert.

Beispiel 4
Keine großen Unterschiede wurden in den Lymphokingehalten in Überständen von aktivierten T-angereicherten Zellen von normalen Mäusen, Früh-TBM und Spät-TBM beobachtet
Zur Bestimmung dessen, ob eine unangemessene Funktion der Subpopulation von CD4⁺-Helferzellen die grundlegende Ursache für das verminderte immunologische Ansprechverhalten in Spät-TBM war, wurden die Lymphokingehalte in den Überständen von aktivierten angereicherten T-Zellen von normalen Mäusen, Früh-TBM und Spät-TBM verglichen. Proben von Überständen wurden nach 24, 48 und 72 Stunden aufgenommen. IL-1 α wurde unter Verwendung des Interest-I-α-Elisa für Mäuse (Genzyme, Cambridge, MA) gemessen. Biologisch aktives Protein wurde unter Verwendung des Bioassays von IL-1-Mäuse-Thymozyten bestätigt. Die IL-2-Gehalte wurden mit dem IL-2-Elisa-Kit (Collaborative Research, Inc., Bedford, MA) getestet und mit dem Il-2-Bioassay unter Verwendung der IL-2-abhängigen Zellreihe CTLL-2 (ATCC) bestätigt. IL-6-Gehalte wurden mit dem Elisa-Kit für Mäuse-IL-6 (Endogen Inc., Boston, MA) gemessen und mit dem Bioassay für Mäuse unter Verwendung der Plasmazytom-Zellreihe T1165 (Genetics Institute) bestätigt. Die gesamten Mäuse-Interferone wurden mit dem Virusbioassay L929 (ATCC) gemessen. Die TNF-α-Gehalte wurden mit der Mäuse-Fibroplast-Zellreihe 1929 (ATCC) gemessen.
Es lagen keine großen Unterschiede in den in den T-AK-Kulturen von Früh- und Spät-TBM in drei unterschiedlichen Versuchen gemessenen Lymphokingehalten vor. Die Daten nach 48 Kulturstunden von zwei dieser Versuche sind in Tabelle III dargestellt. Deutliche Unterschiede in der lytischen Funktion wurden in diesen gleichen Versuchen beobachtet. Die Lymphozytenproduktion war deshalb in den Überständen von aktivierten T-angereicherten Zellen von normalen Mäusen, Früh- und Spät-TBM quantitativ und qualitativ ähnlich. Tabelle III Lymphokingehalte in Überständen von aktivierten T-angereicherten Zellen von normalen Mäusen, Früh-TBM und Spät-TBM^a

^aLymphokingehalte in Überständen von T-angereicherten Zellen von normalen und TBM, aktiviert mit Anti-CD3. Die Proben wurden nach 24, 48 und 72 Stunden erhalten. Die dargelegten Daten gelten für 48 Stunden.
^bpg/ml
^cI. U./ml

Beispiel 5
CD4⁺-Zellen von Spät-TBM mit adäquater Helferfunktion.
CD4⁺-Lymphozyten in Spät-TBM sind als Helferzellen aktiver als CD4⁺-Zellen von normalen Tieren. Mischversuche wurden durchgeführt, um zu testen, ob CD4⁺-Zellen von Spät-TBM die Entwicklung von lytischer Funktion in normalen CD8⁺-Zellen verbessern oder unterdrücken würde. Gereinigte CD4⁺- und CD8⁺-Lymphozyten wurden miteinander in Mulden mit 24 mm gezüchtet, die durch eine Membran mit einer Porengröße von 4 μm untertrennt waren. Diese Porengröße gewährt den freien Austausch von löslichen Bestandteilen. Cytotoxizitätstests wurden am Kulturtag 2 durchgeführt.
CD8⁺-Zellen in normalen Mäusen zeigten beim Züchten zusammen mit CD4⁺-Zellen von Spät-TBM verglichen mit ihren lytischen Aktivität (204 L. U.) in Gegenwart von normalen CD4⁺-Zellen (Tabelle IV) eine erhöhte lytische Aktivität (655 L. U.). CD4⁺-Zellen von Spät-TBM konnten die hohe lytische Funktion von CD8⁺-Lymphozyten von Früh-TBM (1075 L. U.) sogar besser unterstützen als normale CD4⁺-Zellen (482 L. U.). CD4⁺-Lymphozyten sind nicht für das Unterdrücken der Funktion von CD8⁺-Zellen in Spät-TBM verantwortlich, da diese Zellen als Helferzellen aktiver als CD4⁺-Zellen von normalen Tieren sind. Tabelle IV CD4⁺-Zellen von Spät-TBM unterdrücken die lytische Funktion in CD8⁺-Zellen nicht^a

^aMischversuche wurden durch Kombinieren von frisch isolierten Zellsubpopulationen in Mulden mit 24 mm nach Stimulation mit Anti-CD3 und IL-2 durchgeführt. Versuche wurden auch unter Verwendung von „Transwell"-Platten von Costar durchgeführt, wobei die Subpopulationen durch eine Membran mit einer Porengröße von 0,4 μm von abgeteilt waren. Die lytische Funktion wurde drei Tage nach Starten der Kultur gegen MBL2-Lymphom getestet.

Beispiel 6
CD8⁺-Zellen von den Spät-TBM unterdrücken keine anderen CD8⁺-Zellen.
CD8⁺-Zellen von Spät-TBM sind unbrauchbar. CD8⁺-Zellen von Spät-TBM weisen eine schlechte lytische Aktivität auf, wenn sie zusammen mit CD4⁺-Zellen von beliebiger Quelle gezüchtet werden. Als sie zusammen mit den am höchst aktiven CD4⁺-Zellen von Früh-TBM gezüchtet wurden, wiesen CD8⁺-Zellen von Spät-TBM 1/3 bis 1/4 der gesamten lytischen Aktivität von CD8⁺-Zellen von normalen Mäusen oder Früh-TBM auf. Versuche des gemeinsamen Züchtens, die in herkömmlichen einen Zell-Zell-Kontakt zwischen CD4⁺ und CD8⁺-Zellen gewährenden Mulden mit 24 mm durchgeführt wurden zeigten sehr ähnliche Ergebnisse, wobei wiederum CD8⁺-Zellen von Spät-TBM 1/3 bis 1/4 der gesamten lytischen Aktivität von CD8⁺-Zellen von normalen Mäusen oder Früh-TBM aufwiesen. Mischversuche unter Verwendung von CD8⁺-Zellen von Früh- und Spät-TBM lieferten keinen Hinweis darauf, dass die cytolytische Aktivität von CD8⁺ durch andere CD8⁺-Unterdrückerzellen unterdrückt wird. Sogar in Gegenwart von adäquater Helferfunktion waren CD8⁺-Zellen von Spät-TBM schwach cytotoxisch, was nahe legt, dass CD8⁺-Zellen das Ziel für Tumor-vermittelte Immununterdrückung ist.
Beispiel 7
Hemmung von cytotoxischer Aktivität von normalen Zellen durch Überstände von MCA-38-Zellkulturen
Die Abwesenheit von Unterdrückeraktivität in Subpopulationen von Lymphozyten von Spät-TBM legt nahe, dass das (die) hemmenden Signal(e) vom Tumor selbst stammen könnte. Titrationsversuche wurden unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen an Überständen von MCA-38-Zellkulturen durchge führt, indem sichergestellt wurde, dass die IL-2-Konzentration konstant gehalten wurde. Die Lymphozyten wurden mit Anti-CD3 aktiviert und mit 100 U/ml IL-2 gezüchtet. Die Kulturen wurden mit 1,5 × 10⁶ Zellen/ml gestartet, und Zelzählungen und Cytotoxizitätstests wurden am Kulturtag 3 durchgeführt.
Die cytolytische Aktivität von Lymphozyten, die in so wenig wie 30% Überstand von MCA-38-Zellen enthaltenden Medien gezüchtet wurden, nahm um 30–45% ab (Tabelle V). TGF-β ist ein Tumor-verbundenes Cytokin, das mit einer Tumor-vermittelten Unterdrückung in Verbindung gebracht wurde. Antikörper für TGF-β setzten jedoch die hemmenden Wirkungen des Tumorüberstandes nicht herab. In Bioassays misslang der Nachweis von jeglicher TGF-β-Aktivität im Tumorüberstand.
Ähnliche hemmende Wirkungen wurden durch Überstände des MBL-2-Lymphoms vermittelt. Die hemmenden Wirkungen des Tumors sind deshalb nicht auf das MCA-38-Modelsystem beschränkt. Diese Daten legen nahe, dass (ein) lösliche(s) Tumorprodukt(e) die Entwicklung von cytotoxischer Funktion in CD8⁺-Zellen in Spät-TBM hemmt (hemmen). Tabelle V Unterdrückung von cytolytischer Aktivität in vitro von normalen Lymphozyten durch Tumorzellüberstand^a

^aUnterdrücken von cytolytischer Aktivität von normalen Lymphozyten durch einen Überstand von MCA-38-Zellen in Kultur. Die Lymphozyten wurden mit Anti-CD3 aktiviert und mit 100 U/ml IL-2 gezüchtet. Verschiedene Konzentrationen des Überstands von MCA-38-Tumorkulturen wurden in die Zellkulturen titriert. Die Kulturen wurden mit 1,5 × 10⁶ Zellen/ml gestartet, und Zellzählungen und Cytotoxtzitätstests wurden am Kulturtag 3 durchgeführt.

Beispiel 8
Expression von RNA, die für die cytolytischen Proteine Granzym B und TNF-α kodiert
Die gesamte Zell-RNA von angereicherten T-Lymphozyten von normalen Mäusen und Früh- und Spät-TBM wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur durch Northern-Hybridisierung analysiert, um zu testen, ob die verminderte lytische Funktion von T-AK von Spät-TBM mit der Produktion von cytolytischen Effektor-Molekülen verbunden war. Zusätzlich wurden auch die durch Abreichern erhaltenen CD4⁺- und CD8⁺-Subpopulationen analysiert. Die Expression von RNA, die TNF-α, Granzym B, IL-2, IL-2R, IFN-γ und IL-6 kodiert, wurde bestimmt. Eine 18s-RNA wurde zum Bestimmen der relativen Mengen an auf die Gele gespeister RNA verwendet. Zum Kompensieren der Unterschiede in der Beladung wurden densitrometrische Verhältnisse zwischen der Expression von 18s und Granzym B von TNF-α durchgeführt.
Die Expressionsgrade von IL-2, IL-2R, IFN-γ und IL-6-RNA waren in den Lymphozyten von Früh- und Spät-TBM identisch. Der Gehalt an mRNA von Granzym-B war jedoch in den CD8⁺-Zellen von Früh-TBM nach 36-stündiger Kultur um das 10-fache höher als in CD8⁺ von Spät-TBM. Der Gehalt an mRNA von Granzym B in CD8⁺-Zellen von Spät-TBM war nach 36 Stunden ebenso deutlich geringer als in normalen CD8⁺-Zellen, wie gemessen durch Densitometrie. Die Expression von Granzym B kodierender mRNA in den CD8⁺-Zellen von Spät-TBM nahm auf Gehalte, die mit denjenigen, die nach 36-stündiger Kultur in Früh- TBM ersichtlich waren, vergleichbar waren, nur am Kulturtag 8 zu. Es ist nicht bekannt, ob es sich bei den Granzym B exprimierenden Zellen am Tag 8 in den Zellen von Spät-TBM eine kleine Subpopulation von Zellen handelte, die auf nachweisbare Gehalte am Tag 8 wucherten, oder ob es die Zeit in der Kultur erlaubte, dass die CDB⁺-Zellen die cytolytische Funktion wiedergewannen und wiedererlangten.
Die Expression von mRNA von TNF-α war auch in den T-Lymphozyten von Früh-TBM, gemessen nach 36-stündiger Kultur, verglichen mit derjenigen von normalen Mäusen oder Spät-TBM am höchsten. Die Expression von mRNA von TNF-α in T-Lymphozyten von Spät-TBM nahm auf mit denjenigen in Früh-TBM vergleichbare Grade nach 36-stündiger Kultur nur nach Kulturtag 8 zu.
Beispiel 9
Deutliche Veränderungen in der Expression von CD3ζ und CD3γ in T-Lymphozyten von Früh-TBM
Die Expression des TCR-CD3-Komplexes wurde ebenso durch Fluoreszenzintensität der T-Zellen nach dem Markieren mit der Kontrolle Fluorescin-markiertes IgG2A, Anti-Mäuse-αβ (Pharmingen) oder Anti-CD3 (145-2C11) gemessen. Eine phänotypische Analyse zeigte, dass es sich bei den gereinigten T-Zellen von Spät-TBM um CD3⁺ (97%), Thy 1,2⁺ (98%), αβ⁺ (98%), NK1.1- (< 1%) mit einem normalen CD4(L3T4⁺)/CD8(Lyt2⁺)-Verhältnis handelte. Ein Vergleich des TCR-CD3-Komplexes von T-Zellen von normalen Mäusen und Spät-TBM zeigte keine deutlichen Veränderungen in der Expression des TCR-CD3-Komplexes, wie durch die Fluoreszenzintensität nahe gelegt. Die zum Phänotypifizieren des TCR verwendeten Antikörper binden sich jedoch nur an jeweils eine der sieben Ketten im TCR-CD3-Komplex.
Ein weitere Beurteilung des TCR-CD3-Komplexes wurde durch Oberflächenmarkieren mit ¹²⁵Iod, Immunfällung mit Anti-CD3 (145-2C11) und Auflösung durch 2-D-nichtreduzierende-reduzierende SDS-PAGE durchgeführt. Etwa 5 × 10⁷ T-Lymphozyten von normalen Mäusen und Spät-TBM wurden mit ¹²⁵Iod durch das Lactoperoxidase-Glukoseoxidase-Verfahren markiert. Current Protocols in Immunology, Band I, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach und W. Strober (eds.), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 8.11.1–8.11.4 (1991). Nach dem Markieren wurden die TCR-Komplexe mit 145-2C11-MAb gefällt, auf Protein-G-Sepharose absorbiert und durch 2D-nichtreduzierende-reduzierende 14%ige SDS-PAGE aufgelöst. Die großen Veränderungen in den TCR-CD3-Bestandteilen der T-Zellen von Spät-TBM waren ersichtlich. Das Protein der CD3ζ-Untereinheit fehlte, und es lag eine deutliche Abnahme im CD3γ vor. Zusätzlich lag ein blasser Fleck unter der Diagonale vor, der einem kleinen Protein entsprach, was nahe legt, dass eine Fcεγ-Kette mit dem TCR-CD3-Komplex verbunden war. E. Reinherz, J. Exp. Med., 175: 203 (1992).
Die Oberflächenexpression des TCR-CD3-Komplexes von T-Lymphozyten von normalen und Spät-TBM wurde analysiert. T-Lymphozyten von normalen Mäuse exprimierten den αβ-Ti-Komplex, die δ-, ε- und γ-Ketten des CD3 sowie das ζ-Homodimer. T-Lymphozyten von Spät-TBM exprimierten jedoch die CD3ζ- oder CD3γ-Ketten nicht.
Western-Blots unter Verwendung von Anti-ζ oder Anti-Fcεγ bestätigten diese Beobachtungen. Etwa 2 × 10⁷ T-Zellen von normalen und Spät-TBM wurden in Lysepuffer (25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Triton-x 100, 1 mM Natriumortovanadat, 10 μg/ml Aproptinin, 10 μg/m; Leupeptin und 5 mM EDTA) angelöst. Das Lysat wurde zentrifugiert und der Überstand mit Kaninchen-Anti-ζ-Antiserum, der Kontrolle normales Kaninchenserum, Anti-CD3ε (145-2C11 MAb) oder der Kontrolle Anti-human-CD4 (OKT4) immungefällt. Die Immunfällung wurde durch SDS-PAGE aufgelöst und mit Anti-ζ-Kaninchenserum geblottet. T-Lymphozyten von Spät-TBM verloren die Expression der ζ-Kette und exprimierten die Fcεγ-Kette, was gewöhnlich in T-Zellen nicht zu sehen ist. Bei dem TCR in T-Zellen von Spät-TBM handelte es sich deshalb um αβ, δε, Fcεγ₂ statt um den gewöhnlich in T-Lymphozyten ersichtlichen αβ, γδεζ₂. T-Lymphozyten von Früh-TBM wurden nicht auf die TCR-CD3-Struktur getestet.
Eine Western-Blot-Analyse von T-Lymphozyten von Spät-TBM zeigte, dass eine ζ-Proteinexpression in diesen Zellen nicht nachweisbar war. T-Lymphozyten von normalen Mäusen und Früh-TBM, die unter denselben Bedingungen isoliert wurden, exprimierten normale Gehalte an ζ-Protein. Folglich fehlt ein wichtiger Bestandteil im TCR von dem TCR der T-Lymphozyten von Spät-TBM. Der Verlust an ζ-Proteinexpression in T-Lymphozyten von Spät-TBM steht mit dem Verlust der Cytotoxizität in vitro und immuntherapeutischen Aktivität in vivo in Beziehung.
T-Lymphozyten von Spät-TBM exprimierten jedoch normale TCR-Gehalte, wie bestimmt durch Immunofluoreszenz mit Anti-αβ und Anti-ε. Ein Western-Blot mit Anti-Fcεγ zeigte die einzigartige Expression dieses Vertreters der ζ-Familie in T-Lymphozyten von Spät-TBM. Die Expression von Fcεγ in T-Lymphozyten von Spät-TBM kann die Gegenwart in diesen Zellen von normalen TCR-Gehalten in ihrer Membran erklären.
Beispiel 10
Abnormale Signalwiedergabe in Lymphozyten von Spät-TBM
T-Lymphozyten von Spät-TBM zeigen eine abgeänderte Form der Signalwiedergabe. Dies ist aus der Tatsache ersichtlich, dass T-Lymphozyten von Spät-TBM verglichen mit T-Lymphozyten von normalen Mäusen oder Spät-TBM eine deutliche Abnahme ihrer Fähigkeit zum Mobilisieren von Ca²⁺ aufweisen. Der Calciumfluss wurde durch Calcium-sensitive Fluoreszenz in T-Lymphozyten gemessen und die Calciumkonzentration gemäß Current Protocols in Immunology, Band I, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach und W. Strober (eds.), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 5.5.1–5.5.15 (1991) beurteilt. Etwa 1 × 10⁷ T-Zellen wurden mit Indo-1 beladen und mit 10 ng/ml Anti-CD3-MAb (145-2C11) stimuliert. Der maximale Fluss wurde nach Lyse mit Calciumionophor bestimmt. Die maximale Fluoreszenz wurde nach der Lyse mit Triton-X 100 und minimaler Fluoreszenz nach Calciumchelatbildung mit EGTA bestimmt.
Die Stimulation von Lymphozyten von Spät-TBM mit Anti-CD3-MAb zeigte verglichen derjenigen von normalen Mäusen oder von Früh-TBM eine deutlich verminderte Fähigkeit zum Mobilisieren von Ca²⁺. Sogar eine verlängerte Inkubation mit Anti-CD3 (400 Sekunden) war nicht ausreichend, die in T-Zellen von normalen oder Früh-TBM ersichtlichen Grade des Ca²⁺-Flusses zu erzielen. Eine Stimulation von T-Lymphozyten von Spät-TBM mit Calciumionophor führte jedoch zu einem äquivalenten maximalen Ca²⁺-Fluss, was die adäquaten intrazellulären Speicherungen in den Zellen zeigt.
Zusätzlich war das Muster der Phosphorylierung von Tyrosinresten in T-Lymphozyten von Spät-TBM verglichen mit demjenigen von Zellen von normalen Mäusen oder Früh-TBM deutlich unterschiedlich. Etwa 1 × 10⁷ Zellen wurden in serumfreiem Medium mit 10 ng/ml Anti-CD3 (145-2C11) für eine Dauer von 2 Minuten stimuliert. Die Reaktion wurde durch zweimaliges Waschen der Zellen in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 400 μM Natriumorotvanadat und 1 mM EDTA, gestoppt. Die Zellen wurden in 100 μl Lysepuffer (25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 1 mM Natriumortovanadat, 10 μg/ml Aproptinin, 10 μg/m Leupeptin und 5 mM EDTA) für eine Dauer von 5 Minuten auf Eis lysiert. Die Lysate wurden zentrifugiert und die Überstände durch 10,5%iges SDS-PAGE unter reduzierten Bedingungen analysiert. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf einen PVDF-Filter (Imobilon-P) überführt, mit 5%iger Gelatine in TBST-Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 135 mM NaCl, 0,1% Tween 20) blockiert und mit Anti-Phosphortyrosin MAb (40 ng/ml) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Blots mit Anti-Mäuse-Ig-MAb, konju giert mit Peroxidase, inkubiert, einem ECL-Kit (Amersham) unterzogen und mit einem Röntgenfilm belichtet.
Das grundlegende Muster von phosphorylierten Tyrosinresten war in T-Lymphozyten von Spät-TBM verglichen mit den anderen zwei Gruppen deutlich abgeändert. Veränderungen in den Resten im Bereich von 40 bis 52 Mr waren durchwegs in drei Experimenten ersichtlich. Die Stimulation mit Anti-CD3 jedoch induzierte die Phosphorylierung von Tyrosinresten, wodurch eine wirksame Signalwiedergabe gezeigt wurde.
Keine Unterschiede wurden zwischen normalen gereinigten T-Zellen der Milz und denjenigen von Tumor-tragenden Mäusen in der Fluoreszenzintensität (ein Indikator für die Rezeptoranzahl) oder im Prozentgehalt an das TCRαβ-Heterodimer (4A) oder den CD3-Komplex (4B) exprimierenden Zellen nachgewiesen. Eine Fließcytrometrie zeigte, dass T-Zellen der Milz von Tumor-tragenden Mäusen Thy 1.2 (98%) und TCRαβ (98%) exprimieren und ein normales CD4/CD8-Verhältnis aufweisen. Sie exprimierten keine NK-Zellmarkierungen: NK1.1 war < 1%. CD16 (Fc-Rezeptoren) war < 1%. Keine Asymmetrie des Repertoires an T-Zellenrezeptoren wurde nachgewiesen, als die Verwendung des V_β-Gens in T-Zellen der Milz untersucht wurde. Die Bindung des Liganden an den TCR verursacht eine Ca²⁺-Mobilisierung. Weiss, (1990), J. Clin. Invest. 86, 1015. Im Gegensatz zu T-Zellen von normalen Mäusen wiesen diejenigen von Tumor-tragenden Mäusen ein abgestumpftes Calciumansprechverhalten auf, als sie mit monoklonalem Antikörper für CD3 (Anti-CD3) stimuliert wurden. Das Ansprechverhalten verbesserte sich mit verlängerten Inkubationsdauern (400 s) (4A) nicht. Jedoch führte eine Stimulation mit Calciumionophor (Indo-1) zu einem äquivalenten maximalen Fluss an Ca²⁺-Konzentrationen in normalen T-Zellen und in denjenigen von Tumor-tragenden Mäusen. Folglich wiesen die Zellen von Tumor-tragenden Mäusen adäquate intrazelluläre Ca²⁺-Speicherungen und eine Beladung mit Indo-1 auf. Eine Analyse von gereinigten Subpopulationen von CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen zeigte quantitativ ähnliche Fehlstellen in jeder Subpopulation. Diese T-Zellen gaben in Reaktion auf eine Signalgebung durch den TCR auch dann keine optimalen intrazellulären Ca²⁺-Speicherungen ab, wenn die Oberflächendichte des TCR normal war.
Beispiel 11
Eine Expression von Lck und Fyn ist in T-Lymphozyten von Spät-TBM nicht nachweisbar oder herabgesetzt
Bei einer Proteintyrosinphosphorylierung handelt es sich um das frühste nachweisliche Ereignis der TCR-vermittelten Signalgebung, das einer Phosphatidylinositolhydrolyse, Ca²⁺-Mobilisierung und späteren funktionellen Ereignissen wie Cytokinsekretion und Cytokinrezeptorexpression vorangeht (June et al., 1990 P. N. A. S. 87: 7722, J. Immunol. 144: 1591; Mustelin et al., Science 1990, 247: 1584). Da der TCR-abhängige Ca²⁺-Fluss beeinträchtigt war, wurde auch die TCR-abhängige Proteintyrosinphosphorylierung untersucht und als abgeändert befunden. Das grundlegende Muster der Proteintyrosinphosphorylierung war verglichen mit normalen Zellen in T-Zellen von Tumor-tragenden Mäusen abgeändert.
Die TCR-vermittelte Signalgebung wurde in T-Lymphozyten von Tumor-tragenden Mäusen bestimmt. (A) Die TCR-abhängige Ca²⁺-Mobilisierung wurde wie folgt bestimmt: T-Zellen (1 × 10⁷) wurden mit Indo-1 beladen und mit Anti-CD3 (1 μg/ml) stimuliert. Die maximale Ca²⁺-Abgabe wurde in mit Calciumionomycin stimulierten Zellen bestimmt. Die maximale Fluoreszenz wurde in mit Triton-X 100 lysierten Zellen bestimmt, und die Fluoreszenz wurde nach Chelatbildung von Ca²⁺ mit EGTA gemessen. Die Konzentration von freiem intrazellulärem Ca²⁺, [Ca²⁺]_i, wurde durch in Grynkiewicz et al. Biol. Chem., 260: 3440 (1985) gelehrte Verfahren gemessen. (B) Die Proteintyrosinphosphorylierung wurde wie folgt bestimmt: Gereinigte T-Zellen (10 × 10⁶) von normalen (N) oder Tumor-tragenden (T) Mäusen wurden in serumfreien Medium mit 10 μg/ml gereinigtem Anti-CD3 für eine Dauer von 2 Minuten stimuliert (+) oder unbehandelt gelassen (–). Die Reaktion wurde durch zweimaliges Waschen der Zellen in einkalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 400 μm Natriumortovanadat und 1 mM EDTA, gestoppt. Die T-Zellen wurden zum Entfernen der Kerne lysiert und zentrifugiert. Die Proteine in Überständen wurden durch SDS-PAGE abgetrennt, auf Immobilon-P-Filter (Millipore) überführt und mit Antikörper für Phosphotyrosin, MAb-4Glo (40 ng/ml), immun-geblottet. (C) Die Expression von p56^lck und p59^fyn in T-Lymphozyten von normalen und Tumor-tragenden Mäusen wurde wie folgt bestimmt: Proteine in Zelllysaten wurden durch SDS-PAGE (14%igel Gel) abgetrennt, auf Immobilon-P überführt und mit Antiserum für Lck- und Fyn-Peptide (UBI) immun-geblottet.
Eine Stimulation mit Anti-CD3 induzierte eine Proteintyrosinphosphorylierung, jedoch war das Muster der phosphorylierten Proteine nicht normal. Das abnormale Muster der grundlegenden Proteintyrosinphosphorylierung in diesen T-Zellen kann aus den Abänderungen in der Expression von zellulären Proteintyrosinkinasen oder in der Synthese der Substrate resultieren. Deshalb wurde die Expression von in T-Lymphozyten exprimierten p56^lck und p59^fyn, zwei Proteintyrosinkinasen (PTKs) der SRC-Familie (Varonova and Sefton, 1986, Nature 319: 682; Rudd et al., P. N. A. S. 1988, 85: 5190; Samuelson et al., 1990, P. N. A. S. 87: 4358) getestet. Ein Immunblotten von Proteinen der gesamten Zellextrakte zeigte verglichen mit normalen Mäusen eine Reduktion von p56^lck und p59^fyn in T-Zellen von tumortragenden Mäusen.
In Übereinstimmung mit diesem abgeänderten Muster der Phosphorylierung der T-Lymphozyten von Spät-TBM war die Expression von Lck in diesen gleichen Zellen deutlich vermindert. Ein wie vorstehend beschrieben hergestelltes Probenzelllysat wurde in ein 8%iges SDS-PAGE geleitet und mit Anti-Lck- oder Anti-Fyn-Kaninchenserum geblottet. Die Abwesenheit von ζ und die Reduktion in Lck kann den Signalwiedergabeprozess abändern, wodurch die Aktivierung des lytischen Mechanismus verhindert oder verzögert wird. Veränderungen im Expressionsgrad von ζ, CD3γ und Lck in T-Lymphozyten stellen Markierungen bereit, mit welchen zu identifizierende Zellen zur Aktivierung für eine Eigenblutimmuntherapie fähig sind.
Zusätzlich zu den strukturellen Veränderungen im TCR weisen die T-Zellen von Tumor-tragenden Mäusen eine Abnahme von p56^lck und p59^fyn auf. Studien mit PTK-Hemmstoffen zeigten die Funktion solcher Enzyme in der TCR-vermittelten Signalwiedergabe (June et al., 1980, vorstehend genannt). Jedoch blieben eine Wucherung in Reaktion auf Anti-CD3, eine Heraufregulierung von Interleukin-2-Rezeptoren und die Erzeugung von Lymphokinen (Interleukin-2, Interleukin-6, Interferone) in T-Zellen von Tumor-tragenden Mäusen normal. Folglich kann die lytische Funktion stärker von der PTK-Aktivität als von anderen Lymphocytfunktionen abhängen. Eine Interleukin-2-Sekretion kann in Abwesenheit von TCR-abhängigem Ca²⁺-Fluss normal sein.
Überstände einer Vielzahl von Tumorzellreihen hemmen die Anti-CD3-induzierte Cytotoxizität durch normale T-Zellen in vitro. Genau die gleichen funktionellen Abnormalitäten und TCR-Strukturabnormalitäten werden in T-Zellen von das RENCA-Nierenzelladenokarzinon tragenden BALB/c-Mäusen beobachtet. Folglich sind diese Funde für MCA-38-tragende Mäuse nicht einzigartig. Diese Funde sind wahrscheinlich mit der Wechselwirkung des Tumors und des Wirts in diesen Tieren verbunden. Die hier beschriebenen molekularen Veränderungen treten während den Erkrankungsstadien sowohl in MCA-38- als auch in RENCA-tragenden Mäusen auf, wenn diese Mäuse nicht kachektisch oder dem Tode geweiht sind.
Beispiel 12
Expression von TCR-Untereinheiten
Die Struktur des TCR wurde durch Oberflächeniodierung von gereinigten T-Zellen von normalen und Tumor-tragenden Mäusen beurteilt. Die Proteine im TCR-Komplex wurden dann mit Anti-CD3 immungefällt und durch zweidimen soinale nicht reduzierende-reduzierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) (Samuelson et al., 1985 Cell, 43: 223) abgetrennt.
Abänderungen in der Struktur des TCR in T-Lymphozyten von Tumor-tragenden Mäusen wurden wie folgt bestimmt: Fünfzigmillionen T-Lymphozyten wurden mit Na¹²⁵I durch das Lactoperoxidase-Glykoseoxidase-Verfahren markiert. Nach dem Markieren wurden die Zellen in 1 ml Lysepuffer [25 mM Tris (pH 7,4), 300 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin und 5 mM EDTA] für eine Dauer von 5 Minuten auf Eis lysiert. Die TCR-Komplexe wurden aus den Überständen von Zelllysaten mit auf Protein-G-Sepharose adsorbiertem Anti-CD3 immungefällt und durch 2-dimensionale nichtreduzierende(NR)-reduzierende(R) SDS-PAGE (14%iges Gel) aufgelöst. Die Spezifität der immungefällten Untereinheiten wurde mit einer Zellreihe (BW5147), welcher das TCR fehlt, bestätigt. Eine Immunoblotanalyse von TCRζ und Fcεγ-Expression wurde wie folgt durchgeführt: T-Zellen (20 × 10⁶) von normalen Tumor-tragenden Mäusen, BW5147 und 2D4.11, wurden gelöst und die Proteine von den Überständen der Zelllysate mit Kaninchenantiserum für CD3ζ (387) oder normalem Kaninchenserum (NRS) immungefällt. Lysate von TCR-negativem BW5147-Thymom wurden verwendet. Das 2B4.11-Hybridom wurde als positive Kontrolle für Fcεγ verwendet. Proteine in Immunfällungen wurden mit Kaninchenantiserum für CD3ζ-Peptid (387) (bereitgestellt von R. Klausner, NICHD) und Antiserum für Fcεγ (bereitgestellt von J. P. Kinet, NIAID) geblotted. Die Blots wurden mit Peroxidase-konjugiertem monoklonalem Antikörper für Mäuse-IgG durch verbesserte Chemolumineszenz (Amersham) entwickelt.
Sowohl das TCRαβ-Heterodimer (das auf Grund von Disulfidbindungen zwischen den Ketten unter die Diagonale migrierte) als auch die CD3ε-Kette (die auf Grund von Disulfidbindungen zwischen den Ketten über die Diagonale migrierte) lagen in den T-Lymphozaten von Tumor-tragenden Mäusen in etwa normalen Mengen vor.
Im Gegensatz dazu waren Abänderungen in anderen Elementen des TCR-CD3-Komplexes in T-Zellen von Tumor-tragenden Mäusen ersichtlich. Die CD3ζ-Kette fehlte und die Menge an CD3γ-Kette war reduziert. Das Misslingen des Nachweises der ζ-Kette in Verbindung mit dem auf der Zelloberfläche exprimierten TCR könnte aus den reduzierten bleibenden Mengen von CD3ζ, dem abnormalen Zusammenschluss und Transport oder der Instabilität von durch Detergens angelösten Rezeptorkomplexen resultieren. Zum Bestimmen dessen, ob nachweisbare CD3ζ-Proteingehalte vorlagen, wurden Proteine von den gesamten Zelllysaten von T-Zellen der Milz immungeblottet. Wieder fehlte im Gegensatz zu normalen T-Zellen die CD3ζ-Kette von T-Zellen von Tumor-tragenden Mäusen. Dieses Ergebnis war paradox, da der TCR in Abwesenheit von CD3 der ζ-Kette zu der Zelloberfläche uneffizient transportiert wird (Sussman et al., 1989). Jedoch kann der TCR mit anderen Vertretern der ζ-Familie verbunden sein (Orloff et al., 1990). Die Fcεγ-Kette ist ein ζ-verwandtes Protein, das für die ζ-ähnliche Funktion beim Fc-Rezeptor-Zusammenschluss und -Transport und bei der Signalwiedergabe dienlich ist (Reth, 1989). Ein Protein von kleinerer Molekülgröße als die ζ-Kette lag im Oberflächenmarkierungsversuch vor, die in der Größe Fcεγ ähnelte. Die Gegenwart dieser Kette in Tumor-tragenden T-Zellen wurde durch Immunblotten mit Antikörper für Fcεγ (Anti-Fcεγ) bestätigt. Folglich exprimierten die T-Lymphozyten von Tumor-tragenden Mäusen unübliche TCR-Komplexe, welchen die CD3ζ-Kette fehlte, die jedoch die Fcεγ-Kette im Hauptteil der T-Zellen enthielten. Abnormale TCR-Komplexe wurden sowohl in CD4⁺- als auch CD8⁺-Subpopulationen bemerkt. Die bleibenden Gehalte von mRNA für Lck und die CD3ζ-Kette waren normal oder erhöht, was nahe legt, dass der Fehler am posttranskriptionalen Grad auftrat.
Beispiel 13
Tests für Proteine der TCR-Untereinheiten und im Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten nach der Behandlung von Tumoren mit Flavonoiden und IL-2
Bestimmte Krebsformen bleiben für den Angriff von therapeutischen Systemen unangreifbar. Zum Beispiel ist das Nierenzellkarzinom (Adenokarzinom) gegen eine herkömmliche Chemotherapie resistent. Dies ist eine verheerende Erkrankung, da viele Patienten im Laufe der Diagnosezeit eine metastatische Erkrankung aufweisen. Deshalb sind die meisten der Behandlungsverfahren gegen Nierenzellkarzinom unwirksam, obwohl einige Antitumorwirkungen unter Verwendung von biologischen Ansprechmodifikatoren (BRM) beobachtet wurden. Da einige biologische Ansprechmodifikatoren, die einzeln verwendet wurden, (α-IFN, IL-2) eine therapeutische Wirksamkeit zeigten, die mindestens so gut wie eine herkömmliche Chemotherapie war, schlugen kombinierte Modalitätsvorgehensweisen, einschließlich BRM/BRM und BRM/Chemotherapie eine verbesserte Wirksamkeit ein.
Nagermodelle sind beim Identifizieren von therapeutisch wirksamen Kombinationen von Behandlungsmodalitäten nützlich. Komplexe Versuche, die verschiedene Permutationen in eventuell therapeutischen Mitteln, Dosis und Verabreichungsverordnung beinhalten, können schnell, relativ billig und ohne Risiko für die Patienten durchgeführt werden. Ein Beispiel für ein Nagermodel ist das RENCA-System, wobei ein RENCA-Nierenadenokarzinom vom Balb/c-Ursprung in eine orthotrope Stelle implantiert wird, von wo aus sie metastasiert, Murphy und Hrushesky, J. Natl. Cancer Inst., 50: 1013 (1980).
Die meisten Cytokine sind unwirksam, wenn sie als einzelne Mittel verwendet werden. Die wirksamsten Versuchsbehandlungen für diesen Tumor schließen IL-2 im Protokoll ein. Speziell erwies sich die Verwendung von IL-2 in Kombination mit IFN oder Cytokin-induzierenden Flavonoiden als besonders wirksam.
Bei eine Tumorreduktion zeigenden Tieren wurden T-Zellen für das Antitumor-Ansprechverhalten als essentiell befunden. Außerdem wurden Veränderungen in mit Tumoren verbundenen Molekülen für die Signalwiedergabe durch die Therapie umgekehrt. Das abgeänderte tyrosinphosphorylierte Muster der T-Zellen kehrte, wie durch Western-Blot gezeigt, zum normalen zurück. Eine erneute Expression von Lck und Zeta fand so früh wie 7 Wochen nach der Tumorinjektion (3–4 Wochen nach der Behandlung) statt. TCR und der CD3-Komplex waren nicht abgeändert.
Beispiel 14
Bewertung von Patienten für Eigenblutimmuntherapie.
Ein Patient mit Nierenkarzinom wird ausgewählt, und ein Lymphozytenpräparat aus peripherem Blut wird zum Analysieren der Expression von CD3ζ-Protein hergestellt. Lymphozyten werden von einem gesunden Individuum erhalten und in derselben Weise hergestellt und analysiert. Lymphozyten des peripheren Bluts werden durch Venenpunktion oder Lymphophorese isoliert. Zellen werden auf einem Ficoll-Hypaque-Gradienten abgetrennt, um einkernige Zellen zu erhalten. Die Zelldichte der so erhaltenen einkernigen Zellen wird bestimmt, und gleiche Anzahlen an Zellen von dem Patienten und dem gesunden Individuum werden für Protein extrahiert.
Gleiche Anzahlen an Zellen werden in Lysepuffer (25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 μg/ml Aproptinin, 10 μg/m; Leupeptin und 5 mM EDTA) angelöst. Das Lysat wird zentrifugiert und der Überstand mit Kaninchen-Anti-ζ-Antiserum immungefällt. Ein Kontrolllysat wird mit normalem Kaninchenserum immungefällt. Die Immunfällung wird durch SDS-PAGE aufgelöst, auf eine Nylonmembran (Imobilon-P) überführt und mit Anti-ζ-Kaninchenserum geblottet. Eine deutliche Reduktion in der Expression von ζ-Protein im Patienten verglichen mit der Kontrolle ist für eine Immumun terdrückung und den Verlust der Fähigkeit, die T-Lymphozyten des Patienten in autologer Eigenblutimmuntherapie zu verwenden, diagnostisch.
Beispiel 15
Veränderungen der Proteinexpression in Patienten mit Krebs
In sieben von zwölf menschlichen Krebspatienten wurde gefunden, dass die Expression der CD3ζ-Kette in Krebszellen von peripherem Blut fehlte oder vermindert war. Einige wiesen eine verminderte Expression von Lck und PLCγ auf. Folglich werden auch strukturelle und funktionelle Abänderungen in Molekülen für die Signalwiedergabe von T-Zellen von Tumor-tragenden Menschen bemerkt.
Beispiel 16
Impfstoffe
In einer anderen Ausführungsform wird der Immununterdrückungsfaktor der vorliegenden Erfindung in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung verwendet, die beim Verabreichen in einer wirksamen Menge eine Schutzimmunität gegen Immununterdrückung einschließen kann.
Die Herstellung von Proteine als Wirkstoffe enthaltenden Impfstoffen ist auf dem Fachgebiet wohlverstanden. Typischerweise werden solche Impfstoffe als injizierbare entweder flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt; feste Formen, die zur Auflösung oder Suspension in Flüssigkeit vor dem Injizieren geeignet sind, können ebenso hergestellt werden. Das Präparat kann auch in emulgierter Form vorliegen. Der immunogene Wirkstoff wird häufig mit pharmazeutisch verträglichen und mit dem Wirkstoff kompatiblen Exzipienten gemischt. Bei geeigneten Exzipienten handelt es sich z.B. um Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Zusätzlich kann der Impfstoff, falls gewünscht, geringe Mengen an Nebensubstanzen wie Netz- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel oder Zusätze oder Immunverstärker, die die Wirksamkeit des Impfstoffs erhöhen, enthalten.
Die Impfstoffe werden herkömmlich parenteral oder durch Injektion, z.B. entweder subkutan oder intramuskulär verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsmodi geeignet sind, schließen Suppositorien und in manchen Fällen orale Formulierungen ein. Für Suppositorien können traditionelle Bindemittel und Träger z.B. Polyalkylenglukose oder Triglyceride einschließen; solche Suppositorien können für den Wirkstoff im Bereich von 0,5% bis 10%, vorzugsweise 1,2% enthaltende Gemische gebildet werden. Orale Formulierungen schließen gewöhnlich eingesetzt Exzipienten wie z.B. Saccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen von pharmazeutischer Qualität ein. Die Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, pharmazeutisch verträgliche und mit dem Wirkstoff kompatible Exzipienten an. Bei geeigneten Exzipienten handelt es sich z.B. um Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Zusätzlich kann der Impfstoff, falls gewünscht, geringe Mengen an Nebensubstanzen wie Netz- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel oder Zusätze oder Immunverstärker, die die Wirksamkeit des Impfstoffs verbessern, enthalten.
Die proteinhaltigen Teilchen können in den Impfstoff als neutrale oder Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Peptids), die mit anorganischen Säuren wie z.B. Salz- oder Phosphorsäuren oder solchen organischen Säuren wie Essig- Oxal-, Wein-, Mandelsäuren und dergleichen gebildet werden, ein. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können ebenso von anorganischen Basen wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen abgeleitet werden.
Der Begriff „Einheitsdosis" bedeutet physikalisch gesonderte Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Wirkstoff, berechnet zur Herstellung der gewünschten therapeutischen Wirkung zusammen mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d.h. dem Träger oder Vehikulum, enthält.
Die Impfstoffe werden in einer mit der Dosierungsformulierung kompatiblen Weise und in solchen Mengen, wie sie therapeutisch wirksam und immunogen sind, verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Patienten, der Fähigkeit des Immunsystems des Patienten zum Synthetisieren von Antikörpern und dem gewünschten Schutzgrad ab. Genaue Mengen an Wirkstoffen, die zum Verabreichen erforderlich sind, hängen von der Beurteilung des Arztes ab und sind für jedes Individuum einzigartig. Jedoch liegen geeignete Dosierungsbereiche in der Ordnung von einem bis mehreren hundert Mikrogramm Wirkstoff pro Individuum. Geeignete Verordnungen zur anfänglichen Verabreichung und für Wiederholungsimpfungen sind ebenso variierbar, jedoch durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von ein oder zweiwöchigen Intervallen von einer anschließenden Injektion oder anderer Verabreichung verkörpert.
Beispiel 17
Diagnostische Systeme (Kits)
Ein diagnostisches Systeme, vorzugsweise in Kit-Form, das zum Nachweis der Gegenwart eines Proteins der vorliegenden Erfindung oder Antikörpers für das Protein in einer Körperprobe nützlich ist, schließt in getrennten Packungen (a) ein Antigenität zeigendes Protein der vorliegenden Erfindung und (b) ein markiertes spezifisches Bindemittel zur Signalgebung der Gegenwart der Immunreaktion des Proteins der vorliegenden Erfindung mit Antikörpern ein.
Ein „spezifisches Bindungsmittel" ist eine molekulare Einheit, die einen Liganden wie ein Protein der vorliegenden Erfindung oder ein mit einem Protein der vorlie genden Erfindung immunreagierender Antikörper selektiv binden kann. Beispielhafte spezifische Bindemittel sind Antikörper oder Antikörperfragmente wie Fab' und F(ab')₂', Komplementfragmente, Protein A und dergleichen.
In dieser Beschreibung bedeutet der Begriff „Markierung" in seinen verschiedenen grammatischen Formen einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt bei der Herstellung eines nachweisbaren Signals zum Anzeigen der Gegenwart eines Immunreaktanten beteiligt sind. Jedes beliebige Markierungsmittel kann an ein spezifisches Bindemittel gebunden oder darin eingebracht sein oder getrennt verwendet werden, und diese Atome oder Moleküle können allein oder zusammen mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Solche Markierungen sind selbst in der Immunchemie bekannt und bilden nur insofern einen Teil dieser Erfindung, dass sie mit sonst neuen Proteinverfahren und/oder Systemen verwendet werden.
Die diagnostischen Kits der vorliegenden Erfindung werden typischerweise in einem „ELISA"-Format zum Nachweis der Gegenwart einer Menge an Antikörpern in einer Körperprobe wie einem Serum oder Plasma verwendet. „ELISA" bedeutet einen Enzym-verknüpften immunosorbierenden Test, der einen Antikörper oder ein Antigen, der/das an eine feste Phase gebunden ist, und ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörper-Konjugat zum Nachweis und Quantifizieren der in einer Probe vorliegenden Menge an Antigen oder Antikörper einsetzt. Eine Beschreibung der ELISA-Technik ist in Kapitel 22 von BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4. Ausgabe 1982) von D. P. Sites et al., herausgegeben von Lange Medical Publications of Los Altos, California, und in der U.S. Patentschrift Nr. 3,654,090, Nr. 3,850,752 und Nr. 4,016,043 zu finden.
Folglich wird das Antigenität zeigende Protein in bevorzugten Ausführungsformen an einer festen Matrix unter Bildung eines festen Trägers befestigt. Typischerweise kann das Protein durch Adsorption einer wässrigen Lösung an der festen Matrix befestigt werden, obwohl verschiedene Adsorptionsmodi von einen wässrigen Medium sowie andere dem Fachmann bekannte Befestigungsmodi verwendet werden können. Beispielhaft für solche Modi sind die Reaktion des Rezeptors oder Antigens mit der reaktiven Carboxylfunktionalität, die durch die Reaktion von Cyanogenbromid mit glucosehaltigen Matrizen wie vernetzter Dextrose oder Cellulose, wie hier nachstehend erörtert gebundenem Gultaraldehyd zusammen mit Latexteilchen und dergleichen hergestellt werden.
Nützliche Feststoffe sind auf dem Fachgebiet bekannt. Solche Materialien schließen vernetztes Dextran, erhältlich unter der Marke SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); Agarase; Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von etwa 1 Mikron bis etwa 5 mm, erhältlich von Abbott Laboratories of North Chicago, IL; Polyvinylchlorid, Polystyrol, vernetztes Polyacrylamid, Nitrocellulose von Geweben wie Lagen, Streifen oder Flügel auf Nylonbasis oder Rohre, Platten oder die Mulden einer Mikrotiterplatte wie diejenigen, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellt sind, ein.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt der Kit des Weiteren in einer getrennten Packung ein Amplifikationsreagens als Komplement wie Meerschweinchenkomplement, Antiimmunoglobinantikörper oder Protein A des Cowan-Stamms S. aureus, das mit dem Antigen oder den Antikörpern, das/die nachzuweisen ist/sind, reagiert, ein. In diesen Ausführungsformen kann das markierungsspezifische Bindemittel das Amplifikationsmittel spezifisch binden, wenn das Amplifikationsmittel an das Protein oder den Antikörper gebunden ist.
Das markierungsspezifische Bindemittel eines beliebigen diagnostischen hier beschriebenen Systems sowie das vorstehend beschriebene Amplifikationsmittel, können in Lösung, als flüssige Dispersion oder als im Wesentlichen trockenes Pulver z.B. in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. Ist das Indikationsmittel ein Enzym, kann das Enzymsubstrat ebenso in einer getrennten Packung des Systems bereitgestellt werden. Ein fester Träger wie eine Mikrotiterplatte und ein oder mehrere Puffer können ebenso als getrennt verpackte Elemente in diesem diagnostischen Testsystem eingeschlossen sein.
Die hier in Bezug auf diagnostische Systeme erörterte Verpackungen sind diejenigen, die üblicherweise in einem diagnostischem System verwendet werden. Solche Verpackungen schließen Glas- und Kunststoff- (z.B. Polyethylen-, Polypropylen- und Polycarbonat-)-Flaschen, -Phiolen, kunststoff- und kunststofffolienlaminierte Umschläge und dergleichen ein.
Beispiel 18
Das Muster von NF-κB/rel-Transkriptionsfaktoren wird in einem Tiertumormodel abgeändert und durch Therapie umgekehrt
Ein beeinträchtigtes Immunsystem wurde sowohl in einem Krebspatienten als auch in Tumor-tragenden Mäusen dokumentiert. Unter den zur Immunbeeinträchtigung beitragenden Faktoren spielt die T-Zellenfunktion eine wichtige Rolle. Zum Erforschen des T-Zellenzustands in einem Tumor-tragenden Säuger wurde ein Modell mit spontan auftretendem Nierenzellkarzinom (Renca) von einer BALB/c-Maus verwendet. Dieses Tumormodel weist zwei wichtige Merkmale auf: (1) Das durch Renca gezeigte Metastasemuster ähnelt dem menschlichen Nierenzellkarzinom, Golumbek et al. (1991) „Treatment of Established Renal Cancer by Tumor Cells and Engineered to Secrete Interleukin-4", und (2) zeigte es sich in diesem Mäusemodel, dass das Versuchsarzneimittel Flavon-8-essigsäure (FAA) in Kombination mit rIL-2 80% der bestehende Renca-Tumore tragenden Mäuse heilt, und dass diese Mäuse erfolgreich auf eine anschließende erneute Herausforderung ansprachen. Wiltrout et al. (1988) „Flavone-8-Acetic Acid Augments Systemic Natural Cell Activity and Synergizes with IL-2 for the Treatment of Murine Renal Cancer". Immunol. 140 (9): 3261.
Als Kernextrakte von normalen T-Zellen der Milz in einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-c-rel-, Anti-p65- und Anti-p50-Antiseren untersucht wurden, wurden normale Gehalte von allen drei Proteinen beobachtet. Im Gegensatz dazu lagen Kernextrakte von T-Zellen der Milz von Tumor-tragenden Mäusen ohne c-rel und p65 vor. Unerwarteterweise wurden anstelle von p50 zwei kürzere Formen des Proteins (p48 und p44) im Kern beobachtet, wobei „48" und „44" geschätzte angenäherte Molekulargewichte von 48 bzw. 44 kD bedeuten, wie bestimmt durch Gelelektrophorese.
Die Spezifität von Antiseren gegen c-rel, p65 und p50 wurde durch Wettstreit mit den jeweiligen Peptiden gezeigt. Obwohl die kürzeren Formen von p50 ausschließlich im Kern vorlagen, lag ein normal gemessenes Protein im Cytoplasma vor. Als dieselben Extrakte unter Verwendung eines gegen ein N-terminales Peptid des Proteins hergestellten Antiserums auf p50 analysiert wurden, wurde keine kürzere Form von p50 nachgewiesen, obwohl dieses Antiserum normales p50 nachweisen konnte. Die Interpretation dieser Ergebnisse lautet, dass die kürzeren Formen von p50 auf Grund des N-terminalen Abschnitts des Proteins vorliegen. Diese neuen Formen von p50 könnten auch das Ergebnis von abgeändertem Abschneiden sein, obwohl keine kürzere Form des Vorläufermoleküls, p105, in der cytoplasmatischen Fraktion der Tumorprobe beobachtet wurde.
Zum Bestimmen dessen, ob eine Abwesenheit von Kern-c-rel und -p-50 des Kerns und die Gegenwart von abgeänderten Formen von p50 in T-Zellen der Milz von Tumor-tragenden Mäusen mit der Gegenwart eines Tumors in Beziehung standen, wurden T-Zellen der Milz von FAA/IL-2-behandelten Tieren, von welchen eine Probe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung entnommen wurden, durch Western-Blot analysiert. Die Behandlung von Tumor-tragenden Mäusen mit FAA wurde nach sieben Tagen initiiert. IL-2 wurde an jedem der Tage 8 bis 10 verabreicht. 11 Tage später zeigten die T-Zellen der Milz dasselbe Muster wie eine unbehandelte Tumor-tragende Mäusegruppe im Bezug auf Kern-c-rel, -p65 und -p50. Im Gegensatz dazu zeigten T-Zellen der Milz von Tieren, die für eine Dauer von einer weiteren Woche mit FAA und IL-2 behandelt wurden, in etwa normale Gehalte an Kern-c-rel, -p65 und -p50. Interessanterweise lagen keine kürzeren Formen von p50 mehr in der behandelten Gruppe vor. Kein Anzeichen von sichtbarem Tumor wurde entweder durch makroskopische oder mikroskopische Analyse in behandelten Tieren für eine Dauer von vier Wochen nach der Tumorinitiierung, d.h. drei Wochen nach der Behandlung beobachtet. Die unbehandelte Tumor-tragende Gruppe starb normalerweise etwa am Tag 35. Eine Analyse der T-Zellen der Milz von Mäusen, die eine langzeitige Überlebensrate, definiert als Überlebensrate bis Woche 7 aufwiesen, zeigten, dass die Kerngehalte der Vertreter der rel-Familie normal waren.
Als die Kernextrakte der T-Zellen der Milz von normalen und Tumor-tragenden Tieren in einem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstest (EMSA), Tan, T. H. et al., „Purification and characterisation of multiple nuclear factors that bind to the TAX-inducible enhancer within the human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat." (1989) Mol. Cell. Biol. unter Verwendung eines Oligonukleotids von einem schwerkettigen Immunoglobulinen verwendet wurden, unterschieden sich die Muster der DNA-Protein-Komplexe in den Tumorproben verglichen mit keinen Tumor tragenden Proben. Verglichen mit dem normalen Muster wurden zwei schneller migrierende Komplexe beobachtet. Beide dieser Komplexe waren für die Nukleotidsonde spezifisch, wie durch eine Wiederholungsanalyse mit spezifischen und nichtspezifischen Oligonukleotiden gezeigt. Diese neuen DNA-Protein-Komplexe standen auch mit dem Status des Tumors in Beziehung, wie durch das Auftreten des normalen Musters in Proben von der Gruppe, die vier Wochen nach der Tumorinitiierung getestet wurde, gezeigt.
Zum Charakterisieren der Natur der DNA-Protein-Komplexe in Tumorproben wurde eine UV-Vernetzung, Kochel et al., „V-rel and C-rel-Protein Complexes Bind to the NF-εB site In Vitro", Oncogene (1992) 7: 567–572 and immunoprecipitation, Rice et al. (1992) Cell, 71: 243–263, des vernetzten Produkts durchgeführt. In einer normalen Probe bestand der langsamer migrierende DNA-Proteinkomplex aus zwei einer Kombination aus p50 und p65 entsprechenden Proteinen, wohingegen der schneller migrierende Komplex aus einem p50 ent sprechenden Protein bestand, wie früher gezeigt, Sang-Mo Kang et al., „NF-εB Subunit Regluation in Nontransformed CD4⁺T Lymphocytes" (1992) Science 256: 1452. In einer Tumorprobe bestand der obere DNA-Protein-Komplex aus einem Protein, das kürzer als p50 war, und der untere Komplex aus zwei Proteinen, die zwei kürzeren Derivaten von p50 entsprachen. Die UV-vernetzten Produkte wurden mit unterschiedlichen Anti-p50-Antiseren immungefällt. Bei der Durchführung einer Immunfällung mit normalen Proben wurde gefunden, dass der langsamer migrierende Komplex mit zwei verschiedenen Anti-p50- und einem Anti-p65-Antiserum gefällt wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass der obere Komplex aus p50 und p65 bestand. Es wurde gefunden, dass der schneller migrierende Komplex durch drei verschiedene Anti-p50-Antiseren gefällt wurde, was darauf hinwies, dass der untere Komplex aus p50 bestand.
Als die Tumorproben analysiert wurden, wurde gefunden, dass der langsamer migrierende Komplex durch zwei verschiedene Anti-p50-Antiseren, jedoch nicht durch das dritte gegen das N-terminale Peptid hergestellte Antiserum gefällt wurde. Auf der Basis des Molekulargewichts des gefällten Moleküls wurde gefolgert, dass der obere Komplex aus p48 bestand. Gleichermaßen wurde gefunden, dass der schneller migrierende Komplex durch dieselben zwei Anti-p50-Antiseren wie der obere Komplex, jedoch nicht durch das gegen das N-terminale Peptid hergestellte Antiserum gefällt wurde. In diesem Fall wurden zwei Proteine erhalten, die, entsprechend den Anti-Peptid-Antiseren, p48 und p44 entsprachen. Keine Proteinbande wurde erhalten, als eine Immunfällung mit Präimmunseren durchgeführt wurde.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Stimulation von T-Lymphozyten
In einer veranschaulichenden Ausführungsform werden T-Lymphozyten mit einem Antikörper für einen Lymphozytoberflächenrezeptor in vitro für kurze Zeit dauern stimuliert. Gegebenenfalls liegen während der Stimulation auch ein oder mehrere Cytokine vor. Die Zeitdauern zur Stimulation betragen weniger als etwa 24 Stunden, so wenig wie 30 Minuten und im Allgemeinen 12 bis 18 Stunden. Diese stimulierten Zellen weisen eine hochtherapeutische Wirksamkeit auf, wenn sie in vivo injiziert werden. Eine Stimulation durch Anti-CD3 induziert die Expression des IL-2-Rezeptors. Anti-CD3-stimulierte Zellen sind weniger toxisch als Zellen, die in IL-2 für eine Dauer von einigen Tagen gezüchtet wurden, da die Anti-CD3-stimulierten Zellen eine weniger akute Lungentoxizität verursachen. Gleichermaßen können sich, da sich Anti-CD3-stimulierte Zellen in Gegenwart von IL-2 in ihrer Anzahl vermehren können, kleine Anzahlen an injizierten Anti-CD3-Zellen infolge der Einwirkung in vivo von IL-2 auf große Anzahlen vermehren. Dadurch müssen weniger Zellen verabreicht werden, wenn IL-2 vorliegt, um ausreichende Anzahlen an Anti-CD3-stimulierten Zellen zu erzielen.
In einer anderen Ausführungsform werden T-Lymphozyten in vitro mit gegen mehr als einen Lymphozytoberflächenrezeptor gerichteten Antikörpern stimuliert. Gegebenenfalls liegen während der Stimulation auch ein oder mehrere Cytokine vor. Die Stimulation von T-Lymphozyten in vivo kann ebenso mit Antikörpern für ein oder mehrere T-Lymphozyteoberflächenrezeptoren; mit einem oder mehreren Cytokinen oder mit einer Kombination von Antikörpern und Cytokinen erzielt werden.
Kinasereaktionstest

10⁷ Zellen werden in einer Standardweise lysiert.
Es wird mit Anti-Fyn Ab (6 μl) oder Anti-Lck Ab (3 μl) immungefällt.
Es wird 3 × mit Waschpuffer ohne EDTA gewaschen.
Es wird 1 × mit Kinasepuffer ohne ATP gewaschen.
30 μl Kinasepuffer plus 10–20 μCi [γ³² P]ATP (3300 Ci/mmol) (3–5 μl) und 1 μM ATP werden zugesetzt.
Es wird bei RT für eine Dauer von 10 Minuten inkubiert.
Es wird 3 × mit Waschpuffer, enthaltend 20 mM EDTA, gewaschen.
Es wird mit 1,5 × Probenpuffer eluiert.
Es wird über 8% Gel geleitet.
Das Gel wird in 10%iger Ac-Säure und 50% MeOH für eine Dauer von 30 Minuten fixiert.
Es wird mit 3% Glycerin für eine Dauer von 20 Minuten ersetzt.
Das Gel wird unter Verwendung des Geltrockners für eine Dauer von 1,5 Stunden getrocknet.
Das Gel wird mit Röntgenfilm belichtet.
* Kinasepuffer
100 mM NaCl
20 mM HEPES, pH 7,5
5 mM MnCl₂
5 mM MnCl₂
1 μM ATP
3–5 μl [γ³² P]ATP

Verfahren zur Herstellung von Antikörpern
Ein Antikörper für ein Oberflächenrezeptorprotein von T-Lymphozyten oder für den löslichen Immununterdrückungsfaktor kann durch bekannte und herkömmliche Verfahren, z.B. diejenigen, beschrieben in Current Protocols in Immunology, Band I, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Sevach und W. Strober (eds.), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 2.4.1–2.10.3 (1991) hergestellt werden.
Ein gegen den Faktor gerichteter monoklonaler Antikörper wird hergestellt. Der Antikörper wird unter Verwendung von Überständen von Tumorpräparaten als Immunogen und dem Fachmann bekannten Techniken entwickelt. Der monoklonale Antikörper ist beim Reinigen des Faktors durch Affinitätschromatographie (Marlow and Lane Antibodies Manual) nützlich.
Antikörper für einen Oberflächenrezeptor werden allein oder in Kombination mit anderen Antikörpern für verschiedene Oberflächenrezeptoren von T-Zellen zum Aktivieren von T-Lymphozyten verwendet. Geeignete Antikörper schließen Anti-CD2, Anti-CD3, Anti-CD4, Anti-CD5, Anti-CD6, Anti-CD7, Anti-CD8, Anti-CD28, Anti-CDw29 und Anti-CD45R ein. Ein bevorzugter Antikörper ist Anti-CD3-monklonaler Antikörper (MAb). Ein Anti-CD3-MAb schließt OKT3, WT32, Leu-4, SPV-T3c, RIV9, 64.1, 145-2C11 und dergleichen ein. Stärker bevorzugt ist das Anti-CD3-MAb das Anti-Mäuse-CD3-MAb 145-2C11, das von Leo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1374 (1978) identifiziert wurde und von der American Type Culture Collection, (ATCC) erhältlich ist. Mäuse-Anti-human-OKT3 ist von Ortho Divison of Johnson and Johnson erhältlich. Versionen der von Menschen abgeleiteten Antikörper sind für die T-Zellaktivierung in vivo während der Behandlung nützlich. T-Lymphozyten, die mit Anti-CD3-MAb für eine Dauer von weniger als etwa 24 Stunden behandelt wurden, werden vorzugsweise mit einer Gesamtdosis von etwa 10/ng/ml oder weniger behandelt.
Isolierung und Reinigung des löslichen Immununterdrückungsfaktors
Der Immununterdrückungsfaktor wird aus Überständen von Tumorzellpräparaten durch sequentielle Gelfiltration, Anionen- und Kationenaustausch und FPLC gereinigt. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Die Endreinigungsschritte können HPLC unter Verwendung von Ionenaustausch- oder Umkehrphasenchromatographie erfordern. Polypeptidfragmente des isolierten Faktors werden getestet, um zu bestimmen, welche Fragmente die Immununterdrückungsaktivität beibehalten. Die Aminosäuresequenzen von diesen Polypeptidfragmenten werden bestimmt. Abgebaute Oligonukleotide werden dann von den Aminosäuresequenzen abgeleitet und unter Verwendung von Techniken, die von Maniatis (1982). (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben wurden, zum Klonen des Faktors verwendet.

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Immunsuppressionsgrads in einer Probe von T-Lymphozyten eines Säugers, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bestimmen des Expressionsgrads eines Proteins einer TCR-Untereinheit, ausgewählt aus CD3ζ, CD3γ oder Protein Fcεγ, und b) Vergleichen des Proteinexpressionsgrads mit dem Expressionsgrad des Proteins, der für nicht immununterdrückte Individuen derselben Säugerspezies charakteristisch ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Expressionsgrad als Expressionsverhältnis, definiert als das Verhältnis der Anzahl an das Protein exprimierenden T-Lymphozyten zu der Gesamtanzahl an gezählten T-Lymphozyten, gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die T-Lymphozyten von Milzgewebe, peripherem Blut, Tumorgewebe, Lymphknotengewebe, Gehirnflüssigkeit, Pleuraergüssen und Asziten abgeleitet ist.
Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das Immununterdrückung von T-Lymphozyten eines Säugers bewirkt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines T-Lypmphozyten-Präparats, in welchem der Expressionsgrad eines Proteins einer TCR-Untereinheit, ausge wählt aus CD3ζ und CD3γ, für nicht-immununterdrückte Individuen derselben Säugerspezies charakteristisch ist. b) Züchten des Lymphozytenpräparats in Gegenwart eines mutmaßlichen immununterdrückenden Mittels, c) Bestimmen des Expressionsgrads des ausgewählten Proteins und d) Identifizieren eines Mittels, das eine deutliche Reduktion bis unter den Expressionsgrad des Proteins in einem nicht in Gegenwart des Mittel gezüchteten T-Lymphozyten-Präparat bewirkt.
Verfahren zum Identifizieren eines Mittels, das Immununterdrückung von T-Lymphozyten eines Säugers umkehrt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines T-Lymphozyten-Präparats eines Säugers von einem immununterdrückten Säuger, in welchem der Expressionsgrad eines Proteins einer TCR-Untereinheit, ausgewählt aus CD3ζ und CD3γ, unter dem Grad von nicht-immununterdrückten Individuen derselben Säugerspezies liegt, b) Züchten des Lymphozyten-Präparats in Gegenwart eines Mittels, das mutmaßlich Immununterdrückung umkehrt, c) Bestimmen des Expressionsgrads des ausgewählten Proteins in der Kultur und d) Identifizieren eines Mittels, das eine deutliche Zunahme des Expressionsgrads des Proteins bewirkt.
Verfahren zum Durchmustern nach einem Mittel, das einen löslichen Immununterdrückungsfaktor hemmt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Zugabe eines Mittels zu einem Zellsystem, das einen löslichen Immununterdrückungsfaktor enthält, der eine Abnahme des Grads einer TCR-Proteinuntereinheit, ausgewählt aus CD3ζ und CD3γ, in einer biologischen Probe von einem immununterdrückten Säuger im Vergleich zu dem Grad der Untereinheit in einer vergleichbaren Probe von einem nicht-immununterdrückten Säuger bewirken kann, wobei das Zellsystem der Überstand, abgeleitet von der MCA-38-Zellreihe oder dem MBL-2-Lymphom, ist, b) Bestimmen des Immununterdrückungsgrads im System durch i) Bestimmen des Expressionsgrads eines Proteins einer TCR-Untereinheit, ausgewählt aus CD3ζ und CD3γ, und ii) Vergleichen des Proteinexpressionsgrads mit dem Expressionsgrad des Proteins, der für nicht-immununterdrücktete Individuen derselben Säugerspezies charakteristisch ist, und c) Bestimmen dessen, ob das System eine Umkehrung der Immununterdrückung zeigt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Zellsystem der Überstand, abgeleitet von der MCA-38-Zellreihe oder des MBL-2-Lymphoms, ist, und wobei der lösliche Immununterdrückungsfaktor eine Abnahme des Grads eines Proteins für den Signalwiedergabeweg von T-Lymphozyten in einer biologischen Probe von einem Säuger im Vergleich mit dem Grad des Proteins in einer vergleichbaren biologischen Probe von einem nicht-immununterdrückten Säuger bewirken kann.
Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei der immununterdrückte Säuger eine Maus mit einem etwa 26 Tage oder mehr bestehenden Tumor der MCA-38-Zellreihe oder des MBL-2-Lymphoms ist.
Kit zur Verwendung im Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, umfassend in einem getrennten Behälter einen Antikörper, der gegen ein Protein einer TCR-Untereinheit, ausgewählt aus CD3ζ, CD3γ oder Fcεγ, gerichtet ist, und ein Mittel zum Bestimmen der Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes.