CN101137664A - 白介素-21的抗原性表位，相关抗体以及它们在医学领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白介素－21的抗原性表位、相关抗体以及它们在医疗领域的应用，尤其是用于治疗诸如慢性炎性肠病(IBD)、乳糜泻和银屑病等以IL－21的产生和/或活性增加为特征的免疫－炎性疾病。

Description

白介素-21的抗原性表位，相关抗体以及它们在医学领域的应用
本发明涉及白介素-21(IL-21)的抗原性表位和相关中和IL-21抗体，以及它们在治疗。
过去十年间，对人和动物模型进行的一些研究加深了我们对免疫介导疾病发病机制的理解，并有助于对患有这些疾病的患者进行最佳治疗性干涉。因此，已经显示T淋巴细胞在这些疾病如银屑病、类风湿性关节炎、支气管哮喘、原发性胆汁性肝硬化、CD、UC、乳糜泻、幽门螺旋杆菌(Hp、Helicobacterpylori)-相关性胃病、多发性硬化中发挥主要的致病作用(Nickoloff 2004，Firestein 2004；Sollid 2002；Podolsky2002)。对炎性过程基础事件进行仔细的分子分析证实，T淋巴细胞的致病作用主要是由于它们能够合成一些炎性分子，其中包括细胞因子(或白介素)。相关的例子有产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，这是一种能够作用于单核细胞、树突细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞而引起多种炎症的细胞因子(Campbell 2003)。
因此，更好地了解这些炎性疾病及其病理生理学机制的自然史有助于改进治疗选择，尽管对这些病变中每一种的药理干涉仅针对症状而无法治愈。在大多数患者中，炎症活性的消退以及临床症状缓解的诱导需要用皮质类固醇治疗。然而众所周知，这种药物仅对50％的患者有效，且这一半患者需要连续治疗以维持临床症状缓解。不幸的是，类固醇的有益效果是以频繁且经常发生的严重不良反应为代价的(Spahn1997，Scholmerich 2004)。通常与皮质类固醇同时使用或替代皮质类固醇的免疫抑制治疗甚至通常也不能完全限制炎症和控制症状。此外，它还有明确的禁忌症和严重的不良反应(Podolsky，2002)。
二十世纪九十年代可获得的新一代药物是生物制剂。这些生物疗法旨在通过使用重组人蛋白质、单克隆嵌合人源化抗体和融合蛋白控制特定炎症“途径”。文中，在抑制免疫炎性过程中显示出良好效力的化合物是单克隆抗-TNF-α抗体(Seegers等，2002)。这种药物能够在约50-70％的患者中遏制炎症。然而已经报道，潜在微生物感染的复发和超敏现象等不良反应会随着重复治疗而增加。后一个现象可能是由于该抗体阻遏了具有多种生物功能的细胞因子。事实上，除了其炎性效应，TNF-α还在与诱导和维持免疫耐受有关的机制中发挥作用。因此，阻遏TNF-α似乎反而能够促进额外的免疫反应。此外，1/3以上的治疗患者产生了似乎会降低该药物功效的针对该化合物的抗体(Sandbom，2002)。所有这些观察结果说明需要进行新的研究以鉴定用于治疗患有上述疾病的患者的新的化合物(Fiocchi，2001)。
白介素-21(IL-21)是最近鉴定的一种主要由激活的CD4+T淋巴细胞产生的细胞因子(Habib 2003，Parrish-Novak 2002)。IL-21的生物学作用由叫做IL-21R的膜受体介导，该受体显示与IL-2和IL-15受体的α亚基同源，并与受体亚基的γ-链相互作用(Collins 2003，Zhang 2003)。迄今，T和B细胞、自然杀伤淋巴细胞、单核细胞和树突细胞上已经显示有这种受体。
对IL-21与其受体相互作用诱导的信号转导级联进行分析显示，这种细胞因子能够触发一些胞内信号并允许特异性免疫-炎性应答，但这严格取决于所分析的细胞类型。具体地说，对B细胞进行的一些研究显示，IL-21可分别促进或抑制人类或鼠类细胞的细胞死亡进程(Mehta 2003，Jin 2004)。类似地，已知人外周血T淋巴细胞产生高水平干扰素-γ(IFN-γ)，表明IL-21刺激之后产生Th1应答，而在一些鼠科模型中，IL-21似乎以较高水平在TH2淋巴细胞中表达并促进这种类型细胞的分化(Ma2003，Wurstel 2002)。在致癌和糖尿病动物模型中进行的实验证实了IL-21调节T淋巴细胞/自然杀伤细胞活性和产生细胞因子的能力，并强调了这种分子对于免疫-炎性过程的发展和存在的潜在作用(Gallegos 2004)。因此可以想像，调节IL-21的生物学作用代表了一种新的且有希望的所有以IL-21产生和/或活性改变为特征的免疫-炎性疾病的治疗方法。
如上所述，在CD中，慢性炎性疾病主要位于远端回肠和右侧结肠，肠粘膜被T细胞严重浸润(Podolsky 2002)。还有证据显示，T细胞在粘膜水平分化成Th1淋巴细胞，并产生高水平INF-γ和TNF-α。Th1细胞分化似乎取决于局部产生的细胞因子，如IL-12(Neurath M F 1996，Monteleone 1997)。对IBD的人类和动物模型进行的研究显示，IL-12对Th1淋巴细胞的活化触发了导致组织损伤的分子事件级联(NeurathMF 1996，Monteleone 1999)。这种损伤的实质性介质是基质金属蛋白酶(MMP)(Monteleone，1999)，蛋白酶家族能降解胞外基质的一些组分，因此造成粘膜降解和上皮结构破坏。在胃溃疡和肠溃疡以及Hp感染、CD和UC患者的发炎的粘膜区域中始终有包括MMP-1(间质胶原酶)、MMP-2(明胶酶A)、MMP-3(溶基质素)和MMP-9(明胶酶B)在内的一些MMP的显著增加(Heuschkel2000，Saarialho-Kere1996)。此外，中和MMP已显示足以限制胎儿肠外植体中IL-21激活的TH1细胞触发的粘膜降解(Monteleone，1999)。
MMP在免疫-炎性疾病发病机制中的重要性不限于CD和UC，因为有证据证明它们还与银屑病、类风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬化有关(Kane 2004，Wall 2003)。
本发明的作者显示，CD患者的肠粘膜中持续产生IL-21(图1)，且这种增加仅限于活性损伤区域而不依赖于损伤类型(图2)。CD中IL-21表达增强不仅仅表现为T淋巴细胞对粘膜的浸润增加。实际上，与对照相比，CD患者的CD4+T细胞和CD45RO+淋巴细胞蛋白质提取物中还被证实有提高的IL-21合成(图3)。
毋庸置疑的是，Th1细胞的极化和稳定严格依赖于增强IL-21活性的分子的活性。为检测IL-21是否参与这种应答的调节，本发明的作者设计、发展并测试了抗IL-21的六种不同抗体分子(抗血清)的功效。为产生这些抗体，采用了特定人IL-21序列免疫的NZW兔。各种抗血清的IL-21活性抑制显示于图4。具体地说，显示了各种抗血清对IL-21介导的在人外周血单核细胞(PBMC)中造成Stat3磷酸化(p-Stat3)的功效。用Jurkat细胞(一种T细胞系，未显示)还证实了各种抗血清的中和效应。此外，通过使用GM2抗血清(它在PBMC和Jurkat实验中始终并相等地抑制IL-21活性)，显示IL-21活性在CD患者肠固有层单核细胞(LPMC)培养物中的中和作用与Th1细胞分化必需的转录因子如Stat4和T-bet表达的显著降低以及IFN-γ合成的抑制有关(图5)。
T细胞在CD患者发炎的粘膜中显著聚集被认为部分依赖于这种细胞对凋亡刺激物的抗性。还有证据显示，这种现象在维持粘膜炎性状态中发挥关键作用，因为能够提高T细胞对凋亡刺激物易感性的药物如抗-TNF-α促进了正在进行的组织炎症过程的消退。IBD过程中T细胞对凋亡的抗性的确切机制仍旧未知，但这似乎与局部释放的细胞因子有关。
本发明的作者已经显示，用本发明的抗血清阻遏IL-21活性能显著且有效降低分离自CD和UC患者的LPMC培养物中存活的CD3+T细胞(图6)。当使用肠固有层CD3+T细胞培养物时得到了类似的数据。实际上，对CD3+T细胞进行荧光分析显示，相比未处理的细胞(AV：11±1；IP：1，5±0，16；AV-IP：20，8±5，7)或用对照血清处理的细胞(AV：11，6±0，69；IP：2±0，7；AV-IP：21±5，77)，抗-IL-21抗血清GM2使膜联蛋白V(AV)(28，5±8)或碘化丙锭(IP)(7±1，4)或这两者(41±7，6)的百分比显著增加(P<0.01)。当在CD4+T细胞培养物中加入抗-IL-21时观察到了类似的结果。这种效应与线粒体膜电位的降低有关(图7)。
如上所述，UC患者的发炎区域内也显示IL-21的表达增加(图1)，UC是一种以未极化成Th1亚型的T细胞的显著的粘膜浸润为特征的慢性炎性疾病。因此，这种观察提示，IL-21可能调节除控制Th1极化之外的多种炎性途径。
为确定IL-21新的生物学功能，首先用人肠道粘膜细胞内的IL-21受体(IL-21R)表达来表征。这些实验的数据显示，IL-21R表达不限于免疫细胞，令人惊讶的是，非免疫细胞如肠肌成纤维细胞也表达IL-21R(图8)。炎性刺激物如TNF-α或IL-1β可增强这种表达(图9)。其次，已经证实这种细胞对IL-21刺激有反应。具体地说，在分离自健康对象(正常对照)和IBD患者的肠肌成纤维细胞培养物中加入IL-21导致大量分泌MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9(图10)，但MMP组织抑制剂如TIMP-1和TIMP-2的分泌不受影响。IL-21对MMP产生的效应在胎儿肠成纤维细胞系(CCD18CO)中也观察到(未显示数据)且是剂量依赖性的(图10)。此外，显示IL-21增强了膜MMP如MT-MMP-1的表达(图11)，其活性是MMP-2激活所必需的。最后，同时用TNF-α刺激增强了IL-21对MMP合成的功效(图12)，这说明这两种细胞因子协同调节MMP的产生。
为评价CD LPMC-衍生的IL-21是否能调节MMP产生，在存在或不存在CDLPMC上清液(含IL-21，图3)时在添加或不添加抗-IL-21或对照抗血清的情况中培养分离自CD粘膜标本的肠成纤维细胞48小时，通过Western印迹评价MMP产生。如图13所示，在肌成纤维细胞培养物中加入CD LPMC上清液导致所有MMP的合成提高，抗-IL-21抑制了这种效应。这就证实CD LPMC产生的IL-21具有生物学活性并能够增强MMP合成。
更奇怪的是，肠上皮细胞表达IL-21R，且在IBD、尤其是在CD中这种表达增强(图14)。根据这些数据，在一些结肠癌上皮细胞系中被证实存在组成型IL-21R表达(图14)。还显示肠上皮细胞对IL-21有反应。实际上，用IL-21刺激上皮细胞系之后酪氨酸磷酸化的胞内蛋白的含量显著改变(图15A)。为检测IL-21是否还改变了促炎性分子或抗炎性分子的表达，检测未刺激的或用IL-21刺激的相同上皮细胞系培养物上清液中120种不同蛋白质的表达。用IL-21刺激与MIP-3α分泌增强关联(图15B)，MIP-3α是一种CD和UC以及其它免疫-炎性疾病如银屑病中上皮过量产生的蛋白质，它参与淋巴细胞和树突细胞向发炎的组织集中(Kwon 2002，Dieu-Nosjean 2000)。通过ELISA然后也证实了这些数据(图15C)。
为证实IL-21在其它胃肠免疫-炎性疾病发病机制中的潜在作用，本发明的作者还证明，IL-21在Hp感染相关性胃炎患者的胃中以及乳糜泻患者的肠中过表达，上述两种疾病都以占主导地位的粘膜Th1细胞应答为特征(图16和17)。
证实分离自Hp感染或未感染患者的胃上皮细胞以及胃癌上皮细胞系(AGS和MKN)中也存在IL-21R表达(图18)。同样，用IL-21刺激AGS与MMP-2和MMP-9的合成增加关联，MMP-2和MMP-9是两种在Hp感染患者的胃中过量产生的明胶酶(图19A)(Mori，2004)。
分析IL-21对MMP2和MMP9的产生的效应的分子机制显示，IL-21激活了AGS细胞中的NF-kB(图19B)，同时，用市售产品(TPCK)抑制NF-kB与IL-21-介导的MMP-2和MMP-9合成被显著抑制关联(图19C)。
最后，已显示IL-21和IL-21R在银屑病患者的受感染区域中被强烈诱导(图20)。
综观这些数据显示，中和IL-21活性可能是抑制与这种细胞因子的合成/活性失调有关的疾病中正在进行的炎症的合理目标。
因此，本发明的一个目的是属于人IL-21序列的抗原性表位，其包含以下序列或其至少5个氨基酸的部分：
1.KMI HQH LSS RTH GSE DS(SEQ ID NO：1)，含有人IL-21的氨基酸146-162，并被称为GM1；
2.NVS IKK LKR KPP STN(SEQ ID NO：2)，含有人IL-21的氨基酸97-111，并被称为GM2；
3.LGT LVH KSS SQG QDR(SEQ ID NO：3)，含有人IL-21的氨基酸20-34，并被称为GM3；
4.TNA GRR QKH RLT CPS(SEQ ID NO：4)，含有人IL-21的氨基酸110-124，并被称为GM4；
5.CDS YEK KPP KEF LER(SEQ ID NO：5)，含有人IL-21的氨基酸125-139，并被称为GM5；
6.CFQ KAQ LKS ANT GNN E(SEQ ID NO：6)，含有人IL-21的氨基酸78-93，并被称为GM6；
本发明的另一个目的表示为编码上述抗原性表位的寡核苷酸序列。
此外，本发明涉及上述表位在制备抗-IL-21抗体中的应用。具体地说，所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段、嵌合或单链抗体。
本发明的再一个目的是对至少一种如本发明所述的抗原性表位具有特异性和选择性的抗体，该抗体用于中和人IL-21、定向对抗下述人IL-21蛋白的肽序列之一：
1.KMI HQH LSS RTH GSE DS(SEQ ID NO：1)，含有人IL-21的氨基酸146-162，并被称为GM1；
2.NVS IKK LKR KPP STN(SEQ ID NO：2)，含有人IL-21的氨基酸97-111，并被称为GM2；
3.LGT LVH KSS SQG QDR(SEQ ID NO：3)，含有人IL-21的氨基酸20-34，并被称为GM3；
4.TNA GRR QKH RLT CPS(SEQ ID NO：4)，含有人IL-21的氨基酸110-124，并被称为GM4；
5.CDS YEK KPP KEF LER(SEQ ID NO：5)，含有人IL-21的氨基酸125-139，并被称为GM5；
6.CFQ KAQ LKS ANT GNN E(SEQ ID NO：6)，含有人IL-21的氨基酸78-93，并被称为GM6。
这些抗体可以是多克隆抗体(Ab)或单克隆抗体(mab)，或是抗体片段(Fab、Fab’、Fab(ab’)2)或嵌合抗体、人源化抗体或单链(scFv)抗体。所述抗体可以是哺乳动物抗体并优选是人、鼠科、兔、羊来源的抗体。为增强分子稳定性、为防止其降解或者为降低副作用风险的必需变化也包括在本发明范围之内。本发明的抗体可用荧光染料、放射性同位素或药物标记。所述抗体也可用作实验领域的反应物，例如用于IL-21表达中和或表征试验。
本发明的抗体可有利地用于医疗领域。本发明还涉及本发明所述抗体在制备用于治疗或体外诊断与改变的IL-21表达有关的免疫-炎性疾病的药物中的应用，所述疾病如慢性炎性肠病(IBD)、乳糜泻、银屑病。具体地说，所述慢性炎性肠病可以是克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)。
本发明的另一个目的是含有至少一种上述抗体作为活性成分以及一种或多种本领域技术人员熟知的药学上可接受的辅佐剂和/或赋形剂的药物组合物。优选地，该组合物通过局部、全身或口服途径给予。
此外，本发明涉及一种诊断试剂盒，其中装有至少一种如本发明所定义的上述抗体和/或表位。优选地，本发明所述的诊断试剂盒采用诸如ELISA、Western印迹、免疫组织化学或细胞荧光分析法(cytofluorimetry)的技术来诊断与改变的IL-21表达有关的免疫-炎性疾病，所述疾病例如有慢性炎性肠病(IBD)如CD和UC、乳糜泻、银屑病。这种诊断试剂盒可用于中和或表征IL-21的体外或体内表达。
出于举例但非限制的目的，现在将根据其优选实施方案并参照附图描述本发明，图中：
图1A显示了通过Western印迹测得的从3名CD患者、3名UC患者和3名正常对照的肠粘膜样品提取的总蛋白中IL-21(上图)和β-肌动蛋白(下图)的表达。下图显示了各对象中IL-21/β-肌动蛋白的蛋白质比例(在图中用各个点表示)，该比例表示为任意密度计单位。水平线表示各组数值的中值；
图2A显示了通过Western印迹评价的从3名CD患者和2名正常对照的肠粘膜样品提取的总蛋白中IL-21(上图)和β-肌动蛋白(下图)的表达。对于各CD患者，样品取自发炎(感染的)和未发炎的区域。右图显示了在不同患者和健康对照中测得的IL-21/β-肌动蛋白蛋白质含量之比，并表示为任意密度测定单位的平均值±标准差。图2B显示了从3名炎性CD患者、3名纤维狭窄性(fibrostenosing)CD患者和2名正常对照的肠粘膜样品提取的总蛋白中IL-21蛋白含量(上图)和β-肌动蛋白(下图)。右图显示了不同患者和健康对照的IL-21/β-肌动蛋白的蛋白质比例，并表示为任意密度计单位的平均值±标准差；
图3A显示了通过Western印迹测得的从2名CD患者、2名UC患者和2名正常对照的肠固有层单核细胞(LPMC)提取的总蛋白中IL-21(上图)和β-肌动蛋白(下图)的表达。图B显示了分离自2名CD患者、2名UC患者和2名正常对照肠固有层(LPL)T细胞的总蛋白质提取物中IL-21和β-肌动蛋白的代表性Western印迹。左图显示了分离自1名CD患者、1名UC患者和1名正常对照的CD4+o CD8+LPL中IL-21的表达。右图显示了从2名CD患者、2名UC患者和2名正常对照的肠纯化的CD45RO+LPL中的IL-21蛋白含量；
图4显示了各抗-IL-21抗血清(序列GM1、GM2、GM3、GM4、GM5、GM6)在人重组IL-21刺激的人外周血单核细胞(PBMC)中对于诱导转录因子Stat3(pStat3)磷酸化的抑制效应。下图显示了相同样品中的总Stat3含量。pStat3和总Stat3都通过Western印迹评价；
图5显示了GM2抗血清在分离自CD患者肠道的LPMC中对Th1应答相关性转录因子的表达(T-bet和Stat4)和干扰素-γ合成(IFN-γ)的抑制效应。通过总蛋白质提取物的Western印迹分析T-bet(A)和磷酸化和总Stat4(B)的含量，而分泌到培养物上清液中的IFN-γ(C)通过ELISA用市售试剂盒评价；
图6显示了在分离自正常对象以及CD和UC患者肠道并在存在或不存在抗-IL-21抗血清(GM2)或对照血清时培养20小时的LPMC样品中通过细胞荧光分析法测得的CD3+细胞和/或膜联蛋白V(AV)的百分含量；
图7显示了在分离自CD患者肠道并在存在或不存在抗-IL-21抗血清(GM2)或对照血清时培养4小时的CD4+T细胞中通过细胞荧光分析法测得的DIOC6含量；
图8显示了肌成纤维细胞总蛋白质提取物中IL-21R和γ-链受体亚基的代表性Western印迹，所述肌成纤维细胞分离自1名正常对象(对照)、1名CD患者和1名UC患者的结肠，分离自胎儿肠成纤维细胞细胞系(CCD18CO)以及分离自CD患者的外周血淋巴细胞(PBL)。图8B显示了从8名CD患者、8名UC患者和8名正常对照的肠肌成纤维细胞制备的蛋白质提取物中IL-21R/β-肌动蛋白含量的比值。该值表示为任意密度计单位并表示所有试验的平均值±标准差；
图9显示了分离自一名正常对象的结肠并仅用培养基(unst)培养或用TNF-α(20ng/ml)或IL-1β(20ng/ml)刺激24小时的原发性肌成纤维细胞总蛋白质提取物中IL-21R的代表性Western印迹。图9B显示了从上述刺激的肠肌成纤维细胞制备的蛋白质提取物中IL-21R/β-肌动蛋白含量的比值。该值表示为任意密度计单位并表示3次独立试验的平均值±标准差；
图10显示了IL-21刺激对分离自CD患者的肠肌成纤维细胞中MMP(MMP-1、2、3和9)合成的效应。IL-21对MMP的效应是剂量依赖性的且与MMP组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)产生的任何变化无关。对分离自UC患者肠道的肌成纤维细胞观察到类似结果。Ve+＝CD患者结肠的蛋白质提取物被用作阳性对照；
图11显示了IL-21对从肠肌成纤维细胞制备的蛋白质提取物中MT-MMP1合成的效应，所述肠肌成纤维细胞分离自CD患者并单独用培养基培养或用分段剂量的IL-21培养。IL-21对MT-MMP1的效应是剂量依赖性的。Ve+＝CD患者结肠的蛋白质提取物被用作阳性对照。图11B显示了从上述刺激的肠肌成纤维细胞制备的蛋白质提取物中MT-MMP1/β-肌动蛋白含量的比值。该值表示为任意密度计单位并表示3次独立试验的平均值±标准差；
图12显示IL-21和TNF-α在分离自CD患者的肠肌成纤维细胞中协同增强MMP-1、2、3和9的合成但对TIMP1和TIMP2无诱导效应；
图13显示在CD肌成纤维细胞培养物中加入CD LPMC上清液增强了MMP合成，且这种效应能被抗-IL-21抗血清(GM2)抑制而不被对照抗血清抑制；
图14显示了肠上皮细胞中IL-21R的表达。图13A显示了通过免疫组织化学评价的正常对照和CD患者结肠标本中IL-21R的表达。图14B描绘了从1名正常对象(对照)、1名CD患者和1名UC患者的上皮细胞提取的总蛋白质中IL-21R和β肌动蛋白的代表性Western印迹。图C显示了从分离自7名CD患者、7名UC患者和7名正常对照结肠的上皮细胞制备的蛋白质提取物中IL-21R/β-肌动蛋白的蛋白质比例。该值表示为任意密度计单位(a.u.)并表示所有试验的平均值±SD。图D描绘了从6种不同结肠癌上皮细胞系提取的总蛋白质中IL-21的代表性Western印迹；
图15A显示了IL-21对DLD-1细胞中一些磷酸化蛋白质的表达的效应。显示了磷酸化蛋白质(上图)和β-肌动蛋白(下图)的代表性Western印迹。图B描绘了培养48小时后IL-21对DLD-1细胞蛋白质分泌的效应。该分析用能够同时评价120种不同蛋白质的市售试剂盒进行。观察到IL-21刺激细胞有增强的MIP-3α分泌(圆圈标记的蛋白质)。然后通过ELISA分析未刺激的和IL-21-刺激的DLD-1上清液证实了这种增加(图C)；
图16显示了从3名Hp感染患者和3名正常对照的胃粘膜标本制备的总蛋白质提取物中IL-21(上图)和β-肌动蛋白(下图)的代表性Western印迹；
图17显示了从3名乳糜泻(腹腔)患者和3名正常对照的十二指肠粘膜标本制备的总蛋白质提取物中IL-21(上图)和β-肌动蛋白(下图)的代表性Western印迹；
图17显示了从分离自2名Hp-相关性胃炎患者和2名正常对象(对照)的胃的上皮细胞提取的总蛋白质中IL-21R的代表性Western印迹。图B显示了从胃癌上皮细胞系(AGS和MKN)提取的总蛋白质中IL-21R和γ-链的代表性Western印迹；
图19A显示了IL-21对上皮胃细胞(AGS)中MMP-2和MMP-9分泌的剂量依赖性效应。图B显示IL-21能够增强AGS细胞中NF-kB的激活。显示了3种代表性的EMSA之一。图C显示通过TPCK抑制NF-kB的激活如何降低了IL-21-介导的MMP2和MMP9的合成；
图20显示了从4名银屑病患者感染或未感染区域的皮肤活检制备的总蛋白质提取物中IL-21(上图)、IL-21R(中图)和β-肌动蛋白(下图)的代表性Western印迹。
实施例1：CD、UC、Hp感染相关性胃炎和乳糜泻患者中IL-21表达的研究
材料和方法
患者和样品
粘膜样品取自新鲜获得的29名CD患者的标本。18名患者的疾病仅限于末端回肠，而其余患者的损伤同时位于回肠和结肠。手术时，13名患者接受类固醇疗法，10人用类固醇加免疫抑制剂治疗，6人用美沙拉秦加抗生素治疗。18名患者患有纤维狭窄(fibrostricturing)病。从患有回肠结肠疾病的患者患病和未患病的回肠和结肠区域提取粘膜样品。
从以下患者的结肠获得其它粘膜样品：a)26名接受结肠镜检查的UC患者及4名接受结肠切除术的对类固醇和免疫抑制剂药物治疗反应较差的慢性病患者；b)6名憩室病患者，10名肠易激综合征患者和26名结肠癌患者。后一种情况下，粘膜样品取自用肉眼和显微镜观察到未受感染的区域。这些样品被认为是正常对照。此外，粘膜样品取自：1)13名Hp感染相关性胃炎患者和14名通过肉眼和显微镜观察未患有胃炎的病人的胃；b)14名乳糜泻患者和14名正常对照的十二指肠。通过地方委员会获得伦理许可。
肠固有层单核细胞(LPMC)的分离和培养
通过DTT-EDTA和胶原酶法制备LPMC。1等份LPMC立即用于提取总蛋白质，而其余的LPMC被重悬于添加10％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)的RPMI1640(Sigma-Aldrich S.r.l.，米兰)并培养，或用于纯化T固有层淋巴细胞(T-LPL)。出于该目的，将LPMC与抗-CD14、CD19和CD56抗体(Miltenyi Biotec S.r.l.，Calderara diReno，意大利)一起在4℃下培育30分钟，然后用磁性细胞分选系统(MACS，MiltenyiBiotec S.r.l.)通过阴性选择收集T-LPL。CD4+、CD8+和CD45RO+阳性T-LPL用特异于这些细胞亚型的抗体(Miltenyi Biotec，S.r.l.)通过相同的方法纯化。
蛋白质提取和Western印迹分析
将粘膜样品、LPMC或纯化的细胞匀浆并用含有10mM Hepes(pH7.9)、10mMKCl、0.1mM EDTA和0.2mM EGTA的缓冲液A提取总蛋白质。该缓冲液中添加有1mM二硫苏糖醇(DTT)、10μg/ml抑蛋白酶肽(aprotinine)、10μg/ml亮抑酶肽(leupeptine)和1mM二苯甲烷硫酰氟化物(phenylmethansulphonyl fluoride)(所有试剂均来自Sigma-Aldrich)。
用特异于人IL-21的兔抗体(0.5μg/ml，ProSci Incorporated，Poway，CA，USA)分析IL-21蛋白。
使用最终稀释度为1∶20.000的辣根-过氧化物酶偶联的羊抗-兔抗体(Dako Ltd)来检测第一抗体结合，用化学发光试剂盒(Pierce，Rockford，IL，USA)显现免疫反应性。分析IL-21后将斑点剥离然后与作为内部蛋白质加样对照的抗-人β-肌动蛋白抗体(最终稀释度为1∶5000，Sigma-Aldrich)一起培育。
用计算机辅助扫描密度计(Total lab，AB.EL Science-Ware Srl，罗马)分析各Western印迹条带的强度。
结果
检测所有分析样品中的IL-21，但其表达在CD患者中强烈增强(图1)。此外，相比憩室病患者或正常对照，发现UC患者中有增加的IL-21表达(图1)。在CD患者中，发炎区域明显显示有提高的IL-21表达(图2，上图)，但这与损伤类型无关(图2，下图)。
在CD中，当用提取自LPMC的蛋白质进行分析时也观察到有增加的IL-21表达(图3A)。为排除CD或UC患者与对照之间的IL-21含量差异反映了较高数目的粘膜T淋巴细胞浸润，还对提取自相同数目患者和对照LPL的蛋白质进行了分析。如图3B所示，CD患者和一小部分UC患者的T-LPL含有较高量的IL-21。这种增加在CD4+细胞亚型中特别显著(图3B的左图)，且不依赖于细胞激活的状态，因为相比对照CD45RO+LPL，IL-21含量在分离自CD患者结肠的CD45RO+LPL中更加显著(图3B的右图)。
Hp-相关性胃炎患者的胃(图16)和乳糜泻患者的十二指肠活检样品(图17)中也证实有IL-21表达提高。
实施例2：人IL-21中和抗体的开发
材料和方法
IL-21抗原性序列的分析和鉴定
由Washington Biotechnology Company(Washington，USA)进行人IL-21蛋白质序列的计算机分析以鉴定潜在的高抗原性位点。因此，这种序列被认为是免疫和产生抗IL-21抗体的最佳表位。
肽的合成
由Washington Biotechnology Company进行肽的合成和纯化。用采用Fmoc化学的“自动固相化学”技术合成各肽。在各肽序列中，各氨基酸通过肽键偶联，并使用保护基以避免不希望的反应。合成结束时洗去过量试剂，然后从支持树脂上移除合成的肽并通过层析技术(反相柱层析)纯化以得到纯度大于90％的最终产物。然后通过质谱分析(MALDI)来分析和验证各肽。
新西兰白(NZW)兔的免疫
NZW兔的免疫由Washington Biotechnology Company进行。为进行免疫，将各肽与大蛋白质载体(KLH)偶联并与佐剂一起皮下注射入2只不含特异性病原体的兔(新西兰白兔)。6周内强化注射三次，之后抽取测试血样通过ELISA分析抗血清。仅当通过ELISA测得的抗体效价大于1∶50000时才从各兔抽取血液。初免6或8周后抽取血液。然后通过ELISA确定各抗血清效价。
分析各抗血清的中和效力
为测试各抗-IL-21抗血清的中和活性，用取自健康志愿者的血液通过Ficoll分层分离PBMC，并在存在或不存在各抗-IL-21抗血清或对照血清时将其重悬于含有一开始添加或未添加人重组IL-21(终浓度为25ng/ml)的含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的RPMI，所用各抗血清或对照血清的最终稀释度为1∶500-1∶5000。同时如上所述用淋巴细胞细胞系(Jurkat细胞)进行实验。IL-21刺激30分钟后收集细胞并如上所述提取总蛋白质。然后通过电泳分离200μg蛋白质/样品、将其印到硝化纤维上并用单克隆特异性抗体(Santa Cruz Biotechnology)通过Western印迹分析磷酸化的和总的Stat3含量。然后用计算机辅助扫描密度计(Total lab，AB.EL Science-Ware Srl)量化各Western印迹条带的强度。
结果
如所预期的，用IL-21刺激PBMC与增强的Stat3磷酸化相关(图4)。用Jurkat细胞也证实了这一点(未显示数据)。各抗-IL-21抗血清可有效抑制IL-21-介导的磷酸化Stat3的诱导(图4)。
实施例3：IL-21在调节粘膜Th1细胞应答中的作用
材料和方法
细胞培养
为研究IL-21是否参与CD中的Th1细胞分化，将如上所述从6名接受肠切除术的CD患者的发炎区域分离的LPMC重悬于添加有10％FBS的RPMI1640。然后在不存在或存在抗-IL-21抗血清NZW-GM2(最终稀释度为1∶500)或对照血清(1∶500)时培养LPMC12小时，然后再用抗-CD3抗体(最终稀释度为1∶500)刺激24小时。
蛋白质提取和Western印迹分析
如上所述，采用抗T-bet、p-Stat4和Stat4的特异性抗体通过Western印迹分析这些蛋白质(对于T-bet和总Stat4，最终稀释度为1∶500，都由Santa Cruz Biotechnology制造，对于p-Stat4，浓度为1.5μg/ml，由Histo-Line Laboratories，米兰制造)。
然后用计算机辅助扫描密度计(Total lab，AB.EL Science-Ware Srl)量化各Western印迹条带的强度。
ELISA
用市售ELISA试剂盒按照制造商(Peprotech，London，UK)的说明分析LPMC培养物上清液中IFN-γ的含量。
结果
在未刺激的LPMC培养物中IFN-γ是可测的，同时表达p-Stat4和T-bet(图5)。用抗-CD3刺激LPMC与活性Stat4和T-bet的显著升高相关，这与提高的IFN-γ分泌相关。重要的是，用GM2抗血清中和IL-21活性抑制了抗-CD3诱导的活性Stat4和T-bet的表达，从而导致显著抑制IFN-γ(p＝0.02)(图5)。
实施例4：抗-IL-21抗血清对IBD肠T淋巴细胞生存力的影响
材料和方法
患者和样品
粘膜样品取自8名CD患者的手术标本，所述疾病仅限于末端回肠和向上的(ascendant)结肠。手术时，所有患者都接受类固醇和免疫抑制疗法并患有纤维狭窄性疾病。粘膜样品取自以下患者的结肠：a)4名接受结肠切除术的对类固醇和免疫抑制剂药物治疗反应较差的UC患者；b)6名结肠癌患者。后一种情况下，粘膜样品取自用肉眼和显微镜观察到未受感染的区域。这些样品被认为是正常对照。通过地方委员会获得伦理许可。
肠固有层单核细胞(LPMC)的分离和培养
通过DTT-EDTA-胶原酶法制备LPMC。如上所述，1等份LPMC立即用于纯化CD4+T淋巴细胞，而其余的LPMC被重悬于添加10％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)的RPMI1640(Sigma-Aldrich S.r.l.，米兰)并培养。
在存在或不存在不同稀释度的GM2抗-IL-21抗血清或对照血清时培养未分级的LPMC和CD4+T淋巴细胞2-20小时。
细胞死亡和线粒体跨膜电位的细胞荧光分析
将细胞与5μg/mL碘化丙锭(PI；Sigma-Aldrich)一起培育20分钟然后用藻红蛋白(FITC)标记的市售膜联蛋白V(AV)溶液(Becton Dickinson，Milano)染色以分析死亡细胞的比率。通过相同的方法用人单克隆抗体抗-CD3(Becton Dickinson)鉴定CD3+T淋巴细胞以评估其中AV的百分比。然后用细胞荧光计FACSCalibur(Becton Dickinson)的FL-1和FL-2通道测量细胞荧光。为分析线粒体跨膜电位，培育的最后20分钟中将细胞与20μM3，3’-二己基噁羰花青碘化物(3，3’-dihexyloxacarbocyanineiodide)(DiOC6(3)(Invitrogen S.r.L.，Milano)一起培育，然后通过细胞荧光分析法评估荧光。
结果
培养20小时后，在LPMC培养物中加入抗-IL-21抗血清(GM2)显著降低了CD3+淋巴细胞的存活。细胞荧光分析显示，相比未刺激的细胞(AV：11±1；PI：1，5±0，16；AV/PI：20，8±5，7)或用对照血清处理的细胞(AV：11，6±0，69；PI：2±0，7；AV-PI：21±5，77)，抗-IL-21显著提高了AV阳性细胞(28，5±8)、PI(7±1，4)和AV/PI(41±7，6)的百分比(P<0.01)(图6)。
抗-IL-21提高了阳性AV和PI CD4+T淋巴细胞的百分比(未显示数据)，因此排除了抗-IL-21通过抗体介导的细胞毒性机制发挥作用的可能性。这些抗-IL-21的作用与线粒体跨膜电位的显著降低有关(图7)。
实施例5：肌成纤维细胞和粘膜上皮细胞中IL-21受体的表达以及IL-21在诱导MMP和MIP-3a中的作用
材料和方法
肠肌成纤维细胞的分离
将如上所述从CD患者(N＝8)、UC患者(N＝8)和正常对照(N＝8)分离的LPMC重悬于含有1％非必需氨基酸和10％FBS的MEM1X并在37℃培育24小时。然后除去未贴壁的细胞，在存在上述培养基时培育贴壁细胞。3代后用特异性单克隆抗体在形态学和表型上表征所得肌成纤维细胞群。
胃和肠上皮细胞的分离
从取自8名Hp相关性胃炎患者和8名未患胃炎的患者(正常对照)窦的内窥镜活检样品以及8名CD患者、8名UC患者和8名正常对照的结肠分离胃和肠上皮细胞。活检样品立即用Hank溶液洗涤，然后在含有1mM EDTA的溶液中培育30分钟。最后通过Percoll梯度分层(Sigma-Aldrich)充分纯化所得细胞群。
肠肌成纤维细胞培养物和胎儿肠成纤维细胞系
将CD患者、UC患者和正常对照对象的肌成纤维细胞以及胎儿肠成纤维细胞系CCD18CO维持在含有1％非必需氨基酸和10％FBS的MEM1X中直至融合。然后将细胞在不含FBS的MEM1X中维持24小时，最后用不同剂量的IL-21刺激48小时或者不刺激。以相同的方法在存在25ng/ml TNF-α时用50ng/ml IL-21刺激肌成纤维细胞。为检测CDLPMC产生的IL-21是否能够调节MMP合成，将分离自3名CD患者肠的LPMC置于上述培养基中，培养48小时后收集上清液并于-80℃冷冻直至使用。然后以1∶20的稀释度将这种上清液加入一开始添加或未添加最终稀释度为1∶500的抗-IL-21抗血清(GM2)或对照血清的CD患者的肠肌成纤维细胞培养物。培育48小时收集肌成纤维细胞上清液并分析MMP含量。
为检测IL-21R表达是否可被调节，用TNF-α(20ng/ml)或IL-1β(20ng/ml)刺激分离自正常对象肠道的肌成纤维细胞24小时，并通过Western印迹评估IL-21R含量。
AGS培养物
将AGS维持在含10％FBS的DMEM/F12中直至融合。然后将细胞在不含FBS的DMEM/F12中维持24小时，最后用不同剂量的IL-21刺激5分钟到48小时或者不刺激。用NF-kB活性抑制剂TPCK(1-10μM)平行处理AGS培养物60分钟，然后再用IL-21(50ng/ml)刺激48小时。
EMSA
将上述刺激或未刺激的AGS均质并用含有10mM Hepes(pH7.9)、10mM KCl、0.1mM EDTA和0.2mM EGTA的缓冲液A收集胞质提取物。将剩余的核溶于含有20mM Hepes(pH7.9)、0.4M NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA和10％甘油的缓冲液C以制备核提取物。这两种缓冲液都添加有1mM二硫苏糖醇(DTT)、10μg/ml抑蛋白酶肽、10μg/ml亮抑酶肽和1mM二苯甲烷硫酰氟化物(Sigma)。室温下在反应体积为20μl的含有10mM Tris-HCl、50mM KCl、1mM DTT、2.5％甘油、5mM MgCl2、1μg Poly(dI-dC)(Sigma)、50fmol含生物素标记的寡核苷酸的探针和5μg核蛋白的溶液中对核蛋白进行20分钟DNA结合研究。
用两种共有寡核苷酸制备DNA探针(FWD，5’：-AGTTGAGGGGAGTTTCCCAGG-3’(SEQ ID NO：7)，REV，5’：-CGGACCCTTTCAGGGGAGTTGA-3’(SEQ ID NO：8))，所述共有寡核苷酸用市售试剂盒(Pierce，Rockford，IL，U.S.A.)在3’端用生物素标记。将核蛋白样品与未标记的NF-kB探针或与未标记的IL基因的寡核苷酸(IL2G)(5’：ACAACGCGTGAGCTCTCTAGAAAGCATCATCTCAACACTAACTTGATAATTAAGTGCCTCGAGCACA-3’(SEQ ID NO：9))一起培育以验证结合特异性，所述寡核苷酸的摩尔量过量100倍以上以使结合饱和。
在中和实验中，将抗NF-kB/p65(Santa Cruz Biotechnology)的人单克隆抗体或对照抗体(Dako Ltd)(使用浓度皆为2.5μg/20μl)与核蛋白一起培育45分钟，然后加入探针。电泳分离采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶。印到膜上之后用EMSA化学发光试剂盒(Pierce)检测标记的寡核苷酸。
DLD-1培养
将DLD-1维持在含有10％FBS的RPMI1640中直至融合。然后将细胞在不含FBS的RPMI1640中维持24小时，最后用不同剂量的IL-21刺激15分钟到48小时或者不刺激。
IL-21R免疫组织化学(immunohystochemistry)
评价CD患者和正常对照肠切除标本中IL-21R的表达。将组织切片切割、脱蜡(deparafinized)并脱水，之后用二甲苯(xilene)和乙醇处理，然后在微波炉中将载玻片与柠檬酸盐缓冲液(0.01M)，pH6(Sigma-Aldrich)一起孵育20分钟。在4℃与1∶20稀释的人单克隆抗体抗-IL-21R(R&D Systems)或对照抗体孵育一夜。用封闭肽证实染色特异性。用TBS(Sigma)洗涤载玻片，之后将其与HRP过氧化物酶偶联的第二抗体(1∶50稀释，Dako SpA，Milan)一起室温培育30分钟。
加入二氨基联苯胺(Sigma)作为底物并与苏木精对比来观察免疫反应性细胞。在与上述相同的免疫组织化学条件下制备对照切片，但将第一抗体替换成对照抗体(Dako)。脱水后用二甲苯(xilene)和乙醇处理载玻片，之后通过光学显微镜分析。
IL-21R Western印迹
用提取的总蛋白质对IL-21R进行Western印迹分析。提取物制备自肠肌成纤维细胞细胞系、CCD18CO、胃和肠上皮细胞以及胃(AGS)和肠癌上皮细胞(HT-29、HT-115、Colo205、DLD-1、T84、Caco-2)。如上所述进行蛋白质提取和IL-21R分析。为检测IL-21R使用市售的单克隆抗体(最终浓度为1μg/ml，R&D Systems)。
MMP Western印迹
培育之后收集未刺激或用IL-21刺激的肌成纤维细胞和AGS培养物上清液，将其离心并用于通过Western印迹用特异性单克隆抗体(R&D Systems)分析MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2。此外，从IL-21刺激的和未刺激的细胞制备蛋白质提取物，然后用于通过Western印迹用特异性单克隆抗体(R&D
Systems)分析MT-MMP-1。
蛋白质阵列系统
为分析用IL-21刺激肠上皮细胞是否与蛋白质/细胞因子/趋化因子含量的改变相关，用能够同时分析120种蛋白质的市售蛋白质阵列系统试剂盒(RayBiotech，Inc.Norcross，GA，USA)对未刺激的或用IL-21刺激的DLD-1培养物上清液进行蛋白质分析。将1ml各上清液在含有抗120种蛋白质的抗体的膜上孵育过夜。洗涤几次之后将斑点与生物素标记的第二抗体一起孵育，然后与链霉抗生物素蛋白和底物一起孵育。通过计算机辅助分析评价各条带的强度。
MIP-3αELISA
用市售ELISA试剂盒(R&D Systems，Space Import-Export Srl，米兰)分析如上所述未刺激的或用IL-21刺激的DLD-1培养物上清液中的MIP-3α。通过ELISA阅读器Dynatech MR5000测量450nm的光密度。结果以pg/ml表示。
结果
发现肠原发性肌成纤维细胞和胎儿肠成纤维细胞(CCD18CO)组成型地表达IL-21R(图8)。相同的细胞类型也表达功能性IL-21R的必需组分—通用γ-链受体(图8)。包括TNF-α和IL-1β在内的炎性刺激物还能增强IL-21R的表达(图9)。
重要的是，用IL-21刺激肠肌成纤维细胞增强了MMP的分泌，但不增强TIMP的分泌。在原发性肌成纤维细胞和CCD18CO中也证实了这一点(图10)。IL-21还增强了膜MMP如MT-MMP-1的表达(图11)，MT-MMP-1的活性是激活MMP-2所必需的。此外，IL-21与TNF-α合作刺激MMP的合成(图12)。为证实IL-21在诱导MMP中的生物学作用，证明CD LPMC上清液可促进肠肌成纤维细胞合成MMP，而加入抗-IL-21抗血清GM2可抑制这种效应(图13)。在肠原发性上皮细胞系和结肠癌上皮细胞系中也观察到IL-21R的组成型表达(图14)。重要的是，免疫组织化学(immunoistochemistry)(图14A)和Western印迹(图14B)分析显示IBD患者、尤其是CD患者的上皮细胞中有增强的IL-21R的表达。为检测IL-21对肠上皮细胞生物活性的作用，选择表达IL-21R的DLD-1细胞系。用IL-21体外刺激这些细胞与不同磷酸化蛋白含量的改变相关(图15A)。DLD-1响应IL-21刺激分泌高水平MIP-3α这一事实支持了针对IL-21的细胞应答(图14B和C)。IL-21R的表达不限于肠上皮，胃原发性上皮细胞系和胃癌上皮细胞系如AGS和MKN也组成型地表达这种受体(图18)。用IL-21刺激AGS始终导致MMP-2和MMP-9的分泌增强(图19A)，MMP-2和MMP-9是两种在Hp感染患者的上皮细胞中过量产生的明胶酶。这种作用似乎取决于IL-21调节NF-kB活化的能力，因为IL-21提高了NF-kB的活化(图19B)，而用TPCK抑制NF-kB降低了IL-21-介导的MMP-2和MMP-9的合成(图19C)。
实施例6：研究银屑病患者IL-21和IL-21R的表达
材料和方法
患者和样品
从9名银屑病患者感染和未感染的区域获得皮肤活检样品。取样时患者未接受治疗。将活检样品立即冷冻在液氮中并保存于-80℃直至使用。
IL-21和IL-21R Western印迹
用上述方法分析各样品总蛋白质提取物中的IL-21及其受体。
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序列表
<110>  吉利亚尼国际有限公司(Giuliani International Ltd.)
<120>  白介素-21的抗原性表位，相关抗体以及它们在医学领域的应用
<130>  PCT26243
<150>  RM2004A000586
<151>  2004-11-29
<160>  9
<170>  PatentIn version 3.2
<210>  1
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21表位
<400>1
Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp
1               5                   10                  15
Ser
<210>  2
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21表位
<400>  2
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn
1               5                   10                  15
<210>  3
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21表位
<400>  3
Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg
1               5                   10                  15
<210>  4
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21表位
<400>  4
Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser
1               5                   10                  15
<210>  5
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL21表位
<400>  5
Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg
1               5                   10                  15
<210>  6
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21表位
<400>  6
Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu
1               5                   10                  15
<210>  7
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21正向引物
<400>  7
agttgagggg agtttcccag g                                                 21
<210>  8
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21反向引物
<400>  8
cggacccttt caggggagtt ga                                                22
<210>  9
<211>  65
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-21寡核苷酸探针
<400>  9
acaacgcgtg agctctagaa agcatcatct caacactaac ttgataatta agtgcctcga       60
gcaca                                                                   65

Claims (13)

1.属于人IL-21序列的抗原性表位，其包含以下序列或其至少5个氨基酸的部分：
KMI HQH LSS RTH GSE DS(SEQ ID NO：1)；
NVS IKK LKR KPP STN(SEQ ID NO：2)；
LGT LVH KSS SQG QDR(SEQ ID NO：3)；
TNA GRR QKH RLT CPS(SEQ ID NO：4)；
CDS YEK KPP KEF LER(SEQ ID NO：5)；
CFQ KAQ LKS ANT GNN E(SEQ ID NO：6)。
2.编码如权利要求1所定义的抗原性表位的寡核苷酸序列。
3.如权利要求1所定义的表位在制备定向抗人IL-21的抗体中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段、嵌合或单链抗体。
5.对至少一种如权利要求1所定义的抗原性表位具有特异性和选择性的中和抗体。
6.如权利要求5所述的抗体，它标记有荧光染料、放射性同位素或药物。
7.如权利要求5或6所述的抗体在医疗领域的应用。
8.如权利要求5-7所定义的抗体在制备用于治疗与改变的IL-21表达有关的免疫-炎性疾病的药物中的应用。
9.如权利要求5-7所定义的抗体在体外诊断与改变的IL-21表达有关的免疫-炎性疾病中的应用。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述与改变的IL-21表达有关的免疫-炎性疾病是慢性炎性肠病、乳糜泻、银屑病。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述慢性炎性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。
12.一种药物组合物，其含有至少一种如权利要求5-7所定义的抗体作为活性成分以及一种或多种药学上可接受的辅佐剂和/或赋形剂。
13.一种诊断试剂盒，其装有至少一种如权利要求5和/或6所定义的抗体和/或如权利要求1所定义的表位。
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