CN110392695A - 针对cd127的抗体和多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可用于治疗和诊断应用的靶向CD127(IL7受体的α链)的抗体的领域，以及特别提供针对CD127(特别是人CD127)的人源化单克隆抗体、其治疗用途和诊断应用。

Description

针对CD127的抗体和多肽

技术领域

本发明涉及可用于治疗和诊断应用的靶向CD127(IL7受体的α链)的多肽或抗体领域，以及特别提供针对CD127(特别是人CD127)的人源化单克隆抗体、其治疗用途和诊断应用。

背景技术

白细胞介素7(IL-7)受体的α链(或亚基)被称为CD127或p90 IL-7R或IL-7Rα或IL-7Rα(有时也称为IL-7Rα)。

发明内容

在一个具体方面，本文提供的抗体(特别是单克隆抗体)针对人细胞上表达的人IL-7受体的α链。在一个具体方面，本文提供的抗体对IL-7-IL-7R相互作用具有拮抗特性，可能呈现针对CD127阳性细胞的细胞毒活性，但不会增加由TSLP诱导的树突细胞(DC)的成熟。特别地，本文提供的抗体识别人CD127表位，该人CD127表位包含来自CD127的2b位点的序列，特别地，该表位包含CD127的结构域D1和2b位点的人CD127序列，特别地，该表位包含来自D1的至少一个序列和来自2b位点(优选来自CD127的2b位点的第三β折叠)的至少一个序列。或者，或另外地，在一个特定方面，本文提供的抗体不会诱导CD127的内化和/或抑制IL7诱导的CD127内化。在一个具体方面，本文提供的抗体是人源化的并且包含至少80％，优选至少84％，或至少85％的人残基。在一个具体方面，本文提供的抗体对效应记忆T细胞具有快速作用，对效应记忆T细胞具有长期作用，或者，优选地对效应记忆T细胞具有快速且长期的作用。在一个特定方面，本文提供的抗体能够有效地生产。在一个具体方面，可以测量CD127、IL-7和/或TSLP的表达水平，以使用特别是本文提供的抗CD127抗体评估反应的可能性。除了抗体之外，本文还提供特别是作为用于产生抗体和/或用于类似于所述抗体的用途的工具的多肽，特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链、抗原结合片段和来自此类抗体的抗体模拟分子和多核苷酸。

当与WO 2015/189302中公开的N13B2-h1、N13B2-h2和N13B2-h3抗体相比时，本发明人寻求获得了改进的人源化抗体。虽然已知可变结构域框架序列中的一些残基(包括游标区(Vernier zone)残基、规范残基、VH/VL界面的残基等)在抗体结构中是关键的并且不应突变以保持抗体的生物化学和生物学活性，但发明人惊奇地发现，N13B2的轻链可变结构域框架序列中(包括一些这样的关键残基)的一些突变允许增加人残基含量(高于N13B2-h3并且高达86.3％)和改善的生产(比N13B2-h3高4倍)，同时保留所有功能特性。

这些突变由N13B2的轻链可变结构域框架序列内的16个氨基酸取代组成，特别是另外用亮氨酸残基取代48位的缬氨酸残基(V48L)和/或用酪氨酸残基取代87位的苯丙氨酸残基(F87Y)。除非另有说明，使用Kabat编号提供这些位置和本文提供的抗体链的任何氨基酸位置。本文提供了改善的抗体轻链可变结构域，其由以下序列组成：

-SEQ ID No：9(包括所述16个氨基酸取代-所述抗体轻链可变结构域在下文中称为N13B2-hVL3)；

-SEQ ID No：10(包括所述16个氨基酸取代且另外具有突变V48L-所述抗体轻链可变结构域在下文中称为N13B2-hVL4)；

-SEQ ID No：11(包括所述16个氨基酸取代且另外具有突变F87Y-所述抗体轻链可变结构域在下文中称为N13B2-hVL5)；和

-SEQ ID No：12(包括所述16个氨基酸取代且另外具有两个突变V48L和F87Y-所述抗体轻链可变结构域在下文中称为N13B2-hVL6)。

因此，本文中称为N13B2-hVL3的抗体轻链可变结构域包含N13B2-h3的CDR、所述16个氨基酸取代和人框架序列内关键位置48和87处的N13B2的原始残基(即，分别为V和F)，并具有SEQ ID No：9的序列。本文提供的优选的改善的抗体的轻链可变结构域被称为N13B2-hVL6，另外包含突变V48L和F87Y，由SEQ ID No：12所示的序列组成。

技术人员不会预期到，所述突变，特别是在轻链可变结构域框架中的这些位置的突变会使抗体与CD127的亲和力不受影响：V48是规范残基，F87位于VH/VL界面；如本领域技术人员已知的并且如Clark，2014中所讨论的，这些残基的突变预期会影响抗体的亲和力和/或稳定性。如本文所用，术语“规范(canonical)”残基是指限定特定规范CDR结构的CDR或框架中的残基，如Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等，J.Mol.Biol.227：799(1992)限定的。根据Chothia等人，许多抗体的CDR的关键部分具有几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列的层级上有很大差异。每个规范结构主要为形成环的氨基酸残基的连续区段指定一组肽骨架扭转角。未能预见的是，在两个位置引入所公开的突变会导致改善的生产，同时仍然保留抗体的结合特性和有利的其他功能特性。

因此，本文提供了特别用于产生如下文所定义的此类抗体(特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链)或其抗原结合片段或抗体模拟分子的多肽，该抗体(特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链)由序列、特别是多达250个氨基酸的序列组成，包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；或SEQ ID NO：11；或SEQ ID NO：12。在一个具体方面，本发明涉及本文提供的抗体或其抗原结合片段，特别是特异性结合CD127，特别是人CD127的人源化单克隆抗体，并包含：

抗体轻链或抗体轻链可变结构域，该抗体轻链包含选自下组的序列或该抗体轻链可变结构域由选自下组的序列组成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ IDNo：12；特别是SEQ ID No：12；和

抗体重链可变结构域，其包含由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示序列组成的三个CDR，特别是由SEQ ID No：7所示的序列组成的抗体重链可变结构域。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及本文提供的抗体或其抗原结合片段，特别是人源化单克隆抗体，其特异性结合CD127，特别是人CD127，并且包含：

-轻链可变结构域，其由选自下组的序列组成：SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQID No：11和SEQ ID No：12，特别是SEQ ID No：12；和

-重链可变结构域，其包含由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示序列组成的三个CDR，特别是由SEQ ID No：7所示序列组成的重链可变结构域。

在一个特定方面，本文提供的抗体包含轻链和重链，该轻链具有如上可变结构域和由选自SEQ ID No：27或28(优选SEQ ID No：27)的序列组成的恒定结构域，该重链具有如上所述的可变结构域的和由SEQ ID No：26所示序列组成的恒定结构域。

本文还提供了分离的多肽，其由具有多达250个氨基酸(特别是多达217个、多达214个，多达211个氨基酸，更特别是多达200个、多达175个、多达150个、多达135个、多达120个、多达107个氨基酸，甚至更特别是多达100个、多达90个、多达80个、多达74个、多达70个、多达60个氨基酸)的序列组成，其中，所述序列包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成：

-SEQ ID No：9(人框架序列内的N13B2-h3的CDR)；

-SEQ ID No：10(人框架序列内的N13B2-h3的CDR，包含V48L突变)；

-SEQ ID No：11(人框架序列内的N13B2-h3的CDR，包含F87Y突变)；

-SEQ ID No：12(人框架序列内的N13B2-h3的CDR，同时包含V48L和F87Y突变)；和

-其抗原结合片段，特别是包含由SEQ ID No：4、SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示序列组成的三个CDR的所述片段，更特别地，包含至少74个氨基酸(其由SEQ ID No：12的氨基酸24至97组成)的片段。

本文还提供了编码本文提供的多肽(特别是本发明的抗体或其抗原结合片段)的多核苷酸。特别是，此类多核苷酸编码包含选自SEQ ID No：9～12的序列或由其组成的多肽，并且还编码包含选自SEQ ID No：1～3的序列或由其组成的多肽，特别是由SEQ ID No：7组成的多肽，并且还可以编码包含选自SEQ ID No：1～3，特别是SEQ ID No：7的序列或由其组成的多肽，并且还可以编码包含选自SEQ ID No：26～28的序列或由其组成的多肽。特别地，所述多核苷酸包含至少两种分离的核酸序列(分子)的组合或由其组成，第一分离的核酸分子包含选自SEQ ID No：15～18(特别是SEQ ID No.18)的序列或由其组成；所述组合还包含第二分离的核酸分子或由其组成，所述第二分离的核酸分子包含选自SEQ ID No：13和SEQ ID No：29-31(特别是SEQ ID NO：13)的序列或由其组成。

特别地，根据本发明的多肽包含抗体轻链可变结构域或抗体轻链，所述多肽包含至少84％，更特别是至少85％的人残基。所述多肽可以是来自本文公开的抗体的抗原结合片段和/或抗体模拟分子。

本文还提供了包含所述多肽(特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链)、抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子的组合物，以及获得所述抗体的方法、编码所述多肽和抗体的核酸分子以及所述多肽、抗体和组合物的应用。

因此，当IL-7信号通路为所述发病机制提供贡献时(特别是当不希望树突细胞的成熟增加(更确切地说是共刺激分子的上调)时)，本文提供的多肽、抗体轻链可变结构域、抗体轻链、抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子和组合物可以用于和/或适用于治疗由淋巴细胞生成相关的发病机理导致的在人类患者中诊断出的病症。

具体实施方式

生物化学

CD127为IL-7受体(IL-7R)和TSLP受体(TSLPR)共有。IL-7R由CD127和白细胞介素受体的共同γ链(γc)的异二聚体构成。共同γ链(common gamma chain)γc在本文和文献中有时被称为CD132。IL-7R与白细胞介素7结合。TSLP受体是CD127和细胞因子受体样因子2(CRLF2)的异二聚体。TSLP受体与TSLP结合。在文献中，TSLPR有时用于指受体的CRLF2链和CD127/CRLF2复合物。为了避免混淆，在下文中，TSLPR通常指该复合物。

CD127(Swiss Prot登录号P16871)可以以四种同种型存在。规范同种型，也称为H20(Swiss Prot P16871.1)是单次跨膜蛋白并具有459个氨基酸，该459个氨基酸(从N端至C端)由以下组成：20个氨基酸的信号肽、219个氨基酸的细胞外结构域、25个氨基酸的跨膜结构域和195个氨基酸的细胞内结构域。其他同种型享有H20的全部(或大部分)细胞外结构域的序列并显示不同的C末端序列。同种型2和4是分泌的(Swiss Prot P16871-4和P16871-3)，而同种型3(Swiss Prot P16871-2)也是跨膜蛋白。据报道，CD127具有SEQ ID No：21的序列，并且当去除信号肽时，其细胞外结构域具有SEQ ID No：22的序列。除非另有说明，否则本文中用于CD127的氨基酸的编号是SEQ ID No：22的编号。

CD127是细胞因子受体同源性I类(CRH I)受体。如本领域众所周知的，这些受体的细胞外结构域由两个纤连蛋白3结构域(称为D1和D2)组成。CD 127的精确结晶结构已在例如McElroy等，2009；McElroy等，2012和Walsh，2012中发表和讨论，特别是以蛋白质结构数据在结构生物信息学蛋白质数据库研究协作组(RCSB PDB)数据库中被公开，登录号为3UPl。通常认为D1参与与IL-7的结合，而D2参与与γc链的结合(以及与IL-7的结合)。重要的是，结构域D2的2b位点包含三个β折叠，包括以下序列：SEQ ID No.32(FDLSVIYRE)；SEQID No：33(NDFVVTFNTS)和SEQ ID No：34(TKLTLLQR)。因此，结构域D2的2b位点包含在SEQID No：22的氨基酸109和180之间(参见Walsh，2012；Verstraete，K等，Nature Com 2017)。结构域D2的2b位点也可以定义为包含在SEQ ID No：22的氨基酸109和173之间。结构域D2的2b位点也可以定义为包含在SEQ ID No：22的氨基酸113和180之间。结构域2b的2b位点也可以定义为包含在SEQ ID No：22的氨基酸113和173之间。特别地，结构域D2的2b位点包含以下氨基酸，特别是由以下氨基酸组成：SEQ ID No：22的氨基酸109至133(特别是109至127)(前两个β折叠位于其中)；以及SEQ ID No：22的氨基酸166至180(第三个β折叠位于其中)。更特别地，2b位点基本上由SEQ ID No：22的氨基酸113至133(特别是113至127)和SEQ IDNo：22的氨基酸166至180组成。更特别地，2b位点基本上由SEQ ID No：22的氨基酸109至133(特别是109至127)和SEQ ID No：22的氨基酸166至173组成。更特别地，2b位点基本上由SEQID No：22的氨基酸113至133(特别是113至127)和SEQ ID No：22的氨基酸166至173组成。结构域D2的2b位点对于CD127-γc的相互作用是关键的，特别是在IL-7存在下允许或增加CD127与γc的结合。特别地，已经在患有严重联合免疫缺陷(SCID)的患者中识别出的P112和L115的突变被认为会使D2结构域的疏水核心不稳定，这可能导致其致病特征。如上所述，2b位点基本上由SEQ ID No：22的氨基酸109至180组成，或基本上由SEQ ID No：22的氨基酸109至173组成，或基本上由SEQ ID No：22的氨基酸113至180组成，或基本上由SEQ ID No：22的氨基酸113至173组成。技术人员将理解，这种结构域的末端可能不一定用单碱基精确界定，并且2b位点可以理解为在所述序列的任一端或两端包含1、2或3个或更多或更少的氨基酸。因此，当在本文中提及CD127的2b位点时，应该理解为是指从SEQ ID No：22的位置106、107、108、109、110、111、112或113开始并结束于位置173、174、175、176、177、178、179或180的CD127序列；特别是指被认为或显示出构成与IL7-R的γc链(特别是在IL-7存在下)的必要结合位点的序列。更具体地，当在本文中提及CD127的2b位点时，应理解为这是指从SEQID No：22的位置106、107、108、109、110、111、112或113开始且结束于SEQ ID No：22的位置124、125、126、127、128、129、130、131、132或133的CD127序列，但也指从SEQ ID No：22的位置162、163、164、165或166开始且结束于SEQ ID No：22的位置173、174、175、176、177、178、179或180的CD127序列。应注意，如本文所定义的三个β折叠可包含对根据本发明的抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物有特异性的表位序列。根据本发明的抗体、抗原结合片段和抗原结合模拟物可能能够特异性结合SEQ ID No：32、SEQ ID No：33和/或SEQ ID No：34。此外，包含一个β折叠的至少一部分和位于任何β折叠的一端的一些连续氨基酸的氨基酸序列也可以是对根据本发明的抗体有特异性的表位序列。例如，序列SEQ ID No：35(TLLQRKLQPAAMYEI)包含第三个β折叠的最后五个氨基酸和位于第三个β折叠外的十个额外氨基酸。作为另一个实例，SEQ ID No.96(RKLQPAAM)包含位于第三个β折叠内的一个氨基酸和位于第三个β折叠外的七个额外氨基酸。特别地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性结合SEQ ID No：22的R173。特别地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性结合选自SEQ ID No：32、SEQ ID No：33、SEQ IDNo：34、SEQ ID No.35和SEQ ID No：96的至少一种序列。特别地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性结合选自SEQ ID No：36(LVEVKCLNFR)、SEQ IDNo：37(ICGALVEVKCLNFR)和SEQ ID No：38(LVEVKCLNFRK)的至少一种序列。替代地或补充地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段或抗原结合模拟物可特异性结合选自SEQ ID No：39(KKFLLIG)、SEQ ID No：40(KKFLLIGKSNI)和SEQ ID No：41(FIETKKFLLIG)的至少一种序列。SEQ ID No：36至SEQ ID No：41位于CD127的结构域D1内，并且是由根据本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟分子识别的表位序列。在本发明的备选或补充实施方案中，根据本发明的抗体或其抗原结合片段或抗体模拟分子可以特异性结合选自SEQ ID No：42(CLNFR)和SEQ ID No：43(FIETKKF)的至少一种序列。这两个序列是位于CD127的结构域D1内的表位序列。在本发明的一个具体实施方案中，根据本发明的抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性结合至少一种选自下组的序列：SEQ ID No：32、SEQ ID No：33、SEQ ID No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96，特别是选自下组的序列：SEQ ID No：34、SEQID No：35和SEQ ID No：96；和至少一个选自下组的序列：SEQ ID No：36、SEQ ID No：37、SEQID No：38、SEQ ID No：39、SEQ ID No：40、SEQ ID No：41、SEQ ID No：42和SEQ ID No：43，特别是选自下组的序列：SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。在本发明的一个优选实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可特异性结合SEQ ID No 34和至少一种选自SEQ IDNo：42和SEQ ID No：43的序列，特别是SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。在本发明的一个优选实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可特异性结合SEQ ID No：35和至少一种选自SEQ ID No：42和SEQ ID No：43的序列，特别是SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。在本发明的一个优选实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可特异性结合SEQ IDNo：96和至少一种选自SEQ ID No：42和SEQ ID No：43的序列，特别是SEQ ID No：42和SEQID No：43。在本发明的一个优选实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性结合序列SEQ ID No：35和SEQ ID No：96。在本发明的一个优选实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性结合序列SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。在本发明的一个具体实施方案中，根据本发明的抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以至少特异性地识别CD127的结构域D2的2b位点的第三个β折叠。第三个β折叠优选定义为位于SEQ ID No：22的氨基酸166和173之间，对应于SEQ ID No：34，更特别地，第三个β折叠对应于SEQ ID No：34。在本发明的一个更具体的实施方案中，根据本发明的抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性地识别位于结构域D2的2b位点内的至少两个β折叠，更具体地，根据本发明的抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性识别位于如上文所定义的结构域D2的2b位点内的三个β折叠。在本发明的一个更具体的实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性识别位于结构域D2的2b位点内的至少一个β折叠，特别是对应于SEQ ID No：34的第三个β折叠，并与选自SEQ ID No：36、SEQ ID No：37、SEQ ID No：38、SEQ ID No：39、SEQ ID No：40、SEQ ID No：41、SEQ ID No：42和SEQ ID No：43的至少一个序列结合。在本发明的一个优选实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以至少特异性地识别对应SEQ ID No：34的第三个β折叠，以及至少一种选自SEQID No：42和SEQ ID No：43的序列，特别是SEQ ID No：42和SEQ ID No：43。在本发明的一个更具体的实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性识别由SEQ IDNo：35的氨基酸组成的线性肽或线性表位。替代地或补充地，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性识别由序列ID No：96的氨基酸组成的构象肽或构象表位。在更具体的实施方案中，抗体或抗原结合片段或抗原结合模拟物可以特异性识别SEQ ID No：35的氨基酸序列的线性表位或线性肽，以及SEQ ID No：96的构象表位或构象肽。

IL-7R信号传导。IL-7与IL-7R的结合触发了几种信号通路的激活，包括Janus激酶(JAK)-1和-3、信号转导和转录激活因子5(STAT5)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-k)。据报道STAT1和STAT3通路被激活，尽管它们似乎并不是主要通路。STAT5通路的激活是诱导抗凋亡蛋白Bcl-2和预防促凋亡蛋白Bax进入线粒体并因此促进胸腺发育T细胞前体存活所必需的。PI3-k通路的激活导致促凋亡蛋白Bad的磷酸化和细胞质保留。

TSLPR信号传导。胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是上皮细胞细胞因子，其在淋巴细胞生成中具有活性，特别是参与免疫系统细胞发育的调节，所述调节特别影响所述细胞的成熟。人TSLP(Genbank登录号AF338732)是影响树突细胞极化并促进T细胞和B细胞增殖和分化的因子。TSLP还抑制Treg细胞的产生(Lei等，2011)。

已显示，TSLP诱导的信号通路在分子水平上与IL-7诱导的通路不同。特别是，虽然TSLP与其受体结合也会激活Jak-1，但它不会激活Jak-3，但会激活Jak-2。这些差异与以下观察结果一致：Jak-1与CD127(两种受体共有)相关，而Jak-2与CRLF2相关，且Jak-3与γc相关(Rochman等，2010)。STAT5通路的激活还被报道用于TSLP诱导的信号传导(Zhong等人，2014)。TSLP的一个主要作用是导致树突细胞的活化，诱导共刺激分子如CD80的过表达，从而促进TH-2介导的炎症反应(Reche等，2001)。

细胞生物学

“CD127-阳性细胞”是指在其细胞表面表达CD127的细胞。在大多数情况下，CD127阳性细胞在形成IL-7R的复合物(IL-7R阳性细胞)中和/或在形成TSLPR的复合物(TSLPR阳性细胞)中表达CD127。CD127由包括记忆和幼稚T细胞的各种细胞表达。CD127特别由效应T细胞(Teff)(包括静息T细胞和记忆T细胞)和未成熟B细胞表达，但特别地不由静息天然调节性T细胞(天然Treg)表达。CD127对于促进胸腺细胞分化和淋巴细胞的克隆扩增是必需的。

最近几项研究强调了IL7-CD127通路对幼稚T细胞内稳态的重要性，表明常规CD4⁺T细胞上的膜结合的CD127的表达水平与健康个体和HIV感染患者以及MS患者中新近胸腺迁出(RTE)-CD4⁺T细胞的频率相关(Albuquerque等，2007)(Broux等，2010)。CD127也是TSLP受体的组分。由哈氏小体(Hassall′s corpuscles)(由胸腺髓质中的上皮细胞组成的结构)分泌的TSLP已被证明可以调节CD11c⁺髓样树突细胞(MDC)以诱导胸腺细胞分化成Treg(Watanabe等，2005a)。因此，如CD127敲除小鼠中所示，来自IL-7受体的信号是Treg发育所需的(Mazzucchelli等，2008)。在(Haas等，2011)中，作者显示常规T细胞上CD127的表达降低，IL-7血浆水平上调，同时MS中新近胸腺迁出-Treg频率和Treg功能降低，没有明确的遗传影响(Haas等，2011)。

探讨IL-7如何调节其同源受体膜运输对于深入了解IL-7/IL-7R在淋巴细胞功能中的作用至关重要。先前的研究表明，IL-7刺激T细胞导致在30分钟内CD127的表面下调，这可能是因为受体内化。在稍后的时间点(2～6小时)，IL-7显示出会诱导CD127的转录下调。然而，实际的CD127内化动力学和IL-7对运输机制的调节仍有待阐明(Henriques等，2010)。还表明IL-7诱导的信号传导依赖于CD127内化，并且随后的受体降解依赖于JAK3活性并且由蛋白酶体和溶酶体介导。

病理生理学

树突细胞在成熟后表达高水平的共刺激分子，例如CD80，其促进T细胞介导的免疫应答。它们还产生细胞因子TARC(CCL17)，其诱导T细胞中的趋化性。因此，成熟的树突细胞有助于几种免疫介导的疾病(其中T细胞应答起作用)的病理生理学，例如哮喘、类风湿性关节炎、结肠炎、多发性硬化和葡萄膜炎。成熟的树突细胞在细胞、组织或器官同种异体移植物的排斥过程中也起关键作用。因此，许多治疗策略旨在防止树突细胞成熟。

在抗原呈递细胞(APC)(例如树突细胞)上存在或不存在共刺激分子显著影响免疫应答的定性和定量性质。树突细胞过表达CD80导致DC成熟并增加记忆T细胞活化(Bour-Jordan等，2011)。机理上，CD28与CD80的相互作用占据免疫突触的中心簇，并与参与的TCR共定位，从而稳定免疫突触(Dustin和Shaw，1999)(Grakoui等，1999)。CD28和CD80之间的相互作用实际上产生了适当的TCR间隔，以有效地与HLA分子相互作用(Shaw和Dustin，1997)。

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘疾病。MS患者中枢神经系统(CNS)中脱髓鞘斑块的出现与主要由巨噬细胞和T淋巴细胞组成的炎性浸润有关。在机理水平上，MS被认为是一种自身免疫疾病。MS通常被认为是主要由CD4+T细胞介导的疾病。CD4+：Th1和更新近的Th17的特定亚群涉及该疾病的病理生理学。目前仍难以为各个亚群Th1和Th17分派特定的角色。此外，通过alpha4(α4)-整联蛋白的拮抗性抑制白细胞运输现已被证实可作为治疗炎性疾病(例如MS和炎症性肠病(IBD))和治疗动脉粥样硬化的治疗方法(Zhi等，2014)。α4β7在更受限制的一组白细胞上表达，包括活化的巨噬细胞、淋巴细胞亚群、NK细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。

人IL-7在人T淋巴细胞上体外诱导a4和β7整联蛋白的强烈表达，并显著增加表达α4、β7和α4/β7整联蛋白的人T淋巴细胞的频率，α4、β7和α4/β7整联蛋白是T淋巴细胞归巢和保留在非淋巴组织(如肠、脑和皮肤)中所必需的(Denucci等，2009；Gorfu等，2009)

幼稚T细胞是移植的器官和组织的急性排斥的部分原因。这些细胞可以通过目前的免疫抑制药物(钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitors))和阻断共刺激的单克隆抗体(抗粘连，CD80/86抑制剂)来控制。记忆T细胞也是移植排斥的原因。由于获得性免疫史(主要是以前对病毒的反应)，记忆T细胞在人体内积聚。已经表明，记忆T细胞可以被同种异体抗原重新激活，这是“异源免疫”的结果，这是我们的抗病毒防御与同种异体抗原的交叉反应(Adams等，2003)。异源免疫代表了对耐受诱导的有效屏障，因为与幼稚T细胞相比，记忆T细胞被编程为快速激活，对共刺激信号的需求减少。记忆T细胞也可能参与慢性排斥反应。除了它们在器官和组织移植中的作用外，幼稚和记忆T细胞也是许多自身免疫疾病的共同原因。这是溃疡性结肠炎(Shinohara等，2011)、类风湿性关节炎、牛皮癣或移植物抗宿主病的情况。

炎症性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD))是慢性复发性胃肠病症，其特征在于慢性肠道炎症，对肠道微生物群的免疫应答失调和上皮屏障功能障碍(Khor等，2011；Abraham和Cho，2009)。IBD的发病率和患病率在世界范围内不断增加，这些疾病与明显的发病率有关，并对生活质量和工作能力产生重大影响(Danese和Fiocchi，2011；Baumgart和Sandbom，2012)。目前的常规治疗旨在通过逐渐使用抗炎剂、免疫抑制药物和靶向炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子α(TNFα))的生物制剂来抑制炎症。IBD的一个关键特征是在炎症部位快速募集白细胞和延长持续时间，这是由整联蛋白与内皮细胞表达的同源受体相互作用所促成的，使得允许细胞粘附和迁移(Adams和Eksteen，2006；Agace，2006)。新兴疗法通过抗粘附分子将此入口对准肠道，特别是对准肠道特异性α4β7整联蛋白通路(Feagan等，2013；Sandbom等，2013)^7，8。然而，这些疗法在超过一半的患者中不能维持缓解，在高比例的初级反应者中发生复发性发作。作为全身性免疫抑制的结果，也会发展出机会性感染。因此，一个主要目标是为IBD提供新的治疗方法并识别出决定IBD的慢性、反应和复发的标志物。

此外，已显示，几种恶性细胞呈现IL-7R。这是Sezary皮肤淋巴瘤(其中60％)或儿童急性淋巴细胞白血病的情况，其中约15％的病例发展出CD127的功能获得性的突变，使这些肿瘤部分地IL-7依赖(Shochat等，2011)。

消耗T淋巴细胞已成为对抗同种异体移植物排斥或对抗自身免疫的有效免疫抑制方法。然而，总T细胞消耗可能不利于诱导免疫耐受。在不修饰Treg细胞的情况下靶向T细胞亚群或选择性活化的T细胞可构成预先致耐受性(pro-tolerogenic)方法(Haudebourg等，2009)。因此，CD127可以被认为是旨在调节免疫应答的单克隆抗体(Mabs)的潜在有吸引力的治疗靶标，因为这种单克隆抗体可能具有消耗效应子但不调节淋巴细胞的潜力。因此，推测它们可能通过拮抗IL-7对IL-7-R的接近从而限制T和B细胞功能和生长而在移植、自身免疫(Michel等人，2008)和恶性肿瘤中显示功效。

使用干扰IL-7通路的针对CD127⁺细胞的单克隆抗体的疗法可以通过消除/中和幼稚T细胞和记忆T细胞和/或减少它们的数量同时保留Treg细胞，或通过消除或减少CD127阳性恶性细胞的数量，来实现该目标。然而，用针对CD127⁺细胞的单克隆抗体的疗法若导致树突细胞活化则可能成为双刃剑。实际上，CD127也由与CRLF2(形成TSLP受体)相关的树突细胞表达。在TSLP存在下，树突细胞被激活并促进T细胞介导的免疫应答。一些针对CD127的单克隆抗体(据推测通过修饰TSLP与TSLP受体相互作用的方式)具有增加由TSLP诱导的树突细胞成熟的性质。因此，用针对CD127的单克隆抗体的疗法不会增加由TSLP诱导的树突细胞的成熟将提供治疗优势。它将呈现IL7R阻断的益处，而没有在含有TSLP的发炎环境中激活树突细胞的缺点。

在一篇出版物(Racape等，2009)中，作者分析了IL-7受体α(IL7Rα)作为移植中潜在治疗靶标的兴趣。在评估了IL-7Rα在各种T细胞和IL-7应答细胞中的表达后，作者测定了表达IL-7Rα的靶向记忆T细胞是否可以延长同种异体移植物在小鼠中的存活，并得出结论：靶向IL-7或IL-7Rα将有利地节约Treg细胞。在展望中，作者指出，在治疗中靶向IL-7或IL-7Rα可能对表达CD127的细胞的存活具有不同的后果，并且可能引起不同类型的淋巴细胞减少。还从概念的角度提出了如下问题：针对IL-7Rα的抗体的效果取决于它们是否为阻断或中和或细胞毒性抗体。然而，作者没有表明已经获得并测定了这样的抗体，而是表达了需要进一步研究以评估假设的相关性。

鉴于在免疫相关疾病和涉及IL-7/IL-7Rα的其他疾病(例如不同类型的癌症，包括一些乳腺癌)中可用的治疗方法的缺点，仍然需要进一步的候选药物，特别是对于更具选择性的靶标有活性的候选药物，其目的是控制例如调节人类患者的免疫激活。

在此背景下，WO2010/017468中公开了针对IL-7Rα的具有对IL-7Rα的拮抗特性的单克隆抗体，以及WO2011/094259公开了其人源化形式，以治疗多发性硬化等自身免疫疾病。所描述的抗体被认为是IL-7与其受体结合的拮抗剂，并且对T_H17和T_H1细胞的扩增和存活具有活性，该T_H17和T_H1细胞的扩增和存活被认为需要IL-7与其CD127受体的相互作用。尚未考虑这些抗体对免疫细胞，特别是对树突细胞成熟的影响。此外，这些抗体被认为不会抑制TSLP诱导的TARC产生(WO2011/094259的第107页)。类似地，尚未讨论WO2011/104687或WO2013/056984中报道的抗CD127抗体(其被考虑用于治疗糖尿病、狼疮、类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病)对树突细胞成熟的可能影响，并且尚未报道它们与TSLP诱导的信号传导的相互作用。另外，如Kern等人(Kern等，2013；Kem等，2015)所公布的并且如本文所示，现有技术的抗CD127抗体诱导受体内化。由于也诱导CD127内化的拮抗性抗CD127抗体不能控制皮肤IV型超敏反应，而不诱导内化的拮抗性抗-CD127抗体可以，所以内化过程可能会激活信号通路，从而降低抗体的拮抗作用。最后，现有技术的抗体识别不包含来自CD127的2b位点的任何序列(特别是来自SEQ ID No：22的氨基酸109-180，或特别是来自SEQ ID No：22的氨基酸109-173，或特别是来自SEQ ID No：22的氨基酸113-180，或特别是来自SEQ IDNo：22的氨基酸113-173)的表位；并且现有技术的抗体未显示会破坏CD127与IL7-R的γc链的结合。

尽管最近对CD127抗体的开发感兴趣，但努力被集中于抑制IL7诱导的IL-7R信号传导。尽管如此，TSLP和TSLPR已经涉及许多病症。已证明TSLP在皮肤和肺部疾病中起作用(He和Geha，2010)，并与人类和小鼠的包括气道炎性疾病和特应性皮炎等的各种病状相关联(Ying等，2008)(Jariwala等，2011)。此外，已显示TSLP与肠道免疫和炎症的调节相关(Taylor等，2009)。其他涉及TSLP和TSLPR的病状包括儿科B细胞白血病(van Bodegom等，2012)、肺和皮肤特异性过敏性疾病、自身免疫相关疾病(Roan等，2012)和癌症，包括乳腺癌(Olkhanud等，2011)。

WO 2015/189302中公开了不显示增加树突细胞成熟和/或不诱导CD127内化和/或抑制IL7诱导的内化的作用的抗体。在所述申请和下文中，所述抗体，称为N13B2(嵌合抗体)、N13B2-h1、N13B2-h2和N13B2-h3(人源化N13B2)具有高效率，特别是在体内，特别是显示对效应记忆T细胞具有快速作用(如下文所定义)。然而，所述抗体的人源化程度有限，并且它们的生产效率也有限。此外，未报道所述抗体对效应记忆T细胞具有长期作用。

本发明涉及用于设计新型抗体的工具，所述新型抗体适于作为对患有涉及IL-7信号通路的疾病或有患病风险的患者给药的治疗候选物。根据本文提供的各种方法，这种工具改善了意图施用于人宿主的抗体的制备。这种工具尤其包含人源化的，特别是单克隆的抗体，其包含N13B2-h3的所有CDR序列。

特别提供此类多肽(或编码此类多肽的多核苷酸)用于产生抗体(或其抗原结合片段)和/或作为抗体(或其抗原结合片段)，特别是特异性结合CD127的抗体；所述抗体(特别地，单克隆抗体)包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含三个CDR序列，SEQ ID No：1所示的VHCDR1、SEQ ID No：2所示的VHCDR2以及SEQ ID No：3所示的VHCDR3。特别地，所述重链可变结构域由SEQ ID No：7中所示的序列组成，或具有所述序列和额外的突变，特别是四个残基(优选三个或两个残基，甚至更优选一个残基)的取代、缺失或插入，优选地，其中所述突变既不在CDR序列中，也不在框架序列的规范或游标位置。

本文提供的抗体优选是单克隆抗体，意指这些抗体的组合物在抗原结合特异性方面(以及相应地在可变域组成方面)是均质的，尤其是相同的。

本发明提供了共有N13B2-h3抗体的CDR但具有不同的轻链可变结构域框架的抗体。发明人惊奇地揭示，包含与N13B2-h3的轻链可变结构域相同CDR(即，具有SEQ ID No：4、和SEQ ID No：5和SEQ ID No：6的CDR)，但包含不同的轻链可变结构域序列(即，具有SEQ IDNo：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11或SEQ ID No：12的序列)的抗体，虽然广泛地人源化，但与N13B2-h3相比，产量高(高4倍)，同时保留了所有功能特性。

本发明提供了适合于此背景的方法，特别包括针对IL-7Rα的特异性单克隆抗体。在特定实施方案中，所述抗体仅对TSLP通路产生负面干扰。因此，在优选的实施方案中，所述抗体不会增加TSLP诱导的树突细胞成熟。另外或可替代地，在特定实施方案中，所述抗体不诱导CD127的内化和/或抑制IL7诱导的CD127内化。在特定实施方案中，所述抗体将这些与DC成熟和/或内化相关特性与对IL-7/IL-7-R信号传导的拮抗剂活性相结合。在特定实施方案中，所述抗体抑制IL7诱导的T细胞中α4、β7和α4/β7整联蛋白的表达，特别是在体内。在特定实施方案中，所述抗体对靶CD127+细胞发挥细胞毒作用，在物理上减少其数量(缩小该亚群)。另外或可替代地，在特定实施方案中，所述抗体包含至少80％，优选至少84％，或多于84％，甚至更优选至少85％的如下文所定义的人残基。另外或可替代地，在特定实施方案中，所述抗体至少与N13B2-h3一样有效地产生，优选至少两倍有效地产生，如下文所定义。另外或可替代地，在特定实施方案中，所述抗体对效应记忆T细胞具有快速和/或长期作用。

特别地，本文提供的抗体包含可变重链(VH)，该可变重链(VH)包含以下氨基酸序列：

VHCDR1 SEQ ID No：1；

VHCDR2 SEQ ID No：2；

VHCDR3 SEQ ID No：3.

本文提供的抗体优选包含由SEQ ID No：7所示序列组成的VH链：

所述可变重链特别与由SEQ ID No：26的序列组成的恒定重链连接，以构成完整的抗体重链。

特别地，本文提供的抗体包含VL链，其由选自SEQ ID No：9、SEQ ID No：10的序列、SEQ ID No：11的序列和SEQ ID No：12的序列，特别是SEQ ID No：12的序列组成。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYQGLAWYQQKPGKAPKLLLYSANTLHIGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYICQQYYDYPLAFGGGTKVEIK。所述可变轻链特别与恒定轻链连接，以构成完整的抗体轻链，所述恒定轻链由选自SEQ ID No：27和SEQ ID No：28，特别是SEQ ID No：27的序列组成。

特别地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段特异性结合CD127，特别是人CD127，并且包含：

-抗体轻链或抗体轻链可变结构域，该抗体轻链包含选自下组的序列或该抗体轻链可变结构域由选自下组的序列组成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ IDNo：12；特别是SEQ ID No：12；和

-抗体重链可变结构域(其包含由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示序列组成的三个CDR)，特别是由SEQ ID No：7所示的序列组成的抗体重链可变结构域。

在本发明的一个更优选的实施方案中，该抗体或其抗原结合片段特异性结合CD127，特别是人CD127，并且包含：

-根据本发明的抗体轻链可变结构域或抗体轻链，其特别由选自下组的序列组成：SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11和SEQ ID No：12，特别是SEQ ID No：12；和

-抗体重链可变结构域(其包含由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示序列组成的三个CDR)，特别是由SEQ ID No：7所示的序列组成的抗体重链可变结构域。

结合CD127

根据本发明，与IL-7Rα蛋白“结合”是指抗原-抗体类型的相互作用并且包括抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”特性，其特异性结合是指抗体或抗原结合片段与IL-7Rα蛋白质结合，而它们不与或以明显较弱的亲和力与其他蛋白质(例如，常见的细胞因子受体γ链)结合。优选在生理条件下限定和/或测定特异性结合，尤其是在测试溶液的pH和盐含量方面。结合和结合特异性可以根据实施例中公开的试验进行测定，特别是可以通过生物传感器、Blitz、Biacore、ELISA或Western印迹分析进行测定。

在具体的实施方案中，当IL-7-Rα链在TSLP-受体(具有CCRF2；GenBank登录编号AF338733；Reche等，2001)中复合时，本文提供的抗体靶向并结合IL-7-Rα链。在具体的实施方案中，本文提供的抗体作为分离的蛋白质与CD127结合，亲和常数(KD)为5E-9M以下，这可以通过生物传感器分析，特别是通过Blitz方法测定。在具体的实施方案中，使用包含ep1(SEQ ID No：19)和/或ep2(SEQ ID No：20)的序列的人CD127的抗原测定或定义抗体的结合特性。在特定的实施方案中，抗原包含同时包含ep1和ep2的人CD127的片段(即，抗原包含ep1和ep2的序列以及人CD127的插入序列。在具体的实施方案中，本文提供的抗体对所述抗原的亲和力至少与下列抗体相同：WO 2015/189302中公开的N13B2-h3抗体，和/或本文公开的N13B2-hVL6抗体(具有SEQ ID No：7序列的VH和具有SEQ ID No：12序列的VL)，和/或具有SEQ ID No：7的序列的VH和具有SEQ ID No：10的序列的VL或具有SEQ ID No：11的序列的VL的抗体。

测试抗体与其靶标(无论是全长CD127、分离的或作为TSLPR或IL7R或如上所述的其抗原)的结合的方法(包括特别是Blitz方法)是本领域技术人员已知的并且说明于，特别是本文的图3、实施例3和实施例4以及WO 2015/189302的第14页、图3、4和6图及各自的说明和实施例1、2、6、7中。

未增加由TSLP诱导的树突细胞成熟

本文提供的抗体可以结合TSLP受体中的CD127(即当CD127与CRLF2复合而形成TSLP受体时，本文提供的抗体可与CD127结合)。因此，本文提供的抗体可能干扰TSLP诱导的信号传导和/或TSLP受体介导的信号传导。优选地，本文提供的抗体不与TSLP协同作用使免疫细胞(特别是树突细胞)成熟。换句话说，本发明的抗体不会增加由TSLP诱导的免疫细胞的成熟。

在树突细胞的成熟中特别需要这种效果。测量这种效果的方法是本领域技术人员已知的，并且特别地在WO2015/189302的第16-17页和其实施例9中公开。特别地，与单独使用TSLP(无抗体)刺激相比，本文提供的抗体不会使CD40的表达增加超过50％。优选地，CD40的表达的增加不超过25％，优选不超过10％，甚至更优选不超过5％。在特别优选的实施方案中，与单独用TSLP刺激的细胞相比，用TSLP和所述抗体刺激的细胞中CD40的表达没有增加或减少。

抑制IL7诱导的α4、β7和α4/β7整联蛋白的表达

在具体的实施方案中，本文提供的抗体在体外抑制IL7诱导的a4、β7和α4/β7整联蛋白的表达。如本文所用，IL7诱导的α4、β7和α4/β7整联蛋白的表达特指α4和β7整联蛋白中的一个或两个表达水平的增加和/或表达α4、β7和/或α4/β7整联蛋白的T淋巴细胞的数量或比例的增加。抑制可以是部分的，即，在IL7存在下，α4、β7和α4/β7整联蛋白在抗体存在下的表达水平增加超过基线水平(即，既没有抗体且也没有IL7时的水平)，但低于不存在抗体时的水平；或者抑制可以是完全的，即，在IL7和抗体存在下，α4、β7和α4/β7整联蛋白的表达水平不高于基线水平。

在特定实施方案中，本文提供的抗体在体外抑制α4、β7和/或α4/β7整联蛋白的表达，即，用抗体(以及有和/或无IL7)处理的细胞中，α4、β7和/或α4/β7整联蛋白的表达水平低于未处理的细胞(即，没有抗体或IL7)。抑制程度可以是剂量依赖性的。表达的抑制可以如WO2015/189302第18页，特别是第[58]段和实施例16中所述更具体地定义、测试和/或测量。

CD127内化的抑制剂

在一个具体实施方案中，本文提供的抗体抑制IL7诱导的CD127的内化。因此，当将细胞与该抗体一起孵育时，与无抗体一起培育的细胞相比较，IL7的存在不会引起CD127的细胞表面表达降低，或引起不强烈的CD127的细胞表面表达降低。在特定实施方案中，当与所述抗体一起孵育时，当细胞在37℃下与5ng/mL的IL7一起孵育15分钟时，CD127细胞表面表达水平为未与IL7一起孵育的细胞中细胞表面表达水平的至少80％，优选至少90％。在体外，细胞表面表达优选在如上所述的有限时间后测量。此外，由于大多数细胞内化过程在低温下受到抑制，因此通常在生理温度，特别是37℃下观察到最佳效果。然而，还计划在低温，特别是4℃下孵育细胞。

在优选的实施方案中，本文提供的抗体不引起CD127的内化。因此，相对于在其他条件相同但在不存在抗体的情况下孵育的细胞中的细胞表面表达，在所述抗体存在下孵育的细胞中CD127的细胞表面表达没有降低或没有显著降低。在特定实施方案中，当在50ng/mL抗体存在下于37℃孵育30至45分钟时，CD127细胞表面表达水平为在没有抗体的情况下孵育的细胞中的水平的至少80％，优选至少90％。在不存在IL7(在经抗体处理和未经抗体处理的两种细胞中)的情况下、在存在IL7的情况下和/或两种情况下，均可观察到这种效果。

上述两种与CD127内化相关的特性(即，抑制IL7诱导的内化或不引起内化)可以如WO2015/189302中所述进一步定义和/或测试，特别是在第19-20页的第[59]-[63]段和图16和实施例5中。

破坏CD127-γc链的相互作用

根据一个具体实施方案，本文提供的抗体可以破坏CD127与IL7-R的γc链的结合。这意味着，在不存在抗体的情况下CD127和γc链结合在一起的条件(特别是化学和物理条件)下，特别是在IL7存在下，所述抗体的存在显著降低了所述结合。在特定实施方案中，在抗体和IL7存在下，CD127不与γc结合。特别地，在抗体和IL7存在下，与CD127相关(或结合)的γc链的量小于在其他条件完全相同，但无抗体存在(或存有另一抗CD-127抗体，如MD707-13)，特别是存在IL7的条件下的结合量的80％，优选小于50％，甚至更优选小于25％或10％。抗体的这种特性可以特别地通过共免疫沉淀方法来评估，所述共免疫沉淀方法是本领域技术人员公知的用于测试蛋白质相互作用的方法，并且例如在WO2015/189302的实施例21中说明。特别地，可以在存在或不存在测试抗体的情况下孵育细胞，然后在允许保留蛋白质复合物的条件下溶解细胞，并且可以对得到的裂解物进行抗CD127免疫沉淀，并且通过使用抗-γc抗体的蛋白质印迹(Western Blot)评估含有CD127的免疫沉淀复合物中γc的存在(相反，可以使用抗-γc抗体进行免疫沉淀，并且使用抗-CD127抗体评估CD127的存在)。

针对IL7-IL7-R相互作用的拮抗剂

根据一个具体实施方案，本发明的大分子，特别是抗体或其抗原结合片段，还具有对白细胞介素7(IL7)的拮抗特性，从而拮抗IL7接近(即，结合)CD127阳性细胞上的CD127。

“对IL7-IL7-R相互作用的拮抗特性”是指靶向IL7-Rα的本发明的抗体或其抗原结合片段具有阻止CD127细胞(特别是人效应T细胞，特别是人记忆T细胞)表达的IL7受体对其结合配偶体IL7(尤其是人IL7)的可接近性的作用。作为拮抗IL7结合的结果，本发明的抗体或其功能片段通过阻止IL7依赖性胸腺T细胞的产生而导致淋巴细胞减少。

拮抗特性可特别是对IL7诱导的IL7-R信号传导的拮抗作用。如实施例中所述，可通过测量STAT5磷酸化的抑制来测定IL7诱导的IL7-R信号传导的拮抗剂。IL7诱导的STAT5磷酸化是IL7-R活化的标志物，并且预期拮抗IL7-IL7-R相互作用的抗体会降低IL7诱导的STAT5磷酸化。

在特定的实施方案中，本发明的大分子是IL7诱导的IL7-R信号传导的拮抗剂。在一个具体实施方案中，本发明的大分子抑制IL7诱导的STAT5磷酸化。在优选的实施方案中，在低至55ng/ml的抗体浓度下对STAT5磷酸化的抑制大于50％和/或在低至100ng/ml的抗体浓度下对STAT5磷酸化的抑制大于80％。STAT5磷酸化的抑制可以通过本领域技术人员已知的方法评估，特别是通过WO 2015/189302的实施例部分，特别是实施例5和/或第21页，段落[69]和[70]及实施例3中提出的方法评估。

还令人满意的是，本发明的大分子(特别是抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子)抑制PI3-k和/或ERK(细胞外信号调节激酶)信号通路活化和/或不激活或不增加活化，特别是抑制和/或不诱导或不增加PI3-k和/或ERK1和/或ERK2的磷酸化。特别是，本文提供的抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子，特别是该等作为IL-7-IL-7R相互作用拮抗剂的抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子不会诱导PI3-k和/或ERK通路(优选PI3-k和ERK通路)活化，特别是不诱导PI3-k和/或ERK1和/或ERK2磷酸化，更特别地，不会诱导PI3-k及ERK1和ERK 2磷酸化。特别是，本文提供的抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子，特别是作为IL-7-IL-7R相互作用拮抗剂的抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子抑制PI3-k和/或ERK通路活化，特别是抑制PI3-k和/或ERK1和/或ERK2磷酸化，更特别地，抑制PI3-k及ERK1和ERK2磷酸化。所述蛋白质的通路活化和/或磷酸化可以通过本领域技术人员已知的方法测试，特别是通过蛋白质印迹测试，如图7和实施例8所示。

TSLP结合的拮抗剂

由于本文提供的抗体结合IL7-R中的CD127，它们还可以结合TSLPR中的CD127，特别是通过空间位阻和/或通过竞争共同结合位点，它们可以抑制TSLP与TSLPR的结合。换句话说，本文提供的抗体可以对TSLP的结合呈现拮抗活性。

抑制TSLP诱导的TARC产生

在一个具体实施方案中，本文提供的抗体抑制TSLP诱导的CD127阳性细胞的TARC产生。如上所述，TSLP刺激的树突细胞会增加TARC的产生水平。这可能是由于它们与TSLPR结合及其作为TSLP结合的拮抗剂的潜在作用。在一个具体实施方案中，本文提供的抗体不会增加树突细胞的成熟(成熟为例如测定CD40和/或CD80细胞表面标志物的表达增加)。

与用单独的TSLP处理的细胞相比，用TSLP与本文所述的抗CD127抗体一起处理的细胞中，TSLP诱导的TARC产生水平可能更低。换句话说，本文提供的抗体可以是TSLP诱导的TARC产生的抑制剂。在本发明的一个实施方案中，本文提供的抗体降低了TARC产生的水平。在一个具体实施方案中，与仅用TSLP处理的细胞中的水平相比，当抗体浓度低至1μg/ml时，用TSLP和本文提供的抗体处理的细胞中，TARC产生水平降低超过10％，优选超过20％。TARC产生的测量可以使用本领域技术人员已知的任何标准方法，并且例如使用在WO2015/189302中实施例9所述的方法，在来自血液样品的CD127阳性免疫细胞，特别是树突细胞上进行。

细胞毒活性

在一个具体实施方案中，本文提供的抗体对人细胞，特别是表达CD127的人T细胞具有细胞毒性。表达CD127作为IL7受体链的人细胞(为所述抗体的靶标)主要是T淋巴细胞，更确切地说，是效应T淋巴细胞(包括幼稚和记忆T细胞)的亚群，但不是调节性T细胞(Treg)，尤其是不是静止的天然Treg。记忆T细胞是由抗原促发而产生的，主要由其功能特性决定，包括在重新激活时进行召回增殖并分化成次级效应细胞和记忆细胞的能力。类似地，靶向的TSLP受体(作为包括IL-7-Rα链的复合物)调节T辅助淋巴细胞、B细胞和树突细胞分化。

特别地，本文提供的具有“针对T细胞的细胞毒活性”或细胞毒性(细胞毒性抗体)的抗体通过杀死这些细胞而导致效应T细胞群耗尽，并因此在施用时减少这些细胞的数量。相反，所述抗体不会改变调节性T细胞的亚群或不会在很大程度上改变它，从而允许Treg细胞发挥其功能。在这种情况下，在一个特定的实施方案中，在施用所述抗体后，调节性T(Treg)相对效应T(Teff)细胞的比率升高。特别地，本文提供的抗体能够使所述比率提高约10％以上。特别是，Treg相对Teff的比率增加约20％。

特别地，细胞毒性抗体显示抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。或者，本文提供的抗体不具有ADCC特性。当特定的细胞毒性例如高于10％时，抗体ADCC潜力可被认为是正向的。ADCC性质可以在ADCC测定中评估，例如WO2015/189302的实施例10中描述的测试。当抗体是大鼠抗体时，ADCC测定中使用的效应细胞优选是大鼠的LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)细胞。当抗体是人源化的时，ADCC测定可特别在人NK细胞上进行。

对CD127阳性细胞具有细胞毒性和拮抗剂性质的本发明的抗体能够实现这些性质对效应T细胞(特别是记忆T细胞)的消耗的累积效应，从而能够实现更强的消耗(耗尽CD127+细胞池)和靶标T细胞数量的相应减少。

以上段落以及实施例描述了如何测试本文提供的抗体的相关所需功能特性。以下部分将详述抗体的各种结构特征和可能的修饰。根据这些指导，技术人员将能够获得具有以下结构特征以及所需的功能特性的抗体，特别是从具有所需功能特性的N13B2-hVL6抗体开始。

当用于对人受试者施用时，如本领域技术人员所知，期望抗体尽可能强地与人抗体同源。与人抗体的同一性程度测量为抗体序列中(特别是在抗体轻链或重链可变结构域的框架中)人残基的百分比，即，在抗体序列中(特别是在抗体轻链或重链可变结构域的框架中)，与最同源的已知人抗体(特别是在最同源的已知人抗体轻链或重链可变结构域的框架内)的相同功能位置的残基相同的残基百分比。该特性在本文中，如在文献中那样，通常表示为“抗体A(或其可变结构域的框架序列)具有xx％的人残基”，这意味着抗体A(或其可变结构域的框架序列)具有xx％的残基(其与最同源的已知人抗体(或其可变结构域的框架序列)的相同功能位置上的残基是相同的)。这种同一性程度可以通过技术人员已知的方法测量，特别是通过在WHO INN专家组公开会议期间(2015年4月)所阐明的国际免疫遗传学信息系统(IMGT)DomainGapAlign工具测量。优选地，本文提供的抗体与人抗体具有(特别是使用DomainGapAlign工具测定的)超过80％，甚至更优选至少84％，超过84％，甚至更优选至少85％的同一性。所述同一性程度可以仅针对轻链可变结构域确定或仅针对轻链确定(通过与人抗体轻链可变结构域或轻链比较)或针对轻链和重链一起测定，通过将各链与最同源的对应的人抗体链相比较，并报告同一性的累积百分比进行。特别地，根据本发明的抗体轻链可变结构域或抗体轻链包含至少80％，更特别84％，甚至更特别至少85％的人残基。本文提供的特定抗体轻链可变结构域分别具有84.2％(SEQ ID No：9)；85.3％(SEQ ID No：10和SEQ ID No：11)和86.3％(SEQ ID No：12)人残基。本文提供的优选的抗体重链可变结构域(SEQ ID No：7)具有90.8％的人残基。

本文提供的抗体轻链可变结构域可包含最多135个氨基酸，优选最多120个氨基酸，甚至更优选最多110或107个氨基酸。本文提供的抗体轻链可变结构域可包含至少80个，优选至少90个，甚至更优选至少100个或106个氨基酸。本文提供的抗体轻链可变结构域可包含80至135个，优选90至120个，甚至更优选105至110个氨基酸。

本文提供的抗体轻链可包含最多250个氨基酸，优选最多230个氨基酸，甚至更优选最多214或211个氨基酸。本文提供的抗体轻链可包含至少150个，优选至少190个，甚至更优选至少200或210个氨基酸。本文提供的抗体轻链可包含150至250个，优选190至230个，甚至更优选210至220个氨基酸。

本文还提供多肽，其是(i)本文提供的抗体的抗原结合片段，特别是包含以下或由以下组成的抗原结合片段：本文提供的抗体轻链或抗体轻链可变域的片段、本文提供的抗体重链可变结构域；和/或(ii)本文提供的抗体的抗体模拟分子。

抗原结合片段是如上文相关章节(第[44]至[47]段)中所定义的特异性结合CD127蛋白的多肽，并且包含N13B2-h3的至少三个CDR(由SEQ ID Nos：4至6的序列组成)，优选本文提供的包含所述CDR序列的轻链可变结构域(具有SEQ ID No：9至12)的片段。抗原结合片段可包含至少40个，优选至少50个，甚至更优选至少70或74个氨基酸。抗体结合片段可包含至多100个，优选至多90个，甚至更优选至多80个或74个氨基酸。抗原结合片段可包含40至100个，50至90个，优选60至100个，甚至更优选50至70个或60至80个氨基酸。本文提供的抗原结合片段可以特别地具有关于本文提供的抗体公开的任何合适的功能特性，特别是第[47]-[62]段中公开的特性。

因此，本文提供的分离的多肽可以由最多250个氨基酸的序列组成，特别是最多217个氨基酸，最多214个，最多211个，更特别是最多200个，最多175个，最多150个，最多135个，最多120个，最多107个，甚至更特别是最多100个，最多90个，最多80个，最多74个，最多70个，最多60个氨基酸组成。

抗体模拟分子是具有与抗体相似性质的多肽，特别是具有相似的与CD127结合的特性。抗体模拟物可以是例如亲和体(affibody)分子、亲和素(affilin)、黏合素(affimer)、抗运载蛋白(anticalin)、单抗体等。本文提供的抗体模拟分子可以特别地具有关于本文提供的抗体公开的任何合适的功能特性，特别是第[47]-[62]段中公开的特性。

特别地，根据本发明的抗体是人源化抗体，其包含衍生自人恒定结构域的恒定结构域。特别地，抗体轻链恒定结构域衍生自人κ轻链恒定结构域，和/或抗体重链恒定结构域衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，特别是衍生自人IgG4重链恒定区。“衍生自”意指由氨基酸取代引起的一些点突变，例如IgG4(S228P)或IgG1(E333A)。本领域技术人员熟知的这些突变通常会改变一些母链性质。例如，与亲本抗体相比，这些突变导致较低的免疫原性或消除Fcγ受体结合或避免单体抗体的二聚化或稳定二聚化使抗体更好地用于人治疗用途。源自亲本重链和轻链恒定结构域的本发明的抗体包含SEQ ID NO：26，SEQ IDNo：27或SEQ ID No：28中所示的序列或其片段，或者由SEQ ID NO：26，SEQ ID No：27或SEQID No：28所示的序列或其片段组成。更具体地，抗体轻链恒定结构域由SEQ ID No：27所示的序列组成。特别地，抗体重链恒定结构域包含SEQ ID No：26所示的序列或其片段或由其组成。更具体地，抗体重链恒定结构域由SEQ ID No：26所示的序列组成。

本文还提供了编码本发明多肽或本文提供的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。特别地，根据本文提供的任何定义，所述核酸分子编码本文提供的抗体的轻链可变结构域或轻链，与编码本文提供的抗体重链的分离的核酸分子组合。特别地，本文提供了编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含选自SEQ ID No：9、SEQ ID No：10、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12的序列或由其组成。特别地，根据本发明的分离的核酸分子包含选自SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18的序列或由其组成。特别地，所述分离的核酸分子与编码重链(包含由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示序列组成的三个CDR)，特别是编码由SEQ ID No：7所示序列组成的重链可变结构域的分离的核酸分子组合提供，更特别地，分离的核酸分子由SEQ ID No：13所示的序列组成。在优选的实施方案中，提供了编码抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子的组合，所述组合包含第一分离的核酸分子和第二分离的核酸分子或由第一分离的核酸分子和第二分离的核酸分子组成，所述第一分离的核酸分子包含选自SEQ ID No：15，SEQ ID No：16，SEQ ID No：17和SEQ IDNo：18的序列或由其组成；所述第二分离的核酸分子包含SEQ ID No：13的序列或由SEQ IDNo：13的序列组成。在另一个优选的实施方案中，提供了编码抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子的组合，所述组合包含第一分离的核酸分子和第二分离的核酸分子或由第一分离的核酸分子和第二分离的核酸分子组成，所述第一分离的核酸分子包含序列SEQ ID No：18或由序列SEQ ID No：18组成；所述第二分离的核酸分子包含SEQ ID No：13的序列或由SEQ ID No：13的序列组成。

本文还提供了编码完整轻链的多肽序列的多核苷酸，包括可变结构域和恒定结构域，即，特别是编码SEQ ID No：9至12的序列之一和SEQ ID No：27或28的序列的多核苷酸，特别是包含与SEQ ID No：30或SEQ ID No：31连接的序列SEQ ID No：15至18之一或由其组成的多核苷酸。特别地，这些多核苷酸与编码完整重链多肽序列的多核苷酸组合提供，包括可变结构域和恒定结构域，即特别是编码SEQ ID No：7和SEQ ID No：26的序列的多核苷酸，特别是包含与SEQ ID No：29连接的SEQ ID No：13或由其组成的多核苷酸。

特别地，本文提供的分离的核酸分子除了编码本文提供的抗体的轻链和可选的重链的序列之外，还可以在编码所述抗体链的序列的上游有利地包含编码信号肽的序列，当在生产细胞中表达时，所述信号肽允许所述链分泌。它们还可以包含一种以上编码一种以上标记肽的序列，用于检测和/或促进所述链的纯化。

本文还提供了用于克隆和/或表达本文提供的核酸分子的载体。特别地，所述提供的载体是适于在哺乳动物细胞中克隆和/或表达的质粒，其包含用于转录和表达的调节序列。因此，本文提供了包含如上公开的多核苷酸(特别是如段落[76]至[78]中公开的多核苷酸)的载体。

此外，本文提供了与如上所述的核酸分子重组的细胞或细胞系，特别是载体，尤其是哺乳动物或禽细胞或细胞系，特别是如图2中详述的。例如中国仓鼠卵巢细胞，经基因修饰以减少全面岩藻糖基化。实际上，缺乏核心岩藻糖基化的抗体显示出显著增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(von Horsten等，2010)。另一个例子是EB66细胞系，其天然具有低岩藻糖基化特性(Olivier等，2010)。抗体也可以在用如上所述的核酸辅助分子瞬时转染的细胞(特别是载体，特别是COS细胞)中产生，特别是如实施例2中详述的。

本文还提供了用于产生本文提供的多肽(特别是抗体轻链和/或单克隆抗体)的方法，所述方法包括以下步骤：在能够回收所述多肽的条件下，在包含编码所述多肽的核酸分子的细胞中表达所述多肽、抗体轻链或单克隆抗体(或单克隆抗体的轻链和可选重链)；和回收所述多肽。特别地，抗体或其片段在具有低岩藻糖基化特性的细胞(例如EB66禽细胞)中制备。

本文还提供了药物组合物，其包含如上定义的多肽(特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链)和/或抗体或其抗原结合片段或抗体模拟分子和/或分离的核酸分子，和药物载体。所述药物组合物可任选地进一步包含不同的活性成分。所述组合物特别以适于全身施药或局部施药的制剂提供。特别地，本文提供了适合于局部施药的组合物，特别是用于肌内或皮下注射的组合物，用于使用诸如自动注射器(或注射器笔)的装置进行注射，用于透皮施药，特别是使用透皮贴剂，用于经粘膜施药，特别是鼻内或直肠施药。特别地，本文提供了适合于胃肠(GI)道局部施药的组合物，特别是通过口服施药，特别是用于治疗肠疾病如克罗恩病或UC，特别是适于给药至结肠的组合物。特别地，本文提供了适合全身施药的组合物，特别是用于肠胃外或肠内施药，特别是用于静脉内注射或口服施药。如技术人员所知，肠内施药可以是胃肠道的局部施药，或全身施药。无论本文的何处提供此类药物组合物或其用途，必须理解还可以提供给药载体及其应用，例如，当明确提供可注射药物组合物时，必须理解的是，组合物提供在装置中或与允许施用和/或注射所述组合物的装置(“给药装置”)组合提供。给药装置的实例包括但不限于自动注射器，特别是多腔室注射器和透皮贴剂。因此，本文提供了包含所述组合物的给药装置，特别是自动注射器、泵或透皮贴剂，以及如下提供的与药物组合物相关的其用途。本文还提供了试剂盒，其包含药物组合物和含有所述组合物和/或适合于所述组合物施药的局部给药装置(特别是皮下、肠溶或口腔给药装置，特别是载药注射器或无针头装置)，以及如下提供的与药物组合物相关的其用途。药物组合物以任何合适于施药的形式提供，包括作为溶液，特别是无菌水溶液，作为悬浮液，作为固体，特别是冻干固体，特别是用于吸附(或被吸附在)贴剂上和/或用于再悬浮并作为溶液施药，作为丸剂、片剂或其它适于口服施药的固体形式施药，特别是具有延迟释放或延长释放，作为纳米颗粒，例如，包含纳米颗粒的组合物，其中多肽吸附在表面上或所述纳米颗粒内等。药物组合物的形式和给药装置的可选性质可适合于全身或局部给药本文提供的活性成分，即，可以适合活性成分到达活跃状态的靶细胞、组织、器官。特别地，药物组合物的形式和给药装置的可选性质可适合于给药至胃肠道，特别是结肠。据称药物组合物包含药学上可接受的载体；然而，当药物使用不需要这样的载体时(例如如果产品作为纯冻干固体施药)，也提供不含载体的药物组合物，用于类似的用途和目的。特别地，施药根据本文所述的任何合适的方式进行，用于肠释放，尤其是肠延迟释放。

本文还提供了包含如上定义的作为活性成分的多肽(特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链)和/或抗体(特别是单克隆抗体)、其抗原结合片段或抗体模拟分子的组合物，或者如上定义的药物组合物，当其施用于人类患者时，其制剂适合于控制人CD127阳性细胞(特别是人CD127阳性效应细胞，特别是CD127+记忆T细胞，特别是CD127+和CD8+的记忆T细胞，或者CD127+和CD4+的细胞)存活或扩增。特别地，所述包含抗体(或上述其他试剂)作为活性成分的组合物是适于在施用于患者时控制树突细胞分化和/或成熟的制剂。

本发明人惊奇地发现，单次注射本文提供的抗体允许持续作用，并且在单次注射所提供的抗体治疗的动物中，在所述单次注射后长达14个月(甚至长达18个月)，炎症反应仍有显著降低。优选地，多肽(特别是抗体轻链，更特别是本文提供的抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子)的施药(优选单次施药)对效应记忆T细胞具有快速和/或长期作用。优选在施用所述多肽、抗体链或抗体的一周内，更优选在48小时内，甚至更优选一天内观察到快速作用。优选在最近(并且优选地，单次)施用所述多肽、抗体链或抗体后至少12个月，更优选至少14个月观察到长效作用。这种作用特别是可逆的(特别是通过新的疫苗接种可以恢复T细胞应答)。这种作用优选是抗原和/或反应特异性的，并且优选与可测量的淋巴细胞减少无关(即，受试者通过常规方法测量的淋巴细胞的总数量没有减少)。这种作用可以另外定义为记忆T细胞的克隆缺失，或为免疫T记忆的可逆的抗原特异性缺失。这种施药对效应记忆T细胞的影响可以通过比较：随后用本文提供的多肽、抗体链或单克隆抗体治疗的接种疫苗的受试者(特别是狒狒)与未经治疗的接种疫苗的受试者中响应抗原(例如结核菌素(tuberculine))的IFN-γ分泌细胞的水平(通过ELISPOT测量)来评估：如果在治疗后相关时间点，经治疗的受试者中抗原特异性T细胞的测量水平显著降低(优选低至少10％，更优选低至少40％)，则观察到效果。这种效果还可以通过另外评估对给定抗原的炎症反应来测量，例如响应局部施用的抗原的局部(特别是皮肤)炎症反应。或者，可以使用MHC四聚体测定。测试这种效果的方法是本领域技术人员已知的，并且在本文中，特别在实施例6中说明

此外，本发明人惊奇地发现，本文提供的抗体可以具有快速作用，特别是对T细胞活化，特别是对T细胞释放细胞因子，特别是在炎性组织中。特别是在施用抗体的一周内，优选在48小时内，甚至更优选在24小时内观察到这种效果，特别是观察到IFNγ产生(或释放)的减少。特别是在局部观察到这种作用，即在抗体施药部位或在给药部位观察到。特别地，本文提供的抗体特别是对T细胞释放细胞因子具有快速作用，特别是快速局部作用，特别是在施用后24小时内观察到效果。当施用抗体用于局部给药而非直接施用于预期给药的部位时，该抗体在从给药开始，而非从施用开始的相同期间内在给药部位具有如上所述的快速效果，如技术人员所知，该效果从施用开始可能会或可能不会延迟。

本文提供的组合物可以进一步包含具有治疗性免疫调节剂作用(特别是对涉及过敏或自身免疫的细胞)的另外的化合物。为了说明的目的，感兴趣的示例性免疫调节剂是靶向T细胞的其他单克隆抗体，例如抗CD3、抗ICOS或抗CD28抗体或重组蛋白或靶向辅助细胞(例如CTLA4Ig)的抗体，或抗CD40抗体。

本文提供的多肽、抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子、分离的核酸分子、细胞和/或组合物可以以组合产品提供，该组合产品包含其他产品，特别是具有上述治疗性免疫调节剂作用的药剂，特别是用于同时、分开或依次施药。本文提供了组合产品，其包含如上定义的多肽(特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链)和/或抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子，和/或分离的核酸分子、载体、细胞或细胞系，和/或药物组合物，并且该组合产品可选地还包含：

-具有治疗性免疫调节剂作用的药剂，特别是用于与例如本文提供的抗体组合施用，特别是其中所述施用是时间上同时的或分开的，和/或其中所述施用通过相同或不同的途径；和/或

-用于施用产品的装置。

如上定义的多肽，特别是抗体轻链和/或抗体，特别是单克隆抗体和/或抗原结合片段或抗体模拟分子和/或核酸、载体、细胞或细胞系和/或药物组合物或组合物特别提供用于人类患者，用于治疗受免疫应答(尤其是记忆T细胞应答)影响的病况或病理状况。这些病况或病症包括：由移植排斥、自身免疫疾病、过敏性疾病、呼吸系统疾病、慢性病毒感染、慢性炎性疾病(特别是慢性肠道炎症性疾病)、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病(包括由实体瘤引起的疾病)引起的那些病症，其中这些病症与CD127阳性细胞以及IL-7信号通路相关，特别是其中必须避免树突细胞成熟增加的情况下。因此，发明人表明可以考虑使用所述药剂来治疗特定的过敏性皮肤病、炎症性肠病(IBD)，特别是克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)，或原发性干燥综合征(PrimarySyndrome)，或系统性红斑狼疮，或系统性硬化症或多发性硬化症，或I型糖尿病，或急性淋巴细胞白血病(如T-ALL)，或霍奇金淋巴瘤，或与CD127+细胞相关的乳腺癌，肾癌，膀胱癌，肺癌，胰腺癌，或用于治疗T细胞皮肤淋巴瘤，如Sezary淋巴瘤，或用于治疗急性淋巴母细胞样白血病(其中IL-7-R/TSLP通路具有功能获得性突变)，或用于治疗移植排斥和/或需要移植和/或即将进行移植和/或已接受移植的患者。在优选的实施方案中，考虑治疗炎症性肠病(IBD)，特别是克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)，或原发性干燥综合征，或系统性红斑狼疮，或系统性硬化症或多发性硬化症，或I型糖尿病。特别地，本发明涉及根据本发明的多肽，或抗体或其抗原结合片段或抗体模拟分子，或分离的核酸分子，或药物组合物用作药物，更特别地，用于预防或治疗器官或组织移植排斥或选自以下的疾病：自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎，系统性硬化症，多发性硬化症，I型糖尿病，自身免疫性甲状腺炎，系统性红斑狼疮，原发性干燥综合征和炎性疾病，特别是炎症性肠病(IBD)，更特别地，克罗恩病和溃疡性结肠炎和脑脊髓炎和过敏性疾病，以及癌症疾病和与移植和呼吸系统疾病相关的疾病，优选通过局部施药。

本文提供了多肽、抗体轻链或抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子在治疗病理状况中的用途，所述病理状况涉及人类患者中免疫应答的改变导致显性致耐受性状态，或者相反地，缺乏耐受性，在所述病理状况中需要控制免疫应答水平以及破坏恶性CD127阳性细胞。

“治疗”或“治疗性治疗”是指所进行的施用步骤导致有此需要的患有与IL-7通路相关(即，涉及CD127阳性细胞的活化或增殖)的病症的动物或人类患者的临床状况改善。这种治疗旨在通过消除或减轻与IL-7通路相关(即，涉及CD127阳性细胞的活化或增殖)的病症相关的症状，来改善动物或人类患者的临床状态。优选地，本文提供的治疗能够恢复健康。优选地，所述治疗不因免疫细胞(特别是树突细胞)的成熟增加而具有不希望的负面影响。

在治疗患者的特定方面，提供用于和/或适合用于消除CD127阳性细胞同时保留CD127阴性细胞的多肽、抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、多核苷酸、细胞或细胞系或组合物。

在治疗患者的特定方面，提供了多肽、抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、多核苷酸、细胞或细胞系或组合物的应用，用于和/或适合用于预防CD127阳性细胞分化和/或扩增和/或成熟，特别是由IL-7和/或TSLP诱导的分化、扩增或成熟，而对CD127阴性细胞几乎没有或没有直接作用。

在治疗患者的特定方面，提供了多肽、抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、多核苷酸、细胞或细胞系或组合物的应用，用于和/或适合用于通过干扰IL-7诱导的信号传导来消除/中和幼稚和记忆T细胞，同时保留Treg细胞。

在治疗患者的特定方面，提供了多肽、抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、多核苷酸、细胞或细胞系或组合物的应用，用于和/或适合用于通过抗体的细胞毒性作用(可能但不限于通过ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和可选地通过CDC(补体依赖性细胞毒性))，来消耗淋巴细胞亚群或表达CD127的其他细胞群(包括正常或病理性T和B淋巴细胞、NK细胞、树突细胞和其他细胞类型，包括上皮细胞)。

本文还提供了如上定义的多肽(特别是抗体轻链)和/或抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、多核苷酸、细胞或细胞系或组合物，用作有需要的患者的组合或附加治疗方案中的活性成分。还提供了如上定义的多肽(特别是抗体轻链)和/或抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、多核苷酸、细胞或细胞系或组合物作为有需要的患者的组合或附加治疗方案中的治疗活性成分的应用。

在上述方面，预期的用途也适用于上文提供的核酸、载体、细胞、细胞系、组合物和药物组合物。

本文提供了上述用于和/或适用于以下病症的装置和产品：例如由移植排斥、自身免疫疾病、过敏性疾病、呼吸系统疾病、慢性病毒感染、慢性炎性疾病(特别是慢性肠道炎症性疾病)、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病(包括由实体瘤引起的疾病)引起的病症，其中这些病症与CD127阳性细胞以及IL-7信号通路相关，特别是其中必须避免树突细胞成熟增加的情况下。因此，所述装置和产品特别用于或适用于治疗特定的过敏性皮肤病、炎症性肠病(IBD)，特别是克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)，或急性淋巴细胞白血病(如T-ALL)，或霍奇金淋巴瘤，或与CD127+细胞相关的乳腺癌，肾癌，膀胱癌，肺癌，胰腺癌，或用于治疗T细胞皮肤淋巴瘤，如Sezary淋巴瘤，或用于治疗急性淋巴母细胞样白血病(其中IL-7-R/TSLP通路具有功能获得性突变)，或用于治疗移植排斥和/或需要移植和/或即将进行移植和/或已接受移植的患者。

特别地，本文提供了多肽(特别是抗体轻链)和/或抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、核酸、细胞、细胞系或组合物在治疗人患者中由以下引起的病况和/或病症中的应用：移植排斥、自身免疫疾病、过敏性疾病、呼吸系统疾病、慢性病毒感染、慢性炎性疾病(特别是慢性肠道炎症性疾病)、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病，包括由实体瘤引起的疾病，其中这些病症与CD127阳性细胞以及IL-7信号通路相关，特别是其中必须避免树突细胞成熟增加的情况下。因此，所述产品特别用于治疗特定的过敏性皮肤病、炎症性肠病(IBD)，特别是克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)，或急性淋巴细胞白血病(如T-ALL)，或霍奇金淋巴瘤，或与CD127+细胞相关的乳腺癌，肾癌，膀胱癌，肺癌，胰腺癌，或用于治疗T细胞皮肤淋巴瘤，如Sezary淋巴瘤，或用于治疗急性淋巴母细胞样白血病(其中IL-7-R/TSLP通路具有功能获得性突变)，或用于治疗移植排斥和/或需要移植和/或即将进行移植和/或已接受移植的患者、自身免疫疾病或过敏性疾病，或用于治疗白血病，如急性淋巴细胞白血病，或用于治疗淋巴瘤，或用于治疗癌症疾病，或用于治疗慢性病毒感染，或用于治疗炎性疾病，特别是IBD，特别是CD或UC，或用于治疗呼吸系统疾病，或用于预防和/或治疗与移植相关的症状。

特别地，本文提供了一种治疗方法，其包括在人患者中施用如上定义的多肽(特别是抗体轻链可变结构域或抗体轻链)和/或抗体、抗原结合片段、抗体模拟分子、或分离的核酸分子、细胞和/或细胞系或组合物和/或药物组合物，以治疗由以下引起的病况和/或病症：移植排斥、自身免疫疾病、过敏性疾病、呼吸系统疾病、慢性病毒感染、慢性炎性疾病(特别是慢性肠道炎症性疾病)、淋巴瘤、白血病或其他癌症疾病，包括由实体瘤引起的疾病，其中这些病症与CD127阳性细胞以及IL-7信号通路相关，特别是在必须避免树突细胞成熟增加的情况下。因此，所述方法特别用于治疗特定的过敏性皮肤病、炎症性肠病(IBD)，特别是克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)，或急性淋巴细胞白血病(如T-ALL)，或霍奇金淋巴瘤，或与CD127+细胞相关的乳腺癌，肾癌，膀胱癌，肺癌，胰腺癌，或用于治疗T细胞皮肤淋巴瘤，如Sezary淋巴瘤，或用于治疗急性淋巴母细胞样白血病(其中IL-7-R/TSLP通路具有功能获得性突变)，或用于治疗移植排斥和/或需要移植和/或即将进行移植和/或已进行移植的患者、自身免疫疾病或过敏性疾病，或用于治疗白血病，如急性淋巴细胞白血病，或用于治疗淋巴瘤，或用于治疗癌症疾病，或用于治疗慢性病毒感染，或用于治疗炎性疾病，特别是IBD，特别是CD或UC，或用于治疗呼吸系统疾病，或用于预防和/或治疗与移植相关的症状。

本发明人进一步表明，在患有UC的患者中，IL7、CD127和/或TSLPR mRNA的水平允许预测对常规免疫抑制治疗的反应：反应者(即，对治疗有明显症状减轻的患者)具有比非反应者更低水平的IL-7和CD127以及更高水平的TLSPR。因此，本文提供了体内方法，用于评估患有溃疡性结肠炎(UC)的患者(特别是人类患者)中对免疫抑制治疗的反应的可能性，所述方法包括：在从所述患者获得的样品中测量IL7、CD127和/或TLSPR mRNA或蛋白质的水平，以及得出结论：当与参考组相比，测量的IL7和/或CD127水平低于所述组中的平均水平时，和/或测量的TSLPR水平高于所述组中的平均水平时，反应的可能性增加。进行所需测量的方法是本领域技术人员已知的，并且可涉及使用针对CD127的抗体，特别是用于测量CD127的蛋白质表达水平。上文提供的多肽，特别是抗体轻链和/或单克隆抗体特别用于此类方法，特别是应用这样的多肽、抗体轻链和/或单克隆抗体提供这些方法。

特别地，本文提供了从抗体、其抗原结合片段和抗体模拟分子选择化合物的方法，该方法包括以下步骤中的至少一个：

i.测试化合物与CD127，特别是与人CD127的结合，特别是与来自CD127的结构域D1和/或CD127的结构域D2的2b位点的表位序列的结合。

来自结构域D1和/或结构域D2的2b位点的表位序列可以是本文描述的任何一种表位序列，特别是如段落[016]中所公开的，特别是选自SEQ ID No：32、SEQ ID No：33、SEQ IDNo：34、SEQ ID No：35、SEQ ID No：36或SEQ ID No：96，特别是SEQ ID No 34，SEQ ID No：35和SEQ ID No：96的表位序列。在本发明的一个具体实施方案中，结合试验可包括测试化合物与选自SEQ ID No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96的表位序列的结合，以及测试该化合物与选自SEQ ID No：42和SEQ ID No：43的表位序列的结合。化合物的结合能力可以通过本领域已知的任何一种方法测试，特别是技术人员已知的并且特别说明于本文的图3、实施例3和实施例4以及WO 2015/189302的第14页、图3、4和6及各自的说明和实施例1、2、6、7中的Blitz方法，和/或通过本文公开的实施例10的方法；和/或

ii.在化合物存在下测试对IL-7诱导的IL7-R信号传导的抑制，特别是对STAT5磷酸化的抑制。在化合物存在下，IL7诱导的抑制作用可以通过本文实施例8和/或实施例11中公开的方法测试；和/或

iii.在化合物存在下测试磷脂酰肌醇3-激酶的活化。可以根据本文实施例8和/或实施例11中公开的方法，测试磷脂酰肌醇3-激酶在化合物存在下的活化；和/或

iv.在化合物存在下测试ERK信号通路的活化。可以根据本文实施例8和/或实施例11中公开的方法，测试在化合物存在下ERK信号通路的活化；

v.测试化合物与CD127的结构域D2的2b位点的至少一个β折叠结合的能力，特别是至少与2b位点的第三β折叠(定义为SEQ ID No：34的核酸)和/或与至少一种选自SEQ IDNo：35和SEQ ID No：96的氨基酸序列结合的能力。化合物的结合能力可以通过本领域已知的任何一种方法测试，特别是技术人员已知的并且特别说明于本文的图3、实施例3和实施例4以及WO 2015/189302的第14页、图3、4和6及各自的说明和实施例1、2、6、7中的Blitz方法，和/或通过本文公开的实施例10的方法。

该方法还可以包括以下可选步骤中的任何一个，或者以下可选步骤中的至少一个：

vi.在化合物存在下测试CD127(特别是人CD127)与细胞因子受体的γc共有链的结合。在化合物存在下CD127与细胞因子受体的γc共有链的结合可以特别地通过共免疫沉淀方法来评估，所述共免疫沉淀方法是本领域技术人员公知的用于测试蛋白质相互作用的方法并说明于WO2015/189302的实施例21中。特别地，可以在存在或不存在测试化合物的情况下孵育细胞，然后在允许保留蛋白质复合物的条件下溶解细胞，并且可以对得到的溶解物(lysate)进行抗CD127免疫沉淀，并且通过使用抗-γc抗体的蛋白质印迹评估含有CD127的免疫沉淀复合物中γc的存在(相反，可以使用抗-γc抗体进行免疫沉淀，并且使用抗-CD127抗体评估CD127的存在)；和/或

vii.在化合物存在下测试CD127(特别是人CD127)的内化，和/或IL7诱导的CD127的内化。本文在段落[51]至[53]中定义的CD 127的内化可以如WO2015/189302中(特别是第19-20页的段落[59]-[63]和图16及实施例5)所述进一步定义和/或测试；和/或

viii.在化合物存在下测试由TSLP诱导的树突细胞的成熟。由TSLP诱导的树突细胞的成熟在本文的第[47]和[48]段中定义。测量这种效果的方法是本领域技术人员已知的，并且特别公开于WO2015/189302的第16-17页和实施例9中。特别地，测量这种效果的方法包括测量用化合物刺激的细胞和用单独的TSLP刺激的细胞(无化合物)之间的CD40表达。

在该方法的一个具体实施方案中，选择特异性结合CD127(特别是人CD127)的化合物，该化合物是IL7诱导的IL7-R信号传导的拮抗剂，其不诱导磷脂酰肌醇3-激酶和/或ERK信号通路的活化。在该方法的一个更具体的实施方案中，选择特异性结合CD127(特别是人CD127)的化合物，该化合物是IL7诱导的IL7-R信号传导的拮抗剂，并且不诱导磷脂酰肌醇3-激酶的活化并且不诱导ERK信号通路的活化。

特别地，本文提供了产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，所述抗体或其抗原结合片段针对CD127产生，可能来自非人动物(例如可来自比利时Louvain大学的LOU/CIgk1a种系大鼠)的免疫。免疫可以使用SEQ ID No：22的氨基酸序列的片段作为免疫原进行，特别是使用包含本文定义的表位序列的SEQ ID No：22的片段，特别是SEQ ID No：35和/或SEQ ID No：96作为免疫原进行。通过将脾单核细胞与LOU大鼠免疫细胞瘤IR983F融合可以获得杂交瘤。可以根据分泌的单克隆抗体结合选自SEQ ID No：22、SEQ ID No：35和SEQID No：96，特别是SEQ ID No：35和/或SEQ ID No：96的氨基酸序列的能力筛选杂交瘤。因此，本发明还包括免疫原化合物，所述免疫原化合物是SEQ ID No：22的氨基酸序列的片段，特别是包含至少一个选自SEQ ID No：32、SEQ ID No：33、SEQ ID No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96，特别是SEQ No：34、SEQ ID No：35和SEQ ID No：96，更特别是SEQ ID No：96的氨基酸序列的片段。在本发明的一个具体实施方案中，免疫原化合物是线性肽，特别是包含SEQ ID No：96的氨基酸序列的线性肽，更特别是包含SEQ ID No：35的氨基酸序列的线性肽，或由SEQ ID No：35的氨基酸序列组成的线性肽，优选由SEQ ID No：35的氨基酸序列组成的线性肽。

附图说明

图1.本文提供的抗体的氨基酸序列

图A.重链(VH)的序列。CDR以粗体字符表示。

图B.源自N13B2的人源化轻链(LH)的序列。CDR以粗体字符表示。N13B2-VL3在48和87位(下划线)包含N13B2-h3的原始框架残基；N13B2-VL4-V48L和N13B2-VL5-F87Y包含相应的人源化框架残基，N13B2-VL6-V48L-F87Y包含两个人源化框架残基。

图2.抗体的产生-稳定转染

根据常规方法，使用市售的无血清培养基在CHO-M细胞中对每种所述抗体进行三个不同的生产批次，并且在此报道通过ELISA测定法测量的典型实验中获得的滴度。横轴表示培养时间，以天计，而纵轴表示获得的抗体滴度，单位为μg/mL。

图3.与CD127结合

根据实施例3中详述的方法，通过ELISA测定所示抗体与重组CD127的结合。横轴表示抗体浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm处的光密度，任意单位。

图4.STAT5磷酸化的抑制

根据实施例5中详述的方法，通过细胞荧光测定法测定所示抗体对STAT5磷酸化的抑制。在图A(横轴：抗体浓度，单位ng/mL)中报告了用pSTAT5抗体染色的CD3+细胞的百分比。在图B中报告了CD3+细胞的pSTAT5信号的平均荧光强度(以任意单位)。

图5.对记忆T细胞的作用

图A.N13B2注射后狒狒的DTH反应(红斑曲线的曲线下面积)。

在施用N13B2(n＝7只狒狒)或赋形剂(n＝4只狒狒)后，在接种疫苗的狒狒中，通过根据实施例6中详述的方法测量皮肤反应，测定响应于结核菌素攻击的迟发型超敏感性。纵轴表示任意单位的红斑曲线下面积。在施用N13B2或赋形剂之前或之后(在第0天施用)，报告在给定时间点进行的皮内反应的值，在水平轴上以天数表示。“BCG后”对应于在新接种疫苗BCG后进行的皮肤反应结果(nd＝未测定)。

在第150和180天以及“BCG后”未测定赋形剂对照组(nd)。

图B.

注射人源化N13B2后，狒狒的DTH反应(红斑曲线的曲线下面积)。

在施用人源化N13B2(AA892BB、32257、V915GQ、33874)或缓冲液后，通过实施例6中详述的方法测量皮肤反应，在接种疫苗的狒狒中测定响应于结核菌素攻击的迟发型超敏感性。纵轴表示任意单位的红斑曲线下面积。报告在施用人源化N13B2或缓冲液之前(“IDR1”，每只狒狒从左边开始的第一个长条)，施用人源化N13B2或缓冲液后4小时(“IDR2”，从左边开始的第二个长条)，施用人源化N13B2或缓冲液后一个月、两个月、三个月(“IDR3-5”，从左边开始的第3至5个长条)和四个月(“IDR6”，从左边开始的第6个长条，仅对于V915GA而言)之后以及在新接种疫苗BCG之后(“IDR7”，从左边开始的最后一个长条)进行的皮内反应的值。

图C.

在用结核菌素攻击并用人源化N13B2处理的接种BCG的狒狒的血液PBMC上进行的IFNγELISPOT。

根据实施例6中详述的方法，通过IFNγELISPOT测定，在施用人源化N13B2(AA892BB、32257、V915GQ、33874)或缓冲液后，在接种疫苗的狒狒中测定结核菌素攻击后的AG特异性T细胞频率。纵轴表示100000个细胞的斑点频率(spot frequency)。在施用人源化N13B2或缓冲液之前(从每一组长条的左边开始的第一个长条)，施用人源化N13B2或缓冲液4天后(“IDR2”)，施用人源化N13B2或缓冲液后1个月、2个月、3个月(“IDR3-5”)和4个月(“IDR6”，仅对于V915GA而言)后以及新接种疫苗BCG后(从左边开始的最后一个长条，虚线)，报告无抗原(W/o Ag，左边长条)或有结核菌素抗原存在下(右边长条)的Elispot的值。

图6.IBD患者中IL-7、CD127和TSLP的表达

根据实施例7中详述的方法，在以下样本中测量IL-7、CD127(可溶形式的IL-7Rα)和TSLP(全长)的mRNA表达水平：来自健康对照组(非IBD对照组)的组织样本、来自对抗炎治疗没有反应(或不再有反应)的活动性溃疡性结肠炎(UC)患者的健康和患病(炎症)结肠活检样本、来自患有静息疾病(即在采样时治愈或缓解)的UC患者(反应者)的样本。纵轴表示相对荧光单位。绘制给定组中每个样本的值，水平条表示组的平均值，误差条表示标准偏差。“*”表示p值＜0.05，“**”表示p值＜0.01；“****”表示p值＜0.0001。

图7.CD127信号通路的抑制

如实施例8中详述的，通过蛋白质印迹评估各种抗人CD127抗体对信号通路活化的影响。该图代表来自6个不同供体的代表性结果。“无IL-7”对应于未被IL-7刺激的样品。“C”对应于对照样品(在不存在抗CD127抗体的情况下用IL-7刺激)。印迹左侧的水平线代表所示分子量标记的迁移。印迹右侧的箭头表示酪氨酸磷酸化的STAT5、酪氨酸199-磷酸化的PI3-k p55、磷酸化的Akt、磷酸化的ERK 1/2，以及作为加载参照的GAPDH的迁移。

图8.抑制从UC活检组织中释放的T细胞细胞因子

图A.通过离体生长的UC活检组织样品产生的IFNγ。图B.通过离体生长的CD活检组织样品产生的IFNγ。

在两个图中，如实施例9中详述的那样获得和处理样品。每个符号代表用IgG(“对照Ab”)或用抗CD127抗体(“aIL-7Rα”)培养的来自患者的一个样品。连接的符号是来自同一患者的成对样品。**使用Wilcoxon匹配对测试，p＜0.01。抗IL7RαmAb显著抑制IFNγ的产生。对于CD活检组织样品，观察到类似的结果。

图9.抗人IL-7RαmAb和激动剂信号

如实施例11中详述的，通过蛋白质印迹评估各种抗人CD127抗体对STAT5、PI3K和ERK信号通路的活化的影响。图9A显示了在不存在外源重组人IL7的情况下，七个不同供体细胞中的一种。图A：“培养基”对应于没有任何抗人CD127抗体的样品。“无IL7”意味着四个样品未被IL-7刺激。用10μg/mL的一种抗IL-7RαmAb(N13B2-hVL6或MD707-13-G4或1A11-G1)预处理三个样品。

图B.将pI3K和pERK的定量校正为GAPDH表达并归一化至培养基对照条件(n＝7个不同的供体)。纵轴表示以对照组为标准的归一化表达情况。绘制单个组中的每个样品的值，水平条表示组的平均值，误差条表示标准偏差。

图10.抗人IL7-RαmAb对IL7通路活化的影响

将磷酸-STAT5信号的定量校正为GADPH表达并归一化至培养基对照条件。用10μg/mL的一种抗-IL7-RαmAb(N13B2-hVL6或MD707-13-G4或1A11)预处理PBMC，然后在37℃下与5ng/mL的人IL7一起孵育10分钟。将磷酸-STAT5信号的定量校正为GAPDH表达(n＝7个不同的供体)。虚线代表使用单独的培养基而不处理的情况。绘制单个组中的每个样品的值，水平条表示组的平均值，误差条表示标准偏差。“*”表示指定组间的p值＜0.05。

图11.双激动剂/拮抗剂抗IL7-RαmAb诱导转录修饰

对在以下条件下孵育3.5小时的人PBMC(n＝7)的RNA序列进行分析：(1)5ng/ml的人IL7，(2)无IL7，(3、4、5)5ng/mL的人IL7和不同的抗人IL7-RαmAb((3)：10μg/mL的N13B2-hVL6；(4)：10μg/mL的MD707-13-Ig4；(5)：10μg/mL的1A11)。

图A.在IL7刺激和对照条件之间93个最差异表达的基因(错误发现率(FDR)5％，倍数变化(FD)＞2)的表达的热图。

图B.在IL7刺激的、对照，以及IL7和抗人IL7-RαmAb的条件下，三个IL7诱导的簇的中值分布的定量。

图C.用不同抗人IL-7RαmAb(10μg/mL的N13B2-hVL6、10μg/mL的MD707-13-Ig4#1或10μg/mL的1A11)在没有IL-7的情况下孵育3.5小时的人PBMC(n＝7)的RNA序列分析的维恩图(Venn图)。比较抗人IL-7RαmAb和培养基对照条件的481个差异表达基因(FDR 5％，FC＞1.5)的维恩图。圆的大小与每个类别的基因数成比例。

实施例

实施例1.轻链的人源化

除非另有说明，否则在本文的所有实验中使用以下重链，N13B2人源化_VH，核苷酸序列(SEQ ID No：13)：

N13B2人源化_VH，氨基酸序列(SEQ ID No：7)：参见图1A

以下优化的核苷酸序列用于产生抗体轻链(其氨基酸序列在图1B中提供)：

N13B2-h3(SEQ ID No：14)：

N13B2hVL3(SEQ ID No：15)：

N13B2hVL4(SEQ ID No：16)：

N13B2hVL5(SEQ ID No：17)：

N13B2hVL6(SEQ ID No：18)：

通过基因合成获得每个VL序列，将其插入具有BsiWI 5′和3′端的克隆载体(pUC57)中，并在ATG之前添加Kozak序列(GCCACC)。作为表达载体，使用pFuseCLIg-hk表达质粒(Invivogen)，其含有人IgG1的CLkappa恒定结构域。

用BsiWI限制酶消化每个克隆质粒(VL-pUC57-Genscript)以提取VL插入物(400bp)。将纯化的插入物连接到通过BsiWI消化线性化的表达质粒pFuseCLIg-hk中并进行去磷酸化。扩增阳性克隆(其具有在人恒定结构域之前以正确方向插入的VL片段)并通过无Midiprep-内毒素(Macherey-Nagel)纯化以用于转染步骤。以类似方式克隆重链，其中恒定结构域由SEQ ID No：26组成。

实施例2.人源化轻链的制备

对于测试的人源化抗CD127抗体，根据常规方法进行稳定克隆的转染和选择。制备三种对应于重链(HC)和轻链(LC)的不同转染比率的各抗体上清液并测试：HC∶LC为2∶1、1∶1.3和1∶2。得到的滴度在图2中示出，其根据常规方法，不含抗生素，在以300′000个细胞/mL接种的CHO细胞中产生后获得：通过ELISA对相应抗体的固定化抗人IgG(Fc)测定滴度，并用小鼠抗人κBmAb加过氧化物酶标记的驴抗小鼠抗体暴露，并使用TMB底物通过比色法在450nm显示。

还在瞬时转染实验中测试了N13B2-h3和N13B2-hVL6的产生。转染前一天，将COS细胞以100000个细胞/孔接种在具有完全培养基(DMEM SVF10％(Hγclone)+PS 1％+Glu1％)的P12孔板中，并在37℃、5％CO₂下培养。转染当天，COS细胞以50％至90％汇合使用。将它们用PBS洗涤并在500μl的完全培养基中保持。将0.6μg的VH变体+0.4μg的VL变体在200μl的OptiMEM培养基中混合，并加入1μl的Plus试剂(Invitrogen)(在室温下孵育15分钟)。在混合物中加入3.5μl的脂质体LTX(Invitrogen)+100μl，并在室温下孵育25分钟。将全部混合物逐滴地置于COS细胞上，并在37％、5％CO₂下孵育48小时。48小时后，收获上清液并离心(1500rpm，10分钟，4℃)。用ELISA n°TH-MO-43定量上清液。用ELISA TH-MO-44进行活性测定。

实施例3.与CD127结合-酶联免疫吸附测定(Elisa)

对于夹心ELISA，将驴抗人IgG(Fc特异性)抗体以1.2μg/ml涂覆在P96孔板上，并加入纯化的抗体以测量功能浓度的标准范围。孵育和洗涤后，加入小鼠抗人轻链，κ特异性(Effimune，克隆NaM76-5F3)和过氧化物酶标记的驴抗小鼠(Jackson Immunoresearch，参考号715-036-151)抗体，并通过常规方法显示。

对于活性ELISA测定，将重组hCD127(Sino Biologicals，北京，中国；参考号10975-H08H)以1μg/ml固定在塑料上，并加入稀释的抗CD127抗体以测量结合。孵育和洗涤后，加入小鼠抗人轻链(κ特异性)加过氧化物酶标记的驴抗小鼠抗体，并通过常规方法使用TMB底物通过比色法在450nm显示。

获得以下ED50值(达到最大信号的50％所需的浓度)：

	ED50(ng/ml)
		N13B2-h3	16，8
N13B2-hVL3	15，1
		N13B2-hVL4	12，6
N13B2-hVL5	14，8
		N13B2-hVL6	9，5

表1.与抗体的CD127结合的ED50值(以ng/ml为单位)

通过在4℃、25℃和42℃下孵育抗体7、14或30天，来研究抗体的稳定性。即使在孵育30天后，抗体与CD127的结合仍然是优异的。孵育30天后通过ELISA测定的ED50值报告于表2中。

表2.在指定温度下孵育30天后，抗体与CD127结合的ED50值(以ng/ml为单位)。

实施例4.与CD127结合-Blitz

该方法用Blitz(Forte Bio，C22-2 No 61010-1)进行。

将50μg/ml的重组hCD127(Sino Biologicals，北京，中国；参考号10975-H08H)/重组蛋白(Sino Biological Cat：11612-H08H)通过Fc片段固定在抗人IgG Fc(AHC)生物传感器(Forte Bio，18-5063)中30秒。然后，以20μg/mL(饱和浓度)加入抗CD127抗体，结合时间120秒，接着在动力学缓冲液中解离抗CD127抗体120秒。用Blitz pro 1.2软件进行数据分析，该软件计算结合常数(ka)和解离常数(kd)并确定亲和力常数KD(ka/kd)。结果报告在表3中。

表3.Blitz对人CD127重组蛋白的抗CD127抗体的亲和力分析

实施例5.抑制STAT5磷酸化

为了在功能测定中测试对IL7R的抑制，将抗体与人PBMC在37℃孵育30分钟，然后以0.1ng/ml的IL7(AbD Serotec，参考号PHP046)在37℃刺激15分钟。在4℃下停止反应，并用Perm洗涤(Perm Wash)缓冲液洗涤，然后用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Bioscience，参考号554722)在4℃固定15分钟。洗涤细胞并用FITC标记的抗CD3(BD Bioscience，参考号557694)在4℃下染色30分钟。然后，将细胞在Perm Buffer III(BD Bioscience，参考号558050)中在4℃下孵育30分钟使细胞透化。用PBS BSA1％叠氮化物0.1％洗涤后，将细胞用Alexa-647标记的抗pStat5抗体(BD Bioscience，参考号612599)在室温下染色30分钟。在BD CantoII细胞荧光计上分析样品。hPBMC-CD3+与IL7诱导pStat5的磷酸化，而没有IL7时我们没有观察到磷酸化。结果报告在图4和下表中，显示ED50，即在该测定中所指抗体的浓度达到信号的50％。

表4.抗CD127抗体对STAT5磷酸化的抑制

该实验证实，人源化氨基酸修饰种系和修饰结构残基不会改变抗CD127抗体的生物活性。所有测试的变体(N13B2-h3、N13B2-hVL3、N13B2-hVL4、N13B2-hVL5、N13B2-hVL6)均可以在IL7刺激后抑制hPBMC上的Stat5磷酸化，如先前产生的参考批次N13B2。关注N13B2-hVL6(最人源化和最优化的)，我们注意到它能够维持其抑制Stat5磷酸化的生物活性，其抑制程度与参考号N13B2-h3相同。此外，该变体在42℃、25℃或4℃孵育14天后非常稳定，它不诱导聚集体形成，并保持其结合活性。

实施例6.对记忆T细胞的作用

结核菌素诱导的迟发型超敏反应模型

在迟发型超敏反应(DTH)皮肤试验前4周和2周，用卡介苗(0.1ml；2-8 105 CFU；Sanofi Pasteur MSD，里昂，法国)在腿部上部区域对狒狒进行两次皮内免疫。皮内注射2000或1000UI结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD；Symbiotics Corporation，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行皮内反应(IDR)。盐水(0.1ml)用作阴性对照。由至少两名观察者使用卡尺测量注射部位的皮肤反应，当直径＞4mm时被认为是阳性的。在三周洗涤期后，进行第二次IDR，并且动物接受一次静脉注射10mg/kg的N13B2(n＝7)或10mg/kg(V915GA、AA892BB、32257、33874)(n＝4)的人源化N13B2或等体积的赋形剂(n＝4)。注射后每月进行额外的IDR。洗涤期后，一些狒狒(之前用N13B2治疗的)再次用BCG皮内注射两次使其免疫，接着进行新的IDR。记录读数的平均值并绘制每个时间点的图。为了比较多个实验条件，使用Graph PadPrism软件进行计算，将红斑反应量化为曲线下面积(AUC)(图5A和B)。

酶联免疫斑点测定法(Elispot)

根据制造商的说明书，在用结核菌素再刺激的新鲜分离的PBMC上进行Ag-特异性T细胞频率的IFN-g ELISPOT测定(非人灵长类动物IFN-g ELISPOT试剂盒；R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)。

简而言之，在ElispotHTS滤板(Filter Plates)(Merck Millipore)的每个孔中加入捕获抗体(R&D systems，目录号SEL961)，并在4℃下孵育一夜。洗涤三次后，加入封闭缓冲液并将板在环境温度下孵育2小时。通过Ficoll梯度离心(GE HealthcareLife Science，巴黎，法国)从狒狒的血液中新鲜提取狒狒PBMC。然后溶解红细胞并洗涤细胞，然后在含有或不含结核菌素纯化蛋白衍生物的培养基中(补充有青霉素-链霉素(Gibco)的TexMacs培养基)中以适当的浓度重建。将板在37℃和5％CO₂下孵育18～24小时。用清洗缓冲液洗涤三次后，加入检测抗体(R&D systems，目录号SEL961)并在4℃孵育24小时。三次洗涤后加入链霉抗生物素蛋白-AP(R&D systems，目录号SEL002)，并在2小时期间在环境温度下孵育2小时。完成三次洗涤。添加了BCIP/NBT(R&D systems，目录号SEL002)并在30分钟内避光。需要用清洗缓冲液洗涤数次并用去离子水洗涤一次(图5C)。

动物

狒狒(Papio anubis；7-14kg)获自国家科学研究中心(Rousset，法国)。将动物饲养在INSERM单元1064的大型动物设施中。动物研究由法国国家伦理委员会批准。

结果

在第一个实验中，对BCG接种的狒狒用结核菌素进行第一次IDR，该狒狒当时未接受治疗(第30天)。经过一个月的洗涤期后，在静脉注射10mg/kg的N13B2(白色条)后4小时和每个月进行第二次IDR。在新接种BCG疫苗后(抗体注射后14个月)进行最后一次IDR。对照动物(黑色条)接受相似体积的赋形剂静脉注射并接受相同方案的挑战。结果显示，抗IL7Rα嵌合抗体在单次施用后诱导了非常长期的保护(长达14个月)。仅在新疫苗接种后才恢复应答。

在另一个实验中，对BCG接种的狒狒用结核菌素进行第一次IDR(虚线条-例如，V915GA的IDR1)。经过一个月的洗涤期后，在静脉注射10mg/kg的人源化N13B2后4小时和每个月进行第二次IDR(实心条-例如，V915GA的IDR2-6)。在新接种BCG和结核菌素(Tuberculine)(点状条-例如，V915GA的IDR7)疫苗后进行最后一次IDR。对照动物(黑色条)接受相似体积的赋形剂静脉注射并接受相同方案的挑战。结果显示，在评估的3/4的狒狒中，单次施用人源化N13B2后也诱导了长期保护。“33874”动物最初在抗体注射后立即应答，但应答在一个月后自发恢复。

在体外用结核菌素再次刺激血液PBMC。在BCG接种的狒狒(虚线条)上进行具有或不具有结核菌素的第一次IFNγelispot。在注射10mg/Kg的人源化N13B2(满条)后4天进行第二次IFNγelispot。然后在每个月用结核菌素在体内进行新的IDR时进行新的ELISPOT。在新接种BCG疫苗(虚线条)后进行最后一次IFNγelispot。结果显示，施用人源化N13B2在长期应答动物中引起抗原特异性记忆T细胞缺失。在DTH模型中，“33874”狒狒未显示出结核菌素特异性记忆T细胞显著减少并且没有长期保护。在新接种BCG疫苗后，长期应答动物显示出抗原特异性记忆T细胞的频率增加，其恢复至基础水平(在mAb注射之前)，这与体内DTH应答的恢复相关。总之，这些结果表明，人源化N13B2诱导的长期保护与抗原特异性记忆T细胞缺失有关，这解释了该药物的长期作用。

实施例7.IBD患者中IL-7、CD127和TSLP的表达

如图6的说明中详述，分析根据Planell等人，Gut 2013的详述所获得的原始mRNA表达数据。

实施例8.用抗CD127抗体加IL7刺激的人PBMC的信号通路

从人PBMC的溶解物中研究IL7信号通路，该溶解物在37℃下与10μg/ml可溶性抗人CD127抗体孵育30分钟，并在37℃用IL7(AbD Serotec，参考号PHP046)以5ng/ml刺激10分钟。在还原条件下，用20μg细胞溶解物的蛋白质，在7.5％聚丙烯酰胺凝胶中进行Western印迹，并印迹到硝酸纤维素膜(GeHealthcare)上。印迹用5％BSA-Tris缓冲盐水(TBS)饱和，并且通过如下显示：用磷酸(Phospho)-Stat5、Phospho-PI3-激酶p85，Phospho-Akt和Phospho-ERK1/2抗体(细胞信号传导技术(Cell Signalling Technology))以1/1000在1％BSA-TBS中(在4℃下过夜)，然后在室温下以1/2000的多克隆山羊抗兔标记的辣根过氧化物酶抗体(Cell Signalling Technology)1小时；或者用GAPDH抗体(Santa Cruz)以1/1000在1％BSA-TBS中(在4℃下过夜)，然后在室温下用1/2000的多克隆山羊抗小鼠标记的辣根过氧化物酶抗体(Jackson Immunoresearch)1小时。使用LAS-3000成像系统(Fujifilm)通过化学发光来显示膜。由此测定以下抗人CD127抗体：N13B2-h3和N13B2-hVL6(均为本文公开的抗位点1/2b抗体)；MD707-13-G4(“抗位点1抗体”，公开于国际专利申请WO2013/056984中)和1A11(公开于GSK的专利WO2011/094259中)。

实施例9.对IBD组织中T细胞细胞因子释放的作用

来自IBD患者的活检组织可以用作体外疾病的炎性模型，并且已经显示在培养24小时后自发释放高水平的促炎细胞因子(UC：IFNγ，130±19pg/ml；IL-6，4042±529pg/ml；IL-8，25626±1640pg/ml-CD：IFNγ，180±38pg/ml；IL-6，3653±734pg/ml；IL-8，15540±2452pg/ml[分别为UC和CD的平均值±sem])。

使用从20名患有IBD(10例患有克罗恩病，10例患有溃疡性结肠炎)的患者的发炎结肠粘膜中取出的手术标本，在该器官培养测定中以10μg/ml应用抗CD127mAb，并在含有10μg/ml IgG对照mAb或封闭抗人IL-7RαmAb的培养基中，在37℃培养24小时(详见下面的取样和培养条件)。将来自每位患者的配对对照样品取样并在相同条件下培养，用IgG对照代替抗CD127抗体。通过ELISA(如下详述)在离体培养样品的上清液中测量细胞因子浓度。

抗IL7RαmAb显著抑制了离体生长的UC活检组织样品的IFNγ产生。对于一些分泌大量IFNγ的CD活检组织样品，观察到了类似的结果。

离体器官取样和培养

如果使用粘膜切除组织，则使用剪刀切割小的活检组织尺寸的片段。接下来，将活检组织或活检组织尺寸的片段置于补充有L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μg/mL庆大霉素的300μl无血清HL-1培养基(Lonza，Cambridge Bioscience，英国)中。将粘膜外植体在37℃和5％CO₂下孵育24小时。在孵育开始时，以10μg/mL将相应的测试抗体(N13B2)或IgG对照加入培养基中。最后，将上清液和活检组织材料快速冷冻并储存在-70℃下用于将来的分析。

酶联免疫吸附(ELISA)测定

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量活检组织上清液中的细胞因子产生。根据制造商的说明书，使用来自ImmunoTools的人重组IFN-γ(#31673539，弗里索伊特，德国)。

实施例10.与其表位特征相关的抗人IL7-Rα抗体的比较：

质谱分析：使用肽微阵列的抗体谱分析

肽技术的PepStarTM(peptide Technologies′PepStarTM)肽微阵列包含衍生自抗原或其他来源的纯化合成肽，其化学选择性地和共价地固定在玻璃表面上。将优化的亲水性接头部分插入玻璃表面和抗原衍生的肽序列之间，以避免由空间位阻引起的假阴性。由于技术原因，所有肽都含有C-末端甘氨酸。在由52种肽组成的肽文库上进行样品的分析实验。

完整的多肽列表如下所示：

表5.肽微阵列测定中使用的肽的列表

使用多孔(Multiwell)格式在微阵列载玻片上孵育总共4个样品。对于N13B2-h3VL6抗体和其他样品(MD707-13、HAL和1A11)，以6种不同浓度(10μg/ml；2μg/ml；1μg/ml；0.1μg/ml；0.01μg/ml；0.001μg/ml)施用。将系列样品稀释液在30℃下在含有21个单独的微阵列的多孔微阵列载玻片上孵育1小时(每个样品稀释液1个微阵列)。在样品孵育后，加入1μg/ml的二次抗人IgG抗体并使其反应1小时。仅施用第二抗体的另外的对照孵育在相同的微阵列载玻片上平行进行，以评估与肽的假阳性结合。洗涤和干燥后，用高分辨率激光扫描仪在635nm处扫描载玻片以获得荧光强度分布。对得到的图像进行量化以得到每种肽的平均像素值。量化图像以产生每种肽的平均像素值。用Cy5以1μg/ml标记第二抗人IgG抗体。

缓冲液和溶液

使用的缓冲液是TBS缓冲液，包括0.05％Tween20(JPT)和测定缓冲液T20(Pierce，SuperBlock TBS T20，#37536)。使用肽微阵列((JPT Peptide Technologies GmbH，德国柏林；批次#2668，多孔孵育室，Axon Genepix扫描仪4200AL)进行采集和分析，使用高分辨率荧光扫描仪扫描微阵列。所有执行的测量的激光设置和应用的分辨率都相同。使用斑点识别软件GenePix(分子装置(Molecular Devices))分析所得图像并定量。对于每个斑点，提取平均信号强度(在0到65535之间的任意单位)。

为了进一步的数据评估，确定了所谓的MMC2值。MMC2等于微阵列上所有三个实例的平均值，除了变异系数(CV)-标准偏差除以平均值-大于0.5以外。在这种情况下，两个最接近值(MC2)的平均值被指定为MMC2。

氘分析

使用HDX-2系统(Waters S.A./N.V.；Zellik，比利时)，将重组人CD127和0或1摩尔当量的mAb混合并在99.9％的D₂O、10mM的磷酸钠、100mM的NaCl，pH6.8中稀释至最终D₂O含量为90％且CD127或CD127/mAb复合物浓度为27.5μM。氢-氘交换在20.0℃下进行30分钟。用100mM磷酸钠、4M胍·盐酸、0.4M TCEP、pH 2.3在1.0℃以1∶1(v/v)稀释样品使最终pH为2.5来淬灭该交换。2分钟后，将淬灭的样品装填到HDX管理器上，在20.0℃下进行在线胃蛋白酶消化(Enzymate BEH Pepsin，2.1×30mm；5μm)，然后进行脱盐(Acquity BEH C18 Vanguard2.1mm×5mm；1.7μm)，接着在0.0℃、流速40μl/min下，使用梯度为5％-40％的0.2％甲酸的乙腈溶液(pH 2.5)进行反相分离(Acquity BEH C18 1.0mm x 100mm；1.7μM)10分钟。质谱分析在Waters Xevo G2-XS ESI-Q-TOF质谱仪上以正离子模式进行，具有锁定喷雾校正。使用温和的源条件(温度：90℃，毛细管电压：2.5kV，采样锥：30V，去溶剂化气体流量：800L/小时，去溶剂化温度：250℃)以最小化返回交换(back-exchange)，同时确保适当的去溶剂化(73)。使用PLGS 3.0.2和UNIFI 1.8，在MSE模式下收集的碰撞诱导解离辅助肽鉴定。在DynamX 3.0中测定氘结合。使用PyMOL 1.8.2.3(Cambridg，美国麻萨诸塞州)从PDB ID 3DI3(19)制备结构图。磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸胍、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、50％氢氧化钠和甲酸以最高可用纯度购自Sigma Aldrich(Schnelldorf，德国)。LC-MS级溶剂购自Biosolve Chimie(Dieuze，法国)，氧化氘(99.9％D)和在氧化氘(99.96％D)中的20％氯化氘购自Cambridge Isotope Laboratories(Andover，麻萨诸塞州，美国)，盐酸37％购自VWR International(Fontenay-sous-Bois，法国)，牛细胞色素C消化物购自Thermo Fisher Scientific(Germering，德国)。Amicon超离心过滤器(0.5mL；10kDa截止值)购自Merck Millipore(Molsheim，法国)。

结果

通过不同抗IL7RαmAb的线性肽阵列进行的表位表征鉴定了两种类型的拮抗剂mAb：(1)结合至与IL-7相互作用的区域(位点-1)的mAb，如先前由两个其他组描述的(WO/2011/094259中描述的克隆1A11和WO/2011/104687中描述的克隆HAL)且包括MD707-13，和(2)mAb，即本发明的N13B2-h3VL6，其结合位点-1和与IL-7Rα和γ链亚基之间的异二聚化的预测结构域(位点-2b)重叠的表位(Walsh 2012)。

具有较高和相似亲和力的N13B2-h3VL6和MD707-13(以2.10^-10M的KD结合至位点1/2b的结合剂和以5.10^-10M的类似KD结合至位点1的结合剂)用人IgG4 Fc同种型(含有S228P铰链突变以防止Fab臂交换)重组表达，并且与先前描述的具有相似亲和力的其他位点-1mAb，克隆1A11进行比较，该克隆1A11描述于WO/2011/094259(KD为6.10^-10M)并用临床开发的人IgG1 Fc同种型重组表达(NCT02293161)。使用氢氘交换和质谱(HDX-MS)分析构象表位证实了先前的观察结果，并且证明本发明的抗体(即N13B2-h3VL6(位点1/2b mAb))保护位点1的几个肽免于氘结合，也保护在位点2b重叠的肽，而另外两种mAb(MD707-13和1A11)仅明显阻止位点1的肽中的氘结合(数据未显示)。

本发明的抗体是唯一识别位于结构域1的位点1上的构象表位和位于人CD127的位点2b上的构象表位的抗体。

实施例11.抗人IL-7Rα抗体作为IL-7通路的激动剂和/或拮抗剂的能力的比较。

Western Blotting(蛋白质印迹)

将新鲜分离的人PBMC在37℃下与10μg/ml抗人IL-7RαmAb一起孵育30分钟，然后单独或与5ng/ml重组人IL-7(AbDSerotec)一起在37℃培养10分钟。在冰上停止反应后，用RIPA缓冲液(含有蛋白酶抑制剂混合物)制备细胞溶解物。蛋白质(15μg)在还原条件下在7.5％聚丙烯酰胺凝胶上分解，并使用标准方法固定在硝酸纤维素膜(GeHealthcare)上。用5％BSA-Tris缓冲盐水洗涤印迹，并与1％BSA-TBS中的Phospho-STAT 5、Phospho-PI3K p55或Phospho-ERK特异性抗体一起孵育(在4℃过夜)，然后在室温下用多克隆山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的抗体(Cell Signaling Technology)孵育1小时。或者，使用GAPDH抗体(Santa Cruz)在1％BSA-TBS中染色印迹(在4℃过夜)，然后在室温下用多克隆山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的抗体(Jackson Immunoresearch)孵育1小时。使用LAS-3000成像系统(Fujifilm)通过化学发光显示膜。

RNA测序

将新鲜分离的人PBMC与10μg/ml抗人IL-7RαmAb一起孵育(37℃下30分钟)，然后单独或与5ng/ml重组人IL-7(AbDSerotec)一起在37℃培养3小时。在冰上停止反应，将细胞颗粒重悬于RLT缓冲液(Qiagen)中并保存在-80℃，该RLT缓冲液在无RNase/DNase的水中含有1％β巯基乙醇。根据制造商的说明书(Qiagen)，使用RNA迷你提取试剂盒提取RNA。通过红外光谱(Nanodrop)和安捷伦生物分析仪(Agilent RNA 6000 Pico Kit)评估RNA的质量和数量。Smart-Seq2文库由Broad Technology Labs制备，并由Broad Genomics Platform根据SmartSeq2方案测序并进行一些修改。简而言之，使用RNA-SPRI珠纯化总RNA，将polyA+mRNA逆转录为cDNA，将扩增的cDNA进行基于转座子的片段化，其使用双重索引结合每个样本特有的条码，使每个转换的转录物的每个片段条码化。每个索引使用额外8个循环，以配对端2x25bp进行测序。数据由条码分隔，并使用默认设置的Tophat 2.0.10版进行比对。使用Cuffquant 2.2.1版，由Broad Technology Labs计算流程来量化转录物。简而言之，如果50％的读数(read)匹配，并且如果每个样品匹配至少100,000对，则通过CuffNorm处理数据。归一化使用默认设置，包括“几何”归一化，以及使用表达水平信息，如log2转换的FPKM值(每百万映射片段中每千个碱基转录物片段(Fragments per kilobase of transcriptper million mapped fragments))用于后续分析。为了识别差异基因，使用经验贝叶斯统计程序的均值-方差关系(limma-trend)进行线性建模，使用R.Genes的limma软件包进行，其中Benjamini和Hochberg调整的p值＜5％，并且倍数变化(FC)＞1.5被认为是差异表达的。对于基因表达表示，主成分分析(PCA)和聚类分析(clustering)分别使用ade4/adegraphics和pheatmap包在R v3.3.2中进行。使用R clusterProfiler包评估所选基因的生物学意义。选择富含错误发现率(FDR)＜5％并且具有至少五个代表基因的基因本体论(GO)类别。可以在GEO登录号GSE下访问RNA-seq数据。

结果

STAT5，PIK3和ERK信号通路

然后，比较抗人IL-7RαmAb(N13B2-h3VL6、MD707-13、1A11和HAL)激活或阻断先前与IL-7R信号传导相关的STAT5、PI3K和ERK信号通路的能力(图9和10)。如前所述(参见例如图7)，IL-7在人PBMC上诱导有效的STAT5磷酸化，并且所有测试的mAb均为该STAT5磷酸化的有效抑制剂(参见图7)。相反，如图9和10所示，发明人发现，虽然IL-7诱导可变的PI3K磷酸化并且不诱导ERK磷酸化，与根据本发明的抗体相反，现有技术的抗体(即MD707-13、1A11和HAL)即使在不存在外源IL-7的情况下也显著诱导ERK磷酸化并且在更小程度上诱导PI3K信号。这些发现表明，现有技术的抗人IL-7Rα抗体具有部分激动剂特性，因此被认为是人IL-7R的双重激动剂/拮抗剂mAb。相反，根据本发明的抗体，特别是N13B2-h3VL6，仅具有人IL-7R的拮抗特性。

发明人评估了具有激动剂/拮抗剂特性的抗体是否能够递送能够修饰人T细胞的有效激动剂信号。通过基于RNA的下一代测序(RNA-SEQ)分析了在没有外源人IL-7、有人IL-7和有IL-7和抗体(MD707-13，1A11位点1(分别为IgG4#1或lgG1#2)或N13B2-hVL6位点1/2b(IgG4))的情况下，孵育3.5小时的人PBMC的转录组。与对照条件相比，在与抗人IL-7RαmAb一起孵育的人PBMC中总共有481个基因差异表达，而与对照条件相比，在单独用人IL-7刺激时总共有334个基因差异表达。

表6.与未刺激的细胞相比，人PBMC(n＝7)与抗IL7RαmAb一起孵育后显著表达(FDR5％)和差异表达(倍数变化＞1.5)的基因列表。

维恩图(图11C)分析使用三种mAb识别61种常见差异表达基因，没有任何特定的GoMiner基因本体富集。尽管有61种常见基因，但本发明的抗体仅诱导31种显著基因修饰而没有基因本体富集。相反，现有技术的两种抗体诱导人PBMC转录组的重要转录修饰，其中由位点1IgG4#1mAb诱导245个差异表达的基因和由位点1IgG1#2mAb诱导237个差异表达的基因。78个差异表达的基因在这两个位点1mAb间是共通的，但是当用N13B2-hVL6刺激PBMC时这些基因不是差异表达的。

IL-7特征(signature)的主成分分析(PCA)表明，现有技术的抗体诱导的差异表达的基因与IL-7诱导的差异表达的基因有强烈不同。GoMiner基因本体富集表明，现有技术的两种抗体均修饰PBMC生物学功能，例如白细胞活化、增殖、迁移、趋化性、细胞因子分泌和与MAPK/ERK通路相关的炎症反应。

在与对照条件相比用IL7诱导的差异表达的334个基因中，93个基因以高倍数变化(＞2)差异表达，并通过热图分析分成3个不同的簇(图11A)。通过基因本体富集评估的第一下调基因簇主要涉及白细胞分化和凋亡，第二高度上调的基因簇与白细胞粘附、分化和活化有关，第三上调基因簇具有混合基因本体。有趣的是，所有测试的mAb(位点1或位点1/2b)都显示出类似的效果：阻止簇1和簇2修饰，但对簇3没有影响(图11B)。

总而言之，转录分析证实，尽管位点1和位点1/2b抗人IL-7RαmAb具有相似的拮抗特性，但现有技术中描述的两种位点-1mAb诱导与T细胞活化相容的人PBMC的显著转录修饰和MAPK/ERK通路诱导的炎症反应。

与现有技术中描述的两种位点1mAb相比，本发明的位点1/2b抗人IL-7RαmAb，即N13B2-hVL6，诱导较少的人PBMC的转录修饰。

缺乏针对较大物种的特异性和“仅具拮抗剂性质”的抗IL-7RαmAb阻止了在灵长类动物或人类中验证这种效应。本发明人发现，抗IL-7RαmAb的激动剂/拮抗剂性质取决于靶向的特异性表位，因为结合位点1IL-7相互作用结构域的现有技术的抗体似乎同时具有激动剂/拮抗剂性质，而结合IL-7Rα/γc(位点2b)二聚化结构域的本发明抗体显示出严格的拮抗活性。发明人提出，本发明的抗体可以扰乱受体内化和信号传导所需的IL-7Rα/γc二聚化。即使在慢性抗原刺激后，“仅具拮抗剂性质”的抗IL-7R抗体也能阻止灵长类动物长期记忆T细胞介导的皮肤炎症，而不会诱导淋巴细胞减少或多克隆T细胞功能或代谢缺陷。

已显示，IL-7主要通过激活JAK/STAT通路而通过IL-7R信号传导来诱导增殖和抗凋亡信号。还认为IL-7R信号传导涉及PI3K/AKT通路，但这已经在转化的永生化细胞系或原代胸腺细胞中观察到，并且这些信号在外周幼稚或记忆人T淋巴细胞中无法检测到(Watanabe，J.Exp.Med，1998)。一些报道还表明，IL-7R信号传导可以放大T淋巴细胞或pro-B细胞亚群中的ERK磷酸化(Deshpande P.I.Immunol，2013；Fleming HE和Paige CJ，Immunity，2001)。这些通路在成熟和人T细胞中IL-7R信号传导中的作用尚不清楚。使用来自健康志愿者的用高浓度重组人IL-7(5000pg/ml，而血清中的浓度在非淋巴细胞减少的条件下为～5pg/ml，Wong H-L，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008))刺激的原代新鲜分离的人PBMC(主要由T和B淋巴细胞、单核细胞和NK细胞组成)，发明人证实，IL-7诱导可重复的STAT5磷酸化。PI3K信号激活更加可变，并且他们未观察到任何ERK磷酸化。虽然本研究中使用的所有抗IL7Rαmab都是IL-7诱导的pSTAT5的有效抑制剂，并且具有相似的转录拮抗剂特性，我们发现现有技术的两种位点1mAb诱导PI3K/ERK激动剂信号和与MAPK/ERK通路诱导的T细胞活化和炎症反应相关的重要转录修饰。一些mAb的这些相反的双重激动剂/拮抗剂特性不是唯一的，因为其他靶标例如IL-4、IL-6R、IL-15、CD28、CD38、CD40或HER2在受体内吞/内化后表现出类似的活性。

最近已经证实该位点2b与TSLPR的异二聚化，并且其被证明可以用于受体信号传导，如对IL-7Rα和γ链所预测的那样(Verstraete K.，Nature Communications，2017)。有趣的是，预测的IL-7Rα/γ链和IL-7Rα/TSLPR之间的异二聚化位点是重叠的，表明两种受体之间共享异二聚化介导的信号传导机制。

我们发现体外pSTAT5抑制试验不能预测体内抗IL-7R抗体效力。在先前的报道中，另一种抗IL7RαmAb在实验性自身免疫性脑炎(EAE)狨猴模型中，在灵长类动物中体外和离体预防IL-7诱导的pSTAT5，但不能防止脑炎症(Dunham J.，J.Neuroimmune.Pharmacol，2016)。

IL-7在维持小鼠外周幼稚和记忆T淋巴细胞池中已被充分描述。然而，在灵长类动物中，IL-7在维持外周T细胞稳态中的重要性因此可能不太明显和/或冗余机制可能解释物种之间的差异。

这些数据表明，抗IL-7RαmAb的拮抗特性和体内功效不仅与防止IL-7结合和抑制pSTAT5有关。这些数据显示，也靶向受体异二聚化位点(位点2b)的本发明的抗体是“仅具拮抗剂性质”的并且在体内导致更高的抑制性T细胞应答的功效。

用“仅具拮抗剂性质”抗体靶向IL7R具有调节抗原特异性记忆T细胞存活和积累的潜力，因此可能促进防止自身免疫和炎性疾病的长期复发。

参考文献

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Claims (16)

1.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合CD127，特别是人CD127，所述抗体或其抗原结合片段包含：

-抗体轻链或抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链包含选自下组的序列或所述抗体轻链可变结构域由选自下组的序列组成：SEQ ID No：9；SEQ ID No：10；SEQ ID No：11；SEQ IDNo：12；特别是SEQ ID No：12；和

-抗体重链可变结构域，其包含由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示序列组成的三个CDR，特别是由SEQ ID No：7所示的序列组成的抗体重链可变结构域。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是人源化单克隆抗体，特别地其中抗体轻链恒定结构域衍生自人κ轻链恒定结构域，特别地其中轻链恒定结构域由SEQ ID No：27或28的序列组成，并且其中抗体重链恒定结构域衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定结构域，特别是衍生自人IgG4重链恒定结构域，特别地，其中抗体重链恒定结构域由具有SEQ ID No：26的序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体轻链包含SEQ IDNo：12或所述抗体轻链可变结构域由SEQ ID No：12组成，并且其中所述抗体重链可变结构域由SEQ ID No：7组成。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是IL-7诱导的IL-7R信号传导的拮抗剂，并且所述抗体或其抗原结合片段不诱导磷脂酰肌醇3-激酶和/或ERK信号通路的活化。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段识别包含取自CD127的2b位点的序列的表位和/或破坏CD127与细胞因子受体的γc共有链的结合，特别是，所述抗体或其抗原结合片段至少识别CD127的位点2b的第三β折叠。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段不诱导CD127的内化和/或抑制IL7诱导的CD127内化。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段不增加由TSLP诱导的树突细胞的成熟。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有长期效果和/或快速效果，特别是具有快速局部效果。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段以低于5E-9M的亲和常数KD特异性结合人CD127，所述亲和常数KD可通过生物传感器分析确定。

10.编码权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子的组合，特别是包含选自下组的序列或由选自下组的序列组成的第一分离的核酸分子：SEQ IDNo：15、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；和第二分离的核酸分子，其包含SEQID No：13的序列或由SEQ ID No：13的序列组成。

11.药物组合物，其包含权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求10所述的分离的核酸分子的组合，以及药物载体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其适于局部施药，特别是适于局部皮下、肠溶或口服施药，更特别是适于给药至结肠。

13.包含权利要求11或权利要求12的药物组合物和给药装置的试剂盒，所述给药装置适于局部施药，特别是皮下、肠溶或口服给药装置，更特别地，所述装置包括载药注射器或无针头装置。

14.根据权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求10的分离的核酸分子的组合，或根据权利要求11或12的药物组合物，或根据权利要求13的试剂盒，用作药物。

15.根据权利要求1～9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求10的分离的核酸分子的组合，或根据权利要求11或12的药物组合物，或根据权利要求13的试剂盒，用于权利要求14的用于预防或治疗器官或组织移植排斥或疾病的用途，所述疾病选自：自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎，系统性硬化症，多发性硬化症，I型糖尿病，自身免疫性甲状腺炎，系统性红斑狼疮，原发性干燥综合征和炎性疾病，特别是炎症性肠病(IBD)，更特别地，克罗恩病和溃疡性结肠炎和脑脊髓炎和过敏性疾病，以及癌症疾病和与移植和呼吸系统疾病相关的疾病。

16.从抗体、其抗原结合片段或抗体模拟分子中选择化合物的方法，所述方法包括以下步骤中的至少一个或由以下步骤中的至少一个组成：

i.测试化合物与CD127，特别是与人CD127的结合能力，特别是与来自人CD127的结构域D1和/或结构域D2的2b位点的表位序列的结合能力；

ii.在所述化合物存在下，测试IL-7诱导的对IL7-R信号传导的抑制，特别是对STAT5磷酸化的抑制；

iii.在所述化合物存在下，测试磷脂酰肌醇3-激酶的活化；

iv.在所述化合物存在下，测试ERK信号通路的活化；

v.测试所述化合物与CD127，特别是至少与人CD127的2b位点的第三β折叠的结合能力；

所述方法可选地还包括以下步骤中的至少一个：

vi.在所述化合物存在下，测试CD127与细胞因子受体的γc共有链的结合；

vii.在所述化合物存在下，测试CD127的内化和/或IL7诱导的CD127的内化；

viii.在所述化合物存在下，测试由TSLP诱导的树突细胞的成熟；

特别是其中特异性结合CD127的化合物是IL-7诱导的IL-7R信号传导的拮抗剂，并且选择不诱导磷脂酰肌醇3-激酶和/或ERK信号通路的活化的化合物。