JP2022515226A - 検出・処理の構成と方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、糖尿病の分野に関する。より具体的には、本発明は、I型糖尿病を診断および処置するために有用な組成物および方法を提供する。一実施形態では、方法は、患者から得られた生物学的サンプルから配列番号１をコードするヌクレオチド配列を検出することを含む。別の実施形態では、本発明は、配列番号１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、（ｉ）リンパ球上に発現するＢ細胞受容体であって、配列番号１を含む、Ｂ細胞受容体、または（ｉｉ）配列番号１を含む浮遊抗体、に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

Description

関連出願の相互参照
1型糖尿病およびその他の自己免疫疾患
本出願は、各臨時出願No.62/854,289(2019年5月29日出願)、各臨時出願No.62/854,286(2019年5月29日出願)、各仮出願各臨時出願No.62/782,624(2018年12月20日出願)の利益を主張する。
政府関心事記載
この発明は、国の保持体により無償で行われた。AI099027、米国国立衛生研究所が授与。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、自己感染症の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、タイプI糖尿病を診断し治療するのに有用な組成物及び方法を提供する。
電子的に提出された資料の関連会社-BY-REFERENCE OF MATERIAL
本出願には配列リストが含まれる。「P14290-03_ST25.txt」と題されたASCIIテキストファイルとしてEFS-Webを介して電子的に提出されており、配列リストはサイズが37,771バイトであり、2019年12月20日に作成された。それは、ここに引用により、その全体として組み込まれている。
B個々とT個々は適応免疫系の2つの主要なリンパ球で、協調して宿主防御を維持したり、感受性のある人に自己免疫を引き起こす働きをしている。B細胞レセプター(BCR)の式はB細胞を規定し、Ti抗原TCR)はT細胞を規定する。どちらの抗原レセプターも似たような構造をしており、非常に多様なレパートリーを持っている(Wardemann et al., 2003)。BCR (表面イグロブリン、Ig)は重い(IGH)鎖と光(IGL)鎖からなるヘテロダイマーであり、αβTCRヘテロダイマーはTCRαとTCRβ鎖からなる。それぞれのレセプターは、V(可変)、V(可変)、D(IGHとTCRβ)の場合の多様性、およびJ(結合)を含む超可変領域を持ち、無作為に選ばれた大きなセグメントから無作為に選択され、再結合され、補完決定領域(CDR3)を生成し、それぞれのクローノタイプの特異性を表し、その抗原結合サイトを構成する。多様性は、V‐DおよびD‐JジャンクションでそれぞれN1およびN2ヌクレオチド添加/消失によって強化される。理論的には、1018までの独特なBCRまたはTCRが、チムスにおける骨髄およびT細胞のB細胞の発達中に発生する(Sewell, 2012)。多様性は事実上あらゆる病原体から宿主を守るために不可欠であるが、遺伝的に感受性のある人に自己免疫疾患を引き起こす自己反応性B細胞やT細胞の生成にもつながる。現在のところ、自己免疫疾患の治療法はありません。その主な理由は、自己反応性リンパ球とその活性化を引き起こす自己抗原の正体についての知識が限られていることである。自己反応性リンパ球を明確に理解することは、有用なリンパ球や宿主免疫能を免れる抗原特異的な免疫療法につながることが期待される。
1つの側面において、本発明は、患者におけるxクローノタイプを検出するための組成物及び方法を提供する。xクローノタイプの特徴は、以下の構造である: VH04-b-N1-DH05-018-N2-JH04-01*02(N1およびN2ヌクレオチド付加を含む)(図3E参照)。一実施形態では、N-1-DH05-018-N2領域を含むか、エンコードするヌクレオチド配列が検出される。より具体的には、一実施形態では、方法は、患者から得られた生物学的試料から配列番号:1をコードするヌクレオチド配列を検出することを含む。特定の実施では、検出ステップはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を構成する。特定の実施形態において、PCRは、SEQ ID NOS:17-18を含むプライマーを用いた増幅を含む。他の実施形態において、PCRは、SEQ ID NOS:23及び19を含むプライマーを用いた増幅を含む。
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:25を含む。別の実施形態では、ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:2を含む。さらに、生物学的サンプルには、血液および生物由来の他の液体サンプルが含まれ得るが、他には限定されないが、周辺血液、美容液、プラズマ、シリブロスピナル液、尿、サリバ、便、シナビウル液が含まれる。特定の実施例では、生物試料は末梢血である。
追加の実施形態では、検出ステップはさらに配列決定を含む。他の実施形態において、本方法は、HLA-DQアレルのジェノタイピングのステップをさらに構成する。
本発明はまた、患者がタイプ1糖尿病(T1D)の危険にさらされているかどうかを判定する方法を提供する。その工程は、(a)患者から得られた生物学的サンプルからSEQ ID NO:1をエンコードしているSEQ ID NO:1を検出すること、(b)HLA-DQ7アレルまたはHLA-DQ8アレルの存在を検出するためにHLA-DQをジェノタイプすること、SEQ ID NO:1およびHLA-DQ8を有する患者がT1Dの危険にさらされていること、SEQ ID NO:1およびHLA-DQ7を持たない患者はT1Dの危険にさらされていないこと、およびSEQ ID NO:1を持たない患者はT1Dの危険にさらされていないことである。特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法は、病気発達の様々な段階でT1Dを発達させるための危険にさらされている個人を特定するために使用することができる。具体的な実施例では、がん患者はチェックポイント・インヒビター治療の前にスクリーニングを受け、T1D開発の危険を特定することができる。同様の実施形態は、他の自己感染症のスクリーニング/危険にも適用される。実際、本発明は、限定されるわけではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Graves病/橋本病、炎症性腸疾患およびIgG4関連疾患および尋常性天疱瘡のようなまれな自己免疫疾患を含む自己免疫疾患を評価するために使用することができる。さらなる実施形態において、本発明の方法は、患者を治療することをさらに含む。特に、本実施の形態では、本項に記載されているように、それらの抗原結合フラグメントを投与することを含む。
いくつかの実施形態では、処理はインスリンまたはプラムリンタイドを管理することを含む。インスリンの種類には、短時間作用型(レギュラー)インスリン、速効型インスリン、長時間作用型インスリンおよび中間型インスリンがあります。短時間作用(通常)インスリンの実施例としては、ヒュームリンRおよびノボリンR.ラピッド作用インスリンの実施例として、インスリングルリシン(アピドラ)、インスリンリスプロ(フマログ)、インスリンアスパルト(ノボログ)、アドメログ、アグレッザ吸入粉末およびフィアスプがある。長時間作用型インスリンには、インスリングラージン(Lantus、Toujeo Solostar)、インスリンデセミラー(Levemir)、インスリンデグルデク(Tresiba)、およびBasaglarがある。中間型インスリンにはインスリンNPH (ノボリンN、ヒューマリンN)がある。
また、本発明は、x-Idに結合する抗イディオタイプ抗毒素を提供する。本発明は、特定の実施の形態では、x-Idに特別に結合する単離された、又は、それらを拘束する断片を提供し、この断片は、重い鎖補完性決定領域(CDR)1、2、3を構成する。更なる実施の形態では、分離された抗菌剤はさらに軽鎖CDR1、2及び3を含む。
本発明はまた、その(a)CDR1、CDR2、およびCDRからなる重鎖可変領域(VH)および(b)CDR1、CDR2、およびCDR3からなる軽鎖可変領域(VL)を含む、x-Idに特別に結合する、孤立した、又は抗原結合フラグメントを提供する。
本発明は、一実施の形態において、SEQ ID NO:1を特別に結合する、別の実施の形態では、本発明は、(i)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1を含む、(i)細胞レセプター上で表現されるB細胞レセプターを具体的に結合する、(ii)SEQ ID NO:1を含む自由浮遊型のその断片を提供する。あるいは、(ii)SEQ ID NO:1を含む自由浮遊型の抗原レセプターを更なる実施の場合には、SEQ ID NO:1を含む抗原結合型の断片を実施形態結合する。特定の実施形態において、抗原又は抗原結合断片は、SEQ ID NO:1への抗原の結合を防止又は減少させる。さらに、抗原結合フラグメントはscFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2、およびダイアボディを含むことができる。
本発明はまた、アンチ-x-Id OOC又はその抗原結合フラグメントをエンコードする孤立した核酸分子を提供する。特定の実施では、ベクトルは、本明細書に記載の核酸分子を含む。別の実施の形態では、ホストセルは、ここに説明されるベクトルを構成する。宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。
特に、本発明は、(a)ホスト細胞が、当該抗x-Id抗菌または当該抗原結合フラグメントをホスト細胞によって表現するのに適した条件下で、ホスト細胞を栽培し、(b)当該抗x-Id抗菌または抗原結合フラグメントを回収する手順を含む、抗x-Id/抗原結合フラグメントを生産するための方法を提供する。
本発明はまた、それの抗x-Id抗原結合断片及び適当な医薬品担体からなる組成物を提供する。特定の実施では、本組成物は、静脈、筋肉内、口下、皮下、腹内、筋内、または筋肉内の行政のために定式化される。
別の側面において、本発明は、処理方法を提供する。ある実施例において、本発明の組成及び方法は、(a)T1Dを開発する危険特性(すなわち、危険遺伝的プロフィール又はT1D抗毒物を有する者)、(b)残存した小島細胞を保存するための残存内生インスリンを有する新たな開始のT1D、(c)パンクリエイティブ内皮細胞を小島細胞を再生することを可能にする潜在的に可能にするT1D、(d)移植細胞に対する自己抵抗性医療レジメンの一部としてのパンクリエイティック又は小島細胞移植を有する人々において、T1Dを標的にし、不活性化するために使用することができる。本発明はまた、例えば、T1D又は他の自己感染症を発達させるリスクを特定するためのチェックポイント・インバント・トリートメントのような事前に、がん患者をスクリーニングするために利用することができる。
特定の実施形態では、哺乳動物の糖尿病を治療するための方法は、x-Idに特に結合する、治療効果のある量の抗原結合フラグメントを哺乳動物に与える工程を含む。一実施の形態では、T1D又はその危険性を有する被検者におけるタイプ1糖尿病(T1D)の治療又は予防のための方法は、ここに記載されている治療効果のある量の抗菌又は抗原結合フラグメントを患者に施す工程を含む。
さらなる実施態様において、本発明は、限定されるわけではないが、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Graves病/橋本病、炎症性腸疾患およびIgG4関連疾患および尋常性天疱瘡のようなまれな自己免疫疾患を含む他の自己免疫疾患を治療するために使用することができる。
1つの実施形態において、本発明は、重鎖CDR1が配列番号60に示されるアミノ酸配列、または配列番号60に示されるアミノ酸配列が2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含み、重鎖CDR2が配列番号62に示されるアミノ酸、または配列番号62に示されるアミノ酸が2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸を含み、重鎖CDR3が配列番号64に示されるアミノ酸配列、または配列番号64に示されるアミノ酸が2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含む、重鎖相補性決定領域(CDR)1、2および3を含む単離された抗体またはその抗体結合フラグメントを提供する。
さらなる実施形態において、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、L鎖CDR1、2および3をさらに含み、ここで、L鎖CDR1は、配列番号:66に示されるアミノ酸配列、または配列番号:66に示されるアミノ酸配列で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するものを含み、L鎖CDR2は、配列番号:68に示されるアミノ酸配列、または配列番号:68に示されるアミノ酸配列で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するものを含み、L鎖CDR3は、配列番号:9に示されるアミノ酸配列、または配列番号:9に示されるアミノ酸配列で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するものを含む。
別の実施の形態では、本発明は、B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターを具体的に結合する、又はSEQ ID NO:1で構成される自由浮遊型のB細胞レセプターの断片、或いはその抗原結合フラグメントが、SEQ ID NO:60、62及び64に記載されるように、それぞれ、アミノ酸配列から成るCDR1、CDR2及びCDR3で構成される重鎖可変領域(VH)で構成される自由浮遊型のB細胞レセプターを提供する。
更なる実施の形態では、B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターを具体的に結合する単離された、又は抗原結合フラグメント、又はSEQ ID NO:1で構成される自由浮遊性の、又はそれらの抗原結合フラグメントが、SEQ ID NO:66、68及び9に記載されているアミノ酸配列から成るCDR1、CDR2及びCDR3で構成される軽鎖可変領域(VL)で構成される。
本発明はまた、(1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、又は(2)SEQ ID NO:1で構成されるフリーフローティング(SEQ ID NO:1で構成されるフリーフローティング)で構成される、(a)SEQ ID NO:60,62,64に規定されるアミノ酸配列で構成されるCDR1, CDR2, CDR3で構成されるVL及び(b)SEQ ID NO:66,68,9に規定されるアミノ酸配列で構成されるCDR1, CDR2, CDR3で構成されるVLを具体的に結合する、単離された、又は抗原結合フラグメントを提供する。
さらなる実施形態において、(1)リンパ球上に発現されるB細胞レセプターに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、B細胞レセプターが配列番号:1を含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント、または(2)配列番号:1を含む遊離抗体であって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号:60、62および64に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、2および3を含むVHと、それぞれ配列番号:66、68および9に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、2および3を含むVLとを含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。特定の実施形態において、抗原結合フラグメントは、scFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2、およびダイアボディからなるグループから選ばれる。
本発明はまた、(1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1を構成するB細胞レセプターに、(2)SEQ ID NO:1を構成するB細胞レセプターに、または(2)SEQ ID NO:1を構成する自由浮遊型の抗原断片が、SEQ ID NO:74に示されるアミノ酸配列を構成するVHを構成する、分離された抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントを提供する。
別の実施形態では、(1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1を構成するB細胞レセプターを具体的に結合する、単離された、又は抗原結合フラグメントは、(2)SEQ ID NO:76に記載されるアミノ酸配列を構成するVLを構成するSEQ ID NO:1を構成するフリーフローティング(フリーフローティング)を提供する。
特に、特定の実施例では、分離された抗原又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:74に記載されたアミノ酸配列からなるVHと、SEQ ID NO:76に記載されたアミノ酸配列からなるVLからなる。特定の実施形態においては、それの抗原結合フラグメントが人工化される。
一実施形態では、本発明は、重鎖CDR1が配列番号78に示されるアミノ酸配列、または配列番号78に示されるアミノ酸配列が2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含み、重鎖CDR2が配列番号80に示されるアミノ酸、または配列番号80に示されるアミノ酸が2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸を含み、重鎖CDR3が配列番号82に示されるアミノ酸配列、または配列番号82に示されるアミノ酸が2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含む、重鎖相補性決定領域(CDR)1、2および3を含む単離された抗体またはその抗体結合フラグメントを提供する。
さらなる実施形態において、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、L鎖CDR1、2および3をさらに含み、ここで、L鎖CDR1は、配列番号84に示されるアミノ酸配列、または配列番号84に示されるアミノ酸配列で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含み、L鎖CDR2は、配列番号86に示されるアミノ酸配列、または配列番号86に示されるアミノ酸位置で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含み、L鎖CDR3は、配列番号88に示されるアミノ酸配列、または配列番号88に示されるアミノ酸配列で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含む。
別の実施の形態では、本発明は、B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターを具体的に結合する、単離された、又はその抗原結合フラグメントを提供する。SEQ ID NO:1で構成され、また、自由浮遊性の、それでは、その抗原結合フラグメントは、それぞれSEQ ID NO:78、80及び82に記載されているように、アミノ酸配列から成るCDR1、CDR2及びCDR3から成る重鎖可変領域(VH)で構成される。
更なる実施の形態では、B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターを具体的に結合する単離された、又は抗原結合フラグメント、又はSEQ ID NO:1で構成される自由浮遊性の、又はそれらの抗原結合フラグメントは、それぞれSEQ ID NO:84、86及び88に記載されているアミノ酸配列から成るCDR1、CDR2及びCDR3から成る軽鎖可変領域(VL)で構成される。
本発明はまた、(1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、又は、(2)それを構成する自由浮遊型のマイクロソフトを、(a)SEQ ID NO:78,80,82に記載されたアミノ酸配列で構成されるCDR1, CDR2, CDR3で構成されるVH、及び(b)84,86及び88に記載されたアミノ酸配列で構成されるCDR1, CDR2及びCDR3で構成されるVLを具体的に結合する、(a)分離型の、又は抗原結合フラグメントを提供する。
さらなる実施形態において、(1)リンパ球上に発現されるB細胞レセプターに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、B細胞レセプターが配列番号:1を含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント、または(2)配列番号:1を含む遊離抗体であって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号:78、80および82に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、2および3を含むVHと、それぞれ配列番号:84、86および88に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、2および3を含むVLとを含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。特定の実施形態において、抗原結合フラグメントは、scFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2、およびダイアボディからなるグループから選ばれる。
本発明はまた、(1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1を構成するB細胞レセプターに、(2)SEQ ID NO:1を構成するB細胞レセプターに、あるいは(2)それを構成するSEQ ID NO:1を構成する自由浮遊型の抗原断片を具体的に結合する、(1)B細胞レセプターを特定的に結合する断片を提供する。SEQ ID NO:90に記載されるアミノ酸配列を構成するVHを構成する。
別の実施形態では、(1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターまたは(2)SEQ ID NO:1で構成されるフリーフローティング(SEQ ID NO:1で構成される)を具体的に結合する、孤立した、又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:92で規定されるアミノ酸配列で構成されるVLで構成される。
特に、特定の実施例では、分離された抗原又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:90に記載されたアミノ酸配列からなるVHと、SEQ ID NO:92に記載されたアミノ酸配列からなるVLからなる。
更なる実施の形態では、単離された、又は抗原結合フラグメントは、それぞれ、SEQ ID NOS:60、62及び64に記載されたアミノ酸配列を有するCDR1、2及び3を含むVH並びに、SEQ ID NOS:84、86及び88に記載されたアミノ酸配列を有するCDR1、2及び3を含むVLを含む。特に、特定の実施例では、分離された抗原又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:74に記載されたアミノ酸配列からなるVHと、SEQ ID NO:92に記載されたアミノ酸配列からなるVLからなる。
更なる実施の形態では、単離された、又は抗原結合フラグメントは、それぞれ、SEQ ID NOS:78、80及び82に記載されたアミノ酸配列を有するCDR1、2及び3を含むVH並びにSEQ ID NOS:66、68及び9に記載されたアミノ酸配列を有するCDR1、2及び3を含むVLを含む。特に、特定の実施例では、分離された抗原又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:90に記載されたアミノ酸配列からなるVHと、SEQ ID NO:76に記載されたアミノ酸配列からなるVLからなる。
特定の実施例において、記載された抗生物質又は抗原結合フラグメントは、人間化されている。
更なる側面において、本発明はワクチンを提供する。特に、x-ペプチド又はその誘導体(SEQ ID NO:1)は、インスリン-reactive T細胞を中和、不活性化、破壊、または異性化するためのウィンゲンとして使用することができる。
リンパ球のまれなサブセットはTCRとBCRを共発現し、T1Dに拡大する。代表的なドットプロットは、T1D(上部パネル)およびHC (下部パネル)被検者におけるゲートされたCD5+ CD19+電池の間のIgDとTCRの共表現を示している。数字は象限の割合を示す。グラフは累積データ(平均@SEM)です。各ドットは、一つのドナー、T1D(赤、n=16)、HC (ブラック、n=11)、*** P<0.001、**** p<0.0001、をシダックの多重比較試験によるTwo-way ANOVAで表す(図8も参照)。 リンパ球のまれなサブセットはTCRとBCRを共発現し、T1Dに拡大する。代表的なAMNIS画像は、3つのT1D被検者(n=32 DE電池)において、ゲートされた単一IgD +DEによるIgD、TCRおよびIgMの共式とB conおよびT con電池におけるそれらの微分式とを示している。BF、ブライト分野(図9も参照)。 リンパ球のまれなサブセットはTCRとBCRを共発現し、T1Dに拡大する。DE、Bcon、またはTcon電池によって異なる形で表現されたゲネスのヒートマップ。上段にセルの種類が表示されます。その後の3列は、ACTB、PPIA、およびUBBハウスキーピング遺伝子の発現を示し、その後、各セル型において優先的に発現される上位30の遺伝子が続く。色調はlog2(RSEM + 1)の遺伝子表現を示します。DEは、Bcon細胞とTcon細胞に欠けているか、低いかのどちらかである多くの遺伝子を差別的に表現していることに注意されたい。DEは、B細胞およびT細胞のマーカーの発現をそれぞれの細胞型と共有する。33個のDE(緑色)、20個のBcon電池、24個のTcon電池からの情報。 リンパ球のまれなサブセットはTCRとBCRを共発現し、T1Dに拡大する。ヒートマップは、それぞれのセル型TconまたはBconセルを有する、示されたリネージマーカーの共用式を示すDEを示す。 リンパ球のまれなサブセットはTCRとBCRを共発現し、T1Dに拡大する。ヒートマップは、Bcon電池およびTcon電池を有するCD3サブユニットを有するIgα (CD79a)およびIgβ(CD79b)の共用式を示す。CD247 is CD3zeta. リンパ球のまれなサブセットはTCRとBCRを共発現し、T1Dに拡大する。4つのDEにおけるBCRとTCRの再構築。Tcon電池とBcon電池の間にBCRとTCRの二重式はない。 TCR活性化DEは、その二重の表現型を維持し、MHCと共刺激分子をアップレギュレートする(図9、10、11も参照)。TCR活性化は、IgD+およびIgD-電池によるCD69のアップレギュレーションにつながる。左のドットプロットは、CD5+ CD19+細胞とB con細胞とT con細胞が、抗CD3/CD28(上位パネル)と、抑制されていない(下位パネル)文化に集まっていることを示している。ミドルドットプロットは、ゲートされたサブセットによるTCRとIgDの表現を示している。オーバーレイとグラフは、ゲートIgD+(赤色)とIgD-(ナビ青色)によってCD69式を示し、Tcon電池(緑色)、Bcon電池(青色)は活動文化と制御文化において示した。それぞれの点は、Tukeyの多重比較テストによるTwo-way ANOVAによる1つのドナー(n=5)、**** p < 0.0001を表しています。 TCR活性化DEは、その二重の表現型を維持し、MHCと共刺激分子をアップレギュレートする(図9、10、11も参照)。TCR活性化は、CFSE希釈によって決定されるように、IgD+およびIgD- DEサブセットとTcon電池の拡散を導く。開ヒストグラムは非刺激培養を示す。 TCR活性化DEは、その二重の表現型を維持し、MHCと共刺激分子をアップレギュレートする(図9、10、11も参照)。TCR活性化DEによるHLA-DRおよびDQのアップレギュレーション。Bcon電池は、制御に存在するが、活性化培養には存在しないことに注意されたい。グラフはHLA-DR (左)とHLA-DQ (右)のMFI (Mean ± SEM)を示す。それぞれの点は1人のドナー(n=4)を表しており、二元配置分散分析とシダックの多重比較検定により** p < 0.01であった。共チム化分子のアップレギュレーションについては図10を参照されたい。 TCR活性化DEは、その二重の表現型を維持し、MHCと共刺激分子をアップレギュレートする(図9、10、11も参照)。DEsは、反CD3/CD28刺激の7日後のIg同種フェノタイプを維持する。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。ベン図は、T1D#1、#2及び#3の患者におけるIgD+(赤色)及びIgD-(黄色) DE及びBcon電池(青色)によるVHのGen利用を示している。グラフは、各患者のBcon電池と比較して、IgD+またはIgD- DEによって使用された上位10 VH (またはT1D#2の場合はすべて7 VH)のゲインの割合を示す。矢印は、3人の患者の主にIgD+およびOODDEによって使用されたIGHV-04-b+遺伝子セグメントを示している。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。ベン図は、T1D#1、#2及び#3の患者におけるIgD+(赤色)及びIgD-(黄色) DE及びBcon電池(青色)によるVHのGen利用を示している。グラフは、各患者のBcon電池と比較して、IgD+またはIgD- DEによって使用された上位10 VH (またはT1D#2の場合はすべて7 VH)のゲインの割合を示しています。矢印は、3人の患者の主にIgD+およびOODDEによって使用されたIGHV-04-b+遺伝子セグメントを示している。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。ベン図は、T1D#1、#2及び#3の患者におけるIgD+(赤色)及びIgD-(黄色) DE及びBcon電池(青色)によるVHのGen利用を示している。グラフは、各患者のBcon電池と比較して、IgD+またはIgD- DEによって使用された上位10 VH (またはT1D#2の場合はすべて7 VH)のゲインの割合を示しています。矢印は、3人の患者の主にIgD+およびOODDEによって使用されたIGHV-04-b+遺伝子セグメントを示している。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。グラフは、3つのT1D被検者におけるDEおよびB con細胞におけるVH遺伝子1つあたりの突然変わりの絶対数を示している。各点は個々のVH遺伝子を表す。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。概略図は、x-クローノタイプのCDR3のオブシトおよび配列をもつVH(N1)D(N2)JH構成を示す。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。ベン図は、x-クローノタイプが3つのT1D被検者のB conセル間で共有される2つの(赤い)クローノタイプの1つであることを示している。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。ベン図は、HC#1におけるBcon(青色)のそれに匹敵するIgD+(赤色)およびIgD-(黄色) DEによる多様なVH遺伝子使用を示す。グラフは、OOBDEおよびBcon電池と比較して、OOBDEによって使用された上位10個のVH配列の割合を示している。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。3つのT1D被検者とHC#1におけるIGHV04-b +クローンタイプのCDR3配列の比較。*順番にギャップを示す。VH04-bおよびJH04-01*02は、すべての被検者でDEにより非常に節約されて使用されている。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。DE電池とBcon電池におけるVH遺伝子当たりの突然変わりの数。各点は1つのVH遺伝子を表している。 DEのIGHVレパートリーは、T1D被検者の1つのクローノタイプによって支配される(図12および表1、4、5、6および7を参照(図表は示されていない))。図式は、遺伝子型T1DとHCの末梢血中のxクローノタイプの検出に用いられるプライマーを示している。表は、配列比のプライマーを用いて、T1DおよびHC被検者のPBMC cDNAにおけるxクローノタイプの検出を示している。注x‐クローノタイプはDQ7+(DQ8のβ57D+アイソフォーム)で検出可能であるが、DQ8+とDQ2OOBHCでは検出できない。2本目のプローブでは、渋いリバースプライマーの設計が同様の結果をもたらした(表7は示されていない)。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。CDR3(x-Id)ペプチド(CARQEDTAMVYYFDYW) (配列番号:1)を2018年にロードしたHLA分子。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。Wangらのスーパーアゴニスト(SHLVEELYLVAGEEG) (配列番号:7)を2018年にロードしたHLA分子。HLAはシアン・マンガに、HLAはシルバー・マンガに、エピトープの残留物はタイプによって彩色されている:白色の水恐怖症、緑色の極性、青色、基本的な赤酸性。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。CDR3ペプチドおよびスーパーアゴニストのためのポリグリシンからエピトープへのミュートの結合親和性の変化。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。CDR3(x-Id)ペプチドとスーパーアゴニストのためのvdWと電気静電性(Coulomb)に親和性分解を結合する。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。Van der Waalsは、HLAとモレキュラーダイナミクス(MD)シミュレーションからのエピトープの間の相互作用エネルギーである。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。CDR3(x-Id)ペプチド(CARQEDTAMVYYFDYW) (配列番号:1) のためにHLA中に埋め込まれたエピトープ残基の割合(Wangら、2018年)。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。スーパーアゴニスト(SHLVEELYLVAGEEG) (配列番号:7)のためにHLA中に埋め込まれたエピトープ残基の割合(Wangら、2018年)。太字の順番は、テキストで議論されている「コアエピトープ」の順番です。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。CDR3ペプチドとHLAとの間の埋設塩ブリッジ部の詳細な構造 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。各残渣の平均変動(RMSF)。青色の基本残渣、赤色の酸性残渣、タン色のエピトープ背骨。 HLA-CDR3 ペプチド結合(また、図13参照)。CDR3ペプチド(明るい青)とスーパーアゴニスト(赤)の最も代表的なエピトープ構造の重ね合わせ、およびCDR3ペプチドのポケット6と7のチロシン残基が強調された。右、側面図、類似のP1、P4、P9一致を示しているが、他の箇所では大きな違いがある。 注:(図4C-4D)エラーバーは、6つのレプリカにまたがる標準的なエラーです。(図4E-4H)エラー・バーは、MDシミュレーションの最後の250nsを5つのセクションに分割することからの標準誤差である。 x-IdペプチドはCD4 T細胞を刺激する機能的なHLA-DQ8錯体を形成する(図14も参照)。代表的な銀色のSDSゲルは、安定なヘテロダイマーを形成するための水溶性DQ8への指摘ペプチドの結合を示す。矢印はそれぞれp/DQαβ二量体およびDQαおよびDQβ単量体を示す。この結果は、同様の結果を持つ3つの独立した実験のうちの1つから得られたものである。 x-IdペプチドはCD4 T細胞を刺激する機能的なHLA-DQ8錯体を形成する(図14も参照)。x-Id/DQ8複合体は、DQ8+T1D由来のCD4 T細胞の増殖を刺激する。代表的なドットプロットは、示されたペプチドDQ8錯体で刺激されたT1DまたはHC被験体からのPBMCの中で、ゲート化CD4 T細胞によるCFSE希釈を示す。数字は、ゲート付きCFSElow CD4 Tセルの割合を示しています。右側のドットプロットは、防DQ mAbによる拡散の抑制を示している。グラフは、3つのDQ8+ T1Dと3つのHC被検者(n=3)、*p < 0.05、およびSidakの多重比較試験による方法ANOVAの累積データを示している。 x-IdペプチドはCD4 T細胞を刺激する機能的なHLA-DQ8錯体を形成する(図14も参照)。x-IdペプチドはCD4 T細胞を刺激する機能的なHLA-DQ8錯体を形成する(図14も参照)。オーバーレイは、各被検者群におけるゲートCFSE lowCD4 Tセル(赤線)対CFSE hi CD4 Tセル(緑線)によるCD69のアップレギュレーションを示している。数字は、CFSElow CD4 Tセルの割合(平均 × SEM)を示しています。 EBV不死化クローンを用いたDEsによるBCRとTCRの二重式の検証。概略は、lymphoblastoid cell line (x-LCL)の生成と、2つのアプローチ:1を用いたその細胞のエンコード化された抗菌の分析を描写している。選別された単セル(n= 7細胞)からのクローニングで、2つの(IGL1、IGL2)L鎖の1つと対合するx-クローン型の発現を共有する2つの抗体が得られた。2.x1.1クローン化を生成するための制限希釈の利用およびBCR (IgL1/x-クロノタイプ)およびTCRαβの転写産物を増幅するためのPCRクローニングの利用、続いてVDJ利用およびCDR3配列を同定するためのIMGTV-Questの利用。クローン化されたレセプターのヌクレオチド配列を示す。 EBV不死化クローンを用いたDEsによるBCRとTCRの二重式の検証。天然生産されたx-mAbNは、T1DからCD4 T細胞を刺激する。クムマシーブルー染色ゲルはx1.1クローン化によるxmAbNの産生を示す。矢印は、x-mAbN (IgM同位体)の重くL鎖を指している。代表的なプロットは、水溶性x-mAbNによって活性化されたCD4 T細胞によるCFSEの希釈を示す。数字は、CFSElow CD4 Tセル(n=3)の割合(平均@SEM)を示す。 組換えx-mAbRはインスリン反応性CD4 T細胞を断面活性化する。図式は、単一のDE電池からのx-mAbRの光および重鎖の増幅、クローン化およびCDR3配列を、IgG-AbVecおよびIgid-AbVec表現ベクトルを用いて描写したものである。 組換えx-mAbRはインスリン反応性CD4 T細胞を断面活性化する。銀色に染めた縮小ジェルは、x-mAbRの重量およびL鎖(矢印)を示す。代表的なプロットは、固定されたx‐mAbRで刺激された活性化されたCD4 T細胞によるCFSEの希釈を示す。数字は、CFSElow CD4 Tセル(n=5)の割合(平均@SEM)を示す。 組換えx-mAbRはインスリン反応性CD4 T細胞を断面活性化する。結合抑制は、x-Idとミモトープ反応性CD4 Tセルの重複を示す。x-mAbRは、x-Idまたはミモトープで活性化されたCD4 Tセルへのmim-tetおよびx-Id-tetの結合を抑制する。PBMCは、x-Idまたはミモトペプチドが存在しない状態で7日間の文化であった。トップ・ドット・プロットは、x-Id-ペプチドによって拡張されたCD4 T細胞がx-Id-tetだけでなくmim-tetによっても検出されることを示している。相互に、ミモトープペプチドによって拡張されたCD4 T細胞は、x-Id-tetとmim-tetの両方によって検出される。CLIP-Tetを用いて背景染色を測定し、未刺激培養物中のx-Id-tet+またはmim-tet+により前駆体頻度を同定した。底部の点プロットは、x-mAbRで細胞とプレインキュベートすると四量体染色が阻害されることを示している。左のグラフは、x-Idペプチド刺激培養物の異なる培養物中の四量体+ CD4 T細胞の周波数を示す。右のグラフは、mimoptopeで刺激した培養物のデータを示している。各ラインは1つのドナーを表しています。x-mAbRによるブロックは量体結合を抑制した(n =3); *P<0.01, *** P<0.001, **** p < 0.0001、Tukeyの多重比較試験による方法ANOVAによるブロック。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。FSC-Height対FSC-WidthおよびSSC-Height対SSC-Widthプロットを用いて、生きた細胞はゲート化され、ダブルストは除外された。我々の分析は、以下のコントロールを用いても含む。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。汚染されていない試料中にDEは検出されず、オートロフルエンスのための特殊性制御を提供した。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。Fluorescence-Minus One (FMO)分析は、CD5、TCR、IgDおよびCD19に対する非特定信号をそれぞれ示さない。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。PE-IgG1およびAF-488-IgG2a同型制御装置を用いて、非特定IgDまたはTCR信号を検出しなかった。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。汚染中のFC封鎖を含むことは、DEの検出を変えなかった。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。ダンプチャネルを使用したCD11b+単細胞の排除は、DEの検出を変えなかった。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。ドットプロットは、上記の制御を使用したDEの検出を示す。 異なる特定性制御を用いたDEの検証、図1に関連する。単一細胞懸濁液を、所定濃度の指示された蛍光色素結合抗体で氷上で20分間表面染色した。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。DEがB細胞とT細胞の間の非特定の共役形成の結果であることを除外するために、我々は、反CD3/CD28刺激の存在またはなしで単独または一緒に分類し、一緒に栽培した。二重発現因子は検出されなかった。2つの実験と4つの複製文化から同様の結果が得られた。また、図12Aおよび図12Bも参照されたい。 DEsは、図1および図2に関連する、TおよびB細胞および機能的BCRの共同表現マーカーである。代表的なAMNIS画像は、DEによりCD40とCD40Lの共表現と、BconおよびTconセルによるそれらの微分表現を示している。47個のDE電池からも同様の結果が得られた。 DEsは、図1および図2に関連する、TおよびB細胞および機能的BCRの共同表現マーカーである。代表的なAMNIS画像は、DEおよびTcon電池によるCD28の表現を示すが、Bcon電池は示さない。11個のDE電池からも同様の結果が得られた。 DEsは、図1および図2に関連する、TおよびB細胞および機能的BCRの共同表現マーカーである。代表的なドットプロットは、ゲートIgD+およびOODDEが、制御としてTcon電池を使用するCD4+、CD8+、およびCD4- CD8-二ダブルネガティブ(DN)サブセットで構成されることを示す。グラフは累積データ(Means @ SEM)、n=5を示している。 DEsは、図1および図2に関連する、TおよびB細胞および機能的BCRの共同表現マーカーである。代表的なAMNIS画像は、CD4、CD8または両方の欠如の単DE電池による表現を示している。42個のDE電池からも同様の結果が得られた。 DEsは、図1および図2に関連する、TおよびB細胞および機能的BCRの共同表現マーカーである。オーバレイプロットは、陰性対照としてBcon電池を用いて、Tcon電池と比較して、IgD+およびIgD- DE電池によってゲートされたCD3の表現を示す。グラフは、統計的に有意ではないが、3人のドナーからの累積データ(平均@SEM)を示している。 DEsは、図1および図2に関連する、TおよびB細胞および機能的BCRの共同表現マーカーである。代表的オーバーレイは、防IgM刺激後の示された時点で、異なるセルタイプのCD79aリン化を示す。数字は、MFI、Bcon(青色)、OOCDE(赤色)、IgD-(ナビ青色)、Tcon電池(緑色)を示します。グラフは累積データ(平均@SEM, n=3)である。*p < 0.05, Sidakの多重比較検定による二元配置分散分析で*** p < 0.001。時間ゼロに対する意味。 DEs coexpress pan markers of B細胞とT細胞、特にCD3/CD28刺激に対するBセルマーカーのアップレギュレーション、FIGS. 2に関連する。 T1D被検者からのPBMCを、不動化抗CD3/CD28 mAbsによる7日間の刺激の直後または直後の指摘分子の表出のために分析した。ヒストグラムは、示された分子を元生体内および7日間の刺激後に代表的に表したものである。グラフは示された分子のMFIを示している。それぞれの記号は、4つの独立した実験からの1つの被検者(n=4)を表している。**p < 0.01, *** p < 0.001 by Two-way ANOVA with Sidak's multiple comparison test. 注、Bcon電池は刺激培養ではあまりにも少なく、したがって活性培養では検討されなかった。 DEs coexpress pan markers of B細胞とT細胞、特にCD3/CD28刺激に対するBセルマーカーのアップレギュレーション、FIGS. 2に関連する。 T1D被検者からのPBMCを、不動化抗CD3/CD28 mAbsによる7日間の刺激の直後または直後の指摘分子の表出のために分析した。ドットプロットは、DEsのTCR活性化サブセットが式CD45RAを維持するが、CD45ROには切り替わらないことを示す。ゲートTcon電池の大部分は、CD45ROを表していることに注意されたい。代表的な結果は、同様の結果を持つ3つの独立した実験のうちの1つである。 PMA/イオノマイシンまたはTCR刺激に反応して、DE細胞の急速なサイトキン製造サブセットは、図2に関連する。PMA/イオノマイシン刺激に関連して、DE細胞によるIL-10およびIFN-imの顕著な細胞内製造を誘発する。上のパネル、左側のドットプロットは、PMA/ionによるPBMCの4時間の運動後に、B conまたはT con電池とCD5 + CD19+電池のゲートを示す。右ドットプロットは、ゲートCD5+ CD19+電池のDE(TCR+)およびTCR-サブポピュレーションへの分割を示す。中パネルは、細胞内IL-10の各サブセット別の表現を示している。下段のパネルは、それぞれのサブポピュレーションによる細胞内IFN-γの発現を示す。数字は、象限内のパーセンテージを示す。グラフは、累積データ(平均@SEM)を示しています。各点は1被検者(n=3)、*** p < 0.001、**** p < 0.0001、をTukeyの多重比較試験による一方通行のANOVAで表す。未刺激培養の細胞はサイトカインを産生せず、陽性細胞と陰性細胞の境界を描く象限を描くのに用いた。 PMA/イオノマイシンまたはTCR刺激に反応して、DE細胞の急速なサイトキン製造サブセットは、図2に関連する。TCR活性化は、二次PMA/刺激を必要とせずに、DEによってIL-10およびIFN-imの表現を誘発する。T1Dドナー由来のPBMCs(n= 3)を、固定化抗CD3/CD28 mAbsの存在下(刺激)または非存在下(制御)で7日間培養し、PMA/イオンによる4時間刺激なしまたは後に細胞内サイトカイン分析について分析した。代表的なドットプロットは、PMA/イオンによる二次刺激がない状態で、反CDR3/CD28活性化DE細胞によるIL-10およびIFN-imの細胞内表現を示す。グラフは、累積データ(平均@SEM, n=3)を示している。各点は1被検者、n=3; *p <0.05を一元配置分散分析、チューキーの多重比較検定により表す。 PMA/イオノマイシンまたはTCR刺激に反応して、DE細胞の急速なサイトキン製造サブセットは、図2に関連する。TCR活性化は、二次PMA/刺激を必要とせずに、DEによってIL-10およびIFN-imの表現を誘発する。T1Dドナー由来のPBMCs(n= 3)を、固定化抗CD3/CD28 mAbsの存在下(刺激)または非存在下(制御)で7日間培養し、PMA/イオンによる4時間刺激なしまたは後に細胞内サイトカイン分析について分析した。代表的なドットプロットは、PMA/イオンによる二次刺激の後、防CDR3/CD28活性化DE細胞によるIL-10およびIFN-imの細胞内表現を示す。注、PMA/刺激はTCR刺激Tcon細胞によるIFN-im生成を強化するが、それは依然として重要なIL-10を生成することができなかった。グラフは、累積データ(平均@SEM)を示しています。各点は1被検者、n=3; *p <0.05を一元配置分散分析、チューキーの多重比較検定により表す。 PMA/イオノマイシンまたはTCR刺激に反応して、DE細胞の急速なサイトキン製造サブセットは、図2に関連する。TCR活性化は、二次PMA/刺激を必要とせずに、DEによってIL-10およびIFN-imの表現を誘発する。T1Dドナー由来のPBMCs(n= 3)を、固定化抗CD3/CD28 mAbsの存在下(刺激)または非存在下(制御)で7日間培養し、PMA/イオンによる4時間刺激なしまたは後に細胞内サイトカイン分析について分析した。代表的なドットプロットは、刺激されていない培養におけるゲートされた細胞型による細胞内サイトキンの製造を示している。グラフは、累積データ(平均@SEM)を示しています。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。ハイスループット解析のためにDEを分離するために使用される戦略に関連する。ドットプロットは、リンパ球のゲーティング、ダブレットおよび死細胞の排除、続いてCD5およびCD19式を使用して、生きた一重項をBcon, Tcon細胞およびCD5+CD19細胞の間のTCR式に基づいて同定されたDE細胞に分割することを示す。DE電池はさらにIgD+とIgD-サブセットに分割され、それに従ってソートされた。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。ドットプロットは、ソート済みDE、BconおよびTcon電池の純度検査を示す。IgD-細胞の純度は、細胞限定のため試験されなかった。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。DE細胞によるTCRVitaの使用を制限した。ベン図は、DE電池のIgD+(赤色)およびIgD(黄色)サブセットと、T1D#1、#4、および#5からのTcon電池(緑色)のサブセットとによるTCRBVβの使用法をそれぞれ示している。グラフは、3つの被検者のそれぞれのIgD - DE電池とT con電池の割合と比較して、IgD +DE電池が使用するTCRBVの上位10個の遺伝子の割合を示している。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。DE細胞によるTCRVitaの使用を制限した。ベン図は、DE電池のIgD+(赤色)およびIgD(黄色)サブセットと、T1D#1、#4、および#5からのTcon電池(緑色)のサブセットとによるTCRBVβの使用法をそれぞれ示している。グラフは、3つの被検者のそれぞれのIgD - DE電池とT con電池の割合と比較して、IgD +DE電池が使用するTCRBVの上位10個の遺伝子の割合を示している。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。DE細胞によるTCRVitaの使用を制限した。ベン図は、DE電池のIgD+(赤色)およびIgD(黄色)サブセットと、T1D#1、#4、および#5からのTcon電池(緑色)のサブセットとによるTCRBVβの使用法をそれぞれ示している。グラフは、3つの被検者のそれぞれのIgD - DE電池とT con電池の割合と比較して、IgD +DE電池が使用するTCRBVの上位10個の遺伝子の割合を示している。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。DE細胞によるTCRVitaの使用を制限した。ベン図は、DE電池のIgD+(赤色)およびIgD(黄色)サブセットと、T1D#1、#4、および#5からのTcon電池(緑色)のサブセットとによるTCRBVβの使用法をそれぞれ示している。グラフは、3つの被検者のそれぞれのIgD - DE電池とT con電池の割合と比較して、IgD +DE電池が使用するTCRBVの上位10個の遺伝子の割合を示している。ベン図およびグラフは、HC#1におけるIgD+細胞において使用されるTCRBV使用および7つのTCRBV遺伝子全て、ならびにHC#1におけるIgD-およびBcon細胞におけるそれらの割合を示す。T1D被検者でB con細胞によって使用されるトップ10のVH遺伝子には、IGHV04-b +クローノタイプは含まれていない。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。グラフは、適用可能な場合、3つのT1DおよびHC#1(図12J)におけるDE電池のIgD+(赤色)およびIgD-(黄色)サブセットとTcon電池(青色)のサブセットとの割合と比較して、Bconにおける上位10個のVHジェネントの頻度分布を示す。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。グラフは、適用可能な場合、3つのT1DおよびHC#1(図12J)におけるDE電池のIgD+(赤色)およびIgD-(黄色)サブセットとTcon電池(青色)のサブセットとの割合と比較して、Bconにおける上位10個のVHジェネントの頻度分布を示す。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。グラフは、適用可能な場合、3つのT1DおよびHC#1(図12J)におけるDE電池のIgD+(赤色)およびIgD-(黄色)サブセットとTcon電池(青色)のサブセットとの割合と比較して、Bconにおける上位10個のVHジェネントの頻度分布を示す。 分類法、DEのTCRBVレパートリーのハイスループット解析、およびBcon細胞によってトップ10のIGHVに使用され、図3に関連する。グラフは、適用可能な場合、3つのT1DおよびHC#1(図12J)におけるDE電池のIgD+(赤色)およびIgD-(黄色)サブセットとTcon電池(青色)のサブセットとの割合と比較して、Bconにおける上位10個のVHジェネントの頻度分布を示す。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。HLA健康制御(CARQERFWSGPLFDYW) (SEQ ID NO:1)エピトープ構造。HLAはシアン・マンガに、HLAはシルバー・マンガに、エピトープの残留物はタイプによって彩色されている:白色の水恐怖症、緑色の極性、青色、基本的な赤酸性。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。HLAエピトープ錯体の原子位置(RMSD)のシミュレーション時間にわたるHLA‐エピトープ根平均二乗偏差。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。HLA RMSD値のHLAは、健全な制御エピトープのためのHLA鎖に不安定性を示す。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。HLA鎖は、健全な制御エピトープのためのHLA鎖に不安定性を示す。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。Epitope RMSD。RMSDプロットは、背骨原子の1ns実行平均です。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。顕著なHLA-エピトープ相互作用。CDR3ペプチドのチロシン部位6(オレンジ)は、この強い芳香性のポケット内でHLAのPhe11、Tyr30、およびTrp61との相互作用を数多く作っている。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。顕著なHLA-エピトープ相互作用。CDR3ペプチドのチロシンサイト7(オレンジ)は、CDR3ペプチドの最も高い%接触面積を持つ。ここでは、水晶、芳香性のリングはVal67とTyr47と大きな接触をし、一方、水酸基はThr71とArg70に接触する。 HLAエピトープRMSDおよび構造、図4に関連する。顕著なHLA-エピトープ相互作用。すべてHLA上スーパーアゴニストのチロシン部位3(オレンジ)上で、スーパーアゴニストの接触面積が最も高い%である。ここでチロシンはHLA上のPhe54、His24、Tyr22、Tyr9、およびPhe58を含む他の芳香族残基と広範に接触する。HLAはシアン・マンガ、HLAはシルバー・マンガ、CDR3ペプチドの背骨はマゼンタ、残渣物は白色の疎水性、緑色の極性、青色の種類によって示されている。 ソリジオトープペプチド(x-Id)は、図5に関連するHC、被検者ではなく、T1DからCD4 T細胞を刺激する。T1DおよびHC被検者から分離されたCFSE標識PBMCを、7日間、指摘ペプチドの有無にかかわらず栽培した。試料はFlowJoによって染められ、獲得され、分析された。CD4 T細胞をゲートし、分裂した(CFSElow T細胞)の割合を測定した。ドットプロットは、活性化されたCD4 TセルによるCFSEの2つのグループの代表的な希釈を示しており、数字はCFSElow CD4 Tセルの割合を示している。Anti-DQ8 mAbは、x-Idまたはミモトープ(2つの最も強い類似物質)に反応して、拡散を抑制した。抗DR遮断は増殖を阻害しなかった(データは示さず)。グラフは累積データ(平均@SEM)です。すべてのペプチドは、HCs. n= 4/被検者群と比較して、糖尿病誘発性被検者からの有意な増殖を誘導した*2元配置分散分析とシダックの多重比較検定によりp<0.05。HC#1のDEからのh-Idペプチドは、T1DまたはHCsからCD4 T細胞の拡散を引き出さなかったことに注意されたい。 ソリジオトープペプチド(x-Id)は、図5に関連するHC、被検者ではなく、T1DからCD4 T細胞を刺激する。T1DおよびHC被検者から分離されたCFSE標識PBMCを、7日間、指摘ペプチドの有無にかかわらず栽培した。試料はFlowJoによって染められ、獲得され、分析された。CD4 T細胞をゲートし、分裂した(CFSElow T細胞)の割合を測定した。オーバーレイは、3つの被検者および3つの独立した実験からのCFSEhi不拡散(緑) CD4 Tセルに対する、ゲートされたCFSE低Tセル(赤線)によるCD69のアップレギュレーションを示した。数字は、CFSElow CD4 Tセルの割合(平均@SEM)を示す。
本発明は、これらが変動する可能性があるため、ここに記載される特定の方法及び成分等に限定されないことが理解される。また、本発明で使用される用語は、特定の実施例のみを記述する目的で使用されており、本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の参照を含むことに留意されなければならず、したがって、例えば、「タンパク質」への参照は、1つまたは複数のタンパク質への参照であり、当業者に公知のその等価物を含む。
特記しない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実践又は試験において、本発明に記載されているものと同等または同等の方法及び材料を使用することができるが、特定の方法、装置、及び材料が記載されている。
ここに引用されるすべての出版物は、すべての学術論文、書籍、マニュアル、公開特許出願および発行特許を含む参考文献によってここに組み込まれている。また、明細書、例、特許請求範囲に使用されている特定の用語及びフレーズの意味を提供する。本定義は、性質限定的なものではなく、本発明の特定の側面をより明確に理解するのに役立つものである。
本発明は、少なくとも部分的には、適応性細胞のT細胞とB細胞への分裂が絶対的であるというパラダイムを破る、予期せぬ自己反応性細胞の集団を識別することに基づいている。これらのリンパ球は、TCRおよびBCRの共発現、ならびにB細胞およびT細胞の両方の系統マーカーのために、dual expresser(DE)と称される。
より具体的には、1型糖尿病(T1D)被検者の末梢血中のDEの分析により、これらの患者でクローン的に拡大されるBCRの重鎖にコードされている、これまで知られていなかった新生抗原が明らかになった。このネオ抗原の発見は、インスリン反応性CD4 T細胞がどのようにしてプライミングされるかを説明することができた。これは、T1Dの最も重要であるが、あまり理解されていないアスペクトの1つである。一方で、T1Dの開発は、アラニン(β57D■)によるアスパチック酸(D)に代わるHLA‐DQ(DQ8およびDQ2)のβチェーンのβ57位置において、T1D患者の～90%において、多型と密接に結びついている(中山ら、2015)。一方、一次T1D自己抗原であるインスリンB:9-23ペプチド(SHLVEALYLVCGERG) (配列番号:16)の天然にプロセシングされたエピトープは、これらの対立遺伝子に対する結合能が低く、強力な自己抗原である。このパラドックスを説明するための努力は、これらのDQ対立遺伝子が負に荷電した抗原性ペプチドが9位(P9)およびP1位(ChangおよびUnanue, 2009)に存在するという事実に中心が置かれている。しかし、自然に処理されたインスリンB:9-23ペプチドは、P1およびP9の(GまたはR)に非酸性残渣(VまたはA)を置く。これは、DQ分子への結合が悪いことの理論的根拠を提供する。したがって、翻訳後修飾は、強力なインスリンエピトープを生成する機構として示唆されている。この仮説の保持体、P9のアルギニン(R)をグルタミン酸(R22E)で置換すると、天然インスリンB:9-23(Wangら、2018)よりも100倍強力なミモトープを生成する。さらに、R22EとP1位置でのA14E置換を組み合わせると、現地のインスリンB:9-23(Wangら、2018)より約1000倍強力なスーパーアゴニストを生成する。しかしながら、このような変化を有するインスリンペプチドは、生体内で確認されていない。ここに述べたように、我々は、T1D被検者でクローン的に拡張されたDEのイディオタイプにエンコードされるDQ8の最適アンカー残基を持つ強力なネオ抗原(x-Idペプチド)を同定した。一致して、合成されたx-Idペプチドは安定なDQ8錯体を形成し、T1D由来の自己反応性CD4 T細胞を強力に刺激するが、健常対照者では刺激しない。さらに、x-クロノタイプ-ベアリングmAbはCD4 T細胞を刺激し、CD4 T細胞へのインスリン-量体結合を阻害した。まとめると、本発明は、T細胞とB細胞の区分化が絶対的なものではなく、このパラダイムの違反者が、自動免除の推進に関与し得ることを実証している。
従って、一側面において、本発明は、T1D中の自己反応性T細胞を検出し活性化するために使用することができる単離された抗菌を記載する。特定の実施形態では、それの抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:28からなる重鎖を構成する。更なる実施の形態では、抗原結合フラグメントは、さらにSEQ ID NO:30からなるライトチェーンを構成する。抗原結合フラグメントはさらに、SEQ ID No:32からなるライトチェーンを構成することができる。他の実施形態では、抗原結合フラグメントはSEQ IDNO:1を含む。
別の側面では、本発明は、T1Dに見られるが、健全な制御ではない特定のBCR配列を識別するのに有用な診断方法及び組成を提供する。特定の実施形態では、PCRプローブを用いて危険にさらされている個人を特定することができる。
別の側面において、本発明は、T1D関連BCRを有するX電池を標的とし、T1Dの発達を防止し、T1Dの緩慢又は逆の疾患進行の初期段階で個人を治療するために、同一配列の自由浮遊性Absを有するX電池を標的とする治療様式として、生物学を提供する。特に、本発明は、病原性細胞のユニークな集団を検出し除去するために使用することができるx-mAbに対するイディオタイプ抗毒剤を提供し、それゆえ、この療法から利益を受ける可能性がある確立されたT1Dを有する人々又は被検者のT1Dの予防において、また、島交換又は再生療法を受ける人々において使用される。
I.X細胞の検出
本発明は、周辺血液単核細胞(PBMCs)を含むが、それに限らない、生物試料中のx細胞を検出する方法を提供する。X電池はT電池受容体(TCR)とB電池受容体の発現に基づいて同定した。X電池はx-Id (SEQ ID NO:1)からなる。特定の実施例において、x電池は、SEQ ID NOS:1、44及び46を含むVH、並びにSEQ ID NOS:38、40及び42を含むVLからなる。X電池は、SEQ ID NO:28に規定されるVHとSEQ ID NO:30または32に規定されるVLから成り、X電池はさらにSEQ ID NOS:48、50および52から成るTCRアルファとSEQ ID NOS:54、56および58から成るTCRベータから成る。ある実施例では、TCRアルファはSEQ ID NO:33を、TCRベータはSEQ ID NO:34を含む。同一セル上のBCRおよびTCR分子の両方の存在は、TCRのみを発現する従来のT細胞およびBCRのみを発現するB細胞からX細胞を区別することができる。特定の実施形態では、分析は、マルチカラーフローサイトメーター、AMNISマシンを使用するフローサイトメトリーイメージング、および単セルRNA-seq (scRNA-seq)を使用する単セルレベルで実施される。
フローサイトメトリーとAMNISのために、この方法は、X細胞を従来のB細胞およびT細胞から識別し区別するために、TCR、IgD、CD19、CD5に対するフッ素クローム結合単クローン抗生物質のカクテルを含んでいる。加えて、IgM、IgG、IgAに対する抗毒素および表面コスティミュレーター分子が本書に記載されている。
scRNA-seqについては、上述のように、単一X-細胞をその表面表現型に基づいて仕分けし、TおよびB-細胞と比較してトランスクリプトーム解析のために被検者とする。特定の実施において、FlowJOは、X細胞の存在、頻度および表現型を分析するために使用される。
A.PBMCの整備
具体的な実施の形態では、単セルPBMC吊り下げを以下のように準備することができる:
1.円錐管にPBSを入れて、少なくとも1:1まで希釈した血液試料を採取する。
2.希釈した試料の下に、元の試料体積と同じ量のFicollを置く。
3.制動OFFで室温で400 x g で20分間セントリフュージします。
4.PBSとFicoll層の境目にあるPBMCを新鮮なチューブに収穫する。
5.チューブにPBSを充填して電池を洗浄する。
6.300-400 x gで、2-8℃で4-5分間、電池を中心に分岐させます。上澄液を捨てる。
7.セルペレットを適切な量のフローキトメトリー貯留緩衝液または選択の緩衝液に再汚染し、細胞数および生存性分析を実施する。
8.Step 4のように中心核分裂電池は、最終電池濃度が1×107電池/mlになるように、適切なフローキトメトリー貯留バッファまたは緩衝液を適当な量で再費やします。
B.X細胞の検出と表現
別の実施形態では、X電池を検出し、以下のように表現することができる:
1.セルサスペンション(106 セル)の100-uLアリコットをチューブに配布する。
2.(任意)特定のFcを介在させない相互作用を遮断するには、1チューブのPBMCにつき2.5ugのBlockを加え、室温で10分間インキュベートする。
3.指示されたフッ素凝縮抗剤(APC-CD5、BV421-CD19、FITC-TCR、PE-IgD)の所定の最適濃度を細胞に加え、氷上で光から保護するために20分間インキュベートする。
4.2回、Stain Buffer 2-ml(チューブ用)で洗う。300g(5分間)のセントリフュージセル。
5.細胞ペレットから上清を慎重に穿刺液(チューブ)するか、反転してブロットします(チューブの場合)。
6.チューブをタップしてセルペレットを緩めます。
7.Stain Buffer の0.5ml(チューブ用)体積のセルペレットを再度ペンにします。
8.フローサイトメトリーで汚れた細胞サンプルを分析します。
9.収集した標本(5 x 10 5 ～1 x 10 6 ライブイベント)は、単色の色合いを使用して適切に補正されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲート、及びグラフィック表示を行った。二重線は、SSC高さ対SSC幅およびFSC高さ対FSC幅プロットを用いた分析から除外した。
10. 3つのタイプの特殊性制御が用いられた。まず、単色のサンプルを使用して補償を適切に設定しました。蛍光マイナス1(FMO)および同型制御を、正電池を適切にゲートし、象限を設定するために使用した。
11.第3に、試料中の正および/または負のセル[従来のBセル(Bcon)および/またはTセル(Tcon)]の比較を、内部制御として使用した。
12.適宜、刺激追加の対非刺激追加は、さらなる生体情報制御を提供した。
C.ゲーティング戦略
特定の実施において、ゲーティング戦略は、以下を構成する:
1.細胞はまずFSC/SSCパラメータを用いて厳密にゲートし、次に上記の状態法を用いてダブル排除した。
2.ゲートされたリンパ球は、CD5およびCD19式に基づいて3つの異なるT細胞集団において分離された。
(i)CD5-CD19+(Bconセル)
(ii)CD5陽性CD19陽性(CD5陽性B細胞性)
(iii)CD+CD19(Tcon電池)
3.その結果、CD5+CD19-集団では、BCRとTCRを共表現する細胞が主に見られた。これらの新しい(DE電池)二重式電池を同定するために、CD5+CD19+電池サブセットにゲートを当て、TCRとIgDの式を調べた。
4.CD5+CD19集団の中では、大多数がIgDを表し、フェノタイプ的にDE電池はCD5+CD19+TCR+IgD+電池と同定され、この主要な電池サブセットはIgD+ DE電池と呼ばれている。
5.しかしながら、いくつかのDE電池は、IgD(CD5+CD19+TCR)であり、このマイナーな電池サブセットは、IgDDE電池と呼ばれる。
6.IgD+ DE電池はIgM (IgD+IgM+)も発現したが、IgDDE電池はIgG+電池を含み、IgD+サブセットはクラススイッチDE電池を示すことを示唆した。
II.X細胞のin vitroでの拡大
更なる実施の形態では、本発明は、X細胞の体外展開のための方法を提供する。この方法には、迅速な選別フローサイトメトリーの使用、不妊チューブの表面汚染の使用、および増殖因子を補完した完全組織栽培におけるX細胞の選別が含まれる。
III.組み換えおよび天然製造されたx-mAbの製造
また、本発明は、組換え及び自然発生のx-mAbの製造方法を提供する。この方法は、上述のようにX細胞を分類し、エプスタインバーウイルス (EBV)を用いてそれらを不滅化する。不死化X電池はIgMアイソタイプのx-mAbを自発的に分泌する。秘密化された抗物質はSDS頁と市販のキットを用いて同定した。市販されているキットは、秘密の抗物質を浄化するために使用することができる。
x-mAbは、単一のX電池から軽い鎖と重い鎖をIgGベクトルにクローンすることによって生成された。軽い鎖と重い鎖を表すベクトルは、IgG同種のベアリングでx-mAbを秘密にする293A電池を共トランスフェクトするのに用いられる。秘密性の抗物質は、SDS頁と市販のキットを用いて同定される同質性を用いて特徴づけられる。
IV.islet-Reactive T細胞を刺激し検出するためのx-mAbの使用
更なる実施形態において、本発明は、島に反応するT細胞を刺激し検出するためのx-mAbの使用方法を提供する。x-mAbは、24ウェルプレートでCD4 T細胞を刺激するために使用することができる。x‐mAbをPBMCsに加え、表面抗原CD69のアップレギュレーションとCFSE希釈法で測定した拡散を測定してT細胞活性化を検討した。
x-mAbは、インスリン自己抗原反応性T細胞を識別する能力を、結合インスリン-HLA-DQ8テトラマーを遮断する能力によって決定することができる。加えて、T1D患者由来のPBMCのx‐mAb刺激はin vitroでのインスリン反応性T細胞の拡大をもたらす。これはインスリン-HLA-DQテトラマーを用いて決定される。
特定の実施形態では、x-mAbは、フローサイトメトリーを使用することによって特定のT細胞を検出するために使用される。X細胞は、PBMCを染めるのに使われ、二抗体抗ヒト・イムグロブリン・バイオレンスは、x-mAbによって認識されるT細胞を検出するのに使われる。
V.T1Dリスク判定のためのHLA-DQのジェノタイピング
本発明はまた、x-mAbを有する個々のT1Dの危険を決定するためのHLA-DQのジェノタイピング法を提供する。特定の実施の形態では、x-mAbは、ベータ鎖の57の位置のベータ鎖中の単一のアミノ酸に傾向があるHLA-DQ8とは異なるHLA-アレルを持っている個々に存在するので、PCRプローブを用いて危険にさらされている。DQ7を保有する個体は、T1Dと関連せず、この位置にアスパラギン酸を有するが、素因となるDQ8対立遺伝子を保有する個体は、この位置に非アスパラギン酸を有する。したがって、T1Dのリスクのスクリーニングには、x-mAb陽性の個人における遺伝子型HLA分子が関与するであろう。
VI.X-クロノタイプの存在に関するスクリーニング
代替の実施の形態では、本発明は、Xクローノタイプの存在のために末梢血をスクリーニングするためにPCRプローブを使用する方法を提供する。一実施の形態では、本方法は、標準的な方法を用いてPMBCからRNを抽出し、RT-PCRを用いて、市販のキットを用いてRNをcDNAに変換することを含む。
1型糖尿病に関連するX細胞のクローノタイプを検出するために、もし存在するならば、プライマーはPCRを用いて重鎖を増幅するのに用いられる。PCR製品を増幅し、1.2%Agarage gelで400bのバンドサイズを可視化した。
特定のX中心クローノタイプの存在を確認するために、切断されたバンドを配列決定し、ハウス解析ソフトと国立バイオテクノロジー情報IgBlastサーバ(免疫遺伝学サーバ)を用いてそのアイデンティティを確認した。
A.逆転写(RT)-PCR
RT‐PCRについては、製造者の指示に従い、RNeasy blood mini kit (Quigen)を用いて新鮮なPBMCからのRNを抽出し、次に濃度と純度のためのNanoDrop(ND‐1000分光光光度計)測定を行った。キットプロトコルに従い、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermofisher)を用いて、精製された約1mmugの純化したRN上で逆転転写(RT) PCRを行い、cDNAを調製した。簡単に述べると、RNAを5X反応混合物、ランダムヘキサマープライマー、およびRevertAid M-MuLV RT (200 U/μL)酵素混合物と共に、最終容量20μL中、25oCで10分間インキュベートし、続いて42oCで60分間インキュベートし、70o Cで5分間不活化した。正(GAPDH比プライマー)と負(RT分子のない混合反応)反応を用いて、cDNA合成工程の結果を検証した。
B.Primer DesignとPCRの反応
プライマー設計とPCR反応のために、2X QIAGEN HotStarTaqマスターミックスで、RT PCRによって合成されたcDNA (2マイクロL)を合計25マイクロLのPCR増幅に使用した。PCR増幅を使用して標的クローノタイプを検出するために、本発明者は、N1とN2ヌクレオチド付加を含むDH05-018 とJH04-01*02, に一致する特定のジャンクション領域に補完するアンチセンスプライマーと対になったVH04-b固有のリーダーセンスプライマーを設計した。これらのプライマーは、以下を含んでいた:
プリマーN1-D-N2
5GCTGGCTGGATGGGGTA-3 センスプライマー、5GCTGGCTGGATGGGTA-3(SEQ ID NO:17)
VDJアンチセンスプライマー、5'CCCAGTAGTCAAAGTAGTAAACCATA3'(配列番号:18)
プリマーズN2-J
5GCTGGCTGGATGGGGTA-3 センスプライマー、5GCTGGCTGGATGGGTA-3(SEQ ID NO:17)
5' TCCCTGGCCCCAGTAGTCAAAGTAGTA 3' (SEQ ID NO:19) アンチセンスプライマー、TCCCTGGCCCCAGTAGTCAAAGTAGTA 3' (SEQ ID NO:19)。その他のプライマーには、SEQ ID NOS:23-24が含まれています。
PCR増幅は、サーモサイクラー(BioRad T100)を用いて行われた。以下の条件下で、初期変度は95℃で3分、95℃oは30s、54℃oは30s、40サイクルは72℃oで1分、72℃oで60s、続いて最終的な増幅工程は72o Cで10分であった。PCR製品を増幅し、1.2%Agarage gelで400bのバンドサイズを可視化した。
サンガー配列決定のために、400bp Ampliconsをアガロースゲルから直接切り離した。PCR精製キット(Quigen)を用いて製品の浄化を行い、試料をJohns Hopkins Medical Institute GRCF配列コア施設のサンガー配列決定に送り、配列を確認した。配列分析は、社内解析ソフトと国立バイオテクノロジー情報IgBlastサーバ、あるいは免疫遺伝学サーバを用いて行った。
VII. 療法のための抗イディオタイプ抗体
具体的な実施の形態では、本発明は、x-Idに特別に結合する単離された、又は、それらを結合する、その断片であり、ここでは、当該、当該、又は、結合した断片は、重い鎖補完性決定領域(CDR)1、2、3を構成する。更なる実施の形態では、分離された抗菌剤はさらに軽鎖CDR1、2及び3を含む。
本発明はまた、その(a)CDR1、CDR2、およびCDRからなる重鎖可変領域(VH)および(b)CDR1、CDR2、およびCDR3からなる軽鎖可変領域(VL)を含む、x-Idに特別に結合する、孤立した、又は抗原結合フラグメントを提供する。
特に、ここに記載されている単離された抗堪能又は抗原結合フラグメントは、x-Id活動の敵対者である。
本発明はまた、アンチ-x-Id OOC又はその抗原結合フラグメントをエンコードする孤立した核酸分子を提供する。特定の実施では、ベクトルは、本明細書に記載の核酸分子を含む。別の実施の形態では、ホストセルは、ここに説明されるベクトルを構成する。宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。
特に、本発明は、(a)宿主細胞がx-Id抗原またはその抗原結合断片をホスト細胞によって表現するのに適した条件下で宿主細胞を栽培し、(b)x-Id抗原またはそれらの抗原結合断片を回収する手順を含む、抗x-Id抗原結合断片を生成するための方法を提供する。
本発明はまた、それの抗x-Id抗原結合断片及び適当な医薬品担体からなる組成物を提供する。特定の実施では、本組成物は、静脈、筋肉内、口下、皮下、腹内、筋内、または筋肉内の行政のために定式化される。本発明の反イディオタイプ抗毒剤は、毒素を含むが、それに限らない治療薬剤と結合することができる。
別の側面において、本発明は、処理方法を提供する。ある実施例において、哺乳動物における糖尿病を治療する方法は、哺乳動物に、x-Idに特に結合する、治療効果のある量の抗原結合フラグメントを施す工程を含む。一実施の形態では、T1D又はその危険性を有する被検者におけるタイプ1糖尿病(T1D)の治療又は予防のための方法は、ここに記載されている治療効果のある量の抗菌又は抗原結合フラグメントを患者に施す工程を含む。更なる実施態様において、抗原結合フラグメントは、scFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2、およびダイアボディからなるグループから選択される。
具体的な実施例において、本発明は、SEQ ID NO:1を具体的に結合する、抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本発明は、(i)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1を含む、細胞レセプター上で表現されるB細胞レセプターを具体的に結合する、あるいは(ii)SEQ ID NO:1を含む自由浮遊型のその断片を提供する。あるいは、(ii)SEQ ID NO:1を含む自由浮遊型の抗原レセプターを更なる実施の場合には、SEQ ID NO:1を含む抗原結合型の断片を実施形態結合する。特定の実施形態において、抗原又は抗原結合断片は、SEQ ID NO:1への抗原の結合を防止又は減少させる。さらに、抗原結合フラグメントはscFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2、およびダイアボディを含むことができる。
更なる実施形態において、本発明の組成物及び方法は、他の自己感染症の危険を検出し、診断し、及び/又は評価するために利用することができる。特定の実施では、自己免疫疾患は、強直性脊椎炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、クローン病、皮膚筋炎、グレーブス病、ギラン-バレー症候群、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、結節性多発動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症または潰瘍性大腸炎を含む。他の実施形態では、本発明は、IgG4関連の病気及びペンピグス・ヴァルガリスのような希少な自己感染症に対処するために利用することができる。
A.定義
"abid"という用語は、標的(例えば、x-Id、そのサブユニット、またはレセプター複合体)、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、または、先に述べた、イムグロブリン分子の可変領域内の少なくとも一つの抗原認識サイトの組み合わせを認識し、上記の標的に結合するイムグロブリン分子を意味する。典型的なAbidは、少なくとも2つの重(HC)チェーンと2つの軽(LC)チェーンをジスルフィド結合によって相互に結合したものである。各重鎖は、"重いチェーン可変領域"または"重いチェーン可変領域"(以下、VHと略す)と重いチェーン鎖定常領域ドメイン、CHI、CH2、およびCH3から成っている。各軽チェーンは、"軽いチェーン可変領域"または"軽いチェーン可変領域"(以下、VLと略す)と軽いチェーン不変領域から成っている。軽鎖定常領域は、一つの領域であるCIから構成されている。VHとVL領域はさらに、補完性決定領域(CDR)と呼ばれるハイパーバリエーションの領域に、より保存された領域(FRs)と呼ばれる領域に分けられることができる。VHおよびVL領域は、3つのCDRと4つのFRから構成され、アミノ端からカーボキシ終末まで、FRI、CDRI、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に並べられている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。ここで用いられる「ady」という用語は、無傷のポリクローン・抗生物質、無傷のモノクローン・抗生物質、少なくとも2つの無傷の抗生物質、キメラル・抗生物質、人工抗生物質、人工抗生物質、抗原決定部分を含むフュージョン・プロテイン、および希望する生物活動を示す限り、抗原認識サイトを含むその他のいかなる改良されたイムグロブリン・分子から生み出される、シングル・チェーンFv (scFv)、ミニボディ(sc(Fv)2、ディアボディ)、多数の上記の抗生物質、例えば、少なくとも2つの無傷の抗生物質、キメラル・抗生物質、人工抗生物質、Fd、Fb、およびFv断片)、シングル・チェーンFv従って、「Ady」という用語には、全抗生物質及びその抗原結合フラグメント又は単一チェーンが含まれる。アンチボディは裸にしたり、毒素、放射性同位体、小分子薬物、ポリペプチドなどの他の分子に結合したりすることができる。
「隔離された」という用語は、その自然環境の構成要素から特定され、分離され、又は回収された、又はその両方を意味する。その天然環境の汚染成分は抗体についての診断または治療用途に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含むことができる。いくつかの実施形態においては、当該抗体は、例えば、ローリー法によって決定される抗体の重量が95%を超え、重量が99%以上を含むように、また、(2)紡績カップセキュレーターを使用してN-端子または内部アミノ酸シークエンスの少なくとも15の残留物を得るのに十分な程度、または、(3)コマシーブルーまたは銀汚染を使用して減量または非減量条件下でSDS-PAGEによる均一性にまで、浄化される。単離された抗体とは、その抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので組換え細胞中でインサイチュで存在する抗体を包含する。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
「人間化」イム免疫グロブリンという用語は、ヒトのフレームワーク領域と、ヒトでない(通常はマウスまたはラット)のイム免疫グロブリンからの1つ以上のCDRからなるイム免疫グロブリンを意味する。CDRを提供する非ヒトのイム免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒトのイム免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、それらが存在するならば、それらは人間のイムノ免疫グロブリン定常領域、すなわち少なくとも約85～90%、望ましくは約95%以上同一でなければならない。従って、ヒト化されたイムグロブリンのすべての部分は、おそらくCDRを除いて、天然ヒトのイムグロブリン配列の対応箇所と実質的に同一である。「人間化された」とは、ヒト化されたL鎖とヒト化された重鎖であるイノグロブリンからなる、抗たん物である。例えば、人間化された抗菌は、上記で定義された典型的なキメリック抗菌を包含しないであろう。なぜなら、例えば、キメリック抗菌の全可変領域は、非人間であるからである。
「抗原結合フラグメント」という用語は、無傷の抗原の一部を意味し、無傷の抗原の多様な領域を決定する抗原性を意味する。本技術では、抗原結合機能は、フルレングス・ビーズの断片によって行うことができることが知られている。抗原結合型の断片の実施例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、FdおよびFv断片、線形の抗生物質、単一の鎖状抗生物質、ならびに抗原断片から形成された多種の抗生物質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例では、抗体フラグメントは、無傷または全抗体のタンパク質分解消化によって調製され得る。例えば、パパイン、ペプシン、またはプラスミンのようなエンザイムで、全体の抗菌を処理することによって、抗菌フラグメントを得ることができる。全体のパパイン消化はF(ab)2またはFabフラグメントを産出し、全体のペプシン消化はF(ab')2またはFab'を産出し、全体のプラズミン消化はFacbフラグメントを産出する。
「Fab」という用語は、免疫グロブリン(典型的にはIgG)を酵素パパインで消化して得られるものと本質的に同等の抗体フラグメントを意味する。このようなフラグメントは、完全な抗体フラグメント化によって、または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組み換え的に産生されるか、または全体的もしくは部分的に合成的に産生され得る。「F(ab')2」という用語は、酵素ペプシン(典型的にはIgG)を用いてpH 4.0～4.5で消化して得られるフラグメントと本質的に同等の抗体フラグメントを意味する。このようなフラグメントは、完全な抗体フラグメント化によって、または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組み換え的に産生され得るか、または全体的もしくは部分的に合成的に産生され得る。用語「Fv」は、非共有結合相互作用によって一緒に保持される1つのNHおよび1つのNドメインからなる抗体フラグメントを指す。
「x-Id abid」、「anti-x-Id abid」、「anti-x-Id」、「x-Idに結合するabid」という用語及びそのあらゆる文法的バリエーションは、x-Idを標的とするにあたって、抗菌剤又は診断剤として有用であるような十分な親和性を有するx-Idに特に結合することができるabidを指す。本書で開示された非関連の非x-Idプロテインへの抗x-Id抗タンパク質の結合の程度は、例えば、ラジオイムアッセイ(RIA)、BIACORETM (配位子としてリコンバントx-Idを用いた)、又はその逆として知られているその他の拘束力のあるアッセイによって測定されるように、x-Idへの結合の約10%以下である。ある種の実施例において、x-Idに結合する抗菌は、<ミュールM、<100 nM、<50 nM、<10 nM、または<l nM.の酸解離定数(KD)を有する。
2つのポリペプチド(またはポリヌクレオチド)配列間の「%同一」という用語は、2つの配列の最適な配向のために導入されなければならない追加または削除(すなわちギャップ)を考慮に入れて、比較ウィンドウ上の配列間で共有された同一の一致した位置の数を意味する。一致した位置とは、同じヌクレオチドまたはアミノ酸が標的および基準配列の両方で示される位置のいずれかである。対象配列のギャップは、ヌクレオチドやアミノ酸のギャップではないので、数えない。同様に、参照配列で示されたギャップはカウントされない。なぜなら、対象配列のヌクレオチドやアミノ酸はカウントされ、参照配列からのヌクレオチドやアミノ酸はカウントされないからである。配列同一性の割合は、同じアミノ酸残基または核酸塩基が両方のシークエンスの中でどこにある位置にあるかを決めて、一致した位置の数を比較の窓の総数で割って、その結果を100で掛けて配列同一性の割合を作ることで計算されます。2つのシークエンス間のシークエンスの比較とパーセンテージアイデンティティの配列は、オンラインでもダウンロードでも簡単に利用判定ソフトウェアを使って行うことができます。適切なソフトウェアプログラムは、様々な情報源から、また、タンパク質と核酸配列を配向させるために利用可能である。パーセントシークエンスアイデンティティを決定するのに適したプログラムの1つが、BLASTのプログラムの一部であるbl2seqである。bl2seqは、米国政府のナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー情報BLASTウェブサイトから入手できるプログラムである。Bl2seqは、BLASTNまたはBLASTPアルゴリズムを使用して2つの配列間の比較を行います。BLASTNは核酸配列を比較するのに用いられ、BLASTPはアミノ酸配列を比較するのに用いられる。その他の適切なプログラムは、例えば、針、ストレッチャー、水またはマッチャーであり、エンボスのバイオインフォマティクスプログラムの一部であり、また、www.ebi.ac.uk/Tools/psaのヨーロッパバイオインフォマティクス研究所(EBI)からも利用可能である。特定の実施例において、第1のアミノ酸配列の第2のアミノ酸配列の「X」の割合は、100 x (Y/Z)として計算される。この場合、Yは、第1及び第2の配列の並べ方(目視検査又は特定の配列並べ方によって並べられるように)において同一のマッチングとして得点されたアミノ酸残余の数であり、Zは第2の配列における合計残余の数である。最初の配列の長さが2番目の配列より長ければ、最初の配列から2番目の配列への最初の配列のパーセントのアイデンティティは、2番目の配列のパーセントのアイデンティティよりも高いだろう。当業者は、パーセントシークエンスアイデンティティの算出のための配列アラインメントの生成が、第1の配列データによってのみ導かれる二元・シークエンス・シークエンス比較に限定されないことを理解するであろう。シークエンスアラインメントは、複数のシークエンスアラインメントから導き出すことができます。複数の配列アラインメントを生成するのに適したプログラムの1 つはClustalW2 です(ClustalX は、Windows 環境に移植されたClustalW2 プログラムのバージョンです)。また、他に適したプログラムが筋肉である。ClustalW2と筋肉は、欧州バイオインフォマティクス研究所(EBI)などから入手可能である。
「治療剤」という用語は、病気または障害の治療に使用されるあらゆる生物・化学剤を意味する。治療剤には、適当な生物活性化合物、電池、ペプチド、抗毒素、ポリヌクレオチドなどの生物学的由来成分、および放射性同位体などの放射性化学治療剤が含まれる。いくつかの実施例において、治療剤は、安価な母性剤又は鎮痛剤を含む。
ここで用いられているように、「治療」、「治療」等の用語は、望ましい薬理学的および/または生理学的効果を得ることを意味する。この用語はまた、例えば、抗x-Id抗体の「治療効果のある量」の管理の文脈においても使用される。この効果は、特定の成果、病気または兆候の全面的または部分的な防止、および/または、病気に対する部分的または完全な治療、または/または悪影響の観点から治療となる可能性がある。本文書中で用いられている「治療」は、特にヒトにおける、対象の病気の治療を対象としており、(a)病気の原因となる可能性があるが、未だ診断されていないものの、病気の発生を防止すること、(b)病気の阻害、すなわち、その開発を阻止すること、および(c)病気の緩和、例えば、後退を引き起こすこと、を含む。 例えば、病気、つまり、完全に、あるいは部分的にその病気の兆候を取り除くこと。特に、この用語は、糖尿病を含むあらゆるx-Id媒介の病気を予防し又は治療する文脈で使用される。
B.抗x-Id抗体
本開示の抗物質又は抗原結合フラグメントは、特にx-Idと結合する。特定の実施において、これらの抗物質又は抗原結合フラグメントは、特にヒトx-Idに結合する。本項で使用する「特別に結合する」とは、他のタンパク質よりも、抗原結合フラグメントがx-Id (例えば、ヒトのx-Id、マウスのx-Id)を優先的に結合することを意味する。特定の例では、開示された抗x-Id抗生物質は、他のタンパク質に対するよりもx-Idへの親和性が高い。x-Idを特異的に結合する抗x-Id蛋白質は、1×10M以下のヒトx-Id、2×10M以下の-7、3×10M以下の-7、4×10M以下の-7、6×10M以下の-7、7×10M以下の-7、9×10-7 M以下、1×10M以下の-7、2×10M以下の-8、3×10M以下の-8、4×10M以下の-8、5×10M以下の-7、6×10M以下の-8、7×10M以下の-7、-8 8×10以下、9× 10-8 M、1×10M以下、2×10M以下、-93×10M以下、-94×10M以下、-85×10M以下、-96×10M以下、-87×10M以下、-99×10M以下、-81×10M以下、-92×10M以下、-103×10M以下、-104×10M以下、-95×10M以下、-106×10M以下、-97×10M以下、-108×10M以下、-99×10-10 M以下、1×10M以下、2×以下 10-10M、3×10M以下、3×10M以下、-105×10M以下、6×10M以下、-107×10M以下、-119×10M以下、-910M以下、-112×10M以下、-113×10M以下、-114×10M以下、-115×10M以下、-116×10M以下、-117×10M以下、-128×10M以下、9×10-11 M以下 当該技術分野では、結合親和力を測定する方法がよく知られており、表面プラズモン共鳴(SPR) (Morton及びMyszka「表面プラズモンを用いた巨大分子相互作用の運動学的解析」を含む。 酵素学(1998)295、268-294)、バイオレイヤー干渉法、(Abdicheら「並列リアルタイム標識不使用バイオセンサ、Octet」分析生物化学(2008)377、209-217)、速度論的除外アッセイ(Kinetic exass assay and Drug Dev Tech (2004)2、647-657)、等温熱量測定(Pierceら「蛋白質‐蛋白質相互作用の等温滴定熱量」法(1999)19、213-221)および分析超遠心法(Lebowitzら「蛋白質科学におけるModem分析超遠心法:チュートリアルレビュー」Protein Science (2002), 11:2067-2079)。
1.抗体フラグメント
本開示は、x-Id (例えば、人間のx-Id)に発明結合する能力を保持する、ここに記載されている抗菌断片又はドメインを包含する。アンチボディフラグメントには、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、Fvが含まれる。これらのフラグメントはヒト化されているか、完全にヒト的なものであることがある。抗体フラグメントは、インタクト抗体のタンパク質分解消化によって調製することができる。例えば、パパイン、ペプシン、またはプラスミンのようなエンザイムで、全体の抗菌を処理することによって、抗菌フラグメントを得ることができる。全体のパパイン消化はF(ab)2またはFabフラグメントを産出し、全体のペプシン消化はF(ab')2またはFab'を産出し、全体のプラズミン消化はFacbフラグメントを産出する。
あるいは、抗体フラグメントを組換えにより製造することもできる。たとえば、興味のある断片をエンコードする核酸を構築し、式ベクトルに導入し、適切なホスト細胞で式することができる。例えば、Co.M.S. et al., J Immunol., 152:2968-2976 (1994); Better, M. and Horwitz, A.H., Methods in Enzymology, 178:476-496 (1989); Pluckthun, A and Skerra, Methods in Enzymology, 178:476-496 (1989); Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 121:652-663 (1989); Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology, (1989), 121:663-66大腸菌内に遺体の断片を記載し、秘密にすることができるため、大量の断片を容易に生成することができる。抗体フラグメントは、ファージライブラリーから分離することができます。代わりに、Fab'-SHフラグメントはE. coliから直接回収され、化学的に結合してF(ab)2フラグメントを形成することができる(Carter et al., Bio/Technology, 10:163167 (1992)))。別のアプローチに従って、F(ab')2フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。サルベージレセプター結合エピトープ残渣を含むインビボ半減期が増加したFabおよびF(ab')2フラグメントは、米国特許第5,869,046号に記載されている。
2.各投与
また、ここに記載されている抗生物質のミニボディも包含されている。防-x-Id抗毒素のミニボディには、ジアボディ、単鎖(scFv)、単鎖(Fv)2(sc(Fv)2)が含まれる。
"diabody"は遺伝子融合により構築された二価ミニボディである(例えば、Holliger, P. et al., Proc. Natal. Acad. Sci. U. S. A., 90:6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161)。Diabodiesは2つのポリペプチド鎖からなる量体である。ダイアボディの各ポリペプチド鎖のVLとVHドメインはリンカーによって結ばれている。リンカーを構成するアミノ酸残基物の数は、2～12カ所(例:3～10カ所、5カ所、約5カ所)である。ダイアボディ内のポリペプチドのリンカーは、VLとVHが互いに結合することを可能にするには、典型的にはあまりにも短すぎる。このように、同じポリペプチド・チェーンでエンコードされたVLとVHは、単一チェーン可変領域断片を形成することはできず、代わりに異なる単一チェーン可変領域断片を持つ量体を形成する。その結果、ダイアボディには2つの抗原結合サイトがある。
ScFvは、VHとVLをリンカーとリンクさせることによって得られるシングルチェーンポリペプテッドである(例えば、Huston et al., Proc. Natal. Acad. Sci. U. A., 85:5879-5883 (1988)、およびPluckthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol.113, Ed Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp.269-315 (1994各可変ドメイン(またはそれらの一部)は、同一または異なった抗生物質に由来する。単鎖Fv分子は、VHドメインとVLドメインの間に介在するscFvリンカーを含むことが望ましい。例示的なscFv分子は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号; Hoら、遺伝子、77:51(1989); 鳥ら、Science、242:423(1988); Pantolianoら、Biochemistry、30: 101 17(1991); Milenicら、Cancer Research、51 :6363(1991); Takkinenら、Protein Engineering、4:837(1991)に記載されている。
ここで使用する「scFvリンカー」という用語は、scFvのVLドメインとVHドメインの間に挟まれた潤いを意味する。scFvリンカーは、抗原結合型のscFv分子を維持することが望ましい。1つの実施形態において、scFvリンカーはscFvリンカーペプチドを含むか、またはそれからなる。ある種の実施例において、scFvリンカーペプチドは、Gly-Serペプチドリンカーを含むか、またはそれからなる。他の実施形態において、scFvリンカーはジスルフィド結合を含む。
リンクされるVHおよびVLの順序は特に限定されておらず、それらはどのような順序でアレンジされてもよい。配列の実施例としては、[VH]リンカー[VL]または[VL]リンカー[VH]が含まれる。scFv中のH鎖V領域およびL鎖V領域は、ここに記載されているアンチx-Id抗菌または抗原結合フラグメントに由来することができる。
Sc(Fv)2は、2つのVHと2つのVLがリンカーによってリンクされ、単鎖を形成するミニボディである(Hudson, et al., J Immunol. Methods, (1999) 231: 177-189 (1999)))。scFvsとリンカーを接続するなどして、sc(Fv)2を作成することができます。本発明のsc(Fv)2には、1チェーンポリペプチドのNターミナルから、VH、VL、VH、VH、VLの順に2つのVLを並べることが望ましいが、2つのVHと2つのVLの順序は、上記の順序に限らず、どれでも並べることができる。配置例は以下の通りです:
[VL]リンカ[VH]リンカ[VH]リンカ[VL]
[VH]リンカ [VL]リンカ [VL]リンカ [VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー [VL]
[VL] linker [VL] linker [VH] linker [VH]
[VL] linker [VH] linker [VL] linker [VH]
通常は、4つのバラエティに富む領域がつながっている場合には3つのリンカーが必要であり、使用されるリンカーは同一であるか異なっている可能性がある。ミニボディのVHとVL領域をリンクさせるリンカーに特別な制限はない。いくつかの実施形態において、リンカはペプチドリンカーである。リンカーとしては、約3～25の残渣(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、l5、16、17、18)からなる任意のシングルチェーンペプチドを用いることができる。
他の実施形態において、リンカーは、合成複合リンカー(化学的架橋剤)である。市販されている架橋剤の実施例としては、Nhydroxysuccinimide (NHS)、disuccinimidyl(DSS)、bis(スルホコハク酸イミジル)suberate (BS3)、dithiobis(succinimidy Ipropionate) (DSP)、dithiobis(スルホコハク酸イミジイミドIpropionate) (DTSSP)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート) (EGS)、エチレングリコールビス(スルホコハク酸イミジルスクシネート)(スルホ-EGS)、酒石酸塩ジスクシンイミジル(DST)、酒石酸塩ジスルホコハク酸ジイミジル(スルホ-DST)、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、ビス[2-(スルホコハク酸イミドオキシ)エチル]スルホン
Adf断片又はミニボディにおけるVH又はVLのアミノ酸配列には、置換、削除、添加、及び/又は挿入のような変更を含み得る。例えば、このモディフィケーションは、ここに記載されているアンチx-Id抗物質のCDRの1つ以上であることができる。特定の実施形態では、修飾は、VHの1、2、または3個のCDRおよび/または抗x-IdミニボディーのVLドメインの1、2、または3個のCDRにおける1、2、または3個のアミノ酸置換を含む。このような置換は、アンチx‐Idミニボディの結合および/または機能的活性を改善するために行われる。他の実施形態では、VHとVLが関連している場合には、x-Id結合及び/又は機能的活性がある限り、その抗x-Id抗原結合断片の6つのCDRのうちの1つ、2つ、又は3つ以上のアミノ酸を削除又は追加することができる。
3.VHH
ナノボディとしても知られるVHHは、L鎖を持たないラクダやラマに見られる重鎖抗原結合可変重鎖領域(VHHs)に由来する。本開示は、x-Idを特に結合するVHHを包含する。
4.新しいアンチゲンレセプター(VNAR)の可変ドメイン
VNARは新しい抗原レセプター(IgNAR)の可変領域である。IgNARは共有結合した重鎖ホモ二量体としてサメの血清中に存在する。それは、一定の領域の数が異なる可変領域(VNAR)から成る可溶性および受容体結合型として存在する。VNAR は CDRl と CDR3 で構成され、CDR2 の代わりに HV2 と HV4 ドメインがあります (例: Barelle とPorter, Antibodies, 4:240-258 (2015)) を参照してください)。本開示は、x-Idを特に結合するVNARを包含する。
5.定常領域
この開示の反物は、全抗性又は単鎖Fc (scFc)であり、また、当該技術分野で知られている任意の定常領域を含むことができる。軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダタイプの軽鎖定常領域、例えば、人間のカッパまたは人間のラムダ軽鎖定常領域であることができる。鎖定常領域は、例えば、アルファ-、デルタ-、エプシロン-、ガンマ-、又はムー型鎖定常領域、例えば、人間のアルファ-、人間のデルタ-、人間のエプシロン-、人間のガンマ-、又は人間のムー型鎖定常領域であることができる。特定の例では、抗x-Id抗体は、IgA抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgGl抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体、またはIgM抗体である。
一実施の形態では、軽又は重鎖定常領域は、自然に発生する定常領域の断片、誘導体、変形又はミューテーンである。幾つかの実施例において、ここに記載されているアンチx-Id抗物質の可変重鎖は、CH1ドメインおよびヒンジ領域からなる重鎖不変領域とリンクしている。いくつかの実施例において、可変重鎖は、CH2ドメインを含む重鎖不変領域と連結されている。いくつかの実施例において、可変重鎖は、CH3ドメインを含む重鎖不変領域と連結されている。いくつかの実施例において、可変重鎖は、CH2およびCH3ドメインからなる重鎖不変領域と連結されている。いくつかの実施例において、可変重鎖は、ヒンジ領域、CH2およびCH3ドメインからなる重鎖不変領域と連結されている。CH1、ヒンジ領域、CH2、および/またはCH3は、IgG(例:IgGI、IgG4)から得ることができる。特定の実施例では、ここに記載されるアンチ-x-Idの可変重鎖は、IgG4からのCHIドメイン、ヒンジ領域、及びIgGIからのCH2ドメインからなる重鎖不変領域とリンクしている。ある実施例においては、このようなキメリック抗原は、キメリック抗原の安定性を増加させる鎖定常領域において、1つ以上の追加突然異変を含むことができる。ある実施形態においては、鎖定常領域は、反応物の特性を修飾する置換を含む。
特定の実施形態では、本開示の抗x-Id抗体は、IgGアイソタイプ抗体である。1つの実施形態において、当該技術はIgG1である。別の実施の形態では、当該技術はIgG2である。更に別の実施の形態では、標識はIgG4である。いくつかの例では、IgG4の抗菌作用は、機能的に一価のフォーマットを採用することを減少または防止する1つ以上の突然性を有する。例えば、IgG4のヒンジ領域は、ヒトIgG1のヒンジ領域(ヒトIgG4ヒンジのセリンのプロラインへの突然変異)とアミノ酸配列が同一になるように、ミュート化することができる。幾つかの実施例において、本発明は、キメリック鎖定常領域(例えば、IgG4のCH1、ヒンジ、及びIgG1のCH3領域を有する)を有する。
6.二重特異性抗体
ある態様において、本開示の抗x-Id抗体は、二重特異性抗体である。二特異的抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。典型的な二種特有の抗生物質は、x-Idタンパク質の二つの異なったエピトープに結合することがある。他のこのような抗物質は、x-Id結合部位と他のタンパク質の結合部位を結合することができる。二種性抗毒素は、それらの全長または低分子型(例えば、F(ab')2種の二種性抗毒素、sc(Fv)2種の二種性抗毒素、二体性抗毒素)として調製することができる。
2つのチェーンが異なった特性を持つ2つのイムグロブリン重鎖‐ライトチェーンペアの共式に基づいて、二種類の特殊な抗生物質を製造してきた(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)))。別のアプローチでは、希望の結合特殊性を持つ、多様なドメインを、イムグロブリンの一定領域配列に融合する。イムグロブリン重鎖溶融をエンコードしているDNAと、もし望ましければ、イムグロブリンL鎖を、独立した表現ベクトルに挿入し、適切な宿主細胞に共伝させる。このことは、3つのポリペプチド断片の割合を調整する上で、より大きな柔軟性を提供する。しかしながら、少なくとも2つのポリペプチド・チェーンを同じ比率で表現すると高収量となる場合には、2つまたは3つのポリペプチド・チェーンすべてのコード配列を1つの表現ベクトルに挿入することができる。
米国特許第5,731,168号に記載された別のアプローチによれば、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように、一対の抗体分子間の界面を操作することができる。好ましいインターフェイスは、少なくともCH3ドメインの一部を構成しています。この方法では、最初の分子のインターフェースからの1つ以上の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)に置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖を小さな側鎖(例:アラニーンやスレオニン)に置き換えることによって、第二の反応分子のインターフェース上に、大きな側鎖と同一またはそれに類似した大きさの補償的な「空洞」を作り出す。これは、ホモダイマーのような他の望まない最終産物よりもヘテロダイマーの収率を増加させるメカニズムを提供する。
二重特異性抗体としては、架橋された抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの1つの抗体はアビジンに結合させ、他の抗体はビオチンに結合させることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、都合の良い架橋法のいずれかを使用して作製できる。
「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替メカニズムを提供する。フラグメントは、同じ鎖上の2つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーによってVLに接続されたVHを構成する。従って、1つのフラグメントのVHおよびVLドメインは、もう1つのフラグメントの相補的VLおよびVHドメインと強いて対合させ、それにより、2つの抗原-結合部位を形成する。
7.結合抗体
本明細書で開示される抗毒素又は抗原結合フラグメントは、高分子(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、PEG (PEI-PEG)に改造されたポリエチレンミン(PEI)、ポリグルタミン酸(PGA) (N-(2-Hydroxypropyl)メタクリラミド(HPMA)コポリマー)、ヒト上記アルバミン又はその断片、放射性物質(例えば、90Y、131I)、蛍光物質、発光物質、ハプテン、エンザイム、メタルチレート、及び薬物を含む様々な高分子に結合することができる。
特定の実施例では、抗x-Id抗原または抗原結合フラグメントは、それの安定化および/または巡回中の保持、例えば、血液、美容液、または他の組織において、少なくとも1.5、2、5、10、15、20、25、30、40、または50倍に改良された湿度で改良される。例えば、抗x-Id抗原又はそれの抗原結合フラグメントは、ポリアルキレンオキサイド又はポリエチレンオキシドのような実質的に非抗原性重合体に関連づけることができる。適当なポリマーは、実質的に重量によって異なる。分子数平均重量が約200～約35,000ダルトン(約1,000～約15,000、2,000～約12,500)のポリマーが使用できる。例えば、この抗x-Id抗原又は抗原結合フラグメントは、水溶性重合体、例えば、親水性ポリビニルアルコールビニールポリマー、例えば、ポリビニルアルコールコール又はポリビニロリドンに結合することができる。このようなポリマーの例には、ポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキサイド、ポリオキシエナテレンポリオール、そのコポリマー及びそのブロックコポリマーが含まれる。ただし、ブロックコポリマーの水溶性が維持されることを条件とする。さらなる有用なポリマーには、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロック共重合体のようなポリオキシアルキレン;ポリメタクリレート;カルボマー;および分岐または非分岐多糖類が含まれる。
上述の活用された抗物質または断片は、本項に記載されている抗物質またはそれらのより低い分子重量の形成について化学的な修正を行うことによって調製することができる。抗生物質を修正する方法は、本技術で周知である(例えば、米国特許第5,057,313号及び米国特許第5,156,840号)。
C.抗体の特性評価
ここに記載されている抗生物質のx-Id結合特性は、任意の標準的な方法、例えば、OCTET(R)、Surface Plasmon Resonance (SPR)、BIACORETM分析、Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)、EIA (エンザイム・イムノアッセイ)、RIA (ラジオイムアッセイ)、およびFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)によって測定することができる。
興味のあるタンパク質の結合相互作用(抗x-Id bid 又はその機能断片)と標的(例えばx-Id)との結合相互作用は、OCTET(R)システムを用いて分析することができる。この方法では、ForteBio社製のいくつかの楽器(例えば、OCTET(R) QKe、QK)のバリエーションの1つが、タンパク質相互作用、結合特殊性、およびエピトープマッピングを決定するために使用される。OCTET(R)システムは、カスタムチップを下り、その後センサ部に戻る偏光の変化を測定することによって、リアルタイム結合をモニタリングする容易な方法を提供する。
興味のあるタンパク質の結合相互作用(防x-Id bid またはその機能断片)とターゲット(例えばx-Id)の結合相互作用は、Surface Plasmon Resonance (SPR)を用いて分析することができる。SPRまたはBiomolecular Interaction Analysis (BIA)は、相互作用のどれにもラベル付けすることなく、リアルタイムで生物固有の相互作用を検出します。
バイアスチップの結合面の質量の変化(結合事象を示す)は、表面付近の光の屈折指数(表面プラズモン共鳴(SPR)の光現象)の変化をもたらす。反射活動の変化は検出可能な信号を生成し、これは生体情報分子間のリアルタイム反応の指標として測定される。SPRを使用する方法は、例えば、米国特許第5,641,640号; Raether(1988) Surface Plasmons Springer Verlag; SjolanderおよびUrbaniczky (1991) Analに記載されている。Chem 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr.オピン。構造。生涯。5:699-705 また、BIAcore International AB (スウェーデン、ウプサラ州)が提供するオンラインリソース。SPRからの情報は、生体分子を標的に結合するための平衡解離定数(Kd)とKonとKoffを含む運動パラメータの正確で定量的な測定に用いることができる。
エピトープはまた、BIACOREクロマトグラフィック技術(Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Epitope Mapping", Section 6.3.2, (May 1994))を用いて、異なった反x-Id抗物質またはその機能的断片が互いにヒトx-Idに結合する能力を評価することによって直接マッピングすることができる。Johne et al. (1993) J. Immunolも参照のこと。方法、160:191-198)。
エンザイムアッセイを使用する場合、例えば、抗原をコーティングした板に、抗原を生成する細胞の上流のカルチャーまたは精製された抗原を含むサンプルを加える。アルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄後、p-ニトロフェニルホスフェートなどの酵素基質を添加し、吸光度を測定して抗原結合活性を評価する。
Antibodies: Antibodies: A Laboratory Manual, ed. by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor press (1988)には、抗毒剤を評価するための一般的なガイダンス(例えば、Western blots and immuned)
D.親和性成熟
一実施の形態では、抗x-Id抗原またはそれの抗原結合フラグメントが、例えばミューテージェネシスによって、修正された抗物質のプールを提供するように修正される。その後、改良された抗生物質を評価し、1つ以上の機能特性(例えば、拘束力の改善、安定性の改善、抗原性の低下、生体内の安定性の増加)を有する抗生物質を同定する。1つの実装では、ディスプレイライブラリ技術を用いて、改良された抗生物質のプールを選択または画面する。次に、たとえば、より厳密であるか、より競合的な結合および洗浄条件を用いることによって、第2の図書館からより高い親和性が確認される。他のスクリーニング技術も使用できます。親和性成熟を効果的にする方法には、ランダムミューテージソン(例えば、福田ら、Nucleic Acids Res, 34:el27 (2006);標的化ミューテージソン(例、Rajpalら、Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 102:8466-71 (2005));シャッフリングアプローチ(例、Jermutusら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:75-80 (2001));シリカアプローチ(例、Lippowら、Nat. Biotechnol, 25: 1171-6 (2005))。
いくつかの実施形態において、変調性は、既知の領域、又は結合インターフェイスにある可能性のある領域をターゲットとする。例えば、特定された結合性タンパク質が抗生物質であるならば、ミューテージエージェントは、ここに説明されているように、重鎖または軽鎖のCDR領域に向かうことができる。さらに、変性は、CDRに近接する、あるいは隣接する骨格領域、例えば、CDR接合体の10、5、3のアミノ酸の中の骨格領域に向けることができる。抗生物質の場合には、ミューテージェネシスはまた、例えば段階的改善を行うために、CDRの1つまたは2、3に限定することができる。
1つの実施形態において、変異誘発は、抗体を1つ以上の生殖系列配列に類似させるために使用される。1つの例示的な保留法には、以下が含まれることができる:分離された抗菌の配列と類似した1つ以上の保留配列(例えば、特定のデータベースで最も類似している)を同定すること。そして(アミノ酸レベルでの)突然変わることは、結合するか、あるいは両方するかのどちらかで、分離された抗たんの中で行うことができる。たとえば、核酸ライブラリーには、ある種の、あるいはありうるすべての生殖系の突然変わりをエンコードするシークエンスが含まれている。次に、変性抗生物質が評価される。例えば、分離された抗生物質に対して1つ以上のジェムリン残渣があり、かつ依然として有用である(例、機能的活性を有する)ものを同定する。1つの実施形態では、可能な限り多くのジェムリン残渣が分離された抗菌に導入される。
一実施形態では、突然変異誘発を用いて、1つ以上の生殖系列残渣をCDR領域に置換または挿入する。たとえば、ゲルムラインCDR残基は、修正されている変数領域に似た(例、最も類似した)ゲルムライン配列から得られる。ミューテージシス後には、ゲルムリン残渣または残渣が許容されているかどうかを判断するために、抗菌の活動(例えば、結合または他の機能的活性)を評価することができる。フレームワーク領域でも同様の突然変異誘発を行うことができる。
ゲルムライン配列の選択は、異なる方法で行うことができます。例えば、ドナー非人種の抗菌剤に対する、少なくとも75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5%のアイデンティティ、など、選択性または類似性のための所定の基準を満たす場合に、ゲルムライン配列を選択することができる。選択は、最低2、3、5、10 のゲルムライン配列を使用して行うことができます。CDRlとCDR2の場合、類似のゲルムライン配列を識別するには、上記配列を1つ選択することができる。CDR3の場合、類似のゲルムライン配列を識別することは、一つのそのような配列を選択することを含むことができるが、アミノ端子部分と炭酸端子部分に別々に寄与する2つのゲルムライン配列を使用することを含むことができる。他の実装では、例えば、コンセンサス配列を形成するために、1つ以上または2つのゲルムライン配列が使用される。
2つのシークエンス間の「シーク配列同一性算出は、次のように行われます。配列は最適な比較のために並べられている(例えば、ギャップは、最適な配列および非同質配列のために、1番目と2番目のアミノ酸または核酸の配列の一方または両方に導入することができる)。最適なアラインメントは、ギャップペナルティが12のBlossum 62スコアリングマトリックス、ギャップ延長ペナルティが4のギャップとフレームシフトペナルティが5のGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用してベストスコアとして決定されます。それから、それに対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較した。最初の配列の位置が、2番目の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められているとき、分子はその位置で同一である。2つの配列間のパーセントのアイデンティティは、配列間で共有されている同一の位置の数の関数です。
他の実施形態では、当該技術は、改変されたグリコシル化パターン(すなわち、元の又は元のグリコシル化パターンから改変された)を有するように改変され得る。この文脈で使用されるように、「改変」は、1つ以上の炭水化物モイティーを削除し、及び/又は1つ以上のグリコシル化部位を元の抗菌に付加することを意味する。現在開示されている抗体へのグリコシル化部位の付加は、グリコシル化部位コンセンサス配列を含むようにアミノ酸配列を変更することによって達成され得る;このような技術は、当技術分野で周知である。抗生物質上の炭水化物の水分を増加させるもう一つの方法は、配糖体の化学的あるいはエンザイマティック・カップリングによって、抗生物質のアミノ酸残基と結合することである。これらの方法は、例えば、WO 87/05330およびAplin and Wriston (1981) CRC Critに記載されている。改訂バイオケム、22:259-306。Arch(Hakimuddin et al. (1987)に記載されているように、抗生物質に存在する炭水化物の脱離は、化学的に、あるいは酵母学的に達成される。バイオケム。Biophys., 259:52; Edge et al. (1981) Anal.Biochem., 118:131; and Thotakura et al. (1987) Meth.Enzymol., 138:350.例、米国特許第5,869,046号を参照し、サルベージレセプター結合エピトープを提供することにより生体の半寿命が増加する改造法を参照。
ある実施形態では、防x-Id抗菌は、ここに記載されたものと異なる1つ以上のCDR配列(例えば、チョチア、強化チョチア、またはカバトCDR)を有する。1つの実施形態において、抗x-Id上記のCDR配列には、CDRが5-7アミノ酸の長さである場合の1、2、3、4のアミノ酸の置換、あるいはCDRが8のアミノ酸以上である場合のCDRの配列での1、2、3、4、5の置換などの1つ以上のCDR配列が含まれる。代替されるアミノ酸は、同じような電荷、疎水性、立体化学的特性をもつことがある。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換物は控えめな代替物である。「控えめなアミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、側鎖が似たような電荷をもつアミノ酸残基に置き換えたものである。類似の電荷を持つ側鎖を持つアミノ酸残基の家庭が本技術において定義されている。これらの家族は、基本的な側面鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側面鎖(例えば、アスパルチン酸、グルタミン酸)、非充電極性鎖(例えば、グリシン、アスパラジン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性鎖(例えば、アラニン、バリン、レウシン、イソレウシン、プロリン、フェニーラニン、メチオニン、トリプトパン)、ベータ枝分かれした側面鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソレウシン)、及び芳香性側面鎖(例えば、チロジン、フェニーラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有する家族を含む。他の実施形態において、アミノ酸置換物は、非保守的代替物である。置換CDRを含んでいるそれらの、あるいはそれらの、それらの、抗物質をスクリーニングして、興味のある抗生物質を識別することができる。
CDRと違って、構造枠組領域(FR)のより実質的な変化は、抗原の結合特性に悪影響を及ぼさずに行うことができる。FRの変化は、抗原接触または結合部位の安定化に重要な非人為的骨格または工学的骨格残留物を人間化すること、例えば、一定領域の階級または下層を変えること、Fc受容体結合のようなエフェクター機能を変化させる特定のアミノ酸残留物を変化させること(Lundら、J., Immun, 147:26S7-62 (1991); Morganら、Immunology, 86:319-24 (199S)))、または一定領域が由来する種を変えることを含むが、それに限定されない。
もう1つのタイプは、アミノ酸置換変形例である。これらの変種は異なる残基によって置き換えられた抗体分子における少なくとも1つのアミノ酸残基を有する。たとえば、抗生物質の代替的変調性に最も関心のある部位には超可変領域が含まれるが、フレームワーク領域(FR)の変調も考慮されている。
置換、すなわち突然変異誘発のための好ましい位置である抗x-Id抗体の特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、アラニンスキャニング突然変異誘発である。Cunningham & Wells, 244 SCIENCE 1081-85 (1989)を参照。簡単に言うと、標的残渣の残渣またはグループ(例、arg、asp、his、lys、gluなどの電荷を帯びた残渣)が確認され、中性または負電荷を帯びたアミノ酸(最も好ましくはアラニーンまたはポリアラニーン)に置き換えられ、アミノ酸と抗原との相互作用に影響する。置換に対する機能的感度を示すアミノ酸位置は、置換の部位またはその代わりの部位にさらにまたは他の変形例を導入することによって洗練されている。かくして、アミノ酸配列変動を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異自体の性質は予め決定する必要がない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するために、標的コドンまたは領域においてアラニンスキャンまたはランダム突然変異誘発を実施し、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングすることができる。
その効果において著しく異なる置換を選択することにより、たとえば、(i)代替の領域におけるポリペプチド背骨の構造、例えば、シートまたはらせん構造、(ii)標的部位での分子の電荷または排水性、(iii)側鎖の大部分を維持することにより、抗菌の生物学的特性の実質的な変形を達成することができる。自然に発生する残留物は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる:
(1) 疎水性の:ノルレウシン、met、ala、val、leu、ile;
(2) 中性親水性: cys、ser、thr;
(3) 酸性:アスプ、グルー;
(4) basic: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 鎖の方位に影響を与える残留物: gly、pro、および
(6) 芳香性: trp、tyr、phe。
非-保存的置換はもう1つのクラスに代えてのこれらのクラスの1つのメンバーを交換することを含む。保守的な置換とは、同じ種類のアミノ酸を交換することである。
上記抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基はまた、一般にセリンに置換されて、その分子の酸化に対する安定性を改善し得、そして異常な架橋を妨害し得る。逆に、システイン結合は、その安定性を改善するために、特に、Fvフラグメントのような、イノベーショングロブリンフラグメントである場合に、それを改善するために、それらに加えることができる。
別のタイプの代替的な変形例としては、1つ以上の超可変領域残基の親の代替がある。一般的には、結果として得られたバリエーション、すなわち、さらなる発展のために選択された上で定義された機能的等価物は、それらが生成された親抗力に関して生物学的特性を改善するであろう。このような上記変形例を生成するのに便利な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性熟成である。簡単に述べれば、数個の超可変領域部位(例えば、6~7部位)を、各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生じさせるために突然変異させる。各生じた抗体変種を、各粒子内にパッケージされたM13の遺伝子IIIに対する融合としてのフィラメント状ファージ粒子からの一価様式で表示される。次いで、ファージ-表示変種を本明細書中に開示されたそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)につきスクリーニングする。
修正のための候補部位可変領域を特定するために、アラニンスキャンのミューテージシスを行い、抗原結合に著しく寄与する部位可変領域残渣を特定することができる。代わりに、または、追加的に、抗原との間の接触点を特定するために、抗原-抗原複合体の結晶構造を分析することが有益であろう。そのような接触残基および隣接残基は、ここに技巧を凝らした技術に従った置換についての候補である。いったん生成されると、変形例のパネルは、ここに記載されるようにスクリーニングを受け、そして、1つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有するアソシエイトを、さらなる発展のために選択することができる。
本発明の抗生物質を修正すること、すなわち、エフェクター機能に関して機能的等価物を作成することが望ましい。例えば、抗原依存細胞媒介の細胞酸化性(ADCC)および/または/または、それに依存する細胞毒性(CDC)を強化することが望ましい。これは、1つ以上のアミノ酸の置換を、抗菌のFc領域に導入することによって達成することができる。別法として、または加えて、システイン残基をFc領域に導入することができ、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能とする。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、インターナリゼーション能力を改善し、および/または補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)を増加させた可能性がある。Caronら、176 J.実験医学1191-95 (1992); (1992); Shopes, 148 J.イミュノール。2918-22 (1992).抗がん活性を高めたホモディメリック抗生物質はまた、Wolffら、53 Cancer Research 2560-65(1993)に記載されているように、ヘテロバイファンクショナルクロスリンカーを用いて調製することもできる。あるいは、抗体は、これが二重のFc領域を有し、それによって高い補体溶解能力とADCC能力とを有し得るように操作することができる。Stevensonら、3 Anti-Cancer Drug Design 219-30 (1989).
例えば、米国特許に記載されているように、血清半減期を増加させるために、サルベージレセプター結合エピトープを(特にイムグロブリンフラグメント)の中に組み込むことができる。No.5,739,277。本明細書中に用いるように、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」とは、IgG分子のインビボ血清中半減期を増大させることを担うIgG分子のFc領域のエピトープをいう(例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4)。
E.x-id アンチボディの作成方法
この開示の抗x-Id抗物質(又はその抗原結合ドメイン)は、バクテリア細胞又は真核細胞中で生成され得る。興味のあるポリペプチドを作るために、ポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチドを構築し、表現ベクトルに導入し、適当な宿主細胞で表現する。標準的な分子生物学の技術は、組換え式ベクトルを準備し、宿主細胞を変容させ、変形者を選び、宿主細胞を培養し、それを回収するのに用いられる。
もし、その抗菌作用が細菌細胞(例えば、大腸菌)で表現されるならば、表現ベクトルは、菌細胞内でのベクトルの増幅を可能にする特性を持つべきである。さらに、JM109、DH5a、HBlOl、またはXL I-BlueなどのE. coliがホストとして使用される場合、ベクトルはプロモーター、例えばlacZプロモーター(Wardら、341:544-546(1989)、araBプロモーター(Betterら、Science、240: 1041-1043(1988))、またはE. coliの効率的な表現を可能にするT7プロモーターを持たなければならない。そのようなベクトルの例としては、例えば、M13一連ベクトル、pUC一連ベクトル、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-l (Pharmacia)、「QIAexpress system」(QIAGEN)、pEGFP、およびpET (この発現ベクトルが使用される場合、宿主は、好ましくは、T7 RNAポリメラーゼを発現するBL21発現ベクターは、抗体分泌のためのシグナル配列を含み得る。E. coliの周縁部への生成のために、ペルB信号シークエンス(Lei et al., J. Bacteriol., 169:4379 (1987)))を、検出シークエンスのための信号シークエンスとして使用することができる。細菌発現のために、塩化カルシウム法またはエレクトロポレーション法を用いて、発現ベクターを細菌細胞に導入することができる。
もし、その抗菌作用がCHO、COS、293、293T、およびNIH3T3細胞のような動物細胞で表現されるならば、これらの細胞における表現に必要なプロモーターを含む。例えば、SV40プロモーター(Mulliganら、性質、277:108(1979))、MMLV-LTRプロモーター、EF laプロモーター(水島ら、Nucleic Acids Res、18:5322(1990))、またはCMVプロモーターである。電池グローブリンまたはそのドメインをコード化する核酸シークエンスに加えて、再結合式ベクトルは、ホストセルにおけるベクトルの複製(例えば、複製の起源)および選択可能なマーカー遺伝子を規定するシークエンスのような追加的な配列を有することがある。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクトルが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、米国特許第4,399,216号、4,634,665号および5,179,017号を参照)。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクトルが導入された宿主細胞上で、G418、ヒグロマイシン又はメトトレキサートのような薬物に抵抗性を与える。選択マーカーを有するベクターの例としては、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が挙げられる。
一実施の形態では、抗生物質は哺乳類細胞で製造される。ポリペプチドを表現するための模範的な哺乳類宿主細胞には、中国のハムスターオバリ(CHO細胞)(ウルラウブとチャシン(1980)プロクに記載されているdhfrCHO細胞を含む)が含まれる。Natl.アカド。科学米国77:4216-4220。DHFR の選択可能なマーカーで使用されます。例: Kaufman and Sharp (1982) Mol に記載されています。生涯。159:601 621), 621), ヒト胚性腎臓293細胞(例えば、293、293E、293T)、COS細胞、NIH3T3細胞、リンパ球細胞系、例えばNSO骨髄腫細胞およびSP2細胞、ならびにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞。たとえば、電池は乳房上皮電池である。
本開示の抗物質は、宿主細胞の内部または外部(例えば媒体)から分離され、実質的に純粋で均質な抗物質として精製されることができる。ポリペプチドに一般的に用いられている単離精製方法は、ここに記載されている抗生物質の単離精製に使用することができ、特定の方法に限定されるものではない。抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析法、および再結晶を適切に選択し、組み合わせることによって単離および精製され得る。クロマトグラフィーには、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、水泳クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが含まれる(タンパク質精製および特性評価のための方策:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。HPLCやFPLCのような液相クロマトグラフィーを用いてクロマトグラフィーを行うことができる。親和性クロマトグラフィーに用いられるコラムには、タンパク質Aカラムとタンパク質Gカラムがある。タンパク質Aカラムを用いたカラムの例としては、Hyper D、POROS、およびSepharose FF (GEヘルスケアバイオサイエンス)がある。本開示には、これらの浄化方法を用いて高度に精製された抗物質も含まれる。
本開示は、また、本明細書に開示されている、核酸分子又はアンチ-x-Id抗原結合分子をエンコードしている一連の核酸分子を提供する。一実施の形態では、本発明にはポリペプチドチェーンをエンコードしている核酸分子が含まれており、これは、本明細書に記載されている、アンチ-Id抗原結合分子のL鎖を構成している。一実施の形態では、本発明は、本説明のように、防x-Idの重鎖またはそれらの抗原結合分子を含むポリペプチドチェーンをエンコードする核酸分子を含む。
また、上記核酸分子または核酸分子のセットまたはそれらの補完物を含むベクターまたはベクトルのセット、ならびにベクターを含む宿主細胞が提供される。
本発明は、また、本開示されている宿主細胞を培養し、また、それらの抗原結合分子あるいはキメラ分子を培養媒体から回収することを含む、本開示されているx-Id又は抗原結合分子又はキメラ分子を作る方法を提供する。
本明細書に開示されたx-Id抗原結合分子、又は本明細書に開示されたキメラ分子を再結合して生成するために、様々な方法が利用可能である。このコードの劣化のために、様々な核酸配列がポリペプチドのアミノ酸配列をエンコードすることが理解されるであろう。望ましいポリヌクレオチドは、デノボ固相DNA合成または初期に調製されたポリヌクレオチドのPCRミューテージェネシスによって作ることができる。
リコンビネート生成のために、ポリペプチド(例えば、ここに開示されているx-Id binding ex または抗原結合分子)をエンコードしているポリヌクレオチド配列(例えば、ここに開示されているx-Id coding ex またはここに開示されているキメリック分子)を、適切な表現車両、すなわち、挿入されたコーディングシークエンスの転写および翻訳に必要な要素を含むベクトル、または、rna viral vectorの場合には、複製および翻訳に必要な要素を含むベクトルに挿入する。
ポリペプチドをエンコードしている核酸(例えば、ここに開示されているx-Id抗原結合分子、またはここに開示されているキメラ分子のいずれか)は、適切な読み取りフレームでベクトルに挿入される。その後、表現ベクトルを適切な標的細胞に変換し、ポリペプチドを表現する。本技術に知られているトランスフェクション技術には、カルシウムリン酸析出(Wiglerら、1978年、Cell 14:725)およびエレクトロラゾレーション(Neumannら、1982年、EMBO J. 1 :841)が含まれるが、これに限定されない。多様な宿主表現ベクトルシステムを用いて、ここに記載されたポリペプチド(例えば、本明細書に開示されたx-Id抗原結合分子、または本明細書に開示されたキメラ分子のいずれか)を真核細胞中で表現することができる。1つの実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞を含む動物細胞である(例えば、293細胞、PerC6、CHO、BHK、Cos、HeLa細胞)。ポリペプチドが真核細胞中で表現されるとき、ポリペプチドをエンコードするDNA(例えば、ここに開示されたx-Id抗原結合分子またはここに開示されたキメラ分子のいずれか)もまた、ポリペプチドを秘密にすることを可能にするシグナル配列のコードである。当業者は、ポリペプチドが翻訳される一方で、シグナル配列が細胞によって切り離されて成熟したキメラ分子を形成することを理解するであろう。様々な信号配列が当業者に知られており、熟練者になじみがある。あるいは、シグナル配列が含まれていない場合には、ポリペプチド(例えば、ここに開示されているx-Id抗原結合分子、またはここに開示されているキメラ分子のいずれか)を、電池を分解することによって回収することができる。
F.CDR3代替品
本発明は、xクローノタイプのCDR3アミノ酸の代替物である: CARQEDTAMVYYFDYW (SEQ ID NO:1)が、1型糖尿病及び他の自己感染症を治療するとともに、T1Dを開発するための危険にさらされている個人を特定することを意図している。ある実施形態では、CDR3置換物は、MHCクラスII分子またはTCRに対するx-クローン型または超可変領域(すなわち、CDR3)ベアリングx-クローン型もしくは関連配列を有する抗体の結合または相互作用を増加させることによって、x-クローン型の抗原活性を正に調節する置換誘導体を含むことができる。これらの誘導体は、変調器またはワクチンモダリティとして使用することができる。これらの置換には、例えば、x-クローノタイプの異なる配列位置におけるアラニンスキャン誘導体、ならびにx-クローノタイプの異なる配列位置における非保存的置換が含まれる。他の実施形態において、CDR3の置換物は、MHCクラスII分子またはTCRとの超可変領域(CDR3)におけるxクローノタイプを含むxクローノタイプまたはxクローノタイプの結合または相互作用を減少または廃止することにより、xクローノタイプの抗原活性を否定的に変調する代替誘導体を含む。これらの置換には、例えば、x-クローノタイプの異なる配列位置におけるアラニンスキャン誘導体、ならびにx-クローノタイプの異なる配列位置における非保存的置換が含まれる。本発明はまた、ここに記載されている抗生物質のアミノ酸置換を熟考する。
G.医薬組成物
本開示はまた、(i)本明細書に開示されている、1つ以上の(i)x-Idおよび抗原結合分子、(iii)x-Idおよび抗原結合分子をエンコードしている核酸分子または核酸分子、(iii)本明細書に開示されているベクトルまたは一組のベクトルおよび一組のベクトルならびに薬学的に許容可能な担体からなる医薬品組成物を提供する。
本記載のAnti-x-Id抗毒素又はそのフラグメントは、例えば、ここに記載された障害を治療するための、被検者の管理のための医薬組成物として定式化することができる。典型的には、医薬品組成物には、薬事上薬学的に許容可能な担体が含まれる。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に両立である任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および防黴剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。この組成物には、薬学的に許容可能な塩、例えば酸付加塩または塩基付加塩(例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharmを参照)が含まれ得る。科学66:1-19).
薬学的製剤はよく確立された芸術であり、さらに説明される。例えば、Gennaro(編)、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Willikins (2000) (ISBN: 0683306472)、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727)、Kibbe (編)。
医薬組成物は、様々な形態をとることができる。例えば、液体、半固形及び固形の剤形(例えば、注射可能及び不可能な液体)、分散又は懸濁物、タブレット端末、ピル、パウダー、リポソーム及び鎮圧剤を含む。好ましい形態は、意図する投与方法及び治療上の適用方法に依存する。本書に記載されている剤の典型的な組成物は、注射可能又は不可能な解決策の形成である。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、クエン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、一塩基性リン酸ナトリウム、Tween(登録商標)-80、および安定剤などの賦形剤材料と共に製剤化される。それは、例えば、適当な濃度の緩衝溶液中で提供され、2～8℃で貯蔵されることができる。いくつかの他の実施形態では、組成物のpHは、約5.5から7.5の間である(例えば、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5)。
医薬組成物はまた、製剤化された場合に抗体の凝集を減少させる薬剤を含むことができる。凝集還元剤の実施例には、メチオニン、アルギニン、リジン、アスパルチン酸、グリシンおよびグルタミン酸からなるグループから選択された1つ以上のアミノ酸が含まれる。これらのアミノ酸は約0.5mMから約145mM (例:0.5mM、m1M、m2M、m5M、m10M、m25M、m50M、100mM)の濃度に形成される。医薬組成物にはまた、砂糖(例えば、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール)及び/又はトニシティ調整剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール)及び/又は界面活性剤(例えば、ポリソルベート20又はポリソルベート80)を含むことができる。
この組成物は、高濃度で安定貯蔵するのに適した、液体、ミクロエマルジョン、分散、リポソーム、または他の秩序立った構造として定式化することができる。滅菌注射溶液は、必要量の本明細書に記載の薬剤を、適当な溶媒中に、必要に応じて、上記に列挙した食材の1つまたは組み合わせと混合し、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。
一般的に、分散剤は、ここに記載された剤を、基本分散媒体と上記に列挙されたものから必要な他の成分を含む不毛の車両に取り込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、本明細書に記載した薬剤の粉末に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意のさらなる所望の成分を生じる。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用い、分散の場合は必要な粒径を保ち、かつ界面活性剤を用いることによって維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物の中にモノステアリン酸塩やゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を含める事により達成できる。
特定の実施形態では、抗体は、インプラントを含む制御放出製剤、およびマイクロカプセル化送達システムなどの、化合物を急速放出から保護する担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生物分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤の準備のための多くの方法が特許または一般的に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978)を参照。
一実施形態では、医薬製剤は、約0.005mg/mL～500mg/mL (例えば、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL mL、450mg/mL、500mg/mL)、薬学的に許容される担体と濃度製剤化する。幾つかの実施例では、抗菌蒸留水又はリン酸緩衝生理食塩水中で、この抗菌を調合する。製剤のpHは5.5から7.5(例:5.5、5.6、7.5、7.8、5.6、9.6、0.6、1.6 2.6、3.6、4.5、6.6、7.6、8.6、9.7.0、7.1、7.3、7.4、7.5)の間である。
医薬組成物は、本明細書に記載される薬剤の「治療有効量」を含み得る。このような効果量は、管理された剤の影響、あるいは複数の剤が使用された場合の剤の組合せ効果に基づいて決定することができる。治療効果のある薬の量もまた、個々の病状、年齢、性別、体重などの要因、および複合体が個々に望ましい反応を引き出す能力、例えば、少なくとも1つの障害パラメータの改善または少なくとも1つの障害の症状の改善によって変化することがある。また、治療有効量は、組成物の有毒または有害な影響が、治療上有益な効果によって上回る量でもある。
1.投与
それをエンコードしている抗毒剤又は抗原結合フラグメント、又はそれと同一の核酸は、例えば、それを必要としている被検者、例えば、人間又は動物の被検者に、様々な方法で管理することができる。多くの用途のために、投与経路は、静脈内注射または非経口、注入(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)、または筋肉内注射、腫瘍内(IT)のいずれかである。他の親権行政形態も利用できる。そのようなモードの実施例は:動脈内、くも膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、関節内、関節下、くも膜下、脊髄内、及び硬膜外及び盗血内注射を含む。
一実施形態において、本発明の抗生物質の投与経路は、親権的である。本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与を含む。親権行政の静脈的形成が好まれる。これらの行政形態は、明らかに本発明の範囲内であると考えられるが、行政形態は、射出のための解決策、特に、静脈投与射出又は点滴のための解決策であろう。通常、射出のための適切な医薬組成物は緩衝剤(例えば、アセテート、リン酸又はクエン酸緩衝剤)、界面活性剤(例えば、ポリソルベート)、任意の安定剤(例えば、人間のアルバミン)などを含み得る。しかしながら、本明細書の教示に適合する他の方法において、ポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達され得、それによって、治療薬剤への患部組織の露光を増加させる。
親の行政のための準備として、不毛の水性又は非水性のソリューション、吊り下げ、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステルである。水性担体は食塩および緩衝剤を含む水、アルコール/水溶液、懸濁液または乳濁液などである。
薬学的に許容可能な担体には、限定されないが、0.01-0.1M及び好ましくは0.05Mのリン酸緩衝剤又は0.8%の食塩水が含まれる。他の一般的な親の車両としては、リンガーデキストロース、デキストロース、塩化ナトリウム、乳酸リンガー、固定油などがある。輸液車両には、流体及び栄養補給剤、リンガーデキストロースに基づくもののような電解質補給剤等が含まれる。保存剤及びその他の添加物もまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、チーリング剤、不活性ガス等のように存在することができる。
より具体的には、注射可能な使用に適した医薬品組成物には、不毛の水性液体(水溶性の場合)または不毛の注射可能な液体または散布の即時調製のための散布および不毛の粉末が含まれる。このような場合、組成物は不毛でなければならず、注射性が容易な範囲で流動的でなければならない。製造・保管条件の下で安定し、バクテリア・キビ等の微生物の汚染対策が望まれます。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合に必要な粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持される。
微生物の作用防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビック酸、チメロサル等、各種抗菌・抗菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的な吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばモノコテアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより成すことができる。
いずれの場合も、滅菌注射可能な溶液は、必要量の活性化合物(例えば、それ自体で、または他の活性薬剤と組み合わせて、ポリペプチド)を、適当な溶媒中に、本明細書に列挙される食材の1つまたは組み合わせと、必要に応じて、組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。
一般的に、分散剤は、基本的な分散媒体と、上記に列挙したものから必要な他の成分を含む殺菌車両に、活性剤を取り入れることにより調製されます。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、活性成分の粉末と、その以前に無菌濾過された溶液からの任意のさらなる所望の成分とを生じる。注射用調製物は、処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたは瓶などの容器に充填され、当技術分野で公知の方法に従って無菌条件下で密封される。また、キットの形成で包装して販売することも可能です。このような製造品は、好ましくは、その関連組成物が、凝固障害に苦しんでいるか、または生じやすい被検者を扱うのに有用であることを示す標識又は小包入りのチラシを有するであろう。
本開示の組成物の効果的な量は、状態の治療のために、行政手段、標的部位、患者の生理状態、患者が人間であるか動物であるか、他の治療が行われるか、治療が予防的であるか治療であるかを含む多くの異なる要因により異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。処理量は、安全性と有効性を最適化するために、当業者に知られている日常的な方法を用いて、適応させることができる。
また、例えば、被検者を監視することにより、当該抗x-Id抗菌物又はそのフラグメントの投与の経路及び/又は様式も、個々のケースに合わせて調整することができる。
また、一定量、または、1kgあたりの量として、そのような抗菌剤又はそのフラグメントを摂取することができる。また、アンチx-Id 又はそのフラグメントに対する抗毒剤の生成を減少又は回避するためにも、使用量を選択することができる。治療レジメンは、治療効果やコンビナトリアル・セラピー効果など、望ましい反応を与えるように調整される。一般的には、抗体入手可能な量のエージェントを被検者に提供するために、それらの(及び任意の第二のエージェント)の量を使用することができる。例えば、0.1～100mg/kg、0.5～100mg/kg、1mg/kg～100mg/kg、0.5～20mg/kg、0.1～10mg/kg、または1～10mg/kgの範囲の用量を投与することができる。その他の薬も使用できます。特定の実施形態では、OOC又はそのフラグメントを処理しなければならない被検者に、約1mm/kg～約30mm/kgの量で、それを記載する。いくつかの実施形態において、抗x-Id抗体またはそのフラグメントによる治療を必要とする被検者に、抗体またはそのフラグメントを、1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、または50mg/kgの用量で投与する。特定の実施では、1kg/kgから3kgの量の下皮下で、それらの抗菌剤又は断片を管理する。別の実施形態では、それらの抗菌剤又はそのフラグメントを4mm/kg～30mm/kgの量で静脈注射する。
組成物は、約1mg/mL～100mg/mlまたは約10mg/mL～100mg/mlまたは約50～250mg/mLまたは約100～150mg/mlまたは約100～250mg/mlの抗体またはそのフラグメントを含み得る。
ここで使用する「固定量」とは、被検者が扱われるための単一の量として適した物理的に離散した単位をいう。各単位は、必要な医薬品担体と関連し、かつ、オプションで他の剤と協力して所望の治療効果を生み出すように計算された、所定の量の抗菌剤又はそのフラグメントを含む。1回または複数回の投薬を行うこともあります。別の方法、または、添加、それらの抗菌剤またはフラグメントを連続注射によって使用することができる。
抗体またはそのフラグメント用量は、少なくとも2用量、3用量、5用量、10用量、またはそれ以上、例えば、1日1回もしくは2回、または1週間につき約1～4回、または好ましくは週1回、隔週(2週間毎)、3週間毎、月1回、例えば、約1～12週間、好ましくは2～8週間、より好ましくは約3～7週間、さらにより好ましくは約4、5、または6週間を包含するのに十分な期間(治療過程)、周期的時間で投与することができる。被検者を効果的に処理するのに必要な量や時期に影響を与える要因には、たとえば、病気や障害の段階や重度、調合、送達の経路、以前に行った処理、被検者の全般的な健康状態や年齢、その他の疾病があります。さらに、治療有効量の化合物による被検者の治療は、単一の治療を含むことができ、または好ましくは、一連の治療を含むことができる。
ここに記載されている障害の開始の危険にさらされている被検者であれば、例えば予防策として、障害の完全な開始前にそれらの抗菌剤またはフラグメントを使用することができる。このような予防的処置の時間は、単一の量の、又はその断片であり得るか、又はその処置が継続され得る(例えば、複数の量)。例えば、障害の危険にさらされている被検者や障害の傾向がある人には、その障害が起きるのを防ぐために、数日間、数週間、数ヶ月間、あるいは数年にわたって、あるいはそのフラグメントで治療することができます。
一定の実施例では、液体又は断片を、1ag/ml(例:1ag/ml、2 agm/ml、2 agm/ml、3ag/ml、3ag/ml、20 agml、5/ml、20gram/ml、20 agml、20 agml、25/ml、25gram/ml、25 agml、30 agml、35/ml、40 agml、45/ml、50 agl/ml、50 agml、55/ml、55/ml、60gram/ml、65g/ml、60gram/ml、70ag/ml、75ag/ml、75ag/ml、80gram/ml、85gram/ml、85ag/ml /mL, 400 mg/mL, 450 mg/mL).1つの実施形態において、抗x-Id抗体またはそのフラグメントは、50mg/mLの濃度で皮下投与される。別の実施形態では、約1mm/mlから約500mm/mlの濃度で、それの抗菌剤又は断片を静脈的に注射する。一実施の形態では、それらの抗菌剤又は断片を50mm/mlの濃度で静脈的に管理する。
上の範囲における中間体の量はまた、本発明の範囲内であるように意図されている。被検者は、毎日、他の日に、毎週、または経験的解析によって決定される任意の他のスケジュールに従って、上記用量を投与することができる。例えば、少なくとも6ヶ月間など、長期間にわたって複数の投与を行うことが典型的な処理である。2種類以上のポリペプチドを同時に使用する方法もあるが、それぞれのポリペプチドの量が記載された範囲内である場合もある。
本発明のポリペプチドは、複数回に分けて使用することができる。1日、週間、月間、年間の間隔があります。また、患者の血液レベルの変化したポリペプチドまたは抗原を測定することによって示されるように、間隔は不規則である。あるいは、ポリペプチドは徐放性剤として使用することができるが、この場合、より少ない頻度での管理が必要となる。患者のポリペプチドの半減期によって、使用量や頻度は様々である。
投与量および投与頻度は、処理が予防的であるか処理的であるかによって異なることができる。予防出願において、本発明のポリペプチド又はそのカクテルを含む組成物は、患者の抵抗を高めるか、又は病気の影響を最小限に抑えるために、病気状態にすでにいない患者に与えられる。このような量を「予防効果の高い量」と定義し、比較的少ない量を長期間にわたって頻繁に行う。患者さんによっては、生涯にわたって処理を受け続ける場合もあります。
H.治療用機器・キット
Anti-x-Id bid又はそのフラグメントをキットに提供することができる。一実施の形態において、キットは、(a)ここに記載されているように、Anti-x-Id bidを含む組成物又はそのフラグメントを含む容器と、任意の(b)情報材料を含む。情報資料は、ここに記載された方法及び/又は治療的利益のための薬の使用に関連する説明的、指示的、マーケティング又はその他の材料であり得る。
実施の形態では、本キットはまた、ここに記載された障害を治療するための第2の薬を含む。例えば、キットは、Anti-x-Id bid又はそのフラグメントを含む組成物を含む第1のコンテナと、第2のエージェントを含む第2のコンテナを含んでいる。
キットの情報資料は、その形成に限定されていない。一実施の形態では、情報資料は、複合物の製造に関する情報、複合物の分子重量、濃度、賞味期限、バッチ又は製造現場情報等を含むことができる。一実施形態において、情報資料は、抗x-Id抗体またはそのフラグメントを、例えば、本明細書に記載の疾病を有しているか、またはその危険にさらされている被検者を治療するために、好適な投与量、剤形、または投与様式(例えば、本明細書に記載の投与量、剤形、または投与様式)で投与する方法に関する。情報は、様々なフォーマットで提供することができ、印刷されたテキスト、コンピュータ可読の素材、ビデオ記録、またはオーディオレコーディング、あるいは、インターネットなどの実質的な素材へのリンクまたはアドレスを提供する情報を含むことができる。
Anti-x-Id bid又はそのフラグメントに加えて、本キット内の組成物は、溶媒又は緩衝剤、安定剤又は防腐剤のような他の成分を含むことができる。防x-Id/フラグメントは、任意の形態、例えば、液体、乾燥又は親水性の形態であれば、好ましくは実質的に純粋かつ/又は不毛であれば、提供することができる。液体で提供する場合は、液体であることが望ましい。特定の実施形態では、液体溶液中の抗x-Id抗体またはそのフラグメントは、約25mg/mL～約250mg/mL (例えば、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、75mg/mL、85mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、および200mg/mL)の濃度である。アンチ・x-Id抗菌剤又はそのフラグメントを、凍りついた製品として提供する場合には、アンチ・x-Id/フラグメント、又はそのフラグメントは、約75mm/vial～約200mm/vial(例えば、100mm/vial、108.5mm/vial、125mm/vial、150mm/vial)である。硬化した粉末は、一般に適当な溶剤を加えることによって再構成される。溶媒、例えば無菌水または緩衝剤(例えばPBS)は、任意でキットに提供することができる。
このキットは、薬品を含む組成物または組成物のための1つ以上のコンテナを含むことができる。幾つかの実施形態において、本キットは、組成物及び情報材料のための、別容器、ディバイダ又はコンパートメントを含む。例えば、ボトル、バイアル、又は注射器に組成物を入れることができ、情報材料をプラスチック製の袖又は包装に入れることができる。他の実施形態では、キットの別々の要素が、単一の、分離されていない容器内に含まれる。例えば、組成物は、ラベルの形成で情報資料に付属されたボトル、バイアルまたはシリンジに含まれる。幾つかの実施形態において、本キットは、1つ以上の単位量の形態(例えば、ここに記載された量の形態)を含む個々の容器の複数の(例えば、パック)を含む。容器には、例えば、Anti-x-Idのいずれか又はそのフラグメントを含む単位量と、第2の剤、例えば、所望の割合を含む単位量を含むことができる。例えば、本キットは、複数の注射器、アンプル、箔パック、ブリスターパック、又は医療用具、例えば、各々1つの組み合わせ単位量を含む。キットの容器は、気密で、防水(例えば、水分や蒸発の変化に対して不浸透性)であり、また/または光きついものである。
このキットは、任意に、組成物の投与に適した装置、例えば、シリンジ又は他の適切なデリバリー装置含む。装置は、剤の一方または両方を事前にロードするか、空にすることができますが、ロードに適しています。
さらなる詳細な説明なしには、先の説明を用いて、当業者は本発明を最大限に利用できると信じられている。以下の実施例は、単に実施例示的であり、いかなる方法であれ、開示の残りの部分を制限するものではない。
以下の実施例は、本発明に記載され、クレームされる、また/または方法が、純粋に実施例示的であり、発明者が発明とみなす範囲を限定する意図を持たないように、どのようにして、化合物、組成物、成形品、装置、および/または、本技術に記載され、評価されるかを完全に開示し、説明するために提示される。数字(例:数量、温度など)に関しては、正確さを確保するよう努めてきましたが、ここに誤りや逸脱がある場合はカウントする必要があります。特に注意しない限り、パーツは重量によるもの、温度は摂氏によるもの、または周囲の温度によるもの、気圧は大気またはそれに近いものである。反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力および記載されたプロセスから得られる生成物純度および収率を最適化するために使用することができる他の反応範囲および条件の多数の変動および組み合わせがある。このようなプロセス条件を最適化するには、合理的で日常的な実験のみが必要である。
T細胞とB細胞は2つの既知の適応免疫細胞である。ここでは、TCRとBCRのデュアル・エクスプレッサー(DE)であり、B細胞とT細胞の重要な系統マーカーである、これまで知られていなかったリンパ球について述べる。1型糖尿病(T1D)では、DEsはその抗原結合部位に強力なCD4 T細胞自己抗原をコードする1つのクローンタイプ(x‐イディオタイプと呼ばれる)によって優勢である。分子動力学シミュレーションは、x‐イディオタイプペプチド(x‐Id)が糖尿病誘発性HLA‐DQ8に対する最適結合登録を有することを明らかにした。一致して、合成されたx-Idペプチドは安定なDQ8錯体を形成し、T1D由来の自己反応性CD4 T細胞を強力に刺激するが、健常対照者では刺激しない。さらに、x-クロノタイプ-OOBmAbはCD4 T細胞に対して自己反応性であり、CD4 T細胞へのインスリントランスマーの結合を阻害する。このように、適応免疫細胞のT細胞とB細胞への区画化は絶対的なものではなく、このパラダイムの違反因子は自己免疫疾患の鍵を握るものである可能性が高い。
(実施例1)1型糖尿病患者由来のユニークな二重受容体発現リンパ球に存在する公衆BCRは強力なT細胞自己抗原を符号化する
素材と方法
人間の被検者
末梢血サンプルは、Johns Hopkins Institutional Review Boardにより承認されたプロトコルを用いてドナーから入手した。すべてのドナーは、文書によるインフォームド・コンセントを提供した。T1D被検者はいずれも米国糖尿病学会の分類基準を満たしており、ジョンズホプキンス総合糖尿病センターで募集した。T1Dのないドナーは健常対照(HC)に分類され、正常ボランティアから募集された。ドナーの臨床的特徴を表1Aに要約する(データは示していない)。調査はヘルシンキ原理の宣言に従って行われた。Ficoll‐paque密度遠心分離(GE Healthcare)グラデーションを用いて、末梢血単核細胞(PBMCs)を新たに分離した。レパートリーをハイスループットで分析した被検者の膵島自己抗体プロフィールおよびHLA遺伝子型(表1Bおよび1C、図示せず)を、デンバーのバーバラ・デービス中心自己抗体/HLAコアラボで、確立された方法を用いて実施した。
フローサイトメトリー解析
LSRII多色フローサイトメーター(BDバイオサイエンス)を用いて細胞型を分析した。簡単に言うと、確立された方法(Dai et al., 2015; Martina et al., 2015)を用いて、示されたフッ素結合抗物質(主要資源表(示されていない))の所定の最適な濃度で、単セル吊りが氷上で20分間表面汚れた。獲得した試料(5 x 105 ～ 1 x 106 のライブイベント)は、単一の色の汚染で適切に補償されました。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータ解析、ゲーティング、及びグラフィック表示を行った。FSC-Height vs FSC-Width and SSC-Height vs SSC-Width plotsを用いた分析からダブルセットを除外した。複数の特殊性のコントロールが用いられた。これらには、CD5、CD19、TCR、IgD、ダンプゲート、および同型制御用のヒトFcRブロッキング試薬(Miltenyi Biotec)、蛍光マイナスワン(FMO)が含まれた。また、適切な場合には、不適切な細胞タイプが内部生体情報制御として使用され、in vitro刺激の場合には、我々は、ネガティブコントロールとして、計量されていない文化を使用した。
画像(AMNIS)
新しく分離されたPBMCはFITC結合反TCRαβ、ポリエチレン結合反IgD、APC結合反CD5、およびBV421結合反CD19で染められ、INSPIREソフトウェアを用いて低流速/高感度のImage Streamフローサイトメーター(アムニス社)でX60倍率で分析された。試料ごとに10,000件のイベントが獲得された。補償マトリックスの作成、各蛍光色素に対する最適レーザ出力の設定およびカメラの飽和を避けるために、単一のカラーコントロールを使用した。スペクトルクロストークを修正するために、すべてのファイルに補償マトリクスを適用した。正のカットオフ値はTCRαβの明るいディテール類似度(BDS)背景と不適切な信号(例えば側散乱)に基づいて計算されました。画像解析は、セルバウンダリーを設定し、内部化イベントのゲートを設定するために明るいフィールド画像を使用して、IDEAS 6.2ソフトウェアパッケージで実行された。補償データファイルは、傾きRMSと単一イベントと一致し、破片や多層セルラー事象のないアスペクト比(ダブレット)に基づいて、フォーカスセルを選択するゲーティング戦略を用いて分析された。TセルとBセルシングレットは、この方策を用いて、視野内での良い品質、フォーカスシングレットの選択により、最終ゲートの精緻化を可能にした。Tcon及びBcon電池のゲート後、表面プロフィール(CD19＋CD5＋TCR＋IgD＋)に基づき、個々のIgD＋DE電池を識別し、指摘マーカーについて分析した。明視野イメージは、LEDベースの明視野照明装置で収集した。各プロットを手動で調整し、取得開始時に発生したマシンノイズをゼロに設定しました。
単細胞の「R-seq」データの生成と処理
FACS分類単セル(分類方策については図12Aおよび12Bを参照)は、以下の修正を加えてSmart-seq2プロトコル(Picelliら、2014)で処理された。RNAClean XPビード(Beckman Coulter)を用いた逆転写の前にRNA精製を行った。cDNAは21 PCRサイクルで増幅され、その後AMPure XPビードでDNAクリーンアップされた。ライブラリーは、カスタムバーコードアダプターを使用して、Nextera XT Library Prep kit (Illumina) を使用して作成しました。バーコード化されたユニークなライブラリーは、NextSeq 500 シーケンサ(Illumina)で一緒に配列されました。
scRNA-seqデータのバイオインフォマティクス解析Lun et al. (Lun et al., 2016)により記載された方法に従い、Rバイオコンダクターパッケージスキャターを用いて、scR-seqデータ上でQC確認を行った。QCメトリック量には、図書サイズ、表明された特徴の数、ERCCスパイクインコントロールの割合、および実験設計にネガティブコントロールとして含まれた3つの空の井戸が含まれていた。3つの空の井戸に加えて、93個の生物学的(B、TおよびDE)細胞のうち18個は、ログライブラリーサイズおよび/またはログ変換された写本の数が、中央絶対偏差(MAD)を3以上吹き飛ばし、低品質の外れ値試料としてフィルタアウトされた。別のDE電池D07は、最大3つの空の井戸を下回るライブラリーサイズを持ち、低品質のサンプルと見なされた。19の低品質の生物細胞試料のうち、12/45はDE細胞、6/24 Bcon細胞、1/24 Tcon細胞である。すべての19細胞は空の井戸よりも小さく、またはそれに匹敵する大きさの図書館を持っていた。74の良好な品質の試料のうち64の配列決定深さは、1～300万読み取りであり、飽和に達するとみなされ、一方、他の10の試料は、0.7～100万読み取りの深さを有し、大多数の遺伝子の検出に良好である(Michelら、2012; Wuら、2014; Ziegenhainら、2017)。配列決定アッセイキットには、制御に12のERCCスパイクも含まれた。19の低品質電池は、ERCCスパイクインのパターンが上の良質電池と類似しており、増加を示さなかった。細胞の大部分が高品質であると仮定すると、すべての細胞で内在性RNAの消失はほとんどないことが示唆される。まとめると、上記の分析は、scRNA-seq実験の良好な全体的品質を示唆している。
生物学誘導方策の後、scRNA‐Seqデータの下流分析を、log2(RSEM値+1)>0を有すると定義される3つのハウスキーピング遺伝子(PPIA、ACTB、およびUBB)の少なくとも2つが検出された細胞に限定した。これは77の高品質の細胞をもたらした。Bcon電池、Tcon電池、またはDE電池のいずれかで優先的に表現される世代は、テンプレートマッチング法を用いて同定された。この方法は、ピアソンの積モーメント相関係数(PavlidisおよびNoble, 2001)を用いて、各プロファイルと理想的、クラスターあるいは条件特有のプロファイルを表現する人造プロファイルとの間の関連性を検定する。Holmの方法(Holm, 1979)を用いて複数の試験補正を行った。単セルで表現されたBCRとTCRの記録を同定するために、基本 (Canzar et al., 2017)を用いた。基本がBCRまたはTCR転写産物を集合させることができるかどうかに従って、各細胞にアノテーションを行った。
ポリクローナルTCR刺激
Anti-CD3/CD28ビーズ(106ビード/ウェル)の有無にかかわらず、新しく分離したPBMCを24ウェル組織培養プレートの井戸(1ml完全栽培メディアに106電池)の上に置き、37oCおよび5% CO2でインキュベートした。また、Anti-CD3(10mmug/ml)とAnti-CD28(10mmug/ml)をコーティングしたプレートを使用した(Yoneshiro et al., 2017)。7日間の培養後、生存細胞を収穫し、トリパンブルーを用いて数え、BD LSRIIフローサイトメーターを用いて、指摘分子の表現を分析した。絶対細胞数は、示されたサブセットの周波数に生存細胞数を掛け合わせて決定した。
CFSE拡散アッセイ
新しく分離されたPBMCは、汚れに影響を密度血清を除去するために、温(37o C)1x PBSで2回洗浄され、電池は1.5～2.0×106電池/mlで温(37C o)1x PBSで再消費された。細胞には37℃で1～2分間、連続渦巻きにより1mm CFSE (eBioscience)とラベル付けした。標識反応は冷えた完全な文化媒体を加えることで消した。CFSE標識細胞は、1x PBSで洗浄され、完全なメディアで再消費され、24ウェル組織培養プレート(1.5～2.0×106セル/ウェル、1ミリリットルの完全なカルチャーメディア)にめっきされた。HLA‐DQ8分子の機能性を評価するために、24ウェルプレート(10μM)のウェルに、HC#1由来のIgD＋DE(hIdと呼ばれる)由来の標識ペプチド(x‐Id、TP‐Id、mimotope、天然インシュリンおよびCDR3ペプチド)を担持したDQ8分子を固定化し、PBMCの中からCFSE標識CD4 T細胞を刺激するそれらの能力を調べた。並行実験で、マウス防HLA‐DQ(SPV‐L3; Abcam)および防HLA‐DR(L243; Abcam)の存在下(20 uM)で培養を活性化し、MHC制限を評価した。同様に、CFSE標識細胞もまた、可溶抗原として上述のペプチド(10mm)の有無で刺激された。別の実験では、mAb固有の拡散反応を評価するために、2.5および5ugの純化されたAbmRおよびmAbN (方法で後述)濃度を24ウェルプレートの井戸に固定し、CFSEラベルのPBMCを刺激するために用いた。刺激なしおよびCD3-28刺激ありのCFSE標識細胞を、それぞれ比陰性および陽性対照としてとった。7日間のインキュベーションの後、CFSElow CD4 T細胞の周波数を決定することによって評価された、図のレジェンドと拡散に示されるように、文化は染められた。
細胞内サイトカイン分析
Golgi-Plug (Saxena et al., 2017; Xiao et al., 2011)の存在の下で、フォルボル12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA) (50ng/ml)およびイオノマイシン(500ng/ml)を用いて、5% CO2で37oCで4時間刺激した。細胞内サイトカイン分析はメーカーの指示を用いて行った。簡単に言うと、表面に汚れた試料を固定し、mAbsを用いて指示された細胞内サイトキンに対して30分間浸透させ、洗浄し、獲得し、上述の方策を用いて分析した。
抗IgM刺激
RPMI‐1640媒体の新しく分離されたPBMC(1X106)を刺激の30分前にCO2インキュベーターで37oCで休息させた。BCR信号化は、記載された時点のCO2インキュベーターの37oCで、BCRと10mmug/mlの山羊F(ab-2(Jackson ImmunoResearch)を交差させることによって引き起こされた(Wangら、2014)。逆時点で各標本にAnti-IgMを加え、全標本を一斉に固定することにより、時間経過分析を達成した。リン酸化の基礎レベルを決定するために、非刺激PBMCの平行培養物を時間ゼロで固定した。リン化CD79a (pIgα)を検出するために、電池を固定(1.5%パラホルムアルデヒド、5分、室温)、浸透(90%メタノール、10分、4°C)し、pCD79A (Igα、Tyr82)に特有のウサギに染め、続いてPE結合ヤギ反ウサギIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories)した。
IGHVおよびTRBの高スループット配列決定のための細胞選別およびDNA抽出レパートリー分析のために、IgD＋およびIgD－DE電池、Bcon、およびTcon電池をFACSAria II (BD Biosciences, Bedford, MA)を用いて新しく隔離されたPBMCからソートした。
分離方策および分離細胞集団の純度は、図12Aおよび12Bに示されている。各ドナーから2種類の分類を行い(HC#2を除く)、IGHVに使用された1種類とTRB分析に使用された2種類の分類を異なる時点で実施した。膵島自己抗体およびHLA遺伝子型を含むドナーの特徴を以下に示す(表1、図には示していない)。自己Bcon電池を、IGVH解析のための制御およびTRB解析のためのTcon電池として使用した。簡単に言うと、分離したばかりのPBMCは、CD19、CD5、IgD、およびTCRαβのために30分間、氷上で汚れ、徹底的に洗い、事前緩衝液(BD生命科学)で吊るした。プロピジウムヨウ素(PI)は、生存できない電池を除外するために、選別の直前に加えられた。整理した電池を氷上の50% FBSで採集した。IgD＋DEgD電池はCD19、CD5、IgD、TCRαβ(800-1000電池/ソート)、IgD＋DE電池はCD19＋CD5＋IgD＋TCR電池(100-200電池/ソート)として識別されました。Bcon電池はCD19＋CD5－TCR－、Tcon電池はCD19－CD5＋TCRi＋電池と同定されました。総DNAは、製造者の指示に従い、QIAMP DNAミニキット(Qiagen)を用いて選別電池から直接抽出した。本文に記載されているように、IgD＋およびIgD－DE細胞から選別されたDNA、Bcon細胞およびTcon細胞をBCRまたはTCRBV配列決定に使用した。
高スループット免疫SEQおよびデータ解析
IGHVおよびTRBVクローン型の分析は、調査レベル分解能(Adaptive Biotechnologies)で免疫SEQプラットホームを用いて、各選別細胞型由来のゲノムDNAについて実施した。High-through sequencingと高度なバイオインフォマティクスパイプラインを組み合わせたCDR3地域分析(Carlson et al., 2013; DeWitt et al., 2016; Robins et al., 2009)を用いて、multiplex PCRを行った。試料は試料ごとに40ngから100ngのゲノムDNA増幅した。T1D#1からIgD－を、T1D#2からIgD＋セルを配列エンスしようとしたところ、失敗しました。TCRβおよびIGH 配列は、Adaptive Biotechnologies でご利用いただけます。個々のサンプルからのRaw ImmunoSeqデータをImmunoSeqアナライザー2.0ソフトウェア(Adaptive Biotech)で処理した。処理されたデータの測定メトリックは、tsvファイル形式でエクスポートされ、Rプラットホームを使用して分析されました。vGeneのアイデンティティが不明またはフレーム外のクローン化は下流分析から除外した。各細胞種のvGeneについては、「試料中に存在する細胞ゲノムの推定数」のメトリック値を合計し、それに対応するパーセンテージを算出した上で、別個の細胞クローンの数を算出した。割合量化は、vGene (VHとVβの使用法が、異なるセルタイプと試料を通して公平かつ一貫して比較されるようにすること、そして、DEサブセットセルの異なる割合と非常に小さな割合の配列から生じるいかなる影響も最小限に抑えること)のための均一な基準を提供する。パーセンテージをバープロットで可視化し、異なるセル型間でのvGeneの使用を直線的に比較した。異なるセルサブセットにおけるvGeneの有無は、vGeneの用法に基づいて決定した。異なるセルサブセット間のユニークで共有されたvGenesを特定し、R Limmaパッケージの機能を用いてVenn図に表示した。vGene突然変異はIMGTデータベースとのアラインメントに基づいて同定され、その上で生殖系列との差異がマークされ、計数され、記録される。生きたImmunoSeqデータtsvスプレッドシートの「vAlignution Count」の欄に、vGene突然変異値がさらに合計され、Rを用いたボックスプロットと散布図の組合せで表示された。選択されたクローンのアミノ酸配列を用いたストライング検索を行い、個々の被検者におけるそれらの存在を決定した。インバリアントクローン型のアミノ酸配列の文字列検索、「CARQEDTAMVYYFDYW」(SEQ ID NO:1)もまた、ナイーブ細胞および記憶部B con細胞の3700万個の固有BCR配列の公衆ImmunoSEQデータベース3に対するR script、およびnPOD適応免疫レパートリーから調べたIBCのデータベース3に対してR scriptを用いて実施された。
末梢血中のx-クロノタイプを検出するためのPCRプローブ
x‐Idクローノタイプが末梢血中で検出できるかどうかを判定するために、PBMCの分析のために2つのPCRプローブを設計し使用した。最初のプローブでは、VH04-b-specific sense primer (5GCTGCTGGATGTGATGGTAGTA-3) (SEQ ID NO:17) とアンチセンスプライマー (CCCAGTAGTAAACCATA) (SEQ ID NO:18) がCDR3領域全体を補完するものであった(図3J)。第2のプローブでは、VH04-b特異的プライマーを、JH04に及ぶリバースプライマー(3TCCCTGGCCAGTAGTCAAAGTAGTAGTA-5)(配列番号:19)と対合させ、N2領域で終了させた(図14参照)。簡単に述べると、RNeasy血液ミニキット(Quigen)を用いて新鮮なPBMCからRNAを抽出し、NanoDrop (ND-1000分光光度計)により分析して純度を評価し、濃度を測定した。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermofisher)を用いて精製RNA約1μgを逆転写(RT) PCRし、キットプロトコルに従ってcDNAを調製した: RNAを5X反応混合物、ランダムヘキサマープライマー、およびRevertAid M-MuLV RT (200 U/μL)酵素混合物と共に、最終容量20μLで25℃で10分間インキュベートし、続いて42℃で60分間、そして70℃で5分間不活化した。正(GAPDH特異的プライマー)および陰性(RT酵素なしの反応混合物)対照反応を用いて、cDNA合成の特異性を検証した。2X QIAGEN HotStarTaqマスターミックスを用いて調製された全体積の25マイクロL cDNAを以下の条件下で実施した:初期変度は95°Cで3分、95oCで30s、54oCで30s、40サイクルで72oCで1分、続いてサーモサイクラー(BioRad T100)を用いて10分間72oCで最後の延長ステップ。PCR産物アガロースゲル上で200bpのバンドサイズとして可視化され、バンドは、Johns Hopkins Medical Institute GRCF配列決定コアでPCR精製キット(Quigen)とサンガー配列決定を用いて、切断され、浄化された。Immunogenetics IMGT/V-QUESTソフトウェアを用いて、配列を分析した。
分子動態シミュレーション
新しいペプチド系は、HLA-DQ8(PDB ID 1JK8)(シャープ、2012)に結合したインスリンB鎖エピトープの結晶構造から構築された。インスリンのエピトープ配列は、VMDからのミューテータープラグインを使用して新しいペプチドエピトープ配列にミュートされ、新しいペプチドエピトープが望ましい登録されていることを確認した。HC#1のCDR3エピトープも、新しいペプチドシステムと同じ手順でインスリン-boundエピトープ構造(PDB ID 1JK8)から作られました。スーパーアゴニストシステムは、HLA‐DQ8(PDB ID 5UJT) (Wangら、2018)に結合したインスリンミモトープの結晶構造から構築された。このシステムのために、スーパーアゴニストに一致するようにエピトープを変異させることに加えて、両方のHLA鎖を変異させ、インスリン結晶構造(PDB ID 1JK8)中のHLAの配列に一致させた。より具体的には、ディスタル残渣の他に、HLAの残渣72Cを1JK8 HLA配列に一致するようにIsoleucineにミュートした。各システムをTIP3P水箱に溶かし、Na+とCl-を用いて100mM濃度で充電、中和、電化した。
系の作成後、各システム、タンパク質原子を固定するために、少なくとも2万工程の転換傾き最小化を経て、すべての原子が移動できるように少なくとも1万工程の最小化を行った。システムはその後、2fsタイムステップを用いて310Kで1ns平衡化された。製造MDシミュレーションを2fsタイムステップを用いて500ns間実行した。Langevinサーモスタットは310Kで温度を維持した。CHARMM36力場(Best et al., 2012)をタンパク質パラメータに用いた。Particle Mesh Ewald (PME)方法を用いて、12Åの静電及びファンデルワールスカットオフによる長距離静電を計算した。すべてのシミュレーションはNAMD2.11を使用して実行されました。MDシミュレーションのために、最後の250nsのみを分析に使用し、弾道を5部分に分割した。
Gromacs道具の溶媒利用可能面積(SASA)計算を用いて、1.4オーガンの水半径のコンタクト面積を計算した。Van der Waals相互作用エネルギーをNAMDEnergyを用いて計算した。電気静電エネルギーは溶剤スクリーニングの欠如により偏り、相互作用エネルギーから除外された。RMSDとRMSFはGromacsツールを用いて計算された。接触面積、相互作用エネルギー、およびRMSFについての平均と誤差バーは、MDシミュレーションの最後の半分(250ns)を取り、それぞれ50nsの5区分に分割し、各区分の平均を試料中の測定として取り入れて計算した。表示されているエラーバーは標準エラーです。
自由エネルギー摂動
結合親和性自由エネルギー動乱(FEP)法を用いて計算した。製造MDシミュレーションの最後の構造をFEP演算処理のために選んだ。束縛(HLA +エピトープ)と自由状態(エピトープのみ)の自由エネルギー動乱算出を算出し、各算出に対して6個のレプリカを用いた。エピトープ間の広範な配列差のために、エピトープをエピトープの長さであるポリグリシンの中性中間配列に変異させた。2 つのトポロジーは、VMD からのMutator プラグインを使用して実装されました。各システムは、エピトープからポリグリシンへ、最大0.04の増加を用いて、端部に向かってより小さい増加で、各システムの少なくとも34のFEP窓を合計し、ゆっくりと変形した。各FEPウィンドウは1nsで実行され、800ns以上のシミュレーション(6つのレプリカ×34の窓×2つの状態(複雑+自由)×2つのエピソード)が得られた。静電は=0.1からオンになった。各窓の収束は、レプリカ間の値を比較することによって評価された。CHARMM36プロテインフォースフィールドとTIP3P水モデルを用いたNAMD2.11は、MD作業に一致するFEP算出に使用された。FEPの軌跡を観察することにより、ポリグリシンはシフトレジではなく、エピトープのスタートレジストリを維持する。自由エネルギー誤差バーは標準誤差である。
穏やかなSDS‐PAGEアッセイを用いて、DQ8に結合するx‐Idペプチドの分析を行った。Gentle SDS-PAGEを用いて、前述したように、ペプチドとHLA-DQ8分子の間の安定な複合体の形成を評価した(Kimら、2013; Sadegh-Nasseri and Germain、1991)。簡単に言うと、0.5mmのHLA‐DQ8一量体(NIHテトラマーコア施設から提供された)を、CLIPペプチドを切断し除去するためにトロンビンで処理した。空のモノマーを、示されたペプチド(x-Id、TP-Id、mimotope (R22E)、天然インシュリンB:9-23、およびh-Id)100μMの存在下または非存在下で、1mM PMSFおよび0.025% NaN3を含むpH 5.5のクエン酸リン酸緩衝液中で37℃で72時間インキュベートした。反応を中和し、0.1% SDS (最終濃度)を含む同量のSDS-頁サンプルバッファを混ぜ、室温で15分間置き、標準プロトコルを用いて10%の頁ゲルと銀色に染めた。安定性を評価するために、いくつかの試料を3分間沸騰させ、錯体の劣化をもたらした(データは示されていない)。
EBV-不滅DE x1.1クローンの生成
不死化DE電池を生成するために、説明した戦略(図6A)を用いて、FACSAria IIを用いて、新しく分離されたPBMCからIgD+ DE電池を分類した。選別された電池は、24時間早く照射された繊維電池でコーティングされた96ウェルマイクロプレート(ATCC(R)55-XTM)のウェルあたり10、25、50、または100セルで播種された。Caputoら(Caputo and Flytzanis, 1991)によって記載された方法に従って、培養物に2.5μg/mlのCpG ODN 2006(ODN7909)およびB95-8細胞(ATCC(R) VR-1492)由来のEBV上清ストックをパルスした。栽培は、5～7日毎に培地の半分を新しい培地に置き換えて維持した。不死細胞は、50～100個のDE細胞を播種した栽培で8日後に見られた。リンパ芽球様細胞株(以下、x-LCL)を選択し、その後の分析を行った。ある実験では、x-LCLから単セルを選別し、Ig重鎖とL鎖の表現を検討した。第二の設定では、希釈(0.3セル/ウェル)を制限してx1.1クローン化を生成するためにx-LCLを用いた(Hamadら、1994)。x1.1クローンの細胞を用いて、BCRおよびTCRの分析、ならびに自然抗体産生を行った。
BCRとTCRαβの共発現のためのx1.1クローンの分析
著者らは、不死化DE細胞集団の単セルクローン性を保証するために2つのアプローチを使用し、RNAキャッチ緩衝液を含有する上述のようにFACSAria II (BD Biosciences, Bedford, MA)を使用して、96ウェルマイクロプレート上で成長したモノクローナルDE細胞を選別した(Smithら、2009)。
x1.1クローンおよび新鮮な単一DE細胞からのBCRのクローニングおよび発現。我々は、x1.1クローンの単セルと新しく分類された単一DE細胞からのBCR表現の分析のために、Smithら(Smithら、2009年)によって開発された同じ儀式を使用した。簡単に、個々のセルをOneStep RT-PCRキット(Qiagen)を用いてRT-PCRを行うために、RNase阻害剤を含むキャッチ緩衝液を搭載した96ウェルのPCRプレートの井戸に分類した。2つのプライマーを用いて、すべてのVH4遺伝子ファミリー部材およびラムダチェーンをエンコードする遺伝子の増幅のための8つのプライマーを増幅した。重鎖のクローニングPCRは、クローニング制限サイトを組み込み、クローニングベクター(AbVec-hIgG1)内のフレーム内にVDJ重鎖と一定領域遺伝子を配置するプライマーを用いて行った。クローニングPCR産物Monarch PCR & DNAクリーンアップキット(ニューイングランド、バイオラボ)を用いて浄化し、1.5%アガロースゲルで約400bpのバンドとして可視化した。インサートとベクトルをAgeIとSalIで消化し、上述のように清めた。ベクトルへの3倍のモラル過分の挿入をDH5α細胞を変換するために用いた。陽性コロニーを採取し、培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)によってプラスミドを抽出した後、AbVecプライマーを用いて配列決定した。ラムダチェーンは、挿入およびベクトルをAgeIとXhoIで消化し、AbVecIgにクローン化された以外は、同じ手順でクローン化された。可変領域の完全な配列を用いて、IMGTV-QuestによるVDJの使用とCDR3を確認した。
単一DE細胞由来の組換えx-mAbRの発現および分析
浄化と消化の後、単一細胞からの、増幅されたcDNAsは、ヒトIgGを含む式ベクトルにクローン化され、また、前述したように(Smith et al., 2009)、Ig醍醐味の定常領域(AbVec-hIgG1, AbVecIg)を含む式ベクトルにクローン化された。軽鎖Ig遺伝子を含む重およびAbVecIgG1を含むAbVec-hIgG1は、ポリプラスジェット-プライムトランスフェクション(who)および製造者の指示を用いて293Aセルラインに共移植された。移送された293A電池は、4～5日間、セラムフリー基底媒体で抗物質を秘密にし、mAbRは固定性タンパク質Aカラム(Pierce)を用いて精製した。反体式と純度はSDS-PAGEによって確認され、EZQタンパク質定量キット(Invitrogen)を用いて精製された抗たんぱく濃度を測定した。
x1.1クローンからのTCRのα鎖とβ鎖のクローニング
TCRαおよびTCRα鎖の遺伝子を、Eugsterら(Eugsterら、2013)によって記載された方法の改良版を用いてクローン化した。簡単に言うと、合計RNは、RN抽出キット(バイオラボ)を用いて、x1.1クローンの細胞から分離された。cDNAを、OneStep RT-PCRキット(Qiagen)を用いて、αおよびα鎖のための特定のプリマーを用いて、ネストされたPCRにより、αおよびα鎖を別々に増幅するのに使用し、また、ベータ鎖のためのデグレートプライマーと混ぜ合わせた。増幅された製品を1.5%のアガロースゲルで可視化し、pGEM(R)-T Easyベクトル(Promega)にクローン化した。プラスミド抽出キット(Qiagen)とM1プライマー(Eugsterら、2013)を用いてサンガー配列を用いてDNAを抽出した。可変領域の完全な配列を用いて、IMGTV-QuestによるVDJの使用とCDR3を確認した。
x1.1クローン化によって産生されるx-mAbNの特徴
x1.1クローンの細胞を完全なメディアで3～4日間拡大し、PBSで洗浄し、盆地メディア(スター法)で5日間栽培した。分泌されたmAbNは、SDS-PAGEを用いて上清中に検出された。秘密のmAbのアイソタイプは、Pro-DetectTM Rapid Antibody Isotyping Assay Human Kit (Thermo Fisher)を用いてIgMと決定した。抗体濃度は、EZQ Protein Quantitation Kit (Invitrogen)を用いて測定した。
量体の準備と汚れ
我々は、確立された方法(Crawford et al., 2011)を用いて、(NIH Tetramer Core Facility)によって提供されたバイオティレートHLA-DQモノマーを用いて3つのDQ8量体を作った。量体の1つは、HLA-DQとx-Idペプチド(x-Idテット)、1つはインスリンミモトープ(mim-tet)、3つ目はクリップ (クリップ-tet)で構成されている。トロンビンを用いて切り口を除去し、空のモノマーに0.2mm/mlのx-Idまたはインスリン-mimotopeペプチドを装填した。積荷は、2.5mm/ml(0.25%) n-octyl-i-Dglucopyranosideおよび1-M Pefabloc SC (Sigma-Aldrich)の存在下で72時間、37℃で実施した。ペプタイドを積載したHLA‐DQ一量体は、それぞれ1:4のモラル比でポリエチレン結合ストレプタビジン(eBioscience)でテトラメリド化された。HLA-DQ/CLIPモノマーは、汚れの中では負の制御としてテトラメリド化された。量体錯体の成功形成は、穏やかなSDS‐PAGEによって確認された。量体染料は、FACSバッファーの室温で1時間、HLAクラスII量体と2マイクログラム/mlのPBMCsをインキュベートした。表面CD4、TCR、CD19の個体固有を用い、試料を採取した。以上のように分析した(Dai et al., 2015)。
計量・統計解析
図中には、実験例複製と試料の大きさの説明が記載されています。Prism 6(GraphPad Software)を用いて、結果の統計的意義を行った。適切な場合には、独立サンプルt-testまたはペアサンプル生徒t-testを用いて分析を行った。結果は、特に明記しない限り、平均@SEMで表した。p?0.05は統計的に有意とみなした。
データとソフトウェアの可用性
本稿で報告されている、およびDNA-seqデータは、論文の記載を受領した後、GenBankに寄託される。
結果
リンパ球のまれなサブセットは、TおよびB細胞系列マーカーを共発現し、T1Dで拡大する。われわれは、BCRとTCRを共発現するリンパ球のまれな集団を同定し、主に末梢血中のCD5#CD19#集団の中に見いだした(ゲート戦略については図1Aおよび8)。これらの二重発現因子(以下、DEと呼ぶ)の大部分は、IgD/IgMを発現し、表現型はCD5＋CD19＋TCRβ＋IgD＋細胞と同定された(図1A)。CD5＋CD19＋TCRβ＋のマイナーサブセットは、IgD－であったが、IgG、IgA、IgMを表したものであり、従ってクラス切り替えDEとすることができる(下図2D参照)。CD5－CD19＋Bcon セルにはDEが少なく、それ以上の解析はされていない。むしろ、CD5＋CD19＋コンパートメントにあるIgD＋とIgD－DEに焦点を当てた。DEは、健康的な対照であるHCs (図1Aおよび表1の被検者特性を参照)よりもT1D被検者において著しく頻繁であった(示されていない)。我々は、フローサイトメトリック画像、AMNIS (図1B)を用いて、単一セルレベルでのDEsにおけるIgD、IgMおよびTCRの共表現を可視化した。従って、稀ではあるが、DEsはT1Dの拡大のために病理学的に重要である。単一細胞分解能でDEsの二重表現型を検討するために、単一細胞RNAシークエンシング(scRNA‐seq)を用いてそれらのトランスクリプトームを調べた。T1D#1のPBMCから個々のDE、Bcon およびTcon 電池をソートし、プレートベースのスマートフォン‐seq2プロトコル(TiroshおよびSuva,2018; Tiroshら、2016年)を用いてそれらのトランスクリプトムを解析した。合計77電池(34DE、20 Bcon 、23 Tcon)は、3つのハウスキーピングジェネ(図1C)のうち少なくとも2つの表現に基づいて、品質制御を通過した。Tcon またはBcon 電池と比較して、DEにより異なる形で表現された上位30個を示した。同時に、DEはBcon とTcon セルの間で上位30の異なる表現を示した。結果は、単一細胞分解能でのDEsの交差表現型を示す。DEsによる独特の遺伝子セットの発現は、詳細な今後の検討に値する複雑なトランスクリプトームを指摘している。
我々は、DEs (FIGS.1D及び1E)により、B及びT細胞の選択した系列マーカーの共有された式に焦点を当てた。これらはまた、FACSとAMNIS (FIGS.1Bと2Cと9と10)を用いて、タンパク質レベルで可視化した。また、活性化シグナルの伝達を担うBCR (CD79a、およびCD79b)およびTCR (CD3γ、CD3ε、CD3δ、およびCD247)の不変成分についてDEを分析した。当社のFACSに沿って、AMNISと機能データーに沿って、DEはCD79a、CD79bの表現をBcon 電池と、Tcon 電池(図1E)を備えたCD3ガンマ、CDε、CD3δ、CD247(CD3)とで共有した。
最後に、著者らはバイオインフォマティクス基本 (単一細胞からのBCR集合体)ソフトウェアを用いて、対照としてBcon およびTcon 細胞を用いてDEで発現した組換えBCRおよびTCR遺伝子を再構築した。DEsでBCRとTCRの両方のコンティグを検出し、予想通り、Bcon でBCR遺伝子のコンティグとTcon 細胞でのTCR遺伝子のコンティグを検出した(表2は示されていない)。我々はIMGT/V-QUESTソフトウェアを使用し、V(D)Jの使用のための再構成された配列を調べた。多くの単一DEは、少なくとも1つ(22セル)または両方(18セル)のBCR鎖を再構築できた(表2Aは示されていない)。また、TCRβ変数(表2B、表示なし)は、いくつか(8セル)が完全に組み立てされていました。重要なことは、TCRβチェーンを完全に組み立て、TCRVα(図1F)付きで、4つのDEが完全に組み立てられたBCR(重チェーンおよびL鎖表現していることである。特異性制御として、Bcon セル内に組み立てられたTCR連鎖、またはTcon セル内にBCR連鎖は存在しなかった。まとめると、これらの結果は、T細胞とB細胞のハイブリッド表現型をもつリンパ球の存在の原理を証明するものである。
TCR活性化DEは、その二重表現型を維持し、MHCとB細胞の共刺激分子をアップレギュレートする。次に、DEに発現するTCRの機能性とそれらの架橋の表現型および機能的結果を調べた。scRNA-seq解析と一致して、DEsはCD3シグナル伝達サブユニット(図9E)を発現しており、機能的なTCR/CD3複合体が示唆された。この概念を検証するために、7dに対して抗CD3/CD28でPBMCを活性化し、CD69上方規制のために異なるサブセットを解析した。HCにおけるDEはまれであるため、特に明記しない限り、T1D被検者由来のPBMCを用いた実験を実施した。活性培養の解析により、CD19+ CD5－Bcon 電池は、電池のマイナーな部分に戻り、CD69式のために適切に分析できず、傍観者であることと一致することが示された。その結果、残りのCD19+電池はCD5中級ゲート内に存在し(87.3%@11.7; n=5)、表出されたTCRおよびIgD＋およびIgD－DE(図2A)を含んでいた。TCR刺激は、制御培養内のDEと比較して、IgD＋およびIgD－DEsによるCD69の著しいアップレギュレーションにつながった。文化の大部分を作ったTcon 電池もCD69をアップレギュレーションしたが、DEよりはかなり少なかった。従って、DE上のTCRは、機能分子であるだけでなく、TCRクロスリンクに非常に反応する。
二組目の実験では、拡散を読み出しとして用いた。我々は、抗CD3/CD28でPBMCを刺激し、CFSE希釈法(図2B)を用いて拡散を視覚化した。以上の結果と整合的に、Bcon 電池は後退し、活性化された文化内に残ったCD19＋電池の大部分はCD5の量を表していた。IgD＋及びIgD－DEは、Tcon 細胞に類似しており、CFSE希釈(図2B)に示されるように、反CD3/CD28刺激に反応して頑丈に分割されている。scRNA-seq分析によって上に示したように、DEはMHC分子および重要な共刺激分子の転写産物を発現した。そこで、我々はこれらの分子のタンパク質レベルでの表現を検証し、HLA (図2C)に対するTCR刺激のモジュラリー効果を調べ、コスティミュレーター分子を示した(図10A参照)。FACS解析により、DEsがHLA-DR (DR)およびHLA-DQ (DQ)分子、ならびにいくつかのpan-Bおよび-T細胞マーカーを発現することが確認された。反CD3/CD28刺激は、DRおよびDQ分子(図2C)およびパン-Bセルコスティムマーカーの顕著なアップレギュレーションをもたらしたが、パン-Tセルマーカーは著しく変化しなかった(図10A)。ほとんどのIgD＋DEs細胞はIgMの共式を維持し、IgA、IgG、IgD－DEsへの切り替えはなく、IgG+、IgA＋、IgM＋電池とIgE＋DE電池が混在したままであった(図2D)。DEsによるIgアイソタイプの示差式は、それらが一般化された制御不能の遺伝子式に苦しんでいないことを示している。さらに、有効なDEsはCD45RAを表し、CD45ROを表さなかった(図10B)。同様に、トランスクリプトーム解析と一致して、DEはCD4およびCD8共受容体を差次的に発現したが、一部はCD4およびCD8ダブルネガティブであった(図9Cおよび9D)。また、DEs、特にIgD－細胞は、PMA/アイオノミシンまたは反CD3/CD28を介して刺激されたときにIL-10とIFN-+を作ったことも注目される(図11参照)。これらの結果は、TCRが媒介した拡大後、TCRとBCRはDEに安定した共表現を維持することを示している。
また、DEに表現されたBCRの機能性についても検討した。FACS分析は、DEsによるCD79a (Igα)とCD79b (Igβ)の表現を確認し、機能レセプターを示した(Luisiri et al., 1996; Reth, 1992; Yu and Chang, 1992)。この可能性を検証するために、IgMの架橋がDEsにおけるCD79aのリン酸化を誘導するかどうかを明らかにした。この実験は、ほとんどのIgD＋DEsとIgD－DEsの分数がIgM＋(図2D)であることから可能であった。われわれはPBMCsをF(ab)2ヤギ抗ヒトIgMで刺激し、所定の時点でCD79aのリン酸化を測定した。反IgM刺激は、IgD＋DE細胞(図9F)のCD79aのリン化の拡大を導き、IgD－DEsではそれほどではないが(多くのIgD－DEsがIgGまたはIgAを表現していることを考えると)、IgD－DEsにおいてCD79aのリン化を引き起こした(図2Dを参照)。一方、Bcon 電池は一時的であるが、著しくリン色化されたCD79aである。特殊性制御として、Tcon 電池は防IgM刺激に対して何のシグナルも示さなかった。これらの結果はDEによって表現されるBCR錯体が機能分子であることを示した。
DE細胞のTCRおよびBCRレパートリーの分析
次に、DEのTCRβチェーン(TRBV)とIg重鎖(IGHV)レパートリーを分類し分析し、ゲノムDNAとハイスループットImmunoSEQ (Adaptive Biotech)を用いてそれらの従来のレパートリーと比較した。この分析は、DEのクローン性を決定し、また、あるプラズマ膜たんぱく質の別のものへの移行(すなわちトロゴサイトシス(LeMaoultら、2007)のようなタンパク質レベルでの予期せぬアーチファクトを排除するために重要であった。
DE電池のTCRVβ使用制限最初に、3つのT1D被検者(T1D#1、#4および#5)からの8つのDE試料(4つのIgD＋および4つのIgD－サブセット)のTRBVレパートリーを分析した。被検者は無関係であり、様々な時点で配列決定された。分類方法と分類したサブセットの純度を示した(図12A及び12B)。DEsはTCRVβの使用制限(FIGS. 12C, 12E, Tables 3A, 3B, 3C(表は表示していません))を示しています。通常、IgD＋クローノタイプは18～31Vβs、IgD＋クローノタイプは5～29Vβs、Tcon 電池はほぼすべての55 Vβ遺伝子を使用した。HCにおけるDE細胞の不足は、DQ2危険対立遺伝子を発現した1人のドナー(HC#1)を除いて選別とディープシークエンシングを可能にしなかったが、膵島自己抗体、IAAは陰性であった(表1C、図には示していない)。我々はHC#1からIgD＋とIgD－DE電池の両方を分析した。HC#1のIgD－サブセットは7Vβのみを使用し、IgD＋サブセットは5Vβを使用し、Tcon 電池が使用する55 Vβ遺伝子(図12F、ヴェン図、表3Dは表示されていない)と比較した。DEの歪んだTCRレパートリーは、それらの特徴を示す別の一連のエビデンスを提供する。また、DEの表面上で検出されたTCRは、Tcon 電池の多様なレパートリーを反映するVβ用法であるため、Bcon 電池と結合されたTcon 電池から導出された可能性に反対する。また、結合体は通常寿命が短く、末梢血ではなく、二次リンパ性臓器に生じることも注目に値する(岡田ら、2005)。したがって、DEは、同じ被検者内のT con 電池とは異なり、Vβの使用量が制限された歪んだTCRレパートリを持つ。
DEのIGHVレパートリーの分析により、T1D被検者における公衆優性クローンタイプが同定される。次に、上記の仕分け方法(図12A及び12B)を用いて、3つのT1D (#1、#2、#3)被検者から、IgD＋及びIgD－DEのIGHVレパートリー及びB con 電池を分析した。6つのDE試料のうち4つ(T1D#1由来のIgD＋細胞、T1D#2由来のIgD－細胞、T1D#3由来のIgD＋およびIgD－細胞)から得られた。それぞれの被検者からB con 電池のIGHV配列を得た。最近IGHV4-38-2(Watsonら、2013)と命名されたIGHV04-b遺伝子は、3つのT1D被検者でDEによって主に使用された。T1D#1のIgD＋セルの95%、T1D#2のIgD－セルの22%(トップクローノタイプ)、T1D#3のIgD＋セルとIgD－セルの88%(FIGS. 3A, 3B, 3C)で使用された。対照的に、VH04-b遺伝子はB con 細胞の1%未満で使用され、3つの被検者でそれぞれ27/76、31/77、28/82でランク付けされた(表4は示されていない)。さらに、DEとBcon 電池によるVH利用において、著しい重複はなかった。実際、Bcon 細胞(特にT1D#1とT1D#3)によって使用された上位10のVH遺伝子は、DEレパートリーの全く欠けているか、あるいは小さな構成要素を構成しているかのどちらかであった(FIGS. 12G, 12H, 12I, 12J)。3つの被検者のDE電池とB con 電池が用いているVH遺伝子の完全な一覧が示されている(表4は示されていない)。さらに、DEsが使用しているVH遺伝子は、Bcon 細胞上のそれらの遺伝子とは異なり、主にゲルムライン構成(図3D)であった。DEsの別個BCR特性は、Bcon 電池によるDEsの相互汚染を排除する。加えて、この結果は、本研究で分析したものに代表されるT1D患者のサブセットで少なくともDE間の共通性を示す。
DEsによるIGHV04-bの主な利用に興味を持ち、クローン性のためにそれらを分析した。注目すべきことに、IGHV04-b＋DEsは、3つの被検者で同じVH、DHおよびJHセグメントとN1およびN2ジャンクションを使用した単一のクローノタイプから成り、その結果、同一のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を持つCDR3をもたらした(図3E)。CDR3 (CARQEDTAMVYYFDYW) (SEQ ID NO:1) は、IGHV04-b、IGHD05-18およびIGHJ04-01*02 (図3Eおよび表5、示されていない) - 以下、xクローノタイプと呼ぶ。無関係の患者におけるxクローノタイプの優位性は、BCRレパートリーの極端な多様性を考えると偶然ではない(Truck et al., 2015; Venturi et al., 2008)。例として、3つの被検者におけるB con 細胞のクローン多様性が挙げられる(表5E、5F、5Gは示されていない)。xクローノタイプのアイデンティティを確認するために、T1D#1から単一DEを分類し、マルチプレックスPCRを用いてIGHV式を分析した(Smithら、2009年)。我々は7つのDE細胞のうち7つ(FIGS.6と7を参照、および示されていないデータを参照)から正確なxクローノタイプヌクレオチド配列を検出し、T1D#1のDEの95%でxクローノタイプを同定した高スループット配列結果を確認した。
また、3つのT1D被検者のB con 細胞の間でxクローノタイプを検出したが、IGHV04-b遺伝子(T1D#1では8個、T1D#2では39個、T1D#3では17個)を使用したいくつかの小型クローノタイプの1つであった(表5E、5F及び5Gは示されていない)。さらに、同一のアミノ酸配列は、T1D#1(VH04-b; VH03-11; VH01-69; VH01-46; Vh05-51; VH0118)、T1D#2(VH04-b; VH-04-39)、T1D#3(VH04-b; VH03-53, VH01-02, VH1-69)患者(表5E,5F,5異なるVDJ再配列(収束組換え)による同一のCDR3アミノ酸配列の生成は、少なくとも2人の間で共有された公衆TCRの特徴である(Venturiら、2008)。これに関して、xクローノタイプは、2つのIGHVクローノタイプ(図3F)のうちの1つにすぎなかった-(他のそれほど優勢でないものは、3つのT1D被検者でB con 細胞によって共有されたCAGGHNYGIKSYW (SEQ ID NO:20) CDR3シークエンスを持っていた。このように、xクローノタイプはDEs細胞のレパートリーを支配し、3人のT1D患者のBcon 細胞間で共有されたたった2つのクローノタイプのうちの1つであった。
x-clonotypeは、健全な被検者と公共のデータベースのDEのレパートリーには存在しない
xクローノタイプのDEと普及をさらに明らかにするために、IgD＋とIgD－DEのレパートリーを取得・分析し、HC#1のBcon 細胞のレパートリーと比較することができた。HC#1のDEsのレパートリーは、Bcon 細胞(図3Gと表6は示されていない)と同様に多様であることがわかった。IgD＋電池、IgD－電池、HC#1のBcon 電池(表6Aは示されていない)では、IGHV04-b遺伝子の使用はまれであった(0.015%以下)。さらに重要なことは、HC#1のIgD＋、IgD－およびBcon 細胞のレパートリー(表6B、6Cおよび6Dは示されていない)から、xクローノタイプは存在しなかったことである。それにもかかわらず、T1D被検者と同様にHC#1におけるIGHV04‐b{IgD#細胞#1は、DH05‐18遺伝子ではなく、IGHJ04‐01*2遺伝子を用いた1つのクローンタイプから成り、それらのCDR3配列(CARQRFWSGPLFDYW) (配列番号21)はx‐クローンタイプのそれと部分的に一致した(太字)。しかし、IGHV04-b＋IgD＋DE電池は、IGHJ04-01*2を使用した5つのクローノタイプで構成されていたが、DH05-18ではなかった(図3H)。さらに、T1D患者と同様に、HC#1のDEクローノタイプは、ほとんど体性突然変わりはないが、生殖ラインの構成であった(図3I)。したがって、HC#1におけるDEのレパートリーは、3つのT1D被検者におけるものとは異なり、多様であり、x-クロノタイプを含まなかった。
公的データベースの調査では、健康な被検者(DeWittら、2016年)からのナイーブおよび記憶部B細胞の高解像度のIMSEQデータベース(3700万個の独特なBCR配列)およびT1Dおよび制御被検者(Seayら、2016年)からのインスリン-bindingのB con 細胞(IBCs)からのxクローノタイプが欠けていることが示された。しかしながら、NCBIタンパク質データベースの調査では、Trypanosoma bruceiの変形例表面糖たんぱく質(VSG 1125.4290)に由来する非常に重複した配列(RQENFDTAMVYYF) (SEQ ID NO:22)が発見された。太字は重なり合う残渣物を示す。VSGはB細胞の強力な抗原刺激因子であり、Tindependent IgM応答を示す(Mansfield, 1994)。我々は、XクローノタイプがIBCsを含むB細胞のIGHV配列の利用可能なデータベースから欠けていることによって示されるように、ほとんど使用されないと結論する。
Xクローノタイプはシーク配列比のPCRプローブを用いて末梢血中で検出される。2セットの配列特異的プライマーを用いて末梢血中のx‐クロノタイプの検出を試みた。どちらの場合も、VH04-b遺伝子に特有の前進プライマーを使用した。最初のセット(プローブ1)では、CDR3シークエンス全体(図3Jの図を参照)を補完するリバースプライマーと対になった。私たちの主な目的は独立したメカニズムによってイディオタイプの存在を確認することであったので、私たちは限られた数のT1DとHC被検者(表1Bと1Cは示されていない)に分析を限定した。4/8 T1Dと3/8 HCsでx‐クロノタイプを検出した。HCsにおけるx‐クローン型の検出は、参加者のHLAおよび膵島自己抗体(IAA)プロファイルを決定することを促した。予想通り、1人の参加者と共に、全てのT1D被検者が少なくとも1つの危険対立遺伝子(DQ2またはDQ8、以下、総称して、#57D#)を持っており、DQ7(DQB:3*01, DQ8の疾患‐中性アイソフォーム)も示した(#57でDを発現する)。全てのT1D被検者は少なくとも1つのIAAに対して陽性であり、全てのHCはIAAに対して陰性であった。興味深いことに、3つのx‐クローン型+ HCはDQ7を発現した。DQ8アイソフォームは#57でDを発現した。少なくとも1つの危険アレル、すなわちβ57D-/+、上述のβ57D-/+HC 1のハイスループットIGHV配列からxクローノタイプが存在しないことと一致する結果(図3G)を持つ3つのHCにおいて、xクローノタイプは検出されなかった。第2のプローブ(プローブ2)において、より厳密な特殊性を付与するために、我々はN2-Jおよび下流側JHシークエンス(図表7Aを参照、示されていない)。ここでも、4/9 T1D被検者、および4/14 HCでx-クロノタイプを同定した(表7Bおよび7C、図には示していない)。これらの被検者は、IAAの遺伝子型タイピングやチェックが行われていなかった。しかし、最初のプローブの結果から、xクローノタイプ+ HCはIAA-/ DQ7+、危険IAA+/ β/ 57D-/+個人を含んでいると推測した。
分子動力学シミュレーション(MDS)は、DQ8の最適ペプチドームとしてx‐クローノタイプを同定する。上述したように、P9でのR22EとP1置換でのA14Eを組み合わせると、先日発表された結晶構造(Wangら、2018)に示されるように、DQ8に高い親和性を持つインスリンなスーパーアゴニストを生成する。アラインメント解析は、xクローノタイプはP1とP9の位置で酸性残基(EまたはD)を有するDQ8結合エピトープを含み、これはスーパーアゴニストと同様であると予測した。この予測をテストし、CDR3ペプチド‐HLA負荷をさらに特徴づけるために、我々は、エピトープ‐HLAバインディングの計算生物物理学的モデリングを行った。これは、いくつかの以前の研究(Chowell et al., 2018; Holzemer et al., 2015; Joglekar et al., 2018; Xia et al., 2014)で成功した。HLAとCDR3ペプチド(CARQEDTAMVYYFDYW (配列番号:1)、コアエピトープ下線付き)およびスーパーアゴニスト(SHLVEELYLVAGEEG) (配列番号:7)、ならびにそれらの関連結合エネルギーとの結合複合体を(図4)に示す。我々は最初に3つのHLAエピトープ錯体(CDR3、スーパーアゴニスト、ヘルシー制御CARQRFWSGPLFDYW) (SEQ ID NO:21)の分子動力学(方法については補足資料を参照)のシミュレーションを行って、結合エピトープの安定性を評価した。我々は、3つのエピトープすべてが、最初の固定部位からのシフトを登録することなくHLAに結合したままであることを発見したが、HCエピトープは、不利な結合を示すHLA-iサブユニット(背骨RMSD>4オング、図13)を不安定化させた。従って、その後の分析はCDR3ペプチドとスーパーアゴニストに限定された。スーパーアゴニスト用のCDR3ペプチド(側上面図ビュー)と(図4B)の最終結合構造は(図4A)に示されており、両方ともDQ8に強い結合を示す。Free Energy Perturbation (FEP)の計算は、CDR3ペプチドがスーパーアゴニスト(FIGS.4Cと4D)よりもさらに強い結合を示すことを明らかにした。一般的に、FEP法は、あるエピトープから別のエピトープへの錬金術的に変化する結合親和性差を計算することができる(Chowell et al., 2018; Holzemer et al., 2015; Joglekar et al., 2018; Xia et al., 2014) (方法を参照)。しかし、エピトープ配列が1つの保存残基(Val10)のみで現時点で大きく分岐することを考慮して、基準点となる中性ポリグリシン(ペプチド背骨)中間体に対する各々のエピトープの変異に対する結合親和性変化(ΔG)を計算した。異なるエピトープ間の相対的結合親和性は、各エピトープの値の相対的差異から簡単に計算することができる。著者らの結果は、CDR3ペプチドがスーパーアゴニストよりも-2.3×2.8 kcal/mol (図4C)良好な結合親和性を持つことを示した。結合親和性の分解により、-4kcal/mol van der Waalsがスーパーアゴニスト(図4D)よりもCDR3結合に対する相互作用の嗜好を明らかにする。これは、図4Eに示すように、CDR3ペプチドがスーパーアゴニストよりも強いファンデルワールス相互作用をディスプレイする、簡単な相互作用エネルギーの比較によって支持される。全体として、これらの結合親和性結果は、CDR3ペプチドがより強力な自己抗原であることがわかった、前述のin vitro実験結合アッセイとよく一致する。
さらに詳細な構造分析により、この超強力なCDR3ペプチド(FIGS. 4F, 4G, 4H, 4I, 4J)のいくつかの有益な結合特性が明らかになった。CDR3コアエピトープのサイト1、4、6、9におけるアンカー残渣の重要性は、接触分析(図4F及び図4G)から明らかである。興味深いことに、CDR3サイト7およびスーパーアゴニストサイト3のチロシン残渣物は最大の正規化された接触面積を持ち、芳香族および水恐性HLA残渣物と広範囲に接触した(図13Gおよび13Hを参照)。残渣変動は、(図4H)に示されているように、HLAにどの残渣物が厳密に結合しているかを示唆することが多い。「コアエピトープ」に含まれていないにもかかわらず、N-端子CDR3残渣は、Arg3およびAsp6の一時期にHLAに好意的に結合し、HLAの86Eおよび52R(図4I)と共に頑丈であるが複雑な埋設塩ブリッジ部錯体を形成した。対照的に、N-端子スーパーアゴニスト残渣SHLは、HLA (図4G)との接触数が低かっただけでなく、シミュレーション全体(図4H、4Iおよび4J)を通してより大きな変動を示した。さらに、上述のように7位のCDR3[Y (P7)]のチロシン残基(β47Yとの強いπ-πスタッキングおよびβ67Vとの疎水性相互作用を形成する(位置13G))に加えて、6位のコアチロシン残基[Y (P6)]も11F、30Yおよび61Wとの良好な相互作用を形成することによって結合に有利に寄与した(位置4Jおよび13F)。これらを合わせると、CDR3ペプチドの芳香族残基Y(P6)とPY(P7)からの強い栃木‐栃木の積み重ねと吸水性相互作用がHLAとの強い結合に好ましい寄与をしたが、スーパーアゴニストN‐ターミナルの大きな変動は、その低結合親和性にやや不利に寄与した。一緒に、MDSの結果は、CDR3ペプチド(x‐Id)ペプチドは、DQ8に結合するために最適なアンカー残基を持つように見えることを示した。
xclonotypeのCDR3配列は強力なCD4 T細胞エピトープである。T1Dにおけるx-クローン型発現DEの拡大およびx-Idペプチドの独特なDQ8結合特性は、疾患の病因との接続を示唆している。我々は、XクローノタイプがIAAをエンコードする可能性を検討し、排除した。なぜなら、IAAは通常VH06を使用し、正の電荷を持ち、長いCDR3を持つからである(Smithら、2015)。対照的に、xクローノタイプはVH04を用い、正味の負電荷(-2.01)と通常のCDR3長さを持つ。さらに、上述したように、xクローノタイプはIBCの公表された配列からは存在しない。別の仮説は、xクローン型がこれまで知られていなかったDQ8制限CD4 T細胞新抗原をコードするというものである。この仮説は、MDS分析の結果(図4を参照)によって直接裏付けられている。この着想を機能的に検証するために、穏やかなSDS-PAGEアッセイ(Kimら、2013; Sadegh-Nasseri and Germain、1991)を用いて、2つのイディオタイプペプチドが安定なDQ8錯体を形成する能力を調べた。1つのペプチドは完全なCDR3配列であるCARQEDTAMVYYFDYW (x-Id) (SEQ ID NO:1)であり、2つ目はC端子でシステイン(C)を欠いた切り捨て版(TP-Id)であり、N端子-CARQEDTAMVYYFDYW (SEQ ID NO:1)ではトリプトパン(W)である。天然インスリンB: 9～23とミモトープを対照として用いた。また、HC#1のIGVH04-b+IgD+クローノタイプのCDR3ペプチド(CARQRFWSGPLFDYW) (SEQ ID NO:1)の結合も試験した。イディオタイプペプチド(x-IdおよびTP-Id)は両方とも、ミモトープ(図5A)と同様にSDS安定複合体を形成する水溶性DQ8分子を結合することができた。対照的に、HC (h-Id)および天然インスリンペプチドは検出されたDQ8錯体を形成しなかった。これらの結果は、T1Dからx-イディオタイプ(x-Id)が、HC (h-Id)ではなく、DQ8と共にSDS安定複合体を形成できることを示した。CFSE増殖アッセイとCD69アップレギュレーションを用いて、mim/DQ8複合体に類似したx‐Id/DQ8複合体がDQ8+T1D被検者由来のCD4 T細胞の強力な刺激因子であることを示した。応答者はT1D#1を含み、DEのほとんどがIGHV04‐b+クローン型を発現し、したがって自己反応性応答を示した。従って、自己反応であり、DQ8への貧弱な結合と一致して、天然インスリンとHC (h-Id)ペプチドは有意な応答を生じなかった。予想されたように、拡散反応は、反DQ8mAb (図5B)によって抑制された。重要なことに、x-Id/DQ8複合体は、健康な被検者から弱いまたは全く反応を誘導し、その高反応性がT1Dと関連していることを示した(図5B)。加えて、CFSElow CD4 Tセルのほとんどは、CFSEhiコンターパート(図5C)と比較してCD69をアップレギュレーションした。x-IdペプチドをPBMCs (図14)を脈拍するのに用いたときにも、同様のMHCクラスIIに依存する応答結果が得られた。これらの結果から、公共のBCRのイディオタイプにコードされている強力なT細胞自己抗原が初めて同定された。
EBV不死化クローンを用いたDEsによるBCRとTCRの二重式の検証次に、T1D#1から分離され、確立された方法で変換されたDEsからEBV不死のLablastoid細胞系(x-LCL)を作ることに成功した(Caputo and Flytzanis,1991; HuiYuen et al.,2011)。T1D#1のほとんどすべてのDEがx-clonotypeを表していることを考えると(図3を参照)、我々はxLCL電池を用いてx-clonotypeをクローン化し、それを特徴づけた。培養x‐LCLから単セルを選別し、H鎖とL鎖の転写産物について各々を調べた。我々は、新鮮なDE細胞中のx-単ノタイプを検出するために、上述したのと同じプライマーを用いて、7/7に選別された1個のx-LCL細胞におけるx-単ノタイプの表現を確認した(図6A)。L鎖の転写物の分析により、2つのL鎖が確認された:優勢な生産性のあるL鎖(IGL1-x with CDR3: CSLYAGSNNVVVF (SEQ ID NO:9))と、PCRによって選択されなかった生産性のあるL鎖を表現できる2つの電池で検出された、小さな非生産性のチェーン2(IGL3: VVYMQAATMLWYS (SEQ ID NO:8))。また、IGL1-aとIGL2-xは、PCRまたは読み取りの誤差によって引き起こされることができる3つのntを除いて、IGL1-xと同じヌクレオチド配列を有するので、同一のL鎖を表している可能性がある。したがって、DEsで表現される抗生物質は、少なくともT1D#1では、少なくとも1つの生産的なL鎖と対になったxクローノタイプを用いた。
続いて、DE細胞におけるBCRとTCRの共発現を検証するために、x‐LCL細胞の利点を利用した。著者らは限定希釈(0.3セル/ウェル)を用いて、x-クローノタイプ(図6A)と対になったIGL1L鎖を表現するためにPCRクローンをクローン化することによって確認された1つのクローン(x1.1と呼ばれる)を生成した。さらに、フローレンス画像を用いて、TCR、IgD、およびIgMの共表現を単一セルレベルで可視化した。最後に、RT-PCRとネステッドPCRを用いて、x1.1クローンの電池(図6A)からTRBV6-5*01/D1*01、JB1-1*01(TCRに対し-x)、TRAV29/DV5*01/J53*01(TCRα-x)からなるTCRαβの増幅とクローン化に成功した。x1.1クローンの細胞から完全に再編成・発現したBCR鎖とTCR鎖を検出することで、DEsでの二重発現が確認される。
x-Id-ペプチドおよびインスリンミモトープは、CD4 T細胞の重複した亜集団を認識する。抗体は溶存自己抗原(Khodadoust et al., 2017)の源泉であり、イディオタイプ特有のCD4 T細胞は多発性硬化症(Hestvik et al., 2007)とループス (AasHanssen et al., 2014)で記載されていることから、T細胞を活性化することができる。上記のように、x-IdペプチドはDQ8分子と機能複合体を形成することによって自己抗原として機能することができる(図5を参照)。栽培されたx1.1電池は、ここではx-mAbNと呼ばれる、大量のx-clonotypeencoding bidを秘密にしていた。我々は、CFSE拡散アッセイ(図6B)を用いて、T1D被検者からのCD4 T細胞を刺激するx-mAbNの能力を評価した。PBMCに水溶性x‐mAbNを付加すると、CFSElow CD4 T細胞の割合で示されるように、強力な拡散をもたらした。また、IgG1同型(x-mAbRと参照)の再結合x-mAbを生成した。我々は、T1D# 1から分離された単一DE電池から重鎖および軽鎖の可変領域をクローンし、方法(図7A)に記載されているようにヒトIgGベクトルに融合した。その自然なものと同様に、固定されたx-mAbRは、CFSE拡散アッセイ(図7B)においてCD4 T細胞を活性化した。したがって、自然に産生されたx-mAbも組換え体x-mAbもCD4 T細胞に対して刺激性を示す。
x-Id-とインスリン-reactiveのCD4 T細胞の間の関係を調べるために、x-Idペプチド(x-量体)またはミモトープペプチド(mim-量体)をロードしたDQ8量体を生成した。具体性としてCLIP‐DQ8量体(CLIP‐量体)を用いた。著者らは7日間、x-Idペプチドまたはインスリンミモプトープの有無中にT1D被検者からPBMCを培養し、量体正CD4 T細胞の存在のために各培養を分析した(図7C)。CLIP-tet汚染を陰性対照として、非刺激および刺激培養の両方でx-Idおよびミモトープ比CD4 T細胞を検出した。さらに、テトラマー陽性細胞の割合は、非刺激培養と比較して刺激培養で有意に高かった。さらに重要なことに、x-四量体は、インスリンミモトープによって増殖したCD4 T細胞を検出することができ、x-Idペプチドによって増殖したCD4 T細胞を検出したmim-四量体については逆であった。これらの結果は、mimotopeおよびx-Idペプチドが、同じまたは重複するCD4 T細胞のサブ集団を刺激することを示唆している。この考えの直接の保持体では、x-mAbはmim-量体の活性化CD4 T細胞への結合を著しく抑制した(図7C)。このように、xクローン型はインスリン比CD4 T細胞を断面活性化するようである。
考察
本研究では、T1D被検者でクローン性に増殖し、TCRおよびBCRの発現によりエピトーム化されたB細胞およびT細胞の両方の系統マーカーを内包するまれなリンパ球(DE)について報告する。クローナルに拡張されたDEsは、糖尿病発生DQ8分子の最適なレジストリを持つ、Ig重鎖の抗原結合部位にある強力な自己抗原(x‐自己抗原)をエンコードする。x自己抗原ペプチドは、HC被検者ではなくT1D由来のCD4 T細胞を強固に刺激するDQ8分子と機能的複合体を形成する。さらに、xクローン型OOBmAbもCD4 T細胞を刺激する。競合結合抑制分析は、x-mAbとインスリンミモトープが重複するT細胞サブ集団を刺激することを示す(図7C)。まとめると、これらの知見は、T細胞とB細胞の区画化は絶対的ではなく、このパラダイムの違反因子が自己免疫の鍵となる要因となりうることを示している。
x自己抗原の特徴とT1Dの意味分子動力学シミュレーションは、x‐IdペプチドがP1とP9で負電荷残渣を持つDQ8の最適な結合レジストリを持つことを示した。これらの重要な固定位置で酸性残渣を持つことの重要性は、先住民のインスリンB:9-23ペプチドがP1ではアラニン、P9ではアルギニンの代わりにグルタミン酸をDQ8分子に強い結合力を持つ強力なスーパーアゴニストに変換することによって示される。一致して、x-Idペプチドおよびインスリンミモトープは、同等の教室II制限T細胞刺激能力を有する。BCRイディオタイプは、しばしばMHCIIの文脈においてCD4 T細胞に対するネオ抗原として処理され、提示されることを考えると(Khodadoust et al., 2017)、DEsが生体内でx-Idエピトープの源泉となる可能性が考えられる。この可能性の保持体、イディオタイプ固有のCD4 T細胞は多発性硬化症(Hestvik et al., 2007)とループス (Aas-Hanssen et al., 2014)に記載されている。しかし、著者らの知る限り、これらの疾患におけるイディオタイプ自己抗原の細胞源は同定されていない。したがって、異なる自己免疫疾患の患者をDEの存在、クローン拡大および特異性について分析することが重要であろう。また、MHCクラスII分子から溶出したペプチドレパートリーをT1D被検者から検索し、x-Idペプチドの存在を調べることで、われわれの試験管内での知見が病因と関連づけられるかどうかを明らかにすることも大切であろう。x-Id/DQ8複合体の生体内での存在は、T1D被検者におけるx-Id自己抗原を含むDEsのクローン展開とB con細胞における収束組換えを考えれば、D5-18/JH04-2遺伝子セグメントに結合した様々なVH遺伝子を使用した3つのT1D被検者のB con細胞における10個のB conクローノタイプを検出し、極めて低頻度であるにもかかわらず、x-自己抗原のアミノ酸配列をエンコードするCDR3を生成することができる。あるいは、相互に排他的ではないが、DEsはその重鎖イディオタイプにおけるx-自己抗原をコードするmAbsの分泌によってT1Dの病因に影響を及ぼす可能性がある。本結果は、不死化DEにより分泌された、または新鮮DE細胞からクローン化された抗体(x-mAbN)がCD4 T細胞の強力な刺激因子であることを示す。加えて、x‐mAbRはミモトープ四量体の自己反応性CD4 T細胞への結合を有意に阻害し、重複する特異性を示唆した。将来、X-mAbのT1D被検者の血清を調べることにより、病因における病態生理学的役割に関する新たな知見が得られるであろう。
DE細胞上の機能的TCRの発現と病原性の意味TCRのDEに対する表現は、重要な意味を持つかもしれない。一つには、TCRの刺激に応じて、DEsに彼らの数を拡大、増加させる能力を与えてくれる。加えて、DE上のTCRの架橋は、CD40およびCD80/CD86を含むMHCIIおよび共刺激分子のアップレギュレーションを導き、それによりDEを潜在的にAPCに変換する。これらの特徴は、DEsが彼らの表面DQ分子上にx-Idペプチドを処理し、提示することを将来の分析が示すならば、病理学的に関連するであろうし、また/または自己反応性CD4 T細胞を刺激するために膜Igを使用するであろう。DEsのTCR刺激は、その局所環境に影響しうるサイトカインの産生をも導く。このように、将来の研究は、環境抗原および一般的な病原体に対する反応性を含むDEs上に発現されるTCRの抗原特異性を検討すべきである。
即時の翻訳への影響と今後の重要性。T1DとHCsから末梢血サンプルを研究することから導き出された我々の結果は、トランスレーショナル・意義を持つことが期待される。即座に検証可能な疑問の1つは、末梢血中のx自己抗原の存在が、リスクのある個人を区別するバイオマーカーとして役立つかどうかである。本研究で調べた被検者数では、x-クロノタイプは、T1Dの末梢血およびDQ7を発現するHC(鎖の57位にアスパラギン酸を発現するDQ8の中性アイソフォーム)で検出されたが、HC-ベアリングの危険(β57D)DQ対立遺伝子では検出されなかった。このように、xクローノタイプにネガティブなβ57D被検者は、T1D開発の危険が低い可能性がある。一方、DQ7分子は、β57の位置にアスパチック酸を持つことによって、P9に正電荷残渣を有利にすることになり、したがってDQ8分子と少なくとも同じ登録では、xクローノタイプを最適に結合することができない。この差は、T1DのリスクファクターとしてのDQ7の中立的な役割を説明することができる。
分析および短いリード長(38bp)の限られた数の単一DE電池は、DEsが既存のセルタイプの別個または亜集団を表すかどうかを決定すること、およびそれらのCDR3配列をscR-seq設定で正確に分析することができなかった(Rizzetto et al., 2017)。これらは、私たちの将来の実験の目標である。さらに、もしx-クローン型がT1Dの鍵となる促進因子であることが証明されれば、その保存された生殖細胞系配列は抗原特異的な治療戦略の開発に有用であろう。さらに、DEの独特な表面表現型は、それらを容易に検出可能な標的とし、それらの少数の除去は宿主防御に有意な負の影響を及ぼさない可能性がある。
参考文献
1.Aas-Hanssen, K., Funderud, A., Thompson, K.M., Bogen, B., and Munthe, L.A. (2014).イディオタイプ比Th細胞はループスマウスにおける抗dsDNA B細胞のオリゴクローナル増殖を支持する。ジャーナル・オブ・イムロジー193, 2691-2698.
2.Best, R.B., Zhu, X., Shim, J., Lopes, P.E., Mittal, J., Feig, M., and Mackerell, A.D., Jr. (2012).背骨phi,psi,side-chain chi(1)およびchi(2)二面角度の改良サンプリングを対象とした添加剤CHARMM all-atom protein forceフィールドの最適化。J Chem Theory Comput 8, 3257-3273.
3.Canzar, S., Neu, K.E., Tang, Q., Wilson, P.C., and Khan, A.A. (2017).BASIC:単一細胞からのBCR集合体。バイオインフォマティクス33, 425-427。
4.Caputo, J.G., and Flytzanis, N. (1991).sine-Gordonとphi4モデルにおけるKink-antikink衝突:変動アプローチの問題Phys Rev A 44, 6219-6225.
5.Carlson, C.S., Emerson, R.O., Sherwood, A.M., Desmarais, C., Chung, M.W., Parsons, J.M., Steen, M.S., LaMadrid-Herrmannsfeldt, M.A., Williamson, D.W., Livingston, R.J., et al. (2013).合成テンプレートを用いて、偏りのない多重PCRアッセイを設計する。Nat Commun 4, 2680.
6.Chang, K.Y., and Unanue, E.R. (2009).計算プログラムを用いたHLA-DQ8beta細胞ペプチドームの予測と自己反応性T細胞との関係インターナショナル・イムロジー21, 705-713.
7.Chowell, D., Morris, L.G.T., Grigg, C.M., Weber, J.K., Samstein, R.M., Makarov, V., Kuo, F., Kendall, S.M., Requena, D., Riaz, N., et al. (2018).患者のHLAクラスI遺伝子型はチェックポイント遮断免疫療法に対する癌反応に影響する。サイエンス359, 582-587.
8.クロフォード、F., Stadinski, B., Jin, Michels, A., Nakayama, M., Pratt, P., Marrack, P., Eisenbarth, G., and Kappler, J.W. [2011]非肥満糖尿病(NOD)マウスの1型糖尿病におけるインスリン反応性CD4+ T細胞の特異性と検出『米国科学アカデミー紀要108』、16729-16734。
9.Dai、H.、Rahman、A.、Saxena、A.、Jaiswal、A.K.、Mohamood、A.、Ramirez、L.、Noel、S.、Rabb、H.、Jie、C.、およびHamad、A.R. (2015)。シンデカン‐1は、マウスにおけるIL‐17産生ナイーブナチュラルキラーT (NKT17)細胞の周波数を同定し、制御する。欧州免疫学雑誌
10.DeWitt, W.S., Lindau, P., Snyder, T.M., Sherwood, A.M., Vignali, M., Carlson, C.S., Greenberg, P.D., Duerkopp, N., Emerson, R.O.およびRobins, H.S. (2016)。記憶部と単純なB細胞受信器の配列の公的なデータベース。PloS one 11, e0160853.
11.Eugster, A., Lindner, A., Heninger, A.K., Wilhelm, C., Dietz, S., Catani, M., Ziegler, A.G., and Bonifacio, E. (2013).抗原応答性ヒトCD4+ T細胞におけるT細胞受容体およびT細胞遺伝子発現の多様性を測定する。J Immunol Methods 400-401, 13-22.
12.Hamad, A.R., Herman, A., Marrack, P., and Kappler, J.W. (1994).毒素スーパー抗原Staphylococcal enterotoxin B. The Journal of experimental medicine 180, 615-621.上の機能部位を規定するモノクローナル抗体。
13.Hestvik, A.L., Vartdal, F., Fredriksen, A.B., Thompson, K.M., Kvale, E.O., Skorstad, G., Bogen, B., and Holmoy, T. (2007).多発性硬化症患者のT細胞は、自己IgG上の複数のエピトープを認識する。スカンジナビアの免疫学雑誌66, 393-401
14.Holm, S. (1979).単純連続リジェクト多重テスト手順。6.
15.Holzemer, A., Thobakgale, C.F., Jimenez Cruz, C.A., Garcia-Beltran, W.F., Carlson, J.M., van Teijlingen, N.H., Mann, J.K., Jaggernath, M., Kang, S.G., Korner, C., et al. (2015).HLA‐C*03:04‐制限HIV‐1 p24 Gag配列変異体の選択はKIR2DL3+ナチュラルキラー細胞からのウイルス逃避と関連する:南アフリカの観察コホートからのデータ。PLoS medicine 12, e1001900; discussion e1001900.
16.Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., and Bhaduri-McIntosh, S. (2011).エプスタインバーウイルス増殖形質転換リンパ芽球様細胞株の樹立視覚化実験ジャーナル: JoVE。
17.Joglekar, A.V., Liu, Z., Weber, J.K., Ouyang, Y., Jeppson, J.D., Noh, W.J., Lamothe?Molina, P.A., Chen, H., Kang, S.G., Bethune, M.T.ら(2018)。免疫学的制御が異なる患者由来のHIV KK10エピトープに対するT細胞レセプターは、機能的に識別不能である。『米国科学アカデミー紀要』第115号、1877年-1882年
18.Khodadoust, M.S., Olsson, N., Wagar, L.E., Haabeth, O.A., Chen, B., Swaminathan, K., Rawson, K., Liu, C.L., Steiner, D., Lund, P., et al. (2017).抗原提示プロファイリングにより、リンパ腫免疫グロブリン新生抗原の認識が明らかになる。Nature 543, 723-727.
19.Kim, A., Ishizuka, I., Hartman, I., Poluektov, Y., Narayan, K., and Sadegh-Nasseri, S. (2013).MHCクラスIIペプチド負荷と編集をin vitroで研究する。分子生物学960, 447-459における方法。
20.LeMaoult, J., Caumartin, J., and Carosella, E.D. (2007).膜パッチの交換(トロゴサイトーシス)は、免疫細胞の理論的および実際の機能を分割する。ヒト免疫学68, 240-243.
21.Luisiri, P., Lee, Y.J., Eisfelder, B.J., and Clark, M.R. (1996).B細胞抗原レセプター複合体のIg-α/ベータヘテロダイマー内での協同性と機能の偏析J Biol Chem 271, 5158-5163.
22.Lun, A.T., McCarthy, D.J., and Marioni, J.C. (2016).Bioconductorを用いた単一細胞のR-seqデータの低レベル分析のためのステップバイステップワークフロー。F1000Res 5, 2122.
23.Mansfield, J.M. (1994).トリパノソーマ変形例表面糖蛋白質に対するT細胞応答:新しいパラダイム?今日の寄生虫学10年、267-270年。
24.Martina, M.N., Noel, S., Saxena, A., Bandapalle, S., Majithia, R., Jie, C., Arend, L.J., Allaf, M.E., Rabb, H., and Hamad, A.R. (2015).ダブルネガティブαβT細胞はAKIに対する初期応答者であり、ヒト腎臓で見出される。J Am Soc Nephrol.
25.Michel, M.L., Pang, D.J., Haque, S.F., Potocnik, A.J., Pennington, D.J., and Hayday, A.C. (2012).インターロイキン7(IL-7)は、マウスおよびヒトのIL-17産生γδ電池を選択的に促進する。米国科学アカデミー紀要109年、17549年-17554年。
26.中山、M、McDaniel、K.、Fitzgerald-Miller、L.、Kiekhaefer、C.、Snell-Bergeon、J.K.、Davidson、H.W.、Rewers、M.、Yu、L.、Gottlieb、P.、Kappler、J.W.、et al. (2015)健常および1型糖尿病被検者における変異インスリンペプチドに対する調節性対炎症性サイトカインT細胞反応『米国科学アカデミー紀要112』4429-4434。
27.岡田、T.、Miller、M.J.、Parker、I.、Krummel、M.F.、Neighbors、M.、Hartley、S.B.、O'Garra、A.、Cahalan、M.D.、and Cyster、J.G. (2005)。抗原に結合したB細胞はT細胞領域に向かって走化性を起こし、ヘルパーT細胞と運動性のある結合体を形成する。PLoS生物学3, e150.
28.Pavlidis, P., and Noble, W.S. (2001).マウス脳における遺伝子発現の歪みと局所的変動の分析ゲノム生物学2、リサーチ0042。
29.Picelli, S., Faridani, O.R., Bjorklund, A.K., Winberg, G., Sagasser, S., and Sandberg, R. (2014).Smart-seq2を使用した単一細胞からの全長のlength-seq。Nature protocols 9, 171-181.
30.Reth, M. (1992).Bリンパ球上の抗原レセプター。毎年、10, 97-121.のレビューを行っている。
31.Rizzetto, S., Eltahla, A.A., Lin, P., Bull, R., Lloyd, A.R., Ho, J.W.K., Venturi, V., and Luciani, F. (2017).T細胞の単セルRNA配列シーケンシングデータに対する配列決定の深さおよび読み長の影響科学論文7, 12781.
32.Robins, H.S., Campregher, P.V., Srivastava, S.K., Wacher, A., Turtle, C.J., Kahsai, O., Riddell, S.R., Warren, E.H., and Carlson, C.S. (2009).αβT細胞におけるT細胞受容体β鎖の多様性の包括的評価血液114, 4099-4107.
33.Sadegh-Nasseri, S., and Germain, R.N. (1991).MHCクラスII構造の決定におけるペプチドの役割。Nature 353, 167-170.
34.Saxena, A., Yagita, H., Donner, T.W., and Hamad, A.R.A. (2017).1型糖尿病患者におけるFasL発現CD5+ B細胞の拡大Frontiers in immunology 8, 402.
35.Seay, H.R., Yusko, E., Rothweiler, S.J., Zhang, L., Posgai, A.L., Campbell-Thompson, M., Vignali, M., Emerson, R.O., Kaddis, J.S., Ko, D., et al. (2016).1型糖尿病におけるT細胞およびB細胞レパートリーの組織分布およびクローンの多様性JCI Insight 1, e88242.
36.Sewell, A.K. (2012).なぜT細胞は交差反応性をもたなければならないのか。性質はImmunology 12, 669-677をレビューしている。
37.Sharp, K.A. (2012).バインディングおよび分子認識モデル(Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.)の統計熱力学
38.Smith, K., Garman, L., Wrammert, J., Zheng, N.Y., Capra, J.D., Ahmed, R., and Wilson, P.C. (2009).ワクチン接種抗原に特有の完全ヒト単クローン抗生物質の急速な発電。Nature protocols 4, 372-384.
39.Smith, M.J., Packard, T.A., O'Neill, S.K., Henry Dunand, C.J., Huang, M., Fitzgerald?Miller, L., Stowell, D., Hinman, R.M., Wilson,PC.,Gottlieb, P.A.ら(2015)。前糖尿病および新規発症1型糖尿病患者におけるアネルギーB細胞の消失糖尿病64, 17031712。
40.Tirosh, I., and Suva, M.L. (2018).単セルRNA配列決定によるヒト神経膠腫の解剖神経腫瘍学20, 37-43.
41.Tirosh, I., Venteicher, A.S., Hebert, C., Escalante, L.E., Patel, A.P., Yizhak, K., Fisher, J.M., Rodman,C., Mount, C., Filbin, M.G.ら(2016)。単一細胞RNA‐seqはヒトオリゴデンドログリオーマにおける発生階層を支持する。Nature 539, 309-313.
42.トラック、J.、Ramasamy、M.N.、Galson、J.D.、Rance、R.、Parkhill、J.、Lunter、G.、Pollard、A.J.、およびKelly、D.F. (2015)。公衆レパートリー分析を用いた抗原特異的B細胞レセプター配列の同定194年、252-261年のジャーナル。
43.Venturi, V., Price, D.A., Douek, D.C., and Davenport, M.P. (2008).公共のT細胞応答の分子基盤は?性質はImmunology 8, 231-238をレビューしている。
44.Wang, J., Sohn, H., Sun, G., Milner, J.D., and Pierce, S.K. (2014).ホスホリパーゼCγ2の自己抑制性C-端子SH2ドメインは、B細胞レセプターシグナロソーム集合を安定化する。サイン7、ra89。
45.Wang, Y., Sosinowski, T., Novikov, A., Crawford, F., Neau, D.B., Yang, J., Kwok, W.W., Marrack, P., Kappler, J.W., and Dai, S. (2018).インスリンB:11‐23ペプチドのC‐端子修飾は、マウス及びヒト1型糖尿病においてスーパーアゴニストを作り出す。アメリカ合衆国科学アカデミー紀要115年、162年-167年。
46.Wardemann, H., Yurasov, S., Schaefer, A., Young, J.W., Meffre, E., and Nussenzweig, M.C. (2003).初期のヒトB細胞前駆体による優勢な自己抗体産生。サイエンス301, 1374-1377.
47.Watson, C.T., Steinberg, K.M., Huddleston, J., Warren, R.L., Malig, M., Schein, J., Willsey, A.J., Joy, J.B., Scott, J.K., Graves, T.A., et al. (2013).ヒト免疫グロブリン重鎖可変、多様性、および連結遺伝子の完全なハプロタイプ配列と対立遺伝子およびコピー数変異の特徴づけ。Am J Hum Genet 92, 530-546.
48.Wu, A.R., Neff, N.F., Kalisky, T., Dalerba, P., Treutlein, B., Rothenberg, M.E., Mburu, F.M., Mantalas, G.L., Sim, S., Clarke, M.F.ら(2014)。単セルRNA配列決定法の定量的評価ネイチャー方法11、41-46。
49.Xia, Z., Chen, H., Kang, S.G., Huynh, T., Fang, J.W., Lamothe, P.A., Walker, B.D., and Zhou, R. (2014).多様なHIV-1 TCRクローンタイプとの錯体で比pMHC相互作用は、CTL機能の変化の構造的基盤を明らかにしている。科学論文4,4087。
50.Xiao, Z., Mohamood, A.S., Uddin, S., Gutfreund, R., Nakata, C., Marshall, A., Kimura, H., Caturegli, P., Womer, K.L., Huang, Y., et al. (2011).NODマウスにおけるFasリガンドの抑制は、インシュリン炎発症に対するIL‐10の保護的役割を露呈する。Am J Pathol 179, 725-732.
51.米代、T.、松下、M.、日比、M.、利根、H.、竹下、M.、安永、K.、克木、Y.、亀谷、T.、杉江、H.、斉藤、M. (2017)茶カテキンとカフェインはヒトにおいて褐色脂肪組織を活性化し、寒冷誘発熱産生能を増加させる。Am J Clin Nutr 105, 873-881.
52.Yu, L.M., and Chang, T.W. (1992).ヒトmb-1遺伝子:完全なcDNA配列および種々のイソタイプの膜Igを有するB細胞におけるその式。ジャーナル・オブ・イムロジー148, 633-637。
53.Ziegenhain、C.、Vieth、B.、Parekh、S.、Reinius、B.、Guillaumet-Adkins、A.、Smets、M.、Leonhardt、H.、Heyn、H.、Hellmann、I.、およびEnard、W. (2017単一細胞‐細胞‐rna配列決定法の比較分析。電池65, 631-643 e634.
(実施例2)
患者サンプル中のx-mAbの検出
本発明者は、血液液中のx-mAbの存在を測定するために、ELISAアッセイを開発した。特定の実施例において、この方法は、リスクのある個人を識別するために、ベアリング/ベアリングは新しい患者におけるT1Dの診断を確認するために、xイディオタイプを持っている個人のスクリーニングに使用することができる。特に、健康な個人からの血液が対照として用いられる。
議定書:
1.40Cの重炭酸緩衝液に様々な濃度の防xmAbを含んだ高い親和性96ウェルプレートを一晩でコーティングする。
2.皿を4回、0.05%のリン酸緩衝塩200ウルで洗います。
3.ブロック緩衝液(20% FCS)を用いて、370Cで2時間ブロックプレート。
4.1:50から2倍の連続希釈液をブロッキングバッファーで準備する。
5.200マイクロリットルのPBSTで皿を6回洗いなさい。
6.3つの複製井戸に希釈した血清を加える。
7.バックグラウンドシグナルの制御には、防x-mAbまたは血清を欠いた井戸を使用する。
8.一晩40℃で皿を育てる。
9.200マイクロリットルのPBSTで皿を6回洗いなさい。
10.1: 10,000に薄めた二次検出(ヤギ防IgG)を用意する。
11.指示されているように、別の井戸に二抗体反応を加えてください。
12.370Cで30分間、皿を育てる。
13.200マイクロリットルのPBSTで皿を6回洗う。
14.各ウェルにTMB溶液分間加え、硫酸で反応を止めます。
15.ELISAで405nmと550nmを読んでください。
16.550nmの計算で平均とノーマライゼーションを計算します。
17.統計的に有意なシグナルはp?0.05%と定義される。
(実施例3)
1型糖尿病の予測
ラベルのx-mAbは、T1Dが発達するリスクの高い個人(例えば、2つ以上のT1D抗毒薬を持つ人)のT1D比X細胞の存在は、誰がT1Dを発達させるだろうかと予測することを示している。
TrialNetは、T1Dを1つ以上持っている個人から、T1Dの発達をしない人も含めた連続血液試料を収集し、保存している。TrailNetからの1つ以上のT1D抗生物質を持っている個人からのフローズンサンプルは、T1D固有のX細胞を持っている人が誰がT1Dの開発を続けているかを予測するために使用される。
(実施例4)
1型糖尿病の予防と治療
細胞に結合し、細胞を不活性化または破壊するX細胞の表面上のT1D疾患特定のアミノ酸配列(「x-mAbs」)に対するヒト化抗体は、その病原性作用を妨げる。X細胞をT1D自己反応性T細胞の集団に加えると、著しく活性化され、急速に分裂し、サイトカインを分泌する。x-mAbの無力化作用を実証するために実験が行われ、以下のような実験が行われている:
1.x-mAbおよびT1D比X-細胞をT1D自己反応性T細胞の集団に加え、サイトカイン放出および自己反応性T細胞の拡大がin vitroで遮断されることを実証する。
2.T1Dのヒト化マウスモデルにおいて、T1D比X細胞の添加は、膵島細胞のリンパ球浸潤(膵島炎)およびT1Dをもたらす。
3.T1Dのヒト化マウスモデルでは、T1D比X電池を投与されたマウスをx-mAbで処理すると、インスリン炎とT1Dの発生が阻止される。
4.T1Dを発症するリスクの高い患者(例えば、2以上のT1D抗体を有する患者)をx-mAbで治療すると、この疾患は防止される。
5.T1Dを発症するリスクが高い(例えば、T1D比X細胞および1以上のT1D抗体を有する)患者をx-mAbで治療することにより、この疾患は防止される。

Claims (55)

  1. 患者から得た生物学的サンプルからSEQ ID NO:1をエンコードするヌクレオチド配列を検出する方法。
  2. 発見ステップがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む記載の方法。
  3. PCRが、SEQ ID NOS:17-18を含むプライマーを用いた増幅を含む記載の方法。
  4. 記載の方法で、PCRがSEQ ID NOS:23及び19からなるプライマーを用いた増幅を含むもの。
  5. 記載の方法で、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO:25を含む。
  6. 生物試料が周辺血液であることを特徴とする請求項1の方法。
  7. 発見ステップを更に配列決定を含む、請求項2-6のいずれかの方法。
  8. 記載の方法で、HLA-DQアレルをゲノタイピングする工程をさらに含む。
  9. 患者が1型糖尿病(T1D)のリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、以下のステップを含む、方法:
    (a)患者から得た生物学的サンプルからSEQ ID NO:1をエンコードする核酸配列の検出;
    （ｂ）HLA-DQ7アレルまたはHLA-DQ8アレルの存在を検出するためのHLA-DQのジェノタイプ。これは、SEQ ID NO:1およびHLA-DQ8を有する患者がT1Dの危険にさらされ、SEQ ID NO:1およびHLA-DQ7を持たない患者はT1Dの危険にさらされず、SEQ ID NO:1を持たない患者はT1Dの危険にさらされない。
  10. 以下のステップを含む、患者が自己免疫疾患の危険があるかどうかを判定するための方法:
    (a)患者から得た生物学的サンプルからSEQ ID NO:1をエンコードする核酸配列の検出;
    (b)HLA-DQ7対立遺伝子またはHLA-DQ8対立遺伝子の存在を検出するためにHLA-DQをジェノタイピングし、ここで、配列ID NO:1およびHLA-DQ8を有する患者は自己免疫疾患の危険があり、配列ID NO:1およびHLA-DQ7を有さない患者は自己免疫疾患の危険がなく、配列ID NO:1を有さない患者は自己免疫疾患の危険がない。
  11. 自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、または全身性エリテマトーデスを含む、請求項10記載の方法。
  12. SEQ ID NO:1を具体的に結合する、それらの抗原結合フラグメント。
  13. B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成される、(i)B細胞レセプター上で表現されるB細胞レセプターを具体的に結合する、又はその抗原結合フラグメント、又は(ii)SEQ ID NO:1で構成される自由浮遊する、その断片。
  14. SEQ ID NO:1を含む、特定的に結合する、その抗原結合フラグメント。
  15. 請求項12-14のいずれかの抗原結合フラグメント、すなわち、抗原または抗原結合フラグメントが、SEQ ID NO:1への抗原の結合を防止または減少させる。
  16. 抗原結合フラグメントが、scFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2、およびダイアボディからなるグループから選択される、請求項12-15のいずれかの抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメント。
  17. T1Dを有する被検者における第1種糖尿病(T1D)の治療又は予防の方法、又は、請求項12-16のいずれかの抗原結合フラグメントの治療効果のある量を患者に施術する工程を含むその危険性。
  18. 重鎖相補性決定領域(CDR)1、2および3を含む単離された抗体またはその抗体結合フラグメントであって、重鎖CDR1が、配列番号60に示されるアミノ酸配列、または配列番号60に示されるアミノ酸配列で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含み、重鎖CDR2が、配列番号62に示されるアミノ酸、または配列番号62に示されるアミノ酸で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸を含み、重鎖CDR3が、配列番号64に示されるアミノ酸配列、または配列番号64に示されるアミノ酸で2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列を含む、単離された抗体またはその抗体結合フラグメント。
  19. 単離された140又は抗原結合フラグメントが更に軽鎖CDR1、2及び3を含み、軽鎖CDR1はSEQ ID NO:66に記載されたアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:66に記載されたアミノ酸配列は2又はそれ以下のアミノ酸位置に置き換えられ、軽鎖CDR2はSEQ ID NO:68に記載されたアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:68に記載されたアミノ酸配列は2又はそれ以下のアミノ酸位置に置き換えられ、軽鎖CDR3はSEQ ID NO:9に記載されたアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:9に記載されたアミノ酸配列は2又はそれ以下のアミノ酸位置に置き換えられた。
  20. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)および(SEQ ID NO:1で構成される自由浮遊型の)を具体的に結合する、(1)B細胞レセプターの断片であるB細胞レセプター、または、(2)それの反対又は抗原結合フラグメントが、それぞれSEQ ID NO:60、62および64に規定されるアミノ酸配列で構成されるCDR1、CDR2およびCDR3から成る重鎖可変領域(VH)で構成される自由浮遊型の。
  21. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターに、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターまたは(2)SEQ ID NO:1で構成されるフリーフローティング(SEQ ID NO:1で構成される)を具体的に結合する、(1)B細胞レセプターの断片又は抗原結合断片は、SEQ ID NO:66、68及び9に規定されるアミノ酸配列から成るCDR1、CDR2及びCDR3で構成されるライトチェーン可変領域(VL)で構成される。
  22. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター上に表されるB細胞レセプター、又は(2)それが構成されるSEQ ID NO:1で構成される自由浮遊型のバラエティを具体的に結合する、単離された、又は抗原拘束する断片、又は(2)SEQ ID NO:1で構成される:
    (a)SEQ ID NOS:60, 62, 64に記載されているアミノ酸配列からなるCDR1, CDR2, CDRからなるVH;
    (b)SEQ ID NOS:66, 68, 9に記載されているアミノ酸配列からなるCDR1, CDR2, CDR3からなるVL。
  23. 請求項18-22のいずれかの単離された核酸分子で、当該請求項又は抗原結合フラグメントをエンコードしている。
  24. 請求項23の核酸分子からなるベクトル。
  25. 請求項24のベクトルからなる宿主細胞。
  26. 宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項25記載の宿主細胞。
  27. 宿主細胞による、自己又は抗原結合フラグメントの表現に適した条件下で請求項25の宿主細胞を(a)文化する段階、及び(b)それらの抗原結合フラグメントを回収する段階で構成される、抗原結合フラグメントを作る方法。
  28. 宿主細胞が原核または真核細胞であることを示す請求項27の方法。
  29. 請求項18-22のいずれか1つによれば、それらの抗原結合フラグメント又は抗原結合フラグメントを含む組成物と、適切な医薬品担体。
  30. 請求項29の組成物であって、組成物は、静脈、筋肉内、口下、皮下、腹内、筋内、または筋肉内の行政のために定式化される。
  31. 請求項18-22のいずれかの抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントの治療効果のある量を哺乳動物に管理する工程を含んでいる哺乳動物における糖尿病を治療する方法。
  32. 請求項18-22のいずれかのうちの1つで、哺乳動物に、抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントの治療効果的な量を与える工程を含んでいる哺乳動物における自己感染病を治療する方法。
  33. 抗原結合フラグメントがscFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2、およびダイアボディからなるグループから選択される請求項22の抗原結合フラグメント又は抗原結合フラグメント。
  34. 分離された、又は抗原結合フラグメントは、(1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1を構成する、B細胞レセプターに表現されるB細胞レセプターを、(2)それの抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:74に記載されるアミノ酸配列から成るVHを構成するSEQ ID NO:1を構成する自由浮遊する。
  35. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターに、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターを具体的に結合する単離された、又は(2)SEQ ID NO:1で構成される自由浮遊性の、(この場合、それらの抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:76に記載されるアミノ酸配列で構成されるVLで構成される)B細胞レセプターを具体的に結合する、単離された、又は抗原結合フラグメントである。
  36. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、又は(2)SEQ ID NO:1で構成される自由浮遊性のビーズであり、このような、それらの、又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:74に記載されるアミノ酸配列で構成されるVH及びSEQ ID NO:76に記載されるアミノ酸配列で構成されるVLで構成される。
  37. 重鎖CDR1が、配列番号78に記載のアミノ酸配列、または配列番号78に記載のアミノ酸配列の2つ以下のアミノ酸位置での置換を有するアミノ酸配列、配列番号80に記載のアミノ酸、または配列番号80に記載のアミノ酸の2つ以下のアミノ酸位置での置換を有する重鎖CDR2、および配列番号82に記載のアミノ酸配列、または配列番号82に記載のアミノ酸の2つ以下のアミノ酸位置での置換を有する重鎖CDR3を含む、重鎖相補性決定領域(CDR)1、2、および3を含む、単離された抗体またはその抗体結合フラグメント。
  38. 請求項37の単離された抗菌作用又は抗原結合フラグメントはさらに軽鎖CDR1、2及び3を含み、軽鎖CDR1はSEQ ID NO:84に記載されたアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:84に記載されたアミノ酸配列は2又はそれ以下のアミノ酸位置に置き換えられ、軽鎖CDR2はSEQ ID NO:86に記載されたアミノ酸配列、又はSEQ ID NO:86に記載された2又はそれ以下のアミノ酸位置に置き換えられたアミノ酸配列及びSEQ ID NO:88に記載された軽鎖CDR3は2又はそれ以下のアミノ酸位置に置き換えられ、又はSEQ ID NO:88に記載されたアミノ酸配列である。
  39. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、又は(2)それを構成する自由浮遊性の(SEQ ID NO:1で構成される)それらの、又は抗原結合フラグメントは、それぞれ、SEQ ID NO:78、80及び82に規定されるアミノ酸配列から成るCDR1、CDR2及びCDR3で構成される重鎖可変領域(VH)で構成される。
  40. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターに、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターまたは(2)SEQ ID NO:1で構成されるフリーフローティング(SEQ ID NO:1で構成される)を具体的に結合する、(1)B細胞レセプターの断片又は抗原結合断片は、それぞれSEQ ID NO:84、86および88に規定されるアミノ酸配列から成るCDR1、CDR2およびCDR3から成る軽鎖可変領域(VL)で構成される。
  41. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター上に表されるB細胞レセプター、又は(2)それが構成されるSEQ ID NO:1で構成される自由浮遊型のバラエティを具体的に結合する、単離された、又は抗原拘束する断片、又は(2)SEQ ID NO:1で構成される:
    (a)SEQ ID NOS:78, 80, 82に記載されているアミノ酸配列からなるCDR1, CDR2, CDRからなるVH;
    (b)SEQ ID NOS:84, 86, 88に記載されているアミノ酸配列からなるCDR1, CDR2, CDR3からなるVL。
  42. 請求項37-41のいずれかのうちの、抗原結合フラグメント又はそれらをエンコードする孤立した核酸分子。
  43. 請求項42の核酸分子からなるベクトル。
  44. 請求項43のベクトルからなる宿主細胞。
  45. 宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項44記載の宿主細胞。
  46. 宿主細胞による、自己又は抗原結合フラグメントの表現に適した条件下で、(a)請求項44の宿主細胞を栽培する段階、及び(b)それらの抗原結合フラグメントを回収する段階で構成される、抗原結合フラグメントを作る方法。
  47. 宿主細胞が原核または真核細胞である記載の方法。
  48. 請求項37-41のいずれかによれば、それらの抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントと適当な医薬品担体とを含む組成物。
  49. 請求項48の組成物であって、組成物が静脈、筋肉内、口下、皮下、腹内、皮内又は筋肉内の行政のために定式化されるもの。
  50. 請求項37-41のいずれかの抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントの治療効果のある量を哺乳動物に管理する工程を含む哺乳動物における糖尿病を治療する方法。
  51. 請求項37-41のいずれかの抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントの治療効果のある量を哺乳動物に管理する工程を含む哺乳動物における自己感染病を治療する方法。
  52. 抗原結合フラグメントが、scFv、sc(Fv)2、Fab、F(ab)2及びダイアボディからなるグループから選択される請求項41の抗原結合フラグメント又は抗原結合フラグメント。
  53. B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成される、(1)B細胞レセプターに表現されるB細胞レセプターを具体的に結合する、分離された、又は抗原結合フラグメント、又は(2)その抗原結合フラグメントが、SEQ ID NO:90に記載されたアミノ酸配列からなるVHを含むSEQ ID NO:1で構成される自由浮遊する、SEQ ID NO:1で構成される。
  54. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターに、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプターを具体的に結合する単離された、又は(2)SEQ ID NO:1で構成される自由浮遊性の、それらの、又は抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:92に記載されるアミノ酸配列で構成されるVLで構成される。
  55. (1)B細胞レセプターがSEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)SEQ ID NO:1で構成されるB細胞レセプター、(2)SEQ ID NO:1で構成される自由浮遊性のバラエティッド、すなわち、そのバラエティック抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:90で規定されるアミノ酸配列で構成されるVHと、SEQ ID NO:92で規定されるアミノ酸配列で構成されるVLで構成される。
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