ES2848052T3

ES2848052T3 - Anticuerpos de unión dual anti-PD-L1 y PD-L2 de agente individual y métodos de uso

Info

Publication number: ES2848052T3
Application number: ES13824810T
Authority: ES
Inventors: Gordon Freeman; Arlene Sharpe
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2021-08-05
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: EP2890715A1; JP2015527342A; HK1210481A1; JP2019038804A; CN104936982B; US10934353B2; EP2890715A4; US20180201680A1; CN104936982A; WO2014022758A1; CN111499755A; US20150197571A1; EP2890715B1; US9845356B2; JP6827021B2; JP6403166B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente tanto a PD-L1 como a PD-L2, que comprende seis CDRs: CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde CDR-L1 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 70-102 de la SEQ ID NO: 13, CDR-L2 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 148-168 de la SEQ ID NO: 13, CDRL3 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 265-291 de la SEQ ID NO: 13, CDR-H1 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 91-108 de la SEQ ID NO: 15, CDR-H2 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 151-198 de la SEQ ID NO: 15, y CDR-H3 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 295-330 de la SEQ ID NO: 15, preferiblemente donde el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, i) comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 15; ii) comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 13; o ii) comprende la secuencia de dominio variable de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 13.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de unión dual anti-PD-LI y PD-L2 de agente individual y métodos de uso

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. n° 61/679.190, presentada el 3 de agosto de 2012.

Antecedentes de la Invención

Para que las células inmunes, tal como las células T, respondan a proteínas extrañas, se deben proporcionar dos señales por parte de células presentadoras de antígeno (APCs) a los linfocitos T en reposo (Jenkins, M. y Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165: 302-319; Mueller, D. L. et al. (1990) J. Immunol. 144: 3701-3709). La primera señal, que confiere especificidad a la respuesta inmune, es transducida vía receptor de célula T (TCR) después del reconocimiento del péptido antigénico extraño presentado en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La segunda señal, denominada co-estimulación, induce a las células T a proliferar y hacerse funcionales (Lenschow et al. (1996) Annu. Rev. Immunol. 14: 233). La co-estimulación ni es específica de antígeno ni está restringida por MHC y se cree que es proporcionada por uno o más polipéptidos distintos de la superficie celular por APCs (Jenkins, M. K. et al. (1988) J. Immunol. 140: 3324-3330; Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 721-730; Gimmi, C. D., et al. 1991 Frac. Natl. Acad Sci. USA 88: 6575-6579; Young, J. W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90: 229 237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 759-762; Reiser, H. et al. (1992) Frac. Natl. Acad Sci. USA 89: 271 -275; van-Seventer, G. A et al. (1990) J. Immunol. 144: 4579-4586; LaSalle, J. M. et al. (1991) J. Immunol. 147: 774 80; Dustin, M. I. et al. (1989) J. Exp. Med. 169: 503; Armitage, R. J. et al. (1992) Nature 357: 80-82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med. 175: 437-445).

Además de las rutas co-estimuladoras bien conocidas, existen rutas co-inhibidoras para regular a la baja la activación de células T y las respuestas inmunes, y la modulación de dichas rutas co-inhibidoras se puede usar para modular de forma efectiva respuestas inmunes. Por ejemplo, el bloqueo de rutas co-inhibidoras ofrece una estrategia para estimular respuestas inmunes a través del bloqueo de señales negativas, y por tanto presenta potencial terapéutico para tratar dolencias tales como el cáncer o las enfermedades infecciosas crónicas, tal como la infección de virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infección de virus de hepatitis C (VHC), malaria y tuberculosis (TB). Sin embargo, un entramado compuesto por al menos (a) PD-L1 y PD-L2 que interactúan con PD-1; (b) PD-L1 que interactúa con B7-1; y (c) otros receptores que interactúan con PD-L1 y/o PD-L2 presenta un conjunto complejo de rutas co inhibidoras sobre las que actuar. Los agentes actuales solo bloquean un subconjunto de dichas interacciones. De hecho, los esfuerzos por generar agentes que modulen dichas rutas co-inhibidoras se han centrado en agentes individuales que modulan específicamente subconjuntos de interacciones. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (mAb) PD-1 existente podría bloquear la interacción entre PD-1 y los ligandos de PD-1, PD-L1 y PD-L2, pero no bloquear la interacción entre PD-L1 y B7-1 o los ligandos de PD-1 y otros receptores (p.ej., PD-L2 y RGMb). Por tanto, dicho mAb anti-PD-1 bloquearía solo un subconjunto de interacciones. Además, los métodos de generar dichos agentes, tal como la inmunización de modelos animales con polipéptidos PD-L1 o PD-L2, no dan lugar a agentes de unión dual a PD-L1 y PD-L2 ya que albergar PD-L1 y PD-L2 conduce a la tolerancia y eliminación de las células B que producirían dichos agentes. Asimismo, el uso de polipéptidos grandes de PD-L1 y PD-L2 con fines de inmunización obscurece funcionalmente epítopos comunes que darían lugar a anticuerpos capaces de unirse a ambas dianas. Por ejemplo, un ratón salvaje eliminará anticuerpos que reaccionan contra PD-L1 y PD-L2 de ratón y por tanto eliminará un gran número de anticuerpos que se unen a estructuras conservadas entre PD-L1 o PD-L2 humanos y de ratón.

El documento WO 201/036959 describe el uso combinado de anticuerpos que se unen a PD-L1 y anticuerpos que se unen a PD-L2 en terapia.

Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de desarrollar composiciones con una capacidad mejorada de modular simultáneamente rutas co-inhibidoras y métodos de usar dichas composiciones para diagnosticar, pronosticar y proporcionar una terapia de forma efectiva en aplicaciones en las que dichas capacidades de modulación de ruta co-inhibidora mejorada son beneficiosas.

Sumario de la Invención

La presente invención se basa, en parte, en la identificación de nuevos anticuerpos que presentan afinidad de unión tanto por PD-L1 como por PD-L2, y en los métodos para usar los mismos.

La invención está dirigida a un anticuerpo monoclonal aislado, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente tanto a PD-L1 como a PD-L2, que comprende seis CDRs: CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, ^{C D r -}H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde CDR-L1 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 70 102 de la SEQ ID NO: 13, CDR-L2 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 148-168 de la SEQ ID NO: 13, CDR-L3 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 265-291 de la SEQ ID NO: 13, CDR-H1 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 91-108 de la SEQ ID NO: 15, CDR-H2 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 151-198 de la SEQ ID NO: 15, y CDR-H3 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 295-330 de la SEQ ID NO: 15,

preferiblemente donde el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo,

i) comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 15;

ii) comprende la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 13; o

ii) comprende la secuencia de dominio variable de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 13.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-L1 y PD-L2. En una realización, tanto PD-L1 como PD-L2 son PD-L1 y PD-L2 humanos. En otra realización PD-L1 humano comprende una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o 6, y PD-L2 humano comprende una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe una o más de las interacciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb; (e) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L1 a PD-1; (f) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L1 a B7-1; (g) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L2 a PD-1; y (h) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L2 a RGMb (p.ej., el anticuerpo monoclonal aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe uno o más señales co-inmunoinhibidoras de (e), (f), (g) o (h)). En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, potencia una o más de las interacciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb; (e) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L1 a PD-1; (f) una señal coinmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L1 a B7-1; (g) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L2 a PD-1; y (h) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L2 a RGMb (p.ej., la señal coinmunoinhibidora es (e), (f), (g) o (h). En otra realización, PD-1, B7-1 o RGMb es una proteína de fusión. En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de antígeno del mismo, se une a la secuencia de péptido CFTVTBPKDLYVVEYGSN o CYRSMISYGGADYKRITV. En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal aislado está depositado como un clon de hibridoma y tienen asignado un número de acceso. En otra realización, el anticuerpo monoclonal comprende: a) una secuencia de cadena pesada con al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1, o b) una secuencia de cadena ligera con al menos aproximadamente 95% de identidad con una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1. En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal comprende: a) una secuencia de CDR de cadena pesada con una identidad de al menos aproximadamente 95% con una secuencia de CDR de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1, o b) una secuencia de CDR de cadena ligera con una identidad de al menos aproximadamente 95% con una secuencia de CDR de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1. En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal aislado comprende: a) una secuencia de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1; o b) una secuencia de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1. En otra realización, el anticuerpo monoclonal aislado comprende: a) una secuencia de CDR de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1; o b) una secuencia de CDR de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las secuencias enumeradas en la Tabla 1. En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto, de roedor o humano. En otra realización adicional, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento F(ab’)2, fragmento Fab, scFv, scFv bi-específico, scFv tri-específico, diacuerpo, anticuerpo de dominio individual (dAb), minicuerpo, o unidad de reconocimiento molecular (MRU). En otra realización, el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la unión de un anticuerpo comercial a PD-L1 o PD-L2. En otra realización adicional, la presencia del anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo reduce o inhibe al menos una actividad de PD-L1 o PD-L2 respecto a la ausencia del anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto adicional, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que se hibrida, en condiciones de severidad, con el complemento de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de un anticuerpo monoclonal descrito en la presente memoria, o una secuencia con al menos aproximadamente 95% de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de un anticuerpo monoclonal descrito en la presente memoria.

En otro aspecto adicional, se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado descrito en la presente memoria.

En otro aspecto, se proporciona una célula hospedante que comprende un ácido nucleico aislado descrito en la presente memoria y/o expresa el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria.

En otro aspecto adicional, se proporciona un animal no humano transgénico que comprende un ácido nucleico aislado descrito en la presente memoria y/o expresa el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria.

En otro aspecto adicional, se proporciona un método para producir al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria, que comprende cultivar una célula que produce al menos un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a partir del cultivo celular.

En otro aspecto, se proporciona un dispositivo o kit que comprende al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria, comprendiendo opcionalmente dicho dispositivo o kit una etiqueta para detectar el al menos un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un complejo que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, el dispositivo detecta la presencia de un polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 en una muestra mediante el uso de un ensayo de sándwich o un ensayo competitivo.

En otro aspecto adicional, se proporciona un método in vitro para detectar la presencia o el nivel de un polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2, comprendiendo dicho método la detección de dicho polipéptido en una muestra mediante el uso de al menos un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria. En una realización, el al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 y el complejo es detectado en la forma de un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), ensayo radioinmune (RIA) o inmunoquímicamente. En otra realización, la muestra se obtiene a partir de un sujeto.

En otro aspecto adicional de la descripción, se proporciona un método para monitorizar el curso, o la recurrencia, de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo dicho método la determinación del nivel de un polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 en una muestra de dicho sujeto en base a la formación de un complejo que comprende al menos un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria y el polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2, donde el nivel de PD-L1 y/o PD-L2 indica el curso, o la recurrencia, de la enfermedad. En una realización, la etapa de determinación se lleva a cabo mediante ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), ensayo radioinmune (RIA), inmunoquímicamente, o usando un ensayo de flujo intracelular. En otra realización, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cáncer, síndrome metabólico y dislipidemia.

En otro aspecto de la descripción, se proporciona un método para determinar si administrar o no un inhibidor de PD-L1 y/o PD-L2 a un sujeto, que comprende determinar el nivel de polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 en una muestra de dicho sujeto en base a la formación de un complejo que comprende al menos un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria y el polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2; y determinar si administrar o no el inhibidor de PD-L1 y/o PD-L2 en base al nivel de polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 detectado. En una realización, la etapa de determinación se lleva a cabo mediante ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), ensayo radioinmune (RIA), inmunoquímicamente, o usando un ensayo de flujo intracelular.

En otro aspecto adicional de la descripción, se proporciona un método para reactivar células T agotadas, que comprende poner en contacto una población de células, donde al menos algunas células expresan PD-L1 y/o PD-L2, con una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria.

En otro aspecto adicional de la descripción, se proporciona un método para tratar un sujeto que padece una afección que se beneficiaría de la modulación de una respuesta inmune, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria. En una realización, la afección es una infección (p.ej., una infección vírica, infección bacteriana, infección de protozoo, o infección de helminto). En otra realización adicional, la afección es cáncer (p.ej., un tumor sólido, un cáncer hematológico, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer gástrico, glioma, cáncer de cabeza, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, mieloma, cáncer de cuello, cáncer de ovario, melanoma, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer salivar, cáncer de estómago, cáncer epitelial tímico, o cáncer de tiroides). En otra realización adicional, la afección es un trastorno inflamatorio (p.ej., encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia hemolítica autoinmune, artritis, enfermedad de Behcet, pénfigo bulloso, enfermedad celiaca, enfermedad de Chagas, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Goodpasture, enfermedad de injerto-contra-hospedante, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, síndrome híper IgE, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, soriasis, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, arteritis temporal, vasculitis, o granulomatosis de Wegener). En otra realización, la afección es rechazo de trasplante (p.ej., rechazo de órgano, rechazo de trasplante de médula ósea, o rechazo de trasplante de médula ósea no mieloablativo).

Descripción detallada de la Invención

Los agentes actuales modulan de forma ineficiente subconjuntos de rutas co-inhibidoras, ya que solo son capaces de unirse y modular la actividad de dianas individuales (p.ej., CTLA4, B7-1, RGMb, PD-1, PD-L1 o PD-L2). Esto supone un problema para el desarrollo de agentes diagnósticos y terapéuticos útiles, ya que los agentes adicionales requeridos para modular de forma efectiva otras rutas co-inhibidoras (p.ej., anticuerpos anti-CTLA-4, anti-B7-1, anti-RGMb, anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o anti-PD-L2) complican significativamente los regímenes diagnósticos y terapéuticos y aumentan la carga de requisitos regulatorios clínicos. Por consiguiente, la presente invención se basa, al menos en parte, en nuevas composiciones de anticuerpos que se unen a PD-L1 y PD-L2. Adicionalmente, el problema de la tolerización y la eliminación de células B hospedantes que producen dichas composiciones deseadas se ha solventado inmunizando animales hospedantes que albergan mutaciones de bloqueo de PD-L1 y PD-L2, ya que dichos ratones carecen de estas proteínas y por tanto no han sido tolerizados o eliminados de cualesquier células B que producen anticuerpos que se unen a PD-L1 o PD-L2. Entre los anticuerpos generados, se han aislado los anticuerpos de unión dual preferidos que son anticuerpos bloqueantes duales monoclonales que pueden bloquear múltiples rutas inhibidoras. El logro de generar los anticuerpos de unión dual descritos se basa en el descubrimiento de que las estructuras de PD-L1 y PD-L2 presentan regiones de gran similitud, particularmente en la región del dominio de IgV implicado en la unión a PD-1. Adicionalmente, se ha descubierto que los péptidos, CFTVTVPKDLYVVEYGSN y CYRSMISYGGADYKRITV, representan epítopos inmunogénicos para generar anticuerpos de unión dual deseados en base al análisis de conservación estructural y de secuencia entre PD-L1 y PD-L2, así como las relaciones de unión entre PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2.

A fin de que la presente invención pueda ser comprendida más fácilmente, en primer lugar, se definen ciertos términos. A lo largo de la descripción detallada se establecen definiciones adicionales.

Los artículos “un” y “una” se usan en la presente memoria se refieren a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “actividad”, cuando se usa con respecto a un polipéptido, p.ej., un polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 humano, incluye actividades que son inherentes a la estructura de la proteína tal como se descubre en la presente memoria.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, “porción de unión a antígeno”) o una cadena individual del mismo. Un “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas por puentes de disulfuro, o una porción de unión a antígeno del mismo. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligara (abreviada en la presente memoria como Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas entre regiones que son más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. “Anticuerpos inactivantes” se refiere a anticuerpos que no inducen el sistema de complemento. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; xenogénicos, alogénicos o singénicos; o formas modificadas de los mismos (p.ej., humanizados, quiméricos, etc.). Los anticuerpos también pueden ser completamente humanos. En realizaciones preferidos, los anticuerpos de la invención se unen específicamente o de forma sustancialmente específica a PD-L1 humano y PD-L2 humano.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “porción de unión a antígeno” o “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (p.ej., PD-L1 y/o PD-L2 humanos). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser ejercida por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados por el término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vh, Vl, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos a un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vh y Vl de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDRs aisladas que pueden estar unidas opcionalmente por un ligando sintético. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vh y Vl, están codificados por genes separados, que pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, a través de un ligando sintético que les permita constituirse en una única cadena proteica en la que el par de regiones Vh y Vl para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase p.ej., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla, también se pretende que estén abarcados por el término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica, y los fragmentos son cribados en función de su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “célula presentadora de antígeno” incluye células presentadoras de antígeno profesionales (p.ej., linfocitos B, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans) así como otras células presentadoras de antígeno (p.ej., queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos, oligodendrocitos). El término “célula T” incluye células T CD4+ y células T CD8+. El término célula T también incluye células T colaboradoras tipo 1, células T colaboradoras tipo 2, células T colaboradoras tipo 17 y células T inhibidoras.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “afinidad de unión” se refiere a una medida mediante la cual un agente se une a una molécula diana. La afinidad de unión es “específica” si es suficientemente fuerte para unirse a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad (Kd) de aproximadamente menos de 10 7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso inferior, cuando se determina mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en, por ejemplo, un instrumento BIACORE 3000 usando proteína diana recombinante (p.ej., PD-L1 humano y/o PD-L2 humano) como analito y el anticuerpo como ligando, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 o 10,0, o más, veces su afinidad de unión a un antígeno no específico (p.ej., BSA, caseína) diferente del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan de forma intercambiable en la presente memoria con el término “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “fluido corporal” se refiere a fluidos que son excretados o secretados del cuerpo, así como a fluidos que normalmente no los son (p.ej., fluido amniótico, humor acuoso, bilis, sangre, plasma sanguíneo, fluido cerebroespinal, cerumen, cera de oídos, fluido de Cowper o fluido pre-eyaculatorio, quilo, quimo, heces, eyaculado femenino, fluido intersticial, fluido intracelular, linfa, menstruación, leche materna, mucus, fluido pleural, fluido peritoneal, pus, saliva, sebo, semen, suero, sudor, fluido sinovial, lágrimas, orina, lubricación vaginal, humor vítreo y vómito).

Tal como se usa en la presente memoria, los términos “cáncer” o “tumor” se refieren a la presencia de células que poseen características típicas de células que producen cáncer, tal como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, crecimiento rápido y velocidad de proliferación rápida, y determinadas características morfológicas. Las células de cáncer a menudo se encuentran en la forma de un tumor, pero tales células pueden existir solas dentro de un animal, o pueden ser una célula cancerígena no tumorigénica, tal como una célula de leucemia. Tal como se usa en la presente memoria, el término “cáncer” incluye tanto cánceres premalignos como cánceres malignos. Los cánceres incluyen, aunque sin limitación, linfomas, que incluyen linfoma de zona gris, linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin (que incluye linfoma no de Hodgkin de células T y B, p.ej., linfoma de zona de manto, linfoma de célula B grande mediastinal, linfoma de célula B grande difuso, linfoma folicular, linfoma de zona marginal extranodal de tejido asociado a mucosa (linfoma MALT), linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal nodal, linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma linfoplasmático (también denominado macroglobulinanemia de Waldenstrom)), carcinoma de célula escamosa, cáncer de célula B, p.ej., mieloma múltiple, las enfermedades de cadena pesada, tales como, por ejemplo, enfermedad de cadena alfa, enfermedad de cadena gamma, y enfermedad de cadena mu, gammopatía monoclonal benigna, amiloidosis inmunocítica, melanomas (p.ej., melanoma metastásico), cáncer de mama, cáncer de pulmón (p.ej., cáncer de pulmón de célula pequeña y cáncer de pulmón de célula no pequeña), cáncer de bronquios, cáncer colorrectal, cáncer de próstata (p.ej., cáncer de próstata refractario de hormona, metastásico), cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer del sistema nervioso central o de cerebro, cáncer del sistema nervioso periférico, cáncer esofágico, cáncer de cérvix, cáncer uterino o endometrial, cáncer de la cavidad oral o de faringe, cáncer de hígado, cáncer de riñón (p.ej., carcinoma de célula renal), cáncer testicular, cáncer de tracto biliar, cáncer de intestino delgado o de apéndice, cáncer de glándula salival, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de glándula adrenal, osteosarcoma, condrosarcoma, cáncer de tejidos hematológicos, y similares.

Los términos “CDR”, y su plural “CDRs”, se refieren a una región determinante de complementariedad (CDR) de las cuales tres constituyen el carácter de unión de una región variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y tres constituyen el carácter de unión de una región variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3). Las CDRs contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo y están separadas por secuencias de aminoácido que comprenden regiones de sostén o estructurales. Las fronteras de CDR definicionales exactas y las longitudes son objeto de diferentes sistemas de clasificación y numeración. Por tanto, las CDRs pueden referirse según las definiciones de frontera de Kabat, Chothia, de contacto o cualquier otro. A pesar de las diferentes fronteras, cada uno de estos sistemas tiene algún grado de solapamiento en lo que constituye las denominadas “regiones hipervariables” dentro de las secuencias variables. Las definiciones de CDR según estos sistemas pueden por tanto diferir en longitud y áreas de frontera con respecto a la región estructural adyacente. Véase, por ejemplo, Kabat, Chothia y/o MacCallum et al. (Kabat et al., en "Sequences of Proteins of lmmunological Interest," 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901; y MacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732).

Tal como se usa en la presente memoria, el término “clasificar” incluye “asociar” o “categorizar” una muestra con un estado de enfermedad. En determinados casos, la “clasificación” se basa en evidencia estadística, evidencia empírica, o ambas. En determinadas realizaciones, los métodos y sistemas de clasificación usan un, así denominado, conjunto de entrenamiento de muestras que presentan estados de enfermedad conocidos. Una vez establecido, el conjunto de datos de entrenamiento sirve como base, modelo o plantilla para comparar las características de una muestra desconocida, a fin de clasificar el estado de enfermedad desconocido de la muestra. En determinados casos, la clasificación de la muestra es similar a diagnosticar el estado de enfermedad de la muestra. En otros casos determinados, la clasificación de la muestra es similar a diferenciar el estado de enfermedad de la muestra de otro estado de enfermedad.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo compuesto” se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables que comprenden secuencias de inmunoglobulina de línea germinal o de línea no germinal de dos o más regiones variables no relacionadas. Adicionalmente, el término “anticuerpo compuesto humano” se refiere a un anticuerpo que presenta regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana o de línea no germinal humana y regiones variables que comprenden secuencias de línea germinal humana o de línea no germinal humana de dos o más regiones variables humanas no relacionados. Un anticuerpo compuesto humano es útil como componente efectivo en un agente terapéutico según la presente invención ya que se reduce la antigenicidad del anticuerpo compuesto humano en el cuerpo humano.

La presente invención también abarca “modificaciones de secuencia conservativas”, que incluyen modificaciones de secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que no afectan o alteran de forma significativa las características de unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones de secuencia conservativas incluyen sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos y aminoácidos. Las modificaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, como la mutagénesis sito-dirigida y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácido conservativas incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Dichas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (p.ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo de la presente invención preferiblemente es reemplazado por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra realización, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente en la totalidad o en parte de las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos que se unen a PD-L1 y/o PD-L2, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los anticuerpos modificados resultantes pueden ser cribados en función de su actividad de unión.

Adicionalmente, existe una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de aminoácidos de una proteína particular y las secuencias de nucleótido que pueden codificar para la proteína, tal como se define a través del código genético (mostrado a continuación). Del mismo modo, existe una correspondencia conocida y definida entre la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico particular y la secuencia de aminoácidos codificada por dicho ácido nucleico, tal como se define a través del código genético.

CÓDIGO GENÉTICO

Alanina (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT

Arginina (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT

Asparagina (Asn, N) AAC, AAT

Ácido aspártico (Asp, D) GAC, GAT

Cisteína (Cys, C) TGC, TGT

Ácido glutámico (Glu, E) GAA, GAG

Glutamina (Gln, Q) CAA, CAG

Glicina (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT

Histidina (His, H) CAC, CAT

Isoleucina (Ile, I) ATA, ATC, ATT

Leucina (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA,TTG

Lisina (Lys, K) AAA, AAG

Metionina (Met, M) ATG

Fenilalanina (Phe, F) TTC, TTT

Prolina (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT

Serina (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT

Treonina (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT

Triptófano (Trp, W) TGG

Tirosina (Tyr, Y) TAC, TAT

Valina (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT

Señal de terminación (fin) TAA, TAG, TGA

Una características importante y bien conocida del código genético es su redundancia, por la que, para la mayoría de los aminoácidos usados para construir proteínas, se puede emplear más de un triplete de nucleótidos codificador (ilustrado anteriormente). Por tanto, una serie de secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar para una secuencia de aminoácidos dada. Dichas secuencias de nucleótidos se consideran funcionalmente equivalentes, ya que dan como resultado la producción de las mismas secuencias de aminoácido en todos los organismos (aunque determinados organismos pueden traducir algunas secuencias más eficientemente que otras). Además, ocasionalmente, se puede encontrar una variante metilada de una purina o pirimidina en una secuencia de nucleótidos dada. Dichas metilaciones no afectan a la relación de codificación entre el codón trinucleótido y el correspondiente aminoácido.

Para ácidos nucleicos, el término “homología sustancial” indica que dos ácidos nucleicos, o las secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean de forma óptima y se comparan, son idénticos, con las inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80% de los nucleótidos, normalmente en al menos aproximadamente el 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% o más de los nucleótidos, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 97%, 98% o 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe una homología sustancial cuando los segmentos se hibriden, en condiciones de hibridación selectivas, con el complemento de la cadena.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es, % de identidad = n° de posiciones idénticas / n° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que deben ser introducidos para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden llevar a cabo usando un algoritmo matemático, tal como se describe más adelante en los ejemplos no limitativos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en internet en la página web de la compañía GCG), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que ha sido incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de pesos de residuo PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Adicionalmente, se puede determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), algoritmo que ha sido incorporado en el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en internet en la página web de la compañía GCG), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.

Las secuencias de ácido nucleico y proteína de la presente invención pueden usarse adicionalmente como “secuencia de consulta” para llevar a cabo una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Se pueden llevar a cabo búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Se pueden llevar a cabo búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BlAs T tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p.ej., XBLAST y NBLAST) (disponibles en internet en la página web de NCBl).

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisato celular, o en forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico es “aislado” o “se hace sustancialmente puro” cuando se purifica para separarlo de otros componentes celulares u otros contaminantes, p.ej., otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándar, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis de gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica (véase, F. Ausubel et al., ed. “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987)).

Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, aunque a menudo de una secuencia nativa (excepto por los sitios de restricción modificados, y similares), tanto de ADNc, genómico o mezclas de los mismos, pueden ser mutadas de acuerdo a técnicas estándar para proporcionar secuencias génicas. Para secuencias codificadoras, estas mutaciones pueden afectar a la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, se contemplan secuencias de ADN sustancialmente homólogas o derivadas de secuencias tales como V, D, J, constante, interruptores, nativas y otras secuencias descritas en la presente memoria (donde “derivada” indica que una secuencia es idéntica o modificada a partir de otra secuencia).

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo de unión dual” se refiere a un anticuerpo que presenta afinidad de unión por más de un polipéptido físicamente distinto que tiene secuencias de polipéptido distintas. Dichos anticuerpos de unión dual, por ejemplo, pueden reconocer y unirse a un epítopo común compartido por dos polipéptidos físicamente distintos que tienen secuencias de polipéptido distintas en regiones diferentes a las secuencias de epítopo ligadas. En una realización preferida, el anticuerpo de unión dual es un “anticuerpo anti-PD-L1/PD-L2”, también denominado en la presente memoria “anticuerpo anti-PD-L1 y anti-PD-L2”, “anticuerpo de unión dual anti-PD-L1/PD-L2”, y similares.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “región Fc” aquí se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Aunque las fronteras de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, normalmente se define la región Fc de cadena pesada de IgG humana para extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxi de la misma. Las regiones Fc de secuencia nativa adecuadas para uso en los anticuerpos de la invención incluyen IgG 1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4 humanas.

Tal como se usa en la presente memoria, una molécula está “fija” o “fijada” a un sustrato si está asociada de forma covalente o no covalente al sustrato, de tal modo que el sustrato puede ser lavado con un fluido (p.ej., salino de citrato estándar, pH 7,4) sin que una fracción sustancial de la molécula se disocie del sustrato.

Tal como se usa en la presente memoria, residuos “estructurales” o “FR” son aquellos residuos de dominio variable que no son los residuos HVR tal como se definen en la presente memoria.

Tal como se usa en la presente memoria, “receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, que incluyen las variantes alélicas y las formas divididas alternativamente de dichos receptores, los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activante”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos. El receptor activante FcyRIIA contiene una estructura de activación basada en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene una estructura de inhibición basada en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. (Véase, M. Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997). Los FcRs son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). El término “FcR” de la presente memoria abarca otros FcRs, incluyendo aquellos que se identifiquen en el futuro.

“Variantes conservativas de función” son aquellas en las que se ha cambiado un residuo de aminoácido dado de una proteína o enzima sin alterar la conformación y la función general del polipéptido, que incluye, aunque sin limitación, reemplazamiento de un aminoácido por otro que tiene propiedades similares (tal como, por ejemplo, polaridad, potencial de puentes de hidrógeno, ácido, básico, hidrofóbico, aromático, etc.). Aminoácidos no indicados como conservados pueden diferir en una proteína, de tal modo que puede variar el porcentaje de proteína o la similitud de secuencia de aminoácidos entre dos proteínas cualquiera de función similar y puede ser, por ejemplo, entre 70% y 99% según se determina a través de un esquema de alineamiento tal como el Método Cluster, donde la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Una “variante conservativa de función” también incluye un polipéptido que tiene al menos un 60% de identidad de aminoácidos determinada mediante algoritmos BLAST o FASTA, preferiblemente de al menos el 75%, más preferiblemente de al menos el 85%, aún más preferiblemente de al menos el 90% e incluso más preferiblemente de al menos el 95%, y que tiene las mismas propiedades, o sustancialmente similares, que la proteína nativa u original con la cual es comparada.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “patrón de glicosilación” se define como el patrón de unidades de carbohidrato que están unidas covalentemente a una proteína, más específicamente a una proteína de inmunoglobulina. Un patrón de glicosilación de un anticuerpo heterólogo puede caracterizarse por ser sustancialmente similar a los patrones de glicosilación que se dan de forma natural en anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando el especialista en la técnica reconocería el patrón de glicosilación del anticuerpo heterólogo como más similar a dicho patrón de glicosilación en la especie del animal transgénico no humano que a la especie de la cual se derivan los genes Ch del transgén.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo heterólogo” se define en relación al organismo transgénico no humano que produce dicho anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificadora que corresponde con la encontrada en un organismo que no consiste en el animal transgénico no humano, y generalmente de una especie diferente a la del animal transgénico no humano.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que consiste en la CDR de anticuerpos derivados de mamíferos no humanos, y la región FR y la región constante de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado es útil como componente efectivo en un agente terapéutico según la presente invención, ya que se reduce la antigenicidad del anticuerpo humanizado en el cuerpo humano.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “región hipervariable”, “HVR” o “HV”, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o que forman bucles definidos estructuralmente. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVRs; tres en VH (H1, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3). En anticuerpos nativos, H3 y L3 presentan la mayor diversidad de las seis HVRs, y se cree que H3 en particular desempeña una función única al conferir una especificidad fina a los anticuerpos. Véase, p.ej., Xu et al. (2000) Immunity 13, 37-45; Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248, 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). De hecho, los anticuerpos de camélidos naturales que consisten en una cadena pesada solo son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera (véase, p.ej., Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363: 446-448 (1993) y Sheriff et al. (1996) Nature Struct. Biol. 3, 733-736).

Tal como se usa en la presente memoria, el término “respuesta inmune” incluye respuestas inmunes mediadas por células T y/o células B que están influidas por la modulación de la coestimulación de células T. Los ejemplos de respuestas inmunes incluyen respuestas de célula T, p.ej., producción de citocinas, y citotoxicidad celular. Adicionalmente, el término respuesta inmune incluye respuestas inmunes que están afectadas directamente por la activación de células T, p.ej., producción de anticuerpos (respuestas humorales) y activación de células responsivas a citocinas, p.ej., macrófagos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “inhibir” incluye la disminución, limitación o bloqueo de, por ejemplo, una acción, función o interacción en particular. Tal como se usa en la presente memoria, el término “señal inhibidora” se refiere a una señal transmitida a través de un receptor inhibidor (p.ej., CTLA4, PD-1 o RGMb) para un polipéptido en una célula inmune. Dicha señal antagoniza una señal a través de un receptor activante (p.ej., a través de un polipéptido TCR o CD3) y puede dar como resultado, p.ej., la inhibición de la generación del segundo mensajero; una inhibición de la proliferación; una inhibición de la función efectora en la célula inmune, p.ej., una fagocitosis reducida, una producción de anticuerpos reducida, una citotoxicidad celular reducida, la incapacidad de la célula inmune para producir mediadores, (tal como citocinas (p.ej., IL-2) y/o mediadores de respuestas alérgicas); o el desarrollo de anergia.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “interacción”, en referencia a una interacción entre dos moléculas, se refiere al contacto físico (p.ej., la unión) de las moléculas entre sí. Generalmente, dicha interacción da como resultado una actividad (que produce un efecto biológico) de uno o de ambas de dichas moléculas. La actividad puede ser una actividad directa de una o de ambas moléculas (p.ej., transducción de señal). Alternativamente, se puede evitar que una o ambas moléculas de la interacción se unan a un ligando, y de este modo se mantengan inactivas con respecto a la actividad de unión a ligando (p.ej., uniéndose a su ligando y activando o inhibiendo la coestimulación). La inhibición de dicha interacción da como resultado la disrupción de la actividad de una o más moléculas implicadas en la interacción. Para potenciar dicha interacción supone prolongar o aumentar la probabilidad de dicho contacto físico, y prolongar o aumentar la probabilidad de dicha actividad.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo aislado” pretende indicar un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes (p.ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-L1 humano y/o PD-L2 humano y está sustancialmente libre de anticuerpo que no se unen a PD-L1 humano y/o a PD-L2 humano). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de PD-L1 humano y/o PD-L2 humano puede, no obstante, presentar reactividad cruzada con otras proteínas de PD-L1 y/o PD-L2 humanas, respectivamente, de especies diferentes. Sin embargo, en las realizaciones preferidas, el anticuerpo mantiene una mayor afinidad y selectividad por PD-L1 y/o PD-L2 humanos. Adicionalmente, un anticuerpo aislado típicamente está sustancialmente libre de otras materias celulares y/o productos químicos. En una realización de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales “aislados” que tienen diferentes especificidades por PD-L1 y/o PD-L2 humanos se combinan en una composición bien definida.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “isotipo” se refiere a una clase de anticuerpo (p.ej., IgM o IgG1) que está codificado por genes de región constante de cadena pesada.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “KD” pretende indicar la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. La afinidad de unión de anticuerpos de la invención descrita se puede medir o determinar mediante ensayos estándar de anticuerpo-antígeno, por ejemplo, ensayos competitivos, ensayos de saturación o inmunoensayos estándar tales como ELISA o RIA.

Tal como se usa en la presente memoria, un “kit” es cualquier fabricación (p.ej., un paquete o recipiente) que comprende al menos un reactivo, p.ej., una sonda, para detectar específicamente o modular la expresión de un marcador de la invención. El kit puede ser promovido, distribuido o vendido como una unidad para llevar a cabo los métodos de la presente invención.

Tal como se usa en la presente invención, el término “modular” incluye la regulación al alza y la regulación a la baja, p.ej., potenciar o inhibir una respuesta o actividad biológica.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que presenta una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. Por consiguiente, el término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo que presenta una única especificidad de unión y que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal o de línea no germinal. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, p.ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y una transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “natural” tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o de polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus), que puede ser aislada de una fuente natural y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en un laboratorio, es natural.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “molécula de ácido nucleico” pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, pero preferiblemente es ADN de cadena doble. Tal como se usa en la presente memoria, el término “molécula de ácido nucleico aislada” en referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpo (p.ej., Vh, Vl, CDR3) que se une a PD-L1 y/o PD-L2, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótido que codifican el anticuerpo o porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótido que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpo que se unen a antígenos diferentes a PD-L1 y/o PD-L2, otras secuencias que pueden flanquear de forma natural el ácido nucleico en ADN genómico humano.

Un ácido nucleico está “ligado operativamente” cuando se ubica en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia. Con respecto a secuencias reguladoras de la transcripción, ligado operativamente significa que las secuencias de ADN que están siendo ligadas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificadoras de proteína, contiguas y en marco de lectura. Para las secuencias de interruptor, ligado operativamente indica que las secuencias son capaces de efectuar recombinación de interruptor.

Una “sobre-expresión” o un “nivel significativamente mayor de expresión” de un marcador se refiere a un nivel de expresión en una muestra de ensayo que es mayor que el error estándar del ensayo empleado para determinar la expresión, y preferiblemente es al menos dos veces, y más preferiblemente 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veces o más superior a la actividad o nivel de expresión del marcador en una muestra de control (p.ej., la muestra de un sujeto sano que no tiene la enfermedad asociada al marcador) y preferiblemente, el nivel de expresión medio del marcador en varias muestras de control. Un “nivel significativamente menor de expresión” de un marcador se refiere a un nivel de expresión en una muestra de ensayo que es al menos dos veces, y más preferiblemente 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veces o más inferior al nivel de expresión en una muestra de control (p.ej., la muestra de un sujeto sano que no tiene la enfermedad asociada al marcador) y preferiblemente, el nivel de expresión medio del marcador en varias muestras de control.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “paciente” incluye un sujeto humano que se ha presentado en una instalación clínica con un síntoma o síntomas particulares que sugieren uno o más diagnósticos. Un paciente puede estar en necesidad de una categorización adicional mediante procedimientos clínicos bien conocidos por los facultativos médicos (o puede no tener indicios de enfermedad adicionales y parecer normal en cualquiera o todos los respectos). El diagnóstico de un paciente puede alterarse durante la progresión del curso de la enfermedad, tal como por el desarrollo de síntomas adicionales de la enfermedad, o por la remisión de la enfermedad, tanto espontáneamente como durante el curso de un régimen terapéutico o de tratamiento. El término “diagnóstico” no excluye diferentes diagnósticos previos o posteriores para cualquier paciente o sujeto particular. El término “prognosis” se refiere a la determinación para un sujeto o paciente de una probabilidad de desarrollar una afección asociada, o indicada de cualquier otro modo, a la presencia de una o más enzimas en una muestra biológica.

El término “PD-1” se refiere a un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina que actúa como receptor co-inhibidor que tiene PD-L1 y PD-L2 como ligandos conocidos. PD-1 ha sido identificado previamente usando una estrategia basada de clonación por sustracción para seleccionar en términos de proteínas implicadas en la muerte celular apoptótica. PD-1 es un miembro de la familia CD28/CTLA-4 de moléculas en base a su capacidad para unirse a PD-L1. Como CTLA4, PD-1 es inducida rápidamente en la superficie de células T en respuesta a anti-CD3 (Agata et al. 25 (1996) Int. Immunol. 8: 765). Sin embargo, al contrario que CTLA4, PD-1 también es inducida en la superficie de células B (en respuesta a anti-IgM). PD-1 también es expresada en un subconjunto de timocitos y células mieloides (Agata et al. (1996) ver anterior; Nishimura et al. (1996) Int. Immunol. 8: 773).

Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de un biomarcador de PD-1 humana representativo se encuentran disponibles al público en la base de datos GenBank como NM_005018.2 y NP_005009.2 y se muestran en la Tabla 1 (véase también Ishida et al. (1992) 20 EMBO J 11: 3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23: 704; Patente de EE.UU.

5.698.520). PD-1 tiene una región extracelular que contiene dominio de superfamilia de inmunoglobulina, un dominio transmembrana, y una región intracelular que incluye una estructura inhibidora basada en tirosina inmunorreceptor (ITIM) (Ishida et al. (1992) 20 EMBO J. 11: 3887; Shinohara et al. (1994) Genomics 23: 704; Patente de EE.UU.

5.698.520). Estas características también definen una familia más grande de polipéptidos, denominados receptores inmunoinhibidores, lo que también incluye gp49B, PIR-B, y los receptores inhibidores asesinos (KIRs) (Vivier y Daeron (1997) Immunol. Today 18: 286). A menudo se asume que la estructura ITM tirosil fosforilada de dichos receptores interacciona con fosfatasas que contienen dominio SH2, lo que conduce a señales inhibidoras. Un subconjunto de dichos receptores inmunoinhibidores se une a polipéptidos de MHC, por ejemplo los KIRs, y CTLA4 se une a B7-1 y B7-2. Se ha propuesto que existe una relación filogenética entre el MHC y los genes B7 (Henry et al. (1999) Immunol. Today 20(6): 285-8). Las secuencias de ácido nucleico y de polipéptido de ortólogos de PD-1 en organismos no humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, PD-1 de ratón (NM_008798.2 y NP_032824.1), PD-1 de rata (NM_001106927.1 y NP_001100397.1), PD-1 de perro (XM_543338.3 y XP_543338.3), PD-1 de vaca (NM_001083506.1 y NP_001076975.1) y PD-1 de pollo (XM_422723.3 y XP_422723.2).

Los polipéptidos de PD-1 son receptores inhibidores capaces de transmitir una señal inhibidora a una célula inmune para limitar de ese modo la función efectora de célula inmune, o son capaces de promover la coestimulación (p.ej., mediante inhibición competitiva) de células inmunes, p.ej., cuando están presentes en forma soluble monomérica. Los miembros de la familia PD-1 preferidos comparten identidad de secuencia con PD-1 y se unen a uno o más miembros de la familia B7, p.ej., B7-1, B7-2, ligando de PD-1 y/u otros polipéptidos o células presentadoras de antígeno.

El término “actividad de PD-1 ” incluye la capacidad de un polipéptido de PD-1 de modular una señal inhibidora en una célula inmune activada, p.ej., involucrando un ligando de PD-1 natural en una célula presentadora de antígeno. PD-1 transmite una señal inhibidora a una célula inmune de un modo similar a CTLA4. La modulación de una señal inhibidora en una célula inmune da como resultado la modulación de la proliferación, y/o la secreción de citocinas, de una célula inmune. Por tanto, el término “actividad de PD-1” incluye la capacidad de un polipéptido de PD-1 para unirse a su ligando(s) natural(es), la capacidad para modular señales coestimuladoras o inhibidoras de célula inmune, y la capacidad para modular la respuesta inmune.

El término “ligando de PD-1” se refiere a parejas de unión del receptor de PD-1 e incluye tanto PD-L1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192: 1027) como PD-L2 (Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2: 261). Existen al menos dos tipos de polipéptidos de ligando de PD-1 humana. Las proteínas de ligando de PD-1 comprenden una secuencia señal, y un dominio de IgV, un dominio de IgC, un dominio transmembrana, y una cola citoplasmática corta. Tanto PD-L1 (ver Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192: 1027 para los datos de secuencia) como PD-L2 (ver Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2: 261 para los datos de secuencia) son miembros de la familia B7 de polipéptidos. Ambos, PD-L1 y PD-L2, se expresan en la placenta, el bazo, los nodos linfáticos, el timo y el corazón. Solo el PD-L2 se expresa en el páncreas, el pulmón y el hígado, mientras que solo el PD-L1 se expresa en el hígado fetal. Ambos ligandos de PD-1 están regulados al alza en monocitos activados y en células dendríticas.

Los ligandos de PD-1 comprenden una familia de polipéptidos que tienen unas ciertas características estructurales y funcionales conservadas. El término “familia” cuando se usa para referirse a proteínas o a moléculas de ácido nucleico, pretende indicar dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio estructural o estructura común y que tienen una homología de secuencia de aminoácidos o de nucleótidos suficiente, tal como se describe en la presente memoria. Dichos miembros de familia pueden ser naturales o no naturales, y pueden proceder de la misma o de distinta especie. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano, y otras proteínas distintas de origen humano, o alternativamente puede contener homólogos de origen no humano. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes. Los ligandos de PD-1 son miembros de la familia B7 de polipéptidos. El término “familia B7” o “polipéptidos B7” tal como se usa en la presente memoria incluye polipéptidos coestimuladores que comparten homología de secuencia con polipéptidos B7, p.ej., con B7-1, B7-2, B7h (Swallow et al. (1999) Immunity 11: 423), y/o ligandos de PD-1 (p.ej., PD-L1 o PD-L2). Por ejemplo, B7-1 y B7-2 humanas comparten aproximadamente un 26% de identidad de secuencia de aminoácidos cuando se comparan usando el programa BLAST de NCBI con los parámetros por defecto (matriz Blosum62 con penalizaciones de hueco fijadas en existencia 11 y extensión 1 (ver la página web de NCBI). El término familia B7 también incluye variantes de dichos polipéptidos que son capaces de modular la función celular inmune. La familia B7 de moléculas comparte una serie de regiones conservadas, que incluyen dominios de señal, dominios de IgV y los dominios de IgC. Los dominios de IgV y los dominios de IgC son reconocidos en la técnica como dominios miembros de la superfamilia de Ig. Estos dominios corresponden a unidades estructurales que tienen diferentes patrones de plegamiento denominados pliegues de Ig. Los pliegues de Ig están compuestos por un sándwich de dos láminas p, cada una consistente en cadenas p anti-paralelas de 5-10 aminoácidos con un puente de disulfuro conservado entre las dos láminas en la mayoría, aunque no en todos, de los dominios de IgC de Ig, TCR y moléculas de MHC comparten los mismos tipos de patrones de secuencia y se denominan conjunto C1 dentro de la superfamilia de Ig. Otros dominios de IgC entra dentro de otros conjuntos. Los dominios de IgV también comparten patrones de secuencia y se denominan dominios de conjunto V. Los dominios de IgV son más largos que los dominios de IgC y contienen un par adicional de cadenas p.

Los polipéptidos B7 preferidos son capaces de proporcionar señales coestimuladoras o inhibidoras a células inmunes, para de este modo promover o inhibir las respuestas de las células inmunes. Por ejemplo, los miembros de la familia B7 que se unen a receptores coestimuladores aumentan la activación y la proliferación de células T, mientras que los miembros de la familia B7 que se unen a receptores inhibidores reducen la coestimulación. Además, el mismo miembro de la familia B7 puede aumentar o reducir la coestimulación de células T dependiendo del receptor con el que está interaccionando. Por ejemplo, cuando está unido a un receptor coestimulador, el ligando de PD-1 puede inducir la coestimulación de células inmunes o puede inhibir la coestimulación de células inmunes, p.ej., cuando está presente en forma soluble. Cuando está unido a un receptor inhibidor, los polipéptidos de ligando de PD-1 pueden transmitir una señal inhibidora a una célula inmune. Los miembros de la familia B7 preferidos incluyen B7-1, B7-2, B7h, PD-L1 0 PD-L2 y los fragmentos o derivados solubles de los mismos. En una realización, los miembros de la familia B7 se unen a uno o más receptores en una célula inmune, p.ej., CTLA4, CD28, ICOS, PD-1 y/u otros receptores, y, dependiendo del receptor, tienen la capacidad de transmitir una señal inhibidora o una señal coestimuladora a una célula inmune, preferiblemente una célula T.

En algunas realizaciones, se prefieren los miembros B7-1 y/o B7-2 de la familia B7. Las proteínas B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) son moléculas coestimuladoras críticas (Freeman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 625; Freeman et al. (1989) J. Immunol. 143: 2714; Azuma et al. (1993) Nature 366: 76; Freeman et al. (1993) Science 262: 909). B7-2 desempeña un papel predominante durante las respuestas inmunes primarias, mientras que B7-1, que es regulado al alza posteriormente durante una respuesta inmune, puede ser importante para prolongar las respuestas de células T primarias o para coestimular las respuestas de células T secundarias (Bluestone (1995) Immunity 2: 555). PD-L1 se une a ambos, PD-1 y B7-1. Tanto la unión de B7-1 expresado en células T por parte de PD-L1 como la unión de PD-L1 expresado en células T por parte de B7-1 dan como resultado la inhibición de las células T (Butte et al. (2007) Immunity 27: 111). Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de los biomarcadores de B7-1 humano representativos se encuentran disponibles al público en la base de datos de GenBank con los códigos NM_005191.3 y NP_005182.1 (mostradas en la Tabla 1 como SEQ ID NOs: 11 y 12). Adicionalmente, las secuencias de ácido nucleico y de polipéptido de los ortólogos de B7-1 en organismos no humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, B7-1 de chimpancé (XM_001163234.2 y XP_001163234.1), B7-1 de perro (NM_001003147.1 y NP_001003147.1), B7-1 de vaca (NM_001206439.1 y NP_001193368.1), B7-1 de ratón (NM_009855.2 y NP_033985.3) y B7-1 de rata (NM_012926.1 y NP_037058.1).

La modulación de una señal coestimuladora da como resultado la modulación de la función efectora de una célula inmune. Por tanto, el término “actividad de ligando de PD-1 ” incluye la capacidad de un polipéptido de ligando de PD-1 para unirse a su(s) receptor(es) natural(es) (p.ej., PD-1 o B7-1), la capacidad para modular señales coestimuladoras 0 inhibidoras de células inmunes, y la capacidad para modular la respuesta inmune.

El término “PD-L1 ” se refiere a un ligando de PD-1 específico. Se han identificado dos formas de moléculas de PD-L1 humanas. Una forma es un polipéptido soluble natural de PD-L1, es decir, que tiene un dominio hidrofílico corto en el extremo COOH y no tiene dominio transmembrana, y se denomina en la presente memoria PD-L1S (mostrada en la Tabla 1 como s Eq ID NO: 4). La segunda forma es un polipéptido asociado a célula, es decir, que tiene un dominio de transmembrana y un dominio citoplasmático, que se denomina en la presente memoria PD-L1M (mostrada en la SEQ ID NO: 6). Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de biomarcadores de PD-L1 humanos representativos en relación a PD-L1M también se encuentran disponibles al público en la base de datos de GenBank con los códigos NM_014143.3 y NP_054862.1. Las proteínas PD-L1 comprenden una secuencia señal, y un dominio de IgV y un dominio de IgC. La secuencia señal de la SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. La secuencia señal de la SEQ ID NO: 6 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18. El dominio de IgV de la SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134 y el dominio de IgV de la SEQ ID NO: 6 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 19 hasta aproximadamente el aminoácido 134. El dominio de IgC de la SEQ ID NO: 4 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227 y el dominio de IgC de la SEQ ID NO: 6 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227 y el dominio de IgC de la SEQ ID NO: 6 se muestra desde aproximadamente el aminoácido 135 hasta aproximadamente el aminoácido 227. La cola hidrofílica del PD-L1 ejemplificada en la SEQ ID NO: 4 comprende una cola hidrofílica mostrada desde aproximadamente el aminoácido 228 hasta aproximadamente el aminoácido 245. El polipéptido de PD-L1 ejemplificado en la SEQ ID NO: 6 comprende un dominio transmembrana mostrado desde aproximadamente los aminoácidos 239 hasta aproximadamente el aminoácido 259 de la SEQ ID NO: 6 y un dominio citoplasmático mostrado de aproximadamente 30 aminoácidos desde el 260 hasta aproximadamente el aminoácido 290 de la SEQ ID NO: 6. Adicionalmente, las secuencias de ácido nucleico y de polipéptido de ortólogos de PD-L1 en organismo no humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo PD-L1 de ratón (NM_021893.3 y NP_068693.1), PD-L1 de rata (NM_001191954.1 y NP_001178883.1), PD-L1 de perro (XM_541302.3 y XP_541302.3), PD-L1 de vaca (NM_001163412.1 y NP_001156884.1), y PD-L1 de pollo (XM_424811.3 y XP_424811.3).

El término “PD-L2” se refiere a otro ligando de PD-1 específico. PD-L2 es un miembro de la familia B7 expresado en varias APCs, que incluyen células dendríticas, macrófagos y mastocitos derivados de médula ósea (Zhong et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37: 2405). El PD-L2 expresado en APC es capaz de inhibir la activación de células T a través de la ligación de PD-1 y de coestimular la activación de células T a través de un mecanismo independiente de PD-1 (Shin et al. (2005) J. Exp. Med. 201: 1531). Adicionalmente, la ligación de PD-L2 expresado en células dendríticas da como resultado un aumento de la expresión de citocinas de la célula dendrítica y de la supervivencia (Radhakrishnan et al. (2003) J. Immunol. 37: 1827; Nguyen et al. (2002) J. Exp. Med. 196: 1393). Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de biomarcadores de PD-L2 humanos representativos (p.ej., las SEQ ID NOs: 7 y 8) son bien conocidas en la técnica y también se encuentran disponibles al público en la base de datos de GenBank bajo los códigos NM_025239.3 y NP_079515.2. Las proteínas de PD-L2 se caracterizan por elementos estructurales comunes. En algunas realizaciones, las proteínas de PD-L2 incluyen al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio transmembrana, un dominio de IgV, un dominio de IgC, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. Por ejemplo, los aminoácidos 1-19 de la SEQ ID NO: 8 comprenden una secuencia señal. Tal como se usa en la presente memoria, una “secuencia señal” o un “péptido señal” sirven para dirigir un polipéptido que contiene dicha secuencia a una bicapa lipídica, y es escindido en polipéptidos secretados y ligados a membrana, e incluye un péptido que contiene aproximadamente 15 o más aminoácidos que se encuentra en el extremo N de polipéptidos secretores y ligados a membrana, y que contiene un gran número de residuos de aminoácido hidrofóbicos. Por ejemplo, una secuencia señal contiene al menos aproximadamente 10-30 residuos de aminoácido, preferiblemente aproximadamente 15-25 residuos de aminoácido, más preferiblemente aproximadamente 18-20 residuos de aminoácido, e incluso más preferiblemente aproximadamente 19 residuos de aminoácido, y tiene al menos aproximadamente un 35-65%, preferiblemente aproximadamente un 38-50%, y de forma más preferible aproximadamente 40-45% de residuos de aminoácido hidrofóbicos (p.ej., valina, leucina, isoleucina o fenilalanina). En otra realización, los residuos de aminoácido 220-243 del polipéptido PD-L2 humano y los residuos de aminoácido 201-243 del polipéptido maduro comprenden un dominio transmembrana. Tal como se usa en la presente memoria, el término “dominio transmembrana” incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 15 residuos de aminoácido de longitud que abarca la membrana plasmática. Más preferiblemente, un dominio transmembrana incluye aproximadamente al menos 20, 25, 30, 35, 40 o 45 residuos de aminoácido y abarca la membrana plasmática. Los dominios transmembrana son ricos en residuos hidrofóbicos, y típicamente presentan una estructura de hélice alfa. En una realización preferida, al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembrana son hidrofóbicos, p.ej., leucinas, isoleucinas, tirosinas o triptófanos. Los dominios transmembrana se describen, por ejemplo, en Zagotta, W. N. et al. (1996) Annu. Rev. Neurosci. 19: 235-263. En otra realización adicional, los residuos de aminoácido 20-120 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácido 1-101 del polipéptido maduro comprenden un dominio de IgV. Los residuos de aminoácido 121-219 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácido 102-200 del polipéptido maduro comprenden un dominio de IgC. Tal como se usa en la presente memoria, los dominios de IgV e IgC son reconocidos en la técnica como dominios miembros de la superfamilia Ig. Estos dominios corresponden a unidades estructurales que presentan patrones de plegamiento distintos denominados pliegues de Ig. Los pliegues de Ig consisten en un sándwich de dos láminas p, que consisten cada una en 3 cadenas antiparalelas de 5-10 aminoácidos con un puente de disulfuro conservado entre las dos láminas en la mayoría de los dominios, aunque no en todos. Los dominios de IgC de moléculas de Ig, TCR y MHC comparten los mismos tipos de patrones de secuencia y se denominan conjunto C1 dentro de la superfamilia de Ig. Otros dominios de IgC entran dentro de otros conjuntos. Los dominios de IgV también comparten patrones de secuencia y se denominan dominios de conjunto V. Los dominios de IgV son más largos que los dominios C y forman un par adicional de cadenas. En otra realización adicional, los residuos de aminoácido 1 -219 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácido 1 -200 del polipéptido maduro comprenden un dominio extracelular. Tal como se usan en la presente memoria, el término “dominio extracelular” representa los aminoácidos N-terminales que se extienden como una cola desde la superficie de una célula. Un dominio extracelular de la presente invención incluye un dominio de IgV y un dominio de IgC, y puede incluir un dominio de péptido señal. En otra realización adicional, los residuos de aminoácido 244-273 del polipéptido PD-L2 humano nativo y los residuos de aminoácido 225-273 del polipéptido maduro comprenden un dominio citoplasmático. Tal como se usa en la presente memoria, el término “dominio citoplasmático” representa los aminoácidos C-terminales que se extienden como una cola en el citoplasma de una célula. Adicionalmente, las secuencias de ácido nucleico y de polipéptido de ortólogos de PD-L2 en organismos no humano son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, PD-L2 de ratón (NM_021396.2 y NP_067371.1), PD-L2 de rata (NM_001107582.2 y NP_001101052.2), PD-L2 de perro (XM_847012.2 y XP_852105.2), PD-L2 de vaca (XM_586846.5 y XP_586846.3) PD-L2 de chimpancé (XM_001140776.2 y XP_001140776.1).

El término “actividad de PD-L2”, “actividad biológica de PD-L2” o “actividad funcional de PD-L2”, se refiere a una actividad ejercida por una proteína, polipéptido o molécula de ácido nucleico de PD-L2 sobre una célula o tejido que responde a PD-L2, o sobre una pareja de unión de polipéptido de PD-L2, según se determina in vivo, o in vitro, de acuerdo a técnicas estándar. En una realización, una actividad de PD-L2 es una actividad directa, tal como una asociación con una pareja de unión a PD-L2. Tal como se usa en la presente memoria, una “molécula diana” o “pareja de unión” es una molécula con la que se une un polipéptido de PD-L2 o interactúa en la naturaleza, de tal modo que se obtiene una función mediada por PD-L2. En un ejemplo de realización, una molécula diana de PD-L2 es el receptor RGMb. Alternativamente, una actividad de PD-L2 es una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por la interacción del polipéptido de PD-L2 con su pareja de unión natural, p.ej., RGMb. Las actividades biológicas de PD-L2 se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los polipéptidos de PD-L2 de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes actividades: 1) unirse y/o modular la actividad del receptor RGMb, PD-1 u otras parejas de unión naturales de PD-L2, 2) modular la señalización intra- o inter-celular, 3) modular la activación de células inmunes, p.ej., linfocitos T, y 4) modular la respuesta inmune de un organismo, p.ej., un organismo de ratón o humano.

El término “subtipos de células sanguíneas periféricas” se refiere a los tipos de células encontrados normalmente en la sangre periférica, que incluyen, aunque sin limitación, eosinófilos, neutrófilos, células T, monocitos, células NK, granulocitos y células B.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “reorganizada” se refiere a una configuración de una localización de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera donde se posiciona un segmento V inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio Vh y Vl completo, respectivamente. Una localización de gen de inmunoglobulina reorganizada puede identificarse por comparación con ADN de línea germinal; una localización reorganizada tendrá al menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “célula hospedante recombinante” (o simplemente “célula hospedante”), pretende indicar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debería entenderse que dicho término pretende referirse no solo a la célula sujeto en cuestión sino también a la progenie de dicha célula. Dado que se pueden producir determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a una mutación o a influencias ambientales, dicha progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula original, pero aun así se incluye dentro del alcance del término “célula hospedante” tal como se usa en la presente memoria.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “anticuerpo humano recombinante” incluye todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante técnicas recombinantes, tal como (a) anticuerpos aislados de un animal (p.ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos (descrito más detalladamente más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula hospedante transformada para expresar el anticuerpo, p.ej., a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante combinatoria, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante otros medios que implican la división de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana de línea germinal y/o de línea no germinal. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de las secuencias VH y VL de línea germinal humana y están relacionadas con ellas, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo.

El término “RGMb” se refiere a un miembro anclado a glicosilfosfatidilinositol (GPI) de la familia de moléculas guía de repulsión. Samad et al. en JBC Papers 2005, Vol. 280, 14122-14129, describen la interacción entre RGMb y los receptores de Tipo I y Tipo II de la proteína morfogenética ósea (BMP). Sin embargo, la interacción entre RGMb y PD-L2 no era conocida previamente. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de biomarcadores de RGMb humana representativas (p.ej., SEQ ID NOs: 9 y 10) son bien conocidas en la técnica y se encuentran también disponibles al público en la base de datos de GenBank bajo los códigos NM_025239.3 y NP_079515.2. Las proteínas RGMb se caracterizan por elementos estructurales comunes. En algunas realizaciones, las proteínas RGMb comprenden dominios conservados con homología a notch-3, fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinasa tipo II beta, proteína-2 de unión a factor de crecimiento de tipo insulina, trombospondina, precursor de receptor 3 de tipo-B de efrina, y Slit-2, todas las cuales se sabe que influyen en la guía axonal, el sobrecrecimiento de neuritas y en otras funciones del desarrollo neuronal. El extremo C de RGMb también contiene un dominio hidrofóbico indicativo de un ancla de GPI extracelular de 21 aminoácidos. Adicionalmente, las secuencias de ácido nucleico y de polipéptido de los ortólogos de RGMb en organismos no humanos son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, RGMb de ratón (NM_178615.3 y NP_848730.2), RGMb de chimpancé (XM_517848.3 y XP_517848.2), RGMb de vaca (XM_002689413.1 y XP_002689459.1), RGMb de pollo (XM_42860.3 y XP_424860.3) y RGMb de pez cebra (NM_001001727.1 y NP_001001727.1).

El término “muestra” usado para detectar o determinar la presencia o el nivel de al menos un biomarcador es típicamente sangre entera, plasma, suero, saliva, orina, excrementos (p.ej., heces), lágrimas, y cualquier otro fluido corporal (p.ej., como se ha descrito anteriormente para “fluidos corporales”), o una muestra de tejido (p.ej., biopsia) tal como un tejido de intestino delgado, una muestra de colon, o un tejido de resección quirúrgica. En determinados casos, el método de la presente invención comprende además la obtención de la muestra a partir del individuo antes de detectar o determinar la presencia o el nivel de al menos un marcador en la muestra.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “unión específica” se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad (Kd) de aproximadamente menos de 10 7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor, cuando se determina mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento de ensayo BIACORE® usando PD-L1 y/o PD-L2 humanos como analito y el anticuerpo como ligando, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 o 10,0 veces o más superior a su afinidad de unión a un antígeno no específico (p.ej., BSA, caseína) diferente al antígeno predeterminado o a un antígeno estrechamente relacionado. Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico por un antígeno” se usan en la presente memoria de forma intercambiable con el término “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “sujeto” incluye cualquier animal o humano vivo que necesite un diagnóstico o una prognosis para una afección, o que sea susceptible a ella, en particular una afección mediada por PD-L1 y/o PD-L2, tal como se describe más adelante. El término “animal no humano” incluye todos los vertebrados, p.ej., mamíferos y no mamíferos, tal como primates no humanos, oveja, perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, etc. Un sujeto o animal no humano es tratado si se obtienen uno o más resultados beneficiosos o deseados, que incluyen resultados clínicos deseables. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: disminuir uno o más síntomas resultado de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de los que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, y/o prolongar la supervivencia de los individuos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “no reorganizado” o “configuración de línea germinal” en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en la que el segmento V no ha sido recombinado para estar inmediatamente adyacente a un segmento D o J.

Tal como se usa en la presente memoria, el término “vector” pretende indicar una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN de cadena doble circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la que son introducidos (p.ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (p.ej., vectores no episomales de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedante mediante su introducción en la célula hospedante, y de este modo son replicados junto con el genoma del hospedante. Adicionalmente, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria “vectores de expresión recombinante” (o simplemente, “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinantes a menudo se encuentran en la forma de plásmidos. En la presente especificación, “plásmido” y “vector” pueden usarse de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector usada más habitualmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (p.ej., retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que proporcionan funciones equivalentes.

En vista de lo anterior, la secuencia de nucleótidos de un ADN o ARN que codifica para una proteína o polipéptido de fusión de la invención (o cualquier porción de la misma) se puede usar para derivar la secuencia de aminoácidos de la proteína o polipéptido de fusión, usando el código genético para traducir el ADN o ARN en una secuencia de aminoácidos. Del mismo modo, para una secuencia de aminoácidos de proteína o polipéptido de fusión, las correspondientes secuencias de nucleótidos que pueden codificar la proteína o polipéptido de fusión se pueden deducir a partir del código genético (que, debido a su redundancia, producirá múltiples secuencias de ácido nucleico para cualquier secuencia de aminoácidos dada). Por tanto, la descripción de la presente memoria de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o polipéptido de fusión también debería considerarse que incluye la descripción de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos. De forma similar, la descripción de una secuencia de aminoácidos de proteína o polipéptido de fusión en la presente memoria debería considerarse que también incluye la descripción de todas las posibles secuencias de nucleótido que pueden codificar la secuencia de aminoácidos.

Finalmente, la información de secuencia de ácido nucleico y aminoácidos correspondiente a las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos útiles en la presente invención es bien conocida en la técnica y se encuentra fácilmente accesible en bases de datos disponible públicamente, tal como “National Center for Biotechnology Information” (NCBI).

Por ejemplo, los ejemplos de secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos derivadas de bases de datos disponibles públicamente se proporcionan a continuación en la Tabla 1. La Tabla 1 también presenta las secuencias de CDR asociadas y de región variable de anticuerpos referidos en la presente memoria.

Tabla 1

SEQ ID NO: 1 Secuencia de ADNc de PD-1 humana

cactctggtg gggctgctcc aggc atg cag ate cea cag gcg ccc tgg cea 51 Met Gln lie Pro Gln Ala Pro Trp Pro

1 5

gtc gtc tgg jeg gtg cta caa ctg ggc tgg cgg cea gga tgg ttc tta 99 Val Val Trp vía Val Leu Gln Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu

10 15 20 25 gac tcc cea jac agg ccc tgg aac ccc ccc acc ttc tcc cea gee ctg 147 Asp Ser Pro Vsp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

30 35 40

etc gtg gtg ice gaa ggg gac aac gee acc ttc acc tgc age ttc tcc 195 Leu Val Val ’hr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser-

45 50 55

aac aca teg jag age ttc gtg cta aac tgg tac cgc atg age ccc age 243 Asn Thr Ser ;iu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

ttc cae atg age gtg gtc agg gee

cgc aat gac age ggc acc tac 387 Phe His Met Ser Val Val Arg Ala

Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

110 U S 120

etc tgt ggg gee ate tcc ctg gee c aag gcg cag ate ^3. 3. el gag age 435 Leu Cys Gly Ala lie Ser Leu Ala P Lys Ala Gln lie Lys Glu Ser

125 130 135

ctg cgg gea gag etc agg gtg aca gag aga agg gea gaa gtg ccc aca 483 Leu A.rg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

140 14 5 150

gcc cae ccc age ccc tea ccc agg tea gcc ggc cag ttc caa acc ctg 531 Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Ser Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu

155 160 165

gtg gtt ggt gtc gtg ggc ggc ctg ctg ggc age ctg gtg ctg cta gtc 57 9 Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val

17 0 175 180 185

tgg gtc ctg gcc gtc ate tgc tcc cgg gcc gea cga ggg aca ata gga 627 Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr lie Gly

190 195 200

gcc agg cgc acc ggc cag ccc ctg aag gag gac ccc tea gcc gtg cct 675 Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro

205 210 215

gtg ttc tet gtg gac tat ggg gag ctg gat ttc cag tgg cga gag aag 723 Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys

220 225 230

acc ccg gag ccc ccc gtg ccc tgt gtc cct gag cag acg gag tat gcc 771 Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala

235 24 0 245

acc até gtc ttt cct age gga atg ggc acc tea tcc ccc gcc cgc agg 819 Thr lie Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg

250 255 260 265

ggc tea gct gac ggc cct cgg agt gcc cag cea ctg agg cct gag gat 867 Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp

270 275 280

gga cae tgc tet tgg ccc etc tgaccggctt ccttggccac cagtgttctg caí 921 Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

285

SEQ ID NO: 2 Secuencia de am inoácidos de PD-1 hum ana

Met Gln lie Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro G1 y Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 4 0 4 5

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg As p Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg As ri Asp Ser G1 y Thr Tyr Leu Cys Gly Al a lie Ser Leu 115 12 0 12 5

Ala Pro Lys Ala Gln lie Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 14 0

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Ser- Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly va 1 Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val lie Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Giv Thr lie Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Th r Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr lie Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser T rp Pro Leu 275 280 285

SEQ ID NO: 3 Secuencia de ácido de ADNc de PD-L1S humano

gcttcccgag <gctccgcacc agccgcgctt ctgtccgcct gcagggcatt ■ccagaaag 58 atg agg ata ttt gct gtc ttt ata ttc atg acc tac tgg cat ttg ctg 106 Met Arg lie Phe Ala Val Phe lie Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15

aac gca ttt act gtc acg gtt ccc aag gac cta tat gtg gta gag tat 154 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lvs Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

gg^ age aat atg aca att gaa tgc aaa ttc cea gta gaa aaa caa tta 202 Gly Ser Asn Met Thr lie Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45

gac ctg gct gca cta att gtc tat tgg gaa atg gag gat aag aac att 250 Asp Leu Ala Ala Leu lie Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn lie 50 55 60

att caa ttt gtg cat gga gag gaa gac ctg aag gtt cag cat agt age 298 lie Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His ser Ser 65 7 0 75 8 0 tac aga cag agg gee cgg ctg ttg aag gac cag etc tcc ctg gga aat 3 4 6 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

82 90 95

gct gca ctt cag ate aca gat gtg aaa ttg cag gat gca ggg gtg tac 394 Ala Ala Leu Gln lie Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Al a Gly Val Tyr

100 105 110

cgc tgc atg ate age tat ggt ggt gee gac tac aag cga att act gtg 442 Arg Cys Met lie Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg lie Thr Val 115 120 125

aaa gtc aat g a c cea tac aac aaa ate aac caa aga att ttg gtt gtg 4 90 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys lie Asn Gln Arg lie Leu Val Val 130 135 14 0

gat cea gtc acc tet gaa cat gaa ctg aca tgt cag gct gag ggc tac 538 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 ccc aag gee gaa gtc ate tgg aca age agt gac cat caa gtc ctg agt 5 86 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 io 0 175

ggt aag acc acc acc acc aat tcc aaq aga gag gag aag ctt ttc aat 6 34 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe A.sn ieo 185 190 gtg acc age aca ctg aga ate aac aca aca act aat gag att ttc tac 682 Val Thr Ser Thr Leu Arg lie Asn Thr Thr Thr Asn Glu lie Phe Tyr 195 200 205

Lqc act ttt agg aga tta gat cc L gag gaa aac cat aca gct gaa ttg 730 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr A1a Glu Leu 210 215 22 0

gtc ate cea ggt aat att ctg aa L gtg tcc att aaa ata tgt cta aca 778 Val lie Pro Gly Asn lie Leu Asn Val Ser L e Lys lie Cys Leu Thr 225 230 235 240 ctg tcc cct age acc tagcatgatg tctg cctat c atagtca11 c agtga11g11 8 33 Leu Ser Pro Ser Thr

245

gaataaatga atgaatgaat aacactatgt ttacaaaata tatcctaatt cct.cacct.cG 893 attcatccaa accatattgt tacttaataa acattcagca gatatttatg gaataaaaaa 953 a a a a a a a a a a a a a a a 968

SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos de PD-L1S humano

Met Arg lie Phe Ala Val Phe lie Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15

Asn A.la Phe Thr Val Thr Val Pro Lys As p Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr lie Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Glu Leu 35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu H e Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn lie 50 55 60

lie Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 7 0 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

35 90 95

Ala Ala Leu Gln lie Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 ^"110

A.rg Cys Met lie Ser- Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg lie Thr Val 115 1.20 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys lie Asn Gln Arg lie Leu Val Val 130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu val lie Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 17 0 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg lie Asn Thr Thr Thr Asn Glu lie Phe Tyr 195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220

Val lie Pro Gly Asn lie Leu Asn Val Ser lie Lys lie Cys Leu Thr 225 230 235 240 Leu Ser Pro Ser Thr

245

SEQ ID NO: 5 Secuencia de ácido de ADNc de PD-L1M humano

cgaggctccg caccagecgc gcttctgtcc gcctgcaggg cattccagaa agatgagg 53

Met Arg

1

a ta ttt gct gtc ttt ata tte atg acc tac tgg cat ttg ctg aac gca 106 lie Phe Ala Val Phe lie Phe Met Thr Tvr Trp His Leu Leu Asn Ala

5 10 15

ttt act gtc aeg gtt cCC aag gac cta tat gtg gta gag tat ggt age 154 Phe Thr Val Thr Va 1 Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

2C 25 30

aat atg aca att g a a tgc aaa ttc oca gta gaa aaacaa tta gac ctg 202 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu

sG1n Leu Asp Leu

35 40 45 50

gct gca cta att gtc tat tgg gaa atg gag gat aag aac att att caa 250 Ala Ala Leu lie Va 1 Tyr Trp Glu Met Glu Asp

sAsn lie lie Gln

55 60 65

ttt gtg ca L gga gag gaa gac ctg aag gtt cag cat agt age tac aga 298 Phe Val Hi s Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln HisSer Ser Tyr Arg

7 0 75 80

cag agg gee cgg ctg ttg aag gac cag etc tcc ctggga aat gct gca 346 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lvs Asp Gln Leu Ser

uGly Asn Ala Ala

85 90 95

ctt cag atc aca gat gtg aaa ttg cag gat gca ggg gtg tac cgc tgc 394 Leu Gln lie Thr Asp Val Lvs Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 100 105 110

atg aLe age tat ggt ggt gee gac tac aag cga att act gtg aaa gtc 442 Met lie Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Airg H e Thr Val Lys Val 115 120 125 13 0 aat gee cea tac aac aaa ate aac caa aga att ttg gtt gtg gat cea 490 Asn A1a P,r;o Tyr Asn Lys lie Asn G1n Arg Tle Leu Val Val A.sp Pro

135 140 145

gtc ace tet gaa cat gaa ctg aca tgt cag gct. gag ggc tac c c:c aag 538 Val Th r Ser Glu His Glu Leu Thr CVS Gln Ala GLu Gly Tyr Pro Lys

150 155 160

gee gaa gtc ate tgg aca age agí gac cat caa gtc ctg agt ggt aag 586 Ala Glu Val lie Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 165 .1.70 175

acc acc acc acc aat tcc aag aga gag aaq ctt ttc aat gtg acc 634 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

180 185 190

age aca ctg aga ate aac aca aca act aat gag att ttc tac tge act 682 Ser Thr Leu Arg lie Asn Thr Thr Thr Asn Glu lie Phe Tyr Cys Thr 195 200 205 210 ttt agg aga tta gat cct gag gaa aac cat aca gct gaa ttg gtc ate 730 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val lie

215 220 225

cea gaa cta cct ctg cea cat cct cea aat gaa agq act cae ttg gta 778 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Hí 5 Leu Val

230 235 240

att erg gga gee ate tta tta tge ctt ggt gta gca ctg aca ttc atc 826 lie Leu Gly Ala lie Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe lie 245 250 255

ttc cgt tta aga aaa ggg aga atg atg gat gtg aaa tgt ggc ate 874 Phe Arq Leu Arg Lvs Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly lie 260 265 27 0

caa gat aca aac tea aag aag caa agt gat aca cat ttg gag gag acg 922 Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr Has Leu Glu Glu Thr 275 280 285 290 taatccagca ttggaacttc tgatcttcaa gcagggattc tcaacctgtg gtttaggggt 982 tcatcggggc tgagcgtgac aagaggaagg aatgggcccg tgggatgcag gcaatgtggg 1042 acttaaaagg cccaagcact gaaaatggaa cctggcgaaa gcagaggagg agaatgaaga 1102 aagatggagt caaacaggga gcctggaggg agaccttgat actttcaaat gcctgagggg 1162 ctcatcgacg cctgtgacag ggagaaagga tacttctgaa caaggagcct ccaagcaaat 1222 catccattgc tcatcctagg aagacgggtt gagaatccct aatttgaggg tcagttcctg 1282 cagaagtgcc ctttgcctcc actcaatgcc tcaatttgtt ttctgcatga ctgagagtct 1342 gagtgttgga acggga cagt atttatgtat gagtttttcc tatttatttt gagtctgtga 1402

ggtcttcttg tcatgtgagt gtggttgtga atgatttctt ttgaagatat attgtagtag 1462 atgttacaat tttgtcgcca aactaaactt getgcttaat gatttgctca catctagtaa 1522 aacatggag t atttgtaaaa aaaaaaaaaa a 1553 SEQ ID NO: 6 Secuencia de am inoácidos de PD-L1M humano

M e t A rg I l e Phe A ra V a l Phe l i e Phe M e t T h r T y r T rp H is Le u Leu 1 5 10 15 A sn A la ?he T h r V a l T h r V a l P ro L ys A sp Leu T y r V a l V a l G lu T y r

20 25 30

G ly S e r A sn M et T h r l i e G lu Cys L ys Phe P ro V a l G lu Lys G ln Leu 35 4 0 45

A s p le u l i l a A la Leu l i e V a l T y r T rp G lu M e t G lu Aisp L ys A s n l i e 50 55 60

l i e G ln Phe V a l H is G ly G1 u G lu A sp Leu L ys V a l G ln H is S e r S e r 65 70 75 80 T y r A rg G ln A rg A la A rg Leu Leu L ys A sp G ln Leu S e r Leu G ly Asn

8S 90 95

A la A la Leu G ln l i e T h r A sp V a l L y s Leu G ln A sp A la G ly V a l T y r

100 105 110

A rg Cve M e t l i e S e r T y r G ly G ly A la A sp T y r L y s A r g l i e T h r V a l 115 120 125

L y s V a l A sn A la P ro T y r A sn L y s l i e A sn G ln A rg l i e Leu V a l V a l 130 135 140

A sp P ro V a l T h r S e r g : u H is G lu Leu T h r Cys G ln A la G lu G ly T y r 145 150 155 160 P ro L y s A la G lu V a l l i e T rp T h r S e r S e r A s p H is G ln V a l Leu S e r

165 170 175

G ly L y s T h r T h r T h r T h r A sn S e r L y s A rg G lu G lu L y s L eu Phe A sn

18 0 185 190

V a l T h r S e r T h r Leu A rg l i e A sn T h r T h r T h r A sn G lu l i e Phe T y r 195 200 205

C ys T h r Phe A rg A rg Leu A sp P ro G lu G lu A s n H is T h r A la G lu Leu 210 215 220

V a l l i e P ro G lu Leu P ro Leu A la H is P ro P ro A sn G lu A r g T h r H is 225 230 235 240 Leu V a l L ie Leu G ly A la L ie Leu Leu Cys L eu G ly V a l A la L e u T h r

245 250 255

Phe l i e Phe A rg Leu A rg L y s G ly A rg M e t M e t A sp V a l L y s L ys Cys

260 265 270

G ly l i e G ln A sp T h r A sn S e r L y s L ys G ln S e r A sp T h r H is Leu G lu 275 28 0 285

G lu T h r

290

SEQ ID NO: 7 Secuencia de ácido de ADNc de PD-L2 humano

atg ate ttc etc ctg cta atg ttg age ctg gaa ttc cag cttcae cag 48 Met lie Pbe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln

1 5 10 15

ata gea gct tta ttc aca gtg aca gtc cct aag gaa ctg tac ata ata 96 lie Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr lie lie

20 25 30

Gag cat age age aat gtg acc ctg gaa tgc aac ttt gac actgga agt 144 Glu Hi S Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp

rGly Ser

35 4C " 45 ’

cat gtg aac ctt gga gca ata aca gee agt ttg caa aag

gg'aa aat *Í92 His Val Asn Leu Gly Ala lie Thr Ala Ser Leu Gln Lys

lGlu Asn

50 55 60

gat aca tcc cea cae cgt gaa aga gee act ttg ctg gag gagcag ctg 240 Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu GluGln Leu

65 70 " 75 80

ccc cta _{g g g} aag gee teg ttc cae ata cct caa gtc caa gtgaag gac 288 Pro Leu Gly Lys Alia Ser Phe His lie Pro Gln Val Gln

lArg Asp

85 90 95

gaa gga cag tac caa tgc ata ate ate tat ggg gtc gee tgg gac tac 336 Glu Gly Gln Tyr Gln Cys lie Lie lie Tyr Gly Va 1 Ala Trp Asp Tyr

100 105 110

aag tac ctg act ctg aaa gtc aaa gct tcc tac agg aaa ata aa c act 384 Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Va 1 Lys Ala Ser Tyr Arg Lys lie Asn Thr

115 120 125

cae ate cta aag gtt cea gaa aca gat gag gta gag etc acc tgc cag 432 His lie Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu va 1 Glu Leu Thr Cys Gl n

130 135 140

ge t aca ggt Lat cct c Lq gca gaa qta tcc tgg cea aac gtc age gtt 480 Tila Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val

14 5 150 155 160 cct gee aac acc age cae tcc agg acc cct gaa ggc etc tac cag gtc 520 Ero Al a Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val

165 17 0 17 5

acc ag t ctt ctg cgc cta aag cea ccc cct ggc aga aac ttc age tg l 57 6 Thr Ser Val Leu Ar g Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys

180 185 190

gtg ttc tgg aar. act cae gtg agg gaa ctt act tt.g ccc aac att gac: 624 Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser lie Asp

195 200 205

ctt caa agt cag atg gaa ccc agg acc cat cea act tgg ctg ctt cae 672 Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Leu Leu His

210 2.15 220

att ttc ate c c c tcc tgc ate att gct ttc att ttc ata g c c aca gtg 720 lie Phe lie Pro Ser Cys lie lie Ala Phe lie Phe lie Ala Thr Val

225 2 30 235 24 0

ata gee cta aga aaa caa etc tgt ca a aag ctg tat tet tea aaa gac 768 lie Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp

24 5 25 0 255

aca aca aaa aga cct gtc acc sea aca aag agg gaa gtg aac agt gct 816 Th r Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala

260 265 270

ate 819 lie

SEQ ID NO: 8 Secuencia de aminoácidos de PD-L2 humano

Met lie Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln

1 5 10 15

lie A l a Ala Leu Phe Thr Va 1. Thr va .1 Pro Lys Glu Leu Tyr lie 1.1e

20 25 3 0

Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser

35 40 45

His Val Asn Leu Gly Ala lie Thr Al a Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn

50 55 60

Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu

65 70 75 80

Pro Leu G1 y Lys Ala Ser Phe His lie Pro Gln Val Gln Val Arg Asp

85 90 95

Glu Gly Gln Tyr Gln Cys lie lie lie Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr

100 105 11 0

Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys lie Asn Thr

115 120 125

His lie Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln

130 135 140

Al a Thr G 1y Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val

14 5 15 0 155 l e o

Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val

165 17 0 175

Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys

180 135 190

Val Phe Trp Asn Th r His Va 1. Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser lie Asp

195 20G 205

Leu Gln Ser- Gln Me t Glu Pro Arg Thr Hi s Pro Thr Trp Leu Leu His 210 21.5 220

Lie Phe Lie Pro Ser Cys Lie Lie Ala Phe Lie Phe lie Ala Thr Val 225 230 235 24 0 H e Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp

245 250 255

Th r Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala

SEQ ID NO: 9 Secuencia de ADNc de RGMb humano

1 aegataagga agaagaggaa gcgaagcgcg ccccccggcc catgccqcag GGacgggccc 61 agacccgcca cggcgcccgc gccgccgccc tcgccggagc ccacgagacc tgcatggacg 121 ggcatgggct tgagagcagc accttccagc gccgccgctg ccgccgccga ggttgagcag 181 cgccgcagcc ccgggctctg ccccccgccg cr.ggagctgc tgctgctgct gctgttcagc 241 ctcgggctgc tccacgcagg tgactgccaa cagccagccc aatgtcgaat ccagaaatgc 301 accacggact tcgtgtccct gacttctcac ctgaactctg ccgttgacgg ctttgactct 361 gagttttgca aggccttgcg tgcctatgct ggctgcaccc agcgaacttc aaaagcctgc 421 cgtggcaacc tggtatacca ttctgccgtg ttgggtatca gtgacctcat gagccagagg 481 aattgttcca aggatggacc cacatcctct accaaccccg aagtgaccca tgatccttgc 541 aactatcaca gccacgctgg agccagggaa cacaggagag gggaccagaa ccctcccagt 601 tacctttttt gtggcttgtt tggagatcct cacctcagaa ctttcaagga taacttccaa 661 acatgcaaag tagaaggggc ctggccactc atagataata attatctttc agttcaagtg 721 acaaacgtac ctgtggtccc tggatccagt gctactgctá caaataagat cactattatc 781 ttcaaagccc accatgagtg tacagatcag aaagtctacc aagctgtgac agatgacctg 841 ccggccgcct ttgtggatgg caccaccagt ggtggggaca gcgatgccaa gagcctgcgt 901 atcgtggaaa gggagagtgg ccactatgtg gagatgcacg cccgctatat agggaccaca 961 gtgtttgtgc ggcaggtggg tcgctacctg acccttgcca Lccg tatgcc kgaagaccty 1021 gccatgtcct acgaggagag ccaggacctg cagctgtgcg tgaacggctg ccccctgagt 1081 gaacgcatcg atgacgggca gggccaggtg tctgccatcc tgggacacag cctgcctcgc 1141 acctccttgg tgcaggcctg gcctygctac acactggaga ctgccaacac tcaatgccat 1201 gagaagatgc cagtgaagga catctatttc cagtcctgtg tcttcgacct gctcaccact 1261 ggtgatgcca actttactgc cgcagcccac agtgccttgg aggatgtgga ggccctgcac 1321 ccaaggaagg aacgc.tggca cattttcccc agcageggca atgggactcc ccgtqgaggc 1381 agtgatttgt ctgtcagtct aggactcacc tgcttgatcc ttatcgtgtt tttgtag

SEQ ID NO: 10 Secuencia de aminoácidos de RGMb humano

1 mirkk rkrsa ppgpcrshgp rpatapappp speptrpawt gmglraapsa aaaaaaeveq 61 rrspglcppp lellllllfs lgllhagdcq qpaqcriqkc ttdfvsltsh lnsavdgfds 121 efckalraya gctqrrs kac rgnlvyhsav lgisdlmsqr ncskdgptss tnpevthdpc 181 nyhshagare hrrgdqnpps ylfcglfgdp hlrtfkdnfq tckvegawpl idnnylsvqv 241 tnvpvvpgss atatnkitii fkahhectdq kvyqavtddl paafvdgtts ggdsdaksIr 301 iveresghyv emharyigtt vfvrqvgryl tlairmpedl aissyeesqal qlcvngcpls 361 eriddgqgqv sailghslpr tslvqawpgy tlerantqch ekmpvkdiyf qscvfdlltt 421 gdanftaaah saledvealh prkerwhifp ssgngtprgg sdlsvslglt clilivfl SEQ ID NO: 11 Secuencia de ADNc de B7-1 humano

1 atgggccaca cacggaggca gggaacatea ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 61 cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 121 gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgc ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 181 caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 241 atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atateactaa taacctctcc 301 attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 361 tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 421 gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa ettetaatat tagaaggata 461 atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 541 gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 601 agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 661 ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 721 gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 781 tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgeagagaga gaaggaggaa tgagagattg 841 agaagggaaa gtgtacgccc tgtataa

SEQ ID NO: 12 Secuencia de aminoácidos de B7-1 humano

1 mghtrrqgts pskcpylnff qllvlaglsh fcsgvihvtk evkevatlsc ghnvsveela 61 qtriywqkek kmvltmmsgd mniwpeyknr tifditnnls ivilalrpsd egtyeevvlk 121 yekdafkreh laevtlsvka dfptpsisdf eiptsnirri icstsggfpe phlswlenge

181 elnainttvs qdpetelyav sskldfnrntt nhsfmcliky ghlrvnqtfn wnttkqehfp 241 dnllpswait lisvngifvi ccltycfapr crerrrnerl rresvrpv

ADN de cadena ligera variable de 1B9 (vK) y secuencias de aminoácidos

LOCALIZACIÓN 1B9 VK 321 pb ADN lineal

DEFINICIÓN 1B9, ADN 321 bases.

CARACTERÍSTICAS Localización/Clasificadores

J_segmento 292..321

/etiqueta=JK

V_segmento 265..291

/etiqueta=CDR3

V_región 169..264

/etiqueta=FWR3

V_segmento 148..168

/etiqueta=CDR2

V_región 103..147

/etiqueta=FWR2

V_segmento 70..102

/etiqueta=CDR1

V_región 1..69

/etiqueta=FWR1

CDS 1..321

/etiqueta=1 B9\VK

/traducción="DIVMTQSHKFMSTSLGDRVTITCKASQDVGISVVWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSG DFTLTINNVQSEDLADYFCQQYSSYPLTVGAGTKLELK"

RECUENTO DE BASES 85 a 81 c 77 g 78 t

ORIGEN

1 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cactaggaga cagggtcacc 61 atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt atttctgtag tttggtatca acagaaacca

121 gggcaat.ctc ctaaactact. gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat

181 egettcacag gcagtggatc tgggaeagat ttcaetctga ccattaacaa tgtgcagtet

241 gaagacttgg cagattattt ct.gtcagcaa tatageaget atccgctcac ggtcggtgct

301 gggaccaagc tggagctgaa el

ADN de cadena pesada variable de 1B9 y secuencias de aminoácidos

LOCALIZACIÓN 1B9 VH 363pb ADN lineal

DEFINICIÓN 1B9, ADN 363 bases.

CARACTERÍSTICAS Localización/Clasificadores

J_segmento 331..363

/etiqueta=JH

V_segmento 295..330

/etiqueta=CDR3

V_región 199..294

/etiqueta=FWR3

V_segmento 151..198

/etiqueta=CDR2

V_región 109..150

/etiqueta=FWR2

V_segmento 91..108

/etiqueta=CDR1

V_región 1..90

/etiqueta=FWR1

CDS 1..363

/etiqueta=1 B9\VH

/traducción="DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDHAWNWIRQVPGNKLEWMGYITYRGSTTYSPSLKSRIS ITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSMITTGYYVMDYWGQGTSVTVSS"

RECUENTO DE BASES 92 a 99 c 82 g 90 t

ORIGEN

1 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctgg.c ct.ggtgaa.ac cttctcagtc t.ctgtccctc

61 acctgcaet.g tcactggcta ctcaatcacc agtgatcat.g cctggaactg gatccggcag

121 gttccaggaa acaaactgga gtggatgggc taca.taacct accgtggtag cactacctat

181 agcccatctc tcaaaagtcg aatt-tetate actcgagaca catccaagaa ccagttcttc

241 ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagatctatg

301 at.tacgacgg ggtactatgt t.atggactac tggggtcaag gaacctcagt. caccgt.ctcc

361 tea

ADN de cadena ligera variable de 4H1 (vK) y secuencias de aminoácidos

LOCALIZACIÓN 4H1_VK 321 pb ADN lineal

DEFINICIÓN 4H1, ADN 321 bases.

CARACTERÍSTICAS Localización/Clasificadores

J_segmento 292..321

/etiqueta=JK

V_segmento 265..291

/etiqueta=CDR3

V_región 169..264

/etiqueta=FWR3

V_segmento 148..168

/etiqueta=CDR2

V_región 103..147

/etiqueta=FWR2

V_segmento 70..102

/etiqueta=CDR1

V_región 1..69

/etiqueta=FWR1

CDS 1..321

/etiqueta=4H1\VK

/traducción="DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSISCKASQDVGISVAWYQQKPGQSPKLUYWASTRHTGVPVRFTGSGSG TDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSY PPTFGAGTKLELK"

RECUENTO DE BASES 82 a 81 c 79 g 79 t

ORIGEN

1 gacatt.gtga tgacccagtc tcacaaat.tc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc

61 atctcctgca aggccagtca ggatgtgggt. attt.ctgtag cctggtatca acagaaacca

121 gggcaatctc ctaaactact gat.ttact.gg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgtt.

181 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccataagcaa tgtgoagtct

241 gaagacttgg cagattattt. ttgtcagcag tatagcagt.t atccgcccac gtt.cggtgct

301 gggaccaage tggagctgaa a

ADN de cadena pesada variable de 4H1 y secuencias de aminoácidos

LOCALIZACIÓN 4H1 VH 363 pb ADN lineal

DEFINICIÓN 4H1, ADN 363 bases.

CARACTERÍSTICAS Localización/Clasificadores

J_segmento 331..363

/etiqueta=JH

V_segmento 295..330

/etiqueta=CDR3

V_región 199..294

/etiqueta=FWR3

V_segmento 151..198

/etiqueta=CDR2

V_región 109..150

/etiqueta=FWR2

V_segmento 91..108

/etiqueta=CDR1

V_región 1..90

/etiqueta=FWR1

CDS 1..363

/etiqueta=4H1\VH

/traducción="DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTDYSITSDYAWTWIRQFPGNKLEWMGYITYRGTTRYNPSLTSRIS FTRDTSKNQLFLQLNSVTTEDTGTYCCARSMITTGYYAMDYWGQGTSVTVSS"

RECUENTO DE BASES 90 a 103 c 82 g 88 t

ORIGEN

1 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc

61 acct.gcact.g t.cactgacta ctcaatcacc agt.gat.tatg cctggacctg gat.ccggcag

121 tttccgggaa acaaactgga gtggatgggc tacataacct acagaggtac cactcgctac

181 aacccatct.c tcacaagtcg aatctctttc act.cgagaca catccaagaa ccagctcttc

241 ct.gcagtt.ga at.tctgt.gac t.actgaggac acaggcacat. at.tgct.gtgc aagatctat.g

301 at.t.acgacgg ggt.act.atgc t.atggact.ac tggggt.caag gaacct.cagt. caccgtctcc

361 tea

En las siguientes subsecciones se describen varios aspectos de la invención con más detalle.

I. Moléculas de ácido nucleico aisladas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) o porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para usarlos como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos y fragmentos para uso como cebadores de PCR para la amplificación o la mutación de las moléculas de ácido nucleico. Tal como se usa en la presente memoria, el término “molécula de ácido nucleico” pretende incluir moléculas de ADN (p.ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (p.ej., ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótido. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, pero preferiblemente es ADN de cadena doble.

El término “molécula de ácido nucleico aislada” incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, en relación a ADN genómico, el término “aislado” incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el que está asociado de forma natural el ADN genómico. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico “aislada” está libre de las secuencias que flanquean al ácido nucleico de forma natural (esto es, las secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ de la molécula de ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico “aislada”, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares, o medio de cultivo, cuando es producida mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando es sintetizada químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1), o una porción de la misma, puede ser aislada usando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que abarca todas o una porción de las secuencias mostradas en la Tabla 1 puede ser aislada mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando oligonucleótidos cebadores sintéticos diseñados en base a las secuencias mostradas en la Tabla 1.

Una molécula de ácido nucleico de la invención puede ser amplificada usando ADNc, ARNm o, alternativamente, ADN genómico como plantilla y los oligonucleótidos cebadores apropiados según las técnicas estándar de amplificación de PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada puede ser clonada en un vector apropiado y ser caracterizada mediante análisis de secuencia de ADN. Adicionalmente, se pueden preparar oligonucleótidos correspondientes a secuencias de ácido nucleico de la invención mediante técnicas sintéticas estándar, p.ej., usando un sintetizador de ADN automatizado.

En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1), o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1), o una porción de la misma, es aquella que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1, de tal modo que se puede hibridar con la respectiva secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1, formando de este modo un dúplex estable.

En otra realización adicional, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1, o una porción de cualquiera de dichas secuencias de nucleótido.

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solo una porción de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1), o una porción de la misma, por ejemplo, un fragmento que puede ser usado como sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de un polipéptido de la invención, p.ej., los de la Tabla 1. La sonda/cebador típicamente comprende un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de severidad con al menos aproximadamente 12 o 15, preferiblemente aproximadamente 20 o 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 75 nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1); de una secuencia anti-sentido de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1); o de un mutante de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1).

Las sondas basadas en una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1) pueden usarse para detectar tránscritos o secuencias genómicas que codifican los mismos o polipéptidos homólogos. En una realización, la sonda comprende además un grupo marcador unido a la misma, p.ej., el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor enzimático.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una “porción biológicamente activa de un polipéptido de la invención” puede prepararse aislando una porción de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1) que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de un polipéptido de la invención (p.ej., la capacidad de unirse a su diana antigénica), expresando la porción codificada del polipéptido de la invención (p.ej., mediante expresión recombinante in vitro) y determinando la actividad de la porción codificada del polipéptido de la invención.

En otras realizaciones, un fragmento de ácido nucleico que codifica un “péptido epítopo de la invención” puede prepararse aislando una porción de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1) que codifica un polipéptido para el cual los anticuerpos activados contra el polipéptido serán específicos (p.ej., los péptidos epítopos de PD-L1 y PD-L2 humanos mostrados en la Tabla 1).

La invención abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de la(s) secuencia(s) de nucleótidos mostrada(s) en la Tabla 1 debido a una degeneración del código genético, y que por tanto codifican los mismos polipéptidos codificados por la respectiva secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1. En otra realización, una molécula de ácido nucleico de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1).

Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a homólogos de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) pueden aislarse en base a su homología con respecto a los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria usando los ADNcs descritos en la presente memoria, o una porción de los mismos, como sonda de hibridación según las técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación severas.

Por consiguiente, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una longitud de al menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos y se hibrida en condiciones de severidad con la molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1).

Tal como se usa en la presente memoria, el término “se hibrida en condiciones de severidad” pretende describir las condiciones de hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos que son significativamente idénticas u homólogas entre sí permanecen hibridadas unas con otras. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias que son idénticas en al menos aproximadamente un 70%, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80%, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente 85% o 90%, entre sí, permanecen hibridadas unas con a las otras. Dichas condiciones de severidad son conocidas por los especialistas en la técnica y pueden encontrarse en “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), secciones 2, 4 y 6. Otras condiciones de severidad se pueden encontrar en “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), capítulos 7, 9 y 11. Un ejemplo no limitativo de condiciones de hibridación severas incluye la hibridación en 4x o 6x cloruro sódico/citrato sódico (SSC), a aproximadamente 65-70°C (o hibridación en 4x SSC más 50% de formamida a aproximadamente 42-50°C) seguida de uno o más lavados en 1x SSC, a aproximadamente 65-70°C. Un ejemplo no limitativo adicional de condiciones de hibridación severas incluye la hibridación a 6x SSC a 45°C, seguida de uno o más lavados en 0,2x SSC, 0,1% de SDS a 65°C. Un ejemplo no limitativo de condiciones de hibridación altamente severas incluye la hibridación en 1x SSC, a aproximadamente 65-70°C (o hibridación en 1x SSC más 50% de formamida a aproximadamente 42-50°C) seguida de uno o más lavados en 0,3x SSC, a aproximadamente 65-70°C. Un ejemplo no limitativo de condiciones de hibridación de severidad reducida incluye la hibridación en 4x o 6x SSC, a aproximadamente 50-60°C (o alternativamente la hibridación en 6x SSC más 50% de formamida a aproximadamente 40-45°C) seguida de uno o más lavados en 2x, a aproximadamente 50-60°C. Los rangos intermedios de los valores recitados anteriormente, p.ej., a 65-70°C o a 42-50°C también se pretende que queden abarcados por la presente invención. SSPE (1x SSPE es NaCl 0,15M, NaH2PO410 mM y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede ser sustituido por SSC (1x SSC es NaCl 0,15M y citrato sódico 15mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se llevan a cabo durante 15 minutos cada uno después de que se complete la hibridación. La temperatura de hibridación para los híbridos que se anticipa que tengan menos de 50 pares de bases de longitud debería ser 5-10°C inferior a la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina según las siguientes ecuaciones. Para híbridos con una longitud de menos de 18 pares de bases, Tm (°C) = 2 (n° de bases A T) 4 (n° de bases G C). Pará híbridos con una longitud entre 18 y 49 pares de bases, Tm (°C) = 81,5 16,6(log10 [Na+]) 0,41 (% G+C) - (600/N), donde N es el número de bases del híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación ([Na+] para 1x SSC = 0,165 M). El especialista en la técnica reconocerá que se pueden añadir reactivos adicionales a los tampones de hibridación y/o lavado para disminuir la hibridación no específica de moléculas de ácido nucleico a membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o de nylon, que incluyen aunque sin limitación agentes bloqueantes (p.ej., BSA o ADN portador de esperma de salmón o arenque), detergentes (p.ej., SDS), agentes quelantes (p.ej., EDTA), Ficoll, PVP y similares. Cuando se usan membranas de nylon, en particular, un ejemplo no limitativo adicional de condiciones de hibridación severas es la hibridación en NaH2PO40,25-0,5M, 7% de SDS a aproximadamente 65°C, seguida de uno o más lavados en NaH2PO4 0,02M, 1% de SDS a 65°C, véase, p.ej., Church y Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (o alternativamente 0,2x SSC, 1 % de SDS).

El especialista apreciará adicionalmente que se pueden introducir cambios mediante mutación en una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados de la presente invención, sin alterar la capacidad funcional de los polipéptidos. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en los residuos de aminoácido “no esenciales” en una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1). Un residuo de aminoácido “no esencial” es un residuo que puede ser alterado en una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido “esencial” es imprescindible para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de aminoácido que son conservados entre los polipéptidos de la presente invención, p.ej., aquellos requeridos para la unión de los polipéptidos a su antígeno diana, se predice que son particularmente susceptibles de alteración.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) que contienen cambios en los residuos de aminoácido que no son esenciales para la actividad. Dichos polipéptidos difieren en la secuencia de aminoácidos respecto a las secuencias de la Tabla 1, o a porciones de las mismas, pero aun así mantienen la actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos aproximadamente el 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a las secuencias de la Tabla 1, o a porciones de las mismas.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido idéntico a los polipéptidos de las secuencias de la Tabla 1, o porciones de los mismos, puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas, de tal modo que se introducen una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en el polipéptido codificado. Se pueden introducir mutaciones en moléculas de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) mediante técnicas estándar, tal como mutagénesis sito-dirigida y mutagénesis mediada por PCR. En una realización, se realizan sustituciones conservativas de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácido predichos no esenciales. Una “sustitución conservativa de aminoácidos” es aquella en la que el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p.ej., glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo de aminoácido predicho no esencial de un polipéptido de la invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) puede ser reemplazado por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra realización, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo, o en un parte, de la(s) molécula(s) de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1), tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden cribar en función de su actividad biológica para identificar los mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis de una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1), el polipéptido codificado puede ser expresado recombinantemente y se puede determinar la actividad del polipéptido.

En una realización, un polipéptido mutante de la invención puede ser evaluado para determinar su capacidad para unirse y/o modular la actividad de PD-L1 y/o PD-L2.

Otro aspecto adicional de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas de fusión. Dichas moléculas de ácido nucleico, que comprenden al menos una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1) ligada operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1), se pueden preparar mediante técnicas estándar de ADN recombinante.

Las características de expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) dentro de una línea celular o microorganismo pueden ser modificadas insertando un elemento regulador de ADN heterólogo en el genoma de una línea celular estable o de un microorganismo clonado, de tal modo que el elemento regulador insertado esté ligado operativamente a una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1). Por ejemplo, se puede insertar un elemento regulador heterólogo en una línea celular estable o un microorganismo clonado, de tal modo que esté ligado operativamente a una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), usando técnicas, tal como la recombinación homologa dirigida, que son bien conocidas por los especialistas en la técnica, y que se describen, p.ej., en Chappel, Patente de EE.UU. n° 5.272.071; publicación de patente internacional PCt n° WO 91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991.

II. Moléculas de polipéptido aisladas

Un aspecto de la invención se refiere a polipéptidos aislados de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) y a porciones biológicamente activas de los mismos. En una realización, los polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), y las porciones biológicamente activas de los mismos, pueden aislarse de fuentes celulares o de tejido mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas estándar de purificación de proteínas. En otra realización, los polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), y las porciones biológicamente activas de los mismos, son producidos mediante técnicas de ADN recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), y las porciones biológicamente activas de los mismos, pueden ser sintetizadas químicamente usando técnicas estándar de síntesis de péptidos.

Un polipéptido “aislado” o “purificado”, o una porción biológicamente activa del mismo, está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes procedentes de la fuente celular o de tejido del cual se ha derivado el polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. El lenguaje “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), y las porciones biológicamente activas de los mismos, en las cuales el polipéptido es separado de los componentes celulares de las células de las cuales es aislado o producido recombinantemente. En una realización, la expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), y las porciones biológicamente activas de los mismos, que tienen menos de aproximadamente un 30% (en peso seco) de proteínas que no son de la presente invención (también denominadas en la presente memoria “proteínas contaminantes”), más preferiblemente menos de aproximadamente el 20% de proteínas que no son de la presente invención, aún más preferiblemente menos de aproximadamente el 10% de proteínas que no son de la presente invención, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% de proteínas que no son de la presente invención. Cuando los polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), o la porción biológicamente activa de los mismos, son producidos recombinantemente, también están preferiblemente libres sustancialmente de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión “sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos” incluye preparaciones de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), o una porción biológicamente activa de los mismos, en las que el polipéptido es separado de los precursores químicos o de otros productos químicos implicados en la síntesis del polipéptido. En una realización, la expresión “sustancialmente libre de precursores químicos o de otros productos químicos” incluye preparaciones de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), o una porción biológicamente activa de los mismos, que tiene menos de aproximadamente un 30% (en peso seco) de precursores químicos o de proteínas que no son de la presente invención, más preferiblemente menos de aproximadamente un 20% de precursores químicos o de proteínas que no son de la presente invención, aún más preferiblemente menos de aproximadamente un 10% de precursores químicos o de proteínas que no son de la presente invención, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% de precursores químicos o de proteínas que no son de la presente invención.

Tal como se usa en la presente memoria, una “porción biológicamente activa” de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) incluye polipéptidos que participan en una interacción entre PD-L1 y sus receptores, así como PD-L2 y sus receptores. En algunas realizaciones, PD-L1 y/o PD-L2 son los ortólogos humanos. Las porciones biológicamente activas de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas o derivadas de la secuencia de aminoácidos de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), que incluyen menos aminoácidos que el respectivo polipéptido(s) de longitud completa de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1), y exhiben al menos una actividad del respectivo polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1). En una realización, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o estructura con la capacidad de unirse específicamente a PD-L1 y/o PD-L2 según el antígeno, respectivamente, para el cual se activaron o se diseñaron para unirse.

En otra realización, el polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1. En otras realizaciones, el polipéptido es sustancialmente idéntico al polipéptido(s) mostrado en la Tabla 1, aunque difiere en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis, como se describe más detalladamente en la presente memoria. Por consiguiente, en otra realización, un polipéptido(s) de la presente invención es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos aproximadamente 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% o más a un polipéptido(s) mostrado en la Tabla 1.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias son alineadas con fines de comparación óptima (p.ej., se pueden introducir huecos en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo, y las secuencias no idénticas se pueden descartar para los fines de comparación). En una realización, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines de comparación es al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más preferiblemente al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,9% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los residuos de aminoácido o los nucleótidos de las correspondientes posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o el mismo nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición (tal como se usa en la presente memoria “identidad” de aminoácido o de ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La invención también proporciona proteínas quiméricas o de fusión. Tal como se usa en la presente memoria, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” comprende un polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) ligado operativamente a un polipéptido que no es de la presente invención. Un “polipéptido(s) de la presente invención” se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido mostrado en la Tabla 1, mientras que un “polipéptido que no es de la presente invención” se refiere a un polipéptido que no tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente homólogo a un polipéptido mostrado en la Tabla 1, p.ej., un polipéptido que es diferente de un polipéptido mostrado en la Tabla 1 y que se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. En la proteína de fusión, el término “ligado operativamente” pretende indicar que el polipéptido(s) de la presente invención y el polipéptido(s) que no es de la presente invención están fusionados en la misma estructura el uno con el otro. El polipéptido(s) que no es de la presente invención puede estar fusionado con el extremo N o el extremo C del polipéptido(s) de la presente invención y corresponde a un grupo funcional que altera la solubilidad, la afinidad de unión, la estabilidad o la valencia del polipéptido(s) de la presente invención.

Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST con un polipéptido(s) de la presente invención. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de polipéptidos recombinantes de la invención. En otra realización, la proteína de fusión contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. En otra realización adicional, la proteína de fusión contiene un grupo funcional citotóxico (p.ej., toxina). En determinadas células hospedantes (p.ej., células hospedantes de mamífero), la expresión y/o secreción de polipéptido(s) de la presente invención puede aumentarse a través del uso de una secuencia señal heteróloga.

Un polipéptido(s) quimérico o de fusión de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1) puede ser producido mediante técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptido son ligados juntos en la misma estructura de acuerdo a técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos con final redondeado o con final escalonado para ligación, digestión con enzima de restricción para proporcionar los extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar una unión no deseada, y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación de PCR de fragmentos génicos usando cebadores ancla que dan lugar a solapes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden ser madurados posteriormente y reamplificados para generar una secuencia de gen quimérico (véase, por ejemplo, “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992). Además, se encuentran disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que ya codifican un grupo funcional de fusión (p.ej., un polipéptido GST).

Las secuencias de aminoácidos de polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1) identificadas en la presente memoria permitirán a los especialistas en la técnica producir polipéptidos correspondientes a polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1). Dichos polipéptidos pueden ser producidos en células hospedantes procarióticas o eucarióticas mediante expresión de polinucleótidos que codifican un polipéptido(s) de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1). Alternativamente, dichos péptidos pueden sintetizarse mediante métodos químicos. Los métodos para expresión de polipéptidos heterólogos en hospedantes recombinantes, la síntesis química de polipéptidos, y la traducción in vitro son bien conocidos en la técnica y se describen con más detalle en Maniatis et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989), 2a Ed., Cold Spring Harbor, N. Y.; Berger y Kimmel, “Methods in Enzymology”, Volumen 152, “Guide to Molecular Cloning Techniques” (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91: 501; Chaiken l. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Science 243: 187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57: 957; y Offord, R. E. (1980) “Semisynthetic Proteins”, Wiley Publishing).

III. Anticuerpos que se unen a PD-L1 y PD-L2

Sin pretender establecer ninguna teoría, y simplemente para mejorar la comprensión de la invención descrita, se cree que los anticuerpos de la presente invención son únicos en relación a anticuerpos de unión a PD-L1 o PD-L2 conocidos en al menos una de las CDRs (regiones determinantes de complementariedad) que participan en la unión al polipéptido de PD-L1 y PD-L2, al menos porque los anticuerpos de unión a PD-L1 o PD-L2 existentes no presentan afinidad de unión por ambos, PD-L1 y PD-L2. Esta creencia se basa en parte en la bien conocida disposición estructural de elementos, que incluyen las CDR que contienen regiones hipervariables, de la estructura de un anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención también pueden diferir de los anticuerpos de unión a PD-L1 y/o PD-L2 conocidos en más de una CDR y/o en más de una posición de aminoácidos dentro de una o más CDR. Estas diferencias pueden proporcionar a los anticuerpos de la invención descrita la característica de unión a epítopos conservados tanto de PD-L1 como de PD-L2 respecto a los anticuerpos previos contra PD-L1 y/o PD-L2. En una realización, los anticuerpos de la presente invención se unen específicamente a las secuencias de péptido conservadas de PD-L1 y PD-L2, CFTVTVPKDLYVVEYGSN y CYr Sm ISYGGADYKRITV, que representan epítopos inmunogénicos para generar anticuerpos de unión dual deseados en base al análisis de conservación estructural y de secuencia entre PD-L1 y PD-L2, así como las relaciones de unión entre PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención reconocen tanto a PD-L1 como a PD-L2 con una mayor especificidad y/o sensibilidad que los anticuerpos de PD-L1 o PD-L2 conocidos. Dichos anticuerpos son adecuados, entre otros usos, para tinción Western (o inmunotinción), inmunohistoquímica (IHC), detección de formas desnaturalizadas o fijas de PD-L1 y/o PD-L2, ensayos ELISA y ensayos RIA.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la presente invención los fragmentos de unión a antígeno de los mismos también pueden inhibir (bloquear) la actividad de PD-L1 y/o PD-L2 y actuar así como inhibidores de PD-L1 y/o PD-L2. Dichos anticuerpos, y fragmentos, pueden usarse para detectar la presencia de PD-L1 y/o PD-L2 y para inhibir la actividad de PD-L1 y/o PD-L2 sin la necesidad de introducir un inhibidor adicional de PD-L1 y/o PD-L2. Alternativamente, un anticuerpo inhibidor de PD-L1 y/o PD-L2, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se puede usar en combinación con otro inhibidor de PD-L1 y/o PD-L2, tal como en una composición para inhibir la actividad de PD-L1 y/o PD-L2, o administrado, por separado o en combinación, a un sujeto como parte de un método para inhibir la actividad de PD-L1 y/o PD-L2.

Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser producidos usando una variedad de técnicas conocidas, tal como la técnica estándar de hibridación de células somáticas describa por Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque los procedimientos de hibridación de células somáticas son preferidos, en principio, también se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, p.ej., la transformación viral u oncogénica de linfocitos B, la técnica de presentación de fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos.

Un método para generar hibridomas que produce anticuerpos monoclonales de la invención es el sistema de ratón. La producción de hibridomas en ratones es bien conocida en la técnica, incluyendo protocolos de inmunización y técnicas para aislamiento y fusión de esplenocitos inmunizados.

Los anticuerpos policlonales se pueden preparar inmunizando un sujeto adecuado con un inmunógeno de polipéptido (p.ej., los enumerados en la Tabla 1). Sin embargo, los protocolos de inmunización convencional, tal como aquellos usados en el campo hasta la fecha, no generarán anticuerpos anti-PD-L1/PD-L2 deseados con una esperanza de éxito razonable. Específicamente, la inmunización de animales hospedantes naturales normales eliminará los anticuerpos que reaccionan contra el PD-L1 y/o PD-L2 de hospedante y con ello eliminará un gran número de células B y anticuerpos producidos a partir de los mismos que se unen a estructuras conservadas entre el PD-L1 y/o PD-L2 hospedantes y las secuencias de inmunización de PD-L1 y/o PD-L2. Por consiguiente, se ha descubierto en el presente trabajo que la inmunización de animales hospedantes que tienen un bloqueo genético para PD-L1 y PD-L2 (es decir, bloqueos genéticos dobles) de tal modo que los polipéptidos de PD-L1 y PD-L2 no son expresados, inhibe o impide la tolerización y la eliminación de células B que producen anticuerpos de reacción cruzada que se unen para inmunizar secuencias de PD-L1 y PD-L2.

Se puede usar una variedad de estrategias de inmunización y activación para generar una respuesta inmune que contiene los anticuerpos de PD-L1/PD-L2 deseados, que incluyen los esquemas de inmunización tradicionales (típicamente dos inmunizaciones en las primeras de cuatro a cinco semanas, seguidas de inmunizaciones adicionales si no se alcanza el título deseado), con una activación final de tres a cuatro días antes de la recolección de células para clonación y aislamiento de anticuerpos. Otras estrategias adicionales incluyen la inmunización rápida en sitios múltiples, o protocolo de inmunización RIMMS (ver Kilpatrick et al. (1997) Hybridoma 16(4): 381-9 y Bynum et al. (1999) Hybridoma 19(5): 407-11). Adicionalmente, las estrategias de inmunización/activación se pueden adaptar mediante el uso de una combinación de inmunógenos, que incluyen fragmentos de dominio extracelular soluble de PD-L1 y/o PD-L2, células modificadas para expresar niveles elevados de PD-L1 y/o PD-L2 sobre su superficie, PD-L1 o PD-L2 solubilizados purificados, y péptidos derivados de PD-L1 y/o PD-L2 (p.ej., ver la Tabla 1).

El título de anticuerpos de polipéptido en el sujeto inmunizado puede monitorizarse con el tiempo mediante técnicas estándar, tal como un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) usando polipéptido inmovilizado. Si se desea, el anticuerpo dirigido contra el antígeno puede ser aislado del mamífero (p.ej., a partir de la sangre) y ser purificado adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tal como una cromatografía de proteína A para obtener la fracción de IgG. A un tiempo apropiado tras la inmunización, p.ej., cuando los títulos de anticuerpos son máximos, se pueden obtener las células productoras de anticuerpos del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar, tal como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497) (ver también Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) Frac. Natl. Acad Sci. 76: 2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cáncer 29: 269-75), la más reciente técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today4: 72), la Técnica de EBV-hibridoma (Cole et al. (1985) “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es bien conocida (ver de forma general Kenneth, R. H. en “Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses”, Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); Lemer, E. A (1981) Yale J. Biol. Med. 54: 387-402; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet.

3: 231-36). Resumidamente, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) es fusionada con linfocitos (típicamente esplenocitos) procedentes de un mamífero inmunizado con un inmunógeno como se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes son cribados para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une al antígeno de polipéptido, preferiblemente de forma específica.

Se puede aplicar cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas con el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 y/o PD-L2 (ver, p.ej., Galfre, G. et al. (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al. (1977) ver anterior; Lemer (1981) ver anterior; Kenneth (1980) ver anterior). Además, los especialistas en la técnica apreciarán que existen muchas variaciones de dichos métodos que también podrían ser útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (p.ej., una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, se pueden preparar hibridomas de ratón fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular inmortalizada de ratón. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT"). Se puede usar cualquier número de líneas celulares de mieloma como pareja de fusión según las técnicas estándar, p.ej., las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles en la “American Type Culture Collection (ATCC)", Rockville, Md. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT son fusionadas a esplenocitos de ratón usando polietilén glicol (“PEG"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión son seleccionadas entonces usando medio HAT, que mata células de mieloma no fusionadas y fusionadas de forma no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no son transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención son detectadas cribando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para identificar anticuerpos que se unen a un polipéptido dado, p.ej., usando un ensayo ELISA estándar.

Como alternativa para preparar hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, un monoclonal específico para uno de los polipéptidos descritos anteriormente puede ser identificado y aislado cribando una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (p.ej., una biblioteca de presentación de fagos de anticuerpo) con el polipéptido apropiado para aislar de este modo miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se unen al polipéptido. Los kits para generar y cribar bibliotecas de presentación de fagos se encuentran disponibles comercialmente (p.ej., el “Pharmacia Recombinant Phage Antibody System", n° de catálogo 27-9400-01; y el kit “Stratagene SurfZAp™ Phage Display K it’, n° de catálogo 240612). Adicionalmente, los ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles de uso en la generación y el cribado de una biblioteca de presentación de anticuerpos se pueden encontrar, por ejemplo, en Ladner et al. Patente de EE.UU. n° 5.223.409; Kang et al. Publicación Internacional n° WO 92/18619; Dower et al. Publicación Internacional n° WO 91/17271; Winter et al. Publicación Internacional WO 92/20791; Markland et al. Publicación Internacional n° WO 92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación Internacional n° WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional n° WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional n° WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9: 1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Frac. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) Frac. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; y McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-554.

Adicionalmente, se pueden generar anticuerpos de unión dual recombinantes anti-PD-L1/PD-L2, tal como los anticuerpos monoclonales quiméricos, compuestos y humanizados, que pueden ser preparados usando técnicas de ADN recombinante estándar. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos, compuestos y humanizados pueden ser producidos mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, usando métodos descritos en Robinson et al. Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira et al. Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M. Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al. Solicitud PCT n° WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de EE.UU. n° 4.816.567; Cabilly et al. Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Frac. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Frac. Natl. Acad. Sci. 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) Biotechniques 4: 214; Winter Patente de EE.UU. n° 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.

Adicionalmente, se pueden preparar anticuerpos humanizados según protocolos estándar tales como los descritos en la Patente de EE.UU. n° 5.565.332. En otra realización, las cadenas de anticuerpos o los miembros de pares de unión específicos se pueden producir por recombinación entre vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican una fusión de una cadena de polipéptido de un miembro de par de unión específico y un componente de un paquete de presentación genérico replicable y vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican una segunda cadena de polipéptido de un único miembro de par de unión usando técnicas conocidas en la técnica, p.ej., tal como se describe en las Patentes de EE.UU. n° 5.565.332, 5.871.907 o 5.733.743. El uso de anticuerpos intracelulares para inhibir la función de la proteína en una célula también es conocido en la técnica (ver, p.ej., Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9: 101-108; Werge, T. M. et al. (l990) FEBS Lett. 274: 193-198; Carlson, J. R. (1993) Frac. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Frac. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12: 396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5: 595-601; Duan, L et al. (1994) Frac. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Frac. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 666-672; Mhashilkar, A M. et al. (1995) EMBO J. 14: 1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Publicación PCT n° WO 94/02610 a nombre de Marasco et al.; y la Publicación PCT n° WO 95/03832 a nombre de Duan et al.).

En otra realización, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PD-L1 y PD-L2 pueden ser generados usando ratones transgénico o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. En una realización, los ratones transgénicos, referidos en la presente memoria como “ratones HuMAb” que contienen una minilocalización de gen de inmunoglobulina humano que codifica secuencias de inmunoglobulina humana de cadena pesada (g y y) y ligera k, junto con las mutaciones dirigidas que inactivan las localizaciones de cadena g y k endógenas (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859). Por consiguiente, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM o k de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos sufren un cambio de clase y una mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgGK humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), ver anterior; revisado en Lonberg, N. (1994) “Handbook of Experimental Pharmacology” 113: 49 101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 6593, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci .764: 536 546). La Preparación de ratones HuMAb se describe en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 62876295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 37203724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912 2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856859; Lonberg, N. (1994) “Handbook of Experimental Pharmacology” 113: 49101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579591; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 6593; Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 851. Ver además, las Patentes de EE.UU. n° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas a nombre de Lonberg y Kay, y GenPharm International; la Patente de EE.UU. n° 5.545.807 a nombre de Surani et al.; las Publicaciones Internacionales n° WO 98/24884, publicada el 11 de junio de 1998; WO 94/25585, publicada el 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22645, publicada el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de marzo de 1992.

En otra realización, un anticuerpo para uso en la invención es un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de un único polipéptido anticuerpo. La unión a antígeno puede ser simultánea o secuencial. Los triomas y los hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecíficos. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos producidos por un hibridoma híbrido o un trioma se describen en la Patente de EE.UU. n° 4.474.893. Los anticuerpos biespecíficos han sido construidos por medios químicos (Staerz et al. (1985) Nature 314: 628, y Perez et al. (1985) Nature 316: 354) y con tecnología de hibridoma (Staerz y Bevan (1986) Frac. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 1453, y Staerz y Bevan (1986) Immunol. Today 7: 241). Los anticuerpos biespecíficos también se describen en la Patente de EE.UU. n° 5.959.084. Los fragmentos de anticuerpos biespecíficos se describen en la Patente de EE.UU. n° 5.798.229.

Los agentes biespecíficos también pueden generarse fabricando heterohibridomas mediante la fusión de hibridomas u otras células que fabrican diferentes anticuerpos, seguido de la identificación de los clones que producen y co ensamblan ambos anticuerpos. También pueden generarse mediante conjugación química o genética de cadenas de inmunoglobulina completas o de porciones de las mismas, tal como secuencias Fab y Fv. El componente de anticuerpo puede unirse a PD-L1 y PD-L2. En una realización, el anticuerpo biespecífico podría unirse específicamente tanto a PD-L1 como a PD-L2, además de a otras dianas deseables, tal como otros polipéptidos co-inmunoinhibidores (p.ej., CTLA4, B7-1, PD-1, etc.).

Otro aspecto adicional de la invención se refiere a anticuerpos anti-polipéptido PD-L1/PD-L2 que se pueden obtener mediante un proceso que comprende inmunizar a un animal con un polipéptido inmunogénico de PD-L1 y PD-L2 o con porciones inmunogénicas del mismo (p.ej., los polipéptidos mostrados en la Tabla 1), y a continuación aislar los anticuerpos del animal que se unen específicamente al polipéptido.

En otro aspecto adicional de la invención, se pueden usar secuencias de anticuerpo parciales o conocidas para generar y/o expresar nuevos anticuerpos. Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana predominantemente a través de los residuos de aminoácido que están localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácido dentro de CDRs son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de CDRs. Puesto que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos naturales específicos construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico natural ancladas a secuencias estructurales de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (ver, p.ej., Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332: 323327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321: 522525; y Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029 10033). Dichas secuencias estructurales pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de línea germinal y de línea no germinal. Dichas secuencias de línea germinal diferirán de las secuencias génicas de anticuerpo maduro porque no incluyen genes variables completamente ensamblados, que son formados mediante unión V(D)J durante la maduración de células B. Las secuencias génicas de línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad en individual de forma uniforme por toda la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la porción amino-terminal de la región estructural 1 y en la porción carboxi-terminal de la región estructural 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran de forma significativa las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia de ADN entera de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de unión similares a las del anticuerpo original. La secuencia de cadena pesada y ligera parcial que se extiende por las regiones de CDR es típicamente suficiente para este propósito. La secuencia parcial usada para determinar qué segmentos génicos variables y de unión, de línea germinal y/o no de línea germinal, contribuyeron a los genes variables del anticuerpo recombinado. La secuencia de línea germinal y/o de línea no germinal es usada entonces para rellenar las porciones que faltan de las regiones variables. Las secuencias líder de cadena pesada y ligera son escindidas durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para añadir las secuencias que faltan, se pueden combinar secuencias de ADNc con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación de PCR. Alternativamente, se puede sintetizar la región variable entera como un conjunto de oligonucleótidos cortos solapados y combinarse mediante amplificación de PCR para crear un clon de región variable enteramente sintético. Este proceso presenta ciertas ventajas, tal como la eliminación o la inclusión de sitios de restricción particulares, o la optimización de codones particulares. El proceso también puede usarse para cribar bibliotecas de secuencias codificadoras de inmunoglobulina particulares en una especie (p.ej., humana) para diseñar secuencias codificadoras de inmunoglobulina cognadas a partir de una secuencia de anticuerpo conocida en otra especie (p.ej., ratón).

Las secuencias de nucleótidos de los tránscritos de cadena pesada y ligera de un hibridoma se usan para diseñar un conjunto solapado de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las de las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: cuerdas de bases de nucleótidos repetidas son interrumpidas para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación de PCR; se incorporan sitios de inicio de traducción óptimos según las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266L 19867019870); y, se diseñan sitios HindIII por encima de los sitios de inicio de traducción.

Para ambas regiones variables de cadena pesada y ligera, las secuencias codificadoras de cadena optimizadas, y las correspondientes no codificadoras, se descomponen en 30-50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del correspondiente oligonucleótido no codificador. Por tanto, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos de cadena doble solapados que se producen segmentos de 150-400 nucleótidos. Los conjuntos son usados entonces como plantillas para producir productos de amplificación de PCR de 150-400 nucleótidos. Típicamente un conjunto de oligonucleótidos de región variable se descompondrá en dos grupos que son amplificados de forma separada para generar dos productos de PCR solapados. Dichos productos solapados son combinados a continuación mediante amplificación de PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento solapado de la región constante de cadena pesada o ligera en la amplificación de PCR para generar fragmentos que puedan clonarse fácilmente en las construcciones de vector de expresión.

Las regiones variables de cadena pesada y ligera reconstruidas son combinadas entonces con las secuencias de promotor clonado, secuencia líder, de inicio de traducción, secuencia líder, región constante, secuencia 3’ no traducida, secuencia de poliadenilación, y secuencia de terminación de la transcripción, para formar construcciones de vector de expresión. Las construcciones de expresión de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un único vector, cotransfectarse, transfectarse en serie, o transfectarse por separado en células hospedantes que a continuación son fusionadas para formar una célula hospedante que expresa ambas cadenas.

Los plásmidos para este uso son conocidos en la técnica. Los anticuerpos completamente humanos y quiméricos de la presente invención también incluyen los anticuerpos IgG2, IgG3, IgE, IgA, IgM e IgD. Se pueden construir plásmidos similares para la expresión de otros isótopos de cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.

Por tanto, en otro aspecto de la invención, se pueden usar las características estructurales de anticuerpos conocidos, humanos o no humanos (p.ej., un anticuerpo de ratón anti-PD-L1/PD-L2 humano) para crear anticuerpos humanos anti-PD-L1/PD-L2 humano relacionados estructuralmente que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión a PD-L1 y PD-L2. Otra propiedad funcional incluye inhibir la unión de los anticuerpos originales conocidos, no humanos o humanos, en un ensayo ELISA de competición. Adicionalmente, una o más CDR o regiones variables de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) pueden combinarse recombinantemente con regiones estructurales humanas conocidas y CDRs para crear anticuerpos anti-PD-L1/PD-L2 humano adicionales, creados recombinantemente, de la presente invención.

Dado que es bien conocido en la técnica que los dominios de CDR3 de cadena pesada y ligera de anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno, los anticuerpos recombinantes de la invención preparados como se ha indicado anteriormente preferiblemente comprenden las CDR3s de cadena pesada y ligera de regiones variables de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas). Los anticuerpos además pueden comprender las CDR2s de regiones variables de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas). Los anticuerpos además pueden comprender las CDR1s de regiones variables de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas). En otras realizaciones, los anticuerpos pueden comprender cualquier combinación de CDRs.

Las regiones de CDR1, 2 y/o 3 de los anticuerpos modificados descritos anteriormente pueden comprender la(s) secuencia(s) de aminoácidos exacta(s) de las regiones variables de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) descritas en la presente memoria. Sin embargo, el especialista en la técnica apreciará que puede ser posible alguna desviación respecto a las secuencias de CDR exactas manteniendo la capacidad del anticuerpo para unirse efectivamente a PD-L1 y/o PD-L2 (p.ej., modificaciones de secuencia conservativas). Por consiguiente, en otra realización, el anticuerpo modificado puede estar compuesto por una o más CDRs que, por ejemplo, son idénticas en un 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% a una o más CDRs de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas).

Las características estructurales de anticuerpos no humanos o humanos descritos en la presente memoria pueden usarse para crear anticuerpos humanos relacionados estructuralmente que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la presente invención, tal como la unión a PD-L1 y PD-L2 humanos. Otra propiedad funcional incluye la inhibición de la unión de los anticuerpos originales conocidos de PD-L1 y/o PD-L2, no humanos o humanos, en un ensayo ELISA de competición. La Tabla 1 presenta numerosas secuencias vK y vH que contienen numerosas CDRs que pueden mezclarse y acoplarse en cualquier combinación, siempre que el anticuerpo recombinante o el fragmento de unión a antígeno del mismo mantenga la capacidad de unirse a PD-L1 y PD-L2.

En algunas realizaciones se proporcionan anticuerpos monoclonales capaces de unirse a PD-L1 y PD-L2 humanos, que comprenden una cadena pesada donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% al grupo de CDRs de dominio variable de cadena pesada presentado en la Tabla 1.

De forma similar, también se proporcionan anticuerpos monoclonales capaces de unirse a PD-L1 y PD-L2 humanos que comprenden una cadena ligera donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% al grupo de CDRs de dominio variable de cadena ligera presentado en la Tabla 1.

También se proporcionan anticuerpos monoclonales capaces de unirse a PD-L1 y PD-L2 humanos, que comprenden una cadena pesada donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% al grupo de CDRs de dominio variable de cadena pesada presentado en la Tabla 1; y que comprenden una cadena ligera donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% al grupo de CDRs de dominio variable de cadena ligera presentado en la Tabla 1.

Un especialista en la técnica notará que dicho porcentaje de homología es equivalente, y puede lograrse introduciendo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos conservativas dentro de una CDR dada.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden comprender una cadena pesada, donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las CDRs de dominio variable de cadena pesada presentadas en la Tabla 1 y una cadena ligera, donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las CDRs de dominio variable de cadena ligera presentadas en la Tabla 1.

Dichos anticuerpos monoclonales pueden comprender una cadena ligera, donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, tal como se describen en la presente memoria; y/o una cadena pesada, donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, tal como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales capaces de unirse a PD-L1 y PD-L2 humano comprenden o consisten en CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, tal como se describe en la presente memoria.

El dominio variable de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales de la presente invención puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos vH establecida en la Tabla 1 y/o el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos monoclonales de la presente invención puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos vk establecida en la Tabla 1.

La presente invención proporciona además fragmentos de dichos anticuerpos monoclonales que incluyen, aunque sin limitación Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 y diacuerpos; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, una serie de moléculas inmunoinhibidoras, tal como CTLA-4, y similares, se pueden ligar de un modo biespecífico o multiespecífico.

También se contemplan otros fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Por ejemplo, se proporcionan cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulina individuales, donde los dominios variables de las mismas comprenden al menos una CDR presentada en la Tabla 1. En una realización, la cadena pesada de inmunoglobulina comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% al grupo de CDRs de dominio variable de cadena pesada o de cadena ligera presentado en la Tabla 1. En otra realización, también se proporciona una cadena ligera de inmunoglobulina comprende al menos una CDR que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 100% al grupo de CDRs de dominio variable de cadena pesada o de cadena ligera descrito en la presente memoria (p.ej., presentado en la Tabla 1).

En algunas realizaciones, la cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina comprende un dominio variable que comprende al menos una de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3, descritas en la presente memoria. Dichas cadenas pesadas de inmunoglobulina pueden comprender o consistir en al menos una de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3. Dichas cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden comprender o consistir en al menos una de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3.

En otras realizaciones, una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina según la presente invención comprende o consiste en una secuencia de dominio variable de vH o vk, respectivamente, proporcionada en la Tabla 1.

La presente invención proporciona además polipéptidos que tienen una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de dominio variable vH, dominio variable vk, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 descritas en la presente memoria.

Los anticuerpos, inmunoglobulinas y polipéptidos de la invención se pueden usar en una forma aislada (p.ej., purificada) o en una forma contenida en un vector, tal como una membrana o una vesícula lipídica (p.ej., un liposoma).

Se contempla(n) modificación(es) de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Es sabido que cuando se produce un anticuerpo humanizado mediante un simple anclaje solo de las CDRs en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FRs de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de unión a antígeno se reduce en comparación con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios residuos de aminoácido de VH y VL del anticuerpo no humano, no solo de las CDRs sino también de las FRs, están asociados directa o indirectamente a la actividad de unión a antígeno. Por tanto, la sustitución de dichos residuos de aminoácido por residuos de aminoácido diferentes derivados de FRs de VH y VL del anticuerpo humano reduciría la actividad de unión y se puede correlacionar reemplazando los aminoácidos por residuos de aminoácido del anticuerpo original derivado de un animal no humano.

Se pueden introducir modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invención, y en las secuencias de ADN que los codifican, y aun así obtener una molécula funcional que codifica un anticuerpo y un polipéptido con características deseables. Por ejemplo, se pueden sustituir determinados aminoácidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de actividad. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar determinadas sustituciones de aminoácido en una secuencia proteínica, y, por supuesto, en su secuencia codificadora de ADN, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla que se pueden realizar varios cambios en las secuencias de anticuerpos de la invención, o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos, sin una pérdida apreciable de su actividad biológica.

Al hacer cambios en las secuencias de aminoácido del polipéptido, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. En la técnica se reconoce de forma general la importancia del índice hidropático de aminoácido al conferir una función biológica interactiva a una proteína. Es aceptado que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, etc. Cada aminoácido tiene asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y sus características de carga, y son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+ 1,9); alanina (+ 1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (<RTI 3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

En la técnica es sabido que determinados aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar, y que darán lugar a una proteína con una actividad biológica similar, es decir, darán lugar a una proteína funcionalmente equivalente desde el punto de vista biológico.

Como se ha descrito antes, las sustituciones de aminoácido se basan por tanto en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácido, por ejemplo, en su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, etc. Los ejemplos de sustituciones que toman en consideración varias de las anteriores características son bien conocidos por los especialistas en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la invención puede ser útil para alterar el patrón de glicosilación original del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la estabilidad. Con “alterar” se pretende indicar eliminar uno o más grupos funcionales de carbohidrato del anticuerpo y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos típicamente es N-ligada. “N-ligada” se refiere a la unión del grupo funcional de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento correspondientes a la unión enzimática del grupo funcional de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de dichas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se lleva a cabo de forma conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de tal modo que contiene una o más de las secuencias de tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-ligados). Otro tipo de modificación covalente implica glicósidos acoplar química o enzimáticamente glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos al no requerir la producción del anticuerpo en una célula hospedante que tiene capacidades de glicosilación para glicosilación N- u O-ligada. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Por ejemplo, dichos métodos se describen en el documento WO 87/05330.

De forma similar, la eliminación de cualquier grupo funcional de carbohidratos presente en el anticuerpo puede conseguirse química o enzimáticamente. La glicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la ruptura de la mayoría, o de todos, los azúcares excepto el azúcar ligando (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), manteniendo el anticuerpo intacto. La desglicosilación química es descrita por Sojahr et al. (1987) y por Edge et al. (1981). La ruptura enzimática de grupos funcionales de carbohidrato en anticuerpos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas, como describen Thotakura et al. (1987).

Otras modificaciones pueden implicar la formación de inmunoconjugados. Por ejemplo, en un tipo de modificación covalente, los anticuerpos o proteínas son ligados covalentemente a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, p.ej., polietilén glicol, polipropilén glicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en las Patentes de EE.UU. n° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 o 4.179.337.

La conjugación de anticuerpos u otras proteínas de la presente invención con agentes heterólogos se puede realizar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales que incluyen, aunque sin limitación, N-succinimidil (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tal como disuccinimidil suberato), aldehídos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como tolien 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, el ácido 1-isotiocianatobencil metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo (WO 94/11026).

En otro aspecto, la presente invención presenta anticuerpos conjugados a un grupo funcional terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco y/o un radioisótopo. Cuando se conjuga con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpo se refieren a “inmunotoxinas”. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células (p.ej., las mata). Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, coquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanodol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, aunque sin limitación, antimetabolitos (p.ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbacina), agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatino), antraciclinas (p.ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p.ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p.ej., vincristina y vinblastina). Un anticuerpo de la presente invención se puede conjugar a un radioisótopo, p.ej., yodo radioactivo, para generar compuestos radiofarmacéuticos citotóxicos para tratar un trastorno relacionado, tal como un cáncer.

Se pueden usar anticuerpos conjugados en diagnóstico o prognosis para monitorizar los niveles de polipéptido en tejido como parte de un procedimiento de evaluación clínica, p.ej., para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar mediante el acoplamiento (es decir, la unión física) del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo protésico adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, diclorotirazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina (PE); un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Tal como se usa en la presente memoria, el término “marcado”, con respecto al anticuerpo, se pretende que abarque el marcado directo del anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, enlace físico) de una sustancia detectable, tal como un agente radioactivo o un fluoróforo (p.ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)) al anticuerpo, así como el marcado indirecto del anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable.

Los conjugados de anticuerpo de la presente invención pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada. El grupo funcional terapéutico no debe considerarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el grupo funcional de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, o toxina de la difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-gamma; o modificadores de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulante de colonia de macrófago granulocito (“GM-CSF”), factor estimulante de colonia de granulocito (“G-CSF”), u otras citocinas o factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar dicho grupo funcional terapéutico con anticuerpos son bien conocidas, véase, p.ej., Arnon et al., ''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pág. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery'', en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pág. 62353 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pág. 475 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pág. 303 16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 11958 (1982).

En algunas realizaciones, las conjugaciones se pueden realizar usando un “ligando escindible” que facilita la liberación del agente citotóxico o del agente inhibidor del crecimiento en una célula. Por ejemplo, se puede usar un ligando lábil frente a ácidos, un ligando sensible a peptidasa, un ligando fotolábil, un ligando de dimetilo o un ligando que contiene disulfuro (ver, p.ej., la Patente de EE.UU. n° 5.208.020). Alternativamente, se puede preparar una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico o el agente inhibidor del crecimiento, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud de ADN puede comprender las respectivas regiones que codifican las dos porciones del conjugado tanto adyacentes entre sí como separadas por una región que codifica un péptido ligando que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

Además de unirse simplemente a PD-L1 y PD-L2, los anticuerpos, tal como los descritos en la presente memoria, se pueden seleccionar por sus efectos sobre las funciones de PD-L1 y PD-L2, tal como modular la expresión de FoxP3, modular la fosforilación de ERK1 o ERK2, modular la fosforilación de PKC-0, modular la fosforilación de SHP-2, modular la producción de citocinas, y modular la proliferación celular y/o metástasis.

En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo tiene un efecto seleccionado del grupo que consiste en (a) regula al alza la señalización de PD-L2/RGMb y con ello regula a la baja la fosforilación de ERK 1 o ERK 2; (b) regula a la baja la señalización de PD-L2/RGMb y con ello regula al alza la fosforilación de ERK 1 o ERK 2; (c) regula al alza la señalización de PD-L2/RGMb y con ello regula a la baja la fosforilación de PKC-0; (d) regula a la baja la señalización de PD-L2/RGMb y con ello regula al alza la fosforilación de PKC-0; (e) regula al alza la señalización de PD-L2/RGMb y con ello regula al alza la fosforilación de SHSP-2; y (f) regula a la baja la señalización de PD-L2/RGMb y con ello regula a la baja la fosforilación de SHP-2.

FoxP3, ERK1/ERK2, PKC-0 y SHP-2 son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, FOXP3 tiene una función en la regulación del desarrollo de células B, células T y células T reguladoras CD25+/CD4+. Se expresa en leucemia/linfoma de célula T adulta y es usado ampliamente como marcador de una población de células T reguladoras (Tregs) que controlan la inmunotolerancia y habilitan a las células tumorales para evadir la respuesta de hospedante (Bignone y Banham (2008) EOBT 8: 1897-1920). SHP-2 (también conocido como Syp, SHPTP2, PTP2C, PTPNl 1, PTPlD y BPTP3) es un miembro de la familia de fosfatasas de tirosina no de membrana (Patente de EE.UU. n° 5.589.375 y Patente de EE.UU. n° 5.831.009). La proteína SHP-2 contiene dos dominios de homología de src 2 (SH2), regiones conservadas de aproximadamente 100 aminoácidos identificadas originalmente en Src proteína tirosina quinasas, que promueven las interacciones proteína-proteína a través de la unión de residuo de fosfotirosilo (Neel, Semin. Cell. Biol.

4: 419-432 (1993)). Se ha demostrado que estos dos dominios presentan funciones diferenciales en la regulación de la fosfatasa SHP-2 y por consiguiente afectan a diferentes rutas de señalización. El dominio SH2 N-terminal sirve como dominio regulador y de reclutamiento, produciendo un efecto autoinhibidor a través de interacciones intramoleculares con el dominio catalítico interno de la fosfatasa. Aunque el dominio SH2 C-terminal actúan meramente para reclutar otras proteínas para interacciones intermoleculares necesarias para la transducción de señal (Pei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 1141-1145 20 (1996)). El estado de fosforilación de la molécula SHP-2 regula su actividad de fosfatasa. Las proteína-tirosina fosfatasas, que incluyen las fosfatasas que contienen SH2, son altamente conservadas entre los eucariontes de especies tan diversas como mamíferos, incluyendo humanos, o levaduras y Xenopus. Se ha demostrado que SHP-2 desempeña un papel crítico en las respuestas inmunológicas aberrantes (p.ej., en la respuesta alérgica (Pazdrak et al., J. Exp. Med. 186: 561-568 (1997)). La fosforilación de SHP-2 es fácilmente detectable mediante los métodos de la técnica, que incluyen, sin limitación, la detección de movilidad alterada de la molécula SHP-2 en un gel PAGE, ensayos de fosforilación, y ensayos que miden la actividad de la molécula SHP-2. La detección de la fosforilación de SHP-2 puede ser directa, o alternativamente puede ser indirecta, p.ej., detección de una actividad o evento aguas abajo.

ERK1 y ERK2 (también conocidas como MAPK1 y MAPK2) son también quinasas (Boulton, et al., Cell 65: 663-675, (1991)). La activación de la molécula de ERK se realiza mediante fosforilación de serina/treonina o fosforilación de tirosina. La inhibición de ERK 1 y 2 puede ser el resultado de la inhibición de la fosforilación previa de las moléculas de ERK 1 y 2, o puede ser el resultado de la activación de una fosfatasa que desfosforile ERK 1 y 2, para reducir la actividad. Se sabe que las proteínas ERK son activadas mediante fosforilación por la molécula m Ek , una quinasa de especificidad dual. Tras activación, ERK1 y ERK2 se traslocalizan al núcleo, donde pueden fosforilar directamente y activar una variedad de 20 factores de transcripción que incluyen c-Myc, C/EBP~, p62, TCF /Elk-1, ATF-2 y c-Jun. El estado de fosforilación/estado de activación de las moléculas ERK1 y 2 tras la activación de células T es un indicio de señalización vía PD-1. El estado de fosforilación/estado de activación de ERK 1 y 2 puede ser fácilmente determinado por el especialista en la técnica usando ensayos fácilmente disponibles en la técnica. Por ejemplo, el estado de fosforilación de las moléculas ERK1 y 2 se puede determinar usando un anticuerpo específico para la forma fosforilada de las proteínas p42/44 ERK.1/2 (específico de fosfo-Thr202/Tyr204), varias de las cuales se encuentran disponibles comercialmente. Alternativamente, el estado de fosforilación de las moléculas ERK.1 y 2 se puede determinar por su movilidad en un gel, usando un anticuerpo que reconoce ERK1 y 2, independientemente del estado de fosforilación) para identificación. Alternativamente, el estado de activación de ERK.1 y 2 se puede determinar ensayando la actividad de quinasa de las moléculas ERK.1 y 2. La determinación del estado de fosforilación/activación de ERK1 y 2 también puede realizarse a través de métodos indirectos, p.ej., la detección de una actividad o evento posterior.

Las isoenzimas PKC desempeñan un papel importante en muchos eventos de señalización celular. PKC-0 (también conocida como PKC-0, PKCT, PRKCT, nPKC-0 y PRKCQ) es una isoforma independiente de calcio de la familia PKC de serina-treonina quinasas. La sobreexpresión temporal de la proteína PKC-0 en células de timoma de ratón dio como resultado la activación transcripcional de una construcción dirigida por promotor de interleucina-2 (Baier et al., Eur. J. Biochem. 225: 195-203 (1994)), lo que indica un papel para PKC-0 en las rutas de señalización de células T. También se ha demostrado que PKC-0 es activada en el curso de la activación de células T mediada por receptor de célula T, y dicha activación se correlaciona con la traslocalización de la molécula de PKC-0 a la membrana plasmática en el sitio de contacto de APC (Patente de EE.UU. n° 6.040.152). PKC-0 también ha sido implicada en otros procesos celulares que incluyen la apoptosis (Datta et al., J. Biol. Chem. 272: 20317-20320 (1997)), la disposición citoesquelética (Pietromonaco et al., J. Biol. Chem. 273: 7594-7603 (1998); Simons et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 561-565 (1998)), la proliferación (Passalacqua et al., Biochem. J. 337: 113-118 (1999)), y la angiogénesis y reparación de heridas (Tang et al., J. Biol. Chem. 272: 28704-28711 (1997)). El estado de fosforilación refleja el estado de activación de la molécula de PKC-0 indicando la fosforilación una activación. El estado de fosforilación/estado de activación de PKC-0 pueden ser determinados fácilmente por el especialista en la técnica usando ensayos fácilmente disponibles en la técnica. Por ejemplo, el estado de fosforilación de la molécula PKC-0 puede determinarse usando un anticuerpo específico para la forma fosforilada de la proteína PKC-0 (p.ej., anti-fosfo T538), que se encuentra disponible comercialmente. Alternativamente, el estado de fosforilación de la molécula PKC-0 puede determinarse por su movilidad en un gel, usando un anticuerpo que reconoce PKC-0 (independientemente del estado de fosforilación) para la detección. Alternativamente, el estado de activación de PKC-0 se puede determinar evaluando la actividad de quinasa de la molécula PKC-0 (Kupfer et al., Patente de EE.UU. n° 6.040.152), o evaluando la traslocalización a la membrana en el punto de contacto APC (Kupfer et al., Patente de EE.UU. n° 6.040.152). La determinación del estado de fosforilación/activación de PKC-0 también puede realizarse mediante métodos indirectos, p.ej., la detección de una actividad o evento posterior.

IV. Vectores de expresión recombinantes y células hospedantes

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas). Tal como se usa en la presente memoria, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN circular de cadena doble en el cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la que son introducidos (p.ej., vectores bacterianos que tiene un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (p.ej., vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedante tras introducción en la célula hospedante, y así son replicados junto con el genoma del hospedante. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo se encuentran en la forma de plásmidos. En la presente especificación, “plásmido” y “vector” pueden usarse de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector utilizada más habitualmente. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas formas adicionales de vectores de expresión, tal como vectores virales (p.ej., retrovirus con replicación deficiente, adenovirus y virus adeno-asociados), que dan lugar a funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedante, lo que significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedantes a usa para la expresión, que está ligada operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. En relación al vector de expresión recombinante, “ligado operativamente” pretende indicar que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de un modo que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p.ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedante cuando el vector es introducido en la célula hospedante). El término “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p.ej., señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185: 3-7. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en determinadas células hospedantes (p.ej., secuencias reguladoras específicas de tejido). Los especialistas en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedante que va a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedantes para producir así proteínas o péptidos, que incluyen proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en la presente memoria.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión de polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células hospedantes adecuadas se discuten con más detalle en Goeddel (1990), ver anterior. Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de promotor T7 y polimerasa de T7.

La expresión de polipéptidos en procariontes se realiza de la forma más habitual en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden un número de aminoácidos a un polipéptido codificado, normalmente al extremo amino del polipéptido recombinante. Dichos vectores de fusión típicamente sirven a tres propósitos: 1) aumentar la expresión del polipéptido recombinante; 2) aumentar la solubilidad del polipéptido recombinante; y 3) ayudar en la purificación del polipéptido recombinante actuando como ligando en una purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de ruptura proteolítica en la unión del grupo funcional de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante del grupo funcional de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa S, o proteína A, respectivamente, al polipéptido recombinante diana.

Los ejemplos de vectores de expresión adecuados de E. coli no de fusión inducibles incluyen pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) y pET 1 Id (Studier et al. (1990) Methods Enzymol. 185: 60-89). La expresión de gen diana del vector pTrc se basa en la transcripción de ARN polimerasa de un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión de gen diana del vector pET 11 d se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedantes BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago residente que alberga un gen T7 gn1 bajo control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptido recombinante en E. coli es expresar el polipéptido en bacterias hospedantes con una alteración en la capacidad para romper proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S. (1990) Methods Enzymol. 185: 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que va a ser insertado en un vector de expresión de tal modo que los codones individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente en E. co li(Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo mediante técnicas estándar de síntesis de ADN.

En otra realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), y picZ (Invitrogen Corp, San Diego, Calif.).

Alternativamente, los polipéptidos de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) se pueden expresar en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para expresión de polipéptidos en células de insecto cultivadas (p.ej., células Sf9) incluyen la serie pAc’ (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170: 31-39).

En otra realización adicional, un ácido nucleico de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) es expresado en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo son proporcionadas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores usados habitualmente son derivados de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados, tanto para células procarióticas como para células eucarióticas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

En otra realización, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente a un tipo de célula particular (p.ej., se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), los promotores específicos linfoideos (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), los promotores particulares de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), los promotores específicos de neurona (p.ej., el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), los promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916), y los promotores específicos de glándula mamaria (p.ej. el promotor de suero de leche; Patente de EE.UU. n° 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea n° 264.166). También se contemplan los promotores regulados en el desarrollo, por ejemplo, por los promotores hox de ratón (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374-379) y el promotor de alfafetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedantes en las que se introduce una molécula de ácido nucleico de la presente invención (p.ej., Tabla 1) dentro de un vector de expresión recombinante o una molécula de ácido nucleico que contiene secuencias que la permiten recombinarse homogéneamente en un sitio específico del genoma de la célula hospedante. Los términos “célula hospedante” y “célula hospedante recombinante” se usan de forma intercambiable en la presente memoria. Se entiende que dichos términos se refieren no solo a la célula sujeto particular sino también a la progenie o a la potencial progenie de dicha célula. Dado que se pueden producir determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a una mutación o a influencias ambientales, puede que dicha progenie, de hecho, no sea idéntica a la célula original, pero aun así se incluye dentro del alcance del término tal como se usa en la presente memoria.

Una célula hospedante puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) puede expresarse en células bacterianas tal como E. coli, en células de insecto, de levadura o en células de mamífero (tal como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los especialistas en la técnica conocen otras células hospedantes adecuadas.

Se puede introducir ADN de vector en células procarióticas o eucarióticas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se usan en la presente memoria, los términos “transformación” y “transfección” pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas para introducir ácido nucleico extraño (p.ej., ADN) en una célula hospedante, que incluyen la co-precipitación de fosfato de calcio o de cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes se pueden encontrar en Sambrook et al. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y en otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección usada, solo una fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Para identificar y seleccionar dichas integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (p.ej., de resistencia a antibióticos) en las células hospedantes junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse en una célula hospedante en el mismo vector que el que codifica un polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 o el polipéptido anticuerpo anti-PD-L1 y/o PD-L2, o puede introducirse en un vector separado. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección de fármaco (p.ej., las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Una célula hospedante de la invención, tal como una célula hospedante procariótica o eucariótica en cultivo, se puede usar para producir (es decir, expresar) un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas). Por consiguiente, la invención proporciona además métodos para producir un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluyen las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) usando las células hospedantes de la presente invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedante de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas)) en un medio adecuado de tal forma que se produce un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas). En otra realización, el método comprende además aislar un polipéptido de la presente invención (p.ej., que incluye las secuencias de la Tabla 1, o porciones de las mismas) a partir del medio o de la célula hospedante.

Las células hospedantes de la invención también pueden usarse para producir animales transgénicos no humanos, como se describe a continuación.

V. Conjugados de anticuerpos/Inmunotoxinas

En otro aspecto, la presente invención presenta anticuerpos anti-PD-L1/PD-L2 conjugados a un grupo funcional terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (p.ej., un inmunosupresor) o un radioisótopo. Cuando se conjugan a una citotoxina, estos conjugados de anticuerpo se denominan “inmunotoxinas”. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (p.ej., que las mate). Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agente terapéuticos incluyen, aunque sin limitación, antimetabolitos (p.ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p.ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p.ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p.ej., vincristina y vinblastina). Un anticuerpo de la presente invención puede conjugarse a un radioisótopo, p.ej., un yodo radioactivo, para generar compuestos radiofarmacéuticos citotóxicos para tratar un trastorno relacionado, tal como un cáncer.

Los anticuerpos anti-PD-L1/PD-L2 conjugados pueden usarse diagnósticamente o prognósticamente para monitorizar los niveles de polipéptido en un tejido como parte de un procedimiento de evaluación clínica, p.ej., para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede ser facilitada por el acoplamiento (es decir, la unión física) del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo protésico adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluyen luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S y 3H.

Los conjugados de anticuerpo de la invención pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada. El grupo funcional terapéutico no debe considerarse limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el grupo funcional de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, o toxina de la difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-gamma; o modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulante de colonia de granulocitos macrófagos (“GM-CSF”), factor estimulante de colonia de granulocitos (“G-CSF”), u otras citocinas o factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugas dicho grupo funcional terapéutico a anticuerpos son bien conocidas, véase, p.ej., Arnon et al., ''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pág. 24356 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pág. 62353 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pág. 475 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pág. 303 16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 11958 (1982).

VI. Usos y métodos de la Invención

Las composiciones descritas en la presente memoria (que incluyen anticuerpos de unión dual, así como derivados y conjugados de los mismos) se pueden usar en una variedad de aplicaciones diagnósticas o de pronóstico. Por ejemplo, muchas dolencias humanas podrían beneficiarse de una respuesta inmune modulada (p.ej., tanto la regulación al alza como la regulación a la baja de respuestas inmunes) y esto puede conseguirse de un modo eficiente modulando simultáneamente un entramado de rutas de señalización co-inmunoinhibidoras mediadas a través de PD-L1 y PD-L2 usando un único agente. Por tanto, se contemplan métodos para modular la unión y/o la señalización de rutas coinmunoinhibidoras mediadas por PD-L1 y PD-L2 (p.ej., que modulan una o más de las interacciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) unión de PD-L1 a PD-1; (b) unión de PD-L1 a B7-1; (c) unión de PD-L2 a PD-1; (d) unión de PD-L2 a RGMb; (e) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L1 a PD-1; (f) una señal coinmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L1 a B7-1; (g) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L2 a PD-1; y (h) una señal co-inmunoinhibidora mediada por la unión de PD-L2 a RGMb) usando las composiciones de la presente invención. Adicionalmente, se contemplan métodos para modular la actividad biológica de PD-L1 y PD-L2 usando las composiciones de la invención. En particular, las composiciones de la presente invención (p.ej., anticuerpos anti-PD-L1/PD-L2) descritas en la presente memoria son útiles para diagnosticar y pronosticar aplicaciones relacionadas a afecciones concretas mediadas por PD-L1 y PD-L2.

En algunas realizaciones, los anticuerpos se asocian a un componente o dispositivo para el uso de los anticuerpos en un ELISA o RIA. Los ejemplos no limitativos incluyen anticuerpos inmovilizados sobre superficies sólidas para uso en estos ensayos (p.ej., ligados y/o conjugados a una marca detectable basada en emisión de luz o radiación como se ha descrito anteriormente). En otras realizaciones, los anticuerpos se asocian a un dispositivo o tira para la detección de PD-L1 y/o PD-L2 mediante el uso de un ensayo inmunocromatográfico o inmunoquímico tal como un ensayo “sándwich” o competitivo. Los ejemplos adicionales de dichos dispositivos o tiras son los diseñados para hacer test en casa o para tests de puntos rápidos. Los ejemplos adicionales incluyen aquellos diseñados para el análisis simultáneo de múltiples analitos en una única muestra. Por ejemplo, un anticuerpo no marcado de la invención puede aplicarse a la “captura” de un polipéptido de PD-L1 y/o PD-L2 en una muestra biológica y los polipéptidos de PD-L1 y/o PD-L2 capturas (o inmovilizados) pueden unirse a una forma marcada de un anticuerpo de la presente invención para su detección. Los especialistas en la técnica conocen otras realizaciones estándar de inmunoensayos, que incluyen ensayos basados, por ejemplo, en inmunodifusión, inmunoelectroforesis, inmunohistopatología, inmunohistoquímica e histopatología.

1. Métodos de cribado

Un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de cribado, que incluyen ensayos no basados en células. En una realización, los ensayos proporcionan un método para identificar anticuerpos que modulan la interacción entre PD-L1/receptores de PD-L1 y/o PD-L2/receptores de PD-L2 (PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb). En otras realizaciones, los ensayos proporcionan un método para identificar anticuerpos que modulan la actividad biológica de PD-L1 y/o PD-L2.

En una realización, la invención se refiere a ensayos para cribar anticuerpos candidatos o de ensayo que se unen, o que modulan la actividad biológica de PD-L1 y/o PD-L2, p.ej., que modulan la capacidad del polipéptido para interaccionar con (p.ej., para unirse a) su pareja de unión cognada. En una realización, un método para identificar un anticuerpo para modular una respuesta inmune implica determinar la capacidad del anticuerpo para modular, p.ej., potenciar o inhibir, la interacción entre PD-L1/receptores de PD-L1 y/o PD-L2/receptores de PD-L2 (PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb).

En una realización, un ensayo es un ensayo sin células, que comprende poner en contacto PD-L1 o PD-L2, con un anticuerpo de ensayo y determinar la capacidad del anticuerpo de ensayo para modular (p.ej., estimular o inhibir) la interacción entre PD-L1/receptores de PD-L1 y/o PD-L2/receptores de PD-L2 (PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb). Se puede llevar a cabo la determinación de la modulación de la interacción entre PD-L1/receptores de PD-L1 y/o PD-L2/receptores de PD-L2 (PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb), p.ej., midiendo la unión directa o midiendo parámetros indirectos como se describe a continuación.

Por ejemplo, en un ensayo de unión directa, la proteína PD-L1 o PD-L2 (o sus respectivos polipéptidos o moléculas diana) pueden acoplarse con una marca de radioisótopo o enzimática de tal modo que la unión puede determinarse detectando la proteína o molécula marcada en un complejo. Por ejemplo, las dianas pueden ser marcadas con 125I, 35S, 14C o 3H, tanto directamente como indirectamente, y el radioisótopo se puede detectar haciendo un recuento de la emisión de radiactividad o mediante un recuento de centelleo. Alternativamente, las dianas pueden ser marcadas enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina o luciferasa, y la marca enzimática se puede detectar a través de la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.

La determinación de la interacción entre PD-L1/receptores y de PD-L1 y/o PD-L2/receptores de PD-L2 (PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb) también puede lograrse usando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) en tiempo real (Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705). Tal como se usa en la presente memoria, “BIA” es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcado de ninguno de los agentes interaccionantes (p.ej., BIAcore). Los cambios en el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR) se pueden usar como indicación de reacciones en tiempo real entre polipéptidos biológicos. Los polipéptidos o las moléculas pueden inmovilizarse en un chip BIAcore y los anticuerpos pueden ser evaluados para determinar la unión a los polipéptidos o moléculas inmovilizados. Un ejemplo de uso de tecnología BIA se describe en Fitz et al. (1997) Oncogene 15: 613.

En una o más realizaciones de los métodos de ensayo descritos anteriormente, puede ser deseable inmovilizar polipéptidos o moléculas para facilitar la separación de formas acomplejadas y formas no acomplejadas de una o de ambas proteínas o moléculas, así como para acomodar la automatización del ensayo. La unión de un anticuerpo de ensayo a una diana (p.ej., PD-L1 o PD-L2) se puede conseguir en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos no limitativos de dichos recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de micro-centrífuga. Las formas inmovilizadas de los anticuerpos de la presente invención también pueden incluir anticuerpos ligados a una fase sólida tal como un material poroso, microporoso (con un diámetro de poro medio inferior a aproximadamente un micrómetro) o macroporoso (con un diámetro de poro medido superior a aproximadamente 10 micrómetros), tal como una membrana, celulosa, nitrocelulosa o fibras de vidrio; una perla, tal como una fabricada en agarosa o poliacrilamida o látex; o una superficie de un plato, placa, o pocillo, tal como una fabricada en poliestireno. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o las dos proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, se pueden adsorber proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/PD-L1 o PD-L2, o proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/diana, sobre perlas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación de glutationa derivatizada, que a continuación son combinadas con el compuesto de ensayo, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación de complejo (p.ej., en condiciones fisiológicas de salinidad y pH). Después de la incubación, las perlas o los pocillos de placa de microtitulación son lavados para eliminar los componentes no ligados, la matriz es inmovilizada en el caso de perlas, se determina el complejo tanto directamente como indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz, y se puede determinar el nivel de unión 0 actividad de PD-L1 y/o PD-L2 usando técnicas estándar.

En una realización alternativa, la determinación de la capacidad de un anticuerpo de la invención para modular la interacción entre PD-L1/receptores de PD-L1 y PD-L2/receptores de PD-L2 (PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de p D-l2 a RGMb) se puede realizar determinando la capacidad del anticuerpo de ensayo para modular la actividad de un polipéptido o producto que actúa aguas debajo de PD-L1 y/o PD-L2, p.ej., señalización relacionada co-inmunoinhibidora.

En una realización alternativa, la determinación de la capacidad de un anticuerpo de la invención para modular la interacción entre PD-L1/receptores de PD-L1 y PD-L2/receptores de PD-L2 (PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de p D-l2 a RGMb) se puede realizar determinando la capacidad del anticuerpo de ensayo para modular la unión de una proteína de fusión de PD-1 -, B7-1 - o RGMb-Ig a una célula transfectada con PD-L1 o PD-L2.

Se puede usar un anticuerpo identificado como se describe en la presente memoria en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente memoria se puede usar en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad o los efectos secundarios del tratamiento con dicho anticuerpo. Alternativamente, se puede usar un anticuerpo identificado como se describe en la presente memoria en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho anticuerpo. Adicionalmente, esta invención se refiere a usos de anticuerpos identificados mediante los ensayos de cribados descritos anteriormente para tratamientos como los descritos en la presente memoria.

2. Medicina predictiva

La presente invención también pertenece al campo de la medicina predictiva en la que se emplean ensayos diagnósticos, ensayos prognósticos y ensayos clínicos de monitorización con fines prognósticos (predictivos) para tratar así a un individuo de forma profiláctica. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos diagnósticos para determinar el nivel de expresión y/o actividad de PD-L1 y/o PD-L2 o de fragmentos de los mismos, en el contexto de una muestra biológica (p.ej., sangre, suero, células o tejido) para determinar así si un individuo padece una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno, asociado a la expresión o actividad aberrante o no deseada de un biomarcador. La invención también proporciona ensayos prognósticos (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado a la expresión o actividad de un polipéptido o ácido nucleico biomarcador. Por ejemplo, se pueden evaluar las mutaciones de un gen biomarcador en una muestra biológica.

Dichos ensayos pueden usarse con fines prognósticos o predictivos para tratar de este modo profilácticamente a un individuo antes de la aparición o después de la recurrencia de un trastorno que se caracteriza o que está asociado a la expresión o actividad de un polipéptido, ácido nucleico, biomarcador.

Otro aspecto de la invención se refiere a la monitorización de la influencia de agentes (p.ej., fármacos, compuestos y moléculas pequeñas basadas en ácido nucleico) sobre la expresión o la actividad de PD-L1 y/o PD-L2, o fragmentos de los mismos, en ensayos clínicos. Estos y otros agentes se describen con más detalle en las siguientes secciones.

3. Ensayos diagnósticos

La presente invención proporciona, en parte, métodos, sistemas, y códigos para clasificar con precisión si una muestra biológica está asociada a una enfermedad o trastorno asociado a una expresión o actividad aberrante por parte de PD-L1 y/o PD-L2. En algunas realizaciones, la presente invención es útil para clasificar una muestra (p.ej., procedente de un sujeto) como está asociada a, o se encuentra en riesgo de, una enfermedad o trastorno mediado por PD-L1 y/o PD-L2 (conocidos como muestra de PD-L1 y/o muestra de PD-L2) usando un algoritmo estadístico y/o datos empíricos (p.ej., la presencia o el nivel de un PD-L1 y/o PD-L2).

Un ejemplo de método para detectar el nivel de expresión o de actividad de PD-L1 y/o PD-L2, o de los fragmentos de los mismos, y que por tanto es útil para clasificar si una muestra está asociada a una enfermedad o trastorno mediado por PD-L1 y/o PD-L2 o un subtipo clínico de los mismos, implica obtener una muestra biológica de un sujeto de ensayo y poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la presente invención capaz de detectar PD-L1 y/o PD-L2, de tal modo que se detecta el nivel de expresión o de actividad de PD-L1 y/o PD-L2 en la muestra biológica. En algunas realizaciones, se usa al menos un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, donde se pueden usar dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en combinación (p.ej., en ELISAs de sándwich) o en serie. En determinados casos, se puede usar un sistema clasificador estadístico de aprendizaje sencillo para clasificar una muestra como muestra de PD-L1 y/o muestra de PD-L2 en base a una predicción o valor de probabilidad y a la presencia o nivel de PD-L1 y/o PD-L2. El uso de un sistema clasificador estadístico de aprendizaje sencillo típicamente clasifica la muestra como muestra de PD-L1 y/o muestra de PD-L2 (p.ej., infección crónica), muestra con una sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y/o precisión global de al menos aproximadamente 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.

Los especialistas en la técnica conocen bien otros algoritmos estadísticos adecuados. Por ejemplo, los sistemas clasificadores estadísticos de aprendizaje incluyen una técnica algorítmica de aprendizaje de máquina de adaptación a conjuntos de datos complejos (p.ej., panel de marcadores de interés) y de toma de decisiones en base a dichos conjuntos de datos. En algunas realizaciones, se usa un sistema clasificador estadístico de aprendizaje sencillo tal como el árbol de clasificación (p.ej., bosque aleatorio). En otras realizaciones, se usa, preferiblemente en tándem, una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sistemas clasificadores estadísticos de aprendizaje. Los ejemplos de sistemas clasificadores estadísticos de aprendizaje incluyen, aunque sin limitación, los que usando aprendizaje inductivo (p.ej., árboles de decisión/clasificación tales como bosques aleatorios, árboles de clasificación y regresión (C&RT), árboles boosted, etc.), aprendizaje Correcto Aproximadamente Probablemente (PAC), aprendizaje conexionista (p.ej., redes neurales (NN), redes neurales artificiales (ANN), redes neuro difusas (NFN), estructuras de red, perceptrones tales como perceptrones multi-capa, redes multi-capa alimento-hacia-delante, aplicaciones de redes neurales, aprendizaje Bayesiano en redes de creencia, etc.), aprendizaje de refuerzo (p.ej., aprendizaje pasivo en un entorno conocido tal como aprendizaje ingenuo, aprendizaje dinámico adaptativo, y aprendizaje de diferencia temporal, aprendizaje pasivo en un entorno desconocido, aprendizaje activo en un entorno desconocido, funciones acción-valor de aprendizaje, aplicaciones de aprendizaje de refuerzo, etc.), y algoritmos genéticos y programación evolucionaria. Otros sistemas clasificadores estadísticos de aprendizaje incluyen máquinas de vector de soporte (p.ej., métodos Kernel), ranuras de regresión adaptativa multivariable (MARS), algoritmos de Levengerg-Marquardt, algoritmos de Gauss-Newton, mezclas de Gaussianas, algoritmos descendentes de gradiente, y cuantización de vector de aprendizaje (LVQ). En determinadas realizaciones, el método de la presente invención comprende además enviar los resultados de clasificación de la muestra de PD-L1 y/o la muestra de PD-L2 a un médico, p.ej., un gastroenterólogo o un médico de cabecera.

En otra realización, el método de la presente invención proporciona además un diagnóstico en la forma de una probabilidad de que el individuo tenga una afección o trastorno asociado a la expresión o actividad aberrante de PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, el individuo puede tener una probabilidad de aproximadamente 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o más de tener la afección o trastorno. En otra realización adicional, el método de la presente invención proporciona además una prognosis de la afección o trastorno en el individuo. En algunos casos, el método de clasificación de una muestra como muestra de PD-L1 y/o muestra de PD-L2 se basa además en los síntomas (p.ej., factores clínicos) del individuo del cual se ha obtenido la muestra. Los síntomas o el grupo de síntomas pueden ser, por ejemplo, diarrea, dolor abdominal, calambres, fiebre, anemia, pérdida de peso, ansiedad, depresión y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el diagnóstico de un individuo con una afección o trastorno asociado a la expresión o actividad aberrante de PD-L1 y/o PD-L2 va seguido de la administración al individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco útil para tratar uno o más síntomas asociados a la afección o trastorno (p.ej., agentes quimioterapéuticos).

En una realización, los métodos implican además obtener una muestra biológica de control (p.ej., una muestra biológica de un sujeto que no tiene una afección o trastorno mediado por PD-L1 y/o PD-L2), una muestra biológica del sujeto durante la remisión o antes de desarrollar una afección o trastorno mediado por PD-L1 y/o PD-L2, o una muestra biológica del sujeto durante el tratamiento para el desarrollo de una afección o trastorno mediado por PD-L1 y/o PD-L2.

4. Ensayos prognósticos

Los métodos diagnósticos descritos en la presente memoria pueden utilizarse además para identificar sujetos que tienen o que están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado a la expresión o actividad aberrante de PD-L1 y/o PD-L2, o un fragmento de los mismos. Tal como se usa en la presente memoria, el término “aberrante” incluyen los niveles de expresión o actividad de un biomarcador que se desvían de la expresión o actividad normal en un control.

Los ensayos descritos en la presente memoria, tal como los ensayos diagnósticos precedentes o los siguientes ensayos, pueden utilizarse para identificar un sujeto que tiene o que está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado a una desregulación de la actividad o la expresión de PD-L1 y/o PD-L2, tal como en el cáncer. Alternativamente, los ensayos prognósticos pueden utilizarse para identificar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con una desregulación de la actividad o la expresión de PD-L1 y/o PD-L2, tal como en el cáncer. Por tanto, la presente invención proporciona un método para identificar y/o clasificar una enfermedad asociada a la expresión o actividad aberrante de PD-L1 y/o PD-L2, o de un fragmento de los mismos. Adicionalmente, los ensayos prognósticos descritos en la presente memoria pueden usarse para determinar si a un sujeto se le puede administrar un agente (p.ej., un agonista, antagonista, peptidomimético, polipéptido, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro candidato de fármaco) para tratar una enfermedad o trastorno asociado a la expresión o actividad aberrante de un biomarcador. Por tanto, la presente invención proporciona métodos para determinar si un sujeto puede ser tratado de manear efectiva con un agente para una enfermedad asociada a la expresión o actividad aberrante de PD-L1 y/o PD-L2, en los que se obtiene una muestra de ensayo y se detecta la expresión o actividad de PD-L1 y/o PD-L2 (p.ej., donde un aumento o una reducción significativos del polipéptido biomarcador o de la expresión o actividad de ácido nucleico respecto a un control es diagnóstico de que se puede administrar al sujeto el agente para tratar un trastorno asociado a la expresión o actividad aberrante de PD-L1 y/o PD-L2). En algunas realizaciones, el aumento o reducción significativos de la expresión o actividad de biomarcador comprende al menos 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veces o más superior o inferior, respectivamente, al nivel de expresión o actividad del marcador en una muestra de control.

5. Monitorización de efectos durante los ensayos clínicos

La monitorización de la influencia de agentes (p.ej., fármacos) sobre la expresión o la actividad de PD-L1 y/o PD-L2 o un fragmento de los mismos (p.ej., la modulación de cáncer) puede aplicarse no solo en el cribado básico de fármacos, sino también en ensayos clínicos. Por ejemplo, se puede determinar la eficacia de un agente detectando una modulación (es decir, un aumento o una reducción) de la expresión y/o la actividad de PD-L1 y/o PD-L2 usando un anticuerpo de la presente invención, respecto a una referencia de control. En dichos ensayos clínicos, se puede usar la expresión y/o la actividad de PD-L1 y/o PD-L2 como “lectura” o marcador del fenotipo de una célula o afección particular.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para monitorizar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (p.ej., un agonista, antagonista, peptidomimético, polipéptido, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro fármaco) que incluye las etapas de (i) obtener una muestra pre-administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión y/o actividad de PD-L1 y/o PD-L2 o de fragmentos de los mismos en la muestra pre-administración; (iii) obtener una o más muestras post-administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de PD-L1 y/o PD-L2 o de fragmentos del mismo en las muestras post-administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de PD-L1 y/o PD-L2 o de fragmentos de los mismos en la muestra pre-administración con el del biomarcador en la muestra o muestras post-administración; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto de forma consecuente. Por ejemplo, puede ser deseable un aumento de la administración del agente para reducir la expresión o la actividad de PD-L1 y/o PD-L2 a niveles más bajos que los detectados. Según dicha realización, la expresión o la actividad de PD-L1 y/o PD-L2 pueden usarse como indicador de la eficacia de un agente, incluso en ausencia de una respuesta fenotípica observable.

6. Métodos de tratamiento

Las composiciones descritas en la presente memoria (que incluyen anticuerpos de unión dual y derivados y conjugados de los mismos) se pueden usar en una variedad de aplicaciones terapéuticas in vitro e in vivo (p.ej., regulando al alza y regulando a la baja la respuesta inmune). En una realización, los anticuerpos que bloquean la interacción entre PD-L1/receptores de PD-L1 y PD-L2/receptores de PD-L2 (p.ej., PD-L1 y PD-L2 (p.ej., (a) la unión de PD-L1 a PD-1; (b) la unión de PD-L1 a B7-1; (c) la unión de PD-L2 a PD-1; (d) la unión de PD-L2 a RGMb) pueden prevenir la señalización inhibidora. En una realización, los anticuerpos que bloquean la señal coestimuladora del ligando de PD-1 bloquean una señal coestimuladora a una célula inmune. Adicionalmente, la ligación de PD-L2 puede inducir la secreción de citocinas y la supervivencia de células dendríticas. Así, los anticuerpos que bloquean la ligación de PD-L2 pueden inhibir la supervivencia de células dendríticas y reducir la expresión de citocinas por parte de las células dendríticas, y a través de dichos mecanismos pueden inhibir una respuesta inmune. En particular, los anticuerpos descritos en la presente memoria son útiles para aplicaciones terapéuticas relacionadas con afecciones particulares mediadas por PD-L1 y PD-L2, tal como se discute, por ejemplo, en Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol.

26: 677; Sharpe et al., (2007) Nat. Immunol. 8: 239; Freeman et al. (2007) J. Exp. Med. 10: 2223.

En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son útiles para aplicaciones terapéuticas, además de para aplicaciones diagnósticas, prognósticas y de prevención, en relación a enfermedades neurodegenerativas que incluyen, aunque sin limitación, geriopsicosis, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, neuropatía diabética, síndrome de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis lateral amiotrófica, y neuropatía diabética.

En otra realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son útiles para aplicaciones terapéuticas, además de para aplicaciones diagnósticas, prognósticas y de prevención (tal como tratar y retrasar la aparición o la progresión de las enfermedades), para inhibir enfermedades que regulan al alza la reacción inmune, por ejemplo, asma, enfermedades autoinmunes (nefritis glomerular, artritis, enfermedad de tipo cardiomiopatía dilatada, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, eritematodes sistémico, artritis reumatoide crónica, esclerosis múltiple, psoriasis, dermatitis de contacto alérgica, polimiosis, paquiderma, periarteritis nudosa, fiebre reumática, vitíligo vulgaris, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de Behcet, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, dermatomiositis, miastenia grave, síndrome de Reiter, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, síndrome de Goospasture, enfermedad de esterilidad, hepatitis activa crónica, pénfigo, púrpura trombopénica autoinmune, y anemia hemolítica autoinmune, hepatitis crónica activa, enfermedad de Addison, síndrome anti-fosfolípido, alergia atópica, gastritis atrófica autoinmune, aclorhidra autoimune, enfermedad celíaca, síndrome de Cushing, dermatomiositis, lupus discoide, eritematosis, síndrome de Goodpasture, tiroiditis de Hashimoto, atrofia adrenal idiopática, trombocitopenia idiopática, diabetes dependiente de insulina, síndrome de Lambert-Eaton, hepatitis lupoide, algunos casos de linfopenia, enfermedad de tejido conectivo mixto, penfigoide, pénfigo vulgaris, enema pernicioso, uveítis facogénica, poliarteritis nudosa, autosíndromes poliglandulares, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerotizante primaria, síndrome de Raynaud, policondritis reincidente, síndrome de Schmidt, escleroderma limitado (o síndrome de cresta), oftalmia simpatética, lupus eritematoso sistémico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, tirotoxicosis, resistencia a insulina de tipo b, colitis ulcerativa y granulomatosis de Wegener).

En otra realización adicional, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son útiles para aplicaciones terapéuticas, además de para aplicaciones diagnósticas, prognósticas y de prevención (tal como el tratamiento y el retraso de la aparición o la progresión de las enfermedades) para una enfermedad infecciosa persistente (p.ej., enfermedades infecciosas virales que incluyen HPV, HBV, virus de hepatitis C (HCV), retrovirus tales como el virus de inmunodeficiencia humano (VIH-1 y VIH-2), virus del herpes tales como el virus de Epstein Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), HSV-1 y HSV-2, y virus de la gripe. Otros antígenos asociados a patógenos que pueden ser usados como se describe en la presente memoria son antígenos de diversos parásitos, que incluye malaria, preferiblemente péptidos de malaria basados en repeticiones de NANP. Adicionalmente, se incluyen enfermedades bacterianas, fúngicas y otras enfermedades patogénicas, tal como Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma y Vibriocholerae. Los ejemplos de especies incluyen Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichomonas vaginalis, Haemophilus vaginalis, Streptococcus sp. de Grupo B, Microplasma hominis, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus. Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Trichomonas foetus, Toxoplasma gondii, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Aspergillus fumigatus, Absidia ramosa, Trypanosoma equiperdum, Babesia caballi, Clostridium tetani, Clostridium botulinum; o, un hongo, tal como, p.ej., Paracoccidioides brasiliensis; u otro patógeno, p.ej., Plasmodium falciparum. También se incluyen los patógenos prioritarios del “National Institute of Allergy and Infectious Diseases” (NIAID). Estos incluyen agentes de Categoría A, tal como viruela mayor (viruela), Bacillus anthracis (anthrax), Yersinia pestis (peste), toxina de Clostridium botulinum (botulismo), Francisella tularensis (tularemia), filovirus (fiebre hemorrágica de Ébola, fiebre hemorrágica de Marburg), arenavirus (fiebre de Lassa), Junin (fiebre hemorrágica argentina) y virus relacionados ); agentes de Categoría B, tal como Coxiella burnetti (fiebre Q), Brucella species (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), alfavirus (encefalomielitis venezolana, encefalomielitis equina oriental y occidental), toxina ricina de Ricinus communis (semilla de ricino), toxina épsilon de Clostridium perfringens; enterotoxina B de Staphylococcus, Salmonella species, Shigella dysenteriae, Escherichia coli cepa O157:H7, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum; agentes de Categoría C, tal como virus nipah, hantavirus, virus de fiebre hemorrágica transmitida por garrapata, virus de encefalitis transmitida por garrapata, fiebre amarilla, y tuberculosis resistente a multifármacos; helmintos, tal como esquistosomas y tenias; y protozoo, tal como Leishmania (p.ej., L. mexicana) y Plasmodium.

En otra realización adicional, los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son útiles para aplicaciones terapéuticas, además de para aplicaciones diagnósticas, prognósticas y de prevención en relación al rechazo de injerto de órganos, la enfermedad de injerto-contra-hospedante (GVHD), enfermedad alérgica, y enfermedades causadas por la atenuación de reacciones inmunes mediadas por PD-L1 y PD-L2.

En algunas realizaciones, se desea una regulación a la baja de las respuestas inmunes. Por ejemplo, la respuesta inmune puede ser regulada a la baja usando anticuerpos anti-PD-L1/PD-L2 que bloquean la coestimulación por un ligando de PD-1 tal como PD-L1, o que promueven la unión de PD-L1 y/o PD-L2 con PD-1 (p.ej., sin afectar o manteniendo la inhibición de la coestimulación por parte del ligando de PD-1).

En una realización de la invención, se induce la tolerancia contra antígenos específicos mediante la co-administración de un antígeno con un anticuerpo que bloquea la coestimulación mediada por B7 y/o mediada por ligando de PD-1. Por ejemplo, se puede inducir tolerancia a proteínas específicas. En una realización, se pueden inhibir las respuestas inmunes a alérgenos, o a proteínas extrañas para las que no es deseable una respuesta inmune. Por ejemplo, los pacientes que reciben Factor VIII con frecuencia generan anticuerpos contra dicho factor de coagulación. La co administración de un anticuerpo que bloquea una señal coestimuladora mediada por B7 y/o mediada por ligando de PD-1 o un anticuerpo que estimula una señal inhibidora mediada por CTL4A, PD-1 y/o RGMb, en combinación con factor recombinante VI 11 (o ligado físicamente a Factor VIII, p.ej., mediante reticulación) puede dar como resultado una regulación a la baja de la respuesta inmune.

En otra realización, los métodos de tratamiento pueden usar adicionalmente agentes que bloquean una actividad de rutas coestimuladoras, tal como la de otro antígeno de linfocito B como B7-1, B7-2 o B7-3) para regular aún más a la baja las respuestas inmunes. Se pueden combinar dos agentes separados que regulan a la baja respuestas inmunes en una única composición, o pueden administrarse por separado (simultáneamente o secuencialmente) para regular a la baja de forma más efectiva respuestas inmunes mediadas por células inmunes en un sujeto. Adicionalmente, se puede usar una cantidad terapéuticamente activa de uno o más de los anticuerpos sujetos, en conjunción con otros reactivos de modulación a la baja para influir en las respuestas inmunes. Los ejemplos de otros reactivos inmunomoduladores incluyen, sin limitación, anticuerpos que bloquean una señal coestimuladora (p.ej., contra CD28 o ICOS), anticuerpos que actúan como agonistas de CTLA4, y/o anticuerpos contra otros marcadores de células inmunes (p.ej., contra CD40, contra ligando de CD40 o contra citocinas), proteínas de fusión (p.ej., CTLA4-Fc), y fármacos inmunosupresores (p.ej., rapamicina, ciclosporina A o FK506). En algunas realizaciones, un anticuerpo de bloqueo dual PD-L1/PD-L2 de la presente invención puede combinarse con terapia de radiación y/o un inhibidor de histona desacetilasa (p.ej., vorinostat, romidepsina, panobinostat, ácido valproico, belinostat, mocetinostat, abexinostat, entinostat, SB-939, resminostat, givinostat, quisinostat, etc.) para potenciar la eficacia terapéutica.

La regulación a la baja o la prevención de la coestimulación de ligando de PD-1, o la promoción de una interacción entre un ligando de PD-1 y PD-1 es útil para regular a la baja la respuesta inmune, p.ej., en situaciones de trasplante de tejido, piel y órgano, en la enfermedad de injerto-contra-hospedante (GVHD), o en enfermedades inflamatorias tales como el lupus sistémico eritematoso, y la esclerosis múltiple. Por ejemplo, el bloqueo de la función celular inmune da como resultado una menor destrucción de tejido en el trasplante de tejidos. Típicamente, en el trasplante de tejidos, el rechazo del trasplante se inicia a través de su reconocimiento como extraño para las células inmunes, seguido de una reacción inmune que destruye el trasplante. La administración de un anticuerpo que inhibe la coestimulación de ligando de PD-1 solo o en conjunción con otro agente modulador a la baja, antes o en el momento del trasplante, puede promover la generación de una señal inhibidora. Adicionalmente, la inhibición de señales coestimuladoras de ligando de PD-1, o la promoción de un ligando de PD-1 o de señales inhibidoras de PD-1, también puede ser suficiente para energizar las células inmunes, induciendo de este modo tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo mediante el bloqueo de una señal coestimuladora mediada por ligando de PD-L1 puede evitar la necesidad de una administración repetida de dichos reactivos de bloqueo.

Para alcanzar una inmunosupresión o tolerancia suficientes en un sujeto, también puede ser deseable bloquear la función coestimuladora de otros polipéptidos. Por ejemplo, puede ser deseable bloquear la función de B7-1, B7-2, o B7-1 y B7-2, administrando una forma soluble de una combinación de péptidos que tienen una actividad de cada uno de dichos antígenos, bloqueando los anticuerpos contra dichos antígenos o bloqueando moléculas pequeñas (por separado o juntos en una única composición) antes o en el momento del trasplante. Alternativamente, puede ser deseable promover la actividad inhibidora de un ligando de PD-1 o PD-1 e inhibir una actividad coestimuladora de B7-1 y/o B7-2. Otros agentes de modulación a la baja que pueden usarse en conexión con los métodos de modulación a la baja de la invención incluyen, por ejemplo, agentes que transmiten una señal inhibidora a través de CTLA4, formas solubles de CTLA4, anticuerpos que activan una señal inhibidora a través de CTLA4, bloqueando anticuerpos contra otros marcadores de célula inmune o formas solubles de otros pares receptor ligando (p.ej., agentes que alteran la interacción entre CD40 y el ligando de CD40 (p.ej., anticuerpos anti-ligando de CD40)), anticuerpos contra citocinas, o fármacos inmunosupresores.

La regulación a la baja de respuestas inmunes es útil para tratar una serie de afecciones, p.ej., en situaciones de trasplante de tejido, piel y órgano, en la enfermedad de injerto-contra-hospedante (GVHD), o en enfermedades autoinmunes tales como el lupus sistémico eritematoso, la esclerosis múltiple, alergia, un trasplante, respuesta de hipersensibilidad, un trastorno que requiere un aumento de la producción o la función de células T CD4+, un trastorno que requiere una eficacia de vacunación mejorada, un trastorno que requiere un aumento de la producción o la función de células T reguladoras, y un trastorno que requiere una eficacia de vacunación mejorada. Por ejemplo, el bloqueo de la función celular inmune da como resultado una menor destrucción de tejido en el trasplante de tejido. Típicamente, en los trasplantes de tejido, el rechazo del trasplante se inicia a través de su reconocimiento como extraño por parte de las células inmunes, seguido de una reacción inmune que destruye el trasplante. La administración de un agente descrito en la presente memoria antes o en el momento del trasplante puede promover la generación de una señal inhibidora. Adicionalmente, la inhibición también puede ser suficiente para energizar las células inmunes, induciendo de este modo tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo evita la necesidad de una administración repetida de dichos agentes bloqueantes.

La regulación a la baja de respuestas inmunes también es útil para tratar enfermedades autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de una activación inapropiada de las células inmunes que son reactivas contra el propio tejido y que promueven la producción de citocinas y autoanticuerpos implicados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células inmunes autorreactivas puede reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. La administración de los agentes descritos en la presente memoria puede ser útil para prevenir la generación de autoanticuerpos o citocinas que pueden estar implicadas en el proceso de enfermedad. Adicionalmente, los agentes que promueven una función inhibidora mediada por la interacción entre RGMb y PD-L2 pueden inducir tolerancia específica de antígeno de las células inmunes autorreactivas, lo que podría conducir a un alivio a largo plazo de la enfermedad. La eficacia de los reactivos para prevenir o aliviar trastornos autoinmunes puede determinarse usando una serie de modelos animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Los ejemplos incluyen la encefalitis autoinmune experimental de ratón, el lupus sistémico eritematoso en ratones MRL/lpr/lpr o en ratones híbridos NZB, la artritis de colágeno autoinmune de ratón, la diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y la miastenia grave experimental en ratones (ver, p.ej., Paul ed., FundamentalImmunology, Raven Press, Nueva York, Tercera Edición 1993, capítulo 30).

La inhibición de la activación de células inmunes también es útil terapéuticamente en el tratamiento de la alergia y de reacciones alérgicas, p.ej., a través de la inhibición de la producción de IgE. Las reacciones alérgicas pueden ser sistémicas o locales en naturaleza, dependiendo de la ruta de entrada del alérgeno y del patrón de deposición de IgE en los mastocitos o basófilos. Por tanto, la inhibición de las respuestas alérgicas mediadas por células inmunes local o sistémicamente mediante la administración de un agente descrito en la presente memoria promueve una función inhibidora mediada por RGMb y PD-L2.

La inhibición de la activación de células inmunes también puede ser importante terapéuticamente en infecciones parasitarias y virales de células inmunes. Por ejemplo, en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la replicación viral es estimulada por la activación de células inmunes. La modulación de estas interacciones puede dar como resultado la inhibición de la replicación viral y con ello aliviar el curso del SIDA. La modulación de estas interacciones también puede ser útil para promover el mantenimiento del embarazo. Las mujeres con riesgo de aborto espontáneo (p.ej., aquellas que han tenido previamente un aborto espontáneo o aquellas que han tenido dificultades para la concepción) debido a un rechazo inmunológico del embrión o feto pueden ser tratadas con agentes que modulan estas interacciones.

La regulación a la baja de una respuesta inmune modulando la interacción entre RGMb y PD-L2 también puede ser útil para tratar un ataque autoinmune de tejidos autólogos. Por lo tanto, entra dentro del alcance de la invención modular afecciones exacerbadas por un ataque autoinmune, tal como los trastornos autoinmunes, así como afecciones tales como la enfermedad cardíaca, el infarto de miocardio y la aterosclerosis.

También es útil terapéuticamente el bloqueo simultáneo de la interacción de PD-L1 y PD-L2 con receptores coinmunoinhibidores como medio de regular al alza una respuesta inmune. La regulación al alza de las respuestas inmunes puede ser en la forma de potenciar una respuesta inmune existente o de activar una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, potenciar una respuesta inmune usando las composiciones y métodos objeto de la presente es útil en casos de infecciones con microbios (p.ej., bacterias, virus o parásitos). En una realización, se usa un anticuerpo que bloquea la interacción de PD-L1 y PD-L2 con receptores co-inmunoinhibidores para potenciar la respuesta inmune. Dicho anticuerpo (p.ej., un anticuerpo de bloqueo (no activante) que bloquea la unión de PD-L1 y PD-L2 a PD-1 con o sin bloquear la unión de PD-L2 a RGMb) es útil terapéuticamente en las situaciones en las que sería beneficiosa la regulación al alza de las respuestas de anticuerpo y mediadas por células (p.ej., para tratar el cáncer, una enfermedad infecciosa (p.ej., de bacterias, virus o parásitos), una infección parasitaria, asma asociado a una tolerancia afectada de las vías respiratorias, una enfermedad neurológica y una enfermedad inmunosupresora). Los ejemplos de trastornos incluyen enfermedades cutáneas virales, tal como Herpes o Herpes Zóster, en cuyo caso dicho agente puede administrarse tópicamente sobre la piel. Adicionalmente, las enfermedades virales sistémicas, tal como la gripe, el resfriado común y la encefalitis, podrían ser aliviadas por la administración sistémica de dichos agentes.

Alternativamente, las respuestas inmunes se pueden potenciar en un paciente infectado a través de una estrategia ex vivo, por ejemplo, retirando células inmunes del paciente, poniendo en contacto las células inmunes in vitro con un agente que modula la interacción entre RGMb y PD-L2, y reintroduciendo las células inmunes estimuladas in vitro en el paciente.

En determinados casos, puede ser deseable administrar además otros agentes que regulan al alza las respuestas inmunes, por ejemplo, formas de otros miembros de la familia B7 que transducen señales a través de receptores coestimuladores, a fin de aumentar adicionalmente la respuesta inmune.

Los agentes que regulan al alza una respuesta inmune pueden usarse profilácticamente en vacunas contra varios polipéptidos (p.ej., polipéptidos derivados de patógenos). La inmunidad contra un patógeno (p.ej., un virus) puede inducirse vacunando con una proteína viral junto con un agente que regula al alza una respuesta inmune, en un adyuvante apropiado.

En otra realización, la regulación al alza o la potenciación de una función de respuesta inmune, tal como se describe en la presente memoria, es útil para inducir inmunidad tumoral. En otra realización, la respuesta inmune puede ser estimulada mediante los métodos descritos en la presente memoria, de tal modo que se supera una tolerancia, eliminación clonal y/o agotamiento (p.ej., agotamiento de células T) preexistentes. Por ejemplo, las respuestas inmunes contra antígenos para los que el sujeto no puede montar una respuesta inmune significativa, p.ej., para un antígeno autólogo, tal como antígenos específicos de un tumor, se puede inducir administrando los agentes apropiados descritos en la presente memoria que regulan al alza la respuesta inmune. En una realización, se puede co-administrar un antígeno autólogo, tal como un antígeno específico de tumor. En otra realización, se puede estimular una respuesta inmune contra un antígeno (p.ej., un antígeno autólogo) para tratar un trastorno neurológico. En otra realización, los agentes objeto de la presente pueden usarse como adyuvantes para activar respuestas contra antígenos extraños en el proceso de inmunización activa.

En una realización, se obtienen células inmunes de un sujeto y se cultivan ex vivo en presencia de un agente como se describe en la presente memoria, para expandir la población de células inmunes y/o potenciar la activación de células inmunes. En una realización adicional, las células inmunes son administradas a continuación a un sujeto. Las células inmunes pueden ser estimuladas in vitro, por ejemplo, proporcionando a las células inmunes una señal de activación primaria y una señal coestimuladora, como es conocido en la técnica. También se pueden usar varios agentes para coestimular la proliferación de células inmunes. En una realización, se cultivan células inmunes ex vivo según el método descrito en la solicitud PCT n° WO 94/29436. El polipéptido coestimulador puede ser soluble, estar unido a una membrana celular, o unido a una superficie sólida, tal como una perla.

En otra realización adicional, los agentes descritos en la presente memoria útiles para regular al alza respuestas inmunes pueden ser además ligados, o unidos operativamente, a toxinas usando técnicas conocidas en la técnica, p.ej., reticulación o mediante técnicas de ADN recombinantes. Dichos agentes pueden dar como resultado la destrucción celular de las células deseadas. En una realización, una toxina puede conjugarse a un anticuerpo, tal como un anticuerpo biespecífico. Dichos anticuerpos son útiles para atacar una población de células específica, p.ej., usando un marcador encontrado solo en un determinado tipo de célula, p.ej., una célula que expresa RGMb y/o PD-L2. La preparación de inmunotoxinas es, en general, bien conocida en la técnica (véase, p.ej., la Patente de EE.UU. n° 4.340.535 y el documento EP 44167). Se conocen numerosos tipos de ligandos que contienen puentes de disulfuro que pueden ser empleados con éxito para conjugar el grupo funcional de la toxina con un polipéptido. En una realización, se prefieren los ligandos que contienen un puente de disulfuro que está “impedido” estéricamente, debido a su mayor estabilidad in vivo, previniendo de este modo la liberación del grupo funcional toxina antes de la unión al sitio de acción. Se conoce una amplia variedad de toxinas que pueden ser conjugadas a polipéptidos o anticuerpos de la invención. Los ejemplos incluyen: numerosas toxinas útiles derivadas de plantas, hongos o incluso bacterias, que, a modo de ejemplo, incluyen varias toxinas de cadena A, particularmente cadena A de ricina, proteínas desactivantes de ribosoma tales como saporina o gelonina, a-sarcina, aspergilina, restrictocina, ribonucleasas, tal como ribonucleasa placentaria, angiogénica, toxina de la difteria y exotoxina de Pseudomonas, etc. Un grupo funcional toxina preferido para el uso en relación con la invención es la toxina de cadena A que ha sido tratada para modificar o eliminar residuos de carbohidrato, cadena A desglicosilada (Patente de EE.UU. 5.776.427). La infusión de uno o de una combinación de dichos agentes citotóxicos (p.ej., fusiones de ricina) en un paciente puede dar como resultado la muerte de las células inmunes.

7. Kits

La presente invención también abarca kits para detectar polipéptidos de PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, el kit puede comprender al menos un anticuerpo anti-PD-L1/PD-L2 de la presente invención y/o reactivos de control (p.ej., patrones de proteínas PD-L1 y/o PD-L2) en un recipiente adecuado.

Un kit de la presente invención también puede incluir materiales de instrucción que describen el uso del kit o de un anticuerpo de la invención descrita en un método de la invención descrita tal como se proporciona en la presente memoria. Un kit también puede incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la cual se ha diseñado el kit. Por ejemplo, un kit puede contener adicionalmente medios para detectar la etiqueta (p.ej., sustratos enzimáticos para etiquetas enzimáticas, conjuntos de filtros para detectar etiquetas fluorescentes, etiquetas secundarias apropiadas tal como una anti-ratón-HRP de oveja, etc.) y los reactivos necesarios para los controles (p.ej., muestras biológicas de control o patrones de proteína PD-L1 y/o PD-L2). Un kit puede incluir adicionalmente tampones y otros reactivos reconocidos para el uso en un método de la invención descrita. Los ejemplos no limitativos incluyen agentes para reducir la unión no específica, tal como una proteína portadora o un detergente.

VII. Administración de agentes

Los agentes inmunomoduladores de la invención se administran a los sujetos en una forma biológicamente compatible para la administración farmacéutica in vivo, tanto para potenciar como para suprimir respuestas inmunes mediadas por células inmunes. Por “forma biológicamente compatible adecuada para administración in vivo" se pretende indicar una forma de la proteína que se va a administrar en la que cualesquier efectos tóxicos son compensados por los efectos terapéuticos de la proteína. El término “sujeto” pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmune, p.ej., mamíferos. Los ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. La administración de un agente como el descrito en la presente memoria puede ser en cualquier forma farmacológica que incluye una cantidad terapéuticamente activa de un agente solo o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La administración de una cantidad terapéuticamente activa de la composición terapéutica de la presente invención se define como una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un agente puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del péptido para activar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosis se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

Los agentes de la invención descrita en la presente memoria pueden administrarse de un modo conveniente tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo puede recubrirse con un material para proteger al compuesto de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar al compuesto. Por ejemplo, para la administración de agentes, por ruta diferente a la administración parenteral, puede ser deseable recubrir el agente, o co-administrar el agente, con un material para prevenir su inactivación.

Se puede administrar un agente a un individuo en un vehículo, diluyente o adyuvante apropiado, co-administrado con inhibidores enzimáticos o en un vehículo apropiado tal como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones salinas y disoluciones acuosas tamponadas. Adyuvante se usa en su más amplio sentido e incluye cualquier compuesto inmunoestimulante tal como interferón. Los adyuvantes contemplados en la presente memoria incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos tales como polioxietilen oleil éter y n-hexadecil polietilén éter. Los inhibidores enzimáticos incluyen inhibidor de tripsina pancreáticas, diisopropilfluorofosfato (DEEP) y trasylol. Los liposomas incluyen emulsiones de agua-en-aceite-en-agua, así como liposomas convencionales (Sterna et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

El agente también puede administrarse parenteralmente o intraperitonealmente. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilén glicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, dichas preparaciones pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas de agentes adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición preferiblemente será estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista facilidad para su manejo en jeringa. Preferiblemente será estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conservará contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilén glicol, y polietilén glicol líquido, y similares), y las mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr con diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un agente de la invención (p.ej., un anticuerpo, péptido, proteína de fusión o molécula pequeña) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno, o con una combinación, de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de una esterilización por filtración. De forma general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los ingredientes adicionales requeridos de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado a vacío y el secado por congelación, que dan lugar a un polvo del agente más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución del mismo previamente esterilizada por filtración.

Cuando el agente está protegido de forma adecuada, tal como se ha descrito anteriormente, la proteína puede administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable. Tal como se usa en la presente memoria, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en caso de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. “Forma de dosis unitaria”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas acondicionadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos en tratamiento; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención viene dictada por, y es directamente dependiente de, (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr; y (b) las limitaciones inherentes de la técnica de formulación de compuestos tales como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

En una realización, un agente de la invención es un anticuerpo. Tal como se define en la presente memoria, una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo (es decir, una dosis efectiva) oscila entre aproximadamente 0,001 y 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,01 y 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 10 mg/kg, 2 y 9 mg/kg, 3 y 8 mg/kg, 4 y 7 mg/kg o 5 y 6 mg/kg de peso corporal. El especialista en la técnica apreciará que determinados factores pueden influir en la dosis requerida para tratar de forma efectiva a un sujeto, que incluyen, aunque sin limitación, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto es tratado con anticuerpo en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante entre aproximadamente 1 y 10 semanas, preferiblemente entre 2 y 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. Cabe destacar también que la dosis efectiva de anticuerpo usada para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el curso de un tratamiento particular. Como consecuencia de los resultados de ensayos diagnósticos se pueden producir cambios de dosis.

Esta invención se ilustra adicionalmente a través de los siguientes ejemplos, que no deberían ser considerados como limitativos. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud, así como las Figuras, quedan incorporadas a la presente memoria a modo de referencia. En los siguientes Ejemplos se describen otras realizaciones de la presente invención. La presente invención se ilustra adicionalmente a través de los siguientes ejemplos, que no deberían ser considerados como adicionalmente limitativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Descubrimiento y caracterización de anticuerpos que bloquean las interacciones de PD-L1 y PD-L2 con PD-1

El dominio extracelular de PD-L1 o PD-L2 humanos, fusionado cada uno a región constante de IgG2a de ratón (PD-L1-mIgG2a y PD-L2-mIgG2a, respectivamente), se usaron como inmunógenos. Se inmunizaron ratones hembra BALB/c o C57BL/6 de bloqueo dual PD-L1/PD-L2 (Bu et al. (2011) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31(5): 1100-7) usando protocolos de inmunización tradicional y de inmunización rápida en sitios múltiples (RIMMS).

Inmunización tradicional

El protocolo de inmunización tradicional utilizó ratones BALB/c de bloqueo dual e inmunización con PD-L2-mIgG2a en adyuvante de Freund completo (CFA) en el día 1, seguido de PD-L2-mIgG2a en adyuvante de Freund incompleto (IFA) en los días 15 y 29, seguido de inmunización con PD-L1-mIgG2a en IFA en los días 43 y 57. Se evaluó el título en el día 67 y se inyectó a los animales proteínas de dominio extracelular de PD-L1 y PD-L2 marcadas con oligohistidina en el día 74. Se recolectaron esplenocitos y se llevaron a cabo las fusiones en el día 78.

Los hibridomas se formaron usando fusión mediada por PEG con células de mieloma de ratón SP 2/0 como pareja de fusión. Los hibridomas fueron llevados a placas multipocillo con una densidad clonal sobre capas cebadoras de fibroblasto de pulmón diploide humano MRC-5 y se cultivaron en medio HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina, ATCC 69x), a continuación fueron llevados gradualmente a medio HT (ATCC 71x). Los hibridomas fueron cribados en términos de su unión a PD-L1, PD-L2 y un antígeno irrelevante usando un ensayo de tinción basado en FACS.

Las secuencias correspondientes a los anticuerpos monoclonales, tal como los anticuerpos monoclonales 1B9 y 4H1, se proporcionan en la Tabla 1. De forma resumida, el dominio variable de las cadenas ligeras y pesadas de los mAbs fue secuenciado y se proporcionan las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) del mismo. La numeración se muestra según las posiciones de ácido nucleico y los correspondientes residuos de aminoácido, por ejemplo correspondientes a las CDRs, se pueden identificar fácilmente en base a las traducciones proporcionadas.

Después de la subclonación, los hibridomas 1B9 y 4H1 procedentes de la estrategia de inmunización tradicional (ahora designados 1B9.2E11.3 y 4H1.G10.15, respectivamente) fueron caracterizados adicionalmente en un ensayo de tinción basado en FACS adicional. Los sobrenadantes de hibridoma fueron mezclados con células 300.19 que expresan PD-L1 o PD-L2 humanos o con células 300.19 no transfectadas, y se incubaron con agitación a 4°C durante 30 minutos. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación, lavadas con PBS con un 2% de suero bovino fetal (FBS), y entonces fueron incubadas con un anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra marcado con ficoeritrina (PE) con agitación a 4°C durante 30 minutos. Las células fueron recolectadas nuevamente mediante centrifugación, se lavaron y se preservaron en PBS con un 2% de formaldehído antes del análisis FACS. Los controles fueron un anticuerpo de control de isotipo (MOPC31C) y uno sin anticuerpo (“Blanco”). Los resultados (intensidad de fluorescencia media, o MFI) se resumen en la Tabla 2; nótese que en este ensayo, la MFI es proporcional a la unión de anticuerpo.

Tabla 2

Se llevaron a cabo ensayos de unión similares a los descritos para los resultados experimentales mostrados en la Tabla 2 usando una variedad de títulos de anticuerpo monoclonales con controles negativos adicionales. Los resultados se muestran en la Tabla 3 y dichos resultados confirman los resultados mostrados en la Tabla 2.

Tabla 3

Células 300 ue ex resan PD-L1 humano

Células 300 ue ex resan PD-L2 humano

Células 300 de control ne ativo

1 B9.2E11.3 y 4H1.G10.15 también fueron caracterizados usando un ensayo que mide el bloqueo de la unión de PD-L1/PD-1 o de PD-L2/PD-1, usando un ensayo basado en FACS. Los anticuerpos se mezclaron con células 300.19 que expresan PD-L1 humano o PD-L2 humano y se incubaron con agitación a 4°C durante 30 minutos. A continuación, las células fueron incubadas con agitación a 4°C durante 30 minutos con proteína de fusión de ectodominio de PD-1/IgG 1 humana. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación, lavadas con PBS con un 2% de suero bovino fetal (FBS). La unión de PD-1/PD-L1 o PD-1/PD-L2 se detectó mediante incubación con un anticuerpo de IgG anti-humano de cabra marcado con PE (absorbido para eliminar la reactividad con Ig de ratón) con agitación a 4°C durante 30 minutos. Las células se recolectaron nuevamente mediante centrifugación, se lavaron y a continuación se preservaron en PBS con un 2% de formaldehído antes del análisis FACS. Los controles fueron un anticuerpo de control de isotipo (MOPC31C) y un control PD-1(-) (sin proteína de fusión de ectodominio de PD-1/IgG1 humana). Los resultados se resumen en la Tabla 4; nótese que en este ensayo la MFI es inversamente proporcional al bloqueo de la unión de PD-1/PD-L.

Tabla 4

Se llevaron a cabo ensayos de unión competitiva similares a los descritos para los resultados experimentales mostrados en la Tabla 4 usando una variedad de títulos de anticuerpos monoclonales y con controles negativos adicionales. Los resultados se muestran en la Tabla 5 y estos resultados confirman los resultados mostrados en la Tabla 4.

Tabla 5

Células 300 ue ex resan PD-L1 humano

Células 300 ue ex resan PD-L2 humano

Adicionalmente, se evaluó la capacidad de los anticuerpos monoclonales de unión solo a PD-L1 y de unión dual para bloquear la unión de B7-1 humana a PD-L1 humano según los análisis FACS descritos para los resultados experimentales mostrados en la Tablas 4 y 5. Resumidamente, se pre-incubaron células 300-hPD-L1 con los mAbs durante 30 minutos. Se añadió la proteína de fusión de B7-1 humana-IgG humana (R&D Systems) a una concentración de 1 pg/mL y se incubó durante 30 minutos con un único post-lavado. Se añadió IgG-PE anti-humano de cabra Fab2 absorbido en Ig de ratón (Southern Biotech 2043-09) a una concentración de 2,5 pg/mL durante 30 minutos y a continuación se lavó dos veces. Los resultados mostrados en la Tabla 6 demuestran que los anticuerpos 1B9 y 4H1 bloquean la unión de B7-1 a PD-L1.

Tabla 6

Inmunización RIMMS

Se inmunizaron ratones B16 según un protocolo RIMMS. Los ratones fueron inmunizados con PD-L1-mIgG2a y/o PD-L2-mIgG2a en adyuvante mediante inyección subcutánea/intraperitoneal (SC/IP) o en la planta de la pata como se ha descrito en la Tabla 7. Se evaluó el título en el día 18 y se recolectaron esplenocitos para las fusiones en el día 21.

Tabla 7

Día PD-L1 PD-L2 Adyuvante Tipo de inyección

1 - 100 pg CFA SC/IP

1 - 5 pg Alum Planta de la pata

4 25 pg 100 pg PBS SC/IP

4 5 pg 5 pg Alum Planta de la pata

6 25 pg 50 pg IFA SC/IP

6 5 pg 5 pg Alum Planta de la pata

8 50 pg 50 pg PBS SC/IP

8 5 pg 5 pg Alum Planta de la pata

11 50 pg 50 pg IFA SC/IP

11 5 pg 5 pg Alum Planta de la pata

13 50 pg 25 pg PBS SC/IP

13 5 pg 5 pg Alum Planta de la pata

15 100 pg 25 pg IFA SC/IP

15 5 pg 5 pg Alum Planta de la pata

18 100 pg - PBS SC/IP

18 5 pg - Alum Planta de la pata

Las fusiones se llevaron a cabo como se ha descrito para la estrategia de inmunización tradicional, y los sobrenadantes de hidriboma fueron cribados en términos de unión a PD-L1 y PD-L2.

El ensayo de cribado evaluó la unión de sobrenadantes a una mezcla de células pre-B de ratón 300.19, células 300.19 que expresan PD-L1 humano y células 300.19 que expresan PD-L2 humano (en una proporción de aproximadamente 20%, 40%, 40%, respectivamente). Los anticuerpos (sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos de control) fueron incubados con las mezclas celulares con agitación a 4°C durante 30 minutos, a continuación las células fueron recolectadas mediante centrifugación, lavadas con PBS con un 2% de suero bovino fetal (FBS) e incubadas con un anticuerpo de Ig anti-ratón de cabra marcado con ficoeritrina (PE) con agitación a 4°C durante 30 minutos. Las células fueron recolectadas nuevamente mediante centrifugación, lavadas y después preservadas en PBS con un 2% de formaldehído antes del análisis de FACS. Los controles fueron (a) un anticuerpo específico de PD-L1 humano, (b) un anticuerpo específico de PD-L2 humano, (c) una mezcla de los anticuerpos anti-PD-L1 y PD-L2, y un control de isotipo (MOPC31C).

Los datos de FACS fueron analizados dibujando una puerta (“células”) alrededor de las células viables - “células, fluorescencia media total” muestra su intensidad de tinción. Se fijó una puerta (“P1 ”) para analizar la MFI de las células por encima de la MFI del control de isotipo. %P1 muestra el porcentaje de células en P1, que indica el porcentaje de células de tinción positiva; la fluorescencia de mediana de P1 muestra la MFI de las células de la puerta P1. Los hibridomas con %P1 por encima del 70% y una señal de fluorescencia P1 por encima de 5000 fueron considerados de interés para subclonación y caracterización adicional. En la Tabla 8 se muestran los datos de FACS correspondientes a 29 de los hibridomas procedentes del protocolo RIMMS.

Tabla 8

Ejemplo 2: Descubrimiento y caracterización de anticuerpos que bloquean las interacciones de PD-L1 y PD-L2 con PD-1 usando tecnología in vitro de biblioteca de anticuerpos.

Se usan las proteínas de dominio extracelular soluble de PD-L1 y PD-L2 y células transfectadas con proteínas PD-L1 o PD-L2 para seleccionar in vitro bibliotecas de anticuerpos para descubrir anticuerpos que se unen tanto a PD-L1 como a PD-L2 y que bloquean su interacción con PD-1. Las proteínas diana solubles de PD-L1 y PD-L2 usadas para la selección de biblioteca son construcciones de ectodominio completo o construcciones que comprenden solo el dominio de IgV.

Se usan bibliotecas múltiples para descubrir anticuerpos que bloquean las interacciones de PD-L1 y PD-L2 con PD-1, que incluyen Metha1, una biblioteca de 1,2 x 1010 miembros constituida por genes de cadena pesada y ligera emparejados aleatoriamente aislados a partir de la sangre periférica de 57 voluntarios humanos no inmunizados, Metha2, una biblioteca de 1,5 x 1010 miembros constituida por cadenas pesadas y lambda ligeras emparejadas aleatoriamente capturadas de la sangre periférica de 57 voluntarios humanos no inmunizados, y Griffin1, una biblioteca semi-sintética de 1,2 x 109 miembros basada en la biblioteca 1ox (Herschorn et al. (2010) J. Immunol. 185(12): 7623 32). Las bibliotecas se seleccionan mezclando con proteína diana inmovilizada o incubando con proteína diana marcada y posterior recuperación usando la etiqueta de marcado (p.ej., usando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina para recolectar proteína diana biotinilada). Se emplean rondas múltiples de selección, recuperación y rescate de fagos para enriquecer respecto a los anticuerpos deseados.

Se usan estrategias múltiples de selección para descubrir los anticuerpos deseados, que incluyen la selección con una de las proteínas diana seguida de cribado de los anticuerpos seleccionados en términos de la unión a la otra proteína diana, y de rondas de selección que alternan las proteínas diana. Adicionalmente, en algunas estrategias se incorporan rondas de selección en células completas que expresan una proteína diana.

El ADN que codifica anticuerpos que se unen específicamente tanto a PD-L1 humano como a PD-L2 humano es aislado del fago seleccionado y se usa para construir anticuerpos de formato IgG entero. Los anticuerpos son caracterizados en términos de unión a las proteínas diana (PD-L1 humano y PD-L2 humano) así como a los homólogos de mono cynomolgus y de ratón. Adicionalmente, los anticuerpos son evaluados en un ensayo de bloqueo de la interacción de PD-L1/PD-1 y PD-L2/PD-1 (véase, p.ej., el Ejemplo 1).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente tanto a PD-L1 como a PD-L2, que comprende seis CDRs: CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde CDR-L1 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 70-102 de la SEQ ID NO: 13, CDR-L2 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 148-168 de la SEQ ID NO: 13, CDR-L3 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 265-291 de la SEQ ID NO: 13, CDR-H1 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 91 -108 de la SEQ ID NO: 15, CDR-H2 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 151-198 de la SEQ ID NO: 15, y CDR-H3 consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 295-330 de la SEQ ID NO: 15, preferiblemente donde el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo,

2. El anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, donde el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo es quimérico, humanizado, compuesto, de roedor o humano, o

donde el anticuerpo monoclonal aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fab, scFv, scFv bi-específico o scFv tri-específico.

3. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1 o 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo monoclonal aislado, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1 o 2.

5. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 4.

6. Una célula hospedante que expresa el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1 ó 2.

7. Un animal transgénico no humano que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

8. Un método para producir al menos un anticuerpo monoclonal, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 ó 2, que comprende cultivar una célula que produce el al menos un anticuerpo monoclonal, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, a partir del cultivo celular.

9. Un dispositivo o kit que comprende al menos un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de antígeno del mismo, según la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo dicho dispositivo o kit de forma opcional una etiqueta para detectar el al menos un anticuerpo monoclonal, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, o un complejo que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo, preferiblemente

donde dicho dispositivo detecta la presencia de un polipéptido PD-L1 y/o PD-L2 en una muestra mediante el uso de un ensayo tipo sándwich o un ensayo competitivo.

10. Un método in vitro para detectar la presencia o el nivel de un polipéptido PD-L1 y/o PD-L2, comprendiendo dicho método la detección de dicho polipéptido en una muestra mediante el uso del al menos un anticuerpo monoclonal, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 o 2, preferiblemente

donde el al menos un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un polipéptido PD-L1 y/o PD-L2 y el complejo es detectado en la forma de un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) un ensayo radioinmune (RIA) o inmunoquímicamente.