TW202012430A

TW202012430A - 熱休克蛋白質－結合之胜肽組成物及其使用方法

Info

Publication number: TW202012430A
Application number: TW108114510A
Authority: TW
Inventors: 馬克菲德斯; 班傑明莫林; 比斯奴喬許
Original assignee: 美商艾吉納斯公司
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-04-01
Also published as: WO2019210055A2; JP2021522239A; EP3784688A2; US11065317B2; US20220008527A1; CN112218883A; AU2019261451A1; CA3096909A1; MA52363A; KR20210005646A; WO2019210055A3; AU2019261451A2; US20200000905A1

Abstract

本發明提供包含新型HSP-結合之胜肽的多胜肽和組成物。該等多胜肽和組成物在作為免疫治療劑(例如癌症疫苗)上特別有用。本發明亦提供使用該等多胜肽和組成物誘導細胞免疫反應之方法、使用該等多胜肽和組成物治療疾病之方法、包含該等多胜肽和組成物之套組及製造該等組成物之方法。

Description

熱休克蛋白質－結合之胜肽組成物及其使用方法

本發明關於熱休克蛋白質(HSP)-結合之胜肽組成物和該等組成物於作為免疫治療劑(例如癌症疫苗)之用途。相關申請案

本申請案主張2018年4月26日提交之美國臨時專利申請案第62/663,083號及2018年6月29日提交之美國臨時專利申請案第62/692,009號之優先權，各申請案之全部揭示內容以引用方式併入本文。

免疫療法正在成為治療癌症之重要工具。一種免疫療法的方法涉及使用包含癌症特異性抗原性胜肽之治療性癌症疫苗，該治療性癌症疫苗主動教育患者之免疫系統靶向和破壞癌細胞。然而，該等治療性癌症疫苗之產生受限於該癌症特異性抗原性胜肽之免疫原性。

因此，本技藝需要產生高度免疫原性癌症特異性抗原性胜肽和用於創建包含這些胜肽之有效的抗癌疫苗之改善方法。

因此，於一態樣中，本發明提供包含熱休克蛋白質(HSP)-結合之胜肽的經單離之多胜肽，該HSP-結合之胜肽包含X₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：1)之胺基酸序列，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G。於另一態樣中，本發明提供包含HSP-結合之胜肽的經單離之多胜肽，該HSP-結合之胜肽包含NWX₁ X₂ X₃ X₄ X₅ (SEQ ID NO：232)之胺基酸序列，其中X₁ 為L或I；X₂ 為L、R或K；X₃ 為L或I；X₄ 為T、L、F、K、R或W；且X₅ 為W或K。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含下述胺基酸序列：NX₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：2)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G；WLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：3)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G；或NWLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：4)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含選自由SEQ ID NO：5至12、98至113、204、205和207至215所組成之群組的胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽的胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：5至12、98至113、204、205和207至215所組成之群組的胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：6之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之長度不超過6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸殘基。

於某些實施態樣中，該多胜肽進一步包含抗原性胜肽，該抗原性胜肽包含一或多個主要組織相容性複合物(MHC)-結合之抗原決定位。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位以500 nM或更低之IC₅₀ 與MHC I分子結合。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位以1000 nM或更低之IC₅₀ 與MHC Ⅱ分子結合。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位係來自癌細胞。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位包含該癌細胞之胺基酸突變或基因融合突變。於某些實施態樣中，該胺基酸突變為取代、缺失或插入突變。於某些實施態樣中，該胺基酸突變或基因融合突變係在該抗原性胜肽之中間或附近。於某些實施態樣中，該胺基酸突變或基因融合突變係在該抗原性胜肽之胺基酸序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50處。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位係來自病原微生物。於某些實施態樣中，該病原微生物為病毒。於某些實施態樣中，該病毒為人乳頭瘤病毒(papillomavirus)(HPV)。於某些實施態樣中，該抗原性胜肽包含選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列。

於另一態樣中，本發明提供經單離之多胜肽，該經單離之多胜肽包含HSP-結合之胜肽和抗原性胜肽，該抗原性胜肽包含選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列。

於某些實施態樣中，該抗原性胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含選自由SEQ ID NO：1至12、98至113、204、205、207至215和232所組成之群組的胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：1至12、98至113、204、205、207至215和232所組成之群組的胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位包含經修飾之胺基酸殘基。於某些實施態樣中，該經修飾之胺基酸殘基為已在側鏈羥基或胺上被磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His。於某些實施態樣中，該經修飾之胺基酸殘基為已在側鏈羥基或胺上被磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His胺基酸的模擬物。於一些實施態樣中，該模擬物為不可水解之磷酸化殘基的類似物。於某些實施態樣中，該經修飾之胺基酸殘基為已在側鏈醯胺上被糖化之Asn、已在側鏈羥基上被糖化之Ser或Thr、已在側鏈胺基上被甲基化之Lys或Arg、巳在側鏈胺基上被乙醯化之Lys、已在α-胺基上被乙醯化之N端殘基或已在α-羧基上被醯胺化之C端殘基。於某些實施態樣中，該經修飾之胺基酸殘基係位於該抗原性胜肽之中間或附近。於某些實施態樣中，該經修飾之胺基酸殘基係位在該抗原性胜肽之胺基酸序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50處

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽係經由化學連接子與該抗原性胜肽連接。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽係經由胜肽連接子連接該抗原性胜肽。於某些實施態樣中，該胜肽連接子包含FFRK(SEQ ID NO：13)或FR之胺基酸序列。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽係位在該多胜肽之C端。於某些實施態樣中，該多胜肽在該多胜肽之C端包含下述胺基酸序列： (a) FFRKX₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：14)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (b) FFRKNX₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：15)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (c) FFRKWLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：16)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G； (d) FFRKNWLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：17)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G；或 (e) FFRKNWX₁ X₂ X₃ X₄ X₅ (SEQ ID NO：233)，其中X₁ 為L或I；X₂ 為L、R或K；X₃ 為L或I；X₄ 為T、L、F、K、R或W；且X₅ 為W或K。於某些實施態樣中，該多胜肽在該多胜肽之C端包含選自由SEQ ID NO：18至25、71至75、166、167、173和174所組成之群組的胺基酸序列。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽係位在該多胜肽之N端。於某些實施態樣中，該多胜肽在該多胜肽之N端包含下述胺基酸序列： (a) X₁ LX₂ LTX₃ FFRK(SEQ ID NO：26)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (b) NX₁ LX₂ LTX₃ FFRK(SEQ ID NO：27)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (c) WLX₁ LTX₂ FFRK(SEQ ID NO：28)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G； (d) NWLX₁ LTX₂ FFRK(SEQ ID NO：29)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G；或

(e) NWX₁ X₂ X₃ X₄ X₅ FFRK(SEQ ID NO：233)，其中X₁ 為L或I；X₂ 為L、R或K；X₃ 為L或I；X₄ 為T、L、F、K、R或W；且X₅ 為W或K。於某些實施態樣中，該多胜肽在該多胜肽之N端包含選自由SEQ ID NO：30至37和216至229所組成之群組的胺基酸序列。

於某些實施態樣中，該多胜肽之長度為12至50個胺基酸(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸長)。於某些實施態樣中，該多胜肽之長度為20至40個胺基酸。

於某些實施態樣中，該多胜肽包含選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該多胜肽係經化學合成。

於另一態樣中，本發明提供一種組成物，其包含本文所揭示之多胜肽和純化之壓力蛋白質的複合物。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白(Calreticulin)及其突變體或融合蛋白。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsc70。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為人Hsc70。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為重組蛋白。

於另一態樣中，本發明提供一種組成物，其包含多個如本文所揭示之多胜肽，可選擇地進一步包含如本文所揭示之純化的壓力蛋白質。於某些實施態樣中，該組成物包含2至20種不同之如本文所揭示之多胜肽。於某些實施態樣中，該不同之多胜肽各自包含相同之HSP-結合之胜肽和不同之抗原性胜肽。

於某些實施態樣中，每一該多胜肽之抗原性胜肽包含選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列。於某些實施態樣中，該組成物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種不同之抗原性胜肽。於某些實施態樣中，每一該多胜肽包含選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列。於某些實施態樣中，每一該多胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該組成物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種不同之多胜肽。於某些實施態樣中，該組成物中之多胜肽的總量為約0.1至20 nmol。於某些實施態樣中，該組成物中之多胜肽的總量為約3、4、5或6 nmol。於某些實施態樣中，該組成物中之壓力蛋白質的量為約10μg至600μg。於某些實施態樣中，該組成物中之壓力蛋白質的量為約250μg至290μg。

於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。

於某些實施態樣中，該組成物中之多胜肽和壓力蛋白質的總量為約10μg至600μg。於某些實施態樣中，該組成物中之該多胜肽和壓力蛋白質的總量為約300μg。

於某些實施態樣中，該組成物進一步包含佐劑。於某些實施態樣中，該佐劑包含皂苷或免疫刺激性核酸。於某些實施態樣中，該佐劑包含QS-21。於某些實施態樣中，該組成物中之QS-21的量為約10μg、25μg或50μg。於某些實施態樣中，該佐劑包含Toll樣受體(TLR)促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR4促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR7和/或TLR8促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR9促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR5促效劑。

於某些實施態樣中，該組成物為包含醫藥上可接受之載體或賦形劑的醫藥組成物。於某些實施態樣中，該組成物為單位劑型。

於另一態樣中，本發明提供誘導個體中針對抗原性胜肽之細胞免疫反應的方法，該方法包含對該個體投予有效量之如本文所揭示之組成物或單位劑型。於某些實施態樣中，該個體患有癌症。於某些實施態樣中，該個體患有病原微生物感染。

於另一態樣中，本發明提供治療個體之疾病的方法，該方法包含對該個體投予有效量之如本文所揭示之組成物或單位劑型。於某些實施態樣中，該疾病為癌症。於某些實施態樣中，該疾病為病原微生物感染。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位係存在於該個體之癌細胞中。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位係存在於該病原微生物中。

於某些實施態樣中，該組成物或單位劑型係每週投予該個體，共四週。於某些實施態樣中，在該四個每週劑量後，每二週對該個體投予至少二個該組成物或單位劑型之另外的劑量。於某些實施態樣中，在最後一個每週劑量或每二週劑量後三個月投予至少一個該組成物或單位劑型之加強劑量。於某些實施態樣中，每三個月進一步投予該組成物或單位劑型一次，持續至少1年。

於某些實施態樣中，該方法進一步包含對該個體投予來那度胺(lenalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、介白素-2、重組干擾素α-2b或PEG-干擾素α-2b。於某些實施態樣中，該方法進一步包含對該個體投予吲哚胺二氧酶-1(IDO-1)抑制劑。於某些實施態樣中，該IDO-1抑制劑為4-胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-N'-羥基-1,2,5-噁二唑-3-羧醯胺。於某些實施態樣中，該方法進一步包含對該個體投予免疫檢查點抗體。於某些實施態樣中，該免疫檢查點抗體係選自由下列所組成之群組：促效性抗GITR抗體、促效性抗OX40抗體、拮抗性抗PD-1抗體、拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗TIM-3抗體、拮抗性抗LAG-3抗體、拮抗性抗TIGIT抗體、促效性抗CD96抗體、拮抗性抗VISTA抗體、拮抗性抗CD73抗體、促效性抗CD137抗體、拮抗性抗CEACAM1抗體、促效性抗ICOS抗體和/或其抗原結合片段。

於另一態樣中，本發明提供套組，該套組包含第一容器和第二容器，該第一容器包含如本文所揭示之多胜肽，而該第二容器包含能與該多胜肽結合之純化的壓力蛋白質。

於某些實施態樣中，該第一容器含有2至20種如本文所揭示之不同的多胜肽。於某些實施態樣中，該不同之多胜肽各自包含相同之HSP-結合之胜肽和不同之抗原性胜肽。於某些實施態樣中，該第一容器中之該多胜肽的總量為約0.1至20 nmol。於某些實施態樣中，該第一容器中之該多胜肽的總量為約3、4、5或6 nmol。

於某些實施態樣中，該第一容器含有單一之如本文所揭示之多胜肽。於某些實施態樣中，該第一容器含有至少20種如本文所揭示之不同的多胜肽。於某些實施態樣中，該不同之多胜肽各自包含相同之HSP-結合之胜肽和不同之抗原性胜肽。於某些實施態樣中，該第一容器中之該多胜肽的總量為約0.1至20 nmol。於某些實施態樣中，該第一容器中之該多胜肽的總量為約3、4、5或6 nmol。

於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白及其突變體。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsc70。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為人Hsc70。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為重組蛋白。於某些實施態樣中，該第二容器中之該壓力蛋白質的量為約10μg至600μg。於某些實施態樣中，該第二容器中之該壓力蛋白質的量為約250μg至290μg。

於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。於某些實施態樣中，該第一容器中之該多胜肽和該第二容器中之該壓力蛋白質的總量為約10μg至600μg。於某些實施態樣中，該第一容器中之該多胜肽和該第二容器中之該壓力蛋白質的總量為300μg。

於某些實施態樣中，該套組進一步包含含有佐劑之第三容器。於某些實施態樣中，該佐劑包含皂苷或免疫刺激核酸。於某些實施態樣中，該佐劑包含QS-21。於某些實施態樣中，該第三容器中之QS-21的量為約10μg、25μg或50μg。於某些實施態樣中，該佐劑包含TLR促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR4促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR7和/或TLR8促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR9促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR5促效劑。

於另一態樣中，本發明提供製造疫苗之方法，該方法包含將本文所揭示之一或多種多胜肽與純化之壓力蛋白質在合適之條件下混合，從而使該純化之壓力蛋白質與至少一種該多胜肽結合。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白及其突變體。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsc70。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為人Hsc70。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為重組蛋白。於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。於某些實施態樣中，該合適之條件包含約37℃之溫度。

本發明提供包含新型HSP-結合之胜肽的多胜肽和組成物。該等多胜肽和組成物於作為免疫治療劑(例如癌症疫苗)上特別有用。本發明亦提供使用該等多胜肽和組成物誘導細胞免疫反應之方法、使用該等多胜肽和組成物治療疾病之方法、包含該等多胜肽和組成物之套組及製造該等組成物之方法。6.1 定義

除非本文另有定義，否則本文所使用之科學和技術術語具有本技藝之一般技術人士所通常理解之含義。在具有任何潛在之歧義的事件中，本文提供之定義優先於任何字典或外在定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。除非另有說明，否則使用“或”時意指“和/或”。術語“包括”(including及其他形式，諸如includes和included”)之使用為非限制性的。

如本文所用之術語“約”和“近似”當用於修飾數值或數值範圍時係表示高於該引用之數值或範圍之5%至10%(例如高達高於5%至10%)及低於5%至10%(例如高達低於5%至10%)時該偏差仍保持在該引用之數值或範圍的預期含義內。

如本文所使用者，術語“多胜肽”係指包含具有六個或更多個胺基酸殘基之胜肽的非天然產生之聚合物。多胜肽可進一步包含一或多個非胺基酸殘基結構。於某些實施態樣中，多胜肽包含化學連接子。於某些實施態樣中，多胜肽包含連接該多胜肽的二個部分之化學連接子。於某些實施態樣中，多胜肽不包含含有該SEQ ID NO：1之胺基酸序列之蛋白質(例如天然存在之蛋白質)的整個胺基酸序列。於某些實施態樣中，多胜肽不包含該包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質(例如天然存在之蛋白質)之含有多於6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個連續胺基酸的胺基酸序列。

如本文所使用者，術語“經單離之多胜肽”係指與在表現(例如重組表現)或合成(例如化學合成)多胜肽之後出現的一或多個分子分開之多胜肽。

如本文所使用者，術語“主要組織相容性複合物”和“MHC”可互換使用且係指第I類MHC分子和/或第Ⅱ類MHC分子。

如本文所使用者，術語“人白血球抗原”和“HLA”可互換使用且係指人體中之主要組織相容性複合物(MHC)。HLA分子可為第I類MHC分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C)或第Ⅱ類MHC分子(例如HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR)。

如本文所使用者，術語“主要組織相容性複合物(MHC)-結合之抗原決定位”係指與MHC分子結合之胜肽或被預測與MHC分子結合之胜肽。

如本文所使用者，術語“熱休克蛋白質-結合之胜肽”和“HSP-結合之胜肽”可互換使用且係指與HSP非共價結合之胜肽。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽不包含該包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的蛋白質(例如天然存在之蛋白質)之含有超過6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50個連續胺基酸之胺基酸序列。

如本文所使用者，術語“胜肽連接子”係指連接第一胜肽之C端胺基酸殘基與第二胜肽之N端胺基酸殘基的胜肽鍵或胜肽序列。

如本文所使用者，術語“化學連接子”係指能夠連接二個分子的任何化學鍵或部分，其中該鍵或部分不是胜肽連接子。

如本文所使用者，術語“治療(treat、treating和treatment)”係指本文所描述之治療或預防措施。該“治療”方法採用對患有疾病或病症，或傾向患有該等疾病或病症之個體投予抗體，以預防、治癒、延遲、減輕該疾病或病症之嚴重性或改善該疾病或病症或復發之疾病或病症的一或多種症狀，或用於延長個體之存活期超過無該等治療時所預期之存活期。

如本文所使用者，在對個體投予療法之背景下，術語“有效量”係指達成期望之預防或治療效果之療法的量。

如本文所使用者，術語“個體”包括任何人或非人動物。6.2 熱休克蛋白質 (HSP)- 結合之胜肽

於一態樣中，本發明提供包含HSP-結合之胜肽的多胜肽，該HSP-結合之胜肽包含表1中提供之任一胺基酸序列。

於一態樣中，本發明提供包含HSP-結合之胜肽的多胜肽，該HSP-結合之胜肽包含X₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：1)之胺基酸序列，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G。於另一態樣中，本發明提供包含HSP-結合之胜肽的多胜肽，該HSP-結合之胜肽包含NWX₁ X₂ X₃ X₄ X₅ (SEQ ID NO：232)之胺基酸序列，其中X₁ 為L或I；X₂ 為L、R或K；X₃ 為L或I；X₄ 為T、L、F、K、R或W；且X₅ 為W或K。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽以低於 10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、或10^-9 M之K_d 與HSP(例如Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96或鈣網伴護蛋白)結合。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽以10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、 10^-8 M、10^-9 M或更低之K_d 與Hsc70(例如人Hsc70)結合。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含NX₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：2)之胺基酸序列，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含WLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：3)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含NWLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：4)之胺基酸序列，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含選自由SEQ ID NO：5至12、98至113、204至205及207至215所組成之群組的胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：98之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：113之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：214之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：215之胺基酸序列。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：1之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：2之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：3之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：4之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：232之胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由選自由下列所組成之群組的胺基酸序列所組成：SEQ ID NO：5至12、98至113、204、205和207至215。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：5之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：6之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：7之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：8之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：9之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：10之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：11之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：12之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：98之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：99之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：100之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：101之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：102之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：103之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：104之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：105之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：106之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：107之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：108之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：109之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：110之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：111之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：112之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：113之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：204之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：205之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：207之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：208之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：209之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：210之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：211之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：212之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：213之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：214之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：215之胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽的長度不超過100個(例如不超過6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95個)胺基酸殘基。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽的長度為6至50個胺基酸(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個)胺基酸殘基。

於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列係由該HSP-結合之胜肽的胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽進一步包含連接子。該連接子可為本技藝已知之任何化學連接子或胜肽連接子。

於某些實施態樣中，該連接子包含用於化學交聯或紫外線(UV)交聯之部分。本技藝中已知之任何化學交聯或UV交聯部分均可使用(參見，例如Wong,1991, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press，其全部內容以引用方式併入本文)。於某些實施態樣中，該連接子包含點擊化學柄(click chemistry handle)。如本文所使用者，術語“點擊化學柄”係指可參與點擊化學反應之反應物或反應基團。示例性點擊化學柄已在美國專利公開案20130266512中得到證實(其全部內容以引用方式併入本文)。

於某些實施態樣中，該連接子包含胜肽連接子。於某些實施態樣中，該胜肽連接子包含可被蛋白酶識別和/或裂解之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該蛋白酶係在哺乳動物細胞(例如人細胞)中表現。於某些實施態樣中，該蛋白酶係在抗原呈遞細胞(例如B細胞、巨噬細胞、樹突細胞)中表現。於某些實施態樣中，該蛋白酶為絲胺酸蛋白酶。於某些實施態樣中，該蛋白酶為胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或彈性蛋白酶。於某些實施態樣中，該胜肽連接子包含或由FFRK之胺基酸序列(SEQ ID NO：13)所組成。於某些實施態樣中，該胜肽連接子包含或由FR之胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該多胜肽包含表2中提供之任一胺基酸序列。

於某些實施態樣中，該連接子係在該HSP-結合之胜肽的N端。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：14、15、16、17或233之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：14、15、16、17或233之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174之胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該連接子係在該HSP-結合之胜肽的C端。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：26、27、28、29或234之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：26、27、28、29或234之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229之胺基酸序列所組成。6.3 包含 HSP- 結合之胜肽的多胜肽

於一態樣中，本發明提供多胜肽，該多胜肽包含如本文所揭示之HSP-結合之胜肽旦包含一或多個MHC-結合之抗原決定位之抗原性胜肽。

MHC-結合之抗原決定位可藉由本技藝已知之方法鑑定，例如藉由測量胜肽與MHC分子(例如HLA分子)之結合的分析鑑定。該等分析之非限制性實例包括抑制抗原呈遞(Sette,等人, J. Immunol. 141:3893, 1991)、體外組裝分析(Townsend,等人, Cell 62:285, 1990)和使用突變之細胞(諸如RMA.S)之基於FACS的分析(Melief,等人, Eur. J. Immunol. 21:2963, 1991)。在一些情況下，藉由軟體程式可預測MHC-結合之抗原決定位以與MHC分子(例如HLA分子)結合(例如SYFPEITHI，Rammensee,等人, Immunogenetics 50, 213-219, 1999，其全部內容以引用方式併入本文)。可用於鑑定MHC-結合之抗原決定位之其他方法包括，但不限於下列文獻中所揭示者：Guan, P.等人, (2003) Applied Bioinformatics, 2: 63-66；Blythe, M. J. et al.,(2002) Bioinformatics, 18: 434-439；Flower, D. R. and Doytchinova, I. A. (2002). Applied Bioinformatics, 1: 167-176；Yu, K.等人, (2002) Molecular Medicine, 8: 137-48； Brusic, V.等人, (2002) Immunology and Cell Biology, 80: 280-285； Jung, G.等人, (2001) Biologicals, 29: 179-181(其描述T細胞抗原決定位預測程式EPIPREDICT)；Kwok, W. W.等人, (2001) Trends in Immunology, 22: 583-588；Mallios, R. R. (2001) Bioinformatics, 17: 942-948；Romisch, K. (2001). Trends in Biochemical Sciences, 26: 531； Schirle, M.等人, (2001) Journal of Immunological Methods, 257: 1-16；Singh, H. and Raghava, G. P. S.(2001) Bioinformatics, 17: 1236-1237； Andersen, M. H.等人, (2000) Tissue Antigens, 55: 519-531； Buus, S. (1999). Current Opinion in Immunology, 11: 209-213； Mallios, R. R. (1999) Bioinformatics, 15: 432-439； Maffei, A. and Harris, P. E. (1998). Peptides, 19: 179-198； and Vita R.等人, (2015) Nucleic Acids Res., 43: D405-D412 (其描述免疫抗原決定位數據庫(IEDB)3.0，可從www.iedb.org 取得)(各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

MHC分子被分類為第I類或Ⅱ類分子。第Ⅱ類MHC分子主要表現在參與啟動和維持免疫反應之細胞上，諸如樹突細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞，等。第Ⅱ類MHC分子可被輔助T淋巴細胞識別並誘導輔助T淋巴細胞增殖和擴大對展示之特定免疫原性胜肽的免疫反應。第I類MHC分子表現在幾乎所有有核細胞上並可被細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別，該細胞毒性T淋巴細胞再破壞該攜帶抗原之細胞。細胞毒性T淋巴細胞在腫瘤排斥和對抗病毒感染中特別重要。該CTL識別與第I類MHC分子結合之胜肽片段形式的抗原，而非完整的外來抗原本身。該胜肽與MHC分子結合之能力可以多種不同方式測量，諸如藉由抑制抗原呈遞(Sette,等人, J. Immunol. 141:3893, 1991)、體外組裝分析(Townsend,等人, Cell 62:285, 1990)和使用突變之細胞(諸如RMA.S)之基於FACS的分析(Melief,等人, Eur. J. Immunol. 21:2963, 1991，其全部內容以引用方式併入本文)。被預測與第I類MHC分子結合之MHC-結合之抗原決定位通常為8至11個殘基，而被預測與第Ⅱ類MHC分子結合之MHC-結合之抗原決定位通常係在10至20個殘基之範圍內。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位為HLA-結合之抗原決定位。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位以小於或等於500 nM(例如小於或等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400或450 nM)之IC50與MHC I分子結合。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位以小於或等於1000 nM(例如小於或等於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800或900 nM)之IC50與MHC Ⅱ分子結合。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位之序列係從一或多個個體之癌細胞(例如子宮頸癌、腺癌、膠質母細胞瘤或多發性骨髓瘤之細胞)鑑別。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位之胺基酸序列與該從癌細胞鑑別之序列具有100%同一性。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位之胺基酸序列與從該癌細胞鑑別之序列具有至少70%、80%、90%、或95%同一性，可選擇地，其中該差異大部分或僅包含胺基酸之保守性取代。相對於該物種族群最常見之序列，從該癌細胞鑑別之胺基酸序列可為野生型或突變體。當該從癌細胞鑑別之胺基酸序列為突變體時，其可包含胺基酸突變(例如取代、缺失或插入突變)或基因融合突變(例如為基因組轉位或轉座之結果)。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位之序列係從病原微生物中鑑別。該病原微生物可為病毒、細菌、真菌、原生動物或寄生蟲。示例性病毒包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流感(例如A型流感或B型流感)、水痘(varicella)、腺病毒、第I型單純皰疹(HSV-1)、第Ⅱ型單純皰疹(HSV-Ⅱ)、牛瘟病毒(rinderpest)、鼻病毒(rhinovirus)、埃可病毒(echovirus)、輪狀病毒(rotavirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,)、乳頭狀瘤病毒(papilloma virus)(例如人乳頭狀瘤病毒(HPV))、乳多空病毒(papova virus)、巨細胞病毒、棘狀病毒(echinovirus)、蟲媒病毒(arbovirus)、漢他病毒(hantavirus)、克沙奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measeles virus)、德國麻疹病毒(rubella virus)、脊髓灰質炎病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、第I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)、第Ⅱ型人類免疫缺陷病毒 (HIV-Ⅱ)、登革熱病毒、天花病毒(smallpox virus)和滋卡病毒(Zika virus)。示例性細菌包括大腸桿菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae )、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌(Enterococcus faecalis )、普通變形桿菌(Proteus vulgaris )、草綠色葡萄球菌(Staphylococcus viridans )和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )。示例性真菌包括念珠菌(Candida )(例如光滑念珠菌(Candida glabrata ))、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii )、角膜炎鐮孢菌(Fusarium keratitis )、球黴菌(coccidioidal )、黑曲黴(Aspergillus niger )、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )和膝曲彎孢菌(Curvularia geniculata )。示例性原生動物包括利甚曼原蟲(leishmania)、球蟲(coccidiosis)、錐蟲(trypanosoma)、血吸蟲(schistosoma)和瘧疾。示例性寄生蟲包括衣原體(chlamydia)和立克次氏體(rickettsia)。

於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位包含經修飾之胺基酸殘基。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位包含磷酸化之殘基(例如已在側鏈羥基或胺上被磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His)。於某些實施態樣中，該MHC-結合之抗原決定位包含磷酸模擬殘基(例如已在側鏈羥基或胺上被磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His胺基酸的模擬物)。磷酸模擬基之非限制性實例包括O-硼磷酸基、二羥硼基、O-二硫代磷酸基、磷醯胺、H-膦酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和氟磷酸酯，這些之任一者可在Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys或His殘基上衍生。於某些實施態樣中，Asp或Glu殘基係作為磷酸模擬物來替代胜肽中之磷酸-Tyr、磷酸-Thr、磷酸-Ser，磷酸-Arg、磷酸-Lys和/或磷酸-His殘基。於某些實施態樣中，該磷酸模擬殘基為磷酸化殘基之不可水解的類似物。

該抗原性胜肽可包含一或多個MHC-結合之抗原決定位。於某些實施態樣中，該抗原性胜肽包含一個MHC-結合之抗原決定位。於某些實施態樣中，該抗原性胜肽包含二或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多個)MHC-結合之抗原決定位。該二或更多個MHC-結合之抗原決定位可經由化學連接子或胜肽連接子連接，其中該胜肽連接子可選擇地包含可被蛋白酶識別和/或裂解之胺基酸序列。

於某些實施態樣中，該抗原性胜肽之長度為8至50個胺基酸(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸)。於某些實施態樣中，該抗原性胜肽之長度為12至50、20至40、20至35、25至40、20至30、25至35或30至40個胺基酸。

該HSP-結合之胜肽可經由化學連接子或胜肽連接子與抗原性胜肽連接。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽可經由化學連接子與抗原性胜肽連接。可使用任何化學連接子來將該HSP-結合之胜肽與抗原性胜肽連接。示例性化學連接子包括從化學交聯產生之部分(參見，例如Wong, 1991, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press，其全部內容以引用方式併入本文)、UV交聯和點擊化學反應(參見，例如美國專利公開案20130266512，其全部內容以引用方式併入本文)。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽可經由胜肽連接子(例如，如章節5.2中揭示之胜肽連接子)與抗原性胜肽連接。

該HSP-結合之序列可在任何胺基酸位置連接該抗原性胜肽。於某些實施態樣中，該HSP-結合之序列之C端係經由化學連接子連接該抗原性胜肽之N端。於某些實施態樣中，該HSP-結合之序列之N端係經由化學連接子連接該抗原性胜肽之C端。於某些實施態樣中，該HSP-結合之序列之C端經由胜肽連接子連接該抗原性胜肽之N端。於某些實施態樣中，該HSP-結合之序列之N端係經由胜肽連接子連接該抗原性胜肽之C端。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽係在該多胜肽之C端。當藉由固相合成法產生時，該C端具有HSP-結合之胜肽的多胜肽在提升純度上通常是有利的。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽係在該多胜肽之N端。於某些實施態樣中，該熱休克蛋白質-結合之胜肽不在多胜肽之N端或C端。於某些實施態樣中，該熱休克蛋白質-結合之胜肽係在該多胜肽之中心。

於某些實施態樣中，該多胜肽從N端至C端包含抗原性胜肽(其包含一或多個MHC-結合之抗原決定位)、胜肽連接子和本文所揭示之HSP-結合之胜肽。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：14、15、16、17或233之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列從N端至C端係由本文所揭示之抗原性胜肽之胺基酸序列和SEQ ID NO：14、15、16、17或233之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列從N端至C端係由本文所揭示之抗原性胜肽之胺基酸序列和SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、71、72、74、75、166、167、173或174之胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，該多胜肽從N端至C端包含本文所揭示之HSP-結合之胜肽、胜肽連接子和包含一或多個MHC-結合之抗原決定位之抗原性胜肽。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：26、27、28、29或234之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽包含SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、或216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列從N端至C端係由SEQ ID NO：26、27、28、29或234之胺基酸序列和本文所揭示之抗原性胜肽之胺基酸序列所組成。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列從N端至C端係由SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228或229之胺基酸序列和本文所揭示之抗原性胜肽之胺基酸序列所組成。

於某些實施態樣中，本文所揭示之多胜肽的長度不超過500個胺基酸(例如不超過400、300、200、100、90、80、70、60、50或40個胺基酸)。於某些實施態樣中，該多胜肽之胺基酸序列並非天然產生的。

於某些實施態樣中，該多胜肽以低於10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M或10^-9 M之K_d 與HSP(例如Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96或鈣網伴護蛋白)結合。於某些實施態樣中，該多胜肽以10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M或更低之K_d 與Hsc70(例如人Hsc70)結合。6.3.1 藉由化學合成製造多胜肽

本文所揭示之多胜肽可藉由標準化學方法合成，包括使用胜肽合成儀。可使用本技藝熟知之常規胜肽合成法或其他合成方案。

於某些實施態樣中，本文所揭示之多胜肽係由藉由胜肽鍵連接之胺基酸殘基組成。該等多胜肽可使用類似於Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149(其全部內容以引用方式併入本文)中所描述之程序，藉由，例如固相胜肽合成法合成。在合成期間，將具有受保護之側鏈的N-α-保護之胺基酸逐步添加至逐漸成長之多胜肽鏈，該多胜肽鏈經由其C端連接一不溶性聚合物支持物，即聚苯乙烯小珠。該多胜肽係藉由將N-α-去保護之胺基酸的胺基連接至N-α-保護之胺基酸的α-羧基來合成，該N-α-保護之胺基酸已藉由其與試劑，諸如二環己基碳二亞胺或2-(6-氯-1-H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨六氟磷酸鹽反應而被活化。該游離胺基連接至該經活化之羧基導致胜肽鍵形成。最常使用之N-α-保護基團包括為酸不穩定之Boc和鹼不穩定之Fmoc。合適之化學物、樹脂、保護基、受保護之胺基酸和試劑的細節為本技藝所熟知(參見Atherton,等人, 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press和 Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed., Springer-Verlag，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

此外，多胜肽之類似物和衍生物可依上文之描述以化學方式合成。若需要時，可在胜肽序列中引入用於取代或添加之非經典胺基酸或化學胺基酸類似物。非經典胺基酸包括，但不限於該常見之胺基酸的D-異構體、α-胺基異丁酸、4-胺基丁酸、羥基脯胺酸、肌胺酸、瓜胺酸、半胱胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、苯基甘胺酸、環己基丙胺酸、β-丙胺酸、設計者胺基酸，諸如β-甲基胺基酸、C-α-甲基胺基酸和N-α-甲基胺基酸。

Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys和His之側鏈上磷酸化之多胜肽可使用適當之側鏈經保護之Fmoc-磷酸胺基酸以Fmoc固相合成法合成。以此方式可合成具有磷酸化和非磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys和His殘基之組合的多胜肽。例如，可應用Staerkaer等人之方法(1991, Tetrahedron Letters 32: 5389-5392)。其他程序(某些用於特定胺基酸者)詳細描述於下列文獻中：De Bont等人(1987, Trav. Chim Pays Bas 106: 641, 642)、Bannwarth and Trezeciak(1987, Helv. Chim. Acta 70: 175-186)、Perich and Johns(1988, Tetrahedron Letters 29: 2369-2372)、Kitas et al.(1990, J. Org. Chem. 55:4181-4187)、Valerio et al.(1989, Int. J. Peptide Protein Res. 33:428-438)、Perich et al.(1991, Tetrahedron Letters 32:4033-4034)、Pennington(1994, Meth. Molec. Biol. 35:195-2)及Perich(1997, Methods Enzymol. 289:245-266，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

磷酸化之多胜肽亦可藉由先培養使用該編碼多胜肽之胺基酸序列的核酸轉化之細胞來產生。藉由細胞培養產生該等多胜肽後，該適當之胺基酸的羥基可使用有機合成或使用磷酸化酶之酶催化法以磷酸基團取代。例如，在絲胺酸特異性磷酸化之情況中，可使用絲胺酸激酶。

亦可合成磷酸胜肽模擬物，其中在多胜肽中之磷酸化的胺基酸殘基被磷模擬基團替換。磷酸模擬基團之非限制性實例包括O-硼磷酸基、二羥硼基、O-二硫代磷酸基、磷醯胺、H-膦酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和氟磷酸酯，任一該等基團均可在Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys或His殘基上衍生化。於某些實施態樣中，Asp或Glu殘基係作為磷酸模擬物。Asp或Glu殘基亦可作為磷酸模擬基團並用於替代胜肽中之磷酸-Tyr、磷酸-Thr、磷酸-Ser，磷酸-Arg、磷酸-Lys和/或磷酸-His殘基。

使用常規程序純化所產生之胜肽，諸如使用逆相、凝膠滲透、分配和/或離子交換色層分析法之製備型HPLC。適當之基質和緩衝液的選項為本技藝所熟知，因此本文中不再詳細描述。6.3.2 使用重組 DNA 技術產生胜肽

本文所揭示之多胜肽亦可藉由本技藝已知之重組DNA方法製備。編碼多胜肽之核酸序列可藉由回譯該胺基酸序列及藉由標準化學方法(諸如使用寡核苷酸合成儀)合成來取得。或者，可使用專門設計之寡核苷酸引物和PCR方法從DNA模板獲得多胜肽之編碼信息。該多胜肽之變化和片段可藉由提供功能上相等之分子的取代、插入或缺失來製備。由於該核苷酸編碼序列之簡併性，編碼該相同多胜肽或多胜肽變體之DNA序列可用於實行本發明。這些包括，但不限於被該序列內之不同密碼子(其編碼功能上同等之胺基酸殘基)取代，從而產生靜默或保守性變化而改變的核苷酸序列。該編碼多胜肽之核酸可被插入用於在宿主細胞中增殖和表現之表現載體。

由於本文所考慮之胜肽編碼序列之長度可藉由化學技術合成，例如Matteucci等人, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)之磷酸三酯方法(其全部內容以引用方式併入本文)，修飾可單純地藉由以合適之鹼基取代那些編碼天然肽序列之鹼基來製造。然後，可提供該編碼序列合適之連接子並將其連結入本技藝中常用之表現載體，及用於轉化合適之宿主的載體中以產生所需之胜肽或融合蛋白。目前可用之載體及合適之宿主系統有多種。為了表現該胜肽或融合蛋白，提供該編碼序列可操作地連接之起始和終止密碼子、啟動子和終止子區且通常提供複製系統，以提供用於在所需之細胞宿主中表現之表現載體。

表現構建體係指編碼多胜肽之核苷酸序列，其係可操作地連接一或多個能使該胜肽在適當之宿主細胞中表現之調控區。“可操作地連接”係指其中該調控區與待表現之胜肽序列係以允許轉錄及最終可一人轉譯之方式連接和定位的聯結形式。

胜肽轉錄所必要之調控區可由表現載體提供。若欲表現缺乏其同源起始密碼子之胜肽基因序列，則亦可提供轉譯起始密碼子(ATG)。於相容之宿主構建體系中，細胞轉錄因子(諸如RNA聚合酶)將與該表現構建體上之調控區結合以使該胜肽序列在宿主生物中之轉錄生效。基因表現所需之調控區的確切性質在各別宿主細胞之間可能有所不同。一般而言，需要能夠結合RNA聚合酶並促進可操作地聯結之核酸序列轉錄的啟動子。該等調控區可包括涉及起始轉錄和轉譯之5'非編碼序列者，諸如TATA盒、加帽序列、CAAT序列，等。該編碼序列之3'非編碼區可含有轉錄終止調控序列，諸如終止子和聚腺苷酸化位點。

為了將具有調節功能之DNA序列(諸如啟動子)與胜肽基因序列連接或將胜肽基因序列插入載體之選殖位點，可藉由本技藝熟知之技藝將提供適當之相容限制性位點的連接子或銜接子連接至該cDNA之端點(Wu et al.,1987, Methods in Enzymol 152:343-349，其全部內容以引用方式併入本文)。使用限制酶裂解後可在連接前藉由返回分解或填充單股DNA端來進行修飾以創造鈍端。或者，可藉由使用含有所需之限制酶位點之引物進行PCR來擴增DNA，以將所需之限制酶位點引入DNA片段。

包含可操作地連接調控區之多胜肽編碼序列的表現構建體可被直接引入用於表現之適當之宿主細胞中並產生該胜肽，而不經進一步選殖。該表現構建體亦可含有促進DNA序列整合入該宿主細胞之基因組(例如經由同源重組)中的DNA序列。在此情況下，不需要使用包含適合用於合適之宿主細胞的複製起源之表現載體以在該宿主細胞中繁殖並表現該胜肽。

可使用多種表現載體，包括質粒、黏粒、噬菌體、噬菌粒或經修飾之病毒。通常，該等表現載體包含用於在合適之宿主細胞中繁殖該載體的功能性複製起點、用於插入該胜肽基因序列的一或多個限制性內切核酸酶位點及一或多個選擇標記。可構建表現載體以攜帶用於本文所揭示之一或多種多胜肽之核苷酸序列。該表現載體必須與相容之宿主細胞一起使用，該相容之宿主細胞可源自原核或真核生物，包括，但不限於細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物和人。該等宿主細胞可經轉化以表現一或多種本文所揭示之多胜肽，諸如藉由使用含有多個編碼本文所揭示之任一多胜肽的核苷酸序列之單一表現載體來轉化該宿主細胞或藉由使用多個編碼本文所揭示之不同多胜肽之表現載體來轉化該宿主細胞。

在細菌系統中，許多表現載體可被有利地選擇用來產生多胜肽。例如，當欲產生大量該蛋白質時(諸如用於產生醫藥組成物)，指導表現大量易於純化之融合蛋白產物的載體可能是理想的。該等載體包括大腸桿菌表現載體pUR278(Ruther等人, 1983,EMBO J.2,1791，其全部內容以引用方式併入本文)，其中該胜肽編碼序列可被個別連接入載體中與lac Z編碼區同一框架，從而產生融合蛋白；pIN載體(Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109；Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem 264, 5503-5509，各篇之全部內容以引用方式併入本文)；等。pGEX載體亦可用於表現具有麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之為融合蛋白形式的該等胜肽。通常，該等融合蛋白為可溶的且可藉由吸附至麩胱甘肽-瓊脂糖小珠上輕易地從溶解的細胞中純化，然後在游離麩胱甘肽之存在下洗提出。該pGEX載體係經過設計以包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點，從而使該多胜肽可從該GST部分釋出。

或者，在長期高產量生產經適當加工之胜肽複合物方面，較佳為在哺乳動物細胞中穩定表現。穩定表現胜肽複合物之細胞株可藉由使用含有可選擇之標記的載體進行工程處理。舉例來說，在引入該表現構建體後，令經工程處理之細胞在富集之培養基中生長1至2天，然後轉換至選擇性培養基。該表現構建體中之選擇標記賦予對該選擇標記之抗性，且最佳地，允許細胞將該表現構建體穩定整合入其染色體中並在培養中生長且擴展成細胞株。該等細胞可長時間培養，同時持續表現該胜肽。

該重組細胞可在標準溫度、培養時間、光密度和培養基組成之條件下培養。然而，用於生長重組細胞之條件可能與用於表現該多胜肽者不同。亦可使用經修飾之培養條件和培養基來增進胜肽產生。例如可將含有胜肽與其同源啟動子之重組細胞暴露於熱或其他環境壓力或化學壓力。可應用本技藝已知之任何技術來建立用於產生胜肽複合物之最佳條件。

於本發明之一實施態樣中，將編碼甲硫胺酸之密碼子添加在該編碼多胜肽之核苷酸序列的5'端以提供起始該胜肽轉譯之訊號。該甲硫胺酸可保持連接至該多胜肽，或者可藉由加入可催化甲硫胺酸從胜肽裂解之酶來除去該甲硫胺酸。例如，在原核生物和真核生物中，N端甲硫胺酸係藉由甲硫胺酸胺基胜肽酶(MAP)除去(Tsunasawa等人, 1985, J. Biol. Chem. 260, 5382-5391，其全部內容以引用方式併入本文)。現已從數種生物(包括大腸桿菌、酵母菌和大鼠)中單離並選殖甲硫胺酸胺基胜肽酶。

該胜肽可藉由已知方法從細菌、哺乳動物或其他宿主細胞類型或從培養基中回收(參見，例如Current Protocols in Immunology, vol. 2, chapter 8, Coligan等人(ed.), John Wiley & Sons, Inc.；Pathogenic and Clinical Microbiology: A Laboratory Manual by Rowland等人, Little Brown & Co., June 1994，其全部內容以引用方式併入本文)。

前述二種方法均可用於合成本文所揭示之多胜肽。例如，包含該HSP-結合之胜肽的胺基酸序列之胜肽可以化學方式合成並經由胜肽鍵與抗原性胜肽連接，可選擇地藉由重組DNA技術產生。

本發明範圍包括那些在轉譯期間或轉譯後修飾(例如藉由糖化、乙醯化、磷酸化、醯胺化(例如在C端羧基)，或藉由已知之保護/封閉基團或蛋白水解性裂解衍生化)之本文所揭示之多胜肽的衍生物或類似物。該多種化學修飾之任一者均可藉由已知技術進行，包括，但不限於用於保護或修飾下列群組之試劑：游離NH₂ -基團、游離COOH-基團、OH-基團、Trp-、Tyr-、Phe-、His-、Arg-或Lys-之側基；藉由溴化氰、羥基胺、BNPS-糞臭素(Skatole)、酸或鹼水解進行之特異性化學裂解；藉由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH₄ 進行之酶催化性裂解；乙醯化、甲醯化、氧化、還原；在衣黴素(tunimycin)之存在下進行代謝合成；等。6.4 醫藥組成物

於另一態樣中，本發明提供包含一或多種如本文所揭示之多胜肽的組成物(例如醫藥組成物)。於某些實施態樣中，本發明提供包含一或多種(例如二或更多種、三或更多種、四或更多種、五或更多種、10或更多種、或20或更多種)如本文所揭示之不同多胜肽的組成物(例如醫藥組成物)。於某些實施態樣中，本發明提供包含不超過30種不同之如本文所揭示之多胜肽的組成物(例如醫藥組成物)。於某些實施態樣中，本發明提供包含1至30種(例如2至20、3至20、4至20、5至20、5至15或5至10種)不同之如本文所揭示的多胜肽之組成物(例如醫藥組成物)。於某些實施態樣中，該不同之多胜肽各自包含相同之HSP-結合之胜肽和不同之抗原性胜肽。

於某些實施態樣中，該組成物進一步包含純化之壓力蛋白質。該等組成物可作為疫苗製劑。亦提供用於製造疫苗之方法，該方法包含將一或多種本文所揭示之組成物與純化之壓力蛋白質混合，從而使該純化之壓力蛋白質與至少一種該HSP-結合之抗原性軛合物或胜肽結合。6.4.1 與壓力蛋白質複合之多胜肽

於一特定之態樣中，本發明提供包含一或多種如本文所揭示之多胜肽和純化之壓力蛋白質的組成物(例如醫藥組成物)。於某些實施態樣中，至少一部分之該純化的壓力蛋白質與該組成物中之多胜肽結合。該等組成物可作為用於治療癌症或病原微生物感染之疫苗製劑。

於某些實施態樣中，在與純化之壓力蛋白質複合之前，該多胜肽可在100% DMSO中從粉末重構。然後可將等莫耳量之胜肽在使用無菌水稀釋之75% DMSO溶液中匯集。

於某些實施態樣中，在與純化之壓力蛋白質複合之前，可將該多胜肽在中性水中重構。

於某些實施態樣中，在與純化之壓力蛋白質複合之前，可將該多胜肽在含有HCl之酸性水中重構。

於某些實施態樣中，在與純化之壓力蛋白質複合之前，可將該多胜肽在含有NaOH之鹼性水中重構。

於某些實施態樣中，在與純化之壓力蛋白質複合之前，可測試各個多胜肽在水中之溶解度。若多胜肽可溶於中性水，則可使用中性水作為用於該多胜肽之溶劑。若該多胜肽不溶於中性水，則可測試在含有HCl，或另一種酸，例如醋酸、磷酸、或硫酸之酸性水中之溶解度。若該多胜肽可溶於含有HCl(或另一種酸)之酸性水中，則可使用含有HCl(或另一種酸)之酸性水作為該多胜肽之溶劑。若該多胜肽不溶於含有HCl(或另一種酸)之酸性水中，則可測試在含有NaOH之鹼性水中的溶解度。若該多胜肽溶於含有NaOH之鹼性水中，可使用含有NaOH之鹼性水作為多胜肽之溶劑。若該多胜肽不溶於含有NaOH之鹼性水中，則該多胜肽可能溶解於DMSO中。若該多胜肽不溶於DMSO中，則可將該多胜肽從該疫苗中排除。然後，可將該溶解之多胜肽混合以製造多胜肽匯集體。該溶解之多胜肽可以等體積混合。該溶解之多胜肽可以等莫耳量混合。

用於實踐本發明之壓力蛋白質(本文中亦可與熱休克蛋白(HSP)互換名稱)可選自能與其他蛋白質或胜肽結合且能夠在三磷酸腺苷(ATP)之存在下或在酸性條件下釋出該經結合之蛋白質或胜肽之任何細胞蛋白。當細胞暴露於壓力刺激時，該等蛋白質之細胞內濃度可能增加。除了由壓力誘導之那些熱休克蛋白質外，HSP60、HSP70、HSP90、HSP100、sHSP和PDI家族亦包括與由壓力誘導之HSP為序列相似性相關(例如具有高於35%之胺基酸同一性)，但其表現水準不會被壓力改變之蛋白質。因此，壓力蛋白質或熱休克蛋白質包含與該等在回應壓力刺激時在細胞中之表現水準會增加之家族成員具有至少35%(例如至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99%)之胺基酸同一性的其他蛋白質、突變體、類似物和變體。因此，於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為hsp60、hsp70或hsp90族之壓力蛋白質的成員(例如Hsc70、人Hsc70)或為其突變體、類似物或變體。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群體；hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、鈣網伴護蛋白、其突變體，及其二或更多項之組合。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsc 70(例如人Hsc 70)。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsp70(例如人Hsp70)。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質(例如人hsc70)為重組蛋白。

天然存在之HSP的胺基酸序列及核苷酸序列通常可在序列數據庫(諸如GenBank)中取得。例如智人(Homo sapiens)熱休克蛋白質HSP70(Heat Shock 70kDa Protein 1A)具有下列識別符：HGNC：5232；Entrez Gene：3303；Ensembl：ENSG00000204389；OMIM：140550；UniProtKB：P08107和NCBI參考序列：NM_005345.5。電腦程式，諸如Entrez，可用於瀏覽該數據庫並藉由登編號檢索任何所欲之胺基酸序列和基因序列數據。亦可使用程式，諸如FASTA和BLAST來搜索這些數據庫以識別與查詢序列具有不同程度之相似性的序列，該程式係藉由比對分數和統計學來對相似序列進行排序。可用於製備本發明之HSP胜肽-結合之片段的HSP之非限制性實例的核苷酸序列如下：人Hsp70，Genbank登錄編號 NM_005345，Sargent等人, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1968-1972；人Hsc70: Genbank登錄編號P11142、Y00371；人Hsp90，Genbank登錄編號X15183，Yamazaki等人, Nucl. Acids Res. 17:7108；人gp96: Genbank登錄編號X15187，Maki等人, 1990, Proc. Natl. Acad Sci., 87: 5658-5562；人BiP: Genbank登錄編號M19645；Ting等人, 1988, DNA 7: 275-286；人Hsp27, Genbank登錄編號M24743；Hickey等人, 1986, Nucleic Acids Res. 14:4127-45；小鼠Hsp70: Genbank登錄編號M35021, Hunt等人, 1990, Gene, 87:199-204；小鼠gp96: Genbank登錄編號M16370，Srivastava等人, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3807-3811；及小鼠BiP: Genbank登錄編號U16277, Haas等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2250-2254(這些參考文獻的每一篇之全部內容均以引用方式併入本文)。

除了上述之主要壓力蛋白質家族外，內質網駐留蛋白、鈣網伴護蛋白當與抗原分子複合時亦被視為可用於引發免疫反應之另一熱休克蛋白質(Basu and Srivastava, 1999, J. Exp. Med. 189:797-202；其全部內容以引用方式併入本文)。可用於本發明中之其他壓力蛋白質包括grp78(或BiP)、蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)、hsp110和grp170(Lin等人, 1993, Mol. Biol. Cell, 4:1109-1119；Wang等人, 2001, J. Immunol., 165:490-497，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。這些家族的許多成員隨後被發現於回應其他壓力刺激(包括營養缺乏、代謝破壞、氧自由基、缺氧和細胞內病原體感染)時被誘導出(參見Welch, May 1993, Scientific American 56-64； Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420； Craig, 1993, Science 260:1902-1903； Gething,等人, 1992, Nature 355:33-45；和Lindquist,等人, 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。屬於所有這些家族之HSP/壓力蛋白質被考慮可用於實行本發明。於某些實施態樣中，壓力蛋白質包含促進胜肽-MHC呈遞之任何伴侶蛋白。合適之伴侶蛋白包括，但不限於ER伴侶蛋白和TAP結合素(tapasin)(例如人TAP結合素)。

主要之壓力蛋白質可在承受壓力之細胞中積累至非常大量，但在未承受壓力之細胞中彼等之產生量為低至中等。例如，該可高度誘導之哺乳動物hsp70在常溫下幾乎無法檢測到，但在熱休克時則成為細胞中最積極合成的蛋白之一(Welch,等人, 1985, J. Cell. Biol. 101:1198-1211，其全部內容以引用方式被併入本文)。相反地，hsp90和hsp60蛋白在常溫下在大多數，但不是所有哺乳動物細胞中含量豐富且可進一步被熱誘導(Lai,等人, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-10；van Bergen en Henegouwen,等人, 1987, Genes Dev. 1:525-31，各篇之全部內容以引用方式併入本文中)。

於各種實施態樣中，編碼家族內之熱休克蛋白質或熱休克蛋白質之變體的核苷酸序列可藉由在低至中等嚴格之條件下使用包含編碼HSP之核苷酸序列的探針進行雜交來鑑定和取得。舉例而言，使用該等低嚴格性條件之程序如下(亦參見Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792)。在40ºC下，將含有DNA之過濾物在含有35%甲醯胺、5X SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll、1% BSA和500 μg/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中預處理6小時。在具有下列修飾之相同溶液中進行雜交：0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100μg/ml鮭魚精子DNA、10%(wt/vol)硫酸葡聚醣。將過濾物在40℃下，在雜交混合物中溫育18至20小時，然後在55℃下，在含有2×SSC、25 mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1% SDS之溶液中洗滌1.5小時。以新鮮溶液替換該洗滌溶液，並在60℃下再溫育1.5小時。將過濾物吸乾並暴露以進行訊號檢測。若需要時，在檢測訊號之前，將過濾物在65至68℃下洗滌第三次。可使用之其他低嚴格性條件為本技藝所熟知(例如用於跨物種雜交者)。

當使用壓力蛋白質時，亦可使用壓力蛋白質及其功能活性衍生物、類似物和變體之胜肽-結合片段。因此，於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為全長HSP。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為包含HSP之結構域的多胜肽(例如Hsp60、Hsp70或Hsp90族之成員，諸如Hsc70，特別是人Hsc70)，其中該結構域能夠與胜肽(例如，如本文所描述之HSP-結合之胜肽)非共價結合以形成複合物並可選擇地引發免疫反應，且其中該壓力蛋白質不是全長HSP。

於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為能夠與胜肽非共價結合之多胜肽(例如，如本文所描述之HSP-結合之胜肽)以形成複合物並可選擇地引發免疫反應，其中該壓力蛋白質與野生型HSP(例如Hsp60、Hsp70或Hsp90家族之成員，諸如Hsc70，特別是人Hsc70)具有高度之序列相似性。為了判定介於二個胺基酸序列或核酸序列之間的同一性區域，比對序列以供最佳比較(例如可在第一胺基酸或核酸序列的序列中引入間隙以與第二胺基酸或核酸序列做最佳比對)。然後，比較在對應之胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置被與第二序列中之對應位置處相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據，則在該位置處的分子為完全相同的。介於該二個序列之間的同一性百分比為該二個序列所共有之相同位置數的函數(即，%同一性=完全相同之重疊位置之數目/位置總數×100%)。於一實施態樣中，該二個序列之長度相同。

亦可使用數學算法來判定介於二個序列之間的同一性百分比。用於比較二個序列之數學算法的非限制性實例為Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268之算法，其係依Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877修改(各篇之全部內容以引用方式併入本文)。該等算法被併入Altschul,等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410(其全部內容以引用方式併入本文)之NBLAST和XBLAST程式中。BLAST核苷酸搜索可使用NBLAST程式進行，例如得分= 100，字長=12，以取得與本發明之核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可使用XBLAST程式進行，例如得分=50，字長=3以取得與本發明之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了取得用於比較目的之間隙比對，可依Altschul等人, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中之描述利用Gapped BLAST。或者，可使用PSI-Blast來執行迭代搜索，該迭代搜索係檢測分子之間的遠距離關係(Altschul et al.,1997，同上)。當使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程式時，可使用各別程式(例如XBLAST和NBLAST)之默認參數。用於比較序列之數學算法的另一實例為Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17之算法。該等算法被併入ALIGN程式(版本2.0)中，該ALIGN程式為GCG序列比對軟體包之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表，空隙長度罰分為12及空隙罰分為4。介於二個序列之間的同一性百分比可使用類似於上述技術判定(允許或不允許空隙)。在計算同一性百分比時，通常僅計算完全匹配。

於某些實施態樣中，使用經單離之壓力蛋白質(例如Hsp70和Hsc70)的胜肽-結合結構域。這些胜肽-結合結構域可藉由壓力蛋白質(例如Hsp70和Hsc70)之胜肽-結合位點之三維結構的電腦建模識別。參見，例如美國專利公開案US 2001/0034042中揭示之HSP的胜肽-結合片段(其全部內容以引用方式併入本文)。

於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為對靶的多胜肽之親和力高於天然壓力蛋白質對該靶的多胜肽之親和力的經突變之壓力蛋白質。當該靶的多胜肽被磷酸化或為磷酸胜肽模擬物(諸如不可水解之類似物)或具有一些其他的轉譯後修飾時，該等經突變之壓力蛋白質可能有用。

該壓力蛋白質可藉由從組織純化製備，或藉由重組DNA技術製備。HSP可在ATP之存在下或在酸性條件下(pH 1至pH 6.9)下從組織中純化，以供隨後在體外與一或多個多胜肽複合。參見Peng,等人, 1997, J. Immunol. Methods, 204:13-21；Li and Srivastava, 1993, EMBO J. 12:3143-3151(這些參考文獻的每一篇之全部內容以引用方式併入本文)。“純化的”壓力蛋白質基本上不含有與細胞中、細胞萃取物中、細胞培養基中或個體中之蛋白質聯結的物質。於某些實施態樣中，該從組織中純化之壓力蛋白質為不同HSP(例如hsp70和hsc70)之混合物。

使用指定之HSP或其胜肽-結合結構域之界定的胺基酸或cDNA序列，個人可製造被轉染入宿主細胞中並在宿主細胞中表現之遺傳構建體。該重組宿主細胞可含有一或多個包含編碼HSP或胜肽-結合片段之序列的核酸序列之副本，該序列與該驅動宿主細胞中之HSP核酸序列表現的調控區可操作地連接。重組DNA技術可很容易地用於產生重組HSP基因或HSP基因之片段，並可使用標準技術來表現該等HSP基因片段。編碼HSP胜肽-結合之結構域(包括cDNA和基因組DNA)的任何核酸序列均可用於製備本發明之HSP或胜肽-結合片段。該核酸序列可為野生型或為編碼該相同胺基酸序列之密碼子優化的變體。含有胜肽-結合結構域之HSP基因片段可被插入合適之選殖載體中並引入宿主細胞中，從而產生許多基因序列之副本。可使用大量本技藝已知之載體-宿主系統，諸如，但不限於噬菌體，諸如λ衍生物或質粒，諸如pBR322、pUC質粒衍生物、Bluescript載體(Stratagene)或pET系列載體(Novagen)。本技藝已知之任何用於誘變的技術均可用於修飾DNA序列中之個別核苷酸以在該表現之胜肽序列中製造胺基酸取代，或用於創建/刪除限制性位點以促進進一步的操作。

該壓力蛋白質可以融合蛋白之形式表現以促成從表現該壓力蛋白質之細胞中回收和純化。例如，該壓力蛋白質可含有訊號序列前導胜肽以指導該壓力蛋白質轉位跨越該內質網膜以分泌入培養基中。此外，該壓力蛋白質可含有親和標記，該親和標記與該不涉及與靶的多胜肽結合之蛋白質的任何部分融合，例如該羧基端。該親和標記可藉由與親和配偶體分子結合而用於促進該蛋白質純化。可使用本技藝已知之多種親和標記，其非限制性實例包括該免疫球蛋白恆定區、多組胺酸序列(Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel等人, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience，其全部內容以引用方式併入本文)、麩胱甘肽S-轉移酶(GST；Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229，其全部內容以引用方式併入本文)、大腸桿菌麥芽糖-結合蛋白(Guan et al.,1987, Gene 67:21-30，其全部內容以引用方式併入本文)和各種纖維素結合結構域(美國專利案第5,496,934；5,202,247；5,137,819號；Tomme等人, 1994, Protein Eng. 7:117-123，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。

可分析該等重組壓力蛋白質之胜肽-結合活性(參見，例如Klappa等人, 1998, EMBO J., 17:927-935，其全部內容以引用方式併入本文)以分析其引發免疫反應之能力。於某些實施態樣中，該宿主細胞中產生之重組壓力蛋白質與該免疫原性組成物之預期接受者屬於同一物種(例如人)。

該壓力蛋白質可與該多胜肽非共價或共價結合。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係與該多胜肽非共價結合。製備該等複合物之方法闡述於下文中。

該總多胜肽與總壓力蛋白質之莫耳比可為約0.01：1至約100：1之任何比例，包括，但不限於約0.01：1、0.02：1、0.05：1、0.1：1、0.2：1、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、30：1、40：1、49：1，至高為100：1。於某些實施態樣中，該組成物包含多個複合物，該多個複合物各自包含本文所揭示之多胜肽及壓力蛋白質，其中各複合物中之該多胜肽對壓力蛋白質之莫耳比為至少約1：1(例如約1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、30：1、40：1、49：1，至高為100：1)。

於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。該等比例，特別是接近1：1之比例是有利的，因為該組成物不包含大量過量之未與壓力蛋白質結合的游離胜肽。由於許多包含MHC-結合之抗原決定位的抗原性胜肽傾向於包含疏水區，因此過量之游離胜肽可能在製備和儲存該組成物之過程中趨於聚集。該多胜肽對該壓力蛋白質之高結合親和力使其可與壓力蛋白質以總多胜肽對總壓力蛋白質接近1：1(例如1：1、1.25：1、1.5：1或2：1)之莫耳比與壓力蛋白質大量複合。因此，於某些實施態樣中，該多胜肽以低於10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M或10^-9 M之K_d 與HSP(例如Hsc70、Hsp70，Hsp90，Hsp110、Grp170、Gp96或鈣網伴護蛋白)結合。於某些實施態樣中，該多胜肽以10^-3 M、10^-4 M、 10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M或更低之K_d 與Hsc70(例如人Hsc70)結合。

於某些實施態樣中，組成物中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之壓力蛋白質與該多胜肽結合。於某些實施態樣中，組成物中基本上所有壓力蛋白質與該多胜肽結合。

任何數量之不同多胜肽均可包括在如本文所揭示之單一組成物中。於某些實施態樣中，該組成物包含不超過100種不同之多胜肽，例如2至50、2至30、2至20、5至20、5至15、5至10或10至15種不同之多胜肽。於某些實施態樣中，每一該多胜肽皆包含相同之HSP-結合之胜肽和不同之抗原性胜肽。於某些實施態樣中，組成物包含單一壓力蛋白質，其中該壓力蛋白質能與該HSP-結合之胜肽結合。本發明之醫藥組成物可經過配製以含有一或多種醫藥上可接受之載體或賦形劑(包括填充劑、穩定劑、緩衝劑、氯化鈉、鈣鹽、表面活性劑、抗氧化劑、螯合劑、其他賦形劑及彼等之組合。

於製備該疫苗組成物之凍乾製劑時填充劑為較佳者。該等填充劑形成該凍乾產品之結晶型部分並可選自由下列所組成之群組：甘露醇、甘胺酸、丙胺酸和羥乙基澱粉(HES)。

穩定劑可選自由下列所組成之群組：蔗糖、海藻糖，棉子糖和精胺酸。這些試劑之存在量較佳為1至4%。包含在本發明之調配物中的氯化鈉之量較佳為100至300mM，或者若在無上述填充劑之情況下使用，該調配物中之NaCl的量可為300至500 mM。鈣鹽包括氯化鈣、葡萄糖酸鈣、葡乳醛酸鈣或葡庚糖酸鈣。

緩衝劑可為任何生理上可接受之化學實體或為具有作為緩衝劑之能力的化學實體之組合，包括，但不限於組胺酸、磷酸鉀、TRIS [三-(羥甲基)-胺基甲烷]、BIS-Tris丙烷(1,3-雙-[三-(羥甲基)甲胺基]-丙烷)、PIPES[六氫吡

-N,N'-雙-(2-乙磺酸)]、MOPS[3-(N-嗎啉基)乙磺酸]、HEPES (N-2-羥乙基-六氫吡

-N'-2-乙磺酸)、MES [2-(N-嗎啉基)乙磺酸]和ACES(N-2-乙醯胺基-2-胺基乙磺酸)。通常，包含之緩衝劑的濃度為10至50mM。鹼緩衝劑之特定實例包括(i)PBS；(ii)10mM KPO₄ 、150mM NaCl；(iii)10mM HEPES、150mM NaCl；(iv)10 mM咪唑、150mM NaCl；和(v)20 mM檸檬酸鈉。可使用之賦形劑包括(i)甘油(10%、20%)；(ii)吐溫50(0.05%、0.005%)；(iii) 9%蔗糖；(iv)20% 山梨糖醇；(v)10 mM離胺酸；或(vi)0.01 mM硫酸葡聚醣。

較佳地，表面活性劑(若存在時)之濃度為0.1%或更低且可選自下列群組：包括，但不限於聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、普朗尼克(pluronic)多元醇和BRIJ 35(聚氧乙烯23月桂基醚)。若使用時，抗氧化劑必須與所用之藥物製劑相容且較佳為水溶性的。合適之抗氧化劑包括高半胱胺酸、麩胱甘肽、硫辛酸、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-羧酸(Trolox)、甲硫胺酸、硫代硫酸鈉、鉑、甘胺酸-甘胺酸-組胺酸(三胜肽)和丁基化之羥基甲苯(BHT)。若在該組成物中使用鈣鹽，則螯合劑較佳為以高於與鈣之親和力來與金屬，諸如銅和鐵結合。示例性螯合劑為去鐵胺(deferoxamine)。

本技藝已知之許多調配物均可使用。例如美國專利案第5,763,401號中描述治療性調配物，其包含15至60 mM之蔗糖，至多50mM之NaCl，至多5 mM之氯化鈣，65至400mM甘胺酸和至多50 mM之組胺酸。於一些實施態樣中，該治療性調配物為在磷酸鉀緩衝液中之9% 蔗糖溶液。

美國專利案第5,733,873號(其全部內容以引用方式併入本文)中揭示包含0.01至1 mg/ml之表面活性劑的調配物。該專利案揭示具有在下列範圍內之賦形劑的調配物：含量至少0.01 mg/ml之聚山梨醇酯20或80，較佳為0.02至1.0 mg/ml；至少0.1 M之NaCl；至少0.5 mM之鈣鹽；和至少1 mM之組胺酸。更特別地，亦揭示下列特定調配物：(1)14.7-50-65mM組胺酸、0.31至0.6M NaCl、4mM氯化鈣、0.001-0.02-0.025%之聚山梨醇酯80、含有或不含有0.1% PEG 4000或19.9 mM蔗糖；和(2)20 mg/ml之甘露醇、2.67 mg/ml之組胺酸、18 mg/ml之NaCl、3.7 mM之氯化鈣和0.23 mg/ml之聚山梨醇酯80。

已有關於使用低濃度或高濃度氯化鈉之描述，例如美國專利案第4,877,608號(其全部內容以引用方式併入本文)教示具有相對低濃度之氯化鈉的調配物，諸如包含下列群組之調配物：0.5mM至15mM之NaCl、5 mM之氯化鈣、0.2 mM至5 mM之組胺酸、0.01至10 mM之離胺酸鹽酸鹽和至多10%之麥芽糖、10%之蔗糖或5%之甘露醇。

美國專利案第5,605,884號(其全部內容以引用方式併入本文)教示使用具有相對高濃度之氯化鈉的調配物。這些調配物包含0.35 M至1.2 M之NaCl，1.5至40 mM之氯化鈣，1 mM至50 mM之組胺酸和至多10%之糖(諸如甘露醇、蔗糖或麥芽糖)。示範之實例為包含0.45 M NaCl、2.3 mM氯化鈣和1.4 mM組胺酸之調配物。

國際專利申請案第WO 96/22107號(其全部內容以引用方式併入本文)中描述包含海藻糖之調配物，例如包含下列各項之調配物：(1) 0.1 M NaCl、15 mM氯化鈣、15 mM組胺酸和1.27 M(48%)海藻糖；或(2) 0.011% 氯化鈣、0.12% 組胺酸、0.002% TRIS、0.002%吐溫80、0.004% PEG 3350、7.5%海藻糖；和0.13%或1.03% NaCl。

美國專利案第5,328,694號(其全部內容以引用方式併入本文)中描述包含100至650 mM雙醣和100 mM至1.0 M胺基酸之調配物，例如(1)0.9 M蔗糖、0.25 M甘胺酸、0.25 M離胺酸和3 mM氯化鈣；(2)0.7 M蔗糖、0.5 M甘胺酸和5 mM氯化鈣。可選擇地，可將醫藥組成物製備成凍乾產品，然後可將其配製成用於口服投予或重構成用於經由腸胃道外投予之液體形式。

於某些實施態樣中，該組成物在經投予該組成物之個體中刺激T細胞反應，該T細胞反應係針對表現或展示包含一或多個MHC-結合之抗原決定位之多胜肽的細胞。該表現該多胜肽之細胞可為包含編碼該多胜肽之多核苷酸的細胞，其中該多核苷酸係在該細胞之基因組中、在游離型載體中或在已經感染該細胞之病毒的基因組中。展示該多胜肽之細胞可不包含編碼該多胜肽之多核苷酸且可藉由令該細胞與該多胜肽或其衍生物接觸來產生。

於某些實施態樣中，該組成物在體外誘導從個體單離出之外周血單核細胞(PBMC)中之T細胞活化。體外活化T細胞包括，但不限於體外增殖T細胞、產生來自T細胞之細胞因子(例如IFNγ)及增加T細胞上之活化標記物(例如CD25、CD45RO)的表面表現。6.4.2 製備多胜肽和壓力蛋白質之複合物

於另一態樣中，本發明提供製造疫苗之方法，該方法包含將一或多種如本文所揭示之多胜肽在合適之條件下與純化之壓力蛋白質在體外混合，從而使該純化之壓力蛋白質與至少一種該多胜肽結合。該方法在本文中亦稱為複合反應。於某些實施態樣中，使用二或更多種純化之壓力蛋白質，其中各純化之壓力蛋白質與至少一種該多胜肽結合。

該壓力蛋白質可與該多胜肽非共價或共價結合。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質與該多胜肽非共價結合。於各種實施態樣中，可將該在體外形成之複合物需要地純化。壓力蛋白質和多胜肽之純化的複合物基本上不含有在細胞或細胞萃取物中與該等複合物聯結之物質。當在體外複合反應中使用純化之壓力蛋白質和純化之多胜肽時，術語“純化之複合物”並不排除該亦包含不在複合物中之游離的壓力蛋白質和軛合物或胜肽的組成物。

上文描述之任何壓力蛋白質均可用於本發明之方法中。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白、其突變體及彼等之二或更多種之組合。於一實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsc70，例如人Hsc70。於另一實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsp70，例如人Hsp70。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質(例如人Hsc70或人Hsp70)為重組蛋白。

在複合之前，該HSP可使用ATP預處理或暴露於酸性條件以除去任何可能與所欲之HSP非共價結合的胜肽。酸性條件為低於pH 7之任何pH值，包括pH 1至pH 2、pH 2至pH 3、pH 3至pH 4、pH 4至pH 5、pH 5至pH 6和pH 6至pH 6.9之範圍。當使用ATP程序時，過量之ATP係依Levy,等人, 1991, Cell 67:265-274 (其全部內容以引用方式併入本文)之描述，藉由添加三磷酸脲苷雙磷酸酶(apyranase)來從製劑中除去。當使用酸性條件時，該緩衝液係藉由添加pH修飾劑來重新調整至中性pH。

該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比可為0.01：1至100：1之任何比例，包括，但不限於0.01：1、0.02：1、0.05：1、0.1：1、0.2：1、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、30：1、40：1、49：1、最高達100：1。於某些實施態樣中，該待製備之組成物包含多個複合物，該複合物各自包含本文所揭示之多胜肽和壓力蛋白質，且該複合反應包含將該多胜肽與該壓力蛋白質混合，其中在各複合物中之該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為至少1:1(例如約2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、30：1、40：1、49：1、最高為100：1)。

於某些實施態樣中，該總多胜肽對該總壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。該等比例，特別是接近1：1之比例的有利處在於該組成物不包含大量過量之未與壓力蛋白質結合之游離胜肽。由於許多包含MHC-結合之抗原決定位之抗原性胜肽傾向於包含疏水區，因此在組成物之製備和儲存期間，過量之游離胜肽可能趨向聚集。藉由該多胜肽對該壓力蛋白質之高結合親和力能夠使總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比接近1：1(例如1：1、1.25：1、1.5：1或2：1)時與壓力蛋白質之大量複合成為可行。因此，於某些實施態樣中，該用於複合反應之多胜肽係以低於 10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M或10^-9 M之K_d 與HSP(例如Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96或鈣網伴護蛋白)結合。於某些實施態樣中，該多胜肽係以低於10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、 10^-8 M、10^-9 M或更低之K_d 與Hsc70(例如人Hsc70)結合。

本文所揭示之方法可用於大量(例如大於或等於30mg、50mg、100mg、200mg、300mg、500mg、或1克之總胜肽和蛋白質)製備組成物(例如醫藥組成物或疫苗)。然後可將該製備之組成物轉移到一次性或多次使用之容器中，或分配到單位劑型中。或者，本文所揭示之方法可用於製備少量(例如少於或等於300μg、1 mg、3 mg、10mg、30 mg、或100 mg之總胜肽和蛋白質)之組成物(例如醫藥組成物或疫苗)。於某些實施態樣中，該組成物可製備成用於單次使用，可選擇地為單位劑型。

於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之該多胜肽和壓力蛋白質之總量為約10μg至600μg(例如約50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg)。於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之該多胜肽和壓力蛋白質之總量為約300μg。單位劑型中之壓力蛋白質和多胜肽的量揭示於下文中。

本文中提供用於多胜肽群與壓力蛋白質在體外非共價複合之示例性方案。多胜肽群可包含本發明中之不同多胜肽物種的混合物。然後，將混合物與純化和/或預處理之壓力蛋白質在合適之結合緩衝液中在4℃至50℃(例如37℃)下溫育15分鐘至3小時(例如1小時)，該結合緩衝液為，諸如磷酸鹽緩衝之鹽水pH 7.4，其可選擇地補充0.01%聚山梨醇酯20；在磷酸鉀緩衝液中包含9%蔗糖之緩衝液；包含2.7 mM磷酸氫二鈉、1.5 mM磷酸二氫鉀、150 mM NaCl，pH7.2之緩衝液；含有20mM磷酸鈉，pH 7.2至7.5、350至500 mM NaCl、3 mM MgCl₂ 和1 mM苯基甲基磺醯氟(PMSF)之緩衝液；及可選擇地包含1 mM ADP之緩衝液。可使用任何可與該壓力蛋白質相容之緩衝液。然後可選擇地藉由Centricon 10裝配(Millipore；Billerica，MA)進行離心來純化該製劑以除去任何未經結合之胜肽。該蛋白質/胜肽與HSP之非共價結合可藉由高效液相色層分析法(HPLC)、質譜分析(MS)、混合之淋巴細胞靶細胞分析(MLTC)或酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析(Taguchi T等人，J Immunol Methods 1990；128：65-73，其全部內容以引用併入本文)來進行分析。該複合物一旦經單離並稀釋後，可進一步在動物模型中可選擇地使用本文所描述之投予方案和賦形劑進行表徵(參見，例如下文中之實施例2)。

可製備來自不同之共價和/或非共價複合反應之壓力蛋白質和多胜肽的複合物以在投予個體之前形成組成物。於某些實施態樣中，該組成物係在投予個體之前的1、2、3、4、5、6或7天內製備。於某些實施態樣中，該組成物係在投予個體之前的1、2、3、4、5、6、7或8週內製備。於某些實施態樣中，該組成物係在投予個體之前的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月內製備。在製備後和使用前，可將該組成物視需要地在約4℃、-20℃或-80℃下儲存。

於某些實施態樣中，該藉由本文所揭示之方法製備之複合物係在投予患者之前不久在床邊與佐劑混合。於某些實施態樣中，該佐劑包含皂苷或免疫刺激性核酸。於某些實施態樣中，該佐劑包含QS-21。於某些實施態樣中，該QS-21之劑量為10μg、25μg或50μg。於某些實施態樣中，該QS-21之劑量為50μg。於某些實施態樣中，該佐劑包含TLR促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR4促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR7和/或TLR8促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR9促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR5促效劑。

作為製造壓力蛋白質與多胜肽之非共價複合物的替代方法，該多胜肽可，例如藉由化學交聯或UV交聯共價連接壓力蛋白質。本技藝中已知之任何化學交聯或UV交聯方法(參見，例如Wong, 1991, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRC出版社，其全部內容以引用方式併入本文)均可採用。例如，可使用戊二醛交聯法(參見，例如Barrios等人, 1992, Eur. J. Immunol. 22: 1365-1372，其全部內容以引用方式併入本文)。於示例性方案中，將1至2mg之HSP-胜肽複合物在0.002%戊二醛之存在下交聯2小時。藉由對磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)透析過夜來除去戊二醛(Lussow等人, 1991, Eur. J. Immunol. 21: 2297-2302，其全部內容以引用方式併入本文)。6.4.3 疫苗

本文所揭示之組成物可作為疫苗。因此，於另一態樣中，本發明提供疫苗調配物。該疫苗調配物可藉由任何能產生穩定、無菌，較佳為可注射之調配物的方法製備。

於某些實施態樣中，該疫苗包含本文所揭示之一或多種組成物和一或多種佐劑。可使用之佐劑有多種，包括，例如全身性佐劑和黏膜佐劑。全身性佐劑為可經由胃腸道外途徑遞送之佐劑。全身性佐劑包括可創建貯庫效應之佐劑、刺激註免疫系統之佐劑和具有該二種作用之佐劑。

創建貯庫效應之佐劑為使該抗原在體內緩慢釋出，從而延長免疫細胞暴露於該抗原之佐劑。此類別之佐劑包括明礬(例如氫氧化鋁、磷酸鋁)；或基於乳劑之調配物，包括礦物油、非礦物油、油包水或油包水包油乳劑、水包油乳劑，諸如Seppic ISA系列之Montanide佐劑(例如Montanide ISA 720，AirLiquide，法國巴黎)；MF-59(使用Span 85和Tween 80穩定之水包角鯊烯乳劑；Chiron Corporation，加州Emeryville)；和PROVAX(含有穩定洗滌劑和膠束形成劑之水包油乳劑；IDEC，Pharmaceuticals Corporation，加州聖地牙哥)。

其他佐劑刺激該免疫系統，例如導致免疫細胞產生和分泌細胞因子或IgG。該類佐劑包括免疫刺激性核酸，諸如CpG寡核苷酸；從皂皮樹(Q. saponaria tree)之樹皮中純化之皂苷，諸如QS-21；聚[二(羧基苯氧基)磷腈(PCPP聚合物；美國病毒研究所)；RNA模擬物，諸如聚肌胞苷：聚胞苷酸(聚I：C)或使用聚離胺酸穩定化之聚I：C (聚-ICLC[Hiltonol®；Oncovir，Inc.]；脂多醣衍生物(LPS)，諸如單磷醯脂質A(MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，蒙大拿州漢彌爾頓(Hamilton，Mont))、胞壁醯二胜肽(MDP；Ribi)和蘇胺醯-胞壁醯二胜肽(t-MDP； Ribi)；OM-174(與脂質A相關之葡糖胺二糖；OM Pharma SA，瑞士Meyrin)；和利甚曼原蟲延伸因子(純化之利甚曼原蟲蛋白；Corixa Corporation，華盛頓州西雅圖)。

其他全身性佐劑為創建貯庫效果並刺激免疫系統之佐劑。這些化合物同時具有上文鑑別之全身性佐劑的二種功能。該類佐劑包括，但不限於ISCOM(免疫刺激複合物，其含有混合之皂苷、脂質並形成具有可容納抗原之小孔的病毒大小顆粒；CSL，澳洲墨爾本)；AS01，其為含有MPL和QS-21之基於脂質體的調配物(GlaxoSmithKline，比利時)；AS02(GlaxoSmithKline，其為含有MPL和QS-21之水包油乳劑：GlaxoSmithKline，比利時Rixensart)；AS04(GlaxoSmithKline，其含有明礬和MPL；GSK，比利時)；AS15，其為含有CpG寡核苷酸、MPL和QS-21之基於脂質體之調配物(GlaxoSmithKline，比利時)；形成膠束之非離子性嵌段共聚物，諸如CRL 1005(其含有側邊鄰接聚氧乙烯鏈之疏水性聚氧丙烯直鏈；Vaxcel公司，喬治亞州Norcross)；和Syntex佐劑調配物(SAF，含有吐溫80和非離子性嵌段共聚物之水包油乳劑；Syntex Chemicals公司，科羅拉多州Boulder)。

根據本發明之有用的黏膜佐劑為當與本發明之複合物一起投予至黏膜表面時能在個體中誘導黏膜免疫反應之佐劑。黏膜佐劑包括CpG核酸(例如PCT發表之專利申請案WO 99/61056，其全部內容以引用方式併入本文)、細菌毒素：例如霍亂毒素(CT)、CT衍生物，包括，但不限於CT B次單位(CTB)；CTD53(Val至Asp)；CTK97(Val至Lys)；CTK104(Tyr至Lys)；CTD53/K63(Val至Asp，Ser至Lys)；CTH54(Arg至His)；CTN107(His至Asn)；CTE114(Ser至Glu)；CTE112K(Glu至Lys)；CTS61F(Ser至Phe)；CTS 106(Pro至Lys)；和CTK63(Ser至Lys)、閉鎖帶狀毒素(Zonula occludens toxin)(zot)、大腸桿菌熱不穩定腸毒素、不穩定毒素(LT)、LT衍生物，包括，但不限於LT B次單位(LTB)；LT7K(Arg至Lys)；LT61F(Ser至Phe)；LT112K(Glu至Lys)；LT118E(Gly至Glu)；LT146E(Arg至Glu)；LT192G(Arg至Gly)；LTK63(Ser至Lys)；和LTR72(Ala至Arg)、百日咳毒素，PT.，包括PT-9K/129G；毒素衍生物(見下文)；脂質A衍生物(例如單磷醯脂質A，MPL)；胞壁醯二胜肽(MDP)衍生物；細菌外膜蛋白(例如伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi )之外表面蛋白A(OspA)脂蛋白、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis )之外膜蛋白)；油包水乳劑(例如MF59；鋁鹽(Isaka等人, 1998, 1999)；和皂苷(例如QS-21，例如QS-21 STIMULON®、Antigenics LLC，麻薩諸塞州Lexington)、ISCOM、MF-59(使用Span 85和Tween 80穩定化之水包角鯊烯乳劑；Chiron Corporation，加州Emeryville)；Seppic ISA系列之Montanide佐劑(例如Montanide ISA 720； AirLiquide，法國巴黎)；PROVAX(含有穩定洗滌劑和膠束形成劑之水包油乳劑；IDEC Pharmaceuticals Corporation，加州聖地牙哥)；Syntext佐劑調配物(SAF；Syntex化學公司，科羅拉多州Boulder)；聚[二(羧基苯氧基)]磷腈(PCPP聚合物；Virus Research Institute，USA)和利甚曼原蟲延伸因子(Corixa Corporation，華盛頓州西雅圖)。

於某些實施態樣中，添加在本文所揭示之組成物中之佐劑包含皂苷和/或免疫刺激性核酸。於某些實施態樣中，該添加至該組成物中之佐劑包含或進一步包含QS-21。

於某些實施態樣中，添加在本文所揭示之組成物中的佐劑包含Toll樣受體(TLR)促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR4促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR7和/或TLR8促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR9促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR5促效劑。

本文所描述之本發明的組成物可以數種方式與佐劑組合。例如，可先將不同多胜肽混合在一起以形成混合物，然後與壓力蛋白質和/或佐劑複合以形成組成物。另一實例為可將不同的多胜肽個別與壓力蛋白質和/或佐劑複合，然後可將所產生之複合物的批次混合以形成組成物。

該佐劑可在投予包含壓力蛋白質和多胜肽之複合物的組成物之前、期間或之後投予。該佐劑和組成物可投予在相同或不同之投予部位。6.4.4 單位劑型

於另一態樣中，本發明提供本文所揭示之醫藥組成物或疫苗的單位劑型。

根據該多胜肽、壓力蛋白質和/或佐劑之化學性質和效力，本發明之疫苗調配物的效力可隨該多胜肽、壓力蛋白質和/或佐劑之量和濃度而變化。典型地，該疫苗調配物之起始量和濃度為那些傳統上用於使用傳統之投予途徑(例如肌內注射)引發期望之免疫反應者。然後可調節該胜肽、軛合物、壓力蛋白質和/或佐劑之量和濃度(例如使用稀釋劑藉由稀釋調節)，從而在使用本技藝已知之標準方法評估時實現有效之保護性免疫反應(例如藉由抗體或T細胞對該疫苗調配物相對於對照調配物之反應來判定)。

於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之多胜肽和壓力蛋白質的總量為約10μg至600μg(例如約50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg)。於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之多胜肽和壓力蛋白質的總量為約300μg。於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之壓力蛋白質的量為約250μg至290μg。

於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之壓力蛋白質的量為約10μg至600μg(例如約50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg)。於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之壓力蛋白質的量為約300μg。該多胜肽之量係基於該多胜肽之指定的莫耳比和分子量計算。

於某些實施態樣中，該醫藥組成物之單位劑型中之多胜肽的總莫耳量為約0.1至10 nmol(例如約0.1 nmol、0.5 nmol、1 nmol、2 nmol、3 nmol、4 nmol、5 nmol、6 nmol、7 nmol、8 nmol、9 nmol或10 nmol)。於某些實施態樣中，該醫藥組成物之單位劑型中之多胜肽的總莫耳量為約4 nmol。於某些實施態樣中，該醫藥組成物之單位劑型中之多胜肽的總莫耳量為約5 nmol。

該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比可為約0.01：1至約100：1之任何比例，包括，但不限於約0.01：1、0.02：1、0.05：1、0.1：1、0.2：1、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、30：1、40：1、49：1，最高為100：1。於某些實施態樣中，該組成物包含多個複合物，該多個複合物各自包含多胜肽和壓力蛋白質，其中各複合物中之該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為至少約1：1(例如約1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、30：1、40：1、49：1，最高為100：1)。於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。

於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。於某些實施態樣中，該總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。該等比例，特別是接近1：1之比例的有利處在於該組成物不包含大量過量之未與壓力蛋白質結合的游離胜肽。由於許多包含MHC-結合之抗原決定位的抗原性胜肽傾向於包含疏水區，因此在組成物之製備和儲存期間，過量之游離胜肽可能趨向聚集。藉由該多胜肽對該壓力蛋白質之高結合親和力能夠使總多胜肽對總壓力蛋白質之莫耳比接近1：1(例如1：1、1.25：1、1.5：1或2：1)時與壓力蛋白質之大量複合成為可行。因此，於某些實施態樣中，該多胜肽係以低於10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M或10^-9 M之K_d 與HSP(例如Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96或鈣網伴護蛋白)結合。於某些實施態樣中，該多胜肽係以低於10^-3 M、10^-4 M、10^-5 M、 10^-6 M、10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M或更低之K_d 與Hsc70(例如人Hsc70)結合。

提供計算在該單位劑型中之組分的量之方法。例如，於某些實施態樣中，該多胜肽之平均分子量為約3 kD且HSC 70之分子量為約71 kD。假設於一實施態樣中，該醫藥組成物中之多胜肽和壓力蛋白質之總量為300μg且該多胜肽對Hsc70之莫耳比為1.5：1。該Hsc70之莫耳量之計算法係將300μg除以71 kD+ 1.5×3 kD，結果為約4.0 nmol，而該Hsc70之質量的計算法係將莫耳量與71 kD相乘，結果為約280 kD。該多胜肽之總莫耳量的計算法為1.5×4.0 nmol，結果為6.0 nmol。若使用10種不同之多胜肽，則各多胜肽之莫耳量為0.60 nmol。假設於另一實施態樣中，單位劑型中意圖包含300μg之Hsc70劑量且該多胜肽對Hsc70之莫耳比為1.5：1。該多胜肽之總莫耳量的計算法為將300μg除以71 kD，再乘1.5，結果為6.3 nmol。若使用10種不同之多胜肽，則各多胜肽之莫耳量為0.63 nmol。在其中一或多個該變量與實施例中之變量不同的情況中，該壓力蛋白質和該多胜肽之量係據此縮放。

應進一步理解的是，該單位劑型可選擇地包含一或多種如上文揭示之佐劑。於某些實施態樣中，該佐劑包含皂苷和/或免疫刺激核酸。於某些實施態樣中，該佐劑包含或進一步包含QS-21。於某些實施態樣中，該醫藥組成物之單位劑型中的QS-21之量為10μg、25μg或50μg。於某些實施態樣中，該醫藥組成物之單位劑型中的QS-21之量為50μg。於某些實施態樣中，該佐劑包含Toll樣受體(TLR)促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR4促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR7和/或TLR8促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR9促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR5促效劑。6.5 使用方法

本文所揭示之組成物(例如醫藥組成物)、疫苗調配物和單位劑型可用於誘導細胞免疫反應。壓力蛋白質可經由膜受體(主要為CD91)或藉由與Toll樣受體結合將免疫原性胜肽遞送通過抗原呈遞細胞(APC)(例如巨噬細胞和樹突狀細胞(DC))中之交叉呈遞通路，從而導致CD8⁺ 和CD4⁺ T細胞活化。壓力蛋白質-胜肽複合物之內化造成APC功能成熟，產生趨化因子和細胞因子而導致天然殺手細胞(NK)、單核細胞及由Th1和Th-2介導之免疫反應活化。

因此，於一態樣中，本發明提供誘導個體中針對抗原性胜肽之細胞免疫反應的方法，該方法包含對該個體投予有效量之如本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型。於另一態樣中，本發明提供治療個體之疾病(例如癌症或感染)的方法，該方法包含對該個體投予有效量之如本文揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型。如本文所揭示之該組成物(例如醫藥組成物)、疫苗調配物和單位劑型亦可用於製備用於治療個體之藥物或疫苗。

於各種實施態樣中，該等個體可為動物，例如哺乳動物、非人類靈長類動物和人。術語“動物”包括伴侶動物，諸如貓和狗；動物園動物；野生動物，包括鹿、狐狸和浣熊；農場動物、牲畜和家禽，包括馬、牛、羊、豬、火雞、鴨和雞，及實驗動物，諸如齧齒動物、兔子和天竺鼠。於某些實施態樣中，該個體患有癌症。於某些實施態樣中，該個體具有病原微生物之感染。6.5.1 治療癌症

本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型可單獨使用或與其他用於治療癌症之療法組合。該HSP-結合之抗原性軛合物或胜肽中之一或多個MHC-結合之抗原決定位可存在於該個體之癌細胞中。於某些實施態樣中，一或多個該MHC-結合之抗原決定位在癌症之類型和/或階段中很普遍或常被找到。如本文所使用者，術語“常在癌症中找到”係指在多於5%之癌症中找到之一或多個突變體MHC-結合之抗原決定位。於某些實施態樣中，一或多個該MHC-結合之抗原決定位係特異於該個體之癌症。

可使用本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型治療之癌症包括，但不限於實體瘤、血液癌症(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤)和轉移病灶。於一實施態樣中，該癌症為實體瘤。實體瘤之實例包括惡性腫瘤，例如肉瘤和癌瘤，例如各種器官系統之腺癌，諸如影響肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃腸(例如結腸)、肛門、生殖器和泌尿生殖道(例如腎、尿路上皮、膀胱細胞、前列腺)、咽、CNS(例如腦、神經或神經膠質細胞)、頭頸部、皮膚(例如黑色素瘤)和胰腺，以及腺癌，包括，諸如結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌(例如非小細胞肺癌或小細胞肺癌)、小腸癌和食道癌等惡性腫瘤。該癌症可能為早期、中期、末期或轉移性癌症。於某些實施態樣中，該癌症與升高之PD-1活性(例如升高之PD-1表現)相關。

於一實施態樣中，該癌症係選自肺癌(例如肺腺癌或非小細胞肺癌(NSCLC)(例如具有鱗狀和/或非鱗狀組織學之NSCLC，或NSCLC腺癌))、黑色素瘤(例如末期黑色素瘤)、腎癌(例如腎細胞癌)、肝癌(例如肝細胞癌或肝內膽管癌)、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、前列腺癌、乳癌(例如不表現一、二個或全部雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu之乳癌，例如三陰性乳癌)、卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌、頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、肛門癌、胃食道癌(例如食道鱗狀細胞癌)、間皮瘤、鼻咽癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、上皮癌、腹膜癌或淋巴組織增生性疾病(例如移植後淋巴組織增生性疾病)。於一實施態樣中，該癌症為NSCLC。於一實施態樣中，該癌症為腎細胞癌。於一實施態樣中，該癌症為卵巢癌，可選擇地，其中該卵巢癌與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關。於一特定之實施態樣中，該卵巢癌為鉑難治性卵巢癌。

於一實施態樣中，該癌症為血液癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。於一實施態樣中，該癌症為白血病，例如急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性成髓細胞白血病(AML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性髓樣白血病(CML)、慢性髓性單核細胞白血病(CMML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)或髮細胞白血病。於一實施態樣中，該癌症為淋巴瘤，例如B細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化之B細胞樣(ABC)瀰漫性大B細胞淋巴瘤、生發中心B細胞(GCB)瀰漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、復發之非何杰金氏淋巴瘤、難治性非何杰金氏淋巴瘤、反複發生之濾泡性非何杰金氏淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤或結外邊緣區淋巴瘤。於一實施態樣中，該癌症為骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤。

於另一實施態樣中，該癌症係選自癌瘤(例如末期或轉移性癌瘤)、黑色素瘤或肺癌瘤，例如非小細胞肺癌。

於一實施態樣中，該癌症為肺癌，例如肺腺癌、非小細胞肺癌或小細胞肺癌。

於一實施態樣中，該癌症為黑色素瘤，例如末期黑色素瘤。於一實施態樣中，該癌症為對其他療法無反應之末期或無法切除之黑色素瘤。於其他實施態樣中，該癌症為具有BRAF突變之黑色素瘤(例如BRAF V600突變)。再於其他實施態樣中，本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型係在使用抗-CTLA-4抗體(例如伊普利姆單抗(ipilimumab))，加上或不加上BRAF抑制劑(例如威羅非尼(vemurafenib)或達拉非尼(dabrafenib))進行治療後投予。

於另一實施態樣中，該癌症為肝癌，例如具有或不具有病毒感染之末期肝癌，例如慢性病毒性肝炎。

於另一實施態樣中，該癌症為前列腺癌，例如末期前列腺癌。

再於另一實施態樣中，該癌症為骨髓瘤，例如多發性骨髓瘤。

再於另一實施態樣中，該癌症為腎癌，例如腎細胞癌(RCC)(例如轉移性RCC、透明細胞腎細胞癌(CCRCC)或腎乳頭狀細胞癌)。

再於另一實施態樣中，該癌症係選自肺癌、黑色素瘤、腎癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、或該癌症之轉移灶。

當檢測到癌症，或在癌症復發之前或發作期間可投予本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型。

投予可在癌症之第一個徵兆時或復發時開始，隨後投予加強劑量直到至少症狀大幅減輕且再持續一段時間。

於一些實施態樣中，可將該組成物投予已經歷腫瘤切除手術之患有癌症之個體，該腫瘤切除手術導致切除之腫瘤組織的量不足(例如切除之腫瘤組織少於7g、少於6g、少於5g、少於4g、少於3g、少於2g、或少於1g)以用於產生治療有效量之自體癌症疫苗，該自體癌症疫苗之治療有效量包含從該切除之腫瘤組織收集的代表性抗原組。參見，例如Expert Opin. Biol. Ther. 2009 Feb;9(2): 179-86(其全部內容以引用方式併入本文) 中描述之癌症疫苗。

本發明之組成物、疫苗調配物和單位劑型亦可用於對抗癌症復發之免疫化。對個體預防性投予組成物可賦予針對未來癌症復發之保護。6.5.2 治療感染

本發明之組成物、疫苗調配物和單位劑型可單獨使用或與其他用於治療微生物感染(例如病原微生物感染)之療法組合使用。該HSP-結合之抗原性軛合物或胜肽中之一或多個MHC-結合之抗原決定位可從該微生物鑑定出。於某些實施態樣中，該一或多個MHC-結合之抗原決定位存在於該微生物之表面或被該微生物感染之細胞中。

可使用本發明之組成物、疫苗調配物和單位劑型治療之感染包括，但不限於病毒感染、細菌感染、真菌感染、原生動物感染或寄生蟲感染。

可藉由本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型治療之病毒感染包括，但不限於由下列群組所引起者：A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、流感(例如A型流感或B型流感)、水痘、腺病毒、第I型單純皰疹(HSV-I)、第Ⅱ型單純皰疹病毒(HSV-Ⅱ)、牛瘟病毒(rinderpest)、鼻病毒、埃可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒(例如人乳頭瘤病毒(HPV))、乳多空病毒(papova virus)、巨細胞病毒、棘狀病毒、蟲媒病毒、漢他病毒、手足口病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、脊髓灰質炎病毒、愛潑斯坦-巴爾(Epstein Barr)病毒(EBV)、第I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)、第Ⅱ型人類免疫缺陷病毒(HIV-Ⅱ)、登革熱病毒、天花病毒、狂犬病病毒、狂犬病病毒和滋卡病毒。可根據本文所描述之方法治療之任一由該等病毒引起的病毒性疾病包括，但不限於發熱、免疫缺陷、病毒性腦膜炎和腦炎。

可藉由本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型治療之細菌感染包括，但不限於由大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、草綠色葡萄球菌和銅綠假單胞菌所引起之感染。由可根據本文所描述之方法治療之任一該等細菌引起的細菌疾病包括，但不限於立克次氏體分枝桿菌、支原體、奈瑟氏球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi) (萊姆病)、芽孢桿菌(炭疽)、破傷風菌、鏈球菌、葡萄球菌、分枝桿菌、百日咳、霍亂、鼠疫、白喉、衣原體、金黃色葡萄球菌和軍團菌之疾病。

可藉由本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型治療之真菌感染包括，但不限於由念珠菌(例如光滑念珠菌(Candida glabrata ))、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii ,)、角膜炎鐮刀菌(Fusarium keratitis )、球蟲、黑曲黴、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )和膝曲彎孢菌(Curvularia geniculata)引起之感染。由可根據本文所描述之方法治療之任一該等細菌所引起之真菌疾病包括，但不限於接合菌病(zygomycosis)、念珠菌乳腺炎(Candida mastitis)、具有潛伏性毛孢子蟲血症的進行性播散性毛孢子蟲病(progressive disseminated trichosporonosis with latent trichosporonemia)、播散性念珠菌病(disseminated candidiasis)、肺部球孢子菌病(pulmonary paracoccidioidomycosis)、肺曲黴病(pulmonary aspergillosis)、卡氏肺孢子蟲肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia)、隱球菌性腦膜炎(cryptococcal meningitis)、球蟲菌腦膜腦炎和腦脊髓炎、鼻竇真菌病、煙曲黴心內膜炎、脛骨軟骨發育不良、光滑念珠菌陰道炎、口咽念珠菌病、X連鎖慢性肉芽腫病、足癬、皮膚念珠菌病、黴菌性胸膜炎、播散性毛孢子蟲病、過敏性支氣管肺動脈曲黴菌病、真菌性角膜炎、真菌性腹膜炎、葡萄球菌性眼內炎、孢子絲菌病和皮膚癬菌病。

可藉由本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型治療之原生動物感染包括，但不限於由利甚曼原蟲、球蟲病、錐蟲、血吸蟲和瘧原蟲引起之感染。

可藉由本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型治療之寄生蟲感染包括，但不限於由衣原體和立克次氏體引起之感染。

本發明之組成物、疫苗調配物和單位劑型可用於將藉由本技藝已知之任何醫學方法被診斷出患有感染之個體進行免疫化。它們可用於對已暴露於病原微生物、將暴露於病原微生物或處於感染傳染病之高風險下的個體進行免疫化以用於預防。6.5.3 組合療法

組合療法係指使用本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型作為第一治療模態(modality)，與第二治療模態組合以治療癌症或感染。因此，於某些實施態樣中，本揭示內容提供誘導個體中針對如本文所揭示之抗原性胜肽之細胞免疫反應的方法，或治療個體中如本文所揭示之疾病的方法，該方法包含對該個體投予有效量之(a)如本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型和(b)第二治療模態。

於一實施態樣中，該第二治療模態為非HSP治療模態，例如不包含HSP作為組分之治療模態。該種方法通常被稱為組合療法、輔助療法或結合療法(這些術語可互換使用)。藉由組合療法，可觀察到加成效力或加成之治療效果。當該治療效力大於加成效力時可尋求協同作用之結果。使用組合療法亦可提供較單獨投予第一治療模態或第二治療模態更好之治療變化形廓。

加成或協同效果可允許減少任一種或二種治療模態之劑量和/或給藥頻率以減輕不利影響。於某些實施態樣中，單獨投予之第二治療模態在臨床上不足以治療該個體(例如該個體對該單一治療模態不反應或為難治性)，從而使該個體需要額外之治療模態。於某些實施態樣中，該個體已對該第二治療模態反應，但苦於副作用、復發、產生耐藥性，等，從而使該個體需要額外之治療模態。本發明之方法包含對該等個體投予本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型以改善該第二治療模態之治療效力。該治療模態之治療效力可使用本技藝已知之方法在體內或體外分析。

於一實施態樣中，在個體中產生治療益處所需要之第二治療模態的量較少。於特定之實施態樣中，可實現減少約10%、20%、30%、40%和50%之第二治療模態量。該第二治療模態之量(包括不產生任何可觀察到之治療益處的範圍之內的量)可藉由本技藝中熟知之方法在動物模型中進行劑量-反應實驗判定。

於某些實施態樣中，該第二治療模態包含TCR，例如可溶性TCR或表現TCR之細胞。於某些實施態樣中，該第二治療模態包含表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞。於某些實施態樣中，該表現TCR或CAR之細胞為T細胞。於特定之實施態樣中，該TCR或CAR與本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型中至少一個MHC-結合之抗原決定位結合(例如特異性結合)。

於某些實施態樣中，該第二治療模態包含TCR模擬抗體。於某些實施態樣中，該TCR模擬抗體為與胜肽-MHC複合物特異性結合之抗體。TCR模擬抗體之非限制性實例揭示於美國專利案第9,074,000號、美國公開案第US 2009/0304679 A1和US 2014/0134191 A1號中，所有這些文獻之全部內容均以引用方式併入本文。於一特定之實施態樣中，該TCR模擬抗體與本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型中至少一個MHC-結合之抗原決定位結合(例如特異性結合)。

於某些實施態樣中，該第二治療模態包含檢查點標靶劑。於某些實施態樣中，該檢查點標靶劑係選自由下列所組成之群組：拮抗劑抗-CTLA-4抗體、拮抗劑抗-PD-L1抗體、拮抗劑抗-PD-L2抗體、拮抗劑抗-PD-1抗體、拮抗劑抗TIM-3抗體、拮抗劑抗LAG-3抗體、拮抗劑抗CEACAM1抗體、促效劑抗CD137抗體、拮抗劑抗TIGIT抗體、拮抗劑抗VISTA抗體、促效劑抗-GITR抗體和促效劑抗OX40抗體。

於某些實施態樣中，抗PD-1抗體係作為本文所揭示之方法中的第二治療模態。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由Bristol-Myers Squibb研發之保疾伏(nivolumab)，亦稱為BMS-936558或MDX1106。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由默克藥廠研發之帕博利珠單抗(pembrolizumab)，亦稱為蘭博利珠單抗(lambrolizumab)或MK-3475。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由CureTech研發之比迪利珠單抗(pidilizumab)，亦稱為CT-011。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由Medimmune研發之MEDI0680，亦稱為AMP-514。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由Novartis製藥研發之PDR001。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由Regeneron製藥研發之REGN2810。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由輝瑞藥廠研發之PF-06801591。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由BeiGene研發之BGB-A317。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由AnaptysBio和Tesaro研發之TSR-042。於某些實施態樣中，該抗PD-1抗體為由Hengrui研發之SHR-1210。

可用於本文所揭示之治療方法之抗PD-1抗體的其他非限制性實例揭示於下列專利案和專利申請案中，所有這些文獻之全部內容均以引用方式併入本文用於所有目的：美國專利案第6,808,710號；美國專利案第7,332,582號；美國專利案第7,488,802號；美國專利案第8,008,449號；美國專利案第8,114,845號；美國專利案第8,168,757號；美國專利案第8,354,509號；美國專利案第8,686,119號；美國專利案第8,735,553號；美國專利案第8,747,847號；美國專利案第8,779,105號；美國專利案第8,927,697號；美國專利案第8,993,731號；美國專利案第9,102,727號；美國專利案第9,205,148號；美國公開案第US 2013/0202623 A1號；美國公開案第US 2013/0291136 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2014/0356363 A1號；美國公開案第US 2016/0075783 A1號；和PCT公開案第WO 2013/033091 A1號；PCT公開案第WO 2015/036394 A1號；PCT公開案第WO 2014/179664 A2號；PCT公開案第WO 2014/209804 A1號；PCT公開案第WO 2014/206107 A1號；PCT公開案第WO 2015/058573 A1號；PCT公開案第WO 2015/085847 A1號；PCT公開案第WO 2015/200119 A1號；PCT公開案第WO 2016/015685 A1號；和PCT公開案第WO 2016/020856 A1號。

於某些實施態樣中，抗PD-L1抗體係作為本文所揭示之方法中的第二治療模態。於某些實施態樣中，該抗PD-L1抗體為由Genentech研發之阿特珠單抗(atezolizumab)。於某些實施態樣中，該抗PD-L1抗體為由AstraZeneca、Celgene和Medimmune研發之得瓦魯單抗(durvalumab)。於某些實施態樣中，該抗PD-L1抗體為由Merck Serono和輝瑞公司研發之阿維魯單抗(avelumab)，亦稱為MSB0010718C。於某些實施態樣中，該抗PD-L1抗體為由Bristol-Myers Squibb研發之MDX-1105。於某些實施態樣中，該抗PD-L1抗體為由Amplimmune和GSK研發之AMP-224。

可用於本文所揭示之治療方法中的抗PD-L1抗體之非限制性實例揭示於下列專利案和專利申請案中，所有這些專利案之全部內容均以引用方式併入本文以用於所有目的：美國專利案第7,943,743號；美國專利案第8,168,179號；美國專利案第8,217,149號；美國專利案第8,552,154號；美國專利案第8,779,108號；美國專利案第8,981,063號；美國專利案第9,175,082號；美國公開案第US 2010/0203056 A1號；美國公開案第US 2003/0232323 A1號；美國公開案第US 2013/0323249 A1號；美國公開案第US 2014/0341917 A1號；美國公開案第US 2014/0044738 A1號；美國公開案第US 2015/0203580 A1號；美國公開案第US 2015/0225483 A1號；美國公開案第US 2015/0346208 A1號；美國公開案第US 2015/0355184 A1號；和PCT公開案第WO 2014/100079 A1號；PCT公開案第WO 2014/022758 A1號；PCT公開案第WO 2014/055897 A2號；PCT公開案第WO 2015/061668 A1號；PCT公開案第WO 2015/109124 A1號；PCT公開案第WO 2015/195163 A1號；PCT公開案第WO 2016/000619 A1號；和PCT公開案第WO 2016/030350 A1號。

於某些實施態樣中，使用靶向免疫調節酶之化合物，諸如IDO(吲哚胺-(2,3)-雙加氧酶)和/或TDO(色胺酸2,3-雙加氧酶)作為本文所揭示之方法中的第二治療模態。因此，於一實施態樣中，該化合物靶向免疫調節酶，諸如吲哚胺-(2,3)-雙加氧酶(IDO)之抑制劑。於某些實施態樣中，該等化合物係選自由下列所組成之群組：伊卡朵他汀(epacadostat)(Incyte Corp；參見，例如WO 2010/005958，其全部內容以引用方式併入本文)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(indoximod)(NewLink Genetics)和NLG919(NewLink Genetics)。於一實施態樣中，該化合物為伊卡朵他汀。於另一實施態樣中，該化合物為F001287。於另一實施態樣中，該化合物為吲哚莫德。於另一實施態樣中，該化合物為NLG919。於一特定之實施態樣中，本文所揭示之抗TIM-3(例如人TIM-3)抗體係與用於治療癌症之IDO抑制劑組合投予個體。如本文所描述之用於治療癌症的IDO抑制劑係存在於醫藥組成物之固體劑型(諸如片劑、丸劑或膠囊)中，其中該醫藥組成物包含IDO抑制劑和醫藥上可接受之賦形劑。因此，如本文所描述之抗體和如本文所描述之IDO抑制劑可以單獨之劑型單獨、依次或同時投予。於一實施態樣中，該抗體係經由胃腸道外投予且該IDO抑制劑係經由口服投予。於特定之實施態樣中，該抑制劑係選自由下列所組成之群組：伊卡朵他汀(Incyte公司)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(NewLink Genetics)和NLG919(NewLink Genetics)。伊卡朵他汀已描述於PCT公開案第WO 2010/005958號中，其全部內容以引用方式併入本文以用於所有目的。於一實施態樣中，該抑制劑為伊卡朵他汀。於另一實施態樣中，該抑制劑為F001287。於另一實施態樣中，該抑制劑為吲哚莫德。於另一實施態樣中，該抑制劑為NLG919。

於某些實施態樣中，該第二治療模態包含用於治療癌症或感染之不同的疫苗(例如胜肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗)。於某些實施態樣中，該疫苗為基於熱休克蛋白質之腫瘤疫苗或基於熱休克蛋白質之病原體疫苗(例如，如WO 2016/183486中描述之疫苗，該WO 2016/183486之全部內容以引用方式併入本文)。於一特定之實施態樣中，該第二治療模態包含基於壓力蛋白質之疫苗。例如，於某些實施態樣中，該第二治療模態包含與第一治療模態不同之如本文所揭示之組成物、疫苗調配物或單位劑型。於某些實施態樣中，該第二治療模態包含類似於本文所揭示者之組成物、疫苗調配物或單位劑型，除了具有不同之HSP-結合之胜肽的序列外。於某些實施態樣中，該基於壓力蛋白質之疫苗係源自腫瘤製劑，從而使該由疫苗引發之免疫力係特異地針對由每個個體之癌症表現的獨特抗原性胜肽庫。

於某些實施態樣中，該第二治療模態包含一或多種佐劑，諸如上文揭示之可包含在本文所揭示之疫苗調配物中的佐劑。於某些實施態樣中，該第二治療模態包含皂苷、免疫刺激性核酸和/或QS-21 。於某些實施態樣中，該第二治療模態包含Toll樣受體(TLR)促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR4促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR7和/或TLR8促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR9促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR5促效劑。

於某些實施態樣中，該第二治療模態包含一或多種選自由下列所組成之群組的藥劑：來那度胺(lenalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、介白素-2、重組干擾素α-2b和聚乙二醇化干擾素α-2b。

於某些實施態樣中，當該醫藥組成物、疫苗調配物或單位劑型係用於治療患有癌症之個體時，該第二治療模態包含化學治療劑或放射治療劑。於某些實施態樣中，該化學治療劑為低甲基化劑(例如阿扎胞苷(azacitidine))。

於某些實施態樣中，當該醫藥組成物、疫苗調配物或單位劑型係用於治療感染病原微生物之個體時，該第二治療模態包含一或多種用於治療該傳染病之抗感染干預(例如抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑、或抗蠕蟲劑)。

本發明之組成物、疫苗調配物或單位劑型可與第二治療模態(例如化學治療劑、放射治療劑、檢查點靶向劑、IDO抑制劑、疫苗、佐劑、可溶性TCR、表現TCR之細胞、表現CAR之細胞和/或TCR模擬抗體)藉由相同或不同之遞送途徑分開、依次或同時投予。6.5.4 劑量方案

若欲投予組合療法，本文所揭示之組成物或疫苗調配物之劑量，和任何額外之治療模態的劑量很大程度地取決於該待治療之個體的體重和一般健康狀態，以及治療頻率和投予途徑。用於此用途之有效量亦取決於該疾病之階段和嚴重程度及開立處方醫師之判斷，但對70kg患者而言，初次免疫化(即，用於治療投予)之範圍通常為約1.0μg至約1000μg(1mg)(包括，例如10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg)之本文所揭示的任一組成物，接著藉由測量患者血液中之特定CTL活性，根據患者之反應和情況，依照為期數週至數個月之加強方案再投予約1.0μg至約1000μg(包括，例如10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg)之組成物的加強劑量。用於持續療法之方案(包括部位、劑量和頻率)可由初始反應和臨床判斷來指導。佐劑之劑量範圍和方案為本技藝之技術人員所已知，參見，例如Vogel and Powell, 1995, A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients；M. F. Powell, M. J. Newman (eds.), Plenum Press, New York,141-228頁。

較佳之佐劑包括QS-21，例如QS-21 Stimulon®和CpG寡核苷酸。QS-21之示例性劑量範圍為每次投予1μg至200μg。於其他實施態樣中，QS-21之劑量可為每次投予10、25和50μg。於某些實施態樣中，該佐劑包含Toll樣受體(TLR)促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR4的促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR7和/或TLR8促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR9促效劑。於某些實施態樣中，該TRL促效劑為TLR5促效劑。

於某些實施態樣中，該組成物之投予量取決於該投予途徑和該組成物中之HSP之類型。例如，該組成物中之HSP的量可在例如每次投予5至1000μg(1mg)的範圍內。於某些實施態樣中，該包含Hsc70-、Hsp70-和/或Gp96-多胜肽複合物之組成物的投予量為，例如5、10、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900或1000μg。於某些實施態樣中，該組成物之投予量係在每次投予約10至600μg之範圍內且若該組成物係經由皮內投予，則每次投予係在約5至100μg之範圍內。於某些實施態樣中，該組成物之投予量為約5μg至600μg、約5μg至300μg、約5μg至150μg、或約5μg至60μg。於某些實施態樣中，該組成物之投予量少於100μg。於某些實施態樣中，該組成物之投予量為約5μg、25μg、50μg或240μg。於某些實施態樣中，該包含壓力蛋白質和多胜肽之複合物的組成物係經純化。

於治療方案之一實施態樣中，基本上與在較小之非人動物(例如小鼠或天竺鼠)中所觀察到之有效劑量相等的劑量對投予人類是有效的，該劑量可基於在該等哺乳動物和人體中之相對淋巴結大小，可選擇地經受增加不超過50倍之校正因子。具體而言，用於人類劑量之與抗原性分子非共價結合或混合之壓力蛋白質(或HSP)的種間劑量-反應等效性係以在小鼠中觀察到之治療劑量與單一縮放比(增加不超過50倍)之乘積估計。於某些實施態樣中，該組成物之劑量可遠小於藉由外推估計之劑量。

上述劑量可，諸如每天、每隔一天、每週、每二週或每月給予一次或重複給予，持續長達一年或一年以上。較佳地，每28天給予一次劑量，持續約52週或更久之期間。

於一實施態樣中，該組成物係與另外之治療模態在差不多相同的時間投予個體。該方法提供將二次投予在彼此相隔不到一分鐘至約五分鐘，或相隔至多約六十分鐘之時間範圍內進行，例如在同一次醫生訪視時。

於另一實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係在完全相同之時間投予。

於另一實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係依序投予且係在可使本發明之複合物和另外之治療模態可一起作用之時間間隔內投予，以提供較單獨投予時增加之益處。

於另一實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係在足夠接近之時間內投予以提供所需之治療或預防結果。該組成物和另外之治療模態可以任何適當之形式和藉由任何合適之途徑同時或分開投予。於一實施態樣中，本發明之複合物和另外之治療模態係藉由不同投予途徑投予。於另一替換之實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係各自藉由相同之投予途徑投予。該組成物可投予在相同或不同部位，例如手臂和腿。當同時投予時，該組成物和另外之治療模態可能或可能不在混合物中投予或藉由相同之途徑投予在相同之投予部位。

於各種實施態樣中，該組成物和另外之治療模態之投予係相隔不到1小時、相隔約1小時、相隔1小時至2小時、相隔2小時至3小時、相隔3小時至4小時、相隔4小時至5小時、相隔5小時至6小時、相隔6小時至7小時、相隔7小時至8小時、相隔8小時至9小時、相隔9小時至10小時、相隔10小時至11小時、相隔11小時至相隔12小時、相隔不超過24小時或相隔不超過48小時。於其他實施態樣中，該組成物和和疫苗組成物之投予係相隔2至4天，相隔4至6天，相隔1週，相隔1至2週，相隔2至4週，相隔1個月，相隔1至2個月，或相隔2個月或更多個月。於較佳之實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係在二者仍然有效之時間範圍內投予。本技藝之技熟習人士將能夠藉由判定各投予之組分的半衰期來判定該等時間範圍。

於某些實施態樣中，係組成物係每週投予該個體，至少四週。於某些實施態樣中，投予四個週劑量後，每二週對該個體投予該組成物之至少另外2個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)劑量。於某些實施態樣中，在最後一個每週或每二週劑量後三個月，投予該組成物以作為加強劑。該個體可終身投予該三個月加強劑(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多年)。於某些實施態樣中，投予該個體之組成物的劑量總數為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

於一實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係在同一次患者訪視中投予。於某些實施態樣中，該組成物係在投予該另外之治療模態之前投予。於一替代之特定實施態樣中，該組成物係在投予另外之治療模態之後投予。

於某些實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係以循環方式投予個體。循環療法涉及投予該組成物一段時間，然後投予治療模態一段時間並重複此順序投予。循環療法可減少對一或多種療法發展出抗性，避免或減少該療法其中一者之副作用，和/或改善該治療之效力。於該等實施態樣中，本發明考慮交替投予該組成物，接著在4至6天後，較佳為2至4天後，更佳為1至2天後投予治療模態，其中可依需要重複進行該等循環多次。於某些實施態樣中，該組成物和另外之治療模態係在少於3週、每二週一次、每10天一次或每週一次之循環中交替投予。於某些實施態樣中，該組成物係在投予治療模態後1小時至24小時之時間範圍內投予個體。若使用緩慢或連續釋出類型之治療模態遞送系統，則可將該時間範圍進一步延長數天或更久。6.5.5 投予途徑

本文所揭示之組成物可使用任何所需之投予途徑投予。許多方法可用於引入上述之組成物，包括，但不限於口服、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、黏膜、鼻內、腫瘤內和淋巴結內途徑。非黏膜投予途徑包括，但不限於皮內和局部投予。黏膜投予途徑包括，但不限於口服、直腸和鼻腔投予。皮內投予之優點分別包括使用較低之劑量和快速吸收。皮下或肌肉內投予之優點分別包括適用於某些不溶性懸浮液和油性懸浮液。用於黏膜投予之製劑適合用於如下述之各種調配物中。

溶解度和投予部位為在選擇組成物之投予途徑時應考慮的因素。投予模式可在多種投予途徑之間變化，包括上文列出之投予途徑。

若該組成物為水溶性，則可將其在合適之緩衝液中配製，例如磷酸鹽緩衝之鹽水或其他生理上相容之溶液，較佳為無菌的。或者，若組成物在水性溶劑中之溶解度差，則其可使用非離子表面活性劑，諸如吐溫或聚乙二醇配製。因此，該組成物可被配製成藉由吸入或吹入(藉由口或鼻)或口服、口腔、腸胃道外或直腸投予來投予。

在口服投予方面，該組成物可為液體形式，例如溶液、糖漿或懸浮液，或可以在使用前以水或其他合適之載劑重建之藥物產品形式呈現。該等液體製劑可藉由常規方法，使用醫藥上可接受之添加劑製備，諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化之食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載劑(例如杏仁油、油性酯或分餾之植物油)；和防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。該組成物可為，例如使用醫藥上可接受之賦形劑藉由常規方法製備之片劑或膠囊劑形式，該醫藥上可接受之賦形劑為，諸如黏合劑(例如預膠化之玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如乳糖、微晶型纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化矽)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或乙醇酸澱粉鈉)；或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。該片劑可藉由本技藝熟知之方法塗層。

用於口服投予之組成物可適當地配製成以受控和/或定時之方式釋出。

在口腔投予方面，該組成物可為以常規方式配製之片劑或口含劑形式。

該製劑可配製成用於藉由注射，經由腸胃道外投予，例如藉由推注或連續輸注投予。用於注射之調配物可以單位劑型存在(例如在安瓿或多劑量容器中)並具有添加之防腐劑。該製劑可為，諸如在油性或水性載劑中之懸浮液、溶液或乳劑形式且可含有配製劑，諸如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，該活性成分可為在使用前以合適之載劑(例如無菌之無熱原水)構建之粉末形式。

該製劑亦可配製成直腸製劑，諸如栓劑或保留灌腸劑，例如含有常規栓劑基質，諸如可可脂或其他甘油酯。

除了上述調配物之外，該製劑亦可配製成長效製劑。該等長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌內注射投予。因此，例如該製劑可使用合適之聚合或疏水材料配製(例如為在可接受之油中的乳劑)或使用離子交換樹脂配製，或配製成微溶之衍生物，例如為微溶鹽之形式。脂質體和乳劑為眾所周知之用於親水性藥物的遞送載劑或載體之實例。

在吸入投予方面，該組成物可方便地使用合適之推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適之氣體)以氣霧劑噴霧形式從經加壓之包裝或噴霧器呈遞。在經加壓之氣霧劑的情況中，該劑量單位可藉由提供閥確定以遞送計量之量。用於吸入器或吹入器之例如明膠膠囊和藥筒可配製成含有化合物及合適之粉末基質(諸如乳糖或澱粉)的粉末混合物。6.5.6 患者 ( 個體 ) 評估

可測試使用本文所揭示之組成物治療之患者的抗腫瘤免疫反應。在此方面，可從患者取得外周血並分析抗腫瘤免疫力之標記物。白血球可使用標準之實驗室程序從外周血取得，並分析不同免疫細胞表型之頻率、HLA亞型和抗腫瘤免疫細胞之功能。

抗腫瘤反應中之大多數效應免疫細胞為CD8⁺ T細胞，因此為第I類HLA限制性。於其他腫瘤類型中使用免疫治療策略可在大多數患者中發現識別第I類HLA限制性抗原之CD8+細胞擴增。然而，其他細胞類型參與抗腫瘤免疫反應，包括，例如可作為抗原呈遞細胞之CD4+T細胞及巨噬細胞和樹突細胞。T細胞(CD4+、CD8+和Treg細胞)、巨噬細胞和抗原呈遞細胞群可使用流式細胞術測定。HLA分型可使用本技藝之常規方法進行，諸如Boegel等人Genome Medicine 2012, 4:102 (seq2HLA)中描述之方法，或使用TruSight®HLA測序小組(Illumina，Inc.)。CD8+T細胞之HLA亞型可藉由補體依賴性微細胞毒性試驗來測定。

為了測定抗腫瘤T細胞反應是否增加，可進行酶聯免疫斑點分析以定量產生IFNγ之外周血單核細胞(PBMC)。該技術提供用於識別抗原和免疫細胞功能之分析。於一些實施態樣中，臨床上對疫苗作出反應之個體的腫瘤特異性T細胞和/或產生IFNγ之PBMC可能增加。於一些實施態樣中，使用流式細胞術評估免疫細胞頻率。於一些實施態樣中，使用酶聯免疫斑點分析來評估抗原識別和免疫細胞功能。

於一些實施態樣中，可進行一組分析以表徵對單獨之組成物所產生之免疫反應或對與標準照護(例如最大手術切除、放射療法及使用用於多形性膠質母細胞瘤之替莫唑胺(temozolomide)的伴隨和輔助化學療法)組合給予之組成物所產生之免疫反應。於一些實施態樣中，該組分析包括一或多種下列試驗：全血細胞計數、絕對淋巴細胞計數、單核細胞計數、CD4⁺ CD3⁺ T細胞之百分比、CD8⁺ CD3⁺ T細胞之百分比、CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺ 調節性T細胞之百分比和PBL表面標記物之其他表型分析、用於檢測蛋白質層級之促炎細胞因子的細胞內細胞因子染色、用於檢測mRNA層級之細胞因子的qPCR和用於分析T細胞增殖之CFSE稀釋。

在評估個體時，可進行許多其他測試以判定該個體之總體健康。例如，可從個體收集血液樣本並分析血液學、凝血時間和血清生物化學。CBC之血液學可包括紅血球計數、血小板、血細胞比容、血紅素、白血球(WBC)計數，加欲提供中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的絕對計數之WBC分類。血清生物化學可包括白蛋白、鹼性磷酸酶、天門冬胺酸胺基轉移酶、丙胺酸胺基轉移酶、總膽紅素、BUN、葡萄糖、肌酸酐、鉀和鈉。亦可測試凝血酶原時間(PT)和部分凝血活酶時間(PTT)。亦可進行一或多種下列測試：抗甲狀腺(抗微粒體或甲狀腺球蛋白)抗體測試、抗核抗體和類風濕因子評估。可進行尿液分析以評估尿液中之蛋白質、RBC和WBC量。此外，可抽血以判定組織相容性白血球抗原(HLA)狀態。

於一些實施態樣中，在整個治療過程中進行一或多次放射學腫瘤評估以評估腫瘤大小和狀態。例如腫瘤評估掃描可在手術前30天內、手術後48小時內(例如評估切除百分比)、第一次疫苗接種之前1週(最多14天)(例如作為基線評估)及手術後約每8週執行一次，持續一段特定期間。可使用MRI或CT成像。通常，每次腫瘤評估訪視係使用用於基線評估之相同的成像治療模態。6.6 套組

亦提供用於實行本文所揭示之預防和治療方法的套組。該套組可選擇地進一步包含關於如何使用該套組之各種組分的說明。

於某些實施態樣中，該套組包含第一容器和第二容器，該第一容器含有本文所揭示之組成物，且該第二容器含有一或多種佐劑。該佐劑可為本文所揭示之任何佐劑，例如皂苷、免疫刺激核酸或QS-21(例如QS-21 Stimulon®)。於某些實施態樣中，該套組進一步包含含有另外之治療模態的第三容器。該套組可進一步包含關於該組成物之適應症、給藥方案和投予途徑、佐劑及另外之治療模態(例如，如本文章節5.5中所揭示者)之說明書。

或者，該套組可在分開的容器中包含本文所揭示之組成物的壓力蛋白質和多胜肽。於某些實施態樣中，該套組包含第一容器和第二容器，該第一容器含有一或多種本文所揭示之多胜肽且該第二容器包含能與該多胜肽結合之純化的壓力蛋白質。

該第一容器可含有任何數量之不同多胜肽。例如，於某些實施態樣中，該第一容器含有不超過100種不同之多胜肽，例如2至50、2至30、2至20、5至20、5至15、5至10、或10至15種不同之多胜肽。於某些實施態樣中，該不同之多胜肽各自包含相同之HSP-結合之胜肽和不同之抗原性胜肽。於某些實施態樣中，該第一容器中之多胜肽的總量為用於單位劑量之合適量。於某些實施態樣中，該第一容器中之多胜肽的總量為約0.1至20 nmol(例如3、4、5或6 nmol)。

該第二容器可含有本文所揭示之任何壓力蛋白質。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96或鈣網伴護蛋白，及其突變體或融合蛋白。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsc70(例如人Hsc70)。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為重組蛋白。於某些實施態樣中，該第二容器中之壓力蛋白質的總量為約10μg至600μg(例如250μg至290μg)。於某些實施態樣中，該第二容器中之壓力蛋白質的總量為約50μg、100μg、200μg、300μg、400μg或500μg。於某些實施態樣中，該醫藥組成物中之壓力蛋白質的量為約300μg。於某些實施態樣中，該第二容器中之壓力蛋白質的總莫耳量係基於第一容器中之多胜肽的總莫耳量計算，從而使該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1(例如約1：1至2：1，例如約1：1、1.25：1或1.5：1)。於某些實施態樣中，該第二容器中之壓力蛋白質的總量為用於多次投予之量(例如少於或等於1mg、3mg、10mg、30mg或100mg)。

於某些實施態樣中，該套組進一步包含用於從第一容器中之多胜肽和第二容器中之壓力蛋白質製備組成物之說明書(例如，如本文章節5.4.2中揭示之用於複合反應的說明書)。

於某些實施態樣中，該套組進一步包含含有一或多種佐劑之第三容器。該佐劑可為本文所揭示之任何佐劑，例如皂苷、免疫刺激核酸或QS-21(例如QS-21 Stimulon®)。於某些實施態樣中，該套組進一步包含含有另外之治療模態的第四容器。該套組可進一步包含說明書，該說明書係關於從該多胜肽和壓力蛋白質製備之組成物的適應症、劑量方案和投予途徑、佐劑和另外之治療模態(例如，如本文之章節5.5中所揭示者)。

於某些實施態樣中，該容器中之組成物、多胜肽、壓力蛋白質、佐劑和其他治療模態係以能有效治療癌症或感染之預定量存在。若需要時，該組成物可存在於可含有一或多種該組成物之單位劑型的包裝或分配器裝置中。該包裝可，例如包含金屬或塑料箔，諸如泡罩包裝。該包裝或分配器裝置可附有投予說明書。6.7 HPV 胜肽

於另一態樣中，本發明提供包含HSP-結合之胜肽和來自人乳頭瘤病毒(HPV)之胺基酸序列(例如HPV16或HPV18)的多胜肽。該等胺基酸序列在本文中亦稱為HPV胜肽。

該HPV胜肽可包含如表3中所揭示之任何胺基酸序列。於某些實施態樣中，該來自HPV之胺基酸序列包含SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53之胺基酸序列。

該HSP-結合之胜肽可為章節5.2中揭示之任何HSP-結合之胜肽，或為本技藝已知之任何HSP-結合之胜肽(參見，例如US20160331821A1和US7309491B2，各篇之全部內容以引用方式併入本文)。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：1、2、3、4或232之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、204、205、207、208、209、210、211、212、213、214或215之胺基酸序列。於某些實施態樣中，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。

該HPV胜肽可經由本文所揭示之任何連接子(例如章節5.3中)與HSP-結合之胜肽連接。於某些實施態樣中，該HPV胜肽係經由胜肽連接子與HSP-結合之胜肽連接。於某些實施態樣中，該胜肽連接子包含FR或FFRK之胺基酸序列(SEQ ID NO：13)。

於某些實施態樣中，該HPV胜肽包含SEQ ID NO：54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69之胺基酸序列。

於另一態樣中，本發明提供包含多種不同之多胜肽的組成物(例如醫藥組成物)，其中各多胜肽包含HSP-結合之胜肽和HPV胜肽。於某些實施態樣中，該至少一種HPV胜肽之胺基酸序列係選自SEQ ID NO：38至53。於某些實施態樣中，各HPV胜肽之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組。於某些實施態樣中，該組成物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種不同之HPV胜肽。

於某些實施態樣中，該至少一種多胜肽之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組。於某些實施態樣中，各多胜肽之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組。於某些實施態樣中，該組成物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種不同之多胜肽。

於某些實施態樣中，該組成物進一步包含純化之壓力蛋白質。本文所揭示之任何壓力蛋白質(例如在章節5.4中)均可使用。例如，於某些實施態樣中，該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白及其突變體或融合蛋白。於某些實施態樣中，該壓力蛋白質為Hsc70(例如人Hsc70)。

該多胜肽對該壓力蛋白質之比例可為本文所揭示之任何比例，例如約0.5：1至5：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對壓力蛋白質之比例為約1：1至2：1。於某些實施態樣中，該多胜肽對壓力蛋白質之比例為約1：1、1.25：1或1.5：1。再者，該多胜肽和壓力蛋白質之量可為本文章節5.4中所揭示之任何量。於某些實施態樣中，該組成物為單位劑型。

於另一態樣中，本發明提供套組，該套組包含本文所揭示之組成物，無論是在單一容器中或在分開之容器中，及可選擇地，進一步包含含有如本文之章節5.6中所揭示之一或多種佐劑和另外之治療模態的容器。

於另一態樣中，本發明提供在個體中誘導針對HPV胜肽之細胞免疫反應的方法，該方法包含對該個體投予有效量之如本章節中所揭示之組成物。於另一態樣中，本發明提供治療個體中與HPV相關之疾病的方法，該方法包含對該個體投予有效量之如本章節中所揭示之組成物。於某些實施態樣中，該HPV相關疾病為癌症(例如子宮頸癌)。於某些實施態樣中，該HPV為HPV16或HPV18。如本文章節5.5.4中揭示之任何劑量方案和如本文章節5.5.5中揭示之任何投予途徑均可使用。該方法可進一步包含如本文章節5.5.3中揭示之另外的治療模態，並可進一步包含如本文章節5.5.6中揭示之患者評估步驟。7. 實施例

本章節(即，章節6)中之實施例係藉由舉例說明之方式提供，而非藉由限制之方式提供。7.1 實施例 1 ：鑑定以高親和力與 Hsc70 結合之胜肽

本實施例描述熱休克蛋白質(HSP)-結合之胜肽之設計，與具有NLLRLTG(SEQ ID NO：70)之胺基酸序列的熱休克蛋白質-結合之胜肽(參見，以US20160331821A1發表之美國專利申請案，其全部內容以引用方式併入本文)相比較，具有與HSP之改良的結合。7.1.1 胜肽與 Hsc70 之結合

為了鑑定以高親和力與人Hsc70結合之胜肽，設計NLLRLTG(SEQ ID NO：70)序列之變體並在N端添加具有FFRK之胺基酸序列(SEQ ID NO：13)的連接子。該合成和測試之胜肽的胺基酸序列提供於表5中。

在Symphony-X自動合成儀(Gyros Protein技術公司)中使用標準Fmoc固相化學合成法與預加載聚苯乙烯王(polystyrene wang)(PS-Wang)樹脂合成胜肽。使用標準HCTU/NMM活化化學法施用Fmoc保護之L-胺基酸。關於樹脂取代，使用用於胺基酸偶合之5倍過量之胺基酸、5倍過量之活化試劑(HCTU)和10倍過量之N-甲基嗎啉以形成胜肽鍵。對於在整個合成過程中之任何不完全偶合，與雙偶合循環進行反應6分鐘。重複這些步驟直到取得所欲之序列。在合成結束時，使用二氯甲烷(DCM)洗滌樹脂並乾燥之。完成胜肽組裝後，將樹脂轉移至另一裂解容器中以從該樹脂裂解出該胜肽。將裂解混合試劑三氟醋酸：二硫代蘇糖醇水：三異丙基矽烷(88：5：5：2 v/w/v/v)與該樹脂混合並在25℃攪拌4小時。藉由過濾將粗胜肽從該樹脂單離並使用氮氣蒸發，再使用冷卻之乙醚沉澱之並貯存於-20℃12小時。將沉澱之胜肽離心並使用醚洗滌2次，乾燥，溶解在所選擇之溶劑中並凍乾以產生粗乾粉。使用C18管柱(Ultimate 3000，Thermo Scientific )，藉由製備型HPLC，使用水(0.1%TFA)-乙腈(0.1%TFA)梯度純化該粗胜肽。使用分析型C18管柱測試胜肽之純度。藉由6550 Q-TOF(Agilent技術公司)質譜法確認進一步表徵。

將個別胜肽以10 mg/ml溶解於100% DMSO中，然後在75% DMSO中藉由第二次稀釋步驟稀釋成320μM。為了形成胜肽-Hsc70複合物，將濃度為7μM(0.5 mg/ml)之Hsc70與適當濃度之胜肽在1X PBS中混合，使最終體積為25μl。然後，將混合之樣品在37℃溫育1小時，並在冰上冷卻10分鐘。為了評估溶液中該複合物之量，以0.2 ml/min之流速將20μl(10μg)之樣品加載在尺寸排阻色層分析(SEC)管柱TSKgel SuperSW3000(Tosoh Bioscience)上，使用1X PBS作為運行緩衝液。藉由測量280和214 nm處之吸光度來收集數據。

在不同的實驗中，產生胜肽NLLRLTG (SEQ ID NO：70)之其他變體並分析這些胜肽形成胜肽-Hsc70複合物之能力。依上述，再次使用標準Fmoc固相化學合成法合成胜肽。將個別胜肽以250μM之濃度溶解在經調節pH之水中，並摻入聚山梨醇酯20，使最終濃度為0.1%。為了形成胜肽-Hsc70複合物，以0.25：1、0.5：1、1：1、2：1和4：1之胜肽：Hsc70莫耳比將Hsc70(1 mg/ml，0.1%聚山梨醇酯)與胜肽在30℃下混合60分鐘。溫育後，將樣品在室溫下冷卻5分鐘，並轉移至用於分析之HPLC小瓶中。為了評估溶液中該複合物之量，使用1X PBS作為運行緩衝液，以0.2 ml/min之流速將20μl(10μg)之樣品加載在尺寸排阻色層分析(SEC)管柱TSKgel SuperSW3000(Tosoh Bioscience)上。藉由測量214 nm處之吸光度來收集數據。

藉由SEC計算與胜肽結合之Hsc70的百分比。如圖1中描繪之SEC色層分析圖所示，當經SEC色層分析時，重組人熱休克同源71 kDa蛋白質(Hsc70)係以單體(M)、二聚體(D)、三聚體(T)和更高級之高分子量(HMW)寡聚種呈現。由於Hsc70單體與胜肽(Msh)之複合物緊接地洗提出，解析和評估與指定之胜肽或胜肽混合物形成胜肽-Hsc70複合物的程度是複雜的。對應於單體和複合物之峰重疊且無法藉由常規SEC介質完全解析。為了更準確地計算複合物形成之程度，使用下列數據分析方法。該方法之中心特徵係基於觀察到Hsc70之三聚體和二聚體形式被召募來形成單體胜肽複合物之觀察。這些蛋白質種之波峰面積積分可從該複合物和單體被充分解析。此外，形成複合物之程度似乎與三聚體和二聚體被召募來形成複合物之程度成反比。由於此觀察，三聚體和二聚體中之變化反映單體被召募以形成複合物的程度。因此，可使用三聚體和二聚體之量中的變化進展來計算該重疊之複合物和單體種之波峰面積中的預期變化，並使用這些計算的波峰面積來計算該複合物之淨形成。該數據分析方法描述於下。

用於各種色層分析餾分的術語包括：高分子量(HMW)、三聚體和其他中階寡聚物(T)、二聚體(D)、複合物(C)、單體肩(Msh)和單體(M)(參見圖1)。從SEC數據中擷取各種餾分之波峰面積並使用下列程式組計算胜肽-Hsc70複合物形成之百分比： %複合物=(面積_複合物 /面積_總計 )X 100 面積_複合物 =面積_總計 -(面積_T+D +面積_Mshx +面積_Mx ) 面積_總計 =面積_T+D _、 _C _、 _Msh _、 _M +(面積_HDW-x -面積_HDW-0 ) 面積_Mshx =面積_Msh0 X(面積(_(T+D)x )/(面積_(T+D)0 ) 面積_Mx =面積_M0 X(面積(_{T + d)X} )/(面積_(T+D)0 )

面積_總計為從三聚體/寡聚體區到單體波峰之總積分波峰面積的總和，並排除初始HMW波峰面積，但包括當添加胜肽時所觀察到之過量增加的HMW波峰面積。基於HMW對複合為無功能性之聚集蛋白，將該HMW波峰自複合計算排除。此校正係考量HMW面積略微增加之面積_總計因素，將它加回用於計算複合物之面積的基礎總面積。包含此調整可導致在用於形成複合物之胜肽濃度範圍內更穩定之面積_總計。

藉由在色層分析圖上施加垂直線以產生HMW、T、C、D和M段(如第1圖所示)可將前述方法應用在各個複合反應之SEC色層分析圖上，計算所指明之各HMW、T、C、D和M段的曲線下面積，並將這些數值輸入上述程式中。該分析之結果顯示於表6中。

選擇PEP006用於進一步表徵。7.1.2 Hsc70 與 PEP006 之複合

本實施例藉由尺寸排阻色層分析法證明在0.25：1至3：1莫耳比之範圍內，PEP006與Hsc70結合之能力。

簡單地說，在注射用水(WFI)中重構PEP006胜肽使濃度達到645μM。將重組人Hsc70(rhHsc70)之濃度稀釋成1.66 mg/mL。將二種溶液預先在37℃培養箱中加溫10分鐘，合併後在37℃下溫育60分鐘。rhHsc70之最終濃度為1 mg/mL(約14.1μM)且PEP006對rhHsc70之莫耳比為0.25：1、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1和3：1。亦製備僅含有1 mg/mL之rhHsc70的陰性對照組。

使用色層分析管柱TSKgel SuperSW3000 (Tosoh Bioscience，目錄＃18675)，淨注射含量為10μg之各樣品以藉由尺寸排阻HPLC(Alliance HPLC，Waters Model #2695分離模組；雙波長UV檢測器，Waters Model 2487)進行解析，一式三份。該管柱溫度係控制在25℃±5℃且該自動進樣器溫度係控制在5℃±3℃。該流動相係由具有300 mM氯化鈉之10 mM磷酸鈉，pH7.2組成並以0.2 mL/min之流速遞送30分鐘。在波長214 nm和280 nm處測量PEP006胜肽和rhHsc70蛋白質之UV吸光度。藉由Waters Empower(V2)軟體處理該吸光度數據。

圖2顯示PEP006-Hsc70複合產物之色層分析圖，其中當rhHsc70與PEP006結合時，該管柱之保留時間變短。7.1.3 Hsc70 與包含 PEP006 之多胜肽複合

本實施例描述Hsc70與多胜肽 LGVVRPRALHRELDLVDDSPTPGSPGSFFRKNWLRLTW (SEQ ID NO：77)(其包含PEP006和從患者腫瘤中觀察到之胜肽(LGVVRPRALHRELDLVDDSPTPGSPGS(SEQ ID NO：76))結合之表徵。於該實施例中測試之多胜肽對Hsc70之莫耳比為0.125：1、0.25：1、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1和4：1。

圖3A顯示多胜肽-Hsc70複合產物之色層分析圖，其中當rhHsc70與該多胜肽結合時該管柱保留時間變短。圖3B之圖形顯示多胜肽：HscC70之莫耳比在0.125：1至4：1之範圍內時，當使用實施例6.1.1中描述之方法，從類似於圖3A中之尺寸排阻色層分析軌跡計算之包含PEP006之多胜肽與Hsc70的複合百分比。圖中顯示三個獨立的實驗。

為了進一步表徵Hsc70與包含C端PEP006或PEP001之多胜肽的結合，產生一系列具有C端PEP001、PEP006之多胜肽及在一些情況下，產生不具有C端HSC70結合之胜肽的相同多胜肽。使用之胜肽顯示於下列表7中。合成多胜肽，進行複合並根據上文之實施例6.1.1中描述之方法分析SEC數據。

圖4A之圖形顯示五種不同胜肽之複合百分比，其中該五種不同胜肽各自包含C端PEP001、C端PEP006或無C端HSC70-結合之胜肽。圖4B之圖形顯示六種不同胜肽之複合百分比，其中該六種不同胜肽各自包含C端PEP001或C端PEP006。7.2 實施例 2 ：藉由 HSP- 結合之胜肽增強細胞免疫力

本實施例證明包含HPV E6至E7胜肽和PEP001或PEP006之多胜肽在二種動物模型中之免疫原性和腫瘤抑制活性。7.2.1 藉由 HSP- 結合之胜肽增加抗原性胜肽免疫原性

在本實施例中，在免疫原性動物模型中分析四種多胜肽之匯集體的免疫原性，該四種多胜肽各自包含連接PEP001或PEP006，或不連接HSP-結合之胜肽的免疫原性HPV E6或E7胜肽。

簡單地說，以化學合成具有表8中提供之胺基酸序列的四種單獨之HPV E6或E7胜肽，或是連接PEP001或PEP006之HPV E6或E7胜肽，並以在25至100 mg/ml之範圍內的濃度溶解在100% DMSO中。已知這些HPV E6和E7胜肽在C57BL/6小鼠中具免疫原性(參見Bartkowiak等人(2015) Proc Natl Acad Sci U S A. 112(38)；和Manuri等人(2007) Vaccine 25(17):3302-10，各篇之全部內容以引用方式併入本文中)。已知之PEP059和PEP060抗原決定位序列為RAHYNIVTF(SEQ ID NO：78)且已知之PEP061和PEP062抗原決定位序列為VYDFAFRDL(SEQ ID NO：79)。

依序使用弱陰離子性Q瓊脂糖管柱、ATP瓊脂糖親和管柱和DEAE-FF弱陰離子性交換柱，藉由色層分析法從表現rhHsc70之大腸桿菌純化出重組人Hsc70 (rhHsc70)蛋白質。將純化之rhHsc70蛋白質在補充有0.01% 聚山梨醇酯20之經過濾的PBS中稀釋。

在疫苗製劑方面，在75% DMSO中製備四種多胜肽之等莫耳匯集體，總濃度為320μM。將純化之rhHsc70蛋白在37℃下預溫育30分鐘並以2：1或1：1之莫耳比將該多胜肽匯集體加入rhHsc70蛋白質溶液中，以使rhHsc70蛋白質濃度達到0.5 mg/ml。將混合物在37℃溫育1小時並依序通過0.8μm和0.2μm過濾器進行過濾。然後，將混合物置於冰上30分鐘並儲存在-80℃。

在疫苗接種方面，將從Jackson實驗室購買之6週齡雌性C57BL/6J小鼠維持在不含特定病原體之環境中。經由皮下注射疫苗將小鼠免疫化。每一注射液中含有共30μg(約0.42 nmol)，補充有10μg之QS-21 Stimulon®，在BioXcell InVivo Pure pH 7.0稀釋緩衝液中稀釋以使最終體積為200μl之與該胜肽匯集體複合之Hsc70(莫耳比1：1係使用0.42 nmol，莫耳比2：1係使用0.84 nmol)。在不含胜肽組(未與Hsc70複合)中之各注射液方面，將補充有10μg之佐劑QS-21 Stimulon®，總濃度為10 nmol之四種多胜肽的等莫耳匯集體在具有0.1% 聚山梨醇酯20之經過濾的PBS中稀釋以使最終體積為200μl。在初次免疫化後一週，將含有相同疫苗量之加強劑量經由皮下途徑注射入每隻小鼠中。

在第二次免疫化後一週，進行IFNγ ELISpot分析。簡單地說，為免疫化小鼠實施安樂死，輕輕地單離出脾細胞並將來自各小鼠之5×10⁵ 至1×10⁶ 個活細胞接種在預先塗覆鼠類IFNγ捕獲抗體的盤上。使用該裸胜肽(PEP059-062)將細胞再刺激過夜。藉由細胞溶解除去細胞並使用與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之檢測抗體檢測與該捕獲抗體結合之IFNγ。使用CTL S6 ImmunoSpot®分析儀和軟體計算每個孔中之斑點數量，代表此小孔中產生IFNγ之細胞的數量。

如圖5A所示，相較於裸HPV胜肽，含有與Hsc70複合之PEP001-或PEP006連接之胜肽的HPV疫苗證明免疫原性增加。藉由這些特定之HPV胜肽，該含有與Hsc70複合之PEP006連接之胜肽的疫苗顯示出在所使用之條件下較該含有與Hsc70複合之PEP001連接之胜肽的疫苗具有更高之免疫原性。

為了比較含有PEP001-和PEP006之疫苗與相同胜肽劑量之採用裸胜肽之疫苗的免疫原性，使用如上述之相同程序進行另外之實驗，所不同的是不存有Hsc70，在2：1和1：1比例組中該游離胜肽之量分別為0.84 nmol和0.42 nmol。

如圖5B中所示，含有與Hsc70複合之PEP001或PEP006連接之胜肽的HPV疫苗所誘出之產生IFNγ的脾細胞數量多於由相等劑量之與Hsc70複合的裸胜肽所誘出者，該裸胜肽係以1：1和2：1之莫耳比與Hsc70複合。該含有與Hsc70複合之PEP001和PEP006連接之胜肽的疫苗所誘出之反應亦較由該相等劑量之未以1：1和2：1的莫耳比與Hsc70複合之游離胜肽所誘出之反應更大。藉由這些特定之HPV胜肽，該含有與Hsc70複合之PEP006連接之胜肽的疫苗顯示在所使用之條件下與含有與Hsc70複合之PEP001連接之胜肽的疫苗相比較，具有較高之免疫原性。

在相關之實驗中，使用免疫原性動物模型和上述用於HPV E6或E7胜肽之方案來評估該三種不同之MC38胜肽的三個匯集體之免疫原性。該MC38胜肽匯集體之細節列舉於表9中。如圖6所示，所有該胜肽之匯集體均誘出一定程度之免疫反應。

6.2.2 藉由 HSP- 結合之胜肽增加腫瘤疫苗效力

本實施例使用TC1 HPV16 E6/E7同基因小鼠腫瘤模型證明章節6.2.1中描述之HPV疫苗的治療效力。

TC1細胞表現癌基因HRAS、HPV16 E6和E7，如Lin等人(1996) Cancer Res. 56(1):21-26 (其全部內容以引用方式併入本文) 中所揭示者。將低傳代之TC1細胞在不含血清之PBS中洗滌，並以2×10⁶ 個細胞/ml之濃度重新懸浮於PBS中。在使用前三天，將C57BL/6小鼠側腹的毛剃除並在剃毛區域皮下注射在100μl體積中的2×10⁵ 個細胞。根據章節6.2.1中描述之方法製備疫苗。將該裸胜肽、PEP001連接之胜肽和PEP006連接之胜肽分別以1：1、4：1和2：1之比例與rhHsc70蛋白複合。在植入TC1細胞後第5、10和15天，對該小鼠皮下投予疫苗。

每3至4天使用卡尺測量腫瘤。腫瘤體積係使用下列公式計算：1/2×D×d² ，其中D為長軸且d為短軸。任何可觸知，但無法測量之腫瘤均估為0.5 mm³ ，而無腫瘤存在則記錄為0 mm³ 。當腫瘤達到2000 mm³ 或在潰瘍時，犧牲小鼠並繪製存活曲線。

如圖7A至7E所示，相較於注射該包含裸HPV胜肽之疫苗或注射PBS之小鼠，注射該包含PEP001-或PEP006連接之HPV胜肽的疫苗之小鼠的腫瘤生長較慢。存活曲線中可觀察到該包含PEP001-和PEP006-連接之HPV胜肽之疫苗的治療效果類似(圖7F)。包含與rhHsc70複合之PEP006連接之HPV胜肽的疫苗在抑制腫瘤生方面較包含與rhHsc70複合之PEP001連接之HPV胜肽的疫苗更有效(圖7A、7D和7E)。值得注意的是，此差異在這些實驗中被轉譯為對抗死亡率之實質保護(圖7F)。7.2.3 包含 PEP006 和新型 HPV 胜肽組的腫瘤疫苗之效力

本實施例證明包含新型HPV胜肽組之HPV疫苗的治療效力。表4中提供用於該疫苗之多胜肽的序列。具體地說，PEP073和PEP074包含EVYDFAFRDL(SEQ ID NO：92)、鼠類H-2Db和人HLA-A*24:02抗原決定位之胺基酸序列。PEP081包含YMLDLQPET(SEQ ID NO：93)和MLDLQPETT(SEQ ID NO：94)、人HLA-A*02:01抗原決定位之胺基酸序列。PEP084包含RAHYNIVTF(SEQ ID NO：78)、鼠類H-2Db抗原決定位之胺基酸序列。PEP086包含LLMGTLGIVC(SEQ ID NO：95)、人HLA-A*02：01抗原決定位之胺基酸序列。各胜肽亦包含PEP006之胺基酸序列。

藉由章節6.2.2中描述之方法製備該疫苗，且對HPV胜肽匯集體而言，胜肽對rhHsc70蛋白質之比例為2：1。使用如章節6.2.2中描述之相同的小鼠模型評估疫苗之效力，並使用包含PEP063-066匯集體之疫苗作為比較物。

如圖8A和8B所示，在TC1 HPV16 E6/E7同基因腫瘤模型中，含有Hsc70和PEP071-086之疫苗與PBS對照組相比較減少腫瘤生長並提升生存率。7.2.4 包含 PEP006 之二種腫瘤疫苗調配物的效力

本實施例使用二種不同調配物證明疫苗之治療效力，其中之一的所有胜肽最初先在DMSO中重構，且其中之一僅有不溶於該中性、酸性或鹼性水之胜肽最初先在DMSO中重構。表4中提供該疫苗中所使用之多胜肽的序列，該多胜肽含有來自HPV E6和E7癌蛋白之腫瘤相關抗原。具體地說，本實施例中所使用之疫苗包含16種胜肽，PEP071至PEP086。各胜肽在C端包含胺基酸序列PEP006。

產生二種用於評估之疫苗調配物。在調配物A中，首先將該16種HPV胜肽的每一胜肽在100%DMSO中從粉末重構。具體而言，將該胜肽以25 mg/ml再懸浮於100% DMSO中，然後將等莫耳量之各胜肽匯集在無菌水稀釋之75% DMSO的溶液中，使最終匯集體濃度成為320μM(各胜肽@≅20μM)。在調配物B中，測試各胜肽在中性水中之溶解度，若需要時，再使用經調節pH之水(即，酸性，含有HCl或鹼性，含有NaOH)。僅當該胜肽不溶於水時才使用DMSO。具體地說，該16種胜肽可以500μM溶解在中性水溶液、經調節pH之水或在100% DMSO(當胜肽無法再懸浮於水溶液中時)中。然後，將胜肽以等體積混合以製造500μM工作匯集體(各胜肽@≅31μM)。在二種疫苗調配物方面，隨後將胜肽在水性緩衝液中稀釋至與Hsc70複合所需之濃度。

為了與HSC70複合，以總胜肽：蛋白質為2：1之莫耳比，將rh-Hsc70與16種胜肽之匯集體依循無菌程序在37℃溫育0.5小時，再在37℃下進一步溫育1小時。然後將複合物在冰上培育15分鐘。過濾該複合物並分成等分。

C57BL/6小鼠(n=13/組)在側腹皮下注射2×10⁵ 個活TC-1腫瘤細胞，然後使用二種疫苗調配物或PBS對照組治療，該二種疫苗調配物包含相同之16種重疊之長合成胜肽(涵蓋E6和E7 HPV癌蛋白之全長)。在腫瘤挑戰後第5、10和15天，在腫瘤部位對角線相對的肱淋巴結區皮下投予(a)30μg基於Hsc70之疫苗(調配物A或調配物B)+10μg QS-21或(b)PBS至小鼠。每一疫苗劑量含有30μg Hsc70和~4μg總胜肽(各胜肽~250 ng)以及QS-21佐劑。使用具有Sub-Q 26G x 5/8英寸針頭之1mL BD注射器進行注射。

監測腫瘤生長動力學和存活。在腫瘤挑戰後第5天開始，研究中每3至4天藉由卡尺測量腫瘤體積。腫瘤長度係基於最長之線性距離。寬度係基於與長度垂直之最長線性距離。當腫瘤體積達到2000mm³ 時，將小鼠安樂死。腫瘤體積(mm³ )之計算方法為長×寬² ×0.5。在具有二個腫瘤之小鼠方面，獨立測量各腫瘤並將體積相加。在腫瘤接種後第5天，將小鼠隨機分配到各治療組。將無早期可測量之腫瘤的小鼠排除在研究之外。使用Kaplan-Meier法和對數-等級(Log-rank)檢定追踪每組10隻小鼠之存活(使用任一疫苗調配物治療之小鼠的存活相對於使用PBS治療之小鼠的存活p≤0.0001)。每2至3天評估腫瘤大小並將每個組之平均腫瘤體積作為時間函數繪製圖形。

使用PBS治療之對照小鼠中的腫瘤生長迅速(圖9A和9B)。相反地，使用任一疫苗調配物治療之小鼠中可觀察到腫瘤生長速率顯著延遲(圖9A和9B)(與使用PBS治療之小鼠中的腫瘤生長相比較，使用調配物A治療之小鼠中之腫瘤生長** p≤0.01；且與使用PBS治療之小鼠中的腫瘤生長相比較，使用調配物B治療之小鼠中之腫瘤生長****p≤0.0001；Wilcoxon等級和檢定(Wilcoxon Rank Sum test))。將個別小鼠之腫瘤生長動力學作為時間函數繪製圖形。與使用PBS治療之小鼠相比較，使用調配物A或調配物B治療之小鼠中可觀察到存活延長(圖9C)。

已知TC-1腫瘤對可藉由免疫編輯驅動之抗原靶向療法發展出抗性表型並喪失由該腫瘤表現之抗原決定位(Smahel等人，2007)，這似乎可解釋使用該二種疫苗調配物時，腫瘤最終在~第28天開始進展。總結來說，這些數據證明由疫苗誘導之針對腫瘤相關抗原(諸如HPV E6和E7致癌蛋白)的有效免疫反應可轉譯成顯著之腫瘤控制和延長之存活。6.3 實施例 3 ：藉由 Hsc70- 結合之胜肽改善胜肽合成

本實施例證明PEP001和PEP006在合成過程中改善胜肽之粗純度的能力。6.3.1 藉由添加 PEP001 或 PEP006 改善 Ova 抗原性胜肽之粗純度

藉由章節6.1.1中描述之方法合成包含EVSGLEQLESⅡNFEKLTEWTSSNVME之胺基酸序列(PEP053，SEQ ID NO：97)的Ova抗原胜肽，無論是裸出的或是與PEP001(PEP052，SEQ ID NO：230，EVSGLEQLESⅡNFEKLTEWTSSNVMEFFRKNLLRLTG)或PEP006 (PEP054，SEQ ID NO：231，EVSGLEQLESⅡNFEKLTEWTSSNVMEFFRKNWLRLTW)連接者。該Ova抗原胜肽包含具有SIINFEKL之胺基酸序列(SEQ ID NO：96)的MHC-結合之抗原決定位。依照包含在Chromeleon 7.0軟體包內包括之Vanquish/Ultimate 3000用戶指南和數據瀏覽器用戶指南中提供的程序，使用Vanquish Bioanalytical和Ultimate 3000 Dionex工作站，藉由逆相色層分析法判定胜肽純度。

在胺基酸殘基添加之循環後，將合成之胜肽從樹脂裂解出，並以1 mg/mL之濃度溶解在1：1乙腈：水(v/v)中。使用Phenomenex Luna C18 10μm 4.6×250mm管柱，藉由分析型HPLC分析該溶解之樣品。注射體積20μL之樣品，並依照表10之梯度，使用溶液A(在水中之0.1% TFA)和溶液B(在乙腈中之0.1% TFA)之混合物作為移動相進行梯度洗提。將管柱溫保持在37℃±5℃。藉由在214 nm和280 nm波長處之UV吸光度檢測胜肽。

於一洗提曲線中，各個峰代表具有特定保留時間之胜肽，且該峰下之面積反映該胜肽之量。藉由質譜分析確認正確胜肽之峰。該胜肽之粗純度係藉由將正確之胜肽的峰下之面積除以整個曲線下之總面積來計算。

如圖10A中所示，該裸Ova胜肽(中間列)有異源訊號。相反地，Ova-PEP001(上列)和Ova-PEP006(下列)製劑在預期之保留時間幾乎顯示單一峰。色層分析圖之定量亦指出Ova-PEP001和Ova-PEP006具有大幅增加之粗純度(圖10B)。此結果與一般規則，較長之胜肽較難以合成和純化相違背，且表明PEP001和PEP006改善化學合成之胜肽的粗純度。6.3.2 藉由添加 PEP006 來改善一系列之胜肽的粗純度

藉由章節6.1.1中描述之方法合成下列表11中顯示之50種胜肽。該50種胜肽之群組含有在有或無(“裸胜肽”)添加C端PEP006胜肽序列下合成的25種獨特之胜肽序列(經標記之A至Y)。依上述章節6.3.1中之描述，藉由逆相色層分析法測定胜肽純度。如圖11中所示，與對應之裸胜肽相比較，添加PEP006胜肽序列可增加大多數胜肽之粗純度。由於樣品之複雜性，許多胜肽分離為多向度的。在高達95%之標準逆相梯度下，C18管柱中未檢測到三種胜肽。在此三種胜肽方面，在整個梯度範圍內並無可檢測之用於整合之峰且粗純度被列為零。未檢測到該三種胜肽之可能原因可包括樣品黏附到C18管柱或存儲小瓶中，和/或樣品掉出溶液。

本發明不侷限於本文所描述之實施態樣之範圍內。實際上，除了所描述者外，本技藝之技術熟習人士可從前述內容和附圖清楚明白本發明之各種修改。該等修改意圖包含在所附之申請專利範圍內。

本文所引用之所有參考文獻(例如公開案或專利案或專利申請案)的全部內容以引用方式併入本文且用於所有目的，其程度如同各個別參考文獻(例如公開案或專利案或專利申請案)被具體且個別指明其全部內容以引用方式併入本文以用於所有目的。其他實施態樣係在下列申請專利範圍內。

圖 1 為示例性尺寸排阻色層分析法(SEC)色層分析圖，其顯示該未複合之Hsc70(上圖)和與胜肽複合之Hsc70(下圖)的UV吸光度。“C”、“D”、“T”和“HMW”分別表示對應於胜肽-Hsc70複合物、Hsc70二聚體、Hsc70三聚體和高分子量寡聚型Hsc70種之色層分析圖區段。“M_sh ”係指單體肩部。

圖 2 之色層分析圖顯示和Hsc70混合的PEP006之UV吸光度，該PEP006和Hsc70之莫耳比係在0.25：1至3：1之範圍內，其中在該混合物中之組成係藉由尺寸排阻色層分析法分離。

圖 3A 之色層分析圖顯示包含和Hsc70混合的PEP006之多胜肽的UV吸光度，該PEP006和Hsc70之莫耳比係在0.125：1至4：1之範圍內，其中在該混合中之組成係藉由尺寸排阻色層分析法分離。圖 3B 之圖形顯示當從類似於圖3A中之尺寸排阻色層分析軌跡計算時，在多胜肽與Hsc70之莫耳比係在0.125：1至4：1之範圍內，含有PEP006之多胜肽與Hsc70複合之百分比。顯示三個獨立的實驗。

圖 4A 之圖形顯示五種不同之胜肽與Hsc70複合之百分比，其中該五種不同之胜肽各自以三種形式合成：一種具有C端PEP001序列、一種具有C端PEP006序列及一種不具有C端HSP-結合之胜肽(“裸胜肽”)。圖 4B 之圖形顯示六種不同之胜肽與Hsc70複合的百分比，其中該六種不同之胜肽各自以二種形式合成：一種具有C端PEP001序列，一種具有C端PEP006序列。

圖 5A 和5B 之圖形顯示來自以疫苗免疫化之小鼠的生產IFNγ之脾細胞的相對數目，該疫苗包含含有PEP001或PEP006之HPV匯集體的胜肽，或不與HSP-結合之胜肽連接之HPV匯集體胜肽(裸HPV胜肽)，作為游離胜肽或以2：1或1：1之比例與Hsc70蛋白質混合(每一治療組n=3隻小鼠)。

圖 6 之圖形顯示來自以指定之MC38胜肽匯集體免疫化之小鼠的產生IFNγ之脾細胞的相對數目，該MC38胜肽為游離胜肽或以2：1或1：1之比例與Hsc70蛋白質混合(每一治療組n=3隻小鼠)。

圖 7A 之圖形顯示在同基因小鼠腫瘤模型中之腫瘤平均體積，其中該小鼠係使用包含含有PEP001之HPV胜肽(“PEP067-070”)、含有PEP006之HPV胜肽(“PEP063-066”)或裸HPV胜肽(“PEP059-062”)的疫苗免疫化，在各情況中係依本文章節6.2.2中之描述與Hsc70蛋白質混合，或使用PBS作為陰性對照(每一治療組n=10隻小鼠)。圖 7B 至 7E 顯示在該四個治療組中之每隻小鼠的腫瘤體積。圖 7F 顯示一組小鼠存活曲線。

圖 8A 之圖形顯示在同基因小鼠腫瘤模型中之腫瘤平均體積，其中該小鼠係使用疫苗免疫化，該疫苗包含含有PEP006之HPV胜肽的新匯集體(“PEP071-086”)或先前測試之含有PEP006之HPV胜肽的匯集體(“PEP063-066”)，在各情況中係依本文章節6.2.3中之描述與Hsc70蛋白質混合，或使用PBS作為陰性對照(每一治療組n=13隻小鼠；誤差條：標準偏差)。圖 8B 顯示一組小鼠存活曲線。

圖 9A 之一系列圖形顯示與PBS相比較，使用二種基於HSC70之疫苗的不同調配物治療之個別小鼠中的腫瘤生長動力學，該二種不同之基於HSC70之疫苗裝載16種不同之包含PEP006的HPV胜肽。圖 9B 之圖形顯示在同一小鼠中之小組平均腫瘤生長動力學。圖 9C 之圖形顯示在同一實驗中之總體存活率。

圖 10A 之一系列色層分析圖形顯示Ova胜肽、裸(SEQ ID NO：97)或與PEP001(SEQ ID NO：230)或PEP006(SEQ ID NO：231)連接之化學合成產物之逆相色層分析訊號。該箭頭指示純胜肽之保留時間。圖 10B 之圖形顯示圖10A中之訊號的定量。圖 11 之圖形顯示裸胜肽(A至Y)相對於具有C端PEP006序列之相同胜肽(A-Y)的粗純度。

Claims

一種經單離之多胜肽，其包含熱休克蛋白質(HSP)-結合之胜肽，該熱休克蛋白質(HSP)-結合之胜肽包含X₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：1)之胺基酸序列，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G。
如申請專利範圍第1項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽包含下述胺基酸序列： (a) NX₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：2)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (b) WLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：3)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G；或 (c) NWLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：4)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G。
如申請專利範圍第1或2項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽包含選自由SEQ ID NO：5至12、98至113、207和212所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第3項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由選自SEQ ID NO：5至12、98至113、207和212所組成之群組的胺基酸序列所組成。
如前述申請專利範圍中任一項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
如申請專利範圍第5項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：6之胺基酸序列所組成。
一種經單離之多胜肽，該多胜肽包含HSP-結合之胜肽，該HSP-結合之胜肽包含NWX₁ X₂ X₃ X₄ X₅ (SEQ ID NO：232)之胺基酸序列，其中X₁ 為L或I；X₂ 為L、R或K；X₃ 為L或I；X₄ 為T、L、F、K、R或W；且X₅ 為W或K。
如申請專利範圍第7項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽包含選自由SEQ ID NO：204、208至211和213至215所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第8項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：204、208至211和213至215所組成之群組的胺基酸序列所組成。
一種經單離之多胜肽，該多胜肽包含HSP-結合之胜肽，該HSP-結合之胜肽包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列。
如申請專利範圍第10項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由SEQ ID NO：205之胺基酸序列所組成。
如前述申請專利範圍中任一項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽之長度不超過6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸。
如前述申請專利範圍中任一項之經單離之多胜肽，其進一步包含抗原性胜肽，該抗原性胜肽包含一或多個主要組織相容性複合物(MHC)-結合之抗原決定位。
如申請專利範圍第13項之經單離之多胜肽，其中該MHC-結合之抗原決定位以500 nM或更低之IC₅₀ 與MHC I分子結合。
如申請專利範圍第13項之經單離之多胜肽，其中該MHC-結合之抗原決定位以1000 nM或更低之IC₅₀ 與MHC Ⅱ分子結合。
如申請專利範圍第13至15項中任一項之經單離之多胜肽，其中該MHC-結合之抗原決定位係來自癌細胞。
如申請專利範圍第16項之經單離之多胜肽，其中該MHC-結合之抗原決定位包含該癌細胞之胺基酸突變或基因融合突變。
如申請專利範圍第17項之經單離之多胜肽，其中該胺基酸突變為取代、缺失或插入突變。
如申請專利範圍第17或18項之經單離之多胜肽，其中該胺基酸突變或基因融合突變係在該抗原性胜肽之胺基酸序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50處。
如申請專利範圍第13至15項中任一項之經單離之多胜肽，其中該MHC-結合之抗原決定位係來自病原微生物。
如申請專利範圍第20項之經單離之多胜肽，其中該病原微生物為病毒。
如申請專利範圍第21項之經單離之多胜肽，其中該病毒為人乳頭瘤病毒(papillomavirus)(HPV)。
如申請專利範圍第22項之經單離之多胜肽，其中該抗原性胜肽包含選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第13至21項中任一項之經單離之多胜肽，其中該抗原性胜肽之長度為8至50個胺基酸，可選擇地為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸長。
如申請專利範圍第24項之經單離之多胜肽，其中該抗原性胜肽之長度為20至30個胺基酸。
如申請專利範圍第24項之經單離之多胜肽，其中該抗原性胜肽之長度為27個胺基酸。
一種經單離之多胜肽，其包含HSP-結合之胜肽和抗原性胜肽，該抗原性胜肽包含選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第27項之經單離之多胜肽，其中該抗原性胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列所組成。
如申請專利範圍第27或28項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽包含選自由SEQ ID NO：1至12、98至113、204、205、207至215和232所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第29項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：1至12、98至113、204、205、207至215和232所組成之群組的胺基酸序列所組成。
如申請專利範圍第13至30項中任一項之經單離之多胜肽，其中該MHC-結合之抗原決定位包含經修飾之胺基酸殘基。
如申請專利範圍第31項之經單離之多胜肽，其中該經修飾之胺基酸殘基為已在側鏈羥基或胺上被磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His。
如申請專利範圍第31項之經單離之多胜肽，其中該經修飾之胺基酸殘基為已在側鏈羥基或胺上被磷酸化之Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His胺基酸的模擬物。
如申請專利範圍第33項之經單離之多胜肽，其中該模擬物為磷酸化殘基之不可水解的類似物。
如申請專利範圍第31項之經單離之多胜肽，其中該經修飾之胺基酸殘基為已在側鏈醯胺上被糖化之Asn、已在側鏈羥基上被糖化之Ser或Thr、已在側鏈胺基上被甲基化之Lys或Arg、巳在側鏈胺基上被乙醯化之Lys、已在α-胺基上被乙醯化之N端殘基或已在α-羧基上被醯胺化之C端殘基。
如申請專利範圍第31至35項中任一項之經單離之多胜肽，其中該經修飾之胺基酸殘基係在該抗原性胜肽之胺基酸序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50處。
如申請專利範圍第13至36項中任一項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽係經由化學連接子與該抗原性胜肽連接。
如申請專利範圍第13至36項中任一項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽係經由胜肽連接子與該抗原性胜肽連接。
如申請專利範圍第38項之經單離之多胜肽，其中該胜肽連接子包含FFRK(SEQ ID NO：13)或FR之胺基酸序列。
如申請專利範圍第38或39項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽係位在該多胜肽之C端。
如申請專利範圍第40項之經單離之多胜肽，其在該多胜肽之C端包含下述胺基酸序列： (a) FFRKX₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：14)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (b) FFRKNX₁ LX₂ LTX₃ (SEQ ID NO：15)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (c) FFRKWLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：16)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G； (d) FFRKNWLX₁ LTX₂ (SEQ ID NO：17)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G；或 (e) FFRKNWX₁ X₂ X₃ X₄ X₅ (SEQ ID NO：233)，其中X₁ 為L或I；X₂ 為L、R或K；X₃ 為L或I；X₄ 為T、L、F、K、R或W；且X₅ 為W或K。
如申請專利範圍第40項之經單離之多胜肽，其包含選自由SEQ ID NO：18至25、71、72、74、75、166、167、173和174所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第38或39項之經單離之多胜肽，其中該HSP-結合之胜肽係位在該多胜肽之N端。
如申請專利範圍第43項之經單離之多胜肽，其在該多胜肽之N端包含下述胺基酸序列： (a) X₁ LX₂ LTX₃ FFRK (SEQ ID NO：26)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (b) NX₁ LX₂ LTX₃ FFRK (SEQ ID NO：27)，其中X₁ 為W或F；X₂ 為R或K；且X₃ 為W、F或G； (c) WLX₁ LTX₂ FFRK (SEQ ID NO：28)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G； (d) NWLX₁ LTX₂ FFRK (SEQ ID NO：29)，其中X₁ 為R或K；且X₂ 為W或G；或 (e) NWX₁ X₂ X₃ X₄ X₅ FFRK (SEQ ID NO：234)，其中X₁ 為L或I；X₂ 為L、R或K；X₃ 為L或I；X₄ 為T、L、F、K、R或W；且X₅ 為W或K。
如申請專利範圍第43項之經單離之多胜肽，其包含選自由SEQ ID NO：30至37和216至229所組成之群組的胺基酸序列。
如前述申請專利範圍中任一項之經單離之多胜肽，其中該多胜肽之長度為12至50個胺基酸，可選擇地為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸長。
如前述申請專利範圍中任一項之經單離之多胜肽，其中該多胜肽之長度為20至40個胺基酸。
如前述申請專利範圍中任一項之經單離之多胜肽，其包含選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第48項之經單離之多胜肽，其中該多胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列所組成。
如前述申請專利範圍中任一項之經單離之多胜肽，其中該多胜肽係經化學合成。
一種組成物，其包含如申請專利範圍第13至50項中任一項之多胜肽和純化之壓力蛋白質的複合物。
如申請專利範圍第51項之組成物，其中該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白(Calreticulin)及其突變體或融合蛋白。
如申請專利範圍第52項之組成物，其中該壓力蛋白質為Hsc70。
如申請專利範圍第53項之組成物，其中該壓力蛋白質為人Hsc70。
如申請專利範圍第51至54項中任一項之組成物，其中該壓力蛋白質為重組蛋白。
一種組成物，其包含複數個如申請專利範圍第13至50項中任一項之多胜肽。
如申請專利範圍第51至56項中任一項之組成物，其包含2至20種不同之如申請專利範圍第13至50項中任一項之多胜肽。
如申請專利範圍第57項之組成物，其中該不同的多胜肽各自包含相同之HSP-結合之胜肽和不同的抗原性胜肽。
如申請專利範圍第56至58項中任一項之組成物，其中每一該多胜肽之抗原性胜肽包含選自由SEQ ID NO：38至53所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第59項之組成物，其中該組成物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種不同之抗原性胜肽。
如申請專利範圍第58至60項中任一項之組成物，其中每一該多胜肽包含選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列。
如申請專利範圍第58至61項中任一項之組成物，其中每一該多胜肽之胺基酸序列係由選自由SEQ ID NO：54至69所組成之群組的胺基酸序列所組成。
如申請專利範圍第58至62項中任一項之組成物，其中該組成物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16種不同之多胜肽。
如申請專利範圍第47至59項中任一項之組成物，其中該組成物中之多胜肽的總量為約0.1至20 nmol。
如申請專利範圍第64項之組成物，其中該組成物中之多胜肽的總量為約3、4、5或6 nmol。
如申請專利範圍第51至55和57至65項中任一項之組成物，其中該組成物中之壓力蛋白質的量為約10μg至600μg。
如申請專利範圍第66項之組成物，其中該組成物中之壓力蛋白質的量為約250μg至290μg。
如申請專利範圍第51至55和57至67項中任一項之組成物，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。
如申請專利範圍第68項之組成物，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。
如申請專利範圍第69項之組成物，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。
如申請專利範圍第51至55和57至70項中任一項之組成物，其中該組成物中之該多胜肽和壓力蛋白質的總量為約10μg至600μg。
如申請專利範圍第71項之組成物，其中該組成物中之該多胜肽和壓力蛋白質的總量為約300μg。
如申請專利範圍第51至72項中任一項之組成物，其中該組成物進一步包含佐劑。
如申請專利範圍第73項之組成物，其中該佐劑包含皂苷或免疫刺激性核酸。
如申請專利範圍第73項之組成物，其中該佐劑包含QS-21。
如申請專利範圍第75項之組成物，其中該組成物中之QS-21的量為約10μg、25μg或50μg。
如申請專利範圍第73至76項中任一項之組成物，其中該佐劑包含TLR促效劑，可選擇地為TLR4促效劑、TLR5促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑和/或TLR9促效劑。
如申請專利範圍第51至77項中任一項之組成物，其為包含醫藥上可接受之載體或賦形劑的醫藥組成物。
如申請專利範圍第51至78項中任一項之組成物，其中該組成物為單位劑型。
一種誘導個體中針對抗原性胜肽之細胞免疫反應之方法，該方法包含對該個體投予(a)有效量之如申請專利範圍第51至78項中任一項之組成物，或(b)如申請專利範圍第79項之單位劑型。
如申請專利範圍80項之方法，其中該個體患有癌症。
如申請專利範圍80項之方法，其中該個體患有病原微生物感染。
一種治療個體疾病之方法，該方法包含對該個體投予(a)有效量之如申請專利範圍第51至78項中任一項之組成物，或(b)如申請專利範圍第79項之單位劑型。
如申請專利範圍第83項之方法，其中該疾病為癌症。
如申請專利範圍83項之方法，其中該疾病為病原微生物感染。
如申請專利範圍第81或84項之方法，其中該MHC-結合之抗原決定位係存在於該個體之癌細胞中。
如申請專利範圍第82或85項之方法，其中該MHC-結合之抗原決定位係存在於病原微生物中。
如申請專利範圍第80至87項中任一項之方法，其中該組成物或單位劑型係每週投予該個體，共四週。
如申請專利範圍第88項之方法，其中在該四個每週劑量後，每二週對該個體投予至少二個該組成物或單位劑型之另外的劑量。
如申請專利範圍第88或89項之方法，其中在最後一個每週劑量或每二週劑量後三個月投予至少一個該組成物或單位劑型之加強劑量。
如申請專利範圍第90項之方法，其中每三個月進一步投予該組成物或單位劑型，持續至少1年。
如申請專利範圍第80至91項中任一項之方法，其進一步包含對該個體投予來那度胺(lenalidomide)、地塞米松(dexamethasone)、介白素-2、重組干擾素α-2b或PEG-干擾素α-2b。
如申請專利範圍第80至92項中任一項之方法，其進一步包含對該個體投予吲哚胺(indoleamine)二氧酶-1(IDO-1)抑制劑。
如申請專利範圍第93項之方法，其中該IDO-1抑制劑為4-胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-N'-羥基-1,2,5-
二唑-3-甲脒。
如申請專利範圍第80至94項中任一項之方法，其進一步包含對該個體投予免疫檢查點抗體。
如申請專利範圍第95項之方法，其中該免疫檢查點抗體係選自由下列所組成之群組：促效性(agonistic)抗GITR抗體、促效性抗OX40抗體、拮抗性抗PD-1抗體、拮抗性抗CTLA-4抗體、拮抗性抗TIM-3抗體、拮抗性抗LAG-3抗體、拮抗性抗TIGIT抗體、促效性抗CD96抗體、拮抗性抗VISTA抗體、拮抗性抗CD73抗體、促效性抗CD137抗體、拮抗性抗CEACAM1抗體、促效性抗ICOS抗體和/或其抗原結合片段。
一種套組，其包含第一容器和第二容器，該第一容器包含如申請專利範圍第13至51項中任一項之多胜肽且該第二容器包含能與該多胜肽結合之純化的壓力蛋白質。
如申請專利範圍第97項之套組，其中該第一容器包含2至20種不同之如申請專利範圍第13至51項中任一項的多胜肽。
如申請專利範圍第98項之套組，其中該不同之多胜肽各自包含相同之HSP-結合之胜肽和不同之抗原性胜肽。
如申請專利範圍第97至99項中任一項之套組，其中該第一容器中之該多胜肽的總量為約0.1至20 nmol。
如申請專利範圍第100項之套組，其中該第一容器中之該多胜肽的總量為約3、4、5或6 nmol。
如申請專利範圍第97至101項中任一項之套組，其中該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白及其突變體。
如申請專利範圍第102項之套組，其中該壓力蛋白質為Hsc70。
如申請專利範圍第103項之套組，其中該壓力蛋白質為人Hsc70。
如申請專利範圍第97至104項中任一項之套組，其中該壓力蛋白質為重組蛋白。
如申請專利範圍第97至105項中任一項之套組，其中該第二容器中之該壓力蛋白質的量為約10μg至600μg。
如申請專利範圍第106項之套組，其中該第二容器中之該壓力蛋白質的量為約250μg至290μg。
如申請專利範圍第97至107項中任一項之套組，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。
如申請專利範圍第108項之套組，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。
如申請專利範圍第109項之套組，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。
如申請專利範圍第97至110項中任一項之套組，其中該第一容器中之該多胜肽和該第二容器中之該壓力蛋白質的總量為約10μg至600μg。
如申請專利範圍第111項之套組，其中該第一容器中之該多胜肽和該第二容器中之該壓力蛋白質的總量為300μg。
如申請專利範圍第97至112項中任一項之套組，其進一步包含含有佐劑之第三容器。
如申請專利範圍第113項之套組，其中該佐劑包含皂苷或免疫刺激核酸。
如申請專利範圍第114項之套組，其中該佐劑包含QS-21。
如申請專利範圍第115項之套組，其中該第三容器中之該QS-21的量為約10μg、25μg或50μg。
如申請專利範圍第113至116項中任一項之套組，其中該佐劑包含TLR促效劑，可選擇地為TLR4促效劑、TLR5促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑和/或TLR9促效劑。
一種製造疫苗之方法，該方法包含將一或多種如申請專利範圍第13至51項中任一項之多胜肽與純化之壓力蛋白質在合適之條件下混合，從而使該純化之壓力蛋白質與至少一種該多胜肽結合。
如申請專利範圍第118項之方法，其中該壓力蛋白質係選自由下列所組成之群組：Hsc70、Hsp70、Hsp90、Hsp110、Grp170、Gp96、鈣網伴護蛋白及其突變體。
如申請專利範圍第119項之方法，其中該壓力蛋白質為Hsc70。
如申請專利範圍第120項之方法，其中該壓力蛋白質為人Hsc70。
如申請專利範圍第118至121項中任一項之方法，其中該壓力蛋白質為重組蛋白。
如申請專利範圍第118至122項中任一項之方法，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約0.5：1至5：1。
如申請專利範圍第123項之方法，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1至2：1。
如申請專利範圍第118至124項中任一項之方法，其中該合適之條件包含約37℃之溫度。
如申請專利範圍第118至125項中任一項之方法，其中該多胜肽對該壓力蛋白質之莫耳比為約1：1、1.25：1或1.5：1。