JP2016538333A - ヒトパピローマウイルス治療ワクチン - Google Patents
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Abstract
ヒトパピローマウイルスに感染した人々を治療する治療ワクチン用のペプチド及び組成物が提示される。その組成物を使用する方法、及びがんのリスクがある者又は既にヒトパピローマウイルスによるがんをもつ者を含むヒトパピローマウイルスに感染した人々を治療する方法が提示される。【選択図】図1A
Description
子宮頸がんは全世界の女性で4番目によく見られるがんであり、年間528,000の罹病症例、266,000の死亡症例がある。アメリカ合衆国では、新たな子宮頸がん症例は毎年12,360例であり、死亡は4,020例である。ハイリスクヒトパピローマウイルスは最もよく見られる型がHPV16であり、子宮頸がんの主因である。100を超えるさまざまな型のヒトパピローマウイルスのうち、少なくとも15の型が子宮頸部の浸潤性扁平上皮癌と強く関連する。HPV16はこのがんと最も一般的に関連するとわかっているものである。
また、ヒトパピローマウイルス感染症は子宮頸がんの前駆病変、扁平上皮内病変とも関連する。大部分の低度扁平上皮内病変が将来的に自然に消退する一方で、高度扁平上皮内病変に進行するものもある。これらの高度病変、特に子宮頸部扁平上皮内腫瘍3は、高率での浸潤性子宮頸がんへの進行に関連する。
2つの初期遺伝子産物、E6及びE7は、ヒトパピローマウイルスによる悪性の表現型への形質転換を媒介する。これらのウイルスタンパク質はともに、細胞のヒトがん抑制遺伝子の産物と相互作用することが示されている。E6タンパク質は細胞にコードされるp53と結合し、その分解を促進でき、一方でE7タンパク質は網膜芽腫感受性遺伝子産物と相互作用する。HPV E6/E7タンパク質の恒常的発現が、子宮頸がんの悪性の表現型の維持に必要とされる。
細胞性免疫は、ヒトパピローマウイルス感染症及びヒトパピローマウイルス関連疾患の制御に重要な役割を担う。CD4T細胞が抗腫瘍反応を起こすのに重要である。これらのCD4T細胞の有効性は、腫瘍排除において支配的なエフェクター細胞として働くと思われているCD8細胞傷害性Tリンパ球のプライム及び維持を促進する能力にあると考えられている。扁平上皮内病変及び子宮頸がん検体試料の免疫組織化学的分析により、活性化した細胞傷害性Tリンパ球が病変に存在することが示されている。CD4T細胞は、Tヘルパー1サイトカインを産生すること、及び腫瘍特異的な細胞傷害性Tリンパ球をプロフェッショナル抗原提示細胞にプライムするための活性化シグナルをもたらすことによって細胞傷害性Tリンパ球を活性化する。CD8陽性細胞傷害性Tリンパ球は、長さが8〜11個のアミノ酸の外来ペプチドを認識し、ヒト白血球型抗原クラスI分子に結合し、その分子によって提示される。これらのペプチドはT細胞エピトープと呼ばれる。
メモリーT細胞は、以前に遭遇した病原体又は腫瘍抗原に対する長期にわたる免疫の維持に重要な役割を果たす。それらのメモリーT細胞は増殖して急速にエフェクター機能を獲得し、ウイルス感染した細胞又は腫瘍細胞を死滅させ、抗原への再曝露による再刺激後の病原体の複製を阻害するサイトカインを分泌しうる。末梢抗原性シグナルをリンパ器官に伝えうる抗原提示細胞は、ヒトパピローマウイルス感染症及びヒトパピローマウイルス関連腫瘍に対する抗原特異的T細胞免疫応答の誘導に重要な役割を果たす。プロフェッショナル抗原提示細胞としての樹状細胞は、高いレベルの主要組織適合遺伝子複合体及び共刺激分子を発現する。炎症促進性シグナルが不足することによって引き起こされる、適切な共刺激が無い状況での抗原提示を導く、樹状細胞の不充分又は不適切な活性化が抗腫瘍免疫の障害の理由の1つである。
予防的HPVワクチンは利用可能であり、HPV感染症を予防することによって作用する。しかし、それらの予防的HPVワクチンは、既に感染している個人では効果的ではない。標準的な外科的治療は早産のリスクの増加に関連するので、HPV治療ワクチンは前がん病変があるが子どもを産むことを希望する女性に恩恵をもたらすことになるだろう。また、世界の発展途上地域に居住し、外科的モダリティにアクセスできない男女に恩恵をもたらすことにもなるだろう。
治療ワクチンとして使用するためのHPVペプチドを含有する医薬製剤が提供される。また、製剤を作製する方法、とりわけ、難溶性のHPVペプチドを溶解する方法が提供される。また、HPV感染症及びHPV関連がんを含むHPV関連病変を治療する方法が提供される。
1つの実施形態は、長さが20〜100個のアミノ酸の、HPV E6 81〜115(配列番号1の残基81〜115)の少なくとも20個の連続残基を含むHPV E6ペプチドAを、HPVペプチドAを溶解する工程の前に、各々の長さが10〜100個のアミノ酸の、少なくとも50%のHPV E6 1〜80(配列番号1の残基1〜80)の配列及び少なくとも50%のHPV E6 116〜158(配列番号1の残基116〜158)を集合的に含む、2つ以上のHPVペプチドYを溶存形態で含むバッファーに溶解して、ペプチドAを溶存形態で含み、ペプチドYを溶存形態で含む最終可溶性組成物を創り出すことを含むHPV E6ペプチドを溶解する方法を提供する。ペプチドAを溶解する工程の前のバッファー中のペプチドYは好ましくは完全溶存形態(不溶のペプチドYがない)であり、最終可溶性組成物ではペプチドA及びYは好ましくは完全溶存形態である。
別の実施形態は、(a)各々の長さが10〜100個のアミノ酸残基の、1つ以上のHPV E6ペプチド、(b)2〜40mMの濃度のグルタミン酸(塩)、(c)0.3%〜5%(重量/体積)の濃度のトレハロース、(d)0.2%〜10%(重量/体積)の濃度のグリシンを含み、pHが3.0〜5.0である医薬製剤を提供する。
別の実施形態は、HPV E6ペプチドA及び1つ以上のHPVペプチドYを含む医薬製剤を提供し、その組成物は、長さが20〜100個のアミノ酸の、HPV E6 81〜115(配列番号1の残基81〜115)の少なくとも20個の連続残基を含むHPV E6ペプチドAを、前記HPVペプチドAを溶解する工程の前に、各々の長さが10〜100個のアミノ酸の、少なくとも50%のHPV E6 1〜80(配列番号1の残基1〜80)の配列及び少なくとも50%のHPV E6 116〜158(配列番号1の残基116〜158)を集合的に含む、2つ以上のHPVペプチドYを溶存形態で含むバッファーに溶解して、前記ペプチドAを溶存形態で含み、前記ペプチドYを溶存形態で含有する最終可溶性組成物を創り出すことを含む方法によって作製される。
別の実施形態は、(a)各々の長さが10〜100個のアミノ酸残基の1つ以上のHPV E6ペプチド、(b)2〜40mMの濃度のグルタミン酸(塩)(c)0.3%〜5%(重量/体積)の濃度のトレハロース、(d)0.2%〜10%(重量/体積)の濃度のグリシンを含む医薬製剤を投与することを含む、個人のヒトパピローマウイルス(HPV)による感染症を減少又はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させる方法を提供する。
本願明細書では、キャンディン(CANDIN)などのリコール抗原が試験したHPVペプチドに対するT細胞免疫応答を増強することが実施例2で示される。リコール抗原とHPVペプチドの混合物は末梢血単核細胞と接触する。よって、疾患特異的抗原と共にリコール抗原を含むワクチンを投与することは一般的な適用性があって疾患特異的抗原に対する細胞(T細胞)免疫応答を促進しうる。
したがって、1つの実施形態は、個人のヒトパピローマウイルス(HPV)による感染症を減少又はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させてHPVに対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、該方法は、個人に1つ以上のHPV抗原を含む組成物を投与すること及び個人にHPV抗原ではないリコール抗原を投与すること含み、リコール抗原は投与されて個人の1つ以上のHPV抗原と接触させられ、個人は1つ以上のHPV抗原に対するT細胞応答を必要とし、1つ以上のHPV抗原はE6抗原ではない。
生検によって診断された高度扁平上皮(HSIL)をもつ女性との患者の第I相治験では、女性らは、HPVタンパク質E6残基1〜45(配列番号2)、E6 46〜80(配列番号3)、E6 81〜115(配列番号4)、及びE6 116〜158(配列番号5)を含み、すべてがアジュバントとしてのキャンディンと混合された組成物の皮内注射で治療される。試験投与量は、50ug、100ug、及び250ugの各々のペプチドであった。驚いたことに、50ug投与量群では6名の対象のうち4名(67%)、100ug投与量群では6名の対象のうち3名(50%)、250ug投与量群では3名の対象のうち0名に、彼女らの病変の完全な退縮があった。くわえて、50ug投与量群中の1名のさらなる対象に部分的退縮(<0.2mm2の病変が残る)があった。これは最も低い投与量が最も効果的であったという驚くべき結果である。このことは下記実施例3に報告されている。
よって、別の実施形態は、25〜110ugの配列番号2から成るペプチド、25〜110ugの配列番号3から成るペプチド、25〜110ugの配列番号4から成るペプチド、25〜110ugの配列番号5から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、100〜900ulの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
別の実施形態は、25〜110ugの配列番号2から成るペプチド、25〜110ugの配列番号3から成るペプチド、25〜110ugの配列番号4から成るペプチド、25〜110ugの配列番号5から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、100〜900ulの量で含む単位投与量医薬組成物を、患者に皮内注射することを含むHPV感染症を治療する方法を提供する。
別の実施形態は、微生物の1つ以上の抗原を含む組成物を前記対象に皮内投与すること及び微生物の抗原ではないリコール抗原を前記対象に皮内投与することを含み、リコール抗原が投与されて、対象の微生物の1つ以上の抗原と接する、哺乳類対象において微生物によって起こされる疾患を治療する方法を提供する。
本発明は治療ワクチンで用いるHPVペプチドに関わる。
ヒトパピローマウイルスによる扁平上皮の悪性の表現型への形質転換は、2つの初期遺伝子産物−E6及びE7によって媒介される。ウイルスタンパク質はともに、細胞のヒト腫瘍抑制遺伝子の産物と相互作用することが示されている。E6タンパク質は細胞にコードされるp53に結合し、その分解を促進できる一方で、E7タンパク質は網膜芽腫感受性遺伝子産物と相互作用する。E6及びE7オープンリーディングフレームの発現がHPV16によるヒト細胞の形質転換に必要かつ十分であることが示されている。
我々はこれまで、HPVに対する好ましい免疫反応答において認識されるE6及びE7のエピトープを研究してきた(Nakagawa, M. et al, 2010, Journal of Lower Genital Tract Disease, Vol. 14, No. 2, p. 124-129;米国特許(U.S. Patent Publication)第20110293651号、同第20090136531号、同第20090117140号、同第20060182763号)。
我々は、治療ワクチンで用いるHPV E6及びE7ペプチド、とりわけ、HPV E6ペプチドを特定した(米国特許第20110293651号、同第20090136531号、同第20090117140号)。
非常に多くの型のHPVが存在する。がんと最もよく関連するものはHPV16である。
本明細書に記載されるペプチドはHPVのE6タンパク質(HPV E6)に由来する。HPV16由来のE6の配列は下記配列番号1である。
以下の実施形態のペプチドはHPV E6ペプチドであり、それらのペプチドがHPV E6タンパク質の配列に由来することを意味する。E6タンパク質はいずれのHPV株に由来できる。好ましい実施形態では、ペプチドはHPV16のE6に由来する。
好ましくは、ペプチドはHPV E6配列のみを含む。しかし、それらのペプチドは他のアミノ酸残基を含んでもよい。それらのペプチドは、HPV16だけでなく、いずれのHPV株からのE6配列を含んでもよい。
ペプチドは好ましくは化学的に合成されるが、それらのペプチドは組換えDNA技術による組換え生物で作製されてもよい。また、それらのペプチドは当業者に公知の他の手段によって、例えば、E6のタンパク質分解又は作製されるペプチドより長いペプチドペプチドのタンパク質分解によって作製されてもよい。
幾つかの実施形態では、ペプチドは、そのアミノ末端がアセチル化されるか、そのカルボキシ末端がアミド化されるか、又は両方である。その他の実施形態では、いずれの末端も修飾を受けない。
特定の実施例では、ペプチドは、長さが10〜100個、8〜100個、8〜75個、8〜50個、8〜40個、10〜75個、10〜50個、10〜40個、20〜100個、20〜75個、20〜50個、20〜40個、30〜100個、30〜75個、30〜50個、又は30〜40個のアミノ酸残基である。
一般にペプチドは、配列が記載のものであり、アミノ酸がL立体異性体であることを意味する「フォワードL(forward L)」である。しかし、特定の実施形態では、ペプチドはアミノ酸残基の通常配列(ordinary sequence)が反転され、アミノ酸がD立体異性体であることを意味するリバースD(reverse D)ペプチドであることができる。
1つの実施形態は、長さが20〜100個のアミノ酸の、HPV E6 81〜115(配列番号1の残基81〜115)の少なくとも20個の連続残基を含むHPV E6ペプチドAを、HPVペプチドAを溶解する工程の前に、各々の長さが10〜100個のアミノ酸の、少なくとも50%のHPV E6 1〜80(配列番号1の残基1〜80)の配列及び少なくとも50%のHPV E6 116〜158(配列番号1の残基116〜158)を集合的に含む、2つ以上のHPVペプチドYを完全溶存形態で含むバッファーに溶解して、ペプチドAを完全溶存形態で含み、ペプチドYを完全溶存形態で含む最終可溶性組成物を創り出すことを含むHPV E6ペプチドを溶解する方法を含む。
特定の実施形態では、ペプチドAは、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化される。
特定の実施形態では、HPVペプチドAは配列番号1の残基81〜115を含む。その他の実施形態では、HPVペプチドAは、配列番号1の残基81〜115の25個の連続残基を含むか、又は配列番号1の残基81〜115の30個の連続残基を含む。
特定の実施形態では、HPVペプチドAは配列番号1の残基81〜115から成る。
特定の実施形態では、ペプチドAは、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化される。
特定の実施形態では、バッファーは、pHが約pH3.0〜約pH5.0、約pH3.5〜約pH4.5、又は約pH2.5〜約pH5.5である。
特定の実施形態では、バッファーは少なくとも2mMグルタミン酸(塩)を含む。その他の実施形態では、バッファーは、2〜50mMグルタミン酸(塩)、少なくとも5mMグルタミン酸(塩)、5〜50mMグルタミン酸(塩)、又は5〜25mMグルタミン酸(塩)、又は2〜25mMグルタミン酸(塩)を有しうる。この文脈で「グルタミン酸(塩)」という用語は、グルタミン酸のプロトン化及び非プロトン化されたすべての形態、すなわちグルタミン酸塩及びグルタミン酸を含むことを意図する。
特定の実施形態では、ペプチドA及びYは集合的に配列番号1のすべて又はHPV E6配列のすべてを含む。
特定の実施形態では、ペプチドAは、配列番号1の残基81〜115から成り、並びにペプチドYは、配列番号1の残基1〜45、46〜80、及び116〜158から成る3つのペプチドである。
本発明のより特定の実施例では、ペプチドA及びYの各々は、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化され、バッファーは、pHが約pH3.0〜pH5.0であり、溶解後、ペプチドA及び3つのペプチドYの各々は、濃度が0.1〜20mg/mlである。その他の実施形態では、溶解後に、ペプチドA及び3つのペプチドYの各々は、濃度が0.1〜5mg/ml又は0.02〜5mg/mlである。
特定の実施形態では、ペプチドYの各々は、最終可溶性組成物中でペプチドAの少なくとも80%の重量/体積濃度である。
特定の実施形態では、ペプチドA及びペプチドYの各々は、最終可溶性組成物中で0.1〜5mg/mlである。その他の実施形態では、それらのペプチドA及びペプチドYの各々は、0.1〜20mg/ml又は0.02〜5mg/mlである。
1つの実施形態は、(a)各々の長さが10〜100個のアミノ酸残基の1つ以上のHPV E6ペプチド、(b)濃度が2〜40mMのグルタミン酸(塩)、(c)濃度が0.3%〜5%(重量/体積)のトレハロース、(d)濃度が0.2%〜10%(重量/体積)のグリシンを含む医薬組成物を提供し、その組成物は、pHが3.0〜5.0である。
グルタミン酸(塩)濃度の他の可能性のある範囲は、2〜20mM及び5〜20mMである。トレハロース濃度の他の可能性のある範囲は、0.2%〜5%(重量/体積)、0.5%〜5%(重量/体積)、及び0.3%〜2%(重量/体積)、及び0.5%〜2%(重量/体積)である。グリシン濃度の他の可能性のある範囲は、0.2%以上、0.3%以上、0.5%以上、1%以上、並びに最大でも3%、最大でも5%、最大でも8%、最大でも10% 、最大でも15%、及び最大でも20%である。
特定の実施形態では、1つ以上のHPV E6ペプチドの少なくとも1つは、配列番号1の残基46〜70を含むか、又は配列番号1の残基91〜115を含むか、又は配列番号1の残基80〜88を含む。特定の実施形態では、1つ以上のHPV E6ペプチドの少なくとも1つは、配列番号1の残基46〜70を含むか、又は配列番号1の残基91〜115を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、各々の長さが10〜100個のアミノ酸残基の、集合的にHPV E6配列の少なくとも50%を含む、少なくとも3つのHPV E6ペプチドを含む。
特定の実施形態では、組成物は、配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、又は116〜158から成る少なくとも1つのペプチド、配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、又は116〜158から成る少なくとも2つのペプチド、配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、又は116〜158から成る少なくとも3つのペプチドを含むか、又は配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、及び116〜158からそれぞれ成る4つのペプチドを含む。
特定の実施形態では、ペプチドは各々、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシ末端がアミド化される。
医薬組成物はまた、リコール抗原を含みうる。プロトタイプのリコール抗原は、一般的に免疫学的皮膚試験に使用して免疫反応を試験するものであり、特に、流行性耳下腺炎抗原、カンジダ抗原、及び白癬菌抗原である。該試験は、身体が抗原を「記憶」又は「リコール」するか否か、すなわち抗原が皮内注射によって投与される皮膚の遅延型過敏症応答があるか否かを示す。
「リコール抗原」という用語は、複数の蛋白様抗原を含有する物質又は混合物として本明細書では定義され、混合物は皮内皮膚試験において以前にリコール抗原に感作又は露出された大部分の人々に遅延型過敏症応答を誘発する。プロトタイプのリコール抗原は、一般的に免疫学的皮膚試験に使用して免疫反応を試験するものであり、特に、流行性耳下腺炎抗原、カンジダ抗原、及び白癬菌抗原である。これらの各々は、単数形「抗原(antigen)」によって言及されるが、実際には、免疫応答を誘導できる数個又多くの分子性物質から構成される。
特定の実施形態では、リコール抗原は、流行性耳下腺炎抗原(例えば、不活化全ムンプスウイルス)、カンジダ抽出物、又は白癬菌抽出物でありうる。
特定の実施形態では、リコール抗原は、不活化全ウイルス、不活化全細菌、又は不活化全微生物である。
下記実施例2は、E6ペプチドがインビトロでランゲルハンス細胞に部分的な成熟効果を及ぼす一方で、E6ペプチドに曝された細胞でカンジダ抽出物はインビトロでT細胞増殖に関与したことを示す。そこで、カンジダ抽出物は、強力なHPVに対するT細胞応答を誘導するE6ペプチドの優れたアジュバントである。
我々は、4つのHPV E6ペプチドとキャンディンとの皮内注射に関する治験を行なっている。ペプチドは、10mMグルタミン酸(塩)、1.0%(重量/体積)トレハロース、2.0%(重量/体積)グリシン、及び0.714mg/mlの各々の4つのHPV16 E6ペプチド(配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、及び116〜158から成り、各々、そのカルボキシ末端がアミド化され、そのアミノ末端がアセチル化されている)を含有する薬剤溶液(pharmaceutical solution)Aにある。薬剤溶液Aは、50μg、100μg、250μg、又は500μg(70〜700μlの溶液A)の量で注射器に吸い取り、注射器内で300ulのキャンディンと混ぜる。次いで、注射器内の混合物は子宮頸部病変を有するHPV陽性患者に皮内注射される。
キャンディン(登録商標)(カンジダ・アルビカンス)は、カンジダ・アルビカンスの2つの株の培養ろ過液及び細胞から作られる。該菌類は、無機塩、ビオチン、及び蔗糖から成る化学組成既知の培地的で増殖させる。凍結乾燥原材料は、0.25%NaCl、0.125%NaHCO3及び50%(体積/堆積)グリセロールの溶液で抽出する。濃縮抽出物は0.5%NaCl、0.25%NaHCO3、0.03%米国薬局方アルブミン(ヒト)、8ppmポリソルベート80、及び0.4%フェノールの溶液で希釈する。
キャンディン(登録商標)(カンジダ・アルビカンス)の効力は、ヒトではDTH皮膚試験で測定する。手順には、以前にスクリーニングされ、試験対象として役目を果たすのに適格とされた感受性のある成人(sensitive adult)を使って、内部基準(IR)とともに生産ロットを同時に(並行して)テストすることが含まれる。0.1mLの生産ロットによって生じる48時間時の硬結反応を測定し、0.1mLのIRによって引き起こされる反応と比較する。0.05のp値で対応のあるt検定(両側)によって解析した際に、生産ロットの効力がIRの効力と比べて±20%を超えて違わない場合、試験は基準内である。
IRの効力はDTH皮膚試験によってモニターされる。効力検定に関わる人々は、平均硬結反応(mm)が計算される4回のIRでの皮膚試験を受けることによって試験対象として適格とされる。IRでの現行皮膚試験は、0.05のp値で対応のあるt検定(両側)によって解析した際に、IRの効力が、同じ試験対象での平均適格反応と比べて±20%を超えて変化しないことを示さなければならない。求められるIRに対する48時間時の硬結反応は15mm±20%である。
キャンディン(登録商標)(カンジダ・アルビカンス)の皮膚試験の濃度は成人健常者における用量反応試験から決定される。製品が意図するの、抗原に対する細胞過敏症をもつ免疫学的に適格な人々において≧5mmの硬結反応を引き起こすことである。
別の実施形態は、(a)各々の長さが10〜100個のアミノ酸残基の1つ以上のHPV E6ペプチド、(b)2〜40mMの濃度のグルタミン酸(塩)(c)0.3%〜5%(重量/体積)の濃度のトレハロース、(d)0.2%〜10%(重量/体積)の濃度のグリシンを含む医薬製剤を投与することを含む、個人のヒトパピローマウイルス(HPV)による感染症を減少又はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させる方法を提供する。
別の実施形態は、医薬組成物を、それを必要とするHPV陽性の個人に投与することを含む、個人のヒトパピローマウイルス(HPV)による感染症を減少又はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させる方法を提供する。この場合、医薬組成物は、HPV E6ペプチドA及び1つ以上のHPVペプチドYを含む医薬組成物でありうる。その組成物は、長さが20〜100個のアミノ酸の、HPV E6 81〜115(配列番号1の残基81〜115)の少なくとも20個の連続残基を含むHPV E6ペプチドAを、前記HPVペプチドAを溶解する工程の前に、各々の長さが10〜100個のアミノ酸の、少なくとも50%のHPV E6 1〜80(配列番号1の残基1〜80)の配列及び少なくとも50%のHPV E6 116〜158(配列番号1の残基116〜158)を集合的に含む、2つ以上のHPVペプチドYを溶存形態で含むバッファーに溶解して、前記ペプチドAを溶存形態で含み、前記ペプチドYを溶存形態で含有する最終可溶性組成物を創り出すことを含む方法によって作製される。
これらの治療法の特定の実施形態では、該方法は医薬組成物を皮内に注射することを含む。また、医薬組成物は他の経路によって、例えば静脈注射若しくは皮下注射によって、又は腸内に投与されてもよい。しかし、皮内注射が好ましい経路である。
該治療法の特定の実施形態では、医薬組成物はリコール抗原をさらに含む。
該治療法の特定の実施形態では、該方法はリコール抗原を皮内に注射することをさらに含む。
特定の実施形態では、該方法はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は悪性腫瘍である。
特定の実施形態では、病変は子宮頸がんである。
特定の実施形態では、病変は頭頸部癌である。
特定の実施形態では、該方法はHPV関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、又は咽頭口腔部の腫瘍である。
特定の実施形態では、該方法はHPV関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は高度扁平上皮内病変(HSIL)である。
その他の実施形態では、該方法はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させる方法であり、病変は良性腫瘍又は前がん病変である。
幾つかの実施形態でのペプチドは、そのアミノ末端がアセチル化されるか、そのカルボキシ末端がアミド化されるか、又は両方である。その他の実施形態では、いずれの末端も修飾を受けない。
好ましくは、該方法では組成物は皮内注射によって投与される。しかし、組成物はいずれの好適な方法、例えば、筋肉内注射によって投与されてよい。
1つの実施形態は、個人のヒトパピローマウイルス(HPV)による感染症を減少又はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させてHPVに対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、該方法は、個人に1つ以上のHPV抗原を含む組成物を投与すること及び個人にHPV抗原ではないリコール抗原を投与すること含み、リコール抗原は投与されて個人の1つ以上のHPV抗原と接触させられ、個人は1つ以上のHPV抗原に対するT細胞応答を必要とする。特定の実施形態では、1つ以上のHPV抗原はE6抗原又はE7抗原である。他の特定の実施例では、それらはE6抗原ではない。別の特定の実施形態では、それらはE7抗原ではない。
該方法は、HPV抗原ではないリコール抗原を投与することを含まない、その他は同一の方法と比べて、投与する個人におけるHPV抗原に対するより強力なT細胞応答を生じさせることが期待される。「より強力なT細胞応答」は、例えば、インビトロで、リコール抗原無しに疾患特異的抗原で治療された対象由来のT細胞に対して、リコール抗原と疾患特異的抗原の混合物で治療された対象由来のT細胞における抗原特異的T細胞によって媒体される細胞傷害性又は抗原特異的T細胞増殖応答がより大きいことよって示されうる。これは、治験でヒト被験者を試験することによって、より可能性があるのは動物モデル試験で、又は例えば下記実施例2の図3に示されるようにヒト由来のT細胞のインビトロ試験によって示されることができる。
好ましくは、1つ以上のHPV抗原及びリコール抗原の投与は、1つ以上のHPV抗原及びリコール抗原の両方を含む組成物を投与することによって行なわれる。しかし、その投与は、1つ以上のHPV抗原及びリコール抗原の連続した別々の投与でも、例えば、1つの組成物中の1つ以上のHPV抗原の皮内注射並びに第2の組成物中のリコール抗原の同じ場所への別個の皮内注射によっても行なうことができる。
よって、1つの実施形態では、1つ以上のHPV抗原を含む組成物はリコール抗原も含む。
1つの実施形態では、個人に1つ以上のHPV抗原を投与する工程及び個人にリコール抗原を投与する工程は、1つ以上のHPV抗原及びリコール抗原を皮内に注射することを含む。他の特定の実施例では、リコール抗原及びHPV抗原は皮下注射によって投与される。ランゲルハンス細胞は皮膚で最も一般的な抗原提示細胞であり、最も多量に見られるので、皮内注射が特に好ましい。
特定の実施形態では、1つ以上のHPV抗原はHPV E7抗原を含む。
特定の実施形態では、1つ以上のHPV抗原は、長さが8〜100個のアミノ酸、8〜70個のアミノ酸、8〜50個のアミノ酸、又は8〜40個のアミノ酸のペプチドである。より特定の実施例では、1つ以上のペプチドは化学的に合成される。
生検によって診断された高度扁平上皮(HSIL)をもつ女性との患者の第I相治験では、女性らは、HPVタンパク質E6残基1〜45(配列番号2)、E6 46〜80(配列番号3)、E6 81〜115(配列番号4)、及びE6 116〜158(配列番号5)を含み、すべてがアジュバントとしてのキャンディンと混合された組成物の皮内注射で治療される。試験投与量は、50ug、100ug、及び250ugの各々のペプチドであった。驚いたことに、50ug投与量群では6名の対象のうち4名(67%)、100ug投与量群では6名の対象のうち3名(50%)、250ug投与量群では3名の対象のうち0名に、彼女らの病変の完全HSIL退縮があった。くわえて、50ug投与量群中の1名のさらなる対象に部分的退縮(<0.2mm2の病変が残る)があった。これは最も低い投与量が最も効果的であったという驚くべきの結果である。このことは下記実施例3に報告されている。
よって、別の実施形態は、25〜110ugの配列番号2から成るペプチド、25〜110ugの配列番号3から成るペプチド、25〜110ugの配列番号4から成るペプチド、25〜110ugの配列番号5から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、100〜900ul、200〜900ul、300〜900ul、又は100〜600ulの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
リコール抗原は、ヒトへの皮内注射、以前に抗原に曝されたことがある免疫が適格な成人(immunocompetent adults)の大部分への皮内注射の際に硬結反応を生じさせるの充分な量及び濃度にあるべきである。
特定の実施形態では、リコール抗原はカンジダ抽出物である。
特定の実施形態では、単位投与量医薬組成物は、200〜400ulのキャンディン又は等価総効力のカンジダ抽出物を含む。
単位投与量医薬組成物の特定の実施形態では、総量は200〜500ulである。
特定の実施形態では、単位投与量医薬組成物は30〜70ugの各々のペプチドを含むか、又は他の実施形態では、約50ugの各々のペプチドを含む。
特定の実施形態では、ペプチドは各々、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシ末端がアミド化される。
実施例3では、各々の4つのペプチドを100ug含む組成物を注射することは、病変の退縮を引き起こすのにも良好に作用した。よって、別の実施形態は、55〜150ugの配列番号2から成るペプチド、55〜150ugの配列番号3から成るペプチド、55〜150ugの配列番号4から成るペプチド、55〜150ugの配列番号5から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、100〜900ulの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
別の実施形態は、約100ugの配列番号2から成るペプチド、約100ugの配列番号3から成るペプチド、約100ugの配列番号4から成るペプチド、約100ugの配列番号5から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、100〜900ulの量で含む単位投与量医薬組成物を提供する。
別の実施形態は、患者に、25〜110ugの配列番号2から成るペプチド、25〜110ugの配列番号3から成るペプチド、25〜110ugの配列番号4から成るペプチド、25〜110ugの配列番号5から成るペプチド、及びリコール抗原を、皮内注射用単位剤形で、100〜900ulの量で含む単位投与量医薬組成物を皮内投与することを含むHPV感染症を治療する方法を提供する。
特定の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を5日以上28日以下あけて、連続して少なくとも3回皮内注射することを含む。
別の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を10日以上21日以下あけて、連続して少なくとも3回皮内注射することを含む。
特定の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を10日以上21日以下あけて、連続して少なくとも2回皮内注射することを含む。
特定の実施形態では、方法は患者に単位投与量医薬組成物を、各注射の間を5日以上28日以下あけて、2年の期間内に少なくとも3回多くても6回皮内注射することを含む。
本願明細書で実施例2に、キャンディンなどのリコール抗原が、試験HPVペプチドに対するT細胞免疫応答を高めることが示される。リコール抗原とHPVペプチドの混合物は末梢血単核細胞と接触する。よって、疾患特異的抗原とともリコール抗原を含むワクチンの投与は、一般的な適用性がり、疾患特異的抗原に対する細胞(T細胞)免疫応答を促進しうる。
よって、1つの実施形態は、微生物の1つ以上の抗原を含む組成物を対象に投与すること及び微生物の抗原ではないリコール抗原を対象に投与することを含み、リコール抗原が投与されて、対象の微生物の1つ以上の抗原と接する、哺乳類対象において微生物によって起こされる疾患を治療する方法を提供する。
特定の実施形態では、微生物は、ウイルス、細菌、又は真菌(例えば、酵母)でありうる。特定の実施形態では、微生物はHPVではない。特定の実施形態では、微生物は単純ヘルペスウイルスではない。
微生物の1つ以上の抗原は、長さが10〜100個、8〜100個、8〜75個、8〜50個、8〜40個、10〜75個、10〜50個、10〜40個、20〜100個、20〜75個、20〜50個、20〜40個、30〜100個、30〜75個、30〜50個、又は30〜40個のアミノ酸残基の特定の実施例におけるペプチドでありうる。
ペプチドは好ましくは化学的に合成されるが、それらのペプチドは組換えDNA技術による組換え生物で作製されてもよい。また、それらのペプチドは当業者に公知の他の手段によって、例えば、微生物のタンパク質のタンパク質分解によって作製されてもよい。
幾つかの実施形態でのペプチドは、そのアミノ末端がアセチル化されるか、そのカルボキシ末端がアミド化されるか、又は両方である。その他の実施形態では、いずれの末端も修飾を受けない。
好ましくは、該方法では組成物は皮内注射によって投与される。しかし、組成物はいずれの好適な方法、例えば、筋肉内注射によって投与されてよい。
実施例1
アミド化及びアセチル化したHPV E6 81〜115ペプチドを溶解すること、並びに医薬製剤の形成
我々は、4つのHPV E6ペプチドを用いて医薬製剤を作製することを試みた。4つのペプチドは、配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、及び116〜158から成るペプチドであった。各ペプチドは、そのカルボキシル末端をアミド化し、そのアミノ末端をアセチル化した。ペプチドは各々化学的に合成した。
アミド化及びアセチル化したHPV E6 81〜115ペプチドを溶解すること、並びに医薬製剤の形成
我々は、4つのHPV E6ペプチドを用いて医薬製剤を作製することを試みた。4つのペプチドは、配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、及び116〜158から成るペプチドであった。各ペプチドは、そのカルボキシル末端をアミド化し、そのアミノ末端をアセチル化した。ペプチドは各々化学的に合成した。
HPV16 E6 81〜115ペプチドは、製造に適したバッファーのいずれにも不溶であることが分かった。しかし、そのペプチドは、溶解したE6 1〜45、E6 46〜80、及びE6 116〜158を既に含有する10mMグルタミン酸のpH4.0溶液に加えた場合、4つのペプチドの各々が5mg/mlの濃度にて溶解可能で溶解したままと思われることがわかった。
医薬製剤のために、これと、安定化剤としてのトレハロース及び浸透圧調節剤としてのグリシンを混ぜた。製剤の最終濃度は、グルタミン酸が10mM、トレハロースが1.0%(重量/体積)、グリシンが2.0%(重量/体積)、及び4つのペプチド各々が0.714mg/mlであった。
保存するために製剤を凍結乾燥し、適量の注射用水を添加することによって再溶解して上記の濃度を得た。
実施例2:ヒトパピローマウイルスペプチドに基づく治療ワクチン用の新規アジュバントとしてのカンジダ皮膚試験試薬
細胞性免疫を効果的に促進できるワクチンアジュバントは現在のところない。カンジダ皮膚試験試薬注射には尋常性疣贅の消退を誘導する能力があることから、我々のグループはペプチドに基づくヒトパピローマウイルス治療ワクチンの治験でそれを新規アジュバントとして使用している。この現在の試験の目的は、どのようにカンジダがワクチン免疫反応を高めるかのメカニズムを調べることであった。ランゲルハンス細胞の成熟効果、T細胞増殖能、ランゲルハンス細胞によるサイトカイン及びパターン認識受容体の発現、並びにTh1、Th2、及びTh17応答を誘導する能力を健康な対象で調べた。ワクチン、カンジダを伴うヒトパピローマウイルスペプチド、CD40(p=0.00007)及びCD80(p<0.00001)レベルの有意な上方制御によって示唆されるランゲルハンス細胞への部分的成熟効果を示し、インビトロでランゲルハンス細胞によって提示された場合、T細胞増殖能(p<0.00001)を示した。興味深いことに、成熟効果はペプチドに起因した一方でカンジダはT細胞増殖の原因となった。ワクチン又はカンジダのみで処理したランゲルハンス細胞のサイトカイン分析結果(IL−1β、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12p40、IL−23Ap19、IFN−γ、及びTNF−α)は、IL−12p40のmRNAが最も高い頻度で誘導されたことを示し、IL−12p70タンパク質が上澄みに検出された。カンジダ・アルビカンスに関連することが知られているパターン認識受容体(DC−SIGN、デクチン−1、デクチン−2、ガレクチン−3、ミンクル、マンノース受容体、Toll様受容体−1、2、4、6、及び9)の存在が対象全員で示された。他方では、ワクチン又はカンジダでのパルスを受けたランゲルハンス細胞で刺激したCD4細胞によるIFN−γ分泌によって示されるTh1応答の誘導は、1名の対象のみで示された。まとめると、ワクチンのランゲルハンス細胞成熟効果はペプチドに起因した一方で、T細胞増殖能はカンジダに由来し、最も高い頻度で誘導されたサイトカインはIL−12であった。
細胞性免疫を効果的に促進できるワクチンアジュバントは現在のところない。カンジダ皮膚試験試薬注射には尋常性疣贅の消退を誘導する能力があることから、我々のグループはペプチドに基づくヒトパピローマウイルス治療ワクチンの治験でそれを新規アジュバントとして使用している。この現在の試験の目的は、どのようにカンジダがワクチン免疫反応を高めるかのメカニズムを調べることであった。ランゲルハンス細胞の成熟効果、T細胞増殖能、ランゲルハンス細胞によるサイトカイン及びパターン認識受容体の発現、並びにTh1、Th2、及びTh17応答を誘導する能力を健康な対象で調べた。ワクチン、カンジダを伴うヒトパピローマウイルスペプチド、CD40(p=0.00007)及びCD80(p<0.00001)レベルの有意な上方制御によって示唆されるランゲルハンス細胞への部分的成熟効果を示し、インビトロでランゲルハンス細胞によって提示された場合、T細胞増殖能(p<0.00001)を示した。興味深いことに、成熟効果はペプチドに起因した一方でカンジダはT細胞増殖の原因となった。ワクチン又はカンジダのみで処理したランゲルハンス細胞のサイトカイン分析結果(IL−1β、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12p40、IL−23Ap19、IFN−γ、及びTNF−α)は、IL−12p40のmRNAが最も高い頻度で誘導されたことを示し、IL−12p70タンパク質が上澄みに検出された。カンジダ・アルビカンスに関連することが知られているパターン認識受容体(DC−SIGN、デクチン−1、デクチン−2、ガレクチン−3、ミンクル、マンノース受容体、Toll様受容体−1、2、4、6、及び9)の存在が対象全員で示された。他方では、ワクチン又はカンジダでのパルスを受けたランゲルハンス細胞で刺激したCD4細胞によるIFN−γ分泌によって示されるTh1応答の誘導は、1名の対象のみで示された。まとめると、ワクチンのランゲルハンス細胞成熟効果はペプチドに起因した一方で、T細胞増殖能はカンジダに由来し、最も高い頻度で誘導されたサイトカインはIL−12であった。
略称:APC、抗原提示細胞;HPV、ヒトパピローマウイルス;LC、ランゲルハンス細胞;MFI、平均蛍光強度;PAMP、病原体関連分子パターン;PBMC、末梢血単核細胞;PE、フィコエリスリン;qRT‐PCR、定量リアルタイムPCR;PRR、パターン認識受容体
1 序論
認可されているヒトワクチンに最も広く使用されるアジュバントは、主にTh2免疫応答を引き起こすことが示されているミョウバンに基づくアジュバントである[1]。よって、ミョウバンに基づくアジュバントは、抗体応答をブーストするように設計されたワクチンでは有用であると思われるが、細胞性免疫応答を刺激するように設計されたワクチンに対しては有用ではない。ヒトパピローマウイルス(HPV)感染症の排除の成功は、細胞性免疫によって誘導されると考えられているので[2、3]、そのような免疫を促進すると思われるアジュバントが必要であるが、手に入れることができない。
認可されているヒトワクチンに最も広く使用されるアジュバントは、主にTh2免疫応答を引き起こすことが示されているミョウバンに基づくアジュバントである[1]。よって、ミョウバンに基づくアジュバントは、抗体応答をブーストするように設計されたワクチンでは有用であると思われるが、細胞性免疫応答を刺激するように設計されたワクチンに対しては有用ではない。ヒトパピローマウイルス(HPV)感染症の排除の成功は、細胞性免疫によって誘導されると考えられているので[2、3]、そのような免疫を促進すると思われるアジュバントが必要であるが、手に入れることができない。
我々のグループ及び他のグループは、カンジダ、ムンプス、及び/又はトリコフィトンなどの皮膚試験試薬を用いた連続尋常性疣贅病巣内注射が治療した疣贅の退縮だけでなく離れた未治療の疣贅の退縮も誘導できることを示している[4〜9]。第I相治験(NCT00569231)において我々のグループは、カンジダ・アルビカンスの無色抽出物であるキャンディン(登録商標)(Allermed社、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して尋常性疣贅を治療した。治療した疣贅の消散が82%の対象で起こり、抗HPVT細胞応答が示された[8]。キャンディンがカンジダ・アルビカンスに由来することを考えれば、多数の病原体関連分子パターン(PAMP)を含有するはずである。我々は、キャンディンは複数のパターン認識受容体(PRR)を刺激し、先天性免疫及び獲得免疫を誘導すると思われる効果的なワクチンアジュバントでありうると仮説をたてた。
子宮頸がんはほとんどの場合ハイリスクHPV感染症によって引き起こされ、世界中の女性で2番目に多いがんである。2つの非常に効果的な予防HPVワクチン、ガーダシル(登録商標)(メルク社、ニュージャージー州、アメリカ合衆国)及びサーバリックス(登録商標)(グラクソ・スミスクライン社、ミドルセックス、英国)がs使用可能であり、それらのワクチンは高い力価の中和抗体を誘導することによって作用する[10〜12]。しかし、予防HPVワクチンは、前から存在するHPV感染症をもつ女性には効果的ではない[10、12、13]。したがって、既にHPVに感染した人及び/又はHPV関連腫瘍を発症している人に使用できる治療HPVワクチンはない。我々のグループは、HPV感染症及び/又は子宮頸部病変をもつ女性において自然に誘導される免疫を研究し、ハイリスクHPVの腫瘍性タンパク質の1つであるE6に対するT細胞応答を誘導する能力が、HPV排除及び子宮頸部病変の消退に関連することを見出してきた[3、14、15]。したがって、我々は4つのHPV16 E6ペプチド及びキャンディン(Candin)から成るHPV治療ワクチンを設計し、第I相治験(NCT01653249)を行っっている。
現在の試験では、我々はキャンディンのワクチンアジュバントとしての免疫増強効果を調べた。驚いたことに、E6ペプチドはランゲルハンス細胞(LC)の部分的成熟に関与した一方で、キャンディンはT細胞増殖効果に関与した。最もよく誘導されたLCによるサイトカインはIL−12であった。
2.材料及び方法
2.1 単球由来LCの産生
単核細胞をアフェレーシスによって健常な血液ドナー(n=10)から集めた(キー・バイオロジーズ有限責任会社(Key Biologies, LLC)、テネシー州メンフィス)。対象は時系列順に番号を付けた。フィコール勾配遠心分離法を用いて末梢血単核細胞(PBMC)を精製した。単球を単球単離キットII(ミルテニーバイオテク社、カリフォルニア州オーバーン)を用いてPBMCからネガティブに単離し、Faheyら[17]の記載のように顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、IL−4、及びトランスフォーミング増殖因子β−1を用いてLCに形質転換した。LCへの転換の有効性は、選択された実験においてCD1a(イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ)、ランゲリン(ベックマン・コールター社、カリフォルニア州ブレア)、及びEカドヘリン(イーバイオサイエンス社)を、FACS Fortessa(アーカンソー州大学メディカルサイエンス(University of Arkansas for Medical Sciences)微生物学及び免疫学フローサイトメトリーコア研究室)及びCellQuest Proソフトウェア(BDバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンノゼ)を用いて検出することによって示された(図1)。LC成熟実験を行うことができなかった対象1を除いた対象全員から充分な数の細胞を得ることができた。
2.1 単球由来LCの産生
単核細胞をアフェレーシスによって健常な血液ドナー(n=10)から集めた(キー・バイオロジーズ有限責任会社(Key Biologies, LLC)、テネシー州メンフィス)。対象は時系列順に番号を付けた。フィコール勾配遠心分離法を用いて末梢血単核細胞(PBMC)を精製した。単球を単球単離キットII(ミルテニーバイオテク社、カリフォルニア州オーバーン)を用いてPBMCからネガティブに単離し、Faheyら[17]の記載のように顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、IL−4、及びトランスフォーミング増殖因子β−1を用いてLCに形質転換した。LCへの転換の有効性は、選択された実験においてCD1a(イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ)、ランゲリン(ベックマン・コールター社、カリフォルニア州ブレア)、及びEカドヘリン(イーバイオサイエンス社)を、FACS Fortessa(アーカンソー州大学メディカルサイエンス(University of Arkansas for Medical Sciences)微生物学及び免疫学フローサイトメトリーコア研究室)及びCellQuest Proソフトウェア(BDバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンノゼ)を用いて検出することによって示された(図1)。LC成熟実験を行うことができなかった対象1を除いた対象全員から充分な数の細胞を得ることができた。
2.2 キャンディン及び/又はHPVペプチドで処理したLCの成熟分析
キャンディンをスライド−A−ライザーG2透析カセット(サーモ・サイエンティフィック社、イリノイ州ロックフォード)を用いて使用前に透析して少量の溶媒(0.4%フェノール)を除去した。LCを上記のように調製し、100万個のLCをそれぞれ、キャンディン(150μl/ml)、4つの現行適正製造基準グレードHPV16 E6ペプチド[E6 1〜45、E6 46〜80、E6 81〜115、及びE6 116〜158(以降、「ペプチド」と呼ぶ);10μg/ml/ペプチド;CPCサイエンティフィック社、カリフォルニア州サニーベールによって製造され、インテグリティ・バイオ社(Integrity Bio)、カリフォルニア州カマリロによってバイアル化]、又はキャンディン/「ペプチド」で処理した。ザイモサン(10μg/ml、インビボジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ)、β−グルカン及びマンナンを含む多くの多糖類酵母細胞壁粒子[18]を陽性対照として用いた。48時間インキュベーションした後、抗ヒトCD40フィコエリスリン(PE)−Cy5.5、CD80フルオレセインイソチオシアネート、CD86PE−Cy5 、及びHLA−DR PE(イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ)で細胞を染色した。1万の事象を獲得し、Flowjoソフトウェア(BDバイオサイエンス社)を用いてデータを解析した。
キャンディンをスライド−A−ライザーG2透析カセット(サーモ・サイエンティフィック社、イリノイ州ロックフォード)を用いて使用前に透析して少量の溶媒(0.4%フェノール)を除去した。LCを上記のように調製し、100万個のLCをそれぞれ、キャンディン(150μl/ml)、4つの現行適正製造基準グレードHPV16 E6ペプチド[E6 1〜45、E6 46〜80、E6 81〜115、及びE6 116〜158(以降、「ペプチド」と呼ぶ);10μg/ml/ペプチド;CPCサイエンティフィック社、カリフォルニア州サニーベールによって製造され、インテグリティ・バイオ社(Integrity Bio)、カリフォルニア州カマリロによってバイアル化]、又はキャンディン/「ペプチド」で処理した。ザイモサン(10μg/ml、インビボジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ)、β−グルカン及びマンナンを含む多くの多糖類酵母細胞壁粒子[18]を陽性対照として用いた。48時間インキュベーションした後、抗ヒトCD40フィコエリスリン(PE)−Cy5.5、CD80フルオレセインイソチオシアネート、CD86PE−Cy5 、及びHLA−DR PE(イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ)で細胞を染色した。1万の事象を獲得し、Flowjoソフトウェア(BDバイオサイエンス社)を用いてデータを解析した。
2.3 キャンディン及び/又は「ペプチド」で処理したLCによって誘導したT細胞増殖の分析
LC形質転換の7日目に、同じ対象のCD3T細胞を、汎T細胞単離キットII(ミルテニーバイオテク社)を用いてPBMCからネガティブに単離した。CD25制御性T細胞を除去するために、ヒトCD25抗体−ビオチン(ミルテニーバイオテク社)を加えた。96ウェルプレートの各ウェル中で、1%ヒト血清を含有する100μlの完全Ysselの培地(ジェミニ・バイオ−プロダクツ社(Gemini Bioproducts Inc)、カリフォルニア州ウッドランド)でT細胞(1.5×106個の細胞/mL)を自己由来LC(3×104個の細胞/mL)と共培養することによって、T細胞増殖アッセイを6連反復ウェルで行った。細胞(T細胞及びLC)を含み、細胞及びキャンディン(150μl/ml)、細胞及びキャンディン/「ペプチド」、並びに細胞及び破傷風トキソイド(500ng/ml、EMDミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ)を入れたウェルをセットアップした。インキュベーションの7日後に、10μlのアラマーブルー(ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド)を使用して、各ウェルの培地に相当する量を置換した後、プレートを37℃で6時間インキュベーションした。バイオテックシナジー2(BioTek Synergy-2)マルチプレートリーダー(USバイオテック社、ワシントン州シアトル)を用いて培地中で、蛍光を測定した(励起波長530nm及び発光波長590nm)。
LC形質転換の7日目に、同じ対象のCD3T細胞を、汎T細胞単離キットII(ミルテニーバイオテク社)を用いてPBMCからネガティブに単離した。CD25制御性T細胞を除去するために、ヒトCD25抗体−ビオチン(ミルテニーバイオテク社)を加えた。96ウェルプレートの各ウェル中で、1%ヒト血清を含有する100μlの完全Ysselの培地(ジェミニ・バイオ−プロダクツ社(Gemini Bioproducts Inc)、カリフォルニア州ウッドランド)でT細胞(1.5×106個の細胞/mL)を自己由来LC(3×104個の細胞/mL)と共培養することによって、T細胞増殖アッセイを6連反復ウェルで行った。細胞(T細胞及びLC)を含み、細胞及びキャンディン(150μl/ml)、細胞及びキャンディン/「ペプチド」、並びに細胞及び破傷風トキソイド(500ng/ml、EMDミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ)を入れたウェルをセットアップした。インキュベーションの7日後に、10μlのアラマーブルー(ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド)を使用して、各ウェルの培地に相当する量を置換した後、プレートを37℃で6時間インキュベーションした。バイオテックシナジー2(BioTek Synergy-2)マルチプレートリーダー(USバイオテック社、ワシントン州シアトル)を用いて培地中で、蛍光を測定した(励起波長530nm及び発光波長590nm)。
2.4 定量リアルタイムPCR(qRT‐PCR)によるサイトカイン及びPRR分析
「ペプチド」(10μg/ml/ペプチド)と共に又は「ペプチド」無しで、キャンディン(50μl/ml、100μl/ml、及び150μl/ml)で各キャンディン濃度にて100万個のLCをそれぞれ処理した。ザイモサンを陽性対照として10ug/mlで使用し、培地のみを陰性対照として使用した。8時間及び24 時間後にRNA用に細胞を採取した。RNeasyキット(キアゲン、カリフォルニア州バレンシア)を用いてRNAを抽出し、DNaseI(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)で処理した。cDNA合成をスーパースクリプト(Superscript)III第一鎖合成システム(ライフテクノロジーズ社)を用いて実施した。
「ペプチド」(10μg/ml/ペプチド)と共に又は「ペプチド」無しで、キャンディン(50μl/ml、100μl/ml、及び150μl/ml)で各キャンディン濃度にて100万個のLCをそれぞれ処理した。ザイモサンを陽性対照として10ug/mlで使用し、培地のみを陰性対照として使用した。8時間及び24 時間後にRNA用に細胞を採取した。RNeasyキット(キアゲン、カリフォルニア州バレンシア)を用いてRNAを抽出し、DNaseI(プロメガ、ウィスコンシン州マディソン)で処理した。cDNA合成をスーパースクリプト(Superscript)III第一鎖合成システム(ライフテクノロジーズ社)を用いて実施した。
IL−1β、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12p40、IL−23Ap19、IFN−γ、及びTNF−αを含むサイトカインについて、定量PCR分析をiQ−SYBRミックス(バイオ・ラッド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を用いて2連で行った。くわえて、カンジダ・アルビカンスと関連することが知られているPRR(DC−SIGN、デクチン−1、デクチン−2、ガレクチン−3、ミンクル、マンノース受容体、TLR−1、TLR−2、TLR−4、TLR−6、及びTLR−9)[19〜28]の発現を調べた。IL−12を検出するために使用したプライマーは、Vernalら[29]によって以前に報告されている。他のプライマーはすべて、Beacon Designソフトウェア(バイオ・ラッド社、表1)を用いて設計した。閾値サイクル数(threshold cycle)は、ヒトハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド 3−リン酸デヒドロゲナーゼに対して正規化し、8時間時点の未処理のLCと比較して倍率変化(fold change)として計算した。cDNAの増幅が示された場合、mRNAが検出されたとみなす。
2.5 ELISAによるIL−12p70タンパク質分析
「ペプチド」(10μg/ml/ペプチド)と共に又は「ペプチド」無しでキャンディン(50μl/ml、100μl/ml、及び150μl/ml)で処理したLCの上澄みを、24時間時点でqRT‐PCR実験から採取し、IL−12p70高感度ELISAキット(イーバイオサイエンス社)を用いて試験した。培地のみのウェルの値を実験用のウェルから減算する。
「ペプチド」(10μg/ml/ペプチド)と共に又は「ペプチド」無しでキャンディン(50μl/ml、100μl/ml、及び150μl/ml)で処理したLCの上澄みを、24時間時点でqRT‐PCR実験から採取し、IL−12p70高感度ELISAキット(イーバイオサイエンス社)を用いて試験した。培地のみのウェルの値を実験用のウェルから減算する。
2.6 細胞内サイトカイン染色
方法はZielinskiら[30]によって記載されたものを適合した。CD4T細胞はPBMCからCD4T細胞単離キットII(ミルテニーバイオテク社)を用いてネガティブに単離し、た自己由来LCと50:1(CD4T細胞:LC)の比で共培養した。「ペプチド」(10μg/ml/ペプチド)と共に又は無しにキャンディン(150μl/ml)を加えて細胞を刺激した。培地のみを陰性対照として使用した。共培養の6日後、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(200nM、シグマ社、ミズーリ州セントルイス)、及びイオノマイシン(1μg/ml、シグマ社)で細胞を2時間刺激した。次に、ブレフェルジンA(10μg/ml、イーバイオサイエンス社) をさらに2時間加えた。Fixable Viability Dye eFluor450(登録商標)(イーバイオサイエンス社)を用いて染色した後、細胞を透過処理/固定して、抗ヒトIFN−γPE、IL−17Aペリジニンクロロフィルタンパク質−Cy5.5、IL−4アロフィコシアニン、又は関連アイソタイプ対照(イーバイオサイエンス社)で染色した。1万事象をFACS Fortessaを用いて獲得した。生存リンパ球をゲートし、IFN−γ、IL−17A、及びIL−4陽性CD4T細胞の%割合をFACS Diva(BDバイオサイエンス社)及びFlowjoソフトウェアを用いて解析した。
方法はZielinskiら[30]によって記載されたものを適合した。CD4T細胞はPBMCからCD4T細胞単離キットII(ミルテニーバイオテク社)を用いてネガティブに単離し、た自己由来LCと50:1(CD4T細胞:LC)の比で共培養した。「ペプチド」(10μg/ml/ペプチド)と共に又は無しにキャンディン(150μl/ml)を加えて細胞を刺激した。培地のみを陰性対照として使用した。共培養の6日後、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(200nM、シグマ社、ミズーリ州セントルイス)、及びイオノマイシン(1μg/ml、シグマ社)で細胞を2時間刺激した。次に、ブレフェルジンA(10μg/ml、イーバイオサイエンス社) をさらに2時間加えた。Fixable Viability Dye eFluor450(登録商標)(イーバイオサイエンス社)を用いて染色した後、細胞を透過処理/固定して、抗ヒトIFN−γPE、IL−17Aペリジニンクロロフィルタンパク質−Cy5.5、IL−4アロフィコシアニン、又は関連アイソタイプ対照(イーバイオサイエンス社)で染色した。1万事象をFACS Fortessaを用いて獲得した。生存リンパ球をゲートし、IFN−γ、IL−17A、及びIL−4陽性CD4T細胞の%割合をFACS Diva(BDバイオサイエンス社)及びFlowjoソフトウェアを用いて解析した。
2.7 統計解析
混合効果モデルによるANOVAを用いて、群間の従属性を考慮しつつ群を比較した。成熟マーカーについてテューキーの多重比較法を用いてすべての対比較ペアを行った(図2B)一方で、T細胞増殖についてダネットの検定を用いて培地対照値を残りの群と比較した(図3)。
混合効果モデルによるANOVAを用いて、群間の従属性を考慮しつつ群を比較した。成熟マーカーについてテューキーの多重比較法を用いてすべての対比較ペアを行った(図2B)一方で、T細胞増殖についてダネットの検定を用いて培地対照値を残りの群と比較した(図3)。
3.結果
3.1 LCの表現型成熟
我々は、キャンディン(Candin)及び/又は「ペプチド」のLCに対する成熟効果を評価した(図1〜2)。CD40に関して、未処理のLCと比較して、ザイモサン(p<0.00001)、「ペプチド」(p=0.00003)、及びキャンディン/「ペプチド」(p=0.00007)で処理したLCで平均蛍光強度(MFI)の統計的に有意な増加が見られた。くわえて、「ペプチド」及びキャンディン/「ペプチド」で処理したLCのMFIは、キャンディンのみで処理したLCのMFIと比べて有意に高かった(それぞれ、p=0.001及び0.003)。CD80に関して、培地と比較して、「ペプチド」(p<0.00001)及びキャンディン/「ペプチド」(p<0.00001)で処理したLCでMFIの有意な増加が見られた。キャンディンで処理したLCと比較して、「ペプチド」及びキャンディン/「ペプチド」で処理したLCでCD80発現が有意に高かった(共にp<0.00001)。ザイモサンのみが、有意にCD86のMFIを増加させた(p<0.00001)。HLA−DRに関しては有意な増加は観察されなかった。まとめると、「ペプチド」は、部分的LC成熟効果を発揮した一方でキャンディンは発揮しなかった。個別に試験した「ペプチド」のエンドトキシンレベルはすべて検出限界未満であった(<1.0EU/mg)。
3.1 LCの表現型成熟
我々は、キャンディン(Candin)及び/又は「ペプチド」のLCに対する成熟効果を評価した(図1〜2)。CD40に関して、未処理のLCと比較して、ザイモサン(p<0.00001)、「ペプチド」(p=0.00003)、及びキャンディン/「ペプチド」(p=0.00007)で処理したLCで平均蛍光強度(MFI)の統計的に有意な増加が見られた。くわえて、「ペプチド」及びキャンディン/「ペプチド」で処理したLCのMFIは、キャンディンのみで処理したLCのMFIと比べて有意に高かった(それぞれ、p=0.001及び0.003)。CD80に関して、培地と比較して、「ペプチド」(p<0.00001)及びキャンディン/「ペプチド」(p<0.00001)で処理したLCでMFIの有意な増加が見られた。キャンディンで処理したLCと比較して、「ペプチド」及びキャンディン/「ペプチド」で処理したLCでCD80発現が有意に高かった(共にp<0.00001)。ザイモサンのみが、有意にCD86のMFIを増加させた(p<0.00001)。HLA−DRに関しては有意な増加は観察されなかった。まとめると、「ペプチド」は、部分的LC成熟効果を発揮した一方でキャンディンは発揮しなかった。個別に試験した「ペプチド」のエンドトキシンレベルはすべて検出限界未満であった(<1.0EU/mg)。
3.2 アラマーブルーで測定したT細胞増殖
培地と比較してキャンディン(p<0.00001)及びキャンディン/「ペプチド」(p<0.00001)で増殖が有意に増加した(図3)。「ペプチド」は測定可能な増殖を誘導しなかった。破傷風トキソイドで測定可能な増殖(>5000の蛍光の増加)が対象2及び5で示されたが、全体として培地と比較して有意な増加は見られなかった(図3)。ありそうもないが、T細胞に加えてLCも増殖したかもしれない可能性を排除することはできない。
培地と比較してキャンディン(p<0.00001)及びキャンディン/「ペプチド」(p<0.00001)で増殖が有意に増加した(図3)。「ペプチド」は測定可能な増殖を誘導しなかった。破傷風トキソイドで測定可能な増殖(>5000の蛍光の増加)が対象2及び5で示されたが、全体として培地と比較して有意な増加は見られなかった(図3)。ありそうもないが、T細胞に加えてLCも増殖したかもしれない可能性を排除することはできない。
3.3 キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」でパルスしたLCによるサイトカインの発現
10名の対象のLCをキャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で処理し、8つのサイトカインmRNA発現(表1)をqRT‐PCRによって調べた(図4、表2)。選択した実験ではゲルを精製した後、目的の産物の増幅をDNAシークエンシングによって確認した。全体として、キャンディン及びキャンディン/「ペプチド」で処理したLCのサイトカイン発現分析結果は同じようなものであった。IL−12p40が最も高い頻度で強化されたサイトカイン(未処理のものと比較して>5倍)であり、その発現は、キャンディンでは5名の対象で、キャンディン/「ペプチド」では7名の対象で検出された。IFN−γが2番目に高い頻度で誘導されたサイトカイン(6名の対象)であり、キャンディンでは5名の対象で、キャンディン/「ペプチド」では4名の対象で検出された。また、IL−1βも6名の対象で誘導され、キャンディンでは4名の対象で、キャンディン/「ペプチド」では6名の対象であった。IL−6及びIL−23p19は、キャンディン(IL−6については2名の対象及びIL−23p19については1名の対象)でのみ誘導された。TNF−αは1名の対象でキャンディン/「ペプチド」でのみ発現した。IL−8及びIL−10はいずれの対象でも発現しなかった。
10名の対象のLCをキャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で処理し、8つのサイトカインmRNA発現(表1)をqRT‐PCRによって調べた(図4、表2)。選択した実験ではゲルを精製した後、目的の産物の増幅をDNAシークエンシングによって確認した。全体として、キャンディン及びキャンディン/「ペプチド」で処理したLCのサイトカイン発現分析結果は同じようなものであった。IL−12p40が最も高い頻度で強化されたサイトカイン(未処理のものと比較して>5倍)であり、その発現は、キャンディンでは5名の対象で、キャンディン/「ペプチド」では7名の対象で検出された。IFN−γが2番目に高い頻度で誘導されたサイトカイン(6名の対象)であり、キャンディンでは5名の対象で、キャンディン/「ペプチド」では4名の対象で検出された。また、IL−1βも6名の対象で誘導され、キャンディンでは4名の対象で、キャンディン/「ペプチド」では6名の対象であった。IL−6及びIL−23p19は、キャンディン(IL−6については2名の対象及びIL−23p19については1名の対象)でのみ誘導された。TNF−αは1名の対象でキャンディン/「ペプチド」でのみ発現した。IL−8及びIL−10はいずれの対象でも発現しなかった。
キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で24時間処理したLCからの上澄みを、IL12p70タンパク質の有無について分析した。IL12p70は、キャンディン(38〜177ng/mlの範囲)で処理した30個のサンプルのうち27個で、キャンディン/「ペプチド」(38〜299ng/mlの範囲)で処理した30個のサンプルのうち27個で検出された。
表1 qRT‐PCRに使用したプライマー
*同一プライマーを使用して、2つの遺伝子の間の100%相同領域を増幅してTLR1及び6を分析した。
表2
最も高い頻度で増加した3つのサイトカインに関するqRT‐PCR結果の概要
最も高い頻度で増加した3つのサイトカインに関するqRT‐PCR結果の概要
倍率増加が≧5を示す。
3.4 LCのPRR発現
対象全員の未処理のLCで、調べた11つのPRRがすべて検出可能であった(データ示さず)。キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で刺激した際、発現の増加を示したPRRはほとんどなかった(未処理と比較して>5倍)。キャンディンで処理したLCとキャンディン/「ペプチド」で処理したLCの間にPRRの発現に明らかな違いは観察されなかった。TLR−9の発現は3名の対象において(キャンディンで5〜18倍、キャンディン/「ペプチド」で9〜16倍)、ミンクルの発現は2名の対象において(キャンディン及びキャンディン/「ペプチド」で5倍)、マンノース受容体の発現は2名の対象において(キャンディンで5〜9倍、キャンディン/「ペプチド」で5〜11倍)、デクチン−2の発現は2名の対象において(キャンディンで5〜54倍、キャンディン/「ペプチド」で5〜8倍)、並びにDC−SIGNの発現は1名の対象において(キャンディンで5〜22倍)増加した。PRRの発現が増加した5名の対象では、彼女らのうち3名が、LCの2つ以上のPRRの発現の増加を示した。
対象全員の未処理のLCで、調べた11つのPRRがすべて検出可能であった(データ示さず)。キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で刺激した際、発現の増加を示したPRRはほとんどなかった(未処理と比較して>5倍)。キャンディンで処理したLCとキャンディン/「ペプチド」で処理したLCの間にPRRの発現に明らかな違いは観察されなかった。TLR−9の発現は3名の対象において(キャンディンで5〜18倍、キャンディン/「ペプチド」で9〜16倍)、ミンクルの発現は2名の対象において(キャンディン及びキャンディン/「ペプチド」で5倍)、マンノース受容体の発現は2名の対象において(キャンディンで5〜9倍、キャンディン/「ペプチド」で5〜11倍)、デクチン−2の発現は2名の対象において(キャンディンで5〜54倍、キャンディン/「ペプチド」で5〜8倍)、並びにDC−SIGNの発現は1名の対象において(キャンディンで5〜22倍)増加した。PRRの発現が増加した5名の対象では、彼女らのうち3名が、LCの2つ以上のPRRの発現の増加を示した。
3.5 キャンディンでパルスしたLC又はキャンディン/「ペプチド」でパルスしたLCで刺激したCD4T細胞の細胞内サイトカイン発現
IFN−γ(Th1)、IL−4(Th2)、及びIL−17A(Th17)の細胞内分泌について、10名の対象の、キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で処理したLCで刺激したCD4T細胞を染色した(図5)。対象4では、培地と比較して、キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で処理したLCに曝したCD4T細胞でIFN−γ分泌の増加(>5%)が見られた(それぞれ、9.5%及び6.9%)。全体として、LCのみで処理したCD4T細胞と、キャンディンで処理したLCで処理したCD4T細胞との間でも、LCのみで処理したCD4T細胞と、キャンディン/「ペプチド」で処理したLCで処理したCD4T細胞との間でも、IFN−γ、IL−4、及びIL−17Aの分泌に違いは見られなかった。
IFN−γ(Th1)、IL−4(Th2)、及びIL−17A(Th17)の細胞内分泌について、10名の対象の、キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で処理したLCで刺激したCD4T細胞を染色した(図5)。対象4では、培地と比較して、キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」で処理したLCに曝したCD4T細胞でIFN−γ分泌の増加(>5%)が見られた(それぞれ、9.5%及び6.9%)。全体として、LCのみで処理したCD4T細胞と、キャンディンで処理したLCで処理したCD4T細胞との間でも、LCのみで処理したCD4T細胞と、キャンディン/「ペプチド」で処理したLCで処理したCD4T細胞との間でも、IFN−γ、IL−4、及びIL−17Aの分泌に違いは見られなかった。
4 考察
「アジュバント」はラテン語の単語、adjuvareに由来し、補助すること又は増強することを意味する。効果的なワクチンアジュバントは、サイズ及び耐久性の点からワクチン抗原に対して強い免疫応答を促進できるべきである。抗原提示細胞(APC)を免疫応答の始動に決定的な役割を担う。アジュバントの所望の特徴の1つは、APCの成熟及びその結果としての効果的なT細胞応答のプライミングを増強する能力である。CD40及びCD80は抗原特異的なヘルパーT細胞[31]及び細胞傷害性T細胞[32]の活性化に決定的に重要であることが示されている。我々の結果は、「ペプチド」はCD40及びCD80の有意に高い発現を誘導できることが示す。本HPV治療ワクチンは、アジュバントよりもむしろペプチド抗原がAPCを成熟させることを一層可能にする点で稀なワクチンであるかもしれない。これらの結果は、カンジダ・アルビカンスによる樹状細胞上のCD40、CD80、CD86、及びHLA−DRの上方調節を示したRomagnoliら[33]によって報告されているものとは異なる。エンドトキシンは「ペプチド」で中に検出限界未満であったので、LCに対する予想外の部分的成熟効果に混入が寄与しているということはありそうにない。我々のワクチンは表皮での充分なLCをうまく利用するために皮内経路用に製剤されていたので、我々はLC成熟効果を調べることに重点的に取り組んだ。樹状細胞や単球などの他のAPCに対する成熟効果の研究は将来的に重要であろう。
「アジュバント」はラテン語の単語、adjuvareに由来し、補助すること又は増強することを意味する。効果的なワクチンアジュバントは、サイズ及び耐久性の点からワクチン抗原に対して強い免疫応答を促進できるべきである。抗原提示細胞(APC)を免疫応答の始動に決定的な役割を担う。アジュバントの所望の特徴の1つは、APCの成熟及びその結果としての効果的なT細胞応答のプライミングを増強する能力である。CD40及びCD80は抗原特異的なヘルパーT細胞[31]及び細胞傷害性T細胞[32]の活性化に決定的に重要であることが示されている。我々の結果は、「ペプチド」はCD40及びCD80の有意に高い発現を誘導できることが示す。本HPV治療ワクチンは、アジュバントよりもむしろペプチド抗原がAPCを成熟させることを一層可能にする点で稀なワクチンであるかもしれない。これらの結果は、カンジダ・アルビカンスによる樹状細胞上のCD40、CD80、CD86、及びHLA−DRの上方調節を示したRomagnoliら[33]によって報告されているものとは異なる。エンドトキシンは「ペプチド」で中に検出限界未満であったので、LCに対する予想外の部分的成熟効果に混入が寄与しているということはありそうにない。我々のワクチンは表皮での充分なLCをうまく利用するために皮内経路用に製剤されていたので、我々はLC成熟効果を調べることに重点的に取り組んだ。樹状細胞や単球などの他のAPCに対する成熟効果の研究は将来的に重要であろう。
正常フローラの構成要素としてのカンジダ・アルビカンスは多くの場合、健常人の皮膚及び粘膜表面にコロニーを作る。カンジダ・アルビカンスに対する潜在的獲得免疫は通常、免疫が正常な個人に存在する[34]。この研究では、キャンディン及びキャンディン/「ペプチド」は、顕著なT細胞増殖を誘導したが、「ペプチド」は誘導しなかった。我々の結果と同様に、Gordonら[35]は92%の健康な対象でのカンジダ・アルビカンスに対する皮膚試験陽性反応を示し、Bauerleらは71%の健康な対象でのカンジダ特異的T細胞応答を示した。キャンディンは、細胞性免疫が損なわれていない状態であることを評価するのに臨床で使用され、そこで、本研究で我々がカンジダ・アルビカンスからの抽出物にはT細胞増殖効果があることを見出すことと一致する。しかし、残念ながら、カンジダ・アルビカンスの成熟効果[33]は抽出物では失われる。他方では、「ペプチド」が幾分の成熟効果を発揮することが本研究で見出される。
本ワクチンの創出では、E6タンパク質が疎水性であることは既知のため、直面した障害は「ペプチド」が溶解した製剤の開発を可能にすることにあった。それらは製剤の酸性のpHでは溶存しても残る一方で、中性のpHでは不溶で微粒子を形成する(未発表データ)。この独特の特性は、LCを刺激してこれらの微粒子を貪食することによって成熟効果に寄与しているのかもしれない。
PRRシグナリングは、APCを誘導してTリンパ球の活性化及び分化に必要な共刺激分子及びサイトカインを発現できる[37]。複数のPRRを刺激することによるAPCでのさまざまなPRRの協調は、相乗的なTh1応答[20、38]及び細胞傷害性Tリンパ球応答[39]を導く。カンジダ・アルビカンスは、DC−SIGN[19]、デクチン−1[20]、デクチン−2[21]、ガレクチン−3[22]、マンノース受容体[19]、ミンクル[40]、及び幾つかのTLR[25〜27、41、42]を含む多くのPRRを活性化することが示されている。幾つかのPRRが活性化の間に増加するので[43、44]、我々はこれらのPRRの存在及び発現の増幅を調べた。本研究では、調べたPRRはすべて、キャンディン及びキャンディン/「ペプチド」でパルスしたLCによって発現し、ある特定のPRR(DC−SIGN、デクチン−2、ミンクル、単球受容体、及びTLR−9)の発現の増加が、10名の対象のうち5名で示された。どのPRRが本HPV治療ワクチンからのシグナルの伝達に関与しうるかを決定するのにさらなる研究が必要である。デクチン−1はTLR−2と共に、NF−κΒ[20]を活性化でき、またデクチン−1は独立して樹状細胞でのNFAT活性化を媒介でき、IL−12p70などの炎症性メディエーターの発現を導く[45]。したがって、キャンディン又はキャンディン/「ペプチド」がNF−κΒ及びNFAT活性化で何らかの役割を担うか否かを研究することは将来的に興味深いであろう。
APCによって分泌されるサイトカインは、ヘルパーT細胞をTh1、Th2、又はTh17細胞に分化する過程において重要な役割を果たす。IL−12p70がTh1応答を導く一方で、IL−1β及びIL−6はTh17応答を導く[37、46]。処理したLCのサイトカイン分析結果は、IL−12p40は最も高い頻度で強化されたサイトカインであったことを示し、IL−12p70はタンパク質レベルでも検出された。既報の研究は、カンジダ・アルビカンスが特異的なTh1及びTh17細胞の分化を誘導できること[30、33]、並びにカンジダ特異的Th1免疫応答が健康な対象で検出できること[47、48]を示した。これらのデータから我々はカンジダ・アルビカンスの抽出物であるキャンディンがTh1とTh17の偏り効果(skewing effect)を誘導とすると予想した。Th1応答(IFN−γ分泌>5%)の増加が1名の対象で観察されたが、10名の対象の全体としての結果はTh1応答及びTh17応答への偏りを示さなかった。カンジダは複数のメカニズムを通してTh1及びTh17効果を発揮するかもしれない。皮膚には、抗原提示及びT細胞活性化の過程において役割を担いうる真皮のDCのような他のAPCのサブセットが存在する[49]。さらに、本HPV治療ワクチンがHPV特異的T細胞応答を誘導する能力を評価することが重要であろう。そのことは現在進行中の治験の状況で調べられている。
まとめると、「ペプチド」(抗原)がLC成熟効果に関与している一方で、キャンディン(アジュバント)が本HPV治療ワクチンに対する顕著なT細胞増殖を誘導する。したがって、抗原及びアジュバントは相補的な免疫増強効果がある。やがて、現在進行中の治験から、これらの相補的な効果が効果的な臨床反応につながるか否かが明らかにされるであろう。
実施例2の参考文献
実施例3 生検によって診断された高度扁平上皮内病変をもつ女性におけるE6 ペプチド及びキャンディンを含有するHPV治療ワクチンの第I相治験
生検によって診断された高度扁平上皮内(HSIL)をもつ女性におけるE6ペプチド及びキャンディンを含有するHPV治療ワクチンの単一群、非盲験、投与量漸増第I相治験を行う。ワクチンはHPVペプチド及びキャンディンの混合物で構成される。ペプチドは、10mMグルタミン酸(塩)、1.0%(重量/体積)トレハロース、2.0%(重量/体積)グリシン、及び0.714mg/mlの各々の4つのHPV16 E6ペプチド(配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、及び116〜158から成り、各々、そのカルボキシ末端がアミド化され、そのアミノ末端がアセチル化されている)を含有する薬剤溶液(pharmaceutical solution)Aにある。薬剤溶液Aを50ug、100ug、250ug、又は500ug(70〜700ulの溶液A)の量で注射器に吸い取り、注射器内で300ulのキャンディンと混ぜる。次いで、子宮頸部病変を有するHPV陽性患者に注射器内の混合物を皮内注射する。
生検によって診断された高度扁平上皮内(HSIL)をもつ女性におけるE6ペプチド及びキャンディンを含有するHPV治療ワクチンの単一群、非盲験、投与量漸増第I相治験を行う。ワクチンはHPVペプチド及びキャンディンの混合物で構成される。ペプチドは、10mMグルタミン酸(塩)、1.0%(重量/体積)トレハロース、2.0%(重量/体積)グリシン、及び0.714mg/mlの各々の4つのHPV16 E6ペプチド(配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、及び116〜158から成り、各々、そのカルボキシ末端がアミド化され、そのアミノ末端がアセチル化されている)を含有する薬剤溶液(pharmaceutical solution)Aにある。薬剤溶液Aを50ug、100ug、250ug、又は500ug(70〜700ulの溶液A)の量で注射器に吸い取り、注射器内で300ulのキャンディンと混ぜる。次いで、子宮頸部病変を有するHPV陽性患者に注射器内の混合物を皮内注射する。
ワクチンを受ける者は、未治療の生検によって診断されたHSILをもつ女性である。4回のワクチン注射(3週間に1回)は上肢に皮内投与される。2回目の注射及び4回目の注射の前後に、(CD4及びCD8応答を評価するための)CD3 ELISPOT及び免疫抑制細胞分析のために血液を採取する。臨床反応は4回目の注射後にLEEP切除を行うことによって評価する。4回目の注射前後にHPV−DNA検査を行う(図6)。対象は各々、4回の接種すべて単回投与レベルを受ける。最初のコホートの6名の対象は50ug投与量を受け、そのコホートが完了すると、次の対象は次のより高い投与量レベルを受ける(詳くは下記及び図7)。全投与量を試験した後(用量制限毒性は見られないと仮定)、最大耐量(MTD)、免疫学的至適投与量(IOD)、及び臨床的至適投与量(COD)を決定する。さらなる30名の対象を最終投与量でワクチン接種する(下記参照)。
最初の6名の対象は各々、用量制限毒性が2名以上のワクチン接種者で見られない限り、各ペプチドの最低投与量(50ug)を受ける。各投与量レベルでは最初の2名の対象は、FDAの推奨により少なくとも1週間ずらす。図7に示されるように、最大耐量に達するか、試験が完了するまで投与量レベルを上げる。30名のさらなる対象は、臨床反応のさらなる評価のための最終投与量でワクチン接種を受ける。
シンプレップ試料を、製造業者の取扱説明書に従って、「リニアアレイ HPVジェノタイピングテスト」(ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス社、カリフォルニア州アラメダ)を用いて37のHPV遺伝子型について検査する。検査するHPV型としては、6型、11型、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、40型、42型、45型、51型、52型、53型、54型、55型、56型、58型、59型、61型、62型、64型、66型、67型、68型、69型、70型、71型、72型、73型、81型、82型、83型、84型、IS39型、及びCP6108型が挙げられる。ヒトベータ−グロビンシグナルを、各試料のDNA含有量の試料妥当性のための陽性対照としてアッセイした。陽性対照試料(HPVプラスミドDNA及びプラスミドにコードされたヒトベータ−グロビン遺伝子を加えて含む)並びに陰性対照試料(HPVプラスミドDNAもヒトベータ−グロビン遺伝子も無し)が製造業者によって供給され、各実験に含まれる。
各回の採血後に、PBMCをCD14+とCD14−集団に分け、凍結保存する。アッセイ間のばらつきをなくすために、3つの血液試料(ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後)をすべて使用してT細胞株を確立し、ELISPOTアッセイを行う。インビトロで磁気的に選択したCD3細胞を、HPV16 E6−vac、E7−vac、E6−GST、及びE7−GSTに曝した自己由来の成熟樹状細胞で刺激することによってCD3T細胞株を確立する。記載のようにELISPOTアッセイを行う(1)。HPV16 E6及びE7タンパク質の16領域(E6 1〜25、E6 16〜40、E6 31〜55、E6 46〜70、E6 61〜85、E6 76〜100、E6 91〜115、E6 106〜130、E6 121〜145、E6 136〜158、E7 1〜25、E7 16〜40、E7 31〜55、E7 46〜70、E7 61〜85、及びE7 76〜98)を調べる。アッセイは3連で行う。ワクチン接種前と2回の接種後又は4回の接種後の各領域を比較するために、前述のように、対応のある標本のt検定を行う(2)。したがって、2回の接種後又は4回の接種後のT細胞応答の統計的に有意な増加をもつ領域の数の点から各対象を評価する。
循環Treg細胞及び骨髄由来抑制細胞(MDSC)の測定には、各回採血の少量のPBMC(2×106個の細胞)を使用し、循環Treg及びMDSCのレベルをモニターしてワクチン接種がそれらを不注意に刺激するか否かを評価する(3)。CD4+CD25+フォークヘッドボックス(FOX)P3+細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA−4)+細胞の数を、抗ヒトFoxP3染色キット(アロフィコシアニン、イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ)、CDLA−4ペリジニン−クロロフィル−タンパク質複合体(BD PharMingen社、カリフォルニア州サンノゼ)、CD25フィコエリスリン、及びCD4フルオレセインイソチオシアネート(BDバイオサイエンス(BD Biosciences)、カリフォルニア州サンノゼ)を用いてフローサイトメトリーで決定する(4)。細胞はフローサイトメトリー(XL−MCL、ベックマン・コールター社、カリフォルニア州フラトン)によって分析する。ワクチン接種前、2回の接種後、及び4回の接種後の循環Treg細胞の割合(% CD4+CD25+FoxP3+CTLA−4+/総CD4+)を求める。その割合が接種前と比べて、2回の接種後又は4回の接種後、少なくとも2倍の大きい場合、Treg細胞は増加したときなされる。MDSCを数えるには、PBMCをCD14及びHLA−DR抗体で染色し、CD14+HLA−DR−/lowの%割合を評価する(5)。LEEP検査試料の代表的な断面をFOXP3(ウサギポリクローナル、アブカム社、マサチューセッツ州ケンブリッジ)を用いる免疫組織化学的染色に使用して子宮頸部Tregの数を数える(6)。FOXP3+細胞の密度は、画像解析ソフトウェアを用いて決定し、核染色をもつ細胞のみを数える。
結果
募集 今日まで、44名の対象が登録しており、そのうち27名が生検によって診断されたHSILをもち、少なくとも1回のワクチン接種をうけている(最大で27名のさらなる対象が4/12/15より前にワクチン接種可能)。
募集 今日まで、44名の対象が登録しており、そのうち27名が生検によって診断されたHSILをもち、少なくとも1回のワクチン接種をうけている(最大で27名のさらなる対象が4/12/15より前にワクチン接種可能)。
安全性 99回の注射が27名の対象になされた。>グレード2のワクチン関連有害事象(AE)は報告されていない(表3)。(表3中の2つのグレード3の事象はワクチン関連ではなかった。)
グレード4の事象は全く報告されていない。
グレード4の事象は全く報告されていない。
表3
aワクチン接種の時間から<24時間で出現する;bワクチン接種の時間から>24時間で出現する;c>38.0度の体温の所見なしに熱感がある
最もよく見られた有害事象(AE)は、即時注射部位反応及び遅延注射部位反応(注射部位のびまん性軽度紅班)であった。
インビトロでの研究は予想外にも、HPV16 E6タンパク質を対象とする4つの現行医薬品適正製造基準ペプチドが、CD40(p=0.00007)及びCD80(p<0.00001)レベルの上方制御で判断されるランゲルハンス細胞(LC)の成熟効果をもつことを明らかにした[30]。これらの成熟効果は、中性pHでのペプチドによって(製剤の酸性pHで溶解している)微粒子が形成されることによるものである可能性が高い。不溶性微粒子はLCによって貪食される可能性が高く、結果としてその活性化及び抗原提示をもたらすので、第I相治験の間に見られた即時注射部位反応及び遅延注射部位反応は、これらの微粒子によるものでありうる。
直径が約1〜3ミクロンの微粒子は、酸性pHで溶解したペプチドが中性pHのバッファーと混ぜられた場合に形成する。ペプチドが中性pHのバッファーに加える前にカンジダ抽出物と混ぜられたか否かにかかわらず微粒子は形成する。
臨床反応15名のワクチン接種者(平均年齢、33.4±6.5歳)からの結果を用いることができる。完全HSIL退縮が、50ug投与量群では6名の対象のうち4名(67%)、100ug投与量群では6名の対象のうち3名(50%)、250ug投与量群では3名の対象のうち0名に起こった。部分的な退縮は試験参加終了時に残っている<0.2mm2のHSIL病変として定義され、50ug投与量群では1名に、250ug投与量群ではもう1名にが見られた。
組織学的な全奏効率は60%(15名のうち9名)であった。これは、22%〜28%の範囲の歴史的プラシーボ群の退縮率より高い。5名のベースラインでHPV16をもつ対象のうち2名(40%)で退縮があり、10名の16型以外のHPVをもつ対象うち7名(70%)で退縮があった。扁平上皮癌に進行した者はいなかった。
ウイルス排除 少なくとも1つのHPV型が15名の対象のうち9名(60%)で検出できなくなった。これらの9名の対象のうち7名(78%)が臨床反応を示した。
免疫応答 ワクチンによって誘導されたCD3T細胞のE6への応答(陽性指数≧2)は、13名の対象のうち10名(77%)で検出され、増加は6名の対象で統計的に有意であった(46%)(図8)。
ワクチン接種後に、末梢のTh1細胞、Treg、及び骨髄由来抑制細胞の%割合は変化せず、CD4(p=0.02)及びTh2細胞の%割合は減少した(図9)。
上皮(1mm2当たり127.4±174.9対1mm2当たり119.1±115.6)及び上皮下間質(1mm2当たり351.9±355対1mm2当たり380.4±152)において、非レスポンダー(non−responders)(n=7)の病変でのFoxP3陽性Tregの数には、レスポンダー(responders)(n=7)の病変(CIN1又は代表的な正常領域)と比較して違いが測定されなかった。
実施例3の参考文献
実施例4 第II相治験
HPV治療ワクチンの必要性
過去数十年、数多くの前臨床治験及び治験が予防的HPVワクチンを評価してきたが、これらのワクチンは、すでに罹患しているHPV感染者には役立たない[51]。ガーダシル、四価HPV L1ウイルス様粒子ワクチン(HPV16型、18型、6型、及び11型)は最初のものであり、2006年にFDA認可され、その3年後に、二価バージョン(HPV16型及び18型)のサーバリックスがFDAに認可された。治験ではHPV16型陰性又はHPV18型陰性の女性での優れたワクチン有効性が示されているが[52、53]、防御期間はまだ明らかにされていない。また、二価ワクチンの試験では既存のHPV感染症をもつ女性においてウイルス排除を高めることの証拠は示されていない(n=1,259;排除はワクチン接種群では35.5%、陰性対照ワクチン接種群では31.5%、p=NS)[51]。したがって、治療ワクチンが、HPV感染症にすでに罹患している症例及びHPV関連疾患がすでに発症している症例に必要とされる。このことは特に当てはまる。というのは、ターゲット群(年齢が13〜17歳の少女)の予防ワクチン接種率は全国的にわずか32%であることが報告されているからである[54]。LEEPなどのHSILに対する標準的な外科的治療は非常に効果的である[14]が、早産の発生率が4.4%から8.9%に増加する意図せぬ副作用[14、15]が懸念されてきた。以降、最新のガイドラインは、若い女性(狭義には≦24歳、広義には今後妊娠を計画しているいずれの女性[14])ではCIN2に対して治療することをもはや推奨していない。CIN3に対して依然として治療が推奨されるが、現在、経過観察が許容可能と考えられている。HPV治療ワクチンのような子宮頸部の解剖学的に完全な状態を変えない新たな治療が本当に必要である。要するに、以下のことからHPV治療ワクチンは必要である。(1)予防ワクチンはすでに罹患したHPV感染症に対して効果的ではない、(2)予防ワクチンの利用が少ない、(3)治療ワクチンは子宮頸部を完全な状態のままに残すと思われ、早産のリスクを増加させそうにない、(4)治療ワクチンは、肛門がん、咽頭口腔がん、陰茎がん、膣がん、及び外陰部がんなどのHPVによって引き起こされる他のがんに対して効果的でありうる。
HPV治療ワクチンの必要性
過去数十年、数多くの前臨床治験及び治験が予防的HPVワクチンを評価してきたが、これらのワクチンは、すでに罹患しているHPV感染者には役立たない[51]。ガーダシル、四価HPV L1ウイルス様粒子ワクチン(HPV16型、18型、6型、及び11型)は最初のものであり、2006年にFDA認可され、その3年後に、二価バージョン(HPV16型及び18型)のサーバリックスがFDAに認可された。治験ではHPV16型陰性又はHPV18型陰性の女性での優れたワクチン有効性が示されているが[52、53]、防御期間はまだ明らかにされていない。また、二価ワクチンの試験では既存のHPV感染症をもつ女性においてウイルス排除を高めることの証拠は示されていない(n=1,259;排除はワクチン接種群では35.5%、陰性対照ワクチン接種群では31.5%、p=NS)[51]。したがって、治療ワクチンが、HPV感染症にすでに罹患している症例及びHPV関連疾患がすでに発症している症例に必要とされる。このことは特に当てはまる。というのは、ターゲット群(年齢が13〜17歳の少女)の予防ワクチン接種率は全国的にわずか32%であることが報告されているからである[54]。LEEPなどのHSILに対する標準的な外科的治療は非常に効果的である[14]が、早産の発生率が4.4%から8.9%に増加する意図せぬ副作用[14、15]が懸念されてきた。以降、最新のガイドラインは、若い女性(狭義には≦24歳、広義には今後妊娠を計画しているいずれの女性[14])ではCIN2に対して治療することをもはや推奨していない。CIN3に対して依然として治療が推奨されるが、現在、経過観察が許容可能と考えられている。HPV治療ワクチンのような子宮頸部の解剖学的に完全な状態を変えない新たな治療が本当に必要である。要するに、以下のことからHPV治療ワクチンは必要である。(1)予防ワクチンはすでに罹患したHPV感染症に対して効果的ではない、(2)予防ワクチンの利用が少ない、(3)治療ワクチンは子宮頸部を完全な状態のままに残すと思われ、早産のリスクを増加させそうにない、(4)治療ワクチンは、肛門がん、咽頭口腔がん、陰茎がん、膣がん、及び外陰部がんなどのHPVによって引き起こされる他のがんに対して効果的でありうる。
1.5.2 提案したHPVペプチド投与量に関する理論的根拠
第I相治験では、4つの投与量レベル(ペプチド当たり50、100、250、及び500ug)を試験した。最も高い臨床反応を伴う投与量レベルを選択して第II相治験で用いることになる。今のところ、ペプチド当たり100ug(50%の完全奏効)と比較して、ペプチド当たり50ugの投与量のほうが、奏効率(67%の完全奏効及び17%の部分奏効)が高い。
第I相治験では、4つの投与量レベル(ペプチド当たり50、100、250、及び500ug)を試験した。最も高い臨床反応を伴う投与量レベルを選択して第II相治験で用いることになる。今のところ、ペプチド当たり100ug(50%の完全奏効)と比較して、ペプチド当たり50ugの投与量のほうが、奏効率(67%の完全奏効及び17%の部分奏効)が高い。
初期の4つの投与量レベルは、文献で入手可能な情報に基づいて選んだ。さまざまなペプチドワクチンを用いた治験の既報の研究は、ペプチド当たり5〜3,000ugの範囲の投与量を用いることを報告した[31〜38]。免疫原性を達成するための最適投与量(及び2つの投与量レベルが同じ場合は少ない方の投与量)はワクチン間で大きく異なった:96−merマラリアペプチドの30ug[31]、前立腺がん治療用9−merペプチドの500ug[34]、長さが25〜35個のアミノ酸の範囲の13の型のHPV16 E6及びE7ペプチドの各々の50ug[35]。したがって、最適な免疫原性を生じさせそうな投与量レベルが選ばれた。
最高率の組織学的な退縮によって決定された第I相試験で試験した4つの投与量(50、100、250、及び500ug/ペプチド/注射)からの臨床的に最適な投与量は、第II相治験の投与量として使用されることになる。
1.5.3 提案したキャンディン(登録商標)投与量に関する理論的根拠
300μlのキャンディン(登録商標)が注射1回当たり投与されることになる。その量は、疣贅の病巣内注射に使用された量[47、55]であり、第I相治験でワクチンアジュバントとして使用されたキャンディンの量である。この量は安全かつ効果的であることが示されているので、同じ量が第II相治験に使用されることになる。
300μlのキャンディン(登録商標)が注射1回当たり投与されることになる。その量は、疣贅の病巣内注射に使用された量[47、55]であり、第I相治験でワクチンアジュバントとして使用されたキャンディンの量である。この量は安全かつ効果的であることが示されているので、同じ量が第II相治験に使用されることになる。
1.5.4 提案注射経路に関する理論的根拠
抗原提示細胞としてLCを利用するために内皮経路が使用されることになる。この経路もまた、安全で、効果的で、免疫原性であることが第I相治験で示されており、第II相治験に使用されることになる。
抗原提示細胞としてLCを利用するために内皮経路が使用されることになる。この経路もまた、安全で、効果的で、免疫原性であることが第I相治験で示されており、第II相治験に使用されることになる。
1.5.5 提案注射部位に関する理論的根拠
使用し易いこと、及びこれらの部位から送達したHPVペプチドの有効性を示す十分なデータが入手可能であることから、四肢が投与の部位として選ばれている[35、56]。肢への注射は、安全で、効果的で、免疫原性であることが第I相治験で示されており、第II相治験での注射に使用されることになる。
使用し易いこと、及びこれらの部位から送達したHPVペプチドの有効性を示す十分なデータが入手可能であることから、四肢が投与の部位として選ばれている[35、56]。肢への注射は、安全で、効果的で、免疫原性であることが第I相治験で示されており、第II相治験での注射に使用されることになる。
1.5.7 注射間隔に関する理論的根拠
既報の研究では注射間隔は2週間〜90日の範囲に及ぶが[31〜38]、大部分は3週間の間隔を用いた。Kenterと同僚は、血液試料が最後のワクチン接種の7日後に採血された場合、IFN−γ ELISPOTアッセイで測定したペプチドワクチン免疫原性が認められることが少なかったが、血液試料が最後のワクチン接種の3週間後に採血された場合、該免疫原性は高かったことを報告した[35]。したがって、免疫応答が充分に高まるのに十分長いと思われるので、我々は3週(±7日)の間隔を選んだ。この間隔は、安全で、効果的で、免疫原性であることが示されており、同じ間隔が第II相治験に使用されることになる。
既報の研究では注射間隔は2週間〜90日の範囲に及ぶが[31〜38]、大部分は3週間の間隔を用いた。Kenterと同僚は、血液試料が最後のワクチン接種の7日後に採血された場合、IFN−γ ELISPOTアッセイで測定したペプチドワクチン免疫原性が認められることが少なかったが、血液試料が最後のワクチン接種の3週間後に採血された場合、該免疫原性は高かったことを報告した[35]。したがって、免疫応答が充分に高まるのに十分長いと思われるので、我々は3週(±7日)の間隔を選んだ。この間隔は、安全で、効果的で、免疫原性であることが示されており、同じ間隔が第II相治験に使用されることになる。
1.5.8 最後の注射と最終組織学的な評価との間隔に関する理論的根拠
組織学的な反応を第I相治験でLEEPを行なうことによって最後のワクチン接種の3か月後に評価したが、完全な効果は1年かかることが知られている[17〜19]。第II相治験では、PepCanがLEEPの代わりとして投与されることになり、最後の注射の12か月後にコルポスコピー誘導下生検を得ることによって、組織学的な反応を評価することになる(図10)。同様のペプチドに基づくHPV治療ワクチンを使用して高度外陰上皮内病変を治療した治験では、組織学的な退縮が、ワクチン接種後3か月〜12か月の間に25%〜47%増加した[18]。
組織学的な反応を第I相治験でLEEPを行なうことによって最後のワクチン接種の3か月後に評価したが、完全な効果は1年かかることが知られている[17〜19]。第II相治験では、PepCanがLEEPの代わりとして投与されることになり、最後の注射の12か月後にコルポスコピー誘導下生検を得ることによって、組織学的な反応を評価することになる(図10)。同様のペプチドに基づくHPV治療ワクチンを使用して高度外陰上皮内病変を治療した治験では、組織学的な退縮が、ワクチン接種後3か月〜12か月の間に25%〜47%増加した[18]。
1.5.9 主要評価項目:有効性に関する理論的根拠
ワクチン有効性を評価する臨床反応は、パンチ生検結果をスクリーニング来院(HSIL罹患でワクチン接種に適格とされる)と12か月来院(±2週間)との間で比較することによって評価することになる(図8)。有効性を評価するのにLEEPを行わないことになるが、12か月来院時に、HSILが持続する対象に無料で提供されることになる。
ワクチン有効性を評価する臨床反応は、パンチ生検結果をスクリーニング来院(HSIL罹患でワクチン接種に適格とされる)と12か月来院(±2週間)との間で比較することによって評価することになる(図8)。有効性を評価するのにLEEPを行わないことになるが、12か月来院時に、HSILが持続する対象に無料で提供されることになる。
提案した第II相治験のデザインは、非盲験、単一施設、及び単一群である。我々は、比較ために、類似したデザインの治験からの歴史的プラシーボ群(すなわち、生検によって診断されたCIN2/3をもつ対象の登録及び15か月で生検によって評価される臨床反応)を用いることを計画している[57]。我々の第I相治験で試験した最初2つの投与量レベルのうち、50ug投与量が最良の臨床反応(6名のうち4名、又は67%の完全奏効)を示した。歴史的対照群の117名のうち34名(29%)が退縮を示したので、ワクチン群の20名の対象数は90%検出力(α=0.05、すそ=2)をもたせることになると思われる。しかし、67%の臨床奏効率は少数の対象に基にしたものである。我々が控えめに奏効率は55%であると見積もった場合、53名の対象数が必要とされることになると思われる(90%検出力、α=0.05、すそ=2)。潜在的なスクリーニングの失敗及び試験中止率を考慮して、我々は第II相治験に110名の対象をスクリーニングし、70名の対象のワクチン接種する計画である。歴史的プラシーボ群の使用は同時プラシーボ群を用いるほど厳密でない一方で、12か月間未治療のままであることになると思われる生検によって診断されたCIN2/3をもつ同時プラシーボ群は倫理的に正当化し難いと思われる。
1.5.10 副次評価項目:安全性に関する理論的根拠
HPVペプチドとキャンディン(登録商標)の混合物は、第I相治験で最初に試験され、>グレード2のワクチン関連AEは報告されたことがないので安全と思われる(表2)。第II相治験では、CTCAE4.03を用いて安全性を同様に評価することになる。
HPVペプチドとキャンディン(登録商標)の混合物は、第I相治験で最初に試験され、>グレード2のワクチン関連AEは報告されたことがないので安全と思われる(表2)。第II相治験では、CTCAE4.03を用いて安全性を同様に評価することになる。
1.5.11 三次評価項目:免疫応答及びウイルス排除に関する理論的根拠
1.5.11.1 HPV特異的T細胞応答の測定に関する理論的根拠
HPV特異的CD3T細胞応答は、第I相治験で行われたように、ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後に、IFN−γ ELISPOTアッセイなどの免疫アッセイを用いて評価することになる(図8)。ワクチン有効性でのCD3T細胞に役割を評価するために、臨床反応及びウイルス排除がCD3T細胞活性に基づいて予測できるか否かが評価されることになる。
1.5.11.1 HPV特異的T細胞応答の測定に関する理論的根拠
HPV特異的CD3T細胞応答は、第I相治験で行われたように、ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後に、IFN−γ ELISPOTアッセイなどの免疫アッセイを用いて評価することになる(図8)。ワクチン有効性でのCD3T細胞に役割を評価するために、臨床反応及びウイルス排除がCD3T細胞活性に基づいて予測できるか否かが評価されることになる。
1.5.11.2 循環免疫細胞の測定に関する理論的根拠
CD4T細胞、Th1細胞、Th2細胞、制御性T細胞(Treg)、及び骨髄由来抑制細胞(MDSC)を含む循環免疫細胞のレベルを、ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後に評価することになる。第I相治験からの予備データは、PepCanがTh2応答を減少させ、結果としてエフェクター免疫活性の増加をもたらしうることを示す(図9)。これらの循環免疫細胞のレベルを用いて、臨床反応及びウイルス排除の点でワクチン有効性を予想できるか否かを調べることになる。
CD4T細胞、Th1細胞、Th2細胞、制御性T細胞(Treg)、及び骨髄由来抑制細胞(MDSC)を含む循環免疫細胞のレベルを、ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後に評価することになる。第I相治験からの予備データは、PepCanがTh2応答を減少させ、結果としてエフェクター免疫活性の増加をもたらしうることを示す(図9)。これらの循環免疫細胞のレベルを用いて、臨床反応及びウイルス排除の点でワクチン有効性を予想できるか否かを調べることになる。
1.5.11.3 ウイルス排除の測定に関する理論的根拠
HPV−DNA検査は、スクリーニング来院、6か月来院、及び12か月来院時に行うことになる(図10)。これまで、試験参加者全員はスクリーニング来院時に少なくとも1つの型のHPVをもつ。少なくとも1つの型のHPVの排除が、臨床反応と相関すると思われる。第II相試験では、スクリーニング来院時に存在するが、6か月来院及び12か月来院時には存在しない場合に、HPVの型は排除されたとみなされることになるであろう。
HPV−DNA検査は、スクリーニング来院、6か月来院、及び12か月来院時に行うことになる(図10)。これまで、試験参加者全員はスクリーニング来院時に少なくとも1つの型のHPVをもつ。少なくとも1つの型のHPVの排除が、臨床反応と相関すると思われる。第II相試験では、スクリーニング来院時に存在するが、6か月来院及び12か月来院時には存在しない場合に、HPVの型は排除されたとみなされることになるであろう。
1.5.12 他の評価項目に関する理論的根拠:年齢、HLAタイプ、HPV型、プロテオミクス分析結果、サイトカイン/ケモカイン分析結果、及び臨床検査などの様々な因子を用いてワクチン反応を予想する;交差防御を見つけ出し、考えられるメカニズムとしてエピトープ拡大及び交差反応を検討する
ワクチン接種者全員に臨床反応があるとは期待されない。HSILが持続する者がいることもあり、浸潤性扁平上皮癌に進行する者がいることもある。好ましい反応と関連する因子を特定することは価値があると思われ、その結果として、誰がワクチンに反応するはずでるか、外科的治療をすることを決める前にどのくらい待つべきかに関して知識に基づく判断ができる。したがって、システム生物学的なアプローチを採用して、臨床反応及びウイルス排除に関連する因子は決定されうる。
ワクチン接種者全員に臨床反応があるとは期待されない。HSILが持続する者がいることもあり、浸潤性扁平上皮癌に進行する者がいることもある。好ましい反応と関連する因子を特定することは価値があると思われ、その結果として、誰がワクチンに反応するはずでるか、外科的治療をすることを決める前にどのくらい待つべきかに関して知識に基づく判断ができる。したがって、システム生物学的なアプローチを採用して、臨床反応及びウイルス排除に関連する因子は決定されうる。
第I相治験は、PepCanがHPV16型及び16型ではないHPV型をもつHSILに効果的であることを示している。第II相治験では、16型ではないHPVのどの型に対してPepCanが効果的であるかが決定されうる。さらに、エピトープ拡大及び交差反応は、交差防御の裏の可能なメカニズムとして調べられうる。
2 目的
主要目的:有効性 2.1
コルポスコピー誘導下生検を12か月来院時に得ることによって評価されることになる臨床反応を決定することによって第II相治験でのPepCanの有効性を評価すること。12か月来院生検の際に、対象にCIN 2/3のいずれの兆候がない場合、彼女は「レスポンダー(responder)」とみなされることになる。CIN1に退縮する者もいると思われ、異形成がない者もいることもある。12か月来院時に依然としてCIN2及び/又は3がある場合、その対象は「非レスポンダー(non-responder)」とみなされることになる。副次的目的:安全性 2.2
主要目的:有効性 2.1
コルポスコピー誘導下生検を12か月来院時に得ることによって評価されることになる臨床反応を決定することによって第II相治験でのPepCanの有効性を評価すること。12か月来院生検の際に、対象にCIN 2/3のいずれの兆候がない場合、彼女は「レスポンダー(responder)」とみなされることになる。CIN1に退縮する者もいると思われ、異形成がない者もいることもある。12か月来院時に依然としてCIN2及び/又は3がある場合、その対象は「非レスポンダー(non-responder)」とみなされることになる。副次的目的:安全性 2.2
安全性は、登録時から12か月来院までCTCAE v4.03に従ってAEを記録することによって評価することになる。
三次的目的:免疫応答及びウイルス排除 2.3
ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後、HPV特異的CD3T細胞応答の点からの免疫学的評価をIFN−γ ELISPOTアッセイを用いて評価することになり、一方で、CD4、Th1、Th2、Treg、及びMDSC細胞の循環レベルをFACS分析によって評価することになる。ウイルス学的評価は、スクリーニング来院、6か月来院、及び12か月来院時に行なわれことになる。
ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後、HPV特異的CD3T細胞応答の点からの免疫学的評価をIFN−γ ELISPOTアッセイを用いて評価することになり、一方で、CD4、Th1、Th2、Treg、及びMDSC細胞の循環レベルをFACS分析によって評価することになる。ウイルス学的評価は、スクリーニング来院、6か月来院、及び12か月来院時に行なわれことになる。
他の目的 2.4
(どの特定の集団の女性がワクチンを受けるべきかや、外科的治療のタイミングを決定するために)ワクチンに対する反応に関する予測因子を評価するために、年齢、HLAタイプ、HPV型、プロテオミクス分析結果、サイトカイン/ケモカイン分析結果、臨床検査結果、予防HPVワクチン接種、喫煙、経口避妊薬の使用、パップスメアの結果、CINグレード(CIN2対CIN3)、初期バイタルサイン、ボディマス指数、HPV16 E6に対するCD3T細胞応答、及び循環免疫細胞などのさまざまなパラメーターが解析されうる。
(どの特定の集団の女性がワクチンを受けるべきかや、外科的治療のタイミングを決定するために)ワクチンに対する反応に関する予測因子を評価するために、年齢、HLAタイプ、HPV型、プロテオミクス分析結果、サイトカイン/ケモカイン分析結果、臨床検査結果、予防HPVワクチン接種、喫煙、経口避妊薬の使用、パップスメアの結果、CINグレード(CIN2対CIN3)、初期バイタルサイン、ボディマス指数、HPV16 E6に対するCD3T細胞応答、及び循環免疫細胞などのさまざまなパラメーターが解析されうる。
臨床反応の点からの交差防御は、試験した36のHPV型(16型以外)の各々についてHSIL退縮を示す対象でワクチン接種前に検出される各HPV事象を数えることによって決定されうる。
ウイルス排除の点からの交差防御は、試験した36のHPV型の各々についてスクリーニング来院時には存在するが、6か月来院及び12か月来院時の両方では検出不能になる各HPV事象を数え上げることによって決定されうる。
エピトープ拡大及び交差反応は選択され対象で調べられうる。
3 治験薬
被験物質 3.1
3.1.1 HPVペプチド
PepCanは、4つのHPV16 E6ペプチド、つまりE6 1〜45(Ac−MHQKRTAMFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL−NH2(配列番号2))、E6 46〜80(Ac−RREVYDFAFRDLCIV YRDGN PYA VCDKCLKFYSKI−NH2(配列番号3))、E6 81〜115(Ac−SEYRHYCYSLYGTTLEQQYNK PLCDLLIRCINCQK−NH2(配列番号4))、及びE6 116〜158(Ac−PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWT GRCMSCCRSSRTRRETQL−NH2(配列番号5))を含有することになる(米国特許第8,652,482号)。商業的に生産された現行医薬品適正製造基準(cGMP)グレードペプチド(CPC サイエンティフィック社、カリフォルニア州サンノゼ)が試験されることになる。
被験物質 3.1
3.1.1 HPVペプチド
PepCanは、4つのHPV16 E6ペプチド、つまりE6 1〜45(Ac−MHQKRTAMFQDPQER PRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL−NH2(配列番号2))、E6 46〜80(Ac−RREVYDFAFRDLCIV YRDGN PYA VCDKCLKFYSKI−NH2(配列番号3))、E6 81〜115(Ac−SEYRHYCYSLYGTTLEQQYNK PLCDLLIRCINCQK−NH2(配列番号4))、及びE6 116〜158(Ac−PLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWT GRCMSCCRSSRTRRETQL−NH2(配列番号5))を含有することになる(米国特許第8,652,482号)。商業的に生産された現行医薬品適正製造基準(cGMP)グレードペプチド(CPC サイエンティフィック社、カリフォルニア州サンノゼ)が試験されることになる。
4つのペプチドが個々のバイアルに凍結乾燥形態で提供されることになり、輸送中及び使用直前を除いて、−70℃(許容可能な範囲は−65℃〜−75℃)で保存されることになる。
3.1.2 キャンディン(登録商標)
細胞性過敏症用カンジダ・アルビカンス皮膚試験抗原は、市販薬キャンディン(登録商標)に供給されることになる。バイアルは使用するまで添付文書の指示の通り2℃〜8℃で保存されることになる。この製品は複数回投与に認可されている。本試験の注射1回当たりのキャンディン(登録商標)の投与量は0.3mlである。
細胞性過敏症用カンジダ・アルビカンス皮膚試験抗原は、市販薬キャンディン(登録商標)に供給されることになる。バイアルは使用するまで添付文書の指示の通り2℃〜8℃で保存されることになる。この製品は複数回投与に認可されている。本試験の注射1回当たりのキャンディン(登録商標)の投与量は0.3mlである。
3.1.3 HPVペプチドとキャンディン(登録商標)の混合
滅菌水を、4つの現行医薬品適正製造基準ペプチドを含有するバイアルに加えることになる。再溶解したペプチドの適量を投与量レベルに応じて注射器に吸い取り、0.3mlのキャンディン(登録商標)を同じ注射器に吸い取ることになる。混合したペプチド−キャンディン(登録商標)混合物は、注射直前まで氷上又は冷蔵庫内に保存すべきである。
滅菌水を、4つの現行医薬品適正製造基準ペプチドを含有するバイアルに加えることになる。再溶解したペプチドの適量を投与量レベルに応じて注射器に吸い取り、0.3mlのキャンディン(登録商標)を同じ注射器に吸い取ることになる。混合したペプチド−キャンディン(登録商標)混合物は、注射直前まで氷上又は冷蔵庫内に保存すべきである。
治療レジメン 3.2
対象は PepCan(50〜500μg/ペプチド/注射)の注射を4回、皮内注射で四肢に各注射の間隔を3週間とって受けることになる。
対象は PepCan(50〜500μg/ペプチド/注射)の注射を4回、皮内注射で四肢に各注射の間隔を3週間とって受けることになる。
4 試験デザイン
概要 4.1
本試験は、生検によって診断されたHSILをもつ女性を治療するためのPepCanの単一群、非盲験、第II相治験である。試験デザインはHSILをもつ若い女性を治療するための最新のガイドラインによく似ている[14]。試験参加者は、UAMS産婦人科クリニックに通う、未治療の、生検によって診断されたHSILをもつ患者及び他のクリニックから紹介される患者であることになる。4回のワクチン注射(3週間に1回)は、四肢に皮内投与されることになる。臨床反応は、ワクチン接種前と12か月来院時に得られるコルポスコピー誘導下生検結果を比較することによって評価されることになる。安全性は、登録から12か月来院まで通してモニターされることになる。臨床検査及び免疫学的分析のために、接種前並びに2回目及び4回目ワクチン接種後に血液を採取することになる(「血液検査」)。T細胞分析を補助するために、1回目及び3回目ワクチン接種後、並びに出来る限り6か月、12か月、及び任意LEEP来院時に血液を採取することになる(「採血」)。HPV−DNA検査は、スクリーニング並びに6か月及び12か月来院時に行うことになる(図10)。対象に12か月来院時に持続するHSILがある場合、又は過度の毒性のために対象が治験参加をやめる場合、彼女はLEEP来院に戻ってくる選択を与えられることになる。代替的には、彼女は治験参加をやめることを選択し、外科的治療の前に推奨される通り担当医師による最長2年間の観察を続けてもよい[14]。
概要 4.1
本試験は、生検によって診断されたHSILをもつ女性を治療するためのPepCanの単一群、非盲験、第II相治験である。試験デザインはHSILをもつ若い女性を治療するための最新のガイドラインによく似ている[14]。試験参加者は、UAMS産婦人科クリニックに通う、未治療の、生検によって診断されたHSILをもつ患者及び他のクリニックから紹介される患者であることになる。4回のワクチン注射(3週間に1回)は、四肢に皮内投与されることになる。臨床反応は、ワクチン接種前と12か月来院時に得られるコルポスコピー誘導下生検結果を比較することによって評価されることになる。安全性は、登録から12か月来院まで通してモニターされることになる。臨床検査及び免疫学的分析のために、接種前並びに2回目及び4回目ワクチン接種後に血液を採取することになる(「血液検査」)。T細胞分析を補助するために、1回目及び3回目ワクチン接種後、並びに出来る限り6か月、12か月、及び任意LEEP来院時に血液を採取することになる(「採血」)。HPV−DNA検査は、スクリーニング並びに6か月及び12か月来院時に行うことになる(図10)。対象に12か月来院時に持続するHSILがある場合、又は過度の毒性のために対象が治験参加をやめる場合、彼女はLEEP来院に戻ってくる選択を与えられることになる。代替的には、彼女は治験参加をやめることを選択し、外科的治療の前に推奨される通り担当医師による最長2年間の観察を続けてもよい[14]。
毒性モニタリング 4.2
重度毒性は、薬物に関連する以下のものとして(CTCAE v4.03を用いて)定義されることになる。
・グレードII以上のアレルギー反応
グレードIIは、「治療介入又は注入中断の適応;対症療法(例えば、抗ヒスタミン剤、NSAID、麻薬性鎮痛薬)に即時に反応する;≦24 時間の予防的薬物治療の適応」として定義される。グレードIIIは、「長期に及ぶ(例えば、対症療法的薬物治療及び/又は注入の短い中断)に対して速やかに反応しない;初期改善に続く症状の再発;臨床的続発症(例えば、腎臓障害、肺浸潤)に適応される入院」として定義される。
・グレードII以上の自己免疫反応
グレードIIは、「非本質的な(non-essential)臓器又は機能に関わる自己免疫反応(例えば、甲状腺機能低下)の兆候」として定義される。グレードIIIは、「主要臓器に関わる自己免疫反応(例えば、大腸炎、貧血、心筋炎、腎臓)」として定義される。
・いずれのグレードIII以上の事象
重度の毒性を経験するいずれの対象は試験をやめることになる。
重度毒性は、薬物に関連する以下のものとして(CTCAE v4.03を用いて)定義されることになる。
・グレードII以上のアレルギー反応
グレードIIは、「治療介入又は注入中断の適応;対症療法(例えば、抗ヒスタミン剤、NSAID、麻薬性鎮痛薬)に即時に反応する;≦24 時間の予防的薬物治療の適応」として定義される。グレードIIIは、「長期に及ぶ(例えば、対症療法的薬物治療及び/又は注入の短い中断)に対して速やかに反応しない;初期改善に続く症状の再発;臨床的続発症(例えば、腎臓障害、肺浸潤)に適応される入院」として定義される。
・グレードII以上の自己免疫反応
グレードIIは、「非本質的な(non-essential)臓器又は機能に関わる自己免疫反応(例えば、甲状腺機能低下)の兆候」として定義される。グレードIIIは、「主要臓器に関わる自己免疫反応(例えば、大腸炎、貧血、心筋炎、腎臓)」として定義される。
・いずれのグレードIII以上の事象
重度の毒性を経験するいずれの対象は試験をやめることになる。
中止規則 4.3
・いずれかの対象がワクチンに関連するグレードIV又はそれより高いAEを経験した場合、試験登録及びワクチン投与は一時中断されることになる。これらの活動は、メディカル・モニター(Medical Monitor)及び適用される規制当局が許可を与えた後のみ再開できる。
・治験依頼者は、どの時点であっても、いかなる理由でも試験をやめる決定をしてよい。
・いずれかの対象がワクチンに関連するグレードIV又はそれより高いAEを経験した場合、試験登録及びワクチン投与は一時中断されることになる。これらの活動は、メディカル・モニター(Medical Monitor)及び適用される規制当局が許可を与えた後のみ再開できる。
・治験依頼者は、どの時点であっても、いかなる理由でも試験をやめる決定をしてよい。
5 対象登録及び試験期間
5.1. 対象集団、募集、及びインフォームド・コンセントのプロセス
・年齢が18〜50歳であって、UAMS産婦人科クリニック及びANGELSテレコルポスコピー(Telecolposcopy)プログラムで診察を受け、最近のパップスメアがHSIL陽性又は「HSILを除外できない(Cannot rule out HSIL)」の結果である女性が、医師の照会、小冊子、チラシ、UAMSウェブサイト、及び治験チームによる口伝えを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ/除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。
・最近の異常なパップスメアがHSIL陽性又は「HSILを除外できない」の結果である他の女性が、クリニックによる照会、小冊子、チラシ(大学構内外で配布)、UAMSウェブサイト、並びに新聞広告、ラジオ、及び/又はソーシャルネットワーキングを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ/除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。コーディネーターは、パップスメアの結果の写しを診療所(physician's office)から入手して、それをスクリーニング来院に持参するように、対象に依頼することになる。
・コルポスコピー誘導下パンチ生検でHSILと最近診断された女性(診断日と1回目の接種日の間の期間は≦60日である必要がある)が、クリニックによる照会、小冊子、チラシ(大学構内外で配布)、UAMSウェブサイト、並びに新聞広告、ラジオ、及び/又はソーシャルネットワーキングを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ/除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。コーディネーターは、異常生検の診療記録の写しを診療所から入手して、それをスクリーニング来院に持参するように、対象に依頼することになる。
5.1. 対象集団、募集、及びインフォームド・コンセントのプロセス
・年齢が18〜50歳であって、UAMS産婦人科クリニック及びANGELSテレコルポスコピー(Telecolposcopy)プログラムで診察を受け、最近のパップスメアがHSIL陽性又は「HSILを除外できない(Cannot rule out HSIL)」の結果である女性が、医師の照会、小冊子、チラシ、UAMSウェブサイト、及び治験チームによる口伝えを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ/除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。
・最近の異常なパップスメアがHSIL陽性又は「HSILを除外できない」の結果である他の女性が、クリニックによる照会、小冊子、チラシ(大学構内外で配布)、UAMSウェブサイト、並びに新聞広告、ラジオ、及び/又はソーシャルネットワーキングを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ/除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。コーディネーターは、パップスメアの結果の写しを診療所(physician's office)から入手して、それをスクリーニング来院に持参するように、対象に依頼することになる。
・コルポスコピー誘導下パンチ生検でHSILと最近診断された女性(診断日と1回目の接種日の間の期間は≦60日である必要がある)が、クリニックによる照会、小冊子、チラシ(大学構内外で配布)、UAMSウェブサイト、並びに新聞広告、ラジオ、及び/又はソーシャルネットワーキングを通して募集されることになる。関心のある潜在的な対象は、治験コーディネーターと連絡を取って試験については話し合うことになる。コーディネーターは、初期組み入れ/除外基準評価を行い、スクリーニング来院ために対象をスケジュールし、同意書書類のコピーを対象が見直せるように送付することになる。コーディネーターは、異常生検の診療記録の写しを診療所から入手して、それをスクリーニング来院に持参するように、対象に依頼することになる。
5.1.1 組み入れ基準
・年齢が18〜50歳
・最近(≦60日)のパップスメアの結果がHSILと一致した、又はコルポスコピー誘導下生検で、「HSILを除外できない」若しくはHSILであった
・HSIL又は「HSILを除外できない」が未治療
・同意書を提供できる
・プロトコールの要件に応諾する意思がある、又は該要件に応諾でき、英語を使いこせる
・年齢が18〜50歳
・最近(≦60日)のパップスメアの結果がHSILと一致した、又はコルポスコピー誘導下生検で、「HSILを除外できない」若しくはHSILであった
・HSIL又は「HSILを除外できない」が未治療
・同意書を提供できる
・プロトコールの要件に応諾する意思がある、又は該要件に応諾でき、英語を使いこせる
5.1.2 除外基準
・免疫抑制(例えば、がん、HIV、臓器移植、自己免疫疾患)を引き起こす病歴又は治療歴
・試験参加期間内に妊娠している、又は妊娠しようとしている
・試験参加期間内に授乳している、又は授乳の予定がある
・カンジダ抗原に対するアレルギー
・救急外来受診又は入院を要する重度のぜんそくの病歴
・ベータ遮断薬物治療を現在使用している(アナフィラキシーが起こった場合に、エピネフリンに反応しないことがある)
・子宮頸部の浸潤性扁平上皮癌の病歴
・治験責任医師又は他の治験分担医師に意見により、この試験に参加することが患者の最善の利益にならない場合
・免疫抑制(例えば、がん、HIV、臓器移植、自己免疫疾患)を引き起こす病歴又は治療歴
・試験参加期間内に妊娠している、又は妊娠しようとしている
・試験参加期間内に授乳している、又は授乳の予定がある
・カンジダ抗原に対するアレルギー
・救急外来受診又は入院を要する重度のぜんそくの病歴
・ベータ遮断薬物治療を現在使用している(アナフィラキシーが起こった場合に、エピネフリンに反応しないことがある)
・子宮頸部の浸潤性扁平上皮癌の病歴
・治験責任医師又は他の治験分担医師に意見により、この試験に参加することが患者の最善の利益にならない場合
5.1.3 インフォームド・コンセントのプロセス
・潜在的な候補は、スクリーニング来院の前にインフォームド・コンセント用紙を受け取り、試験参加を決めるのに必要な可能な限りの時間を与えられるであろう。
・PIがインフォームド・コンセントに関する説明を行なう権限を与えた治験コーディネーター/治験チームメンバーは、対象候補と試験について詳細に話し合うことになる(米国コルポスコピー・子宮頸部病理学会によって定期的に発表されるガイドラインの年齢特有の基準を含む)。スクリーニング来院の前のどの時点でも、又はスクリーニング来院で訪れる際にUAMS婦人科クリニックにて(いずれの治験関連手順前に)、対象がもちうる治験に関する質問のすべてに回答するであろう。説明は英語で行われるであろう。
・コンセントは継続する過程であるので、対象らは、各治験来院時の試験手順前に、依然として試験に参加することを望むか否かを尋ねられるであろう。
・潜在的な候補は、スクリーニング来院の前にインフォームド・コンセント用紙を受け取り、試験参加を決めるのに必要な可能な限りの時間を与えられるであろう。
・PIがインフォームド・コンセントに関する説明を行なう権限を与えた治験コーディネーター/治験チームメンバーは、対象候補と試験について詳細に話し合うことになる(米国コルポスコピー・子宮頸部病理学会によって定期的に発表されるガイドラインの年齢特有の基準を含む)。スクリーニング来院の前のどの時点でも、又はスクリーニング来院で訪れる際にUAMS婦人科クリニックにて(いずれの治験関連手順前に)、対象がもちうる治験に関する質問のすべてに回答するであろう。説明は英語で行われるであろう。
・コンセントは継続する過程であるので、対象らは、各治験来院時の試験手順前に、依然として試験に参加することを望むか否かを尋ねられるであろう。
登録のペース 5.2
第I相試験の間に、登録した対象の約3分の2がワクチン接種に適格とされた。スクリーニング失敗率及び試験中止率(現在1年で約5%)を考慮して、我々は、スクリーニングに110名の対象を登録し、70名の対象にワクチン接種を開始する計画である。
第I相試験の間に、登録した対象の約3分の2がワクチン接種に適格とされた。スクリーニング失敗率及び試験中止率(現在1年で約5%)を考慮して、我々は、スクリーニングに110名の対象を登録し、70名の対象にワクチン接種を開始する計画である。
試験期間 5.3
試験期間は最長で66か月であろう。LEEP切除が行われる場合、各対象は約16か月間以上、治験に入っていることが期待される。
試験期間は最長で66か月であろう。LEEP切除が行われる場合、各対象は約16か月間以上、治験に入っていることが期待される。
6 治験来院
治験来院のスケジューリング 6.1
治験コーディネーターは、UAMS産婦人科クリニック及び臨床研究サービスコア(Clinical Research Services Core)(CRSC)の治験来院(スクリーニング、ワクチン接種、6か月、12か月、及び任意LEEP来院)のスケジュールをたてるであろう。スクリーニング、6か月、12か月、及び任意LEEP来院は、約90分間かかることが見込まれる。しかし、クリニックの忙しい日にはそれより長くかかる可能性がある。ワクチン接種来院は約60分かかると見込まれる。
治験来院のスケジューリング 6.1
治験コーディネーターは、UAMS産婦人科クリニック及び臨床研究サービスコア(Clinical Research Services Core)(CRSC)の治験来院(スクリーニング、ワクチン接種、6か月、12か月、及び任意LEEP来院)のスケジュールをたてるであろう。スクリーニング、6か月、12か月、及び任意LEEP来院は、約90分間かかることが見込まれる。しかし、クリニックの忙しい日にはそれより長くかかる可能性がある。ワクチン接種来院は約60分かかると見込まれる。
治験来院許容期間 6.2
6.2.1 個々の対象の来院の間隔
・1回目のワクチン接種来院(来院1)は、できるだけスクリーニング来院の結果がすべて入手でき、対象が試験のワクチン接種フェーズの続行に適格とみなされ後、パンチ生検が得られた日(大部分の対象にとってスクリーニング日)から60日以内にスケジュールすべきである。
・以降のワクチン接種/検査(lab)来院(来院2〜5)は、3週±7日間空けてスケジュールすべきである。
・6か月来院は、4回目の来院の6か月+2週間後にスケジュールすべきである。
・12か月来院は、6か月来院の来院の6か月+2週間後にスケジュールすべきである。
・任意LEEP来院(対象が選択する場合)は、12か月来院の後又は対象が重度毒性のために治験参加をやめた後、できるだけ早くスケジュールすべきである。
6.2.1 個々の対象の来院の間隔
・1回目のワクチン接種来院(来院1)は、できるだけスクリーニング来院の結果がすべて入手でき、対象が試験のワクチン接種フェーズの続行に適格とみなされ後、パンチ生検が得られた日(大部分の対象にとってスクリーニング日)から60日以内にスケジュールすべきである。
・以降のワクチン接種/検査(lab)来院(来院2〜5)は、3週±7日間空けてスケジュールすべきである。
・6か月来院は、4回目の来院の6か月+2週間後にスケジュールすべきである。
・12か月来院は、6か月来院の来院の6か月+2週間後にスケジュールすべきである。
・任意LEEP来院(対象が選択する場合)は、12か月来院の後又は対象が重度毒性のために治験参加をやめた後、できるだけ早くスケジュールすべきである。
スクリーニング来院 6.4
6.4.1 スクリーニング来院の手順
・組み入れ基準/除外基準を再確認する
・(それまでに得ていない場合)同意書を得る
・来院中に「対象連絡先情報」(付属書類2)を対象に記入してもらう
・来院中に「スクリーニング来院調査票」(付属書類3)を対象に記入してもらう
・人口統計学的情報を得る
・対象の既往歴を得る
・病歴:これまでの異常パップスメアの病歴と、それをどのように治療したかを必ず尋ねる
・薬物アレルギー
・併用薬
・身体検査を行う
・バイタルサインを得る
血圧(<200/120mmHgが許容可能)
・心拍数(50〜120bpmが許容可能)
・呼吸数(<25bpmが許容可能)
・体温(<100.4°F)
・体重(制限無し)
・妊娠可能性のある対象について
・ワクチンを受けている間の妊娠に関わるリスクについて説明する
・ワクチン治験に参加する間にどの避妊方法を使用することを考えているかを尋ねる。FDAに認可されている形態として、殺菌、インプラントロッド(implantable rod)、IUD、注射(shot)/注射(injection)、経口避妊薬、バリア法(膣リング、コンドーム、ペッサリー、子宮頸部キャップ)、及び緊急避妊が挙げられる。
・コルポスコピーを行う
・HPV−DNA検査のためのシンプレップを得る
・医師が必要と判断する場合、パンチ生検及び子宮頸管内膜掻爬を得る(適格であるためにHSILが確認される必要がある)
・病変領域をコルポスコピーで見ることができない場合、医師は四半部盲目生検を得ることがある
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、(利用可能な場合)コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る、どこで生検が採られたかを示す
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・対象が生検ですでにHSILと診断されている場合、再度行う必要はない。しかし、コルポスコピーを再度行って、病変部位を記録し、HPV−DNA検査のためのシンプレップを採ることがある。
・CBC、肝機能、及び腎機能用のチューブ採血(UAMS臨床検査室で行われる)
6.4.1 スクリーニング来院の手順
・組み入れ基準/除外基準を再確認する
・(それまでに得ていない場合)同意書を得る
・来院中に「対象連絡先情報」(付属書類2)を対象に記入してもらう
・来院中に「スクリーニング来院調査票」(付属書類3)を対象に記入してもらう
・人口統計学的情報を得る
・対象の既往歴を得る
・病歴:これまでの異常パップスメアの病歴と、それをどのように治療したかを必ず尋ねる
・薬物アレルギー
・併用薬
・身体検査を行う
・バイタルサインを得る
血圧(<200/120mmHgが許容可能)
・心拍数(50〜120bpmが許容可能)
・呼吸数(<25bpmが許容可能)
・体温(<100.4°F)
・体重(制限無し)
・妊娠可能性のある対象について
・ワクチンを受けている間の妊娠に関わるリスクについて説明する
・ワクチン治験に参加する間にどの避妊方法を使用することを考えているかを尋ねる。FDAに認可されている形態として、殺菌、インプラントロッド(implantable rod)、IUD、注射(shot)/注射(injection)、経口避妊薬、バリア法(膣リング、コンドーム、ペッサリー、子宮頸部キャップ)、及び緊急避妊が挙げられる。
・コルポスコピーを行う
・HPV−DNA検査のためのシンプレップを得る
・医師が必要と判断する場合、パンチ生検及び子宮頸管内膜掻爬を得る(適格であるためにHSILが確認される必要がある)
・病変領域をコルポスコピーで見ることができない場合、医師は四半部盲目生検を得ることがある
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、(利用可能な場合)コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る、どこで生検が採られたかを示す
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・対象が生検ですでにHSILと診断されている場合、再度行う必要はない。しかし、コルポスコピーを再度行って、病変部位を記録し、HPV−DNA検査のためのシンプレップを採ることがある。
・CBC、肝機能、及び腎機能用のチューブ採血(UAMS臨床検査室で行われる)
接種来院(来院1〜5)6.5
6.5.1 来院1に関する手順
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・身長と体重を測定してBMIを求める
・接種前にバイタルサインをとる
・以下のための採血することになる
・免疫モニタリング(Immunomonitoring)及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・CBC(1本の3.0ml容紫色キャップEDTAチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・肝パネル及び腎パネル(2本の4.5ml容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・ワクチンを注射投与する
・注射後少なくとも30分が経過した後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記(Subject Diary)」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
6.5.1 来院1に関する手順
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・身長と体重を測定してBMIを求める
・接種前にバイタルサインをとる
・以下のための採血することになる
・免疫モニタリング(Immunomonitoring)及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・CBC(1本の3.0ml容紫色キャップEDTAチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・肝パネル及び腎パネル(2本の4.5ml容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・ワクチンを注射投与する
・注射後少なくとも30分が経過した後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記(Subject Diary)」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
6.5.2 来院2に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・ワクチンを注射投与する
・接種後少なくとも30分経過後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・ワクチンを注射投与する
・接種後少なくとも30分経過後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
6.5.3 来院3に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・CBC(1本の3.0ml容紫色キャップEDTAチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・肝パネル及び腎パネル(2本の4.5ml容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・ワクチンを注射投与する
・注射後少なくとも30分が経過した後のバイタルサインを再度とる
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・「対象日記」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・CBC(1本の3.0ml容紫色キャップEDTAチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・肝パネル及び腎パネル(2本の4.5ml容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ、UAMS臨床検査室で行われる)
・ワクチンを注射投与する
・注射後少なくとも30分が経過した後のバイタルサインを再度とる
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・「対象日記」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
6.5.4 来院4に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・ワクチンを注射投与する
・接種後少なくとも30分経過後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・最終来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・ワクチン接種前尿妊娠検査
・接種前のバイタルサインをとる
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・ワクチンを注射投与する
・接種後少なくとも30分経過後のバイタルサインを再度とる
・あらゆる即時有害反応をモニターする
・イブプロフェン又はナプロキセンの投与を提供する
・「対象日記」(付属書類4)を手渡し、対象に記入して、次回来院時に持ってくるよう依頼する
6.5.5 来院5に関する手順
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・CBC(1本の3.0ml容紫色キャップEDTAチューブ)
・肝パネル及び腎パネル(2本の4.5ml容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ)
・記入した「対象日記」を求める。対象がそれを返さなかった場合、「最後の接種以来なにか副作用を経験したか」を尋ねる。
・以下のために採血されることになる
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・CBC(1本の3.0ml容紫色キャップEDTAチューブ)
・肝パネル及び腎パネル(2本の4.5ml容淡緑色キャップリチウムヘパリンチューブ)
6か月来院 6.6
6か月来院は、ワクチン接種4の約6か月(±2週間)後にスケジュールされることになる。
6か月来院は、ワクチン接種4の約6か月(±2週間)後にスケジュールされることになる。
6.6.1 6か月来院に関する手順
・最後の来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・コルポスコピーを行う
・HPV−DNA検査のためのシンプレップを得る
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、(利用可能な場合)コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る、
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・医師が必要と判断する場合(進行性疾患の疑いがある場合のみ)、パンチ生検及び子宮頸管内膜掻爬を得る
・ELISPOTアッセイの結果に基づいて、何名かの対象は、さらに交差反応、エピトープ拡大、及び/又は新規T細胞エピトープの特徴付けについて調べられることになる。採血が行なわれることになる
・6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ
・最後の来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・コルポスコピーを行う
・HPV−DNA検査のためのシンプレップを得る
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、(利用可能な場合)コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る、
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・医師が必要と判断する場合(進行性疾患の疑いがある場合のみ)、パンチ生検及び子宮頸管内膜掻爬を得る
・ELISPOTアッセイの結果に基づいて、何名かの対象は、さらに交差反応、エピトープ拡大、及び/又は新規T細胞エピトープの特徴付けについて調べられることになる。採血が行なわれることになる
・6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ
12か月来院 6.7
12か月来院は、6か月来院の約6か月(±2週間)後にスケジュールされることになる。6.7.1 12か月来院に関する手順
・身体検査を行う
・バイタルサインを得る
・血圧
・心拍数
・呼吸数
・体温
・体重
・最後の来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・コルポスコピーを行う
・HPV−DNA検査のためのシンプレップを得る
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、(利用可能な場合)コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・パンチ生検及び出来る限り子宮頸管内膜掻爬を得る
・医師が必要と判断した場合、子宮頸管内膜掻爬術を行う
・上記で説明したように以下のために何名かの対象から採血することがある
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・来院中に「12か月来院調査票」(付属書類7)を対象に記入してもらう
12か月来院は、6か月来院の約6か月(±2週間)後にスケジュールされることになる。6.7.1 12か月来院に関する手順
・身体検査を行う
・バイタルサインを得る
・血圧
・心拍数
・呼吸数
・体温
・体重
・最後の来院以降に何らかの投薬治療を開始又は中止したかを尋ねる
・コルポスコピーを行う
・HPV−DNA検査のためのシンプレップを得る
・病変、子宮頸部上での位置を記録する、(利用可能な場合)コルポスコープ付き画像取得システムを用いて子宮頸部の画像を撮る
・いくつの子宮頸部四半部で病変を見ることができるかを記録する
・パンチ生検及び出来る限り子宮頸管内膜掻爬を得る
・医師が必要と判断した場合、子宮頸管内膜掻爬術を行う
・上記で説明したように以下のために何名かの対象から採血することがある
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・来院中に「12か月来院調査票」(付属書類7)を対象に記入してもらう
6.7.2 12か月来院の追跡調査
治験コーディネーター及び治験責任医師又は共同治験分担医師(Co-Investigator)は、12か月来院の情報及び試験結果をすべて精査することになる。生検でHSILの兆候がない場合、対象は試験を完了することになる。持続するHSILがある場合、対象は、(1)LEEPの前にさらに1年間、自身のかかりつけの婦人科医に診てもらうか、又は(2)試験の一部としてLEEPを受けるかを選択してよい。
治験コーディネーター及び治験責任医師又は共同治験分担医師(Co-Investigator)は、12か月来院の情報及び試験結果をすべて精査することになる。生検でHSILの兆候がない場合、対象は試験を完了することになる。持続するHSILがある場合、対象は、(1)LEEPの前にさらに1年間、自身のかかりつけの婦人科医に診てもらうか、又は(2)試験の一部としてLEEPを受けるかを選択してよい。
任意LEEP来院 6.8
6.8.1 LEEP来院の手順
・上で説明したように以下のために数名の対象が採血されうる。
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・LEEP生検を行なう
・HPV−DNA検査のためのシンプレップ検査試料を得る
・可視病変を摘出するか、可視病変が見られない場合、生検を12か月来院時に得た領域から摘出する
6.8.1 LEEP来院の手順
・上で説明したように以下のために数名の対象が採血されうる。
・免疫モニタリング及び他の分析(6〜8本の10.0ml容緑色ゴムキャップヘパリンナトリウムチューブ)
・LEEP生検を行なう
・HPV−DNA検査のためのシンプレップ検査試料を得る
・可視病変を摘出するか、可視病変が見られない場合、生検を12か月来院時に得た領域から摘出する
8 評価項目
臨床評価(UAMS臨床検査室)8.1
臨床反応はスクリーニングからのパンチ生検結果(HSILに罹患していることは組み入れ基準である)を12カ月来院時に行なうパンチ生検と比較することによって(病理学科所属病理学者によって)評価されることになる。対象は、12カ月生検がHSIL陰性(CIN2/3の兆候無し)である場合、「レスポンダー」とみなされ、生検がHSIL(CIN2及び/又は3)を示す場合、「非レスポンダー」とみなされることになる。
臨床評価(UAMS臨床検査室)8.1
臨床反応はスクリーニングからのパンチ生検結果(HSILに罹患していることは組み入れ基準である)を12カ月来院時に行なうパンチ生検と比較することによって(病理学科所属病理学者によって)評価されることになる。対象は、12カ月生検がHSIL陰性(CIN2/3の兆候無し)である場合、「レスポンダー」とみなされ、生検がHSIL(CIN2及び/又は3)を示す場合、「非レスポンダー」とみなされることになる。
ウイルス学的試験 HPV−DNA検査(中川研究室(Nakagawa Laboratory))8.2
シンプレップ試料をHPV−DNAの有無について検査することになる。「リニアアレイ HPVジェノタイピングテスト」(ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス社、カリフォルニア州アラメダ)などの市販のキットを使用してよい。このキットは、37のHPV型(6型、11型、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、40型、42型、45型、51型、52型、53型、54型、55型、56型、58型、59型、61型、62型、64型、66型、67型、68型、69型、70型、71型、72型、73型、81型、82型、83型、84型、IS39型、及びCP6108型)についてテストする。また、ヒトベータ−グロビンシグナルを、各試料のDNA含有量の試料妥当性のための陽性対照としてアッセイすることになる。陽性対照試料(HPVプラスミドDNA及びプラスミドにコードされたヒトベータ−グロビン遺伝子を加えて含む)並びに陰性対照試料(HPVプラスミドDNAもヒトベータ−グロビン遺伝子も無し)が製造業者によって供給され、各実験に含まれることになる。HPV31型、33型、35型、52型、58型、及び67型は、「HPV16型関連」とみなされ、さらにHPV18型、39型、45型、51型、53型、56型、59型、66型、68型、69型、70型、73型、及び82型は、「ハイリスク」とみなされ、6型、11型、40型、42型、54型、61型、62型、71型、72型、81型、83型、84型、及びCP6108型は、「ローリスク」とみなされることになる[58]。
シンプレップ試料をHPV−DNAの有無について検査することになる。「リニアアレイ HPVジェノタイピングテスト」(ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティックス社、カリフォルニア州アラメダ)などの市販のキットを使用してよい。このキットは、37のHPV型(6型、11型、16型、18型、26型、31型、33型、35型、39型、40型、42型、45型、51型、52型、53型、54型、55型、56型、58型、59型、61型、62型、64型、66型、67型、68型、69型、70型、71型、72型、73型、81型、82型、83型、84型、IS39型、及びCP6108型)についてテストする。また、ヒトベータ−グロビンシグナルを、各試料のDNA含有量の試料妥当性のための陽性対照としてアッセイすることになる。陽性対照試料(HPVプラスミドDNA及びプラスミドにコードされたヒトベータ−グロビン遺伝子を加えて含む)並びに陰性対照試料(HPVプラスミドDNAもヒトベータ−グロビン遺伝子も無し)が製造業者によって供給され、各実験に含まれることになる。HPV31型、33型、35型、52型、58型、及び67型は、「HPV16型関連」とみなされ、さらにHPV18型、39型、45型、51型、53型、56型、59型、66型、68型、69型、70型、73型、及び82型は、「ハイリスク」とみなされ、6型、11型、40型、42型、54型、61型、62型、71型、72型、81型、83型、84型、及びCP6108型は、「ローリスク」とみなされることになる[58]。
ウイルス学的反応は、ワクチン接種前後のHPV−DNA検査結果を比較することによって評価することになる。ワクチン接種前に存在する少なくとも1つのHPV型が6か月来院及び12か月来院時の両方で検出不可になる場合、対象は「クリヤラー(clearer)」とみなされることになる。そうでなければ、少なくとも1つのHPV型のベースラインで検出される限り、対象は「パーシスター(persistor)」とみなされることになる。
免疫学的評価 8.3
8.3.1 ELISPOTアッセイ(中川研究室)
ELISPOTアッセイなどのHPV特異的T細胞の有無を評価する免疫アッセイを行なうことになる。各採血の後、PBMCをCD14+集団とCD14−集団に分離し、凍結保存することになる。アッセイ間のばらつきをなくすために、3つの血液試料(ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後)をすべて使用してT細胞株を確立し、ELISPOTアッセイを行うことになる。インビトロで磁気的に選択したCD3細胞を、HPV16 E6−vac、E7−vac、E6−GST、及びE7−GSTに曝した自己由来の成熟樹状細胞で刺激することによってCD3T細胞株を確立することになる。ELISPOTアッセイは以前に記載されたように行なうことになる[28]。我々は典型的に、HPV16 E6及びE7タンパク質内の16領域(E6 1〜25、E6 16〜40、E6 31〜55、E6 46〜70、E6 61〜85、E6 76〜100、E6 91〜115、E6 106〜130、E6 121〜145、E6 136〜158、E7 1〜25、E7 16〜40、E7 31〜55、E7 46〜70、E7 61〜85、及びE7 76〜98)を調べる。十分な細胞が入手可能である場合、アッセイは3連で行われることになる。ワクチン接種前と2回の接種後又は4回の接種後の各領域を比較するために、以前に記載されているように[59]、対応のある標本のt検定を行うことになる。したがって、各対象を、2回の接種後又は4回の接種後のT細胞応答のスチューデントの対応のあるt検定を用いて決定された統計的に有意な増加を伴う領域の数の点から評価することになる。残りのCD3T細胞を使用して、他のハイリスクHPV型由来の相同エピトープの認識の評価、新規のエピトープの説明、及び/又はそのようなエピトープの内部プロセシングの評価を行なってもよい。
8.3.1 ELISPOTアッセイ(中川研究室)
ELISPOTアッセイなどのHPV特異的T細胞の有無を評価する免疫アッセイを行なうことになる。各採血の後、PBMCをCD14+集団とCD14−集団に分離し、凍結保存することになる。アッセイ間のばらつきをなくすために、3つの血液試料(ワクチン接種前、2回のワクチン接種後、及び4回のワクチン接種後)をすべて使用してT細胞株を確立し、ELISPOTアッセイを行うことになる。インビトロで磁気的に選択したCD3細胞を、HPV16 E6−vac、E7−vac、E6−GST、及びE7−GSTに曝した自己由来の成熟樹状細胞で刺激することによってCD3T細胞株を確立することになる。ELISPOTアッセイは以前に記載されたように行なうことになる[28]。我々は典型的に、HPV16 E6及びE7タンパク質内の16領域(E6 1〜25、E6 16〜40、E6 31〜55、E6 46〜70、E6 61〜85、E6 76〜100、E6 91〜115、E6 106〜130、E6 121〜145、E6 136〜158、E7 1〜25、E7 16〜40、E7 31〜55、E7 46〜70、E7 61〜85、及びE7 76〜98)を調べる。十分な細胞が入手可能である場合、アッセイは3連で行われることになる。ワクチン接種前と2回の接種後又は4回の接種後の各領域を比較するために、以前に記載されているように[59]、対応のある標本のt検定を行うことになる。したがって、各対象を、2回の接種後又は4回の接種後のT細胞応答のスチューデントの対応のあるt検定を用いて決定された統計的に有意な増加を伴う領域の数の点から評価することになる。残りのCD3T細胞を使用して、他のハイリスクHPV型由来の相同エピトープの認識の評価、新規のエピトープの説明、及び/又はそのようなエピトープの内部プロセシングの評価を行なってもよい。
8.3.2 免疫細胞の測定
8.3.2.1 循環免疫細胞(中川研究室)
また、来院1、来院3、及び来院5時の採血からの少量のPBMC(約3×106個の細胞)を使用してTreg及びMDSCなどの循環免疫細胞のレベルをモニターし、ワクチン接種がそれらのレベルを減少させうるか否かを評価することになる[60]。フローサイトメトリーを使用してCD4+CD25+FOXP3+(Treg)及びCD14+HLA−DR−/low (MDSC)細胞の数を決定することになる[29、61]。Tbet(Th1)、GATA3(Th2)、及び/又はRORガンマT(TH17)陽性細胞も調べてもよい。循環免疫細胞の数は、ワクチン接種前、2回の接種後、及び4回の接種後に決定することになる。
8.3.2.1 循環免疫細胞(中川研究室)
また、来院1、来院3、及び来院5時の採血からの少量のPBMC(約3×106個の細胞)を使用してTreg及びMDSCなどの循環免疫細胞のレベルをモニターし、ワクチン接種がそれらのレベルを減少させうるか否かを評価することになる[60]。フローサイトメトリーを使用してCD4+CD25+FOXP3+(Treg)及びCD14+HLA−DR−/low (MDSC)細胞の数を決定することになる[29、61]。Tbet(Th1)、GATA3(Th2)、及び/又はRORガンマT(TH17)陽性細胞も調べてもよい。循環免疫細胞の数は、ワクチン接種前、2回の接種後、及び4回の接種後に決定することになる。
8.3.2.2 子宮頸部免疫細胞(UAMS実験病理学コア(Experimental Pathology Core))
慣用的な病理診断が任意LEEP来院時に得るLEEP試料からなされた後、さらなる断面を、CD3(T細胞)、CD4(ヘルパーT細胞)、CD8(細胞傷害性T細胞)、CD56(NK細胞)、CD1a(抗原提示に重要なランゲルハンス細胞)、CD20(B細胞)、CD68(マクロファージ)、FOXP3(Treg)、Tbet(Th1)、及びMadCAM−1(T細胞浸潤に関与するアドレシン)が陽性のものなどの子宮頸部免疫細胞について調べてもよい。好酸球(Th2)も調べてもよい。
慣用的な病理診断が任意LEEP来院時に得るLEEP試料からなされた後、さらなる断面を、CD3(T細胞)、CD4(ヘルパーT細胞)、CD8(細胞傷害性T細胞)、CD56(NK細胞)、CD1a(抗原提示に重要なランゲルハンス細胞)、CD20(B細胞)、CD68(マクロファージ)、FOXP3(Treg)、Tbet(Th1)、及びMadCAM−1(T細胞浸潤に関与するアドレシン)が陽性のものなどの子宮頸部免疫細胞について調べてもよい。好酸球(Th2)も調べてもよい。
8.3.3 その他
血液試料を用いて行なってワクチン反応を評価しうるさらなる分析としては、HPVタンパク質に対する抗体産生、サイトカイン応答(中川研究室)、及びタンパク質発現の変化(UAMSプロテオミクスコア研究室(Proteomics Core Laboratory))が挙げられる。
血液試料を用いて行なってワクチン反応を評価しうるさらなる分析としては、HPVタンパク質に対する抗体産生、サイトカイン応答(中川研究室)、及びタンパク質発現の変化(UAMSプロテオミクスコア研究室(Proteomics Core Laboratory))が挙げられる。
9 データ分析
有効性の評価 9.1
類似した試験デザイン(すなわち、生検によって診断されたCIN2/3をもつ対象の登録、及び15か月で生検によって評価された臨床反応)を含む以前に報告されている試験からの歴史的プラシーボ群を比較のために使用することになる[57]。治験を完了したワクチン接種者(50〜60名の対象と推定される)の奏効率を、29%(117名中34名)であった歴史的プラシーボ群の奏効率と、フィッシャーの直接確率検定を用いて比較することになる。検出力分析及び対象数の正当な根拠について「主要評価項目に関する理論的根拠:効力」(セクション1.5.9)を参照されたい。安全性の評価:有害事象のまとめ 9.2
有効性の評価 9.1
類似した試験デザイン(すなわち、生検によって診断されたCIN2/3をもつ対象の登録、及び15か月で生検によって評価された臨床反応)を含む以前に報告されている試験からの歴史的プラシーボ群を比較のために使用することになる[57]。治験を完了したワクチン接種者(50〜60名の対象と推定される)の奏効率を、29%(117名中34名)であった歴史的プラシーボ群の奏効率と、フィッシャーの直接確率検定を用いて比較することになる。検出力分析及び対象数の正当な根拠について「主要評価項目に関する理論的根拠:効力」(セクション1.5.9)を参照されたい。安全性の評価:有害事象のまとめ 9.2
少なくとも1回のワクチン投与を受けた対象は安全性評価に含まれることになる。表3に示すように結果は表にされるであろう。有害反応の種類、CTCAEグレード、及び反応がワクチン関連か否かが示されるであろう。
免疫応答及びウイルス排除の評価 9.3
9.3.1 免疫応答
9.3.1.1 HPVに対するCD3T細胞応答
図8のように、ワクチン接種前と、2回又は4回の接種後とで各領域を比較するために、上記の通り対応のある標本のt検定を行うことになる。
9.3.1 免疫応答
9.3.1.1 HPVに対するCD3T細胞応答
図8のように、ワクチン接種前と、2回又は4回の接種後とで各領域を比較するために、上記の通り対応のある標本のt検定を行うことになる。
HPVに対するCD3T細胞応答と臨床反応との相関は、「レスポンダー」及び「非レスポンダー」におけるE6に対する統計的に有意な増加を伴う少なくとも1つの領域をもつ多くの対象に関する分割表を作成することによって検討されることになる。フィッシャーの直接確率検定が使用されることになる。
9.3.1.2 循環免疫細胞
図9に示すように、2回のワクチン接種後及び4回のワクチン接種後のCD4、Th1、Th2、Treg、及びMDSCなどの循環免疫細胞の%割合の変化をベースラインで比較されることになる。対応のあるt検定及び一元配置分散分析を行なって、統計的有意性が決定されることになる。
図9に示すように、2回のワクチン接種後及び4回のワクチン接種後のCD4、Th1、Th2、Treg、及びMDSCなどの循環免疫細胞の%割合の変化をベースラインで比較されることになる。対応のあるt検定及び一元配置分散分析を行なって、統計的有意性が決定されることになる。
循環免疫細胞と臨床反応の相関は検討されることになる。ワクチン接種前試料と4回の接種後の試料との間の循環免疫細胞の%割合の変化は「レスポンダー」と「非レスポンダー」との間で比較されることになる。
9.3.2 ウイルス排除
HPV−DNA検査は、スクリーニング、6か月、及び12か月来院のシンプレップ試料を用いて行なうことになる。
HPV−DNA検査は、スクリーニング、6か月、及び12か月来院のシンプレップ試料を用いて行なうことになる。
HPVに対するCD3T細胞応答とウイルス学的反応との相関は、「クリヤラー」及び「パーシスター」におけるE6に対する統計的に有意な増加を伴う少なくとも1つの領域をもつ多くの対象について分割表を作成することによって検討されることになる。フィッシャーの直接確率検定が使用されることになる。
循環免疫細胞とウイルス排除の相関は検討されることになる。ワクチン接種前試料と4回の接種後の試料との間の循環免疫細胞の%割合の変化は「クリヤラー」と「パーシスター」との間で比較されることになる。
試験参加者募集及び保持率に寄与する要因 9.4
「スクリーニング来院調査票」、「早期中止調査票」、及び」「12か月来院調査票」に提供されるデータに基づいて、対象募集及び保持率に寄与する要因が評価されうる。フィッシャーの直接確率検定を用いて、フェイスブックの非公開グループ(private group)の使用頻度、試験参加動機などの要因が比較されることになり、又は幼児の有無が試験を離脱した対象と試験を完了した対象の間で比較されることになる。
「スクリーニング来院調査票」、「早期中止調査票」、及び」「12か月来院調査票」に提供されるデータに基づいて、対象募集及び保持率に寄与する要因が評価されうる。フィッシャーの直接確率検定を用いて、フェイスブックの非公開グループ(private group)の使用頻度、試験参加動機などの要因が比較されることになり、又は幼児の有無が試験を離脱した対象と試験を完了した対象の間で比較されることになる。
臨床反応及びウイルス排除の予測因子 9.5
プロテオミクスデータは3つの時点で集められることになるので、我々はワクチンに対する特有の動的応答(例えば、増加、減少、U字型)に関連するタンパク質のクラスタ群を特定し、また、ワクチン反応を予測するタンパク質発現特性も特定するであろう。タンパク質クラスタリングをもともと遺伝子発現マイクロアレイ時系列データ用に開発されたが、プロテオミクスデータへの応用に成功している[63]ノイズロバスト(noise-robust)クラスタリング法であるMfuzz[62]を用いて行うことになる。我々は、頻度の高い特定の遺伝子オントロジー(GO)アノテーションについて試験タンパクのクラスタ群を解析して、ワクチンに対する異なる反応の根本にある原因を解明することになる。プロテオミクスデータにくわえて、我々は、最初に単変量解析によって、次に10分割交差検証でラッソ(lasso)[64]を用いる変数選択を含む多変量解析によって、ワクチン反応を予測するための他の変数を解析することになる。コンピューター計算はR環境及びR/Bioconductor[65]環境で行われることになる。ラッソを用いる変数選択はパッケージglmmLassoを用いて実行されることになる一方で、遺伝子オントロジー機能情報(Gene Ontology terms)のエンリッチメント解析はtopGOを用いて行なわれることになる。
プロテオミクスデータは3つの時点で集められることになるので、我々はワクチンに対する特有の動的応答(例えば、増加、減少、U字型)に関連するタンパク質のクラスタ群を特定し、また、ワクチン反応を予測するタンパク質発現特性も特定するであろう。タンパク質クラスタリングをもともと遺伝子発現マイクロアレイ時系列データ用に開発されたが、プロテオミクスデータへの応用に成功している[63]ノイズロバスト(noise-robust)クラスタリング法であるMfuzz[62]を用いて行うことになる。我々は、頻度の高い特定の遺伝子オントロジー(GO)アノテーションについて試験タンパクのクラスタ群を解析して、ワクチンに対する異なる反応の根本にある原因を解明することになる。プロテオミクスデータにくわえて、我々は、最初に単変量解析によって、次に10分割交差検証でラッソ(lasso)[64]を用いる変数選択を含む多変量解析によって、ワクチン反応を予測するための他の変数を解析することになる。コンピューター計算はR環境及びR/Bioconductor[65]環境で行われることになる。ラッソを用いる変数選択はパッケージglmmLassoを用いて実行されることになる一方で、遺伝子オントロジー機能情報(Gene Ontology terms)のエンリッチメント解析はtopGOを用いて行なわれることになる。
定義 10.1
10.1.1 有害事象
有害事象は、ワクチンの使用と時間的に関連する、望ましくない又は意図されない兆候、症状、又は疾患のいずれの発生又は悪化であり、有害事象共通用語規準(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE)第4.03版に従ってグレードが類別されることになる。局所及び/又は全身有害事象としては、かゆみ、灼熱感(burning)、痛み、皮膚剥離、発疹、毛細血管性出血、発赤、圧痛、瘢痕化、発熱、吐き気、目まい、及び喘鳴が挙げられうる。対象は接種後に、適切な用量に従う鎮痛剤(イブプロフェン又はナプロキセンなど)の使用が許可され、鎮痛剤の提供を受け、起こりうるいずれの有害事象を制限することになる。いずれの有害事象も検討され、ワクチンと関連するか関連しないかを判断されることになる。当てはまる事象はすべて、IRBポリシー10.2に従ってIRBに、及び21 CFR 312.32に従ってFDAに報告されることになる。
10.1.1 有害事象
有害事象は、ワクチンの使用と時間的に関連する、望ましくない又は意図されない兆候、症状、又は疾患のいずれの発生又は悪化であり、有害事象共通用語規準(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE)第4.03版に従ってグレードが類別されることになる。局所及び/又は全身有害事象としては、かゆみ、灼熱感(burning)、痛み、皮膚剥離、発疹、毛細血管性出血、発赤、圧痛、瘢痕化、発熱、吐き気、目まい、及び喘鳴が挙げられうる。対象は接種後に、適切な用量に従う鎮痛剤(イブプロフェン又はナプロキセンなど)の使用が許可され、鎮痛剤の提供を受け、起こりうるいずれの有害事象を制限することになる。いずれの有害事象も検討され、ワクチンと関連するか関連しないかを判断されることになる。当てはまる事象はすべて、IRBポリシー10.2に従ってIRBに、及び21 CFR 312.32に従ってFDAに報告されることになる。
10.1.2 重篤有害事象
重篤有害事象は以下のいずれかの医療事象である。
・死亡の転帰をとる
・生命への差し迫った脅威である
・入院が必要若しくは現在の入院の延長
・先天性異常若しくは先天障害である、又は
・死の転帰をとらない、生死に関わるものではなく、若しくは入院を必要としない他の重要な医療事象が、適切な医学的判断に基づいて、それらの医療事象が対象を危険にさらすとみなされ、内科的若しくは外科的介入が上記転帰の1つを防ぐのに必要とされる場合には、重篤有害事象とみなされることがある。
重篤有害事象は以下のいずれかの医療事象である。
・死亡の転帰をとる
・生命への差し迫った脅威である
・入院が必要若しくは現在の入院の延長
・先天性異常若しくは先天障害である、又は
・死の転帰をとらない、生死に関わるものではなく、若しくは入院を必要としない他の重要な医療事象が、適切な医学的判断に基づいて、それらの医療事象が対象を危険にさらすとみなされ、内科的若しくは外科的介入が上記転帰の1つを防ぐのに必要とされる場合には、重篤有害事象とみなされることがある。
実施例4の参考文献
引用された出版物、特許、及び特許文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (53)
- HPV E6ペプチドを溶解する方法であって、
長さが20〜100個のアミノ酸の、HPV E6 81〜115(配列番号1の残基81〜115)の少なくとも20個の連続残基を含むHPV E6ペプチドAを、前記HPVペプチドAを溶解する工程の前に、各々の長さが10〜100個のアミノ酸の、少なくとも50%のHPV E6 1〜80(配列番号1の残基1〜80)の配列及び少なくとも50%のHPV E6 116〜158(配列番号1の残基116〜158)を集合的に含む、2つ以上のHPVペプチドYを完全溶存形態で含むバッファーに溶解して、前記ペプチドAを完全溶存形態で含み、前記ペプチドYを完全溶存形態で含む最終可溶性組成物を創り出すことを含む方法。 - 前記ペプチドAが、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化されている請求項1の方法。
- 前記HPVペプチドAが配列番号1の残基81〜115を含む請求項1の方法。
- 前記HPVペプチドAが配列番号1の残基81〜115から成る請求項1の方法。
- 前記ペプチドAが、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化されている請求項4の方法。
- 前記バッファーのpHが約pH3.0〜pH5.0である請求項1〜5のいずれか一項の方法。
- 前記バッファーが少なくとも2mMグルタミン酸(塩)を含む請求項1〜6のいずれか一項の方法。
- 前記ペプチドA及びYが集合的に配列番号1のすべてを含む請求項1〜7のいずれか一項の方法。
- ペプチドAが配列番号1の残基81〜115から成り、前記ペプチドYが配列番号1の残基1〜45、46〜80、及び116〜158から成る3つのペプチドである請求項1の方法。
- 前記ペプチドA及びYの各々が、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化され、前記バッファーのpHが約pH3.0〜pH5.0であり、ペプチドA及び前記3つのペプチドYの各々が溶解後に0.1〜20mg/mlの濃度である請求項9の方法。
- 前記ペプチドYの各々が、前記最終可溶性組成物中でペプチドAの少なくとも80%の重量/体積濃度である請求項1〜10のいずれか一項の方法。
- ペプチドA及び前記ペプチドYの各々が、前記最終可溶性組成物中で0.1〜5mg/mlである請求項1〜11のいずれか一項の方法。
- 医薬組成物であって
・各々の長さが10〜100個のアミノ酸残基の、1つ以上のHPV E6ペプチド、
・2〜40mMの濃度のグルタミン酸(塩)、
・0.3%〜5%(重量/体積)の濃度のトレハロース、
・0.2%〜10%(重量/体積)の濃度のグリシン、
を含み、
・pHが3.0〜5.0である組成物。 - 前記1つ以上のHPVの少なくとも1つが、E6ペプチドが、配列番号1の残基46〜70を含む、又は配列番号1の残基91〜115を含む、又は配列番号1の残基80〜88を含む請求項13の医薬組成物。
- 前記製剤が、各々の長さが10〜100個のアミノ酸残基であり、集合的にHPV E6配列の少なくとも50%を含む少なくとも3つのHPV E6ペプチドを含む請求項13の医薬組成物。
- 前記組成物が配列番号1の残基1〜45、46〜80、81〜115、又は116〜158から成る少なくとも1つのペプチドを含む請求項13〜15のいずれか一項の医薬組成物。
- 前記組成物が、配列番号1の残基1〜45から成るペプチド、配列番号1の残基46〜80から成るペプチド、配列番号1の残基81〜115から成るペプチド、及び配列番号1の残基116〜158から成るペプチドを含む請求項13〜15のいずれか一項の医薬組成物。
- 前記ペプチドの各々が、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシル末端がアミド化されている請求項13〜17のいずれか一項の医薬組成物。
- リコール抗原をさらに含む請求項13〜18のいずれか一項の医薬組成物。
- 医薬組成物であって、
HPV E6ペプチドA及び1つ以上のHPVペプチドYを含み、
長さが20〜100個のアミノ酸で、HPV E6 81〜115(配列番号1の残基81〜115)の少なくとも20個の連続残基を含むHPV E6ペプチドAを、前記HPVペプチドAを溶解する工程前に、集合的にHPV E6 1〜80(配列番号1の残基1〜80)の配列の少なくとも50%及びHPV E6 116〜158(配列番号1の残基116〜158)の少なくとも50%を含む、2つ以上の、各々の長さが10〜100個のアミノ酸のHPVペプチドYを完全溶存形態で含有するバッファーに溶解して、前記ペプチドAを完全溶存形態で、前記ペプチドYを完全溶存形態で含有する最終可溶性組成物を創出することを含む方法によって作成される医薬組成物。 - リコール抗原をさらに含む請求項20の医薬組成物。
- 個人のヒトパピローマウイルス(HPV)による感染症を減少又はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させる方法であって、
請求項13又は請求項20の前記医薬組成物を、それを必要とするHPV陽性の個人に投与することを含む方法。 - 前記医薬組成物がリコール抗原をさらに含む請求項22の方法。
- リコール抗原を皮内に注射することをさらに含む請求項22の方法。
- 前記医薬組成物を皮内に注射することを含む請求項22の方法。
- HPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させる方法であって、前記病変が悪性腫瘍である請求項22〜25のいずれか一項の方法。
- 前記病変が子宮頸がんである請求項26の方法。
- 前記病変が頭頸部癌である請求項26の方法。
- HPV関連病変の退縮を増加させる方法であって、前記病変が、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、又は咽頭口腔部の腫瘍である請求項22〜26のいずれか一項の方法。
- HPV関連病変の退縮を増加させる方法であって、前記病変が高度扁平上皮内病変(HSIL)である請求項22〜25のいずれか一項の方法。
- 個人のヒトパピローマウイルス(HPV)による感染症を減少又はHPV陽性の個人のHPV関連病変の退縮を増加させて、HPVに対するT細胞応答を誘導する方法であって、
前記個人に1つ以上のHPV抗原を含む組成物を投与すること及び前記個人にHPV抗原ではないリコール抗原を投与すること含み、前記リコール抗原が投与されて前記個人の前記1つ以上のHPV抗原と接触させられ、
前記個人が前記1つ以上のHPV抗原に対するT細胞応答を必要とし、
前記1つ以上のHPV抗原がE6抗原ではない方法。 - HPV抗原ではないリコール抗原を投与することを含まず、それ以外の点では同一の方法と比べて、より強力な、投与している前記個人における前記HPV抗原に対するT細胞応答を生じさせる請求項31の方法。
- 前記1つ以上のHPV抗原を含む組成物もまた前記リコール抗原を含む請求項31又は32の方法。
- 前記個人に1つ以上のHPV抗原を投与する工程及び前記個人に前記リコール抗原を投与する工程が、前記1つ以上のHPV抗原及び前記リコール抗原を皮内に注射することを含む請求項31〜33のいずれか一項の方法。
- 前記1つ以上のHPV抗原がHPV E7抗原を含む請求項31〜34のいずれか一項の方法。
- 前記1つ以上のHPV抗原が、長さが8〜100個のアミノ酸、8〜70個のアミノ酸、8〜50個のアミノ酸、又は8〜40個のアミノ酸のペプチドである請求項31〜35のいずれか一項の方法。
- 前記ペプチドが化学的に合成される請求項36の方法。
- 単位投与量医薬組成物であって、
25〜110ugの配列番号2から成るペプチド
25〜110ugの配列番号3から成るペプチド、
25〜110ugの配列番号4から成るペプチド、
25〜110ugの配列番号5から成るペプチド、及び
リコール抗原を、100〜900ul容の皮内注射用単位剤形で含む組成物。 - 前記リコール抗原がカンジダ抽出物である請求項38の単位投与量医薬組成物。
- 前記組成物が、300ulのキャンディン(CANDIN)又は等価総効力のカンジダ抽出物を含む請求項39の単位投与量医薬組成物。
- 量が200〜500ulである請求項38の単位投与量医薬組成物。
- 前記組成物が30〜70ugの前記ペプチドを各々含む請求項38の単位投与量医薬組成物。
- 前記組成物が約50ugの前記ペプチドを各々含む請求項38の単位投与量医薬組成物。
- 前記ペプチドが各々、そのアミノ末端がアセチル化され、そのカルボキシ末端がアミド化されている請求項38〜43のいずれかの単位投与量医薬組成物。
- 患者に請求項43の前記単位投与量医薬組成物を皮内に注射することを含むHPV感染症を治療する方法。
- 前記患者に請求項44の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を5日以上28日以下あけて、連続して少なくとも3回皮内注射することを含む請求項45の方法。
- 前記患者に請求項44の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を10日以上21日以下あけて、連続して少なくとも3回皮内注射することを含む請求項45の方法。
- 前記患者に請求項1の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を10日以上21日以下あけて、連続して少なくとも2回皮内注射することを含む請求項45の方法。
- 前記患者に請求項1の前記単位投与量医薬組成物を、各注射の間を5日以上28日以下あけて、2年の期間内に少なくとも3回多くても6回皮内注射することを含む請求項46の方法。
- 哺乳類対象において微生物によって起こされる疾患を治療する方法であって、
前記微生物の1つ以上の抗原を含む組成物を前記対象に皮内投与すること及び前記微生物の抗原ではないリコール抗原を前記対象に皮内投与することを含み、前記リコール抗原が投与されて、前記対象の前記微生物の前記1つ以上の抗原と接する方法。 - 前記微生物がウイルスである請求項50の方法。
- 前記微生物がヒトパピローマウイルスではない請求項50の方法。
- 前記リコール抗原がカンジダ抽出物である請求項50の方法。
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