WO2013031882A1 - がん治療用ワクチン製剤 - Google Patents

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洋 珠玖
直純 原田
大輔 村岡
一成 秋吉
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国立大学法人三重大学
国立大学法人東京医科歯科大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for treating cancer, particularly a vaccine for treating cancer. More specifically, the present invention relates to a vaccine preparation for treating cancer comprising a synthetic long peptide that is a vaccine antigen, a hydrophobic polysaccharide that is an antigen delivery system, and an immunopotentiator that stimulates antigen-presenting cells.
  • CD8 positive cytotoxic T cells are effector cells having an action of directly destroying tumors
  • CD4 positive helper T cells are killer T cells or antigen presenting cells. It is an important regulatory cell that enhances its function, and antigen-presenting cells, mainly dendritic cells, present and stimulate antigens to T cells and activate T cells via various costimulatory molecules and cytokines As described below, the role and positioning of each cell responsible for the cellular immune response against the tumor has been established (Non-patent Document 1).
  • Tumor cell-derived proteins and proteins administered as vaccine antigens are taken into antigen-presenting cells such as dendritic cells and then cleaved into peptides of various lengths by intracellular protease groups.
  • peptides of 8 to 10 amino acids are loaded as antigen epitope peptides on major histocompatibility complex (MHC) class I molecules and can be presented on the cell surface.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the killer T cell specifically recognizes and activates this MHC class I / antigen peptide complex using a T cell receptor (TCR).
  • TCR T cell receptor
  • Activated killer T cells detect MHC class I / antigen peptide complexes that are also present on tumor cells and destroy the tumor cells using effector molecules such as granzyme and perforin.
  • Non-patent Document 2 Antigen proteins taken up by antigen-presenting cells such as dendritic cells are cleaved to various lengths by intracellular protease groups, of which 15-20 amino acid peptides form complexes with MHC class II molecules. Presented on antigen presenting cells. Helper T cells specifically recognize and activate this. Activated helper T cells enhance the proliferation, survival and function of killer T cells through secretion of cytokines such as interferon (IFN) - ⁇ and interleukin (IL) -2.
  • IFN interferon
  • IL interleukin
  • helper T cells also have a function of activating dendritic cells via the CD40 ligand / CD40 pathway, and the dendritic cells activated by the helper T cells have an improved ability to stimulate killer T cells (non-patented). Reference 3). It has been well known that helper T cells also have the effect of enhancing antigen-specific IgG antibody production in B cells.
  • killer T cells are antigen-specifically activated by antigen-presenting cells such as dendritic cells, and helper T cells behave as important enhancers that further enhance the functions of both killer T cells and dendritic cells.
  • antigen-presenting cells such as dendritic cells
  • helper T cells behave as important enhancers that further enhance the functions of both killer T cells and dendritic cells.
  • These three types of immune cells are indispensable for effective cellular immunity against tumors.
  • the inventors have reported that a vaccine that stimulates only killer T cells and does not activate helper T cells only induces inferior killer T cells and has no therapeutic effect (Non-patent Document 4). In developing a vaccine for cancer treatment, how to activate and effectively function these three types of immune cells is an important issue.
  • the inventors once produced a multivalent cancer therapeutic vaccine using a recombinant full-length protein of a tumor antigen protein as an antigen, aiming at simultaneous activation of killer T cells and helper T cells.
  • the full-length protein contains various antigen peptides recognized by killer T cells and helper T cells, and is expected to activate both T cells simultaneously.
  • exogenous (extracellular) antigen proteins tend to promote activation of helper T cells via the MHC class II pathway, but it is difficult to activate killer T cells via the MHC class I pathway. This is due to the mechanism of exogenous antigen protein uptake and processing in antigen-presenting cells (Non-patent Document 5).
  • short peptides mainly 8 to 10 residue epitope peptides recognized by killer T cells, and to apply them clinically as vaccines. Since short peptides bind directly to MHC molecules on the cell surface without undergoing uptake and processing into antigen-presenting cells, presentation to T cells is likely to occur. In addition, it is necessary to produce and purify the recombinant full-length protein using Escherichia coli, mammalian cells, etc., and much time and labor are required for construction of the production system and quality control. In contrast, short peptides can be produced by chemical synthesis and have the advantage of being simpler than the production of recombinant proteins.
  • Non-Patent Document 4 In the case of a vaccine consisting of a peptide consisting of a mixture of the recognition epitopes of killer T cells and helper T cells as a short chain peptide, induction and treatment of high quality killer T cells by simultaneous activation of killer T cells and helper T cells There is a possibility that an effect is obtained.
  • Non-patent Document 3 Since the recognition epitope peptides of killer T cells and helper T cells are administered as separate components, separate dendritic cells present their respective peptides. There is a high possibility that the interaction will not occur (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 6 Exogenous antigenic proteins are phagocytosed by professional antigen-presenting cells with costimulatory molecules, such as dendritic cells and macrophages, processed intracellularly, and T cells in a manner with appropriate concentrations and costimulation.
  • costimulatory molecules such as dendritic cells and macrophages
  • T cells in a manner with appropriate concentrations and costimulation.
  • short peptides bind directly to the MHC molecules on the cell surface without undergoing such a process, the ability to take up antigens (phagocytic ability) and antigen processing ability is poor and no costimulatory molecules are expressed. In somatic cells, the target peptide will be presented in a large and inappropriate manner, which may lead to immune tolerance.
  • a long peptide is generally a polypeptide of several tens of residues containing at least one recognition epitope peptide for killer T cells and helper T cells.
  • the simultaneous activation of killer T cells and helper T cells by antigen-presenting cells incorporating a long peptide is expected.
  • a vaccine using a long peptide as an antigen can use a chemical synthesis method, it has the advantage of being relatively easy to produce as with a short peptide.
  • long peptides cannot directly bind to MHC molecules as they are.
  • the long peptide is taken up by dendritic cells and undergoes intracellular processing, so that the recognition epitope peptide of the killer T cell and helper T cell contained in the long peptide forms a complex with the MHC molecule.
  • somatic cells lacking antigen uptake and processing ability, long peptides do not function as vaccine antigens, and thus do not cause inappropriate antigen presentation to T cells.
  • a cancer therapeutic vaccine using a synthetic long peptide as a vaccine antigen enables simultaneous activation of killer T cells and helper T cells, and an excellent cancer therapeutic agent that can be produced at a relatively low cost.
  • the possibility of becoming is expected.
  • a cancer treatment vaccine using a synthetic long peptide as a vaccine antigen sufficient T cell activation cannot be obtained when administered alone, so a dendritic tree is used to maximize the vaccine effect. Effective activation of antigen-presenting cells such as cells is necessary.
  • immune enhancers have been conventionally used.
  • Various substances derived from bacterial cells and viruses such as nucleic acids (DNA and RNA), proteins, lipopolysaccharides, and the like have been used as immunopotentiators, but recent studies have shown that these substances are used to activate dendritic cells. It binds to the necessary cell surface and intracellular Toll-like receptors, and significantly enhances the stimulatory activity on T cells through increased expression of costimulatory molecules (CD80 and CD86) and MHC molecules, interferon and cytokine production, etc. It has become clear.
  • Non-patent Document 7 chemotherapeutic agents such as taxane compounds have the effect of activating dendritic cells (Non-patent Document 7), and dendritic cells acquire immunosuppressive activity. It has been reported that the use of a signal transduction inhibitor that has an effect of preventing the disease is effective in enhancing the vaccine effect (Non-patent Document 8), and such a substance may be used as an immune enhancer. .
  • the inventors also provide vaccine antigen delivery that promotes killer T cell activation (referred to as cross-presentation or cross-priming) via the MHC class I pathway of exogenous antigen proteins in antigen-presenting cells such as dendritic cells.
  • System research was advanced and the function was found in the hydrophobized polysaccharide (Patent Document 1).
  • CHP cholesteryl pullulan
  • CHM cholesteryl mannan
  • Nonpatent literature 9 Similar results have been reproduced when another tumor antigen protein, NY-ESO-1 full-length protein, is used (Non-patent Document 10). However, the usefulness of a long peptide with a small molecular weight was unknown. In addition, it is becoming clear that the size and surface charge of vaccine antigen delivery systems are directly linked to vaccine performance.
  • liposomes which are widely used vaccine antigen delivery systems, are reported to increase T cell activation and antibody production induction by vaccines as they are larger in size or charged (non-patent literature). 14-16). However, such conditions were unknown for hydrophobic polysaccharides as vaccine antigen delivery systems.
  • the inventors of the present invention have made a long peptide containing simultaneously recognized epitopes of killer T cells and helper T cells derived from a tumor-specific antigen protein and / or a pathogen-derived antigen protein, and a method for maximizing the therapeutic effect on cancer. It was investigated. As a result, as a result of intensive studies, the inventors first combined a CHP of a hydrophobized polysaccharide, which is an antigen delivery system, with a synthetic long peptide and then used it together with an immunopotentiating agent to produce a remarkable killer T cell. It was found in a mouse model that activation of helper T cells can be induced, and the present invention has been basically completed.
  • the vaccine preparation for cancer treatment according to the present invention for solving the above problems is derived from a tumor-specific antigen protein and / or a pathogen-derived antigen protein, a CD8 positive cytotoxic T cell recognition epitope, and a CD4 positive helper T. It is characterized by comprising one or more kinds of synthetic long peptides simultaneously containing a cell recognition epitope and a drug containing a complex with a hydrophobized polysaccharide and one or more kinds of immunopotentiators.
  • the synthetic long peptide is preferably a polypeptide consisting of 23 to 120 amino acids containing at least two T cell recognition epitopes.
  • the synthetic long peptide is preferably a polypeptide consisting of 23 to 80 amino acids containing at least two T cell recognition epitopes.
  • the synthetic long peptide is preferably a polypeptide consisting of 23 to 40 amino acids containing at least two T cell recognition epitopes.
  • the CD8 positive cytotoxic T cell recognition epitope is preferably a part of the amino acid sequence of the tumor-specific antigen protein.
  • the CD4 positive helper T cell recognition epitope is preferably a part of the amino acid sequence of the tumor-specific antigen protein.
  • the tumor-specific antigen protein is preferably selected from the MAGE family or NY-ESO-1, SPANX family, HER2, WT1, hTERT, RHAMM, and survivin.
  • the CD8 positive helper T cell recognition epitope is preferably a part of the amino acid sequence of the pathogen-derived protein.
  • the CD4 positive helper T cell recognition epitope is preferably a part of the amino acid sequence of the pathogen-derived protein.
  • the pathogen-derived antigenic protein is preferably selected from hepatitis B virus, hepatitis C virus, EB virus, human papilloma virus, human T lymphotropic virus, human herpesvirus type 8, and human immunodeficiency virus. .
  • the constituent polysaccharide of the hydrophobic polysaccharide is preferably pullulan or mannan. Moreover, it is preferable that the hydrophobic group of the hydrophobized polysaccharide is cholesterol. The hydrophobic polysaccharide is preferably nonionic. Moreover, it is preferable that the particle diameter after complex
  • the Toll-like receptor agonist is preferably poly IC RNA or CpG oligo DNA.
  • the immunopotentiator is preferably a chemotherapeutic agent that activates antigen-presenting cells.
  • the chemotherapeutic agent that activates the antigen-presenting cell is preferably a taxane compound or an anthracycline compound.
  • the said immunopotentiator is a chemical
  • the drug having the action of preventing the immunosuppressive activity of the antigen-presenting cell is a JAK / STAT inhibitor or an IDO inhibitor.
  • a long peptide refers to a polypeptide comprising at least two T cell recognition epitopes contained in a tumor-specific antigen protein and / or a pathogen-derived antigen protein.
  • the T cell recognition epitope may be any tumor-specific antigen protein or pathogen-derived antigen protein, and may be MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE- MAGE family molecule such as A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, NY-ESO-1 molecule, LAGE, SAGE family molecule, XAGE family molecule, SPANX family Molecules, HER2, WT1, hTERT, RHAMM, survivin, and other T-cell recognition epitopes included in a protein such as hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), EB virus,
  • T cell recognition epitopes include CTL epitopes recognized by killer T cells and Th epitopes recognized by helper T cells.
  • the long peptide of the present invention preferably contains at least one CTL epitope and one Th epitope at the same time, but a long peptide containing a CTL epitope and a long peptide containing a Th epitope can be used alone or in combination.
  • the length of the long peptide when it is 22 amino acids or less, immune tolerance is caused by direct binding to the MHC molecule, so that the effects of the present invention cannot be achieved, which is not preferable.
  • the effect of this invention is not fully acquired when it is longer than 120 amino acids, it is not preferable. Specifically, 23 to 120 amino acids are preferred, 23 to 80 amino acids are more preferred, and 23 to 40 amino acids are even more preferred. You may use this long peptide in combination of 2 or more types.
  • the hydrophobic polysaccharide used in the present invention can be produced by a method known per se described in, for example, Non-Patent Document 11 to Non-Patent Document 12, Patent Document 2 to Patent Document 4, and the like.
  • the polysaccharide in the hydrophobized polysaccharide is not particularly limited as long as it is a polymer in which sugar residues are glycosidically bonded.
  • a sugar residue constituting the polysaccharide for example, a residue derived from a monosaccharide such as glucose, mannose, galactose, or fucose, or a saccharide such as a disaccharide or an oligosaccharide can be used.
  • the sugar residue may be 1,2-, 1,3-, 1,4- or 1,6-glycosidic bond, and the bond may be either ⁇ - or ⁇ -type bond.
  • the polysaccharide may be either linear or branched.
  • a glucose residue is preferable, and as the polysaccharide, natural or synthetic pullulan, dextran, amylose, amylopectin, or mannan, preferably mannan or pullulan is used.
  • a polysaccharide having an average molecular weight of 50,000 to 150,000 can be used.
  • the hydrophobic group for example, 1 to 5 single-chain and double-chain alkyl groups or sterol residues are preferably introduced per 100 monosaccharides (5% or less by weight).
  • the hydrophobic group is not limited to the above group, and a group having a good encapsulation rate can be appropriately selected according to the molecular weight and isoelectric point of the antigen to be encapsulated.
  • the sterol residue include cholesterol, stigmasterol, ⁇ -sitosterol, lanosterol, ergosterol residue and the like.
  • a cholesterol residue can be used.
  • the alkyl group an alkyl group having preferably 20 or less carbon atoms, more preferably 10 to 18 carbon atoms can be used, and these may be either linear or branched.
  • the primary hydroxyl group of 1 to 5 sugar units per 100 sugar units constituting the polysaccharide is represented by the following formula (I): —O— (CH 2) mCONH (CH 2) nNH—CO
  • R represents an alkyl group or a sterol residue
  • m represents 0 or 1
  • n represents any positive integer
  • the alkyl group or sterol residue those described above can be preferably used, and n is preferably 1-8.
  • the hydrophobized polysaccharide what was couple
  • the hydrophobic polysaccharide is preferably nonionic, and preferably has a zeta potential of ⁇ 2.0 mV to +2.0 mV under physiological conditions after complexing with a long peptide.
  • the particle size is preferably less than 180 nm under physiological conditions after complexing with the long peptide, and more preferably 100 nm or less.
  • a complex of a long peptide and a hydrophobized polysaccharide can be purified by various chromatographic techniques after mixing the aggregate peptide of the long peptide and the hydrophobized polysaccharide at room temperature or low temperature (Non-patent Document 13).
  • the complex of the long peptide thus obtained and the hydrophobized polysaccharide can be used as it is as the vaccine preparation of the present invention, but can be subjected to operations such as sterilization according to a conventional method if necessary. is there.
  • the immunopotentiator may be any agent that has the effect of enhancing the activity of antigen-presenting cells.
  • an agonist of Toll-like receptor, other antigen-presenting cell stimulating agent, and immunosuppressive activity of antigen-presenting cells A drug having an action of inhibiting the acquisition of is selected.
  • the agonist of Toll-like receptor can be selected from inactivated cells, cell extracts, nucleic acids, lipopolysaccharides, lipopeptides, synthetic low molecular weight compounds, etc., preferably CpG oligo DNA, poly IC RNA, Monophosphoryl lipid, lipopeptide, etc. are used.
  • the antigen-presenting cell stimulator a taxane drug or an anthracycline drug can be used.
  • the agent having the action of inhibiting the acquisition of the immunosuppressive activity of the antigen-presenting cell is selected from an inhibitor of JAK / STAT, an inhibitor of indole deoxygenase (IDO), an inhibitor of tryptophan deoxygenase (TDO), etc. .
  • the inhibitory substances include neutralizing antibodies, small interfering RNA (siRNA) and antisense DNA of the factor.
  • the cancer therapeutic vaccine of the present invention can be administered by any method, but suitable parenteral routes such as intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, adipose tissue, intramammary tissue, inhalation or intramuscular. It is preferable to administer by a method via the mucosal route in the form of injection or a nasal spray etc.
  • the vaccine for cancer treatment of the present invention is usually prepared as a kit in which the above active ingredient, that is, a complex of a synthetic long peptide and a hydrophobic polysaccharide and an immunopotentiating agent component are separately formulated, into subcutaneous, intravenous and intramuscular. It can be set as the formulation of a dosage form suitable for parenteral administration.
  • the dose of the vaccine preparation for cancer treatment of the present invention necessary for inducing desired immunity can be appropriately determined.
  • the usual dose is about 0.1 mg / dose to 5 mg / dose as a synthetic long peptide.
  • the dose is given as a guide. It is important that the active ingredients of both preparations coexist at the same time at the administration site, and therefore it is desirable to administer both preparations substantially simultaneously or sequentially. It is appropriate to administer 2 to 20 times. Dosing intervals are selected from 1 to 12 weeks, but longer dosing intervals may be selected in later stages of treatment.
  • Synthetic long peptide of 40 amino acids (aa) derived from the amino acid sequence of tumor-specific protein MAGE-A4 (MAGE-A4, p264: 40) and a kind of hydrophobic polysaccharide CHP (1.7 per 100 monosaccharides in pullulan)
  • a complex having an average molecular weight of 100,000 was prepared (CHP-MAGE-A4, p264: 40 complex).
  • MAGE-A4 p264: 40 or CHP-MAGE-A4 p264: 40 complex was subcutaneously administered to mice at the same time as CpG oligo DNA as an immunopotentiator (at intervals of 1 week, twice).
  • spleen cells were collected, and the frequency of CD8 positive killer T cells (FIG.
  • CD4 positive helper T cells (FIG. 1B) specific for the epitope contained in the synthetic long peptide was determined by an intracellular cytokine staining method. It was measured by.
  • the same experiment as in FIG. 1 was performed using poly IC RNA as an immunopotentiator. Black bars indicate the frequency of antigen-specific CD8 positive killer T cells, and white bars indicate the frequency of antigen-specific CD4 positive helper T cells.
  • Table 1 shows the particle size and zeta potential of each hydrophobized polysaccharide-synthetic long peptide complex.
  • Table 1 shows the particle size and zeta potential of each hydrophobized polysaccharide-synthetic long peptide complex.
  • p264: 80 and p264: 120 consist of the p264: 40 two or three repeat sequences, respectively. The same experiment as FIG.
  • mERK2 p121: 37, mERK2 p121: 74 is a double repeat sequence of p121: 37.
  • BALB / c mice were subcutaneously administered with MAGE-A4 p264: 40 or CHP-MAGE-A4 p264: 40 complex simultaneously with CpG oligo DNA. Seven days later, mouse colon cancer cell CT26 stably transfected with the MAGE-A4 gene was transplanted subcutaneously. The transition of the tumor area of each individual thereafter is shown in the graph.
  • mouse fibrosarcoma cell CMS5a expressing mERK2 protein was implanted subcutaneously. The transition of tumor growth of each individual thereafter is shown in the graph. Only in the CHP-mERK2 p121: 37 complex / CpG oligo DNA administration group, significant suppression of tumor growth was observed compared to the PBS administration group (p ⁇ 0.03).
  • the sequence of the synthetic long peptide was as follows: MAGE-A4 p264: 40 (amino acid sequence (SEQ ID NO: 1): GSNPAREYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNAVRRIAYP, 9 from the second S to the 10th L as a killer T cell epitope sequence
  • An amino acid sequence (SEQ ID NO: 2: SNPARYEFL) is included.
  • 16 amino acid sequences from the 22nd V to the 37th amino acid are included as helper T cell epitopes (SEQ ID NO: 3: VKVLEHVVRVNARVR).
  • MAGE-A4 p264: 80 (amino acid sequence (SEQ ID NO: 4): GSNPAREYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNAARVRIAYPGSNPAREYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNAVRRIAYP, p264: 40) MAGE-A4 p264: 120 (amino acid sequence (SEQ ID NO: 5): GSNPAREYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYPGSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVRVRVNAVVRIVAV mERK2 p121: 37 (amino acid sequence (SEQ ID NO: 6): NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHLDLKPSNLLLNT, killer T cell epitope sequence of 9 amino acid sequences from 16th Q to 24th L (SEQ ID NO: 7: QYIHSANVL) The sequence includes 17 amino acid sequence
  • mERK2 p121 74 (amino acid sequence (SEQ ID NO: 9): NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHLDLPSPSLLLLNTNDHIIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLLNT, p121: 37 repeated sequences).
  • Synthetic peptides were purchased from Sigma Genosis. The amino acid sequence of the peptide was as follows: MAGE-A4 p265 (amino acid sequence (SEQ ID NO: 2): SNPAREYEFL), mERK2 9m (amino acid sequence (SEQ ID NO: 7): QYIHSANVL). CHP was obtained from NOF Corporation.
  • CHP-NH 2 was synthesized by reacting CHP with 1,1′-carbonyldiimidazole in a nitrogen atmosphere using DMSO as a solvent, and then adding ethylenediamine. The reaction solution was dialyzed give the lyophilized CHP-NH 2.
  • CHP-COOH was synthesized by reacting CHP with succinic anhydride using DMSO as a solvent and N, N-dimethyl-4-aminopyridine as a catalyst in a nitrogen atmosphere. After the reaction, the product was reprecipitated and dialyzed, and then lyophilized to obtain CHP-COOH.
  • CHESG enzymatically synthesized glycogen and cholesteryl isocyanate were reacted with DMSO as a solvent and dibutyltin dilaurate as a catalyst in a nitrogen atmosphere. After the reaction, the product was reprecipitated and dialyzed, and then lyophilized to obtain CHESG.
  • poly IC RNA was obtained from Oncovir.
  • CpG oligo DNA was purchased from Hokkaido System Science. Imiquimod was purchased from Sigma Aldrich.
  • FITC-labeled anti-CD4 monoclonal antibody (clone RM4-5), PerCP-Cy5.5-labeled anti-CD8 monoclonal antibody (clone 53-6.7), APC-labeled anti-IFN ⁇ antibody (clone XMG1.2), PE-labeled anti-IL-2
  • the antibody (clone JES6-5H4) was purchased from eBioscience or BD Bioscience.
  • the sample was transferred to a dialysis device (molecular weight cut: 3500, Thermo Scientific) and dialyzed at room temperature for 2 hours to overnight against PBS containing 0.6 M urea having a volume ratio of 100 times or more as an external dialysis solution.
  • dialysis was performed for 2 hours to overnight at room temperature against PBS containing 0.06M urea having a volume ratio of 100 times or more as an external dialysis solution.
  • dialysis was performed as a dialyzed external solution against PBS having a volume ratio of 100 times or more at room temperature for 2 hours to overnight.
  • the dialyzed solution was collected, and UV absorption (280 nm) was measured to determine the final concentration of the synthetic long peptide.
  • the particle size of the hydrophobized polysaccharide-synthetic long peptide complex was measured using a dynamic light scattering photometer (Zetasizer, Malvern), and the Z-Average value was adopted.
  • the zeta potential was measured using a zeta potential measuring device (SZ-100, Horiba Seisakusho).
  • Hydrophobized polysaccharide-synthetic long peptide complex and immunopotentiator were simultaneously administered to mice. The administration was carried out by subcutaneous injection at the back of the mouse twice at weekly intervals. As for the dose, 0.1 mg of the hydrophobized polysaccharide-synthetic long peptide complex was administered as a synthetic long peptide per administration.
  • CpG oligo DNA or poly IC RNA as an immunopotentiator was injected subcutaneously in the vicinity of the site of administration of the hydrophobized polysaccharide-synthetic long peptide complex at 0.05 mg per administration.
  • spleen cells were separated from the administered mice in the following manner. The spleen was isolated from the mouse, washed with RPMI 1640 medium, and blood was removed. After the spleen was ground using a glass slide, the released cells were collected in RPMI 1640 medium. After centrifugation (400 ⁇ g, 5 minutes, 4 ° C.), the supernatant was removed, and 2 mL of ACK solution was added to treat the cells for 1 minute. 18 mL of RPMI 1640 medium was added and centrifuged (400 ⁇ g, 5 minutes, 4 ° C.).
  • the supernatant was removed and the cells were suspended in an appropriate amount of RPMI 1640 medium. After counting the number of cells, the cells were suspended in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) to a cell concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • FBS fetal bovine serum
  • Intracellular cytokine staining The separated spleen cells were added to a 24-well culture plate (Nunk) at 5 ⁇ 10 6 cells / 0.5 mL per well. MAGE-A4 p264, MAGE-A4 p265, or mERK2 9m was added at a concentration of 10 ⁇ M as a peptide for restimulation, and the cells were cultured at 37 ° C., 5% CO 2 for 6 hours.
  • BD GoldiPlug TM (BD bioscience) diluted 10-fold in 10% FBS-containing RPMI 1640 medium was added per well, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 6 hours. Cells were harvested and transferred to 96-well round bottom microplates (Nunk). The supernatant was removed by centrifugation (1200 rpm, 1 minute, 4 ° C.), and then suspended in 50 ⁇ L of staining buffer (PBS containing 0.5% bovine serum albumin) per well.
  • staining buffer PBS containing 0.5% bovine serum albumin
  • FITC-labeled anti-CD8 monoclonal antibody or FITC-labeled anti-CD4 monoclonal antibody was added in an amount recommended by the manufacturer, mixed, and allowed to stand in the dark at 4 ° C. for 15 minutes. After washing the cells twice with 200 ⁇ L of staining buffer, 100 ⁇ L of BD Cytofix / Cytoperm TM buffer (BD Bioscience) was added and mixed very gently. After standing at room temperature in a dark place for 20 minutes, the plate was washed twice with 100 ⁇ L of BD Perm / Wash TM buffer (BD Bioscience).
  • BD Perm / Wash TM buffer supplemented with various anti-cytokine antibodies was added to the cells and suspended gently, and then allowed to stand in the dark at room temperature for 15 minutes. The cells were washed twice with 100 ⁇ L of BD Perm / Wash TM buffer, then resuspended in 200 ⁇ L of staining buffer, and transferred to a round bottom polystyrene tube (BD Bioscience).
  • Flow cytometry analysis The cells were analyzed with a flow cytometer (FACS Canto II, BD Bioscience) using the attached analysis software (FACSDiva).
  • FACSDiva FACSDiva
  • Tumor rejection test A mouse colon cancer cell CT26 cell line stably transfected with the MAGE-A4 gene or a mouse fibrosarcoma CMS5a cell line expressing mERK2 was subcutaneously transplanted as described below.
  • the CT26 cell line or CMS5a cell line cultured in a T75 flask (Nunk) was washed with PBS, the cells were detached with PBS containing 0.5% trypsin, and the cells were collected with RPMI1640 medium containing 10% FBS.
  • CpG oligo DNA which is an immunopotentiator
  • target T cells are not induced.
  • induction of antigen-specific killer T cells and helper T cells is clearly observed when the peptide is co-administered with CpG oligo DNA after being complexed with a kind of hydrophobic polysaccharide, CHP.
  • Administration of CHP-MAGE-A4 p264: 40 complex alone does not cause such T cell induction.
  • long peptide vaccine can enjoy the enhancement effect of CpG oligo DNA, which is an immunopotentiating agent, to the maximum extent only after complexing with hydrophobic polysaccharide CHP.
  • CpG oligo DNA which is an immunopotentiating agent
  • FIG. 1 The same test as in FIG. 1 was performed using poly IC RNA (Toll-like receptor 3 agonist) instead of CpG oligo DNA as an immunopotentiator.
  • the effect of the immunopotentiator was more pronounced in the CHP-synthetic long peptide complex than in the synthetic long peptide alone (FIG. 2). This suggests that any immunopotentiator that enhances immunity induction by administration of a CHP-synthetic long peptide complex can be widely used as long as it can activate antigen-presenting cells such as Toll-like receptor agonists. Yes.
  • Nonionic CHPs made ionic by chemical modification are CHP-NH 2 and CHP-COOH (Table 1).
  • CHP-COOH has a zeta potential close to 0 after complexing with a synthetic long peptide, and is virtually nonionic.
  • CHESG is obtained by increasing the particle size by changing the sugar chain part to glycogen (Table 1).
  • the enhancement effect by CpG oligo DNA was clearly attenuated in the group administered with the long peptide vaccine complexed with CHP-NH 2 or CHESG.
  • the attenuation effect by the CpG oligo DNA was not remarkable. From this, it became clear that the hydrophobized polysaccharide used in the present invention should satisfy the condition that it is nonionic after complex with the synthetic long peptide and the particle diameter is less than 180 nm, preferably less than 100 nm. .
  • Non-Patent Documents 14 to 16 In conventional vaccine antigen delivery systems using liposomes, it has been reported that the larger the size or the more charged, the better the immune induction by the vaccine (Non-Patent Documents 14 to 16). However, in the case of the hydrophobized polysaccharide of the present invention, it was found that the smaller the size after the complex with the long peptide, the better the non-ionic after the complex, which is completely different from the conventional liposome. It became clear.
  • the same test as in FIG. 1 was performed by changing the length of the long peptide from 40aa to 80aa or 120aa (FIG. 5).
  • the sequence of the 80aa or 120aa long peptide is a two or three repeat of the 40aa long peptide, respectively.
  • the long peptide and CHP complex of any length induced the desired killer T cell response, but the enhancement effect by CpG oligo DNA diminished as the amino acid length of the long peptide increased. From this, it became clear for the first time that the length of the long peptide used in the present invention is 120aa or less, preferably 80aa or less, more preferably 40aa or less.
  • FIG. 6 The same test as FIG. 5 was performed by changing the long peptide from the MAGE-A4 protein to the mERK2 protein (FIG. 6). Similar to FIG. 5, the enhancement effect by CpG oligo DNA decreased as the amino acid length of the long peptide increased.
  • Tumor-bearing mouse model transplanted with mouse fibrosarcoma cell CMS5a expressing mERK2 protein also significantly suppressed tumor growth in the CHP-mERK2 p121: 37 complex and CpG oligo DNA coadministration group compared to the PBS administration group The effect was recognized (p ⁇ 0.03) (FIG. 8).
  • mERK2 p121: 37 and CpG oligo DNA a significant growth inhibitory effect was not recognized.
  • the vaccine for cancer treatment with a very high cancer treatment effect was able to be provided.

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Abstract

【課題】　腫瘍特異的抗原タンパク質及び／又は病原体由来抗原タンパク質に由来しＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープとＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の認識エピトープペプチドを同時に含む合成ロングペプチドをワクチン抗原とするがん治療用ワクチンにおいて、キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞を明確に誘導する方法を提供する。 【解決手段】　合成ロングペプチドと抗原デリバリーシステムである疎水化多糖類を複合体化した上で免疫増強剤を同時投与することによって、合成ロングペプチドを抗原とするがん治療用ワクチンによる抗原特異的なキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の明確な誘導が達成される。

Description

がん治療用ワクチン製剤
　本発明はがんの治療法、特にがんの治療用ワクチンに関する。さらに詳しくは、ワクチン抗原である合成ロングペプチドと抗原デリバリーシステムである疎水化多糖類、および抗原提示細胞を刺激する免疫増強剤から構成されるがん治療用ワクチン製剤に関する。
　がんに対する免疫応答に関する長年の研究の結果、がん宿主の腫瘍拒絶における細胞性免疫の重要性が明らかになった。特に、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞（以下キラーＴ細胞）は腫瘍を直接破壊する作用を有するエフェクター細胞であること、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞（以下ヘルパーＴ細胞）はキラーＴ細胞や抗原提示細胞の働きを増強する重要な調節細胞であること、ならびに樹状細胞を中心とする抗原提示細胞はＴ細胞に抗原を提示し刺激すると共に、種々の共刺激分子やサイトカイン等を介してＴ細胞を活性化することが明らかとなり、以下に述べるように、腫瘍に対する細胞性免疫応答を担う各細胞の役割や位置付けが確立された（非特許文献１）。
　腫瘍細胞由来のタンパク質やワクチン抗原として投与されたタンパク質は、樹状細胞等の抗原提示細胞に取り込まれたあと、細胞内のプロテアーゼ群により種々の長さのペプチドへと切断される。生じたペプチドのうち、８～１０アミノ酸のペプチドは主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ，　ＭＨＣ）クラスＩ分子に抗原エピトープペプチドとして搭載され、細胞表面で提示され得る。キラーＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，　ＴＣＲ）を用いてこのＭＨＣクラスI／抗原ペプチド複合体を特異的に認識し活性化する。活性化したキラーＴ細胞は、腫瘍細胞上にも存在するＭＨＣクラスI／抗原ペプチド複合体を検出し、グランザイムやパーフォリンなどのエフェクター分子を用いて腫瘍細胞を破壊する。
　キラーＴ細胞が十分に活性化されるためには、ヘルパーＴ細胞の働きが非常に重要である（非特許文献２）。樹状細胞等の抗原提示細胞に取り込まれた抗原タンパク質は細胞内のプロテアーゼ群により種々の長さに切断されるが、そのうち１５～２０アミノ酸の抗原ペプチドはＭＨＣクラスII分子と複合体を形成し抗原提示細胞上で提示される。ヘルパーＴ細胞はこれを特異的に認識し活性化する。活性化ヘルパーＴ細胞は、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，　ＩＦＮ）-γやインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，　ＩＬ）-２等のサイトカインの分泌を介して、キラーＴ細胞の増殖や生存、機能を増強する。またヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０経路を介して樹状細胞を活性化する働きも有し、ヘルパーＴ細胞により活性化された樹状細胞はキラーＴ細胞に対する刺激能力が向上する（非特許文献３）。ヘルパーＴ細胞にはＢ細胞の抗原特異的ＩｇＧ抗体産生を増強する作用もあることは従来から良く知られている。
　このようにキラーＴ細胞は樹状細胞等の抗原提示細胞により抗原特異的に活性化され、ヘルパーＴ細胞はキラーＴ細胞と樹状細胞の双方の働きをさらに増強する重要なエンハンサーとして振る舞う。この３種類の免疫細胞は、腫瘍に対する細胞性免疫が効果的に作動する上でいずれも欠かせない存在である。発明者らは、キラーＴ細胞のみを刺激しヘルパーＴ細胞を活性化しないワクチンは、劣悪なキラーＴ細胞を誘導するのみで、治療効果を示さないことを報告しており（非特許文献４）、がん治療用ワクチンを開発する上でこれら３種類の免疫細胞をいかに活性化し有効に機能させるかが、重要な課題となっている。
　発明者らはかつて、キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の同時活性化を目指して、腫瘍抗原タンパク質の組換え全長タンパク質を抗原とする多価性がん治療用ワクチンを作製した。全長タンパク質には、キラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞のそれぞれが認識する多様な抗原ペプチドが含まれており、両Ｔ細胞を同時に活性化することが期待される。しかしながら、外因性（細胞外）の抗原タンパク質はＭＨＣクラスII経路を介したヘルパーＴ細胞の活性化は進行しやすいが、ＭＨＣクラスI経路を介したキラーＴ細胞の活性化は進行しにくい。これは抗原提示細胞における外因性抗原タンパク質の取り込みとプロセシングの機構上の理由による（非特許文献５）。
　そこで国内外では、短鎖のペプチド、主としてキラーＴ細胞が認識する８～１０残基のエピトープペプチドを化学合成し、ワクチンとして臨床応用する試みが多くなされている。短鎖ペプチドは抗原提示細胞内への取り込みとプロセシングを経ずに、細胞表面のＭＨＣ分子に直接結合するため、Ｔ細胞への提示は起こりやすい。また、組換え全長タンパク質は大腸菌や哺乳類細胞などを用いて生産し精製する必要があり、製造システムの構築及び品質管理に多くの時間と労力を要する。これに対し、短鎖ペプチドは化学合成による製造が可能で、組換えタンパク質の製造に比べて簡便であるという利点がある。
　しかし、短鎖ペプチドからなるがん治療用ワクチンにはいくつかの重要な課題が指摘されている。短鎖ペプチドワクチンの多くはキラーＴ細胞の認識エピトープペプチドのみを含むことから、ヘルパーＴ細胞の活性化を伴わない単価性のワクチンであり、誘導する細胞性免疫の質や治療効果は不十分である（非特許文献４）。キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の認識エピトープをそれぞれ短鎖ペプチドとして合成し、それらの混合物から成るワクチンであれば、キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞を同時活性化による良質なキラーＴ細胞の誘導と治療効果が得られる可能性もある。しかしながら、この場合、キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の認識エピトープペプチドは別個の成分として投与されるため、別々の樹状細胞がそれぞれのペプチドを提示することになり、キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の相互作用に至らない可能性が高い（非特許文献３）。
　また、短鎖ペプチドが抗原提示細胞内への取り込みとプロセシングを経ずに、細胞表面のＭＨＣ分子に直接結合することについても問題が指摘されている（非特許文献６）。すなわち、外因性の抗原タンパク質は、樹状細胞やマクロファージのように副刺激分子を備えたプロフェッショナルな抗原提示細胞に貪食され、細胞内でプロセシングされ、適切な濃度と副刺激を伴う様式でＴ細胞に抗原提示されるが、短鎖ペプチドはそうした過程を経ずに細胞表面のＭＨＣ分子に直接結合するため、抗原の取り込み能力（貪食能力）や抗原プロセシング能力が乏しく副刺激分子も発現しない一般の体細胞でも目的のペプチドが大量かつ不適切な様式で提示されることになり、免疫寛容に陥る可能性がある。
　こうした短鎖ペプチドから成るワクチンの課題を鑑み、近年、キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の同時活性化が可能な全長タンパク質と、製造が容易で安価な短鎖ペプチドのそれぞれの長所を取り入れた長鎖の合成ペプチド（ロングペプチド）の有用性が提案されている（非特許文献６）。ロングペプチドは、一般にキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の認識エピトープペプチドを少なくとも一つずつ含むような数十残基のポリペプチドである。ロングペプチドを取り込んだ抗原提示細胞によるキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の同時活性化が期待される。また、ロングペプチドを抗原とするワクチンは化学合成法を用いることができるため、短鎖ペプチドと同様に製造が比較的容易であるという長所を持つ。
　さらにロングペプチドは短鎖ペプチドと異なり、そのままではＭＨＣ分子に直接結合できない。ロングペプチドは樹状細胞等に取り込まれて細胞内でのプロセシングを経ることで、ロングペプチドに含まれるキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の認識エピトープペプチドはＭＨＣ分子と複合体を形成し、Ｔ細胞に適切な濃度と様式で提示される。また、抗原の取り込み能力とプロセシング能力を欠く一般の体細胞ではロングペプチドはワクチン抗原として機能しないため、不適切なＴ細胞への抗原提示を生じることがない。
　以上のことから、合成ロングペプチドをワクチン抗原とするがん治療用ワクチンは、キラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の同時活性化が可能である一方、比較的廉価で製造できる優れたがん治療薬となる可能性が期待されている。しかし、合成ロングペプチドをワクチン抗原とするがん治療用ワクチンにおいても、それ単独で投与した場合は十分なＴ細胞の活性化が得られないため、ワクチンの効果を最大化するためには樹状細胞等の抗原提示細胞の効率的な活性化が必要である。
　ワクチンの免疫原性をより高めるために、従来から免疫増強剤（アジュバント）が用いられている。菌体やウイルス由来の種々の物質、例えば核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、タンパク質、リポ多糖等が免疫増強剤として用いられてきたが、近年の研究により、これらの物質は樹状細胞の活性化に必要な細胞表面及び細胞内部のＴｏｌｌ様受容体に結合し、共刺激分子（ＣＤ８０やＣＤ８６）とＭＨＣ分子の発現上昇、インターフェロンやサイトカイン産生などを介してＴ細胞に対する刺激活性を著しく向上させることが明らかになっている。またＴｏｌｌ様受容体に対するアゴニスト以外にも、タキサン系化合物などの化学療法剤が樹状細胞を活性化する作用があることや（非特許文献７）、樹状細胞が免疫抑制活性を獲得するのを防ぐ作用があるシグナル伝達阻害剤の利用もワクチン効果を増強するのに有効であることが報告されており（非特許文献８）、そのような物質も免疫増強剤として利用できる可能性がある。
　また、発明者らは、樹状細胞等の抗原提示細胞における外因性抗原タンパク質のＭＨＣクラスI経路を介したキラーＴ細胞活性化（クロスプレゼンテーションまたはクロスプライミングと呼ばれる）を促進するようなワクチン抗原デリバリーシステムの研究を進め、疎水化多糖類にその機能を見出した（特許文献１）。例えば、腫瘍抗原タンパク質であるＨＥＲ２全長タンパク質を疎水化多糖類の一種であるコレステリルプルラン（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ　ｐｕｌｌｕｌａｎ，　略称ＣＨＰ）またはコレステリルマンナン（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ　ｍａｎｎａｎ，　略称ＣＨＭ）と複合体化したワクチン製剤は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒト樹状細胞に投与した場合にヘルパーＴ細胞だけでなくキラーＴ細胞も効率良く活性化すること、さらに担がんモデルマウスに投与したとき、ＨＥＲ２全長タンパク質を単体で投与した場合に比べ、優れた抗腫瘍効果を示した（非特許文献９）。同様の結果は別の腫瘍抗原タンパク質であるＮＹ-ＥＳＯ-１全長タンパク質を用いた場合においても再現されている（非特許文献１０）。しかしながら、分子量の小さいロングペプチドにおける有用性は不明であった。
　また、ワクチン抗原デリバリーシステムのサイズと表面電荷がワクチン性能に直結し重要であることが明らかとなりつつある。現在、広く利用されているワクチン抗原デリバリーシステムであるリポソームでは、サイズが大きいほど、あるいは電荷を帯びているほど、ワクチンによるT細胞活性化や抗体産生誘導が向上するという報告がある（非特許文献１４～１６）。しかしワクチン抗原デリバリーシステムとして疎水化多糖類では、そうした諸条件は不明であった。
特許第４０３３４９７号 特開昭６１－６９８０１号公報 特開平３－２９２３０１号公報 特開平７－９７３３３号公報
Ｒｉｂａｓ，Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．　２００３；２１（１２）：２４１５-２４３２ Ｓｈｉｋｕ，　Ｈ．　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．　２００３；７７（５）：４３５-８． Ｂｅｈｒｅｎｓ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２００４；８２（１）：８４-９０． Ｍｕｒａｏｋａ，　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２０１０；１８５（６）：３７６８-７６． Ｓｈｅｎ　Ｌ．　＆　Ｒｏｃｋ　Ｋ．Ｌ．　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００６；１８（１）：８５-９１． Ｍｅｌｉｅｆ，　Ｃ．　Ｊ．　Ｍ．，　＆　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｕｒｇ，　Ｓ．　Ｈ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖ．　Ｃａｎｃｅｒ，　２００８；８（５）：３５１-３６０． Ｂｙｒｄ-Ｌｅｉｆｅｒ，　Ｃ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００１；３１（８）：２４４８-５７． Ｋｏｎｇ，　Ｌ．　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２００８；１４（１８）：５７５９-６８． Ｇｕ，　Ｘ．　Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　１９９８；５８（１５）：３３８５-９０． Ｈａｓｅｇａｗａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　２００６；１２（６）：１９２１-２７． Ａｋｉｙｏｓｈｉ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．，　１９９３；２６（１２）：３０６２-６８． Ａｋｉｙｏｓｈｉ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｐｒｏｃ．　Ｊａｐａｎ．　Ａｃａｄ．，　１９９５；７１（７１Ｂ）：１５． Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．　１９９４；２７（２６）：７６５４-５９． Ｂｒｅｗｅｒ，　Ｊ．　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９９８；１６１：４０００-７． Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ-Ｌａｃｅｙ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ．　２０１１；１５４（２）：１３１-７． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ．　１９９９；６１：２３３-４０．
発明が解決しようとする課題及びそれを解決するための手段
　発明者らは、腫瘍特異的抗原タンパク質及び／又は病原体由来抗原タンパク質に由来するキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の認識エピトープを同時に含むロングペプチドを作製し、がんに対する治療効果を最大限に引き出す方法を検討した。その結果、発明者らは鋭意検討の末、抗原デリバリーシステムである疎水化多糖類のＣＨＰと合成ロングペプチドを複合体化した上で免疫増強剤と併用することによって初めて、顕著なキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の活性化を誘導できることをマウスモデルで見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
　こうして、上記課題を解決するための本発明に係るがん治療用ワクチン製剤は、腫瘍特異的抗原タンパク質及び／又は病原体由来抗原タンパク質に由来しＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープを同時に含む１種類以上の合成ロングペプチド並びに疎水化多糖類との複合体を含む薬剤と、１種類以上の免疫増強剤によって構成されることを特徴とする。
　このとき、前記の合成ロングペプチドがＴ細胞認識エピトープを少なくとも２つ以上含む２３～１２０アミノ酸から成るポリペプチドであることが好ましい。また、前記の合成ロングペプチドがＴ細胞認識エピトープを少なくとも２つ以上含む２３～８０アミノ酸から成るポリペプチドであることが好ましい。また、前記の合成ロングペプチドがＴ細胞認識エピトープを少なくとも２つ以上含む２３～４０アミノ酸から成るポリペプチドであることが好ましい。
　また、前記のＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープが、腫瘍特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
　また、前記のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープが、腫瘍特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
　このとき、前記の腫瘍特異的抗原タンパク質が、ＭＡＧＥファミリーまたはＮＹ-ＥＳＯ-１、ＳＰＡＮＸファミリー、ＨＥＲ２、ＷＴ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＨＡＭＭ、サバイビンから選ばれることが好ましい。
　また、前記のＣＤ８陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープが、病原体由来タンパク質のアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
　また、前記のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープが、病原体由来タンパク質のアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
　このとき、前記の病原体由来抗原タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＥＢウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴリンパ向性ウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルスから選ばれることが好ましい。
　また、前記の疎水化多糖類の構成多糖類がプルランまたはマンナンであることが好ましい。
　また、前記の疎水化多糖類の疎水基がコレステロールであることが好ましい。
　また、前記の疎水化多糖類が非イオン性であることが好ましい。
　また、前記の疎水化多糖類と合成ロングペプチドとの複合体化後の粒子径が１８０ｎｍ未満であることが好ましい。また、前記の疎水化多糖類と合成ロングペプチドとの複合体化後の粒子径が１００ｎｍ以下であることがより好ましい。
　また、前記の免疫増強剤がＴｏｌｌ様受容体のアゴニストであることが好ましい。このとき、前記のＴｏｌｌ様受容体のアゴニストが、ポリＩＣ　ＲＮＡまたはＣｐＧオリゴＤＮＡであることが好ましい。
　また、前記の免疫増強剤が、抗原提示細胞を活性化する化学療法剤であることが好ましい。このとき、前記の抗原提示細胞を活性化する化学療法剤が、タキサン系化合物またはアントラサイクリン系化合物であることが好ましい。
　また、前記の免疫増強剤が、抗原提示細胞の免疫抑制活性獲得を防ぐ作用を有する薬剤であることが好ましい。このとき、前記の抗原提示細胞の免疫抑制活性獲得を防ぐ作用を有する薬剤がＪＡＫ／ＳＴＡＴの阻害物質またはＩＤＯの阻害物質であることが好ましい。
　本発明において、ロングペプチドは腫瘍特異的抗原タンパク質及び／又は病原体由来抗原タンパク質に含まれるＴ細胞認識エピトープを少なくとも二つ以上含むことを特徴とするポリペプチドをいう。Ｔ細胞認識エピトープは腫瘍特異的抗原タンパク質又は病原体由来抗原タンパク質に含まれるものであればよく、ＭＡＧＥ-Ａ１、ＭＡＧＥ-Ａ２、ＭＡＧＥ-Ａ３、ＭＡＧＥ-Ａ４、ＭＡＧＥ-Ａ５、ＭＡＧＥ-Ａ６、ＭＡＧＥ-Ａ８、ＭＡＧＥ-Ａ９、ＭＡＧＥ-Ａ１０、ＭＡＧＥ-Ａ１１、ＭＡＧＥ-Ａ１２、ＭＡＧＥ-Ｂ１、ＭＡＧＥ-Ｂ２などのＭＡＧＥファミリー分子やＮＹ-ＥＳＯ-１分子、ＬＡＧＥ、ＳＡＧＥファミリー分子、ＸＡＧＥファミリー分子、ＳＰＡＮＸファミリー分子、ＨＥＲ２、ＷＴ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＨＡＭＭ、サバイビンなどの腫瘍特異的抗原タンパク質に含まれるＴ細胞認識エピトープ及び、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＥＢウイルス、ヒトパピローマウイルス（１６型、１８型の他、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、６９型、７３型、８２型なども選択できる）、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ-１）、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルスなどの病原体由来抗原タンパク質に含まれるＴ細胞認識エピトープから選択することができる。Ｔ細胞認識エピトープにはキラーＴ細胞によって認識されるＣＴＬエピトープと、ヘルパーＴ細胞によって認識されるＴｈエピトープとがある。本発明のロングペプチドは、ＣＴＬエピトープとＴｈエピトープをそれぞれ一つ以上同時に含むのが好ましいが、ＣＴＬエピトープを含むロングペプチドとＴｈエピトープを含むロングペプチドを単独、もしくは組み合わせて使用することもできる。
　ロングペプチドの長さについては、２２アミノ酸以下の場合はＭＨＣ分子への直接結合による免疫寛容を起こすため、本発明の効果を奏することができず、好ましくない。また、１２０アミノ酸より長い場合も本発明の効果を十分に得られないため、好ましくない。具体的には２３～１２０アミノ酸が好ましく、２３～８０アミノ酸がより好ましく、２３～４０アミノ酸がさらに好ましい。このロングペプチドは２種類以上を組み合わせて使ってもよい。
　本発明において使用される疎水化多糖類は、例えば、非特許文献１１～非特許文献１２、特許文献２～特許文献４等に記載されたそれ自体既知の方法で製造することができる。
　疎水化多糖類における多糖類は、糖残基がグリコシド結合した高分子であれば特に限定されることはない。多糖類を構成する糖残基としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等の単糖類、または二糖類またはオリゴ糖類などの糖類に由来する残基を用いることができる。糖残基は１，２－、１，３－、１，４－または１，６－グリコシド結合していてもよく、その結合はα－またはβ－型結合のいずれであってもよい。また、多糖類は直鎖状でも分枝鎖状のいずれでもよい。糖残基としてはグルコース残基が好ましく、多糖類としては、天然または合成由来のプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、又はマンナン、好ましくはマンナンまたはプルランなどが用いられる。多糖類の平均分子量として５０，０００～１５０，０００のものを用いることができる。
　疎水基としては、例えば、１本鎖及び２本鎖のアルキル基またはステロール残基を１００単糖あたり１～５個（重量比で５％以下）導入したものが望ましく、１００単糖あたり１～３個（重量比で３％以下）導入したものがより好ましい。もっとも、疎水基は上記の基に限定されるわけではなく、封入される抗原の分子量や等電点に応じて封入率のよいものを適宜選択することができる。ステロール残基としては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール残基などが挙げられるが、好ましくは、コレステロール残基を用いることができる。また、アルキル基としては、好ましくは炭素数２０以下、さらに好ましくは炭素数１０～１８のアルキル基を用いることができ、これらは直鎖又は分岐鎖のいずれであってもよい。
　疎水化多糖類としては、例えば、多糖類を構成する糖単位１００個あたり１～５個の糖単位の１級水酸基が下記式（Ｉ）：－Ｏ－（ＣＨ２）ｍＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｒ　（Ｉ）（式中、Ｒはアルキル基またはステロール残基を示し；ｍは０または１を示し；ｎは任意の正の整数を示す）で表されるものが好ましい。ここで、アルキル基又はステロール残基としては好ましくは上記のものを用いることができ、ｎは好ましくは１～８である。
　なお、疎水化多糖類としては、特許文献４に記載されたようなリンカーを介して結合したものであってもよい。
　また、疎水化多糖類としては非イオン性であることが好ましく、ロングペプチドとの複合体化後に、生理的条件下でのゼータ電位が－２．０ｍＶ～＋２．０ｍＶのものが好ましい。粒子径は、ロングペプチドとの複合体化後に生理的条件下で１８０ｎｍ未満であることが好ましく、１００ｎｍ以下であることがより好ましい。
　ロングペプチドと疎水化多糖類との複合体は、ロングペプチドと疎水化多糖類の集合体微粒子とを室温または低温で混合した後に、種々のクロマトグラフィー技術により精製できる（非特許文献１３）。このようにして得られたロングペプチドと疎水化多糖類との複合体は、そのまま本発明のワクチン製剤として用いることができるが、必要に応じて常法に従って滅菌等の操作を施すことも可能である。
　免疫増強剤としては、抗原提示細胞の活性を増強させる作用を持つ薬剤であればよく、より具体的にはＴｏｌｌ様受容体のアゴニストやその他の抗原提示細胞刺激剤、抗原提示細胞の免疫抑制活性の獲得を阻害する作用を持つ薬剤が選択される。Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストとしては、不活性化菌体や菌体抽出物、核酸、リポ多糖、リポペプチド、合成低分子化合物などから選択することができ、好ましくはＣｐＧオリゴＤＮＡやポリＩＣ　ＲＮＡ、モノホスホリルリピッドやリポペプチドなどが用いられる。抗原提示細胞刺激剤としては、タキサン系の薬物やアントラサイクリン系の薬物を用いることができる。抗原提示細胞の免疫抑制活性の獲得を阻害する作用を持つ薬剤としては、ＪＡＫ／ＳＴＡＴの阻害物質やインドールデオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害物質、トリプトファンデオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）の阻害物質などから選択される。この阻害物質には、当該因子に対して拮抗作用を持つ化合物の他、当該因子の中和抗体やｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）やアンチセンスＤＮＡも含まれる。
　本発明のがん治療用ワクチンは、いかなる方法により投与することもできるが、適当な非経口経路、例えば静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、または点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等により投与することが好ましい。
　本発明のがん治療用ワクチンは、通常、上記有効成分、すなわち合成ロングペプチドと疎水化多糖類の複合体及び免疫増強剤成分を別個に製剤したキットとして、皮下、静脈内、筋肉内への非経口投与に適した剤型の製剤とすることができる。目的の免疫を誘導するのに必要な本発明のがん治療用ワクチン製剤の投与量は適宜決定できるが、例えば、通常投与量としては合成ロングペプチドとして０．１ｍｇ／回～５ｍｇ／回程度の量を目安として投与する。投与部位において実質的に両製剤の有効成分が同時に共存することが肝要であり、したがって実質的に同時にまたは連続して両製剤を投与することが望ましい。投与は２～２０回行うのが適当である。投与間隔は1～１２週間から選択するが、治療後期ではより長い投与間隔を選択することがある。
　本発明によれば、がん治療効果が極めて高いがん治療用ワクチンを提供できる。
腫瘍特異的タンパク質ＭＡＧＥ-Ａ４のアミノ酸配列に由来する４０アミノ酸（ａａ）の合成ロングペプチド（ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０）と疎水化多糖類の一種のＣＨＰ（プルランに１００単糖あたり１．７個のコレステリル基を導入したもの。平均分子量１００，０００）の複合体を調製した（ＣＨＰ-ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０複合体）。ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０またはＣＨＰ-ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０複合体を免疫増強剤であるＣｐＧオリゴＤＮＡと同時にマウスに皮下投与した（１週間隔，２回）。最終投与の１週間後に脾臓細胞を回収し、合成ロングペプチドに含まれるエピトープに特異的なＣＤ８陽性キラーＴ細胞（図１Ａ）またはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞（図１Ｂ）の頻度を細胞内サイトカイン染色法により測定した。 免疫増強剤としてポリＩＣ　ＲＮＡを用いて、図１と同様の実験を行った。黒のバーは抗原特異的ＣＤ８陽性キラーＴ細胞を、白のバーは抗原特異的ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞の頻度を示す。 合成ロングペプチドとして、マウス腫瘍抗原である変異型ＥＲＫ２（ｍＥＲＫ２）のアミノ酸配列に由来する３７ａａの合成ロングペプチドｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７を用いて、図２と同様の実験を行った。数値は抗原特異的ＣＤ８陽性キラーＴ細胞の頻度を示す。 疎水化多糖として、ＣＨＰ、ＣＨＰ-ＮＨ２（プルランに１００単糖あたり１．２個のコレステリル基及び１３個のアミノ基を導入したもの、平均分子量１００，０００）、ＣＨＰ-ＣＯＯＨ（プルランに１００単糖あたり１．２個のコレステリル基及び２７個のカルボキシル基を導入したもの、平均分子量１００，０００）、及びＣＨＥＳＧ（グリコーゲンに１００単糖あたり０．８個のコレステリル基を導入したもの、平均分子量２,１００，０００）を調製し、それぞれ合成ロングペプチドＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０と複合体化したものを用いて、図１と同様の実験を行った。各疎水化多糖-合成ロングペプチド複合体の粒子径とゼータ電位を表１に示す。 ＭＡＧＥ-Ａ４のアミノ酸配列に由来する４０ａａ、８０ａａまたは１２０ａａの合成ロングペプチド（ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０、ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：８０、ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：１２０）を用いて、図１と同様の実験を行った。ｐ２６４：８０とｐ２６４：１２０は、それぞれｐ２６４：４０の２回または３回繰り返し配列から成る。 ｍＥＲＫ２のアミノ酸配列に由来する３７ａａまたは７４ａａの合成ロングペプチド（ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７、ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：７４）を用いて、図１と同様の実験を行った。ｐ１２１：７４はｐ１２１：３７の２回繰り返し配列である。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０またはＣＨＰ-ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０複合体をＣｐＧオリゴＤＮＡと同時に皮下投与した。その７日後に、ＭＡＧＥ-Ａ４遺伝子を安定導入したマウス大腸がん細胞ＣＴ２６を皮下移植した。その後の各個体の腫瘍面積の推移をグラフに示す。ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０／ＣｐＧオリゴＤＮＡ投与群とＣＨＰ-ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０複合体／ＣｐＧオリゴＤＮＡ投与群の両方で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）投与群と比較して腫瘍増殖の有意な抑制が認められたが（ｐ＜０．０００１）、ＣＨＰ-ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０複合体／ＣｐＧオリゴＤＮＡ投与群の方が増殖抑制効果は顕著であった。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７またはＣＨＰ-ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７複合体をＣｐＧオリゴＤＮＡと同時に皮下投与した。その７日後に、ｍＥＲＫ２蛋白質を発現するマウス繊維肉腫細胞ＣＭＳ５ａを皮下移植した。その後の各個体の腫瘍増殖の推移をグラフに示す。ＣＨＰ-ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７複合体／ＣｐＧオリゴＤＮＡ投与群でのみ、ＰＢＳ投与群と比較して腫瘍増殖の有意な抑制が認められた（ｐ＜０．０３）。
　次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
＜材料及び方法＞
　（１）　材料
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）は日本ＳＬＣから購入し、三重大学医学部動物センターにて飼育した。１週間の馴化の後に実験に使用した。マウスを用いる試験の計画については三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。合成ロングペプチドはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、株式会社スクラムまたは株式会社バイオロジカから購入した。合成ロングペプチドの配列は次の通りであった：ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０（アミノ酸配列（配列番号１）：ＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ、キラーＴ細胞エピトープ配列として２番目のＳから１０番目のＬまでの９個のアミノ酸配列（配列番号２：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬ）を含む。ヘルパーＴ細胞エピトープとして２２番目のＶから３７番目の１６個のアミノ酸配列（配列番号３：ＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩ）を含む）。ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：８０（アミノ酸配列（配列番号４）：ＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ、ｐ２６４：４０の２回繰り返し配列）。ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：１２０（アミノ酸配列（配列番号５）：ＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ、ｐ２６４：４０の３回繰り返し配列）。ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７（アミノ酸配列（配列番号６）：ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ、キラーＴ細胞エピトープ配列として１６番目のＱから２４番目のＬまでの９個のアミノ酸配列（配列番号７：ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ）を、ヘルパーＴ細胞エピトープ配列として１３番目のＲから２９番目のＫまでの１７個のアミノ酸配列（配列番号８：ＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫ）を含む）。ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：７４（アミノ酸配列（配列番号９）：ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ、ｐ１２１：３７の２回繰り返し配列）。合成ペプチドはシグマジェノシスから購入した。ペプチドのアミノ酸配列は次の通りであった：　ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６５（アミノ酸配列（配列番号２）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬ）、ｍＥＲＫ２　９ｍ（アミノ酸配列（配列番号７）：ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ）。ＣＨＰは（株）日油より入手した。ＣＨＰ-ＮＨ２の合成は、ＤＭＳＯを溶媒として窒素雰囲気下でＣＨＰと１，１'-カルボニルジイミダゾールを反応させた後、エチレンジアミンを加え反応させた。反応液を透析精製した後、凍結乾燥しＣＨＰ-ＮＨ２を得た。ＣＨＰ-ＣＯＯＨの合成は、ＤＭＳＯを溶媒とし、窒素雰囲気下でＮ，Ｎ-ジメチル-４-アミノピリジンを触媒としてＣＨＰと無水コハク酸を反応させた。反応後、生成物を再沈殿および透析した後、凍結乾燥しＣＨＰ-ＣＯＯＨを得た。ＣＨＥＳＧの合成は、ＤＭＳＯを溶媒とし、窒素雰囲気下でジラウリン酸ジブチル錫を触媒として酵素合成グリコーゲンとコレステリルイソシアネートを反応させた。反応後、生成物を再沈殿および透析した後、凍結乾燥しＣＨＥＳＧを得た。免疫増強剤として、ポリＩＣ　ＲＮＡはＯｎｃｏｖｉｒ社より入手した。ＣｐＧオリゴＤＮＡは北海道システムサイエンスより購入した。イミキモドはシグマアルドリッチより購入した。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４モノクローナル抗体（クローンＲＭ４-５）、ＰｅｒＣＰ-Ｃｙ５．５標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体（クローン５３-６．７）、ＡＰＣ標識抗ＩＦＮγ抗体（クローンＸＭＧ１．２）、ＰＥ標識抗ＩＬ-２抗体（クローンＪＥＳ６-５Ｈ４）はｅＢｉｏｓｃｉｅｃｅまたはＢＤバイオサイエンスから購入した。
　（２）　疎水化多糖と合成ロングペプチドの複合体の作製
　合成ロングペプチドは１０ｍｇ／ｍＬの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。疎水化多糖は１０ｍｇ／ｍＬの濃度で６Ｍ尿素含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。１ｍＬ（１０ｍｇ）の合成ロングペプチド溶液に対し２０ｍＬ（２００ｍｇ）の疎水化多糖溶液を添加し、暗所にて室温で一晩静置した。透析デバイス（分子量カット：３５００，サーモサイエンティフィック社）に移し、透析外液として容積比１００倍以上の０．６Ｍ尿素含有ＰＢＳに対し室温で２時間から一晩透析した。次いで、透析外液として容積比１００倍以上の０．０６Ｍ尿素含有ＰＢＳに対し室温で２時間から一晩透析した。再び、透析外液として容積比１００倍以上のＰＢＳに対し室温で２時間から一晩透析した。透析内液を回収し、ＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測定して合成ロングペプチドの最終濃度を求めた。疎水化多糖類-合成ロングペプチド複合体の粒子径は、動的光散乱光度計（ゼータサイザー、マルバーン社）を用いて測定し、Ｚ-Ａｖｅｒａｇｅ値を採用した。ゼータ電位は、ゼータ電位測定装置（ＳＺ-１００、堀場製作所）を用いて測定した。
　（３）　投与方法
　疎水化多糖類-合成ロングペプチド複合体と免疫増強剤はマウスに同時投与した。投与は、１週間間隔で２回、マウスの背部皮下に注射して行った。投与量は、投与１回につき疎水化多糖類-合成ロングペプチド複合体は合成ロングペプチドとして０．１ｍｇ相当を投与した。免疫増強剤のＣｐＧオリゴＤＮＡまたはポリＩＣ　ＲＮＡはいずれも投与１回につき０．０５ｍｇを疎水化多糖類-合成ロングペプチド複合体投与部位の近傍に皮下注射した。
　（４）マウス免疫細胞の単離精製
　最終投与の１週間後に、投与マウスから脾臓細胞を次の要領で分離した。マウスから脾臓を単離し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し脱血した。スライドガラスを使いて脾臓を磨砕した後、遊離した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中に回収した。遠心分離（４００×ｇ、５分、４℃）後に上清を除去し、２ｍＬのＡＣＫ溶液を加えて細胞を１分間処理した。１８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、遠心分離（４００×ｇ、５分、４℃）した。上清を除き、細胞を適当な量のＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。細胞数を計数した後、１×１０７個／ｍＬの細胞濃度になるように１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。
　（５）　細胞内サイトカイン染色
　２４穴培養プレート（ヌンク）に、分離した脾臓細胞を１ウェルあたり５×１０６個／０．５ｍＬで添加した。再刺激用のペプチドとしてＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４、ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６５、またはｍＥＲＫ２　９ｍを１０μＭの濃度で添加し、３７℃、５％ＣＯ２で６時間培養を行った。その後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて１０倍希釈したＢＤ　ＧｏｌｄｉＰｌｕｇTM（ＢＤバイオサイエンス）を１ウェル辺り５０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で６時間培養を行った。細胞を回収し、９６穴丸底マイクロプレート（ヌンク）に移した。遠心分離（１２００ｒｐｍ，１分，４℃）して上清を除いた後、１ウェル当たり５０μＬの染色用バッファー（０．５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ）に懸濁した。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体またはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４モノクローナル抗体をメーカーが推奨する量で添加し、混合した後、４℃の暗所にて１５分間静置した。２００μＬの染色用バッファーで細胞を２回洗浄した後、１００μＬのＢＤ　Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍTMバッファー（ＢＤバイオサイエンス）を添加し、ごく穏やかに混合した。室温の暗所にて２０分間静置した後、１００μＬのＢＤ　Ｐｅｒｍ／ＷａｓｈTMバッファー（ＢＤバイオサイエンス）で２回洗浄した。各種の抗サイトカイン抗体を添加した５０μＬのＢＤ　Ｐｅｒｍ／ＷａｓｈTMバッファーを細胞に加えて穏やかに懸濁した後、室温の暗所にて１５分間静置した。１００μＬのＢＤ　Ｐｅｒｍ／ＷａｓｈTMバッファーで細胞を２回洗浄した後、染色用バッファー２００μＬに再懸濁を行い、丸底ポリスチレンチューブ（ＢＤバイオサイエンス）へと移した。
　（６）　フローサイトメトリー解析
　細胞はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩ，ＢＤバイオサイエンス）にて、付属の解析ソフトウェア（ＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて解析した。
　（７）　腫瘍拒絶試験
　ＭＡＧＥ-Ａ４遺伝子を安定導入したマウス大腸がん細胞ＣＴ２６細胞株またはｍＥＲＫ２を発現するマウス繊維肉腫ＣＭＳ５ａ細胞株の皮下移植を下記の要領で行った。Ｔ７５フラスコ（ヌンク）に培養したＣＴ２６細胞株またはＣＭＳ５ａ細胞株をＰＢＳにて洗浄後、０．５％トリプシン含有ＰＢＳにて細胞を剥離し１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を回収した。遠心分離（４００×ｇ，５分，４℃）した後に上清を除き、ＲＰＭＩ１６４０培地にて２回洗浄後、１×１０６個／１００μＬの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁を行い、１００μＬ／個体の量でＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下移植した。その後は経時的に腫瘍面積を測定した。
　（８）　統計解析
　腫瘍拒絶試験におけるデータの比較は、ＭＳ　Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いてＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定により行った。
＜試験結果＞
　合成ロングペプチドと疎水化多糖類を複合体化した上で免疫増強剤を同時投与することによって、合成ロングペプチドを抗原とする特異的なキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の明確な誘導が達成されることを図１のグラフに示す。腫瘍特異的タンパク質ＭＡＧＥ-Ａ４に由来する４０アミノ酸（ａａ）の合成ロングペプチド（ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０）を単独でマウスに投与しても、同ペプチドに特異的なキラーＴ細胞やヘルパーＴ細胞は誘導されない。免疫増強剤であるＣｐＧオリゴＤＮＡ（Ｔｏｌｌ様受容体９アゴニスト）を同ペプチドと同時投与しても目的のＴ細胞は誘導されない。しかし、同ペプチドを疎水化多糖類の一種のＣＨＰとの複合体としてからＣｐＧオリゴＤＮＡと同時投与すれば、抗原特異的なキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞の誘導が明確に観察される。ＣＨＰ－ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０複合体のみの投与では、そのようなＴ細胞誘導は起こらない。このことから、疎水化多糖ＣＨＰと複合体化することで初めて、ロングペプチドワクチンは免疫増強剤であるＣｐＧオリゴＤＮＡの増強効果を最大限に享受できることが分かる。
　免疫増強剤としてＣｐＧオリゴＤＮＡに代わってポリＩＣ　ＲＮＡ（Ｔｏｌｌ様受容体３アゴニスト）を用いて図１と同様の試験を行った。やはり合成ロングペプチド単体よりもＣＨＰ-合成ロングペプチド複合体において免疫増強剤の効果は顕著であった（図２）。このことは、ＣＨＰ-合成ロングペプチド複合体の投与による免疫誘導を増強する免疫増強剤は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストなどの抗原提示細胞を活性化できるものであれば全て幅広く利用できることを示唆している。
　図２と同様の結果は、合成ロングペプチドをＭＡＧＥ-Ａ４タンパク質由来のｐ２６４：４０からｍＥＲＫ２タンパク質由来のｐ１２１：３７（３７ａａ）に変更しても再現された（図３）。このことは、ＣＨＰ-合成ロングペプチド複合体と免疫増強剤の同時投与による明確な免疫誘導は、特定の配列の合成ロングペプチドに限定されないことを示している。
　疎水化多糖のサイズと電荷がワクチンの性能に及ぼす効果を調べるために、図１と同様の試験を、ＣＨＰをＣＨＰ-ＮＨ２、ＣＨＰ-ＣＯＯＨ、またはＣＨＥＳＧに変更して行った（図４）。非イオン性のＣＨＰを化学修飾によりイオン性としたものがＣＨＰ-ＮＨ２とＣＨＰ-ＣＯＯＨである（表１）。ただし、ＣＨＰ-ＣＯＯＨは合成ロングペプチドとの複合体化後はゼータ電位が０に近く、事実上は非イオン性となっている。ＣＨＥＳＧは、糖鎖部分をグリコーゲンにすることで粒子径を大きくしたものである（表１）。試験の結果、ＣｐＧオリゴＤＮＡによる増強効果は、ＣＨＰ-ＮＨ２またはＣＨＥＳＧと複合体化したロングペプチドワクチンの投与群で明らかに減弱した。ＣＨＰ-ＣＯＯＨと複合体化したロングペプチドワクチン投与群では、ＣｐＧオリゴＤＮＡによる増強効果の減弱は顕著ではなかった。このことから、本発明に用いる疎水化多糖は、合成ロングペプチドとの複合体後に非イオン性で、粒子径は１８０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満程度という条件を満たすのが良いことが明らかになった。リポソームを用いる従来のワクチン抗原デリバリーシステムでは、サイズが大きいほど、または電荷を帯びているほどワクチンによる免疫誘導が優れると報告されている（非特許文献１４～１６）。しかし本発明の疎水化多糖の場合には、ロングペプチドとの複合体後のサイズが小さいほど、また複合体後に非イオン性であるのが良いことが分かり、従来のリポソームの場合とは全く異なることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１と同様の試験を、ロングペプチドの長さを４０ａａから８０ａａまたは１２０ａａに変更して行った（図５）。８０ａａまたは１２０ａａのロングペプチドの配列は、それぞれ４０ａａのロングペプチドの２回または３回繰り返しである。いずれの長さのロングペプチドとＣＨＰの複合体も目的のキラーＴ細胞応答を誘導したが、ＣｐＧオリゴＤＮＡによる増強効果はロングペプチドのアミノ酸長が長くなるにつれて減弱した。このことから、本発明に用いるロングペプチドの長さは１２０ａａ以下、好ましくは８０ａａ以下、より好ましくは４０ａａ以下であることが初めて明らかとなった。
　図５と同様の試験を、ロングペプチドをＭＡＧＥ-Ａ４タンパク質由来のものからｍＥＲＫ２タンパク質由来のものに変更して行った（図６）。図５と同様に、ＣｐＧオリゴＤＮＡによる増強効果はロングペプチドのアミノ酸長が長くなるにつれて減弱した。
　ＭＡＧＥ-Ａ４タンパク質を発現するマウス大腸がん細胞ＣＴ２６を移植した担がんマウスモデルにおいて、ＰＢＳ投与群と比較してＣＨＰ-ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０複合体とＣｐＧオリゴＤＮＡの同時投与群では有意な腫瘍増殖抑制効果が認められ（ｐ＜０．０００１）、ＭＡＧＥ-Ａ４　ｐ２６４：４０とＣｐＧオリゴＤＮＡの同時投与群に比べても増殖抑制効果は有意に優れていた（ｐ＜０．０５）（図７）。この結果は、図１で示した各ワクチンの抗原特異的Ｔ細胞を誘導する能力と良く合致する。
　ｍＥＲＫ２タンパク質を発現するマウス繊維肉腫細胞ＣＭＳ５ａを移植した担がんマウスモデルにおいても、ＰＢＳ投与群と比較してＣＨＰ-ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７複合体とＣｐＧオリゴＤＮＡの同時投与群で有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた（ｐ＜０．０３）（図８）。一方、ｍＥＲＫ２　ｐ１２１：３７とＣｐＧオリゴＤＮＡの同時投与群では、有意な増殖抑制効果は認められなかった。
　以上の結果は、合成ロングペプチド単体、合成ロングペプチドと免疫増強剤の同時投与、疎水化多糖-合成ロングペプチド複合体の単体の投与では、いずれも抗原特異的なキラーＴ細胞やヘルパーＴ細胞の誘導が不十分であり、がん治療用ワクチンとしての治療効果も期待できないことを示す一方で、疎水化多糖-合成ロングペプチド複合体と免疫増強剤の同時投与であれば、ワクチンが免疫増強剤の作用を最大限に享受し、抗原特異的Ｔ細胞の活性化と腫瘍に対する治療効果の発現を達成し得ることを明確に示している。また、本発明が効果を最大限に発揮するのに必要な疎水化多糖の物理化学的性質とロングペプチドのペプチド長を明らかにした。
　本実施形態によれば、がん治療効果が極めて高いがん治療用ワクチンを提供できた。

Claims (22)

  1. 腫瘍特異的抗原タンパク質及び／又は病原体由来抗原タンパク質に由来しＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープを同時に含む１種類以上の合成ロングペプチドと疎水化多糖類との複合体を含む薬剤と、１種類以上の免疫増強剤によって構成されるがん治療用ワクチン製剤。
  2. 前記の合成ロングペプチドがＴ細胞認識エピトープを少なくとも２つ以上含む２３～１２０アミノ酸から成るポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  3. 前記合成のロングペプチドは、全アミノ酸配列のうち２２個以下の連続するアミノ酸配列を用いた場合には、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞に免疫寛容、消耗、機能不全を生じ得ることを特徴とする請求項２に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  4. 前記の合成ロングペプチドがＴ細胞認識エピトープを少なくとも２つ以上含む２３～８０アミノ酸から成るポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  5. 前記の合成ロングペプチドがＴ細胞認識エピトープを少なくとも２つ以上含む２３～４０アミノ酸から成るポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  6. 前記のＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープが、腫瘍特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のがん治療用ワクチン製剤。
  7. 前記のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープが、腫瘍特異的抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のがん治療用ワクチン製剤。
  8. 前記の腫瘍特異的抗原タンパク質が、ＭＡＧＥファミリー、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＳＰＡＮＸファミリー、ＨＥＲ２、ＷＴ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＨＡＭＭまたはサバイビンから選ばれることを特徴とする請求項１７記載のがん治療用ワクチン製剤。
  9. 前記のＣＤ８陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープが、病原体由来タンパク質のアミノ酸配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のがん治療用ワクチン製剤。
  10. 前記のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープが、病原体由来タンパク質のアミノ酸配列の一部であることを特徴とする請求項１記載のがん治療用ワクチン製剤。
  11. 前記の病原体由来抗原タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＥＢウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴリンパ向性ウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルスから選ばれることを特徴とする請求項１記載のがん治療用ワクチン製剤。
  12. 前記の疎水化多糖類の構成多糖類がプルランまたはマンナンであることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  13. 前記の疎水化多糖類の疎水基がコレステロールであることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  14. 前記の疎水化多糖類が非イオン性であることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  15. 前記の疎水化多糖類と合成ロングペプチドとの複合体化後の粒子径が１８０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  16. 前記の疎水化多糖類と合成ロングペプチドとの複合体化後の粒子径が１００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  17. 前記の免疫増強剤が、Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストであることを特徴とする請求項１６に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  18. 前記のＴｏｌｌ様受容体のアゴニストが、ポリＩＣ　ＲＮＡまたはＣｐＧオリゴＤＮＡであることを特徴とする請求項１７に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  19. 前記の免疫増強剤が、抗原提示細胞を活性化する化学療法剤であることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  20. 前記の抗原提示細胞を活性化する化学療法剤が、タキサン系化合物またはアントラサイクリン系化合物であることを特徴とする請求項１９に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  21. 前記の免疫増強剤が、抗原提示細胞の免疫抑制活性獲得を防ぐ作用を有する薬剤であることを特徴とする請求項１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
  22. 前記の抗原提示細胞の免疫抑制活性獲得を防ぐ作用を有する薬剤がＪＡＫ／ＳＴＡＴの阻害物質またはＩＤＯの阻害物質である請求項２１に記載のがん治療用ワクチン製剤。
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