WO2022054207A1 - 複合体 - Google Patents

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WO2022054207A1
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cpg
group
modified
complex
nanogel
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PCT/JP2020/034346
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直純 原田
一成 秋吉
晋一 澤田
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ユナイテッド・イミュニティ株式会社
国立大学法人京都大学
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Definitions

  • the present invention relates to a complex or the like containing a modified polysaccharide.
  • TAM tumor-related macrophages
  • CpG oligonucleotides can stimulate innate immune receptors, thereby converting type 2 TAM to type M1 TAM. It is also possible to enhance susceptibility to other immunotherapies (immune checkpoint inhibitors, etc.). However, CpG oligonucleotides have problems in systemic administration (intravenous administration, etc.) in terms of pharmacokinetics and safety.
  • Hydrophobic polysaccharides such as cholesteryl pullulan can self-assemble to form nanogels, have high biocompatibility, function as protein carriers, and have the ability to decompose and suppress the aggregation of contained proteins, so that they can be complexed with proteins. It has been reported to be used as an antigen carrier (Non-Patent Document 1). In addition, cholesteryl pullulan has been found to selectively accumulate in TAM in tumors (Non-Patent Document 2), and is useful as a TAM selective delivery system.
  • the present inventor focused on complexing hydrophobic polysaccharides and CpG oligonucleotides while proceeding with research. Thereby, it is expected that the above-mentioned advantages of the hydrophobized polysaccharide can be imparted to the CpG oligonucleotide, and the above-mentioned problems of the CpG oligonucleotide can be supplemented.
  • CpG oligonucleotides and hydrophobized polysaccharides cannot be complexed as they are.
  • An object of the present invention is to provide a technique for complexing a CpG oligonucleotide and a hydrophobic polysaccharide.
  • the present inventor has focused on modifying and modifying the CpG oligonucleotide as a result of diligent research in view of the above problems.
  • the present inventor has solved the above-mentioned problems if it is a complex containing a modified CpG oligonucleotide containing a hydrophobic group A having a sterol skeleton and a modified polysaccharide containing a hydrophobic group B. I found out what I could do.
  • the present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A complex containing a modified CpG oligonucleotide containing a hydrophobic group A having a sterol skeleton and a modified polysaccharide containing a hydrophobic group B.
  • Item 2 The complex according to Item 1, wherein the constituent CpG oligonucleotide of the modified CpG oligonucleotide contains at least one selected from the group consisting of a class A CpG oligonucleotide and a class B CpG oligonucleotide.
  • the hydrophobic group A is a cholesterol-derived group, a cholestanol-derived group, a lanosterol-derived group, an ergosterol-derived group, a ⁇ -sitosterol-derived group, a campesterol-derived group, a stigmasterol-derived group, and a brassicasterol.
  • Item 2. The complex according to Item 1 or 2, which comprises at least one selected from the group consisting of derived groups.
  • Item 4 The complex according to any one of Items 1 to 3, wherein the modified CpG oligonucleotide has 8 to 50 constituent nucleotides.
  • Item 5 The complex according to any one of Items 1 to 4, wherein the constituent polysaccharide of the modified polysaccharide comprises at least one selected from the group consisting of pullulan, dextran, amylose, amylopectin, and mannan.
  • Item 6. The complex according to any one of Items 1 to 5, wherein the constituent polysaccharide of the modified polysaccharide contains pullulan.
  • Item 7. The complex according to any one of Items 1 to 6, wherein the hydrophobic group B contains a hydrophobic group having a sterol skeleton.
  • Item 8 The complex according to any one of Items 1 to 7, wherein the modified polysaccharide has a weight average molecular weight of 5000 to 2,000,000.
  • Item 9 The complex according to any one of Items 1 to 8, which contains 0.1 to 10 mol of the modified polysaccharide with respect to 1 mol of the modified CpG oligonucleotide.
  • Item 10. The complex according to any one of Items 1 to 9, which is a nanogel particle.
  • Item 11 A reagent containing the complex according to any one of Items 1 to 10.
  • Item 12 A pharmaceutical product containing the complex according to any one of Items 1 to 10.
  • Item 13 The pharmaceutical agent according to Item 12, which is an immunostimulatory agent, an anticancer agent, an adjuvant, or an antiviral agent.
  • Test Example 1-6 the chromatogram of the HPLC analysis result in the case of Chol-CpG (K3): 20uM and CHP nanogel: 20uM is shown.
  • Test Example 1-6 the compounding rate of the HPLC analysis results is shown when the final concentration of Chol-CpG (K3) is 20uM and the final concentration of CHP nanogel is changed in the range of 0-40uM.
  • the particle size distribution by DLS measurement of Test Example 1-7 is shown.
  • the TEM observation image of Test Example 1-8 is shown.
  • the chromatogram of the HPLC analysis result in Test Example 2-4 is shown.
  • the compounding rate of the HPLC analysis results in Test Example 2-4 is shown.
  • the confocal laser scanning microscope observation image of Test Example 3-2 is shown.
  • the scattergram of the flow cytometry analysis of Test Example 3-3 is shown.
  • the ELISA result of Test Example 4 is shown.
  • the present invention in one embodiment, comprises a modified CpG oligonucleotide containing a hydrophobic group A having a sterol skeleton and a modified polysaccharide containing a hydrophobic group B (as used herein, "the present invention”. It may be referred to as “complex of invention”). This will be described below.
  • the modified CpG oligonucleotide is a compound modified by the CpG oligonucleotide and is not particularly limited as long as it contains a hydrophobic group A having a sterol skeleton as a modifying group.
  • CpG oligonucleotide that is, the CpG oligonucleotide before modification
  • the CpG oligonucleotide before modification one containing a dinucleotide (5'-CpG-3') motif (CpG motif) of unmethylated cytosine-guanine.
  • CpG motif a dinucleotide (5'-CpG-3') motif of unmethylated cytosine-guanine.
  • CpG oligonucleotides can be used as a vaccine adjuvant because they induce an adaptive immune response via TLR (Toll-like receptor).
  • a CpG oligonucleotide can contain at least one CpG motif and can also contain multiple CpG motifs.
  • the number of constituent nucleotides of the CpG oligonucleotide is not particularly limited, but is, for example, 8 to 50 bases, preferably 8 to 40 bases, more preferably 8 to 30 bases, still more preferably 10 to 25 bases, still more preferably 15 to 25 bases. Bases, especially preferably 18 to 25 bases and the like.
  • CpG oligonucleotides are Class A (D type), Class B (K type), Class C, Class P, and Class S based on sequence, secondary structure, effects on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), etc. are categorized.
  • CpG oligonucleotides preferably include class A CpG oligonucleotides, class B CpG oligonucleotides, and the like.
  • the internucleotide bond of the CpG oligonucleotide can be a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond. Phosphorothioate binding can improve nuclease resistance.
  • Class B CpG oligonucleotides are usually linear structures with a phosphorothioate skeleton and typically do not form higher order structures.
  • Class A CpG oligonucleotides usually have a phosphodiester bond in the center, and the poly-G motifs at both ends form a higher-order structure called G-tetrad.
  • CpG oligonucleotides are as follows. Class A: D35-CpG, ODN1585, ODN2216, ODN2336, etc .; Class B: K3-CpG, ODNW006, ODN D-SL01, ODN1668, OND1826, OND2006 (CpG7909, PF-3512676), ODN2007, ODN684, etc.; Class C: ODN D-SL03, ODN 2395, ODN M362, etc.
  • CpG-28, CpG-685 (GNKG-168), CpG-ODNC274, KSK-13 (KSK-CpG), CpGODN10104 (CpG-10104), CpGODN-1585, ODN-5890
  • Examples include 1018-ISS and EMD-1201081 (HYB-2055, IMO-2055).
  • the CpG oligonucleotide As the CpG oligonucleotide, a commercially available product can be used, or a product obtained according to a known production method can be used.
  • Hydrophobic group A is a hydrophobic group having a sterol skeleton, and is not particularly limited as long as it is.
  • the sterol skeleton is an alcohol in which a hydroxy group is attached to the cyclopentahydrophenanthrene ring represented by the formula I.
  • the symbols A to D in Formula I represent each ring that constitutes the cyclopentahydrophenanthrene ring.
  • the cyclopentahydrophenanthrene ring may have a double bond, and the position where the hydroxyl group is bonded is not particularly limited.
  • the hydrophobic group A is a compound in which the sterol skeleton is modified, for example, the ring-constituting carbon is substituted with a hydrocarbon group (for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms).
  • the group derived from is mentioned.
  • the "derived group” refers to a group obtained by removing a functional group such as a hydrogen atom or a hydroxyl group in a certain compound.
  • Hydrophobic groups A include, for example, cholesterol-derived groups, cholestanol-derived groups, lanosterol-derived groups, ergosterol-derived groups, ⁇ -sitosterol-derived groups, campesterol-derived groups, stigmasterol-derived groups, and brassicasterols.
  • Examples include groups derived from sterol. Among these, a cholesterol-derived group, a cholestanol-derived group, a lanosterol-derived group, an ergosterol-derived group, and other sterol-derived groups are preferable, and a cholesterol-derived group is more preferable.
  • the number of constituent nucleotides of the modified CpG oligonucleotide is not particularly limited, but is, for example, 8 to 50 bases, preferably 8 to 40 bases, more preferably 8 to 30 bases, still more preferably 10 to 25 bases, still more preferably 15 to. It is 25 bases, particularly preferably 18 to 25 bases and the like.
  • the number of hydrophobic groups A contained in the modified CpG oligonucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 8.
  • the number is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, still more preferably 1 to 2, and even more preferably 1.
  • the number of hydrophobic groups A per 20 constituent nucleotides of the modified CpG oligonucleotide is preferably 1 to 8, more preferably 1 to 5, still more preferably 1 to 3, still more preferably 1 to 2, in particular. It is preferably 1.
  • the linking position of the hydrophobic group A in the modified CpG oligonucleotide is not particularly limited, and can be a terminal (5'end or 3'end) portion or a non-terminal portion (for example, on a base).
  • the connecting position is preferably the end.
  • Hydrophobic group A can be linked directly or indirectly (eg, via a linker) to a CpG oligonucleotide.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include a linker in which a plurality of ethylene glycols are linked (for example, TEG linker, PEG linker, etc.), an alkyl linker, dSpacer, alkynyl dSpacer, a dipropyl disulfide TEG linker, and the like.
  • the number of main chain constituent atoms (carbon atom, oxygen atom, nitrogen atom, sulfur atom, etc.) of the linker is not particularly limited, but is, for example, 1 to 30, preferably 2 to 24, and more preferably 4 to 4. 18, more preferably 8 to 15.
  • the modified CpG oligonucleotide can be synthesized according to or according to a known modification method of the oligonucleotide.
  • the modified CpG oligonucleotide can be one type alone or a combination of two or more types.
  • the modified polysaccharide is a compound obtained by modifying the polysaccharide, and is not particularly limited as long as it contains a hydrophobic group B as a modifying group.
  • the polysaccharide constituting the modified polysaccharide is not particularly limited as long as the sugar residue is a glycosidic-bonded polymer.
  • the sugar residue constituting the polysaccharide for example, a residue derived from a monosaccharide such as glucose, mannose, galactose, fucose, or a saccharide such as a disaccharide or an oligosaccharide can be adopted.
  • the sugar residue may be a 1,2-, 1,3-, 1,4- or 1,6-glycosidic bond, and the bond may be either an ⁇ - or ⁇ -type bond.
  • the polysaccharide may be either linear or branched.
  • a glucose residue is preferable, and as the polysaccharide, for example, naturally or synthetically derived pullulan, dextran, amylose, amylopectin, mannan and the like, preferably pullulan, mannan and the like, more preferably pullulan and the like are used.
  • the weight average molecular weight of the polysaccharide is not particularly limited as long as the modified polysaccharide can form a nanogel, but is, for example, 5,000 to 2,000,000.
  • the weight average molecular weight is preferably 10,000 to 1,000,000, more preferably 20,000 to 500,000, still more preferably 40,000 to 250,000, and even more preferably 80,000 to 125,000.
  • polysaccharide a commercially available product can be used, or a polysaccharide obtained according to a known production method can be used.
  • Hydrophobic group B is a group having hydrophobicity, and is not particularly limited as long as the modified polysaccharide can form a nanogel.
  • Examples of the hydrophobic group B include a hydrophobic group having a sterol skeleton, a hydrocarbon group and the like, and particularly preferably a hydrophobic group having a sterol skeleton.
  • the hydrophobic group having a sterol skeleton is the same as the description in the hydrophobic group A.
  • the hydrocarbon group is not particularly limited, and is, for example, a chain (preferably linear) hydrocarbon group (preferably an alkyl group) having 8 to 50 carbon atoms (preferably 10 to 30, more preferably 12 to 20). Can be mentioned.
  • the weight average molecular weight of the modified polysaccharide is not particularly limited as long as the modified polysaccharide can form a nanogel, but is, for example, 5,000 to 2,000,000.
  • the weight average molecular weight is preferably 10,000 to 1,000,000, more preferably 20,000 to 500,000, still more preferably 40,000 to 250,000, and even more preferably 80,000 to 125,000.
  • the number of hydrophobic groups B contained in the modified polysaccharide is not particularly limited as long as the modified polysaccharide can form a nanogel, for example, 1 to 10 per 100 sugar residues constituting the polysaccharide, preferably 1 to 10. ⁇ 5 pieces.
  • Hydrophobic group B can be directly or indirectly linked to the polysaccharide (eg, via a linker).
  • the primary hydroxyl group of a sugar unit of, for example, 1 to 10 (preferably 1 to 5) per 100 sugar residues constituting the polysaccharide is represented by the formula II: -O- (CH 2 ). ) M CONH (CH 2 ) n NH-CO-O-R (II) (In the formula, R indicates a hydrophobic group or a hydrocarbon group having a sterol skeleton; m indicates 0 or 1; n is arbitrary. The one represented by (indicating a positive integer) is preferable. n is preferably 1-8.
  • Modified polysaccharides can be synthesized according to or according to known methods (eg, WO 00/12564). The following method is given as an example. First, a hydroxyl group-containing hydrocarbon or sterol having 12 to 50 carbon atoms and a diisocyanate compound represented by 0CN-R 1 NCO (in the formula, R 1 is a hydrocarbon group having 1 to 50 carbon atoms). To produce an isocyanate group-containing hydrophobic compound containing an isocyanate group in which one molecule of a hydroxyl group-containing hydrocarbon having 12 to 50 carbon atoms or a sterol has reacted.
  • the obtained isocyanato group-containing hydrophobic compound is further reacted with the polysaccharide to produce a hydrophobic group-containing polysaccharide containing a hydrocarbon group or a steryl group having 12 to 50 carbon atoms as the hydrophobic group. ..
  • the obtained reaction product can be purified with a ketone solvent to produce a high-purity hydrophobic group-containing polysaccharide.
  • the modified polysaccharide can be one kind alone or a combination of two or more kinds.
  • the ratio of the modified CpG oligonucleotide to the modified polysaccharide in the complex of the present invention is not particularly limited.
  • the complex of the present invention contains, for example, 0.1 to 10 mol parts, preferably 1 to 7 mol parts, and more preferably 2 to 4 mol parts of the modified polysaccharide with respect to 1 mol part of the modified CpG oligonucleotide.
  • the complex of the present invention can be nanogel particles.
  • “Nanogel” refers to polymer gel nanoparticles having a hydrogel structure.
  • Hydrogel is a three-dimensional network structure formed by cross-linking a hydrophilic polymer and swelling with water.
  • the modified polysaccharide self-assembles through the physical cross-linking formed based on the hydrophobic interaction by the hydrophobic group B to form a three-dimensional network structure. is doing.
  • the modified CpG oligonucleotide is preferably present inside the nanogel particles.
  • the shape of the nanogel particles is not particularly limited, but is usually spherical.
  • the weight average particle size of the complex of the present invention is, for example, 100 nm or less, preferably 10 to 100 nm, more preferably 15 to 70 nm, and further preferably 20 to 50 nm.
  • the particle size can be measured by a dynamic light scattering method.
  • the complex of the present invention can contain other substances other than modified CpG oligonucleotides and modified polysaccharides.
  • other substances include proteins, peptides, nucleic acids, saccharides, low molecular weight compounds, high molecular weight compounds, inorganic substances, and the like, as well as complexes thereof.
  • the content of other substances is, for example, 0 to 10000 parts by mass, 0 to 1000 parts by mass, 0 to 500 parts by mass, 0 to 100 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total content of the modified CpG oligonucleotide and the modified polysaccharide. Parts, 0 to 50 parts by mass, or 0 to 10 parts by mass.
  • the complex of the present invention can be produced by mixing a modified CpG oligonucleotide solution and a modified polysaccharide solution.
  • Each solution can be prepared by dissolving a modified CpG oligonucleotide or a modified polysaccharide in a solvent.
  • a solvent for example, water or an organic solvent such as DMSO can be used.
  • the modified polysaccharide solution can usually be prepared using water as the solvent. At this time, it is preferable to use a buffer solution such as PBS instead of water.
  • the modified CpG oligonucleotide solution can be prepared by appropriately selecting a solvent according to the type thereof. For example, A-type CpG oligonucleotides can usually be prepared using water as the solvent, and B-type CpG oligonucleotides can usually be prepared using an organic solvent such as DMSO as the solvent. Can be prepared.
  • the concentration of the modified CpG oligonucleotide in the mixed solution obtained by mixing the modified CpG oligonucleotide solution and the modified polysaccharide solution is not particularly limited, but is preferably 1 to 50 uM, for example, from the viewpoint of the formation efficiency of nanogel particles. Is 2 to 40 uM, more preferably 5 to 30 uM, and even more preferably 8 to 25 nM.
  • the concentration of the modified polysaccharide in the mixed solution is not particularly limited, but is, for example, 5 to 100 uM, preferably 5 to 80 uM, and more preferably 8 to 50 uM from the viewpoint of the formation efficiency of nanogel particles and the like.
  • the molar ratio of the modified CpG oligonucleotide to the modified polysaccharide in the mixed solution is not particularly limited, but from the viewpoint of the formation efficiency of nanogel particles and the like, the modified polysaccharide is, for example, 0.1 to 1 mol with respect to 1 mol of the modified CpG oligonucleotide. It is 4 mol, preferably 0.2 to 3 mol, more preferably 0.5 to 2.5 mol, still more preferably 0.8 to 2.2 mol.
  • the former method is more preferable.
  • the latter method can be performed according to or according to a known method.
  • the ultrasonic treatment can be performed, for example, by fixing a plastic tube containing a mixed solution on water in a bath-type ultrasonic tank and irradiating it with ultrasonic waves.
  • the conditions of ultrasonic treatment are not particularly limited, but are, for example, 10 to 40 ° C (preferably 20 to 35 ° C), 10 to 50 kHz (preferably 20 to 40 kHz), 30 to 200 W (preferably 70 to 150 W), and 2 to. 30 minutes (preferably 5 to 15 minutes).
  • the modified polysaccharide solution is first sonicated (eg, 2-30 seconds, preferably 5-15 seconds), then mixed with the modified CpG oligonucleotide and further sonicated. It is preferable to carry out the treatment (for example, 2 to 30 minutes, preferably 5 to 15 minutes).
  • the complex of the present invention contains a modified CpG oligonucleotide
  • various effects of the CpG oligonucleotide for example, TLR stimulating action and various actions based on it (for example, inflammatory cytokine production promoting action, type I interferon production promoting action) Etc.)
  • the compound of the present invention can be used as an active ingredient of a drug, a reagent, etc. (sometimes referred to as "the drug of the present invention" in the present specification), specifically, for various uses based on TLR stimulation.
  • it can be used as an active ingredient such as an immunostimulator, an anticancer agent, an antiviral agent, and an adjuvant (for example, a vaccine adjuvant).
  • the agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains the complex of the present invention, and may further contain other components if necessary.
  • the other components are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable components.
  • Other components include additives as well as components having a pharmacological action. Additives include, for example, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, etc. Examples thereof include a chelating agent.
  • the mode of use of the drug of the present invention is not particularly limited, and an appropriate mode of use can be adopted according to the type thereof.
  • the agent of the present invention can be used, for example, in vitro (for example, added to the medium of cultured cells) or in vivo (for example, administered to animals). You can also.
  • the application target of the agent of the present invention is not particularly limited, and examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer.
  • examples of cells include animal cells and the like.
  • the type of cell is also not particularly limited, and for example, blood cells, hematopoietic stem cells / precursor cells, spouses (sperm, eggs), fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, nerve cells, hepatocytes, keratin-producing cells, muscle cells , Epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells and the like.
  • the target cancer is not particularly limited, and for example, leukemia (including chronic lymphocytic leukemia and acute lymphocytic leukemia) and lymphoma (including chronic lymphocytic leukemia and acute lymphoma).
  • leukemia including chronic lymphocytic leukemia and acute lymphocytic leukemia
  • lymphoma including chronic lymphocytic leukemia and acute lymphoma
  • Non-Hodgkin lymphoma Hodgkin lymphoma, T-cell lymphoma, B-cell lymphoma, Berkit lymphoma, malignant lymphoma, diffuse lymphoma, follicular lymphoma), myeloma (including multiple myeloma), breast cancer, colon cancer , Kidney cancer, gastric cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, liver cancer, head and neck squamous epithelial cancer, skin cancer, malignant melanoma, urinary tract cancer, prostate cancer, villous cancer, Pharyngeal cancer, laryngeal cancer, kyphoma, male germoma, endometrial hyperplasia, endometriosis, germoma, fibrosarcoma, capsicum, hemangiomas, spongy hemangiomas, hemangioblastomas, retinal blastomas, Stellate cell
  • the agent of the present invention can be used in any pharmaceutical form, for example, tablets (including medially disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly-like drops, etc.), rounds, granules, fine granules, powders, etc.
  • Oral preparation forms such as hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspending agents, and syrups), jelly preparations, and injection preparations (for example, drip injection preparations (for example, intravenous drip injection preparations)).
  • Etc. intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection), external preparation (eg, ointment, pap, lotion), suppository inhalation, eye, eye ointment, nasal drop
  • external preparation eg, ointment, pap, lotion
  • suppository inhalation eye, eye ointment, nasal drop
  • Parenteral pharmaceutical forms such as agents, ear drops, and liposomes can be taken.
  • the route of administration of the agent of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained, and is enteral administration such as oral administration, tube feeding, enema administration; intravenous administration, transarterial administration, intramuscular administration, etc. Examples thereof include parenteral administration such as intracardiac administration, subcutaneous administration, intradermal administration, and intraperitoneal administration.
  • the content of the active ingredient in the drug of the present invention depends on the mode of use, application target, state of application target, etc., and is not limited, but is, for example, 0.0001 to 100% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight. Can be%.
  • the dose is not particularly limited as long as it is an effective amount that exerts a medicinal effect, and usually, the weight of the active ingredient is generally 0.1 to 0.1 per day in the case of oral administration. 1000 mg / kg body weight, preferably 0.5 to 500 mg / kg body weight per day, and 0.01 to 100 mg / kg body weight per day, preferably 0.05 to 50 mg / kg body weight in the case of parenteral administration. ..
  • the above dose may be appropriately increased or decreased depending on the age, pathological condition, symptom and the like.
  • Test example 1 Complex test of CHP nanogel and Chol-CpG (K3) ⁇ Test Example 1-1.
  • Preparation of CHP> Cholesterol-modified pullulan (CHP) was prepared by introducing 1.2 cholesterols per 100 monosaccharides into pullulan having a weight average molecular weight of 450,000 according to the description of the previous report (Macromolecules 1993, 23, 3062-3068).
  • Example 1-3 Preparation of CHP nanogel solution> CHP was added to PBS at 0-20 uM, and the mixture was stirred and dissolved at 25 ° C. for 15 hours with a stirrer, and then ultrasonic waves were intermittently irradiated for 6 minutes with a probe-type ultrasonic irradiator. After centrifuging this solution at 25 ° C. and 20000 g for 30 minutes, the supernatant was passed through a 0.22 um filter and sterilized by filtration. In the examples, the CHP solution was prepared by this method regardless of the type of solvent. The weight average molecular weight of CHP nanogel was 450,000 and converted to molar concentration.
  • Figure 1 shows the results (chromatogram) for Chol-CpG (K3): 20uM and CHP nanogel: 20uM.
  • chromatogram for Chol-CpG (K3): 20uM and CHP nanogel: 20uM.
  • blue line of CHP nanogel (20uM) only, only a slight peak due to light scattering of nanogel was detected around 6 minutes.
  • red line of Chol-CpG (K3) (20uM) only, a large single peak derived from Chol-CpG (K3) was detected around 10 minutes.
  • Figure 2 shows the results (composite ratio) when the final concentration of Chol-CpG (K3) was 20uM and the final concentration of CHP nanogel was changed in the range of 0-40uM.
  • the area of the peak derived from Chol-CpG (K3) that is not complexed with the nanogel around 10 minutes is analyzed, and the result of graphing the compounding rate with the nanogel is shown.
  • the peak derived from uncombined Chol-CpG (K3) decreases, and the molar ratio of nanogel with CHP nanogel concentration of 40uM to Chol-CpG (K3) is 2: 1. Under the condition of 1, the compounding ratio was almost 100%, and even under the condition of 1: 1 the compounding ratio was about 95%.
  • the average particle size was about 33 nm for the CHP nanogel alone (final concentration 20uM) and about 39 nm for the composite sample.
  • the particle size of the composite sample was several nm larger than that of the CHP nanogel alone, but no significant increase in particle size due to aggregate formation was detected.
  • TEM Physical characteristic evaluation of complex
  • the complex prepared with Chol-CpG (K3): 20uM and CHP nanogel: 20uM in Test Example 1-5 was observed with a transmission electron microscope (TEM).
  • TEM transmission electron microscope
  • a 10uL complex sample was cast on an elastic carbon support membrane for TEM observation, allowed to stand for 10 minutes, and then the liquid was sucked up with a filter paper.
  • a 10 uL phosphotungstic acid aqueous solution was cast on the support film and allowed to stand for 1 minute for staining, then the staining solution was absorbed with a filter paper, dried under reduced pressure overnight, and TEM observation was performed.
  • Test example 2 Complex test of CHP nanogel and Chol-CpG (D35) ⁇ Test Example 2-1. Preparation of Chol-CpG (D35)> A triethylene glycol linker is used at the 5'end of the D35 CpG oligonucleotide (SEQ ID NO: 2: 5'-g ⁇ gtgcatcgatgcagggg ⁇ g ⁇ g, ⁇ indicates a phosphorothioate bond, otherwise it is a phosphodiester bond). Cholesterol-modified D35 CpG (Chol-CpG (D35)), which is linked with cholesterol, was synthesized by Gene Design.
  • the chromatogram is shown in FIG.
  • the chromatogram (green line) of Chol-CpG (D35) (20uM) only multiple broad peaks derived from Chol-CpG (D35) were detected around 8-15 minutes.
  • Chol-CpG (D35) showed a sharp single peak around 10 minutes, whereas Chol-CpG (D35) showed multiple broad peaks, so Chol-CpG (D35) was in PBS. It is possible that they form multiple types of aggregates.
  • the molar ratio of CHP nanogel and Chol-CpG (D35) increased from 1.25: 20 to 40:20 when the molar ratio of nanogel was increased (light green line-dark blue line), it was around 6 minutes.
  • Figure 6 shows the compounding rate.
  • the area of the peak derived from Chol-CpG (D35) that was not compounded with the nanogel around 8-15 minutes was analyzed, and the compounding rate with the nanogel was graphed.
  • the peak derived from uncombined Chol-CpG (D35) decreases, and the molar ratio of nanogel with CHP nanogel concentration of 40 uM to Chol-CpG (D35) is 2: 1. Under the condition of 1, the compounding ratio was almost 100%, and even under the condition of 1: 1 the compounding ratio was about 90%.
  • Test example 3 Interaction between CpG / CHP nanogel complex and cells
  • Rhodamine-modified CHP CHP-Rh
  • 3'end-modified Fluorescein-modified Chol Complexes were prepared using -CpG (5'-chol, 3'-FAM CpG) and their interaction with mouse macrophage-like cells (RAW264.7) was evaluated by confocal laser scanning microscopy and flow cytometer.
  • Example 3-1 Preparation of CHP-Rh nanogel / 5'-chol, 3'-FAM CpG complex> CHP-Rh nanogel / water (10mg / mL) 90uL under ultrasonic irradiation (28kHz, 100W)) and heat-treated at 90 ° C for 5 minutes 5'-chol, 3'-FAM CpG (K3 and D35) / water (200uM) was added to 10uL, and ultrasonic irradiation was continued for 5 minutes. Then, 10xPBS was added while irradiating with ultrasonic waves, and ultrasonic irradiation was performed for another 5 minutes to prepare a complex in which the solvent was 1xPBS.
  • Example 3-2 Observation with a confocal laser scanning microscope> A RAW264.7 suspension (medium: DMEM + 10% FBS) was seeded in a glass bottom dish at 5.0x10 5 cells / mL in an amount of 190 uL, and precultured overnight. After culturing, add 10 uL of CHP-Rh nanogel / 5'-chol, 3'-FAM CpG (K3 and D35) complex solution (nanogel and CpG final concentration 1uM), and incubate at 37 ° C for 4 hours in a CO 2 incubator. Placed. After standing, the medium was removed and washed with PBS, and then observation was performed using a confocal laser scanning microscope (LSM510META manufactured by Zeiss).
  • LSM510META manufactured by Zeiss
  • Test example 4 CpG activity evaluation 180 uL of RAW264.7 suspension (medium: DMEM + 10% FBS) was seeded at 2.5x10 5 cells / mL on a 96-well plate, and precultured overnight. After culturing, 20 uL of each sample (Table 3) was added to each well to the concentration shown in Table 3, mixed, and cultured in a CO 2 incubator for 2 days. cGAMP, known as an agonist of the STING receptor, was included in the sample as a positive control.
  • the culture supernatant of each well was collected, diluted 5-fold with blocking buffer as an ELISA sample, and the TNF-alpha concentration of the culture supernatant was measured according to the protocol of Mouse TNF-alpha ELISA kit (manufactured by Invitrogen). did.

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Abstract

CpGオリゴヌクレオチドと疎水化多糖類とを複合体化する技術を提供することを課題とし、該課題を、ステロール骨格を有する疎水性基Aを含む修飾CpGオリゴヌクレオチド、及び疎水性基Bを含む修飾多糖類を含有する、複合体、により解決する。

Description

複合体
　本発明は、修飾多糖類を含有する複合体等に関する。
　がんの悪性度を左右する因子として、がん組織中に存在する免疫細胞、特にマクロファージ（腫瘍関連マクロファージ、略称TAM）の重要性が指摘されている。TAMには免疫刺激性のM1型と免疫抑制性のM2型が存在することが知られており、M2型TAMはがんに対する免疫的攻撃を減弱することで、がんの悪性化や増大を助長する。免疫抑制性のM2型TAMを免疫刺激性のM1型TAMに変換することができれば、がんに対する免疫的攻撃を増強し、がんの悪性化や増大を抑制できる。
　CpGオリゴヌクレオチドは、自然免疫受容体を刺激することができ、それにより2型TAMをM1型TAMに変換することができる。また、他の免疫療法（免疫チェックポイント阻害薬等）への感受性を増強することも可能である。しかし、CpGオリゴヌクレオチドは、体内動態や安全性の面で全身投与（静脈内投与等）に問題がある。
　コレステリルプルラン等の疎水化多糖類は、自己組織化してナノゲルを構成することができ、高い生体適合性、タンパク質キャリアとして機能、内包タンパク質の分解及び凝集抑制能を有するので、タンパク質と複合体化して抗原キャリアとして使用することが報告されている（非特許文献１）。また、コレステリルプルランは、腫瘍内のTAMに選択的に蓄積することが分かっており（非特許文献２）、TAM選択的デリバリーシステムとして有用である。
Muraoka, D. et al., ACS Nano, 8 (9), 9209-9218, 2014 Muraoka D. et al., J Clin Invest. 129(3):1278-1294, 2019
　本発明者は、研究を進める中で、疎水化多糖類とCpGオリゴヌクレオチドとを複合体化することに着目した。これにより、疎水化多糖類の上記利点をCpGオリゴヌクレオチドに付与することができ、CpGオリゴヌクレオチドの上記問題点を補うことができると期待される。しかしながら、CpGオリゴヌクレオチドと疎水化多糖類とは、そのままでは複合体化できない。
　本発明は、CpGオリゴヌクレオチドと疎水化多糖類とを複合体化する技術を提供することを課題とする。
　疎水化多糖類と他の物質との複合体化が困難な場合、一般的には、デリバリーキャリアである疎水化多糖類の方を改変や修飾するなどして、複合体化を図ることが行われる。このような背景の下、本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、CpGオリゴヌクレオチドの方を改変や修飾することに着目した。本発明者はさらに研究を進めた結果、ステロール骨格を有する疎水性基Aを含む修飾CpGオリゴヌクレオチド、及び疎水性基Bを含む修飾多糖類を含有する、複合体、であれば上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　ステロール骨格を有する疎水性基Aを含む修飾CpGオリゴヌクレオチド、及び疎水性基Bを含む修飾多糖類を含有する、複合体。
　項２．　前記修飾CpGオリゴヌクレオチドの構成CpGオリゴヌクレオチドがクラスA CpGオリゴヌクレオチド、及びクラスB CpGオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含む、項１に記載の複合体。
　項３．　前記疎水性基Aがコレステロール由来の基、コレスタノール由来の基、ラノステロール由来の基、エルゴステロール由来の基、β－シトステロール由来の基、カンペステロール由来の基、スティグマステロール由来の基、及びブラシカステロール由来の基からなる群より選択される少なくとも1種を含む、項１又は２に記載の複合体。
　項４．　前記修飾CpGオリゴヌクレオチドの構成ヌクレオチド数が8～50である、項１～３のいずれかに記載の複合体。
　項５．　前記修飾多糖類の構成多糖類がプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、及びマンナンからなる群より選択される少なくとも1種を含む、項１～４のいずれかに記載の複合体。
　項６．　前記修飾多糖類の構成多糖類がプルランを含む、項１～５のいずれかに記載の複合体。
　項７．　前記疎水性基Bがステロール骨格を有する疎水性基を含む、項１～６のいずれかに記載の複合体。
　項８．　前記修飾多糖類の重量平均分子量が5000～2,000,000である、項１～７のいずれかに記載の複合体。
　項９．　前記修飾CpGオリゴヌクレオチド1モル部に対して、前記修飾多糖類0.1～10モル部を含有する、項１～８のいずれかに記載の複合体。
　項１０．　ナノゲル粒子である、項１～９のいずれかに記載の複合体。
　項１１．　項１～１０のいずれかに記載の複合体を含有する、試薬。
　項１２．　項１～１０のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬。
　項１３．　免疫賦活剤、抗がん剤、アジュバント、又は抗ウイルス剤である、項１２に記載の医薬。
　本発明によれば、CpGオリゴヌクレオチドと疎水化多糖類とを複合体化する技術を提供することができる。
試験例1-6において、Chol-CpG(K3): 20uM且つCHP nanogel: 20uMの場合のHPLC分析結果のクロマトグラムを示す。 試験例1-6において、Chol-CpG(K3)の終濃度を20uMとし、CHPナノゲル終濃度を0-40uMの範囲で変化させた場合のHPLC分析結果の複合化率を示す。 試験例1-7のDLS測定による粒度分布を示す。 試験例1-8のTEM観察像を示す。 試験例2-4における、HPLC分析結果のクロマトグラムを示す。 試験例2-4における、HPLC分析結果の複合化率を示す。 試験例3-2の共焦点レーザー顕微鏡観察画像を示す。 試験例3-3のフローサイトメトリー解析のスキャッタグラムを示す。 試験例4のELISA結果を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．複合体
　本発明は、その一態様において、ステロール骨格を有する疎水性基Aを含む修飾CpGオリゴヌクレオチド、及び疎水性基Bを含む修飾多糖類を含有する、複合体（本明細書において、「本発明の複合体」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　修飾CpGオリゴヌクレオチドは、CpGオリゴヌクレオチドが修飾してなる化合物であって、修飾基としてステロール骨格を有する疎水性基Aを含む限り、特に制限されない。
　修飾CpGオリゴヌクレオチドを構成するCpGオリゴヌクレオチド（すなわち、修飾前のCpGオリゴヌクレオチド）としては、非メチル化シトシン-グアニンのジヌクレオチド（5’-CpG-3’）モチーフ（CpGモチーフ）を含有する一本鎖のオリゴヌクレオチドである限り、特に制限されない。CpGオリゴヌクレオチドは、TLR（Toll-like receptor）を介して獲得免疫反応を誘導することから、ワクチンアジュバントとして使用可能であることが知られている。CpGオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのCpGモチーフを含むものであることができ、複数のCpGモチーフを含むものであることもできる。
　CpGオリゴヌクレオチドの構成ヌクレオチド数は、特に制限されないが、例えば8～50塩基、好ましくは8～40塩基、より好ましくは8～30塩基、さらに好ましくは10～25塩基、よりさらに好ましくは15～25塩基、とりわけ好ましくは18塩基～25塩基等である。
　CpGオリゴヌクレオチドは、配列、二次構造、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）に対する影響等に基づいて、クラスA（Dタイプ）、クラスB（Kタイプ）、クラスC、クラスP、及びクラスSに分類される。CpGオリゴヌクレオチドとしては、これらの中でも、好ましくはクラスA CpGオリゴヌクレオチド、クラスB CpGオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
　CpGオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合であることができ、またホスホロチオエート結合である事ができる。ホスホロチオエート結合によりヌクレアーゼ耐性を向上させることが可能である。クラスB CpGオリゴヌクレオチドは、通常、ホスホロチオエート骨格をもつlinearな構造であり、典型的には高次構造を形成しない。クラスA CpGオリゴヌクレオチドは、通常、中心にホスホジエステル結合を持ち、両端のポリ-G モチーフがG-tetradという高次構造を形成する。
　CpGオリゴヌクレオチドの具体例は以下の通りである。
クラスA：D35-CpG、ODN1585、ODN2216、ODN2336等；
クラスB：K3-CpG、ODNBW006、ODN D－SL01、ODN1668、OND1826、OND2006（CpG7909、PF-3512676）、ODN2007、ODN684等；
クラスC：ODN D-SL03、ODN 2395、ODN M362等が挙げられる。
　また、その他、例えばCpG-28、CpG-685（GNKG-168）、CpG-ODN C274、KSK-13（KSK-CpG）、CpG ODN 10104（CpG-10104）、CpG ODN-1585、ODN-5890、1018-ISS、EMD-1201081（HYB-2055、IMO-2055）等が挙げられる。
　CpGオリゴヌクレオチドとしては、市販品を使用することができ、或いは公知の製造方法に従って得られたものを使用することができる。
　疎水性基Aは、ステロール骨格を有する疎水性基であり、その限りにおいて特に制限されない。ステロール骨格は、式Iに示すシクロペンタヒドロフェナントレン環にヒドロキシ基が結合したアルコールである。式IのA～Dの記号は、シクロペンタヒドロフェナントレン環を構成する各環を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ステロール骨格においては、シクロペンタヒドロフェナントレン環に二重結合を有していてもよく、水酸基の結合する位置も特段限定されない。好ましくは、C-3位の位置にヒドロキシ基が結合し、B環に二重結合を有するステロール類、又は、C-3位の位置にヒドロキシ基が結合し、飽和環で構成されたスタノール類である。疎水性基Aは、ステロール骨格が修飾されてなる、例えば、環構成炭素において炭化水素基（例えば炭素原子数1～20の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基等）に置換されてなる化合物に由来する基が挙げられる。ここで、「由来する基」とは、ある化合物において、水素原子、又は水酸基等の官能基が除かれてなる基を示す。
　疎水性基Aとしては、例えばコレステロール由来の基、コレスタノール由来の基、ラノステロール由来の基、エルゴステロール由来の基、β－シトステロール由来の基、カンペステロール由来の基、スティグマステロール由来の基、ブラシカステロール由来の基等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコレステロール由来の基、コレスタノール由来の基、ラノステロール由来の基、エルゴステロール由来の基等のステロール由来の基が挙げられ、より好ましくはコレステロール由来の基が挙げられる。
　修飾CpGオリゴヌクレオチドの構成ヌクレオチド数は、特に制限されないが、例えば8～50塩基、好ましくは8～40塩基、より好ましくは8～30塩基、さらに好ましくは10～25塩基、よりさらに好ましくは15～25塩基、とりわけ好ましくは18塩基～25塩基等である。
　修飾CpGオリゴヌクレオチドが含む疎水性基Aの数は、特に制限されず、例えば1～8である。該数は、好ましくは1～5、より好ましくは1～3、さらに好ましくは1～2、よりさらに好ましくは1である。また、修飾CpGオリゴヌクレオチドの構成ヌクレオチド数20あたりの疎水性基Aの数は、好ましくは1～8、より好ましくは1～5、さらに好ましくは1～3、よりさらに好ましくは1～2、特に好ましくは1である。
　修飾CpGオリゴヌクレオチドにおける疎水性基Aの連結位置は、特に制限されず、末端（5’末端又は3’末端）部、非末端部（例えば塩基上）であることができる。該連結位置は好ましくは末端である。
　疎水性基Aは、CpGオリゴヌクレオチドに、直接又は間接的に（例えばリンカーを介して）連結することができる。リンカーとしては、特に制限されないが、例えばエチレングリコールが複数連結してなるリンカー（例えばTEGリンカー、PEGリンカー等）、アルキルリンカー、dSpacer、アルキニルdSpacer、ジプロピルジスルフィドTEGリンカー等が挙げられる。リンカーを有する場合、リンカーの主鎖構成原子（炭素原子、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等）の数は、特に制限されないが、例えば1～30、好ましくは2～24、より好ましくは4～18、さらに好ましくは8～15である。
　修飾CpGオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの公知の修飾方法に従って又は準じて、合成することができる。
　修飾CpGオリゴヌクレオチドは、1種単独であることもできるし、2種以上の組合せであることもできる。
　修飾多糖類は、多糖類が修飾してなる化合物であって、修飾基として疎水性基Bを含む限り、特に制限されない。
　修飾多糖類を構成する多糖類（すなわち、修飾前の多糖類）としては、糖残基がグリコシド結合した高分子であれば特に限定されることはない。多糖類を構成する糖残基としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等の単糖類、または二糖類またはオリゴ糖類などの糖類に由来する残基を採用することができる。糖残基は1,2-、1,3-、1,4-又は1,6-グリコシド結合していてもよく、その結合はα－またはβ－型結合のいずれであってもよい。また、多糖類は直鎖状でも分枝鎖状のいずれでもよい。糖残基としてはグルコース残基が好ましく、多糖類としては、例えば天然または合成由来のプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、マンナン等、好ましくはプルラン、マンナン等、より好ましくはプルランなどが用いられる。
　多糖類の重量平均分子量は、修飾多糖類がナノゲルを構成可能な限り特に制限されないが、例えば5,000～2,000,000である。該重量平均分子量は、好ましくは10,000～1,000,000、より好ましくは20,000～500,000、さらに好ましくは40,000～250,000、よりさらに好ましくは80,000～125,000である。
　多糖類としては、市販品を使用することができ、或いは公知の製造方法に従って得られたものを使用することができる。
　疎水性基Bは、疎水性を有する基であり、修飾多糖類がナノゲルを構成可能な限り限り特に制限されない。疎水性基Bとしては、好ましくはステロール骨格を有する疎水性基、炭化水素基等が挙げられ、特に好ましくはステロール骨格を有する疎水性基が挙げられる。
　ステロール骨格を有する疎水性基については、疎水性基Aにおける説明と同様である。炭化水素基として、特に制限されず、例えば炭素原子数8～50（好ましくは10～30、より好ましくは12～20）の鎖状（好ましくは直鎖状）炭化水素基（好ましくはアルキル基）が挙げられる。
　修飾多糖類の重量平均分子量は、修飾多糖類がナノゲルを構成可能な限り特に制限されないが、例えば5,000～2,000,000である。該重量平均分子量は、好ましくは10,000～1,000,000、より好ましくは20,000～500,000、さらに好ましくは40,000～250,000、よりさらに好ましくは80,000～125,000である。
　修飾多糖類が含む疎水性基Bの数は、修飾多糖類がナノゲルを構成可能な限り特に制限されず、例えば多糖類を構成する糖残基100個当たり、例えば1～10個、好ましくは1～5個である。
　疎水性基Bは、多糖類に、直接又は間接的に（例えばリンカーを介して）連結することができる。
　修飾多糖類としては、例えば、多糖類を構成する糖残基100個当たり例えば1～10個（好ましくは1～5個）の糖単位の1級水酸基が、式II：－O－（CH2）mCONH（CH2）nNH－CO－O－R  （II）（式中、Rはステロール骨格を有する疎水性基又は炭化水素基を示し；mは0又は1を示し；nは任意の正の整数を示す）で表されるものが好ましい。nは好ましくは1～8である。
　修飾多糖類は、公知の方法（例えば国際公開第WO00/12564号）に従って又は準じて、合成することができる。一例として次の方法は挙げられる。最初に、炭素数12～50の水酸基含有炭化水素又はステロールと、0CN-R1 NCO（式中、R1は炭素数1～50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物を反応させて、炭素数12～50の水酸基含有炭化水素又はステロールが1分子反応したイソシアナート基含有疎水性化合物を製造する。次いで、得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数12～50の炭化水素基又はステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。得られた反応生成物をケトン系溶媒で精製して高純度疎水性基含有多糖類の製造が可能である。
　修飾多糖類は、1種単独であることもできるし、2種以上の組合せであることもできる。
　本発明の複合体における修飾CpGオリゴヌクレオチドと修飾多糖類との比は、特に制限されない。本発明の複合体は、修飾CpGオリゴヌクレオチド1モル部に対して、修飾多糖類を、例えば0.1～10モル部、好ましくは1～7モル部、より好ましくは2～4モル部含有する。
　本発明の複合体は、ナノゲル粒子であることができる。「ナノゲル」とはヒドロゲル構造を有する高分子ゲルナノ粒子をいう。ヒドロゲルとは、親水性のポリマーが架橋されて形成される3次元の網目構造が水を含んで膨潤したものである。ナノゲル粒子である本発明の複合体においては、修飾多糖類が、疎水性基Bによる疎水性相互作用に基づいて形成される物理的架橋部を介して自己組織化し、3次元の網目構造を形成している。本発明の複合体がナノゲル粒子である場合、修飾CpGオリゴヌクレオチドは、ナノゲル粒子内部に存在することが好ましい。
　ナノゲル粒子の形状は、特に制限されるものではないが、通常、球状である。
　本発明の複合体の重量平均粒子径は、例えば100nm以下、好ましくは10～100nm、より好ましくは15～70nm、さらに好ましくは20～50nmである。該粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。
　本発明の複合体は、修飾CpGオリゴヌクレオチドと修飾多糖類以外の、他の物質を含有することができる。他の物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖類、低分子化合物、高分子化合物、無機物等、さらにはこれらの複合体等が挙げられる。他の物質の含有量は、修飾CpGオリゴヌクレオチドと修飾多糖類の合計含有量100質量部に対して、例えば0～10000質量部、0～1000質量部、0～500質量部、0～100質量部、0～50質量部、又は0～10質量部である。
　本発明の複合体は、修飾CpGオリゴヌクレオチド溶液と修飾多糖類溶液とを混合することにより製造することができる。
　各溶液は、修飾CpGオリゴヌクレオチド又は修飾多糖類を溶媒に溶解することにより調製することができる。溶媒としては、例えば水や、DMSO等の有機溶媒を使用することができる。修飾多糖類溶液は、通常、溶媒として水を使用して、調製することができる。この際、水に代えて、PBS等の緩衝液を使用することが好ましい。修飾CpGオリゴヌクレオチド溶液は、その種類に応じて溶媒を適宜選択して、調製することができる。例えば、AタイプCpGオリゴヌクレオチドの場合は、通常、溶媒として水を使用して、調製することができ、BタイプCpGオリゴヌクレオチドの場合は、通常、溶媒としてDMSO等の有機溶媒を使用して、調製することができる。
　修飾CpGオリゴヌクレオチド溶液と修飾多糖類溶液とを混合して得られる混合溶液中の修飾CpGオリゴヌクレオチドの濃度は、特に制限されないが、ナノゲル粒子の形成効率等の観点から、例えば1～50uM、好ましくは2～40uM、より好ましくは5～30uM、さらに好ましくは8～25nMである。
　混合溶液中の修飾多糖類の濃度は、特に制限されないが、ナノゲル粒子の形成効率等の観点から、例えば5～100uM、好ましくは5～80uM、より好ましくは8～50uMである。
　混合溶液中の修飾CpGオリゴヌクレオチドと修飾多糖類とのモル比は、特に制限されないが、ナノゲル粒子の形成効率等の観点から、修飾CpGオリゴヌクレオチド1モルに対して、修飾多糖類が例えば0.1～4モル、好ましくは0.2～3モル、より好ましくは0.5～2.5モル、さらに好ましくは0.8～2.2モルである。
　ナノゲル粒子の形成効率等の観点から、混合溶液を超音波処理する、或いは混合溶液に尿素、DMSO、界面活性剤等の変性剤を添加後に透析により変性剤を除去することが好ましい。簡便性の観点から、前者の方法がより好ましい。後者の方法は、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。
　超音波処理は、例えば、混合溶液が入ったプラスチックチューブをバス型超音波槽内の水上に固定し、超音波照射することにより行うことができる。超音波処理の条件は、特に制限されないが、例えば10～40℃（好ましくは20～35℃）、10～50kHz（好ましくは20～40kHz）、30～200W（好ましくは70～150W）、2～30分間（好ましくは5～15分間）である。本発明の一態様においては、最初に修飾多糖類溶液に対して超音波処理を行い（例えば2～30秒間、好ましくは5～15秒間）、その後、修飾CpGオリゴヌクレオチドと混合してさらに超音波処理（例えば2～30分間、好ましくは5～15分間）を行うことが好ましい。
　2．用途
　本発明の複合体は、修飾CpGオリゴヌクレオチドを含有するので、CpGオリゴヌクレオチドが有する各種効果（例えば、TLR刺激作用及びそれに基づく各種作用（例えば炎症性サイトカイン産生促進作用、I型インターフェロン産生促進作用等））を発揮することができる。このため、本発明の化合物は、医薬、試薬等（本明細書において、「本発明の薬剤」と示すこともある。）の有効成分として、具体的にはTLR刺激に基づいた各種用途、より具体的には、例えば免疫賦活剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント等）等の有効成分としての利用が可能である。
　本発明の薬剤は、本発明の複合体を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではない。他の成分としては、薬理作用を有する成分のほか、添加剤も含まれる。添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の薬剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の薬剤は、その用途に応じて、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する。）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に投与する。）こともできる。
　本発明の薬剤の適用対象は特に限定されないが、哺乳動物では、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。また、細胞としては、動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
　本発明の薬剤を抗がん剤として用いる場合、及びがん細胞に用いる場合、対象がんとしては、特に制限されず、例えば白血病（慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、T細胞系リンパ腫、B細胞系リンパ腫、バーキットリンパ腫、悪性リンパ腫、びまん性リンパ腫、濾胞性リンパ腫を含む）、骨髄腫（多発性骨髄腫を含む）、乳癌、大腸癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、悪性黒色腫、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、きょう膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫及びウィルムス腫瘍等が挙げられる。
　本発明の薬剤は、任意の剤形、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口製剤形態、注射用製剤（例えば、点滴注射剤（例えば点滴静注用製剤等）、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等の非経口製剤形態を採ることができる。
　本発明の薬剤の投与経路としては、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与；　経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口投与等が挙げられる。
　本発明の薬剤中の有効成分の含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の薬剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1～1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5～500 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01～100 mg/kg体重、好ましくは0.05～50 mg/kg体重である。上記投与量は、年齢、病態、症状等により適宜増減することもできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．CHPナノゲルとChol-CpG(K3)との複合化試験
　＜試験例1-1．CHPの調製＞
　既報（Macromolecules 1993, 23, 3062-3068）の記載に従って、重量平均分子量450,000のプルランに100単糖あたりコレステロールが1.2個導入されたコレステロール修飾プルラン（CHP）を作製した。
　＜試験例1-2．Chol-CpG(K3)の調製＞
　K3 CpGオリゴヌクレオチド（配列番号1：5’-atcgactctcgagcgttctc、各ヌクレオチド間は全てホスホロチオエート結合）の5’末端に、トリエチレングリコールリンカーを介してコレステロールが連結してなるコレステロール修飾K3 CpG（Chol-CpG(K3)）を、ジーンデザイン社にて受託合成した。
　＜試験例1-3．CHPナノゲル溶液の調製＞
　CHPをPBSに0-20uMとなるように加え、スターラーにより25℃で15時間攪拌溶解させた後、プローブ型超音波照射機により超音波を6分間間欠照射した。この溶液を25℃、20000gで30分間遠心分離処理した後、上清を0.22umフィルターに通して濾過滅菌を行った。実施例ではCHP溶液は溶媒の種類に関わらず本方法により調製した。CHPナノゲルの重量平均分子量は450,000としてモル濃度換算した。
　＜試験例1-4．Chol-CpG(K3)溶液の調製＞
　受託合成したChol-CpG(K3)に400uMとなるようにDMSOを加え攪拌溶解させた。
　＜試験例1-5．CHPナノゲルとChol-CpG(K3)の複合化＞
　CHPナノゲル溶液（試験例1-3）をPBSで希釈し、0-20uMに濃度を調製したCHPナノゲル溶液76uLをプラスチック製チューブに入れ、それを水を満たしたバス型超音波槽内の超音波発振子直上に固定し、水温25-30℃、28kHz、100Wで超音波照射を開始し、5-10秒後に400uMのChol-CpG(K3)/DMSO溶液4.0uLをマイクロピペットを用いてCHPナノゲル溶液に添加した。添加後10分間超音波照射を継続した後得られた溶液をChol-CpG(K3)/CHPナノゲル複合体サンプルとして以降の分析に用いた。
　＜試験例1-6．複合体のHPLC分析＞
　試験例1-5で調製したChol-CpG(K3)/CHPナノゲル複合体サンプルの複合化評価としてサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行った。条件は次の通りである。カラム：G3000SWXL（東ソー），7.8mm x 150mm、検出器：UV（260nm）、カラム・検出温度35℃、注入量：20 uL、流速：0.5 mL/min、溶離液：PBS（pH 7.4）。PBSを溶離液として、溶離物の検出を核酸アジュバントであるCpG特異的な吸光波長である260nmで行った。
　Chol-CpG(K3): 20uM且つCHP nanogel: 20uMの場合の結果（クロマトグラム）を図１に示す。CHPナノゲル（20uM）のみのクロマトグラム（青線）では6分付近にナノゲルの光散乱に起因する僅かなピークのみが検出された。また、Chol-CpG(K3)（20uM）のみのクロマトグラム（赤線）では10分付近にChol-CpG(K3)由来の大きな単ピークが検出された。一方で、CHPナノゲルとChol-CpG(K3)が終濃度20uMの条件で複合化操作を行ったサンプルのクロマトグラム（緑線）ではナノゲルの溶出時間である6分付近に大きな単ピークが検出され、Chol-CpG(K3)の溶出時間である10分付近には小さなピークのみが確認された。複合化サンプルにおける6分付近の大きな単ピークの出現はナノゲルとChol-CpG(K3)が複合体を形成していることを示しており、これは10分付近に検出されるはずのChol-CpG(K3)単独ピークが著しく減少していることからも確認できる。
　Chol-CpG(K3)の終濃度を20uMとし、CHPナノゲル終濃度を0-40uMの範囲で変化させた場合の結果（複合化率）を図２に示す。10分付近のナノゲルと複合化していないChol-CpG(K3)由来ピークの面積を解析し、ナノゲルとの複合化率をグラフにした結果を示す。複合化時のCHPナノゲル濃度が上昇するに従い、複合化していないChol-CpG(K3)由来ピークが減少し、CHPナノゲル濃度が40uMであるナノゲルとChol-CpG(K3)のモル比が2:1の条件においてはおいては複合化率がほぼ100%となり、1:1の条件においても複合化率は約95%であった。
　＜試験例1-7．複合体の物性評価（DLS）＞
　試験例1-5においてChol-CpG(K3): 20uM且つCHP nanogel: 20uMで調製した複合体について、動的光散乱計（DLS）によるキュムラント法解析により得られた平均粒子径の測定を行った。複合体サンプルおよびCHPナノゲルのみ（終濃度20uM）をDLS測定用セルに入れ、DLS（Malvern社製、ZetasizerNano ZS）にセットし測定を行なった。結果を表１及び図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　平均粒子径は、CHPナノゲルのみ（終濃度20uM）では約33nm、複合化サンプルでは約39nmであった。複合化サンプルの粒径はCHPナノゲルのみと比較して数nm大きくなったが、凝集体形成に起因する粒径の顕著な増大は検出されなかった。
　＜試験例1-8．複合体の物性評価（TEM）＞
　試験例1-5においてChol-CpG(K3): 20uM且つCHP nanogel: 20uMで調製した複合体について、透過型電子顕微鏡（TEM）観察を行った。複合体サンプル10uLをTEM観察用エラスチックカーボン支持膜上にキャストし10分間静置した後、濾紙で液を吸い取った。次にその支持膜上にリンタングステン酸水溶液を10uLキャストして1分間静置し染色を行なった後、濾紙で染色液を吸い取り、1晩減圧乾燥してTEM観察を行った。
　結果を図４に示す。TEM観察の結果（スライド11下部）、約20-30nm程度の円形の構造物が観察された。TEM観察及び上記DLSより、複合化操作から得られたChol-CpG(K3)/CHPナノゲル複合体は凝集体を形成せずCHPナノゲルのみと同等の粒径を維持していることが確認された。
　試験例2．CHPナノゲルとChol-CpG(D35)との複合化試験
　＜試験例2-1．Chol-CpG(D35)の調製＞
　D35 CpGオリゴヌクレオチド（配列番号2：5’- g^gtgcatcgatgcagggg^g^g、^はホスホロチオエート結合を示し、それ以外はホスホジエステル結合である。）の5’末端に、トリエチレングリコールリンカーを介してコレステロールが連結してなるコレステロール修飾D35 CpG（Chol-CpG(D35)）を、ジーンデザイン社にて受託合成した。
　＜試験例2-2．Chol-CpG(D35)溶液の調製＞
　受託合成したChol-CpG(D35)に200uMとなるように滅菌蒸留水を加え攪拌溶解させた後、90℃で5分間加熱し、室温まで冷却した。
　＜試験例2-3．CHPナノゲルとChol-CpG(D35)の複合化＞
　CHPナノゲル溶液（試験例1-3）を滅菌蒸留水で希釈し、0-20mg/mLに濃度を調製したCHPナノゲル溶液72uLをプラスチック製チューブに入れ、それを水を満たしたバス型超音波槽内の超音波発振子直上に固定し、28kHz、100Wで超音波照射を開始し、5-10秒後に200uMのChol-CpG(D35)/water溶液8.0uLをマイクロピペットを用いてCHPナノゲル溶液に添加した。添加後5分間超音波照射し、そこに10xPBSを8.8uLを添加し、さらに5分間超音波照射を継続した後得られた溶液をChol-CpG(D35)/CHPナノゲル複合体サンプルとして以降の分析に用いた。
　＜試験例2-4．複合体のHPLC分析＞
　試験例2-3で調製したChol-CpG(D35)/CHPナノゲル複合体サンプルの複合化評価として、試験例1-6と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行った。
　クロマトグラムを図５に示す。Chol-CpG(D35)（20uM）のみのクロマトグラム（緑線）では8-15分付近にChol-CpG(D35)由来の複数のブロードなピークが検出された。Chol-CpG(K3)では10分付近にシャープな単ピークを示したのに対してChol-CpG(D35)が複数のブロードなピークを示したことから、Chol-CpG(D35)がPBS中で複数種の会合体を形成していることが考えられる。一方で、CHPナノゲルとChol-CpG(D35)の複合化時のモル比が1.25:20から40:20にナノゲルのモル比を増加させるに従い（薄緑線-濃青線）、6分付近の複合体に由来するシャープな単ピークの強度が増大し、8-15分付近のChol-CpG(D35)由来のピーク強度が減少していくのが確認された。複合化サンプルにおける6分付近の大きな単ピークの増大はナノゲルとChol-CpG(D35)が複合体を形成していることを示しており、これは8-15分付近に検出されるはずのChol-CpG(D35)ピークが著しく減少していることからも確認できる。
　複合化率を図６に示す。8-15分付近のナノゲルと複合化していないChol-CpG(D35)由来ピークの面積を解析し、ナノゲルとの複合化率をグラフにした。複合化時のCHPナノゲル濃度が上昇するに従い、複合化していないChol-CpG(D35)由来ピークが減少し、CHPナノゲル濃度が40uMであるナノゲルとChol-CpG(D35)のモル比が2:1の条件においてはおいては複合化率がほぼ100%となり、1:1の条件においても複合化率は約90%であった。
　＜試験例2-5．複合体の物性評価（DLS）＞
　試験例2-4においてChol-CpG(D35): 10uM且つCHP nanogel: 10uMで調製した複合体（終濃度9uM）について、試験例1-7と同様にして動的光散乱計（DLS）による粒径測定を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　CHPナノゲルのみでは約33nm、複合化サンプルでは約28nmであった。複合化サンプルの粒径はCHPナノゲルのみと同程度であり、凝集体形成に起因する粒径の顕著な増大は検出されなかった。
　試験例3．CpG/CHPナノゲル複合体と細胞との相互作用
　CHPナノゲル/Chol-CpG複合体と細胞との相互作用について検討するため、Rhodamine修飾したCHP（CHP-Rh）と3’末端にFluoresceinを修飾したChol-CpG（5’-chol, 3’-FAM CpG）を用いて複合体を調製し、マウスマクロファージ様細胞（RAW264.7）との相互作用を共焦点レーザー顕微鏡およびフローサイトメーターにより評価した。
　＜試験例3-1．CHP-Rhナノゲル/5’-chol, 3’-FAM CpG複合体の調製＞
　超音波照射下（28kHz, 100W））でCHP-Rhナノゲル/water（10mg/mL） 90uLに、90℃で5分間加熱処理した5’-chol, 3’-FAM CpG（K3およびD35）/water（200uM）を10uL加え、5分間超音波照射を続けた。その後、超音波照射しながら10xPBSを加えてさらに5分間超音波照射を行い、溶媒を1xPBSとした複合体を調製した。
　＜試験例3-2．共焦点レーザー顕微鏡による観察＞
　ガラスボトムディッシュにRAW264.7懸濁液（培地：DMEM+10%FBS）を5.0x105 cells/mLで190uL播種し、一晩前培養を行った。培養後、CHP-Rhナノゲル/5’-chol, 3’-FAM CpG（K3および D35）複合体溶液を10uL添加し（ナノゲルおよびCpG終濃度1uM )、CO2インキュベーター内で37℃、4時間静置した。静置後培地を除去しPBSで洗浄を行った後、共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss社製、LSM510META）を用いて観察を行った。
　結果を図７に示す。いずれの複合体も、ナノゲルのRh（赤）及びChol-CpGのFAM（緑）由来の蛍光が細胞内に観察されナノゲルおよびChol-CpGがRAW264.7細胞に取り込まれていることが確認された。また、細胞内での局在位置もRhおよびFAMの蛍光において一致している箇所が多く観察されナノゲルとChol-CpGが同時に、つまり複合体の状態で細胞内に取り込まれていることが示唆された。
　＜試験例3-3．フローサイトメトリーによる評価＞
　12well plateにRAW264.7懸濁液（培地：DMEM+10%FBS）を1.0x106 cells/mLで450uL播種し、一晩前培養を行った。培養後、CHP-Rhナノゲル/5’-chol, 3’-FAM CpG（K3および D35）複合体溶液を50uL添加し(終濃度それぞれ1uM) 、CO2インキュベーター内で37℃、4時間静置した。その後、静置後培地を除去しPBSで洗浄を行った後、コラゲナーゼで細胞を剥離させて細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーにより解析した。
　結果を図８に示す。CHP-Rhナノゲル/5’-chol, 3’-FAM CpG複合体を添加した細胞において、Ch1のFAM蛍光強度およびCh2のRh蛍光強度のいずれも増大し、CHP-Rhナノゲル/5’-chol, 3’-FAM CpG(K3)複合体においては、ほぼ全ての細胞がDouble positive領域にあり、ほぼ全ての細胞にナノゲルおよびChol-CpG(K3)が取り込まれていることが確認された。また、CHP-Rhナノゲル/5’-chol, 3’-FAM CpG(D35)複合体においても50%以上の細胞がDouble positive領域に検出され、CHPナノゲル/Chol-CpG複合体が高頻度で細胞に取り込まれ得ることが明らかとなった。
　試験例4．CpG活性評価
　96well plateにRAW264.7懸濁液（培地：DMEM+10%FBS）を2.5x105 cells/mLで180uL播種し、一晩前培養を行った。培養後、各ウェルに表３に示す濃度となるように各サンプル（表３）を20uLずつ添加、混和し、CO2インキュベーター内で2日間培養を行なった。cGAMPはSTING受容体のアゴニストとして知られるが、陽性対照としてサンプルに含めた。培養後、各ウェルの培養上清を回収し、blocking bufferで5倍希釈したものをELISAサンプルとし、Mouse TNF-alpha ELISA kit（Invitrogen社製）のプロトコルに従って培養上清のTNF-alpha濃度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　結果を図９に示す。CHPナノゲル/Chol-CpG(K3)複合体添加ではTNF-alpha濃度が上昇しており、同濃度のCpG(K3)およびChol-CpG(K3)を添加したものよりもその濃度は高かった。この結果からCHPナノゲル/Chol-CpG(K3)複合体はCpG(K3)単独添加と同等以上のサイトカイン産生誘導をし得ることが示唆された。

Claims (13)

  1. ステロール骨格を有する疎水性基Aを含む修飾CpGオリゴヌクレオチド、及び疎水性基Bを含む修飾多糖類を含有する、複合体。
  2. 前記修飾CpGオリゴヌクレオチドの構成CpGオリゴヌクレオチドがクラスA CpGオリゴヌクレオチド、及びクラスB CpGオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記疎水性基Aがコレステロール由来の基、コレスタノール由来の基、ラノステロール由来の基、エルゴステロール由来の基、β－シトステロール由来の基、カンペステロール由来の基、スティグマステロール由来の基、及びブラシカステロール由来の基からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項１又は２に記載の複合体。
  4. 前記修飾CpGオリゴヌクレオチドの構成ヌクレオチド数が8～50である、請求項１～３のいずれかに記載の複合体。
  5. 前記修飾多糖類の構成多糖類がプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、及びマンナンからなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項１～４のいずれかに記載の複合体。
  6. 前記修飾多糖類の構成多糖類がプルランを含む、請求項１～５のいずれかに記載の複合体。
  7. 前記疎水性基Bがステロール骨格を有する疎水性基を含む、請求項１～６のいずれかに記載の複合体。
  8. 前記修飾多糖類の重量平均分子量が5000～2,000,000である、請求項１～７のいずれかに記載の複合体。
  9. 前記修飾CpGオリゴヌクレオチド1モル部に対して、前記修飾多糖類0.1～10モル部を含有する、請求項１～８のいずれかに記載の複合体。
  10. ナノゲル粒子である、請求項１～９のいずれかに記載の複合体。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載の複合体を含有する、試薬。
  12. 請求項１～１０のいずれかに記載の複合体を含有する、医薬
  13. 免疫賦活剤、抗がん剤、アジュバント、又は抗ウイルス剤である、請求項１２に記載の医薬。
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