CN115778918A - 一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用 - Google Patents
一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115778918A CN115778918A CN202211236178.7A CN202211236178A CN115778918A CN 115778918 A CN115778918 A CN 115778918A CN 202211236178 A CN202211236178 A CN 202211236178A CN 115778918 A CN115778918 A CN 115778918A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- calcium
- gene
- concentration
- delivery system
- calcium phosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 title claims abstract description 132
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 title claims abstract description 132
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 title claims abstract description 132
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 90
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 89
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 70
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 143
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 96
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 90
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 78
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 78
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 50
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 49
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 45
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 35
- 229960005153 enoxaparin sodium Drugs 0.000 claims description 30
- CIJQTPFWFXOSEO-NDMITSJXSA-J tetrasodium;(2r,3r,4s)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-6-[(1r,2r,3r,4r)-4-[(2r,3s,4r,5r,6r)-5-acetamido-6-[(4r,5r,6r)-2-carboxylato-4,5-dihydroxy-6-[[(1r,3r,4r,5r)-3-hydroxy-4-(sulfonatoamino)-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-2-yl]oxy]oxan-3-yl]oxy-2-(hydroxy Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].O([C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1O)NC(C)=O)O[C@@H]1C(C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](OC2C(O[C@@H](OC3[C@@H]([C@@H](NS([O-])(=O)=O)[C@@H]4OC[C@H]3O4)O)[C@H](O)[C@H]2O)C([O-])=O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]1C)C([O-])=O)[C@@H]1OC(C([O-])=O)=C[C@H](O)[C@H]1O CIJQTPFWFXOSEO-NDMITSJXSA-J 0.000 claims description 30
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 17
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 14
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- -1 dalteparin sodium Chemical compound 0.000 claims description 8
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 3
- 229940018872 dalteparin sodium Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003661 fondaparinux sodium Drugs 0.000 claims description 3
- XEKSTYNIJLDDAZ-JASSWCPGSA-F fondaparinux sodium Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].O[C@@H]1[C@@H](NS([O-])(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O4)NS([O-])(=O)=O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O2)NS([O-])(=O)=O)[C@H](C(O)=O)O1 XEKSTYNIJLDDAZ-JASSWCPGSA-F 0.000 claims description 3
- 229960002737 fructose Drugs 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 3
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 claims description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 229920000608 Polyaspartic Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 2
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007983 brain glioma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012837 microfluidics method Methods 0.000 claims 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 16
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 8
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 4
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 3
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000317410 Arisaema dracontium Species 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-N amino hydrogen sulfate Chemical group NOS(O)(=O)=O DQPBABKTKYNPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- DUEPRVBVGDRKAG-UHFFFAOYSA-N carbofuran Chemical compound CNC(=O)OC1=CC=CC2=C1OC(C)(C)C2 DUEPRVBVGDRKAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 201000004897 cough variant asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000370 gamma-poly(glutamate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 231100000098 severe acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006807 siRNA silencing Effects 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本公开涉及一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用。本公开具体涉及一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统，所述递送系统为包含外壳和被所述外壳包封的内核的纳米颗粒，所述内核由磷酸钙和基因载物通过静电缩合形成，所述外壳包含具有钙结合能力的钙结合多糖，所述钙结合多糖与钙通过络合形成络合物。本公开还涉及所述基因纳米递送系统的制备方法及其应用。本公开的基因纳米递送系统有助于将基因递送至其发挥作用的位点，更好地发挥基因沉默或表达作用，且种类丰富、制备工艺简单、经济环保、可实现放大生产。
Description
技术领域
本发明属于基因载体技术领域，具体涉及一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法。
背景技术
基因治疗(Gene therapy)是治愈许多相对难以治疗的疾病的希望。然而，裸露的基因具有短的体内半衰期，会被血浆中的核酸酶迅速降解、缺乏组织特异性并且难以穿过细胞疏水性质膜进入细胞质。因此，缺乏安全、高效的和稳定表达的基因递送系统是阻碍基因治疗进入临床的最大障碍。
病毒载体(Vital vector)是利用病毒对宿主细胞的感染能力将外源基因导入宿主细胞内的一类常见的基因递送载体，是基因治疗临床试验中使用的主要载体，但其免疫原性和高昂的治疗成本限制了它们的广泛使用(参见The journal of genemedicine.vol.21,7(2019):e3092，将其全部内容引入于此以作参考)，使用病毒载体亦难以实现对引入的基因的靶向递送。因此，急需开发真正可用于临床的非病毒载体。
与病毒载体相比，非病毒载体具有更高的安全性，但转染效率较低。目前，随着纳米技术的发展，非病毒载体主要包括阳离子聚合物、阳离子脂质、无机纳米颗粒(下文中，有时也称为纳米粒)等。然而，大多数阳离子聚合物具有严重的急性毒性，例如细胞毒性、诱导细胞坏死和诱导红细胞聚集，这主要是由于它们的生物相容性差(参见Journal ofcontrolled release:official journal of the Controlled ReleaseSociety.vol.114,1(2006):100-9以及Molecules(Basel,Switzerland)vol.24,203744.17Oct.2019，将其全部内容引入于此以作参考)，并且在生理条件下难以降解。阳离子脂质的低转染效率和毒性，也限制了其应用。无机纳米颗粒由无机颗粒和可生物降解的聚阳离子合成，它们的细胞毒性和生物降解性能同样限制了其应用。
此外，脂质纳米颗粒(LNP)系统是目前用于实现遗传药物临床转化的主要非病毒递送系统，目前上市的基因递送产品几乎都是采用LNP技术。LNP与其他递送系统相比，具有包封效果好、体内外转染效果好等多方面优势，但仍面临许多问题：LNP制剂的免疫反应以及对改进的LNP系统的需求，以便基于siRNA、mRNA和质粒的治疗可以扩展到非肝组织，并且许多用于临床前研究的LNP具有高度炎症性(参见Iscience.24.12(2021):103479，将其全部内容引入于此以作参考)，LNP中的可电离脂质成分会引起注射部位发生炎症反应。
磷酸钙是一种在骨和牙齿中发现的天然无机材料，具有生物相容性好、生物可降解、易于制备、低毒性的特点，长期以来被认为是一种很有前途的基因递送载体(参见Current pharmaceutical design.vol.22,11(2016):1529-33，将其全部内容引入于此以作参考)，钙离子与带负电荷的磷酸盐之间的强相互作用使形成的沉淀物能够在磷酸钙纳米颗粒的制备过程中构建出包裹基因的稳定内核。然而，磷酸钙纳米颗粒倾向于聚集、沉淀(参见Biomaterials science.vol.7,10(2019):3942-3960，将其全部内容引入于此以作参考)。很难制成可静脉注射的药物制剂。磷酸钙-基因共沉淀物的快速且不可控的生长是限制其在临床中应用的关键所在。
多糖是一种由糖苷键结合的糖链形成的天然高分子材料，其种类丰富，来源广泛，可从各类天然可再生资源中获得。与其他合成聚合物相比，天然的多糖物质生物相容性强，毒性低，是一种安全可靠的材料。此外，多糖链上存在诸多官能团，如羟基、氨基和羧酸基团等，丰富的修饰位点使多糖易于功能化，有利于开发出具有不同性质的多糖衍生物(参见Carbohydrate polymers.vol.221(2019):94-112，将其全部内容引入于此以作参考)。
鉴于现有的病毒载体和非病毒载体中存在诸多限制因素，有必要开发一种具有良好的生物相容性和稳定性、细胞毒性低、同时提高靶向治疗效果的非病毒基因递送系统。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种具有良好的生物相容性和稳定性、细胞毒性低、同时提高靶向治疗效果基因纳米递送系统。
本发明的第二个目的是提供上述基因纳米递送系统的制备方法及其应用。
用于解决问题的方案
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明人进行了深入的研究，并发现了一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统，该递送系统包括磷酸钙与基因载物静电缩合形成的内核和包含具有钙结合能力的钙结合多糖的外壳。通过使用磷酸钙中的钙离子压缩基因，与阳离子聚合物载体相比具有更好的可降解性，无细胞毒性。同时，使用和钙有高度亲和力的多糖可促使磷酸钙/基因内核以纳米状态稳定分散，钙结合多糖的负电性亦能有效屏蔽载体正电性，抑制与血浆蛋白不良相互作用，从而增加纳米载体的体内循环时间，实现稳定输运，抵达靶部位。与简单的正负电荷介导的结合相比，钙结合多糖结构中丰富的羧基、氨基、硫酸基团等以及其适宜配位的立体构型，形成了钙结合多糖与磷酸钙表面钙离子的强配位能力，其结合力更强，结合更为紧密，可防止外壳在到达靶部位之前提前脱落。且不同于正负电荷吸引形成纳米粒，钙结合多糖与磷酸钙纳米粒的结合对外侧多糖材料的电荷并无限制。并且，种类丰富的钙结合多糖可赋予该递送系统多种功能，满足多种疾病实验研究和临床治疗的需要，从而完成了本发明。即本发明如下所述：
本发明的第一方面提供一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统，其中，所述递送系统为包含外壳和被所述外壳包封的内核的纳米颗粒，所述内核由磷酸钙和基因载物通过静电缩合形成，所述外壳包含具有钙结合能力的钙结合多糖，所述钙结合多糖与钙通过络合形成络合物。
在本发明的一些实施方案中，所述钙结合多糖包括果糖、硫酸软骨素、磺达肝癸钠、硫酸乙酰肝素、达肝素钠、依诺肝素钠、氧化壳聚糖、磷酸化壳聚糖、麦芽糖壳聚糖、戊二醛交联壳聚糖、聚氨基葡萄糖羧酸钠、磷酸化纤维素及它们的类似物或衍生物等以及以上物质的混合物组成的组中的至少一种。
在一些优选的实施方案中，所述钙结合多糖为硫酸软骨素及其衍生物、依诺肝素钠及其衍生物、磷酸化壳聚糖及其衍生物以及以上物质的混合物组成的组中的至少一种。
在一些更优选的实施方案中，所述类似物或衍生物包括赖氨酸修饰、三聚磷酸修饰、柠檬酸修饰、甘氨酸修饰、聚谷氨酸修饰、聚天门冬氨酸修饰、聚乙二醇修饰的衍生物。
在本发明的一些实施方案中，所述基因载物包括DNA、RNA及其杂合体；优选地，所述基因载物选自由互补DNA(cDNA)、质粒DNA(pDNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、反义RNA、miRNA、多价RNA、病毒RNA(vRNA)和CRISPR RNA序列组成的组中的至少一种；优选地，所述基因载物选自siRNA和mRNA中的至少一种。
在本发明的一些实施方案中，所述外壳与所述内核的质量比为1:1～200:1；所述内核中的所述磷酸钙与所述基因载物的质量比为1:1～1000:1。
在一些优选的实施方案中，所述外壳与所述内核的质量比为8:1～35:1；所述内核中的所述磷酸钙与所述基因载物的质量比为1:1～100:1。
在一些更优选的实施方案中，所述外壳与所述内核的质量比为10:1～30:1；所述内核中的所述磷酸钙与所述基因载物的质量比为1:1～35:1。
在本发明的一些实施方案中，所述纳米颗粒的粒径为10～1000nm，所述纳米颗粒的Zeta电位为-30mV～25mV。
在一些优选的实施方案中，所述纳米颗粒的粒径为50～300nm；所述纳米颗粒的Zeta电位为-20mV～20mV。
在一些更优选的实施方案中，所述纳米颗粒的粒径为100～200nm；所述纳米颗粒的Zeta电位为-15mV～15mV。
在本发明的一些实施方案中，所述内核由磷酸钙和基因载物组成。
本发明的第二方面提供一种前述基因纳米递送系统的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
1)提供第一流体，所述第一流体包含基因载物和钙盐的含水溶液；
2)提供第二流体，所述第二流体包含钙结合多糖和磷酸盐缓冲液；
3)使所述第一流体和第二流体混合，由此形成基于钙结合多糖和磷酸钙的纳米颗粒；
其中，
在所述第一流体中，所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙中的一种或两种；
在所述第二流体中，所述磷酸盐缓冲液包括HEPES溶液、磷酸盐溶液、氯化钠溶液；优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0-8.0；优选地，所述磷酸盐溶液包括选自由(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4组成的组中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，在所述步骤1)中，在所述第一流体中，所述钙盐的含水溶液中的钙离子浓度为10～3000mM，基因载物的浓度为0.5～40μM。
在一些优选的实施方案中，在所述第一流体中，钙离子浓度为250～1500mM，基因载物的浓度为2.5～35μM。
在一些更优选的实施方案中，在所述第一流体中，钙离子浓度为250～500mM，基因载物的浓度为2.5～30μM。
在本发明的一些实施方案中，在所述步骤2)中，在所述第二流体中，所述HEPES溶液的浓度为10～150mM，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～50mM，所述氯化钠溶液的浓度为50～500mM，钙结合多糖的浓度为0.5～50mg/mL。
在一些优选的实施方案中，在所述第二流体中，HEPES溶液的浓度为10～100mM，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～20mM，所述氯化钠溶液的浓度为50～300mM，钙结合多糖的浓度为0.5～30mg/mL。
在一些更优选的实施方案中，在所述第二流体中，HEPES溶液的浓度为10～60mM，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～10mM，所述氯化钠溶液的浓度为50～200mM，钙结合多糖的浓度为0.5～20mg/mL。
在本发明的一些实施方案中，在所述步骤3)中，所述钙结合多糖与所述基因载物的质量比为1:1～1000:1。
在本发明的一些实施方案中，所述方法任选地还包括将步骤3)中获得的纳米颗粒在细胞外缓冲液中透析。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤3)中的混合通过涡旋法或微流控法进行。
在一些优选的实施方案中，所述混合通过微流控法进行。
本发明的第三方面提供了一种将基因载物递送至靶细胞的方法，其中，所述方法包括将所述细胞与前述基因纳米递送系统接触。
本发明的第四方面提供了一种药物组合物，其中，所述组合物包括前述基因纳米递送系统和药学上可接受的赋形剂。
本发明的第五方面提供了前述基因纳米递送系统在制备预防或治疗疾病的药物中的用途。
在一些优选的实施方案中，所述疾病包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病、炎症性疾病。
在一些更优选的实施方案中，所述疾病为乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤、头颈部恶性肿瘤、食管癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌等实体瘤、白血病、多发性骨髓瘤、以及恶性淋巴瘤等血液系统肿瘤、以及骨关节炎等。
本发明第六方面提供了前述基因纳米递送系统在制备细胞制剂中的用途，所述基因纳米递送系统能够在体外高效转染细胞，且所获得的细胞制剂可用于细胞疗法。
在一些优选实施方案中，所述细胞制剂包括干细胞制剂、NK细胞制剂、巨噬细胞制剂、T细胞制剂、Treg细胞制剂、NKT细胞制剂、DC细胞制剂、CAR-NK细胞制剂、CAR-巨噬细胞制剂、CAR-T细胞制剂、CAR-Treg细胞制剂、CAR-NKT细胞制剂、TCR-T细胞制剂以及它们的组合。
在一些更优选的实施方案中，所述细胞制剂为干细胞制剂。
本发明第七方面提供了前述基因纳米递送系统在细胞疗法中的用途。
在一些优选实施方案中，所述细胞疗法包括干细胞疗法、NK细胞疗法、巨噬细胞疗法、T细胞疗法、Treg细胞疗法、NKT细胞疗法、DC细胞疗法、CAR-NK细胞疗法、CAR-巨噬细胞疗法、CAR-T细胞疗法、CAR-Treg细胞疗法、CAR-NKT细胞疗法、TCR-T细胞疗法等细胞疗法以及它们的组合。
在一些更优选的实施方案中，所述细胞疗法为干细胞疗法。
发明的效果
本发明提供了一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统，根据多糖外壳种类不同可通过多种途径入胞，在酸性溶酶体/内体中溶解，释放的钙离子和磷酸根离子会增加溶酶体/内体的渗透压，使溶酶体/内体膜破裂而实现逃逸，这有助于将基因递送至其发挥作用的位点中，更好地发挥基因沉默/表达作用。该递送系统种类丰富、制备工艺简单、经济环保、可实现放大生产。
具体而言，与现有的技术相比，本发明所述的一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统具有如下优点。
1)该递送系统具有原材料易得、经济环保、制备周期短，基因包载方便，生物相容性好等特点。
2)该递送系统制备工艺简单、无需使用有机溶剂、且安全性好，可扩大生产、具有较高临床转化潜力，同时规避了LNP的诸多专利壁垒，以及LNP制备工艺需要使用有机溶剂以及除溶剂过程，磷脂原材料价格昂贵且易氧化等问题。
3)该递送系统中使用的钙结合多糖对钙的高亲和性可有效防止磷酸钙过度生长，制备出可在水溶液中稳定分散和悬浮的钙结合多糖/磷酸钙基因纳米颗粒；钙结合多糖来源广泛，原料易获得，且具有生物相容性好、生物可降解及无免疫原性的特点；钙结合多糖品种丰富，种类各异的多糖具有多种特性和药理作用，可根据治疗疾病的不同，合理挑选不同外壳，丰富实验研究或临床治疗的选择，赋予该平台多种功能及药理作用；钙结合多糖具有丰富的氨基、羧基等官能团，有利于进行修饰，赋予基因载体更多功能性，有利于进一步挖掘该基因递送平台的内涵，丰富基因递送系统的种类；钙结合多糖的存在可显著提高磷酸钙纳米颗粒在水溶液中的稳定性，屏蔽纳米颗粒表面的正电性，显著改善磷酸钙纳米颗粒的生物活性，因此，适用于药物载体、基因转染、疾病治疗等生物医学领域。
4)所制备出的钙结合多糖/磷酸钙基因纳米颗粒，具有pH值响应性，装载的基因在中性溶液中基本不释放，在纳米颗粒被内吞进入细胞后，溶酶体/内体的酸性环境使纳米颗粒分解，由此产生的离子急剧增加了内部渗透压，从而加速了基因药物递送至其发挥作用的位点(例如细胞质)中，可实现基因载物的持续递送和高效沉默或高效表达，达到基因治疗的效果。
5)该递送系统为核-壳结构，带有正电荷的磷酸钙内核可以高效压缩基因载物，带有负电荷的钙结合多糖可降低阳离子参与的细胞毒性，也可以降低纳米颗粒在血液循环中对血浆蛋白的吸附，避免网状内皮系统不必要的摄取，有利于保护基因载物在体内稳定运输。
为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是作为根据本发明的多糖的一个具体例的硫酸软骨素与钙离子结合的原理图。
图2是作为根据本发明的一个具体例的硫酸软骨素与磷酸钙和基因载物形成基因纳米颗粒的示意图。
图3是作为根据本发明的一个具体例的硫酸软骨素与磷酸钙和基因载物形成基因纳米颗粒的透射电镜图。
图4是作为根据本发明的一个具体例的磷酸化壳聚糖的合成路线图。
图5是根据本发明的一个实施例的基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统(命名为CaP@CS)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipo3000的细胞摄取图的比较结果图，所述CaP为无硫酸软骨素的磷酸钙纳米粒，即硫酸软骨素浓度为0时所得纳米粒。
图6是根据本发明的一个实施例的基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统(命名为CaP@CS)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipo3000沉默目标蛋白24h的比较结果图，所述CaP为无硫酸软骨素的磷酸钙纳米粒，即硫酸软骨素浓度为0时所得纳米粒。
图7根据本发明的一个实施例的基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统(命名为CaP@CS)与游离siRNA对比沉默目标蛋白的体内实验结果图。
图8是根据本发明的一个实施例的基于硫酸软骨素/磷酸钙的mRNA纳米递送系统(命名为CaP@CS)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipofectamine转染293T细胞24h的比较结果图，所述CaP为无硫酸软骨素的磷酸钙纳米粒，即硫酸软骨素浓度为0时所得纳米粒。
图9是根据本发明的一个实施例的基于硫酸软骨素/磷酸钙的mRNA纳米递送系统(命名为CaP@CS)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipofectamine转染干细胞24h的比较结果图，所述CaP为无硫酸软骨素的磷酸钙纳米粒，即硫酸软骨素浓度为0时所得纳米粒。
图10是根据本发明的一个实施例的基于依诺肝素钠/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统(命名为CaP@ES)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipo3000的细胞摄取图的比较结果图，所述CaP为无依诺肝素钠的磷酸钙纳米粒，即依诺肝素钠浓度为0时所得纳米粒。
图11是根据本发明的一个实施例的基于依诺肝素钠/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统(命名为CaP@ES)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipo3000沉默目标蛋白24h的比较结果图，所述CaP为无依诺肝素钠的磷酸钙纳米粒，即依诺肝素钠浓度为0时所得纳米粒。
图12是根据本发明的一个实施例的基于磷酸化壳聚糖/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统(命名为CaP@PCS)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipo3000的细胞摄取图的比较结果图，所述CaP为无磷酸化壳聚糖的磷酸钙纳米粒，即磷酸化壳聚糖浓度为0时所得纳米粒。
图13是根据本发明的一个实施例的基于磷酸化壳聚糖/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统(命名为CaP@PCS)与磷酸钙(命名为CaP)和市售转染试剂Lipo3000沉默目标蛋白24h的比较结果图，所述CaP为无磷酸化壳聚糖的磷酸钙纳米粒，即磷酸化壳聚糖浓度为0时所得纳米粒。
具体实施方式
现将详细说明各实施方案，但本发明绝不限于以下所给出的说明。除非另有说明，表示数值范围的“XX以上且YY以下”或“XX～YY”的说明意指包括作为端点的下限和上限的数值范围。当逐步描述数值范围时，各数值范围的上限和下限可任意组合。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
如本文所使用的，术语“基因载物”指含有至少两个单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA及其杂合体。DNA可以是以下形式：反义分子、质粒DNA、cDNA、PCR产物或载体。RNA可以是以下形式：小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、反义RNA、miRNA、多价RNA、dicer底物RNA或病毒RNA(vRNA)，及其组合。核酸分子包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸(reference nucleic acid)类似的结合性质。这类类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸以及肽-核酸(PNA)。除非特别限定，该术语涵盖包含已知的具有与参考核酸类似的结合性质的天然核苷酸的类似物的核酸。除非另外表明，特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性、和互补序列以及明确表明的序列。特别地，可以通过生成一个或多个所选(或全部)密码子的三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”含有糖(脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA))、碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于，配置新反应基团的修饰，所述新反应基团例如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧化物和烃基卤化物。
如本文所使用的，术语“钙结合多糖”是一种具有钙结合能力的多糖，由糖苷键结合的糖链形成。所述钙结合多糖包括但不限于，天然或人工合成的与二价阳离子具有良好的结合能力的多糖，例如，果糖、硫酸软骨素、磺达肝癸钠、硫酸乙酰肝素、达肝素钠、依诺肝素钠、氧化壳聚糖、磷酸化壳聚糖、麦芽糖壳聚糖、戊二醛交联壳聚糖、聚氨基葡萄糖羧酸钠、磷酸化纤维素及它们的类似物或衍生物等，所述类似物或衍生物包括赖氨酸修饰、三聚磷酸修饰、柠檬酸修饰、甘氨酸修饰、聚谷氨酸修饰、聚天门冬氨酸修饰、聚乙二醇修饰等衍生物。
本发明涉及一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统，其中，所述递送系统为包含外壳和被所述外壳包封的内核的纳米颗粒，所述内核由磷酸钙和基因载物通过静电缩合形成，所述外壳包含具有钙结合能力的钙结合多糖，所述钙结合多糖与钙通过络合形成络合物。
虽然不受理论束缚，推测本发明所述的一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统的作用原理如下：磷酸钙基因内核经钙结合多糖包裹后可形成在水溶液中稳定分散、粒径均一的纳米颗粒，静脉注射给药后，该递送系统由于其稳定的纳米级结构而在体内正常输运，到达靶部位后，通过内吞途径入胞，在溶酶体/内体的酸性环境中溶解，释放钙离子和磷酸根离子增加溶酶体/内体的渗透压，使内体膜破裂而实现逃逸，将基因递送至其发挥作用的位点中，发挥基因沉默或表达作用。
在种类多样的多糖物质中，部分多糖与金属离子具有极强的结合能力，这主要得益于多糖结构中丰富羧基、氨基、硫酸基团等以及其适宜配位的立体构型，从而促使了多糖与金属离子的良好的配位能力。如图1所示，示出了作为根据本发明的多糖的一个具体例的硫酸软骨素与钙离子结合的原理图。本发明中，利用钙结合多糖对二价阳离子的高亲和性，与磷酸钙表面吸附的钙离子相互作用，促使有机-无机稳定界面的形成，可使钙结合多糖直接锚定在磷酸钙纳米颗粒表面，抑制纳米颗粒生长，阻碍纳米颗粒聚集。
不同的钙结合多糖具有自身独特的性质。作为本发明的示例性钙结合多糖，硫酸软骨素与CD44的高亲和力，可实现对CD44阳性靶细胞(如肿瘤细胞、纤维细胞、干细胞等)的靶向；其归巢于关节软骨的特点可用于骨关节疾病的靶向治疗，且硫酸软骨素还具有抗炎止痛抗肿瘤等诸多药理作用。因此，本发明中，将硫酸软骨素作为磷酸钙基因纳米颗粒的外壳，可赋予纳米颗粒靶向性，以及抗炎止痛抗肿瘤的药理作用。
作为本发明的示例性钙结合多糖的另一实例，小分子肝素同样具有良好的钙离子结合能力，此外作为临床广泛使用药品，小分子肝素具有多种药理活性，如抗血栓作用，可保护肝、肾功能，抗炎，治疗咳嗽变异型哮喘以及抑制肝癌细胞增殖，抑制肿瘤血管生成、生长与转移等作用，因此使用小分子肝素作为钙结合多糖外壳，可促使纳米颗粒在多种疾病治疗中发挥作用。在更具体的实施方案中，利用依诺肝素钠等小分子肝素，相比于现有技术中的高分子量肝素钠或生物素化肝素(例如，参见梁平，用于药物传递和药物/基因共传递的多功能有机/无机杂化纳米粒子的研究，2013年，学位论文，武汉大学，将其全部内容引入本文以作参考)，注射吸收好，半衰期长，生物利用度高，不良反应少，且与作为载体的磷酸钙相互配合，制备方法更为简单。
作为本发明的示例性钙结合多糖，磷酸化壳聚糖作为外壳递送基因，与磷酸钙表面吸附的钙离子相互作用强。相比之下，现有技术中使用未经修饰的壳聚糖形成的纳米颗粒(参见Li等人，Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences.2018,27(8):517-529，将其全部内容引入本文以作参考)，由于呈过强正电性(+27mV)，与磷酸钙结合弱，且安全性劣化。
本发明中，钙结合多糖的特性可赋予本发明的基因递送系统丰富的内涵，不同钙结合多糖构建的基因递送系统具有不同的功能，满足临床上不同疾病的治疗需求。此外，多糖主链上丰富的官能团可进一步衍生化，从而实现对递送系统功能化修饰，构建更加智能、功能更丰富的载药平台。
本发明还涉及一种前述基因纳米递送系统的制备方法。1)提供第一流体，所述第一流体包含基因载物和钙盐的含水溶液；2)提供第二流体，所述第二流体包含钙结合多糖和磷酸盐缓冲液；3)使所述第一流体和第二流体混合，由此形成基于钙结合多糖和磷酸钙的纳米颗粒。
在所述方法中，第一流体中钙离子溶液可压缩基因药物载物，并在载体处于溶酶体环境中增加溶酶体渗透压，促使溶酶体破裂，促进基因药物的溶酶体逃逸。第二流体中的磷酸盐缓冲液可与第一流体中的钙离子结合，形成磷酸钙纳米粒，包裹基因药物载物，形成稳定的结构，免于基因的提前泄露。
所述方法任选地还包括将步骤3)中获得的纳米颗粒在细胞外缓冲液中透析。透析可除去过量的钙离子，适当提高纳米粒在细胞实验中的安全性。细胞外缓冲液可调整纳米粒体系的渗透压，使其与细胞外渗透压一致，增强纳米体系的安全性。
实施例
以下将具体说明本发明的实施例。本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
本发明实施例中所使用的试验材料、试验试剂和仪器均可市购获得。
实施例1：基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的制备
(1)制备第一流体：用DEPC水(上海源叶生物科技有限公司，S30710)分别溶解CaCl2、siRNA(广州锐博生物科技有限公司，NC)，使钙离子浓度为500mM；siRNA的浓度为10μM，取CaCl2溶液与等体积的siRNA混合均匀；
(2)制备第二流体：配制30mg/mL的硫酸软骨素溶液母液，稀释得到不同浓度的硫酸软骨素(CS)溶液，浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、30mg/mL；配制磷酸盐缓冲液(各组分的摩尔浓度分别为0.05mol/L HEPES(上海源叶生物科技有限公司，S16013)，0.14mol/LNaCl，3.75mmol/L Na2HPO4，使用10mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2)。将不同浓度的硫酸软骨素(上海麦克林生化科技有限公司(麦克林Macklin)，C875624)溶液加入到等体积的缓冲液中混合均匀备用；
(3)将第一流体和第二流体涡旋混合，制备得到CS终浓度为0.00、0.67、1.33、2.00、2.67、3.33、6.66、10.00mg/mL的硫酸软骨素/磷酸钙基因纳米颗粒(命名为CaP@CS)，其中CS浓度为0mg/mL所制得纳米粒，即为不含钙结合多糖的对照制剂(命名为CaP)，然后将所得制剂在配制的细胞外缓冲液(2mM CaCl2、3.75mM Na2HPO4、25mM Tris、140mM NaCl，调节pH为7.2)中透析30分钟，除去过量游离的钙离子、硫酸软骨素，截留分子量为10kDa。
本实施例制备得到的含硫酸软骨素的磷酸钙基因纳米颗粒的结构示意图具体参见图2，其透射电镜图(日本日立株式会社制)具体参见图3。
实施例2：基于依诺肝素钠/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的制备
(1)制备第一流体：用DEPC水(上海源叶生物科技有限公司，S30710)分别溶解CaCl2、siRNA(广州锐博生物科技有限公司，NC)，使钙离子浓度为500mM；siRNA的浓度为10μM，取CaCl2溶液与等体积的siRNA混合均匀；
(2)制备第二流体：配制10mg/mL的依诺肝素钠(上海麦克林生化科技有限公司(麦克林Macklin)，E887790，Mw3800-5000)溶液(ES)母液，稀释得到不同浓度的ES溶液，浓度分别为0、2、4、6、8、10mg/mL；配制磷酸盐缓冲液(各组分的摩尔浓度分别为0.05mol/L HEPES(上海源叶生物科技有限公司，S16013)，0.14mol/L NaCl，3.75mmol/L Na2HPO4，使用10mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2)。将不同浓度的依诺肝素钠溶液加入到等体积的缓冲液中混合均匀备用；
(3)将第一流体和第二流体涡旋混合，制备得到ES终浓度为0.00、0.67、1.33、2.00、2.67、3.33mg/mL的依诺肝素钠/磷酸钙基因纳米颗粒(命名为CaP@ES)，其中ES溶液浓度为0mg/mL所制得纳米粒，即为不含钙结合多糖的对照制剂(命名为CaP)，然后将制剂在配制的细胞外缓冲液(2mM CaCl2、3.75mM Na2HPO4、25mM Tris、140mM NaCl，调节pH为7.2)中透析30分钟，除去过量游离的钙离子、依诺肝素钠，截留分子量为30kDa。
实施例3：基于磷酸化壳聚糖/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的制备
(1)磷酸化壳聚糖的合成：将10g壳聚糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，C105799，脱乙酰度≥95％，粘度100-200mpa.s)溶解在1％的500mL乙酸溶液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A298827)中，然后将反应体系加热至70℃。接着将10g H3PO3(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，P102924)溶解在20mL去离子水中，将所得溶液加入壳聚糖溶液中。然后将13mL，37％的甲醛水溶液(J&K百灵威，226396)滴加到壳聚糖溶液中。在70℃下磁力搅拌继续反应3小时。反应结束后，将反应溶液冷却至室温，然后加入无水乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，E111989)进行分离沉淀。将粗产物磷酸化壳聚糖用无水乙醇洗涤两次，用去离子水透析，然后冷冻干燥得到磷酸化壳聚糖。图4示出了磷酸化壳聚糖的合成路线。
(2)制备第一流体：用DEPC水(上海源叶生物科技有限公司，S30710)分别溶解CaCl2、siRNA(广州锐博生物科技有限公司，无序序列(NC))，使钙离子浓度为500mM；siRNA的浓度为10μM，取CaCl2溶液与等体积的siRNA混合均匀；
(3)制备第二流体：配制8mg/mL的磷酸化壳聚糖母液，稀释得到不同浓度的磷酸化壳聚糖(PCS)母液，浓度分别为0、2、4、6、8mg/mL；配制磷酸盐缓冲液(各组分的摩尔浓度分别为0.05mol/L HEPES(上海源叶生物科技有限公司，S16013)，0.14mol/L NaCl，3.75mmol/L Na2HPO4，使用10mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2)。将不同浓度的磷酸化壳聚糖溶液加入到等体积的缓冲液中混合均匀备用；
(4)将第一流体和第二流体涡旋混合，制备得到PCS终浓度为0.00、0.67、1.33、2.00、2.67mg/mL的磷酸化壳聚糖/磷酸钙基因纳米颗粒(命名为CaP@PCS)，其中PCS浓度为0mg/mL所制得纳米粒，即为不含钙结合多糖的对照制剂(命名为CaP)，然后将制剂在配制的细胞外缓冲液(2mM CaCl2、3.75mM Na2HPO4、25mM Tris、140mM NaCl，调节pH为7.2)中透析30分钟，除去过量游离的钙离子、磷酸化壳聚糖分子，截留分子量为100kDa。
实施例4：实施例1中制备的基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的表征：
(1)实施例1中制备的硫酸软骨素/磷酸钙的siRNA纳米递送系统粒径和PDI的测定
将实施例1中制备得到的纳米颗粒采用纳米激光粒度测定仪(马尔文ZS90粒度电位仪)测定纳米颗粒的粒径和多分散系数(PDI)，结果总结于下表1。
表1 CaP@CS的粒径和PDI(n＝3)
如表1所示，在2-30mg/mL的优选的浓度范围内，不同浓度硫酸软骨素包裹的磷酸钙siRNA纳米颗粒，粒径小，分散均匀(PDI<0.3)。但当CS浓度过高，纳米粒粒径增长较大，且纳米粒分布不均匀，故从粒径与材料节约的角度综合考虑，特别优选CS浓度范围为4-20mg/mL。
(2)实施例1中制备的硫酸软骨素/磷酸钙的siRNA纳米递送系统的Zeta电位的测定
将实施例1中制备得到的纳米颗粒，通过纳米激光粒度测定仪(马尔文ZS90粒度电位仪)测定纳米颗粒的Zeta电位，结果总结于表2。
表2 CaP@CS的Zeta电位(n＝3)
如表2所示，除未包裹硫酸软骨素的纳米颗粒外，硫酸软骨素/磷酸钙siRNA纳米颗粒的Zeta电位在-6mV至-3mV区间(表2)，电荷翻转表明硫酸软骨素的成功包裹，且上述范围内负电荷量随着修饰比例的增加而增加。但超过一定范围，纳米粒外壳多糖修饰比例达到极限，此时即便增加多糖浓度，纳米粒电位仍不会改变。
实施例5：基于硫酸软骨素/磷酸钙的siRNA纳米递送系统包封率的测定
配制浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μM的Cy5-siRNA(广州锐博生物科技有限公司)，用荧光分光光度计测定荧光强度，得到标准曲线为Y＝22321C-200.64，R2＝0.9999。以与实施例1相同的方法制备载有10μM Cy5-siRNA的硫酸软骨素/磷酸钙siRNA纳米颗粒1mL，置于超滤管中(截留分子量30kDa)，以5000rpm离心30分钟。收集超滤液，使用荧光分光光度计(日本岛津荧光分光光度计)测定游离的荧光强度，并基于游离荧光强度以及标准曲线确定未包封siRNA浓度，并根据siRNA加入总量，计算包封率。包封率(EE)计算如下：
EE＝(Ctotal-Cunloaded)/Ctotal×100％
其中Ctotal是混合物中总siRNA的浓度，Cunloaded表示由纳米颗粒经离心后游离siRNA的浓度。
实验结果：测得硫酸软骨素/磷酸钙siRNA纳米颗粒的包封率为95.7％。
实施例6：基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的细胞摄取实验
4T1细胞(小鼠三阴性乳腺癌细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用含10％胎牛血清(Gibco，10099141)的1640培养液(Gibco，C11875500BT)培养过夜，移除孔内培养液，用PBS洗涤3次后，加入以与实施例1相同的方法制备的含有200nM Cy3-siRNA(广州锐博生物科技有限公司)的纳米颗粒(在本实施例中命名为CaP@CS)，培养基稀释至1mL，继续培养4h后，PBS洗涤三次，4％多聚甲醛(碧云天，P0099)固定10分钟，PBS洗涤三次。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipofectamine 3000Reagent(Thermo Fisher，L3000001)作为阳性对照，无外壳CaP纳米粒为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察细胞对纳米颗粒的吸收，ZeissCLSM软件分析图像。结果示于图5。
实验结果；如图5所示，细胞对硫酸软骨素/磷酸钙siRNA纳米颗粒的摄取高于市售转染试剂Lipo3000和CaP。CaP@CS优秀的细胞摄取能力主要得益于多糖外壳。硫酸软骨素一方面稳定磷酸钙，防止其絮集，保持纳米粒径；另一方面硫酸软骨素具有CD44受体靶向性，可与4T1细胞表面高表达的CD44受体特异性识别并结合，促进其摄取，故而CaP@CS组细胞摄取量高于市售制剂。
实施例7：基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统体外转染实验
NIH-3T3-GFP细胞(小鼠成纤维细胞-转染绿色荧光蛋白，武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用含10％胎牛血清(Gibco，10099141)的DMEM培养液(Gibco，C11995500BT)培养过夜，移除孔内培养液，PBS洗涤3次后，加入含有200nM siGFP(广州锐博生物科技有限公司，SEQ ID NO:1：GGCUACGUCCAGGAGCGCACC(正义链)；SEQ ID NO:2：UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU(反义链))的纳米颗粒(在本实施例中命名为CaP@CS)，培养基稀释至1mL，培养6h后，吸去含有药物的培养基，PBS洗涤三次，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养18h，4％多聚甲醛(碧云天，P0099)固定10分钟。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipofectamine 3000Reagent(Thermo Fisher，L3000001)作为阳性对照，无外壳CaP纳米粒为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察siGFP的转染情况(siGFP对3T3-GFP荧光的沉默效率)，Zeiss CLSM软件分析图像。结果示于图6。
实验结果：如图6所示，硫酸软骨素/磷酸钙siRNA纳米颗粒的沉默效率高于市售转染试剂Lipo3000和CaP。
实施例8：基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统体内转染实验
4-6周龄的雌性BALB/c小鼠(南京市江宁区青龙山动物繁殖场)按照每只鼠1×106个4T1细胞(小鼠三阴性乳腺癌细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)的剂量进行接种。小鼠按照10mg/kg的剂量注射4％水合氯醛，待小鼠麻醉后，使用碘伏消毒皮肤，使用手术剪剖开腹部皮肤，在手术视野下，寻找小鼠乳腺，采用消毒不锈钢弯镊固定乳腺，平行进针后，注射4T1细胞。注射完成后，使用降解缝针线缝合皮肤，伤口使用碘伏消毒后，将小鼠采用仰卧位置于干净鼠笼。在手术后，及时观察小鼠生存状况以及伤口感染情况，完成BALB/c小鼠原位三阴性乳腺癌肿瘤模型的建立。待肿瘤长至100mm3时，将小鼠随机分为3组，每组3只，设置生理盐水组，游离siRNA组以及CaP@CS组，按照0.6mg/kg的PD-L1 siRNA(SEQ ID NO:3：ACUUCUGAGCAUGAACUAAUAUG(正义链)，SEQ ID NO:4：CAUAUUAGUUCAUGCUCAGAAGU(反义链))的剂量进行给药，每3天一次，连续给药6次，并测量肿瘤体积大小，分别量取肿瘤长径a和短径b，并按照公式计算瘤体积。
结果示于图7。图7结果可见，游离的siRNA组肿瘤体积与生理盐水组无显著差别，说明无载体的siRNA在体内难以被细胞摄取并发挥作用。而制剂CaP@CS组肿瘤生长缓慢，肿瘤体积小，证明该制剂可成功递送siRNA至目标细胞，并发挥作用，证实该载体在体内应用的可行性和有效性。
实施例9：微流控制备基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统
制备第一流体：用DEPC水分别溶解CaCl2、siRNA，使钙离子浓度为500mM；siRNA的浓度为10μM，取CaCl2溶液与等体积的siRNA混合均匀。
制备第二流体：将浓度为6mg/mL的硫酸软骨素(CS)溶液与缓冲液(各组分的摩尔浓度分别为0.05mol/L HEPES，0.14mol/L NaCl，3.75mmol/L Na2HPO4，调节pH为7.2)等体积混合。
使用Micro&Nano(INanoTML(Micro&Nano)来制备硫酸软骨素/磷酸钙高效siRNA纳米颗粒：通过微流控芯片的一个入口注入第一流体，并通过微流控芯片的另一个入口注入第二流体。总体积2.1mL，第一流体与第二流体的体积比为1：2，流速比为1：2，总流速：12mL/min，左、右注射器规格2.5mL，起始、结束废液：0.1mL，将硫酸软骨素/磷酸钙高效siRNA纳米颗粒收集在样品收集管中。使用纳米激光粒度测定仪测定粒径和电位。
实验结果：使用微流控制备的硫酸软骨素/磷酸钙siRNA纳米颗粒与涡旋法制备的纳米颗粒相比，粒径更小、更均一(表3)。
表3微流控制备的硫酸软骨素/磷酸钙高效siRNA纳米颗粒的粒径及电位(n＝3)
实施例10：基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效mRNA纳米递送系统的制备与细胞转染
(1)基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效mRNA纳米递送系统的制备
将10μg的能够表达EGFP的mRNA添加到用DEPC水(上海源叶生物科技有限公司，S30710)配制的2.5M的CaCl2溶液中，得到第一流体；将10mg/mL的硫酸软骨素溶液(上海麦克林生化科技有限公司(麦克林Macklin)，C875624)与磷酸盐缓冲液(各组分的摩尔浓度分别为0.05mol/L HEPES(上海源叶生物科技有限公司，S16013)，0.14mol/L NaCl，3.75mmol/L Na2HPO4，调节pH为7.2)等体积混合均匀，得到第二流体；将第一流体和第二流体涡旋混合，制备得到硫酸软骨素/磷酸钙mRNA纳米颗粒(在本实施例中命名为CaP@CS)，然后将制剂在配制的细胞外缓冲液(2mM CaCl2、3.75mM Na2HPO4、25mM Tris、140mM NaCl，调节pH为7.2)中透析30分钟，除去过量游离的钙离子、硫酸软骨素，截留分子量为10kDa。
(2)基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效mRNA纳米递送系统的细胞转染
293T细胞(人胚肾细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用含10％胎牛血清(Gibco，10099141)的DMEM培养液(Gibco，C11995500BT)培养过夜，移除孔内培养液，PBS洗涤3次后，加入含有10μg能够表达EGFP的mRNA(金斯瑞生物科技公司)纳米颗粒(即本实施例中制备得到的CaP@CS)，培养基稀释至1mL，继续培养6h后，吸去含有药物的培养基，PBS洗涤三次，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养18h，4％多聚甲醛(碧云天，P0099)固定10分钟。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipofectamine MessengerMAX(Thermo Fisher，LMRNA003)作为阳性对照，无外壳CaP纳米粒为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察mRNA的转染情况，Zeiss CLSM软件分析图像。结果示于图8。
实验结果：如图8所示，硫酸软骨素/磷酸钙mRNA纳米颗粒的转染效率高于市售转染试剂Lipofectamine和CaP。
(3)基于硫酸软骨素/磷酸钙的高效mRNA纳米递送系统的干细胞转染
hMSC细胞(人脐带间充质干细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用添加10％胎牛血清(Gibco，10099141)的DMEM/F-12高糖培养基(Thermo Fisher，11320033)培养过夜，移除孔内培养液，PBS洗涤3次后，加入含有10μg能够表达EGFP的mRNA(金斯瑞生物科技公司)纳米颗粒(即本实施例中制备得到的CaP@CS)，培养基稀释至1mL，继续培养6h后，吸去含有药物的培养基，PBS洗涤三次，加入含有10％胎牛血清的DMEM/F-12高糖培养液继续培养18h，4％多聚甲醛(碧云天，P0099)固定10分钟。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipofectamine MessengerMAX(Thermo Fisher，LMRNA003)作为阳性对照，无外壳CaP纳米粒为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察mRNA的转染情况，Zeiss CLSM软件分析图像。结果示于图9。
实验结果：如图9所示，硫酸软骨素/磷酸钙mRNA纳米颗粒的hMSC细胞转染效率较高，且优于市售转染试剂Lipofectamine和CaP。
实施例11：实施例2中制备的基于依诺肝素钠/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的表征：
(1)实施例2中制备的依诺肝素钠/磷酸钙的siRNA纳米递送系统的粒径和PDI测定
将实施例2中制备得到的纳米颗粒采用纳米激光粒度测定仪(马尔文ZS90粒度电位仪)测定纳米颗粒的粒径和多分散系数(PDI)，结果总结于下表4。
表4 CaP@ES的粒径和PDI(n＝3)
如表4所示，不同浓度依诺肝素钠包裹的磷酸钙siRNA纳米颗粒，粒径小，分散均匀(PDI<0.3)。但当ES浓度过高，纳米粒粒径增长较大，且纳米粒分布不均匀，故从粒径与材料节约的角度综合考虑，优选ES浓度范围为2-8mg/mL。
(2)实施例2中制备的依诺肝素钠/磷酸钙的siRNA纳米递送系统的Zeta电位的测定
将实施例2中制备得到的纳米颗粒，通过纳米激光粒度测定仪(马尔文ZS90粒度电位仪)测定纳米颗粒的Zeta电位，结果总结于表5。
表5 CaP@ES的Zeta电位(n＝3)
如表5所示，除未包裹硫酸软骨素的纳米颗粒外，依诺肝素钠/磷酸钙siRNA纳米颗粒的Zeta电位在-6mV至-2mV区间(表5)，电荷翻转表明依诺肝素钠的成功包裹。
实施例12：基于依诺肝素钠/磷酸钙的siRNA纳米递送系统包封率的测定
配制浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μM的Cy5-siRNA，用荧光分光光度计测定荧光强度，得到标准曲线为Y＝23724C-178.62，R2＝0.9999。以与实施例1相同的方法制备载有10μM Cy5-siRNA(广州锐博生物科技有限公司)的依诺肝素钠/磷酸钙siRNA纳米颗粒1mL，置于超滤管中(截留分子量30kDa)，以5000rpm离心30分钟。收集超滤液，使用荧光分光光度计(日本岛津荧光分光光度计)测定游离的荧光强度，并基于游离荧光强度以及标准曲线确定未包封siRNA浓度，并根据siRNA加入总量，计算包封率。包封率(EE)计算如下：
EE＝(Ctotal-Cunloaded)/Ctotal×100％
其中Ctotal是混合物中总siRNA的浓度，Cunloaded表示由纳米颗粒经离心后游离siRNA的浓度。
实验结果：测得依诺肝素钠/磷酸钙siRNA纳米颗粒的包封率为96.9％。
实施例13：基于依诺肝素钠/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的细胞摄取实验
4T1细胞(小鼠三阴性乳腺癌细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用含10％胎牛血清(Gibco，10099141)的1640培养液(Gibco，C11875500BT)培养过夜，移除孔内培养液，用PBS洗涤3次后，加入以与实施例1相同的方法制备的含有200nM Cy3-siRNA(广州锐博生物科技有限公司)的纳米颗粒(在本实施例中命名为CaP@ES)，培养基稀释至1mL，继续培养4h后，PBS洗涤三次，4％多聚甲醛(碧云天，P0099)固定10分钟，PBS洗涤三次。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipofectamine 3000Reagent(Thermo Fisher，L3000001)作为阳性对照，无外壳CaP纳米粒为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察细胞对纳米颗粒的吸收，ZeissCLSM软件分析图像。结果示于图10。
实验结果；如图10所示，细胞对依诺肝素钠/磷酸钙siRNA纳米颗粒的摄取高于市售转染试剂Lipo3000和CaP，得益于多糖外壳防止纳米粒蓄积，维持纳米粒粒径的稳定，从而增加细胞的摄取。
实施例14：基于依诺肝素钠/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统体外转染实验
NIH-3T3-GFP(小鼠成纤维细胞-转染绿色荧光蛋白，武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用含10％胎牛血清(Gibco，10099141)的DMEM培养液(Gibco，C11995500BT)培养过夜，移除孔内培养液，PBS洗涤3次后，加入含有200nM siGFP(广州锐博生物科技有限公司，SEQ ID NO:1：GGCUACGUCCAGGAGCGCACC(正义链)；SEQ ID NO:2：UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU(反义链))的纳米颗粒(在本实施例中命名为CaP@ES)，培养基稀释至1mL，培养6h后，吸去含有药物的培养基，PBS洗涤三次，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养18h，4％多聚甲醛(碧云天，P0099)固定10分钟。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipofectamine 3000Reagent(Thermo Fisher，L3000001)作为阳性对照，无外壳CaP为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察siGFP的转染情况(siGFP对3T3-GFP荧光的沉默效率)，Zeiss CLSM软件分析图像。结果示于图11。
实验结果：如图11所示，依诺肝素钠/磷酸钙siRNA纳米颗粒的沉默效率高于市售转染试剂Lipo3000和CaP。
实施例15：实施例3中制备的基于磷酸化壳聚糖/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的表征：
(1)实施例3中制备的磷酸化壳聚糖/磷酸钙的siRNA纳米递送系统的粒径和PDI测定
将实施例3中制备得到的纳米颗粒采用纳米激光粒度测定仪(马尔文ZS90粒度电位仪)测定纳米颗粒的粒径和多分散系数(PDI)，结果总结于下表6。
表6 CaP@PCS的粒径和PDI(n＝3)
如表6所示，不同浓度磷酸化壳聚糖包裹的磷酸钙siRNA纳米颗粒，粒径小，分散均匀(PDI<0.3)。但当PCS浓度过高，纳米粒粒径增长较大，且纳米粒分布不均匀，故从粒径与材料节约的角度综合考虑，优选PCS浓度范围为2-6mg/mL。
(2)实施例3中制备的磷酸化壳聚糖/磷酸钙的siRNA纳米递送系统的Zeta电位的测定
将实施例3中制备得到的纳米颗粒，通过纳米激光粒度测定仪(马尔文ZS90粒度电位仪)测定纳米颗粒的Zeta电位，结果总结于表7。
表7 CaP@PCS的Zeta电位(n＝3)
如表7所示，磷酸化壳聚糖/磷酸钙siRNA纳米颗粒的Zeta电位在+7mV至+17mV区间(表7)，正电荷的增加表明磷酸化壳聚糖的成功包裹。
实施例16：基于磷酸化壳聚糖/磷酸钙的siRNA纳米递送系统包封率的测定
配制浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μM的Cy5-siRNA(广州锐博生物科技有限公司)，用荧光分光光度计(日本岛津荧光分光光度计)测定荧光强度，得到标准曲线为Y＝27374C-220.44，R2＝0.9999。以与实施例1相同的方法制备载有10μM Cy5-siRNA的磷酸化壳聚糖/磷酸钙siRNA纳米颗粒1mL，置于超滤管中(截留分子量100kDa)，以5000rpm离心30分钟。收集超滤液，使用荧光分光光度计测定游离的荧光强度，并基于游离荧光强度以及标准曲线确定未包封siRNA浓度，并根据siRNA加入总量，计算包封率。包封率(EE)计算如下：
EE＝(Ctotal-Cunloaded)/Ctotal×100％
其中Ctotal是混合物中总siRNA的浓度，Cunloaded表示由纳米颗粒经离心后游离siRNA的浓度。
实验结果：测得磷酸化壳聚糖/磷酸钙siRNA纳米颗粒的包封率为94.6％。
实施例17：基于磷酸化壳聚糖/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统的细胞摄取实验
4T1细胞(小鼠三阴性乳腺癌细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用含10％胎牛血清(Gibco，10099141)的1640培养液(Gibco，C11875500BT)培养过夜，移除孔内培养液，用PBS洗涤3次后，加入以与实施例1相同的方法制备的含有200nM Cy3-siRNA(广州锐博生物科技有限公司)的纳米颗粒(在本实施例中命名为CaP@CS)，培养基稀释至1mL，继续培养4h后，PBS洗涤三次，4％多聚甲醛(碧云天，P0099)固定10分钟，PBS洗涤三次。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipo3000作为阳性对照，无外壳CaP纳米粒为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察细胞对纳米颗粒的吸收，Zeiss CLSM软件分析图像。结果示于图12。
实验结果；如图12所示，细胞对磷酸化壳聚糖/磷酸钙siRNA纳米颗粒的摄取高于市售转染试剂Lipo3000和CaP。得益于多糖外壳防止纳米粒蓄积，维持纳米粒粒径的稳定，以及壳聚糖与细胞膜的黏附等原因，从而增加细胞的摄取。
实施例18：基于磷酸化壳聚糖/磷酸钙的高效siRNA纳米递送系统体外转染实验
NIH-3T3-GFP细胞以2×105细胞/孔的浓度接种在20mm共聚焦显微镜培养皿中。用含10％胎牛血清(Gibco，10099141)的DMEM培养液(Gibco，C11995500BT)培养过夜，移除孔内培养液，PBS洗涤3次后，加入含有200nM siGFP(广州锐博生物科技有限公司，SEQ ID NO:1：GGCUACGUCCAGGAGCGCACC(正义链)；SEQ ID NO:2：UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU(反义链))的纳米颗粒(在本实施例中命名为CaP@CS)，培养基稀释至1mL，培养6h后，吸去含有药物的培养基，PBS洗涤三次，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养18h，4％多聚甲醛固定10分钟。以空白作为阴性对照(在本实施例中命名为Control)，以Lipo3000 Reagent(Thermo Fisher，L3000001)作为阳性对照，无外壳CaP纳米粒为对比。LSM700激光共聚焦(德国蔡司)观察siGFP的转染情况(siGFP对3T3-GFP荧光的沉默效率)，Zeiss CLSM软件分析图像。结果示于图13。
实验结果：如图13所示，磷酸化壳聚糖/磷酸钙siRNA纳米颗粒的沉默效率高于市售转染试剂Lipo3000和CaP。
应理解，即使已结合本发明的详细说明来描述本发明，前述说明旨在为示例性的且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来界定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求的范围内。
Claims (14)
1.一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统，其特征在于，所述递送系统为包含外壳和被所述外壳包封的内核的纳米颗粒，
所述内核由磷酸钙和基因载物通过静电缩合形成，所述外壳包含具有钙结合能力的钙结合多糖，所述钙结合多糖与钙通过络合形成络合物。
2.根据权利要求1所述的基因纳米递送系统，其中，所述钙结合多糖包括果糖、硫酸软骨素、磺达肝癸钠、硫酸乙酰肝素、达肝素钠、依诺肝素钠、氧化壳聚糖、磷酸化壳聚糖、麦芽糖壳聚糖、戊二醛交联壳聚糖、聚氨基葡萄糖羧酸钠、磷酸化纤维素及它们的类似物或衍生物等以及以上物质的混合物组成的组中的至少一种；优选地所述钙结合多糖为硫酸软骨素及其衍生物、依诺肝素钠及其衍生物、磷酸化壳聚糖及其衍生物以及以上物质的混合物组成的组中的至少一种，其中，所述类似物或衍生物包括赖氨酸修饰、三聚磷酸修饰、柠檬酸修饰、甘氨酸修饰、聚谷氨酸修饰、聚天门冬氨酸修饰、聚乙二醇修饰的衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的基因纳米递送系统，其中，所述基因载物包括DNA、RNA及其杂合体；优选地，所述基因载物选自由互补DNA(cDNA)、质粒DNA(pDNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、反义RNA、miRNA、多价RNA、病毒RNA(vRNA)和CRISPRRNA序列组成的组中的至少一种；优选地，所述基因载物选自siRNA和mRNA中的至少一种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因纳米递送系统，其中，所述外壳与所述内核的质量比为1:1～200:1；所述内核中的所述磷酸钙与所述基因载物的质量比为1:1～1000:1，优选地，所述外壳与所述内核的质量比为8:1～35:1；所述内核中的所述磷酸钙与所述基因载物的质量比为1:1～100:1；更优选地，所述外壳与所述内核的质量比为10:1～30:1；所述内核中的所述磷酸钙与所述基因载物的质量比为1:1～35:1。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因纳米递送系统，其中，所述纳米颗粒的粒径为10～1000nm，所述纳米颗粒的Zeta电位为-30mV～25mV；优选地，所述纳米颗粒的粒径为50～300nm；所述纳米颗粒的Zeta电位为-20mV～20mV，更优选地，所述纳米颗粒的粒径为100～200nm；所述纳米颗粒的Zeta电位为-15mV～15mV。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的基因纳米递送系统，其中，所述内核由磷酸钙和基因载物组成。
7.一种根据权利要求1至6中任一项所述的基因纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)提供第一流体，所述第一流体包含基因载物和钙盐的含水溶液；
2)提供第二流体，所述第二流体包含钙结合多糖和磷酸盐缓冲液；
3)使所述第一流体和第二流体混合，由此形成基于钙结合多糖和磷酸钙的纳米颗粒；
其中，
在所述第一流体中，所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙中的一种或两种；
在所述第二流体中，所述磷酸盐缓冲液包括HEPES溶液、磷酸盐溶液、氯化钠溶液；优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0～8.0；优选地，所述磷酸盐溶液包括选自由(NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、(NH4)H2PO4、Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4组成的组中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，
在所述步骤1)中，在所述第一流体中，所述钙盐的含水溶液中的钙离子浓度为10～3000mM，基因载物的浓度为0.5～40μM；优选地，钙离子浓度为250～1500mM，基因载物的浓度为2.5～35μM；更优选地，钙离子浓度为250～500mM，基因载物的浓度为2.5～30μM；
在所述步骤2)中，在所述第二流体中，所述HEPES溶液的浓度为10～150mM，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～50mM，所述氯化钠溶液的浓度为50～500mM，钙结合多糖的浓度为0.5～50mg/mL，优选地，HEPES溶液的浓度为10～100mM，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～20mM，所述氯化钠溶液的浓度为50～300mM，钙结合多糖的浓度为0.5～30mg/mL；更优选地，HEPES溶液的浓度为10～60mM，所述磷酸盐溶液的浓度为0.5～10mM，所述氯化钠溶液的浓度为50～200mM，钙结合多糖的浓度为0.5～20mg/mL；
在所述步骤3)中，所述钙结合多糖与所述基因载物的质量比为1:1-1000:1。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其中所述方法任选地还包括将步骤3)中获得的纳米颗粒在细胞外缓冲液中透析。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的制备方法，其中所述步骤3)中的混合通过涡旋法或微流控法进行，优选地，所述混合通过微流控法进行。
11.一种将基因载物递送至靶细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将所述细胞与根据权利要求1至6中任一项所述的基因纳米递送系统接触。
12.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括根据权利要求1至6中任一项所述的基因纳米递送系统和药学上可接受的赋形剂。
13.权利要求1至6中任一项所述的基因纳米递送系统在制备预防或治疗疾病的药物中的用途；优选地，所述疾病包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病、炎症性疾病；更优选地，所述疾病为乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤、头颈部恶性肿瘤、食管癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌等实体瘤、白血病、多发性骨髓瘤、以及恶性淋巴瘤等血液系统肿瘤、以及骨关节炎等。
14.权利要求1至6中任一项所述的基因纳米递送系统在制备细胞制剂中的用途，其特征在于，所述基因纳米递送系统能够在体外高效转染细胞，且所获得的细胞制剂可用于细胞疗法；优选地，所述细胞制剂包括干细胞制剂、NK细胞制剂、巨噬细胞制剂、T细胞制剂、Treg细胞制剂、NKT细胞制剂、DC细胞制剂、CAR-NK细胞制剂、CAR-巨噬细胞制剂、CAR-T细胞制剂、CAR-Treg细胞制剂、CAR-NKT细胞制剂、TCR-T细胞制剂以及它们的组合；更优选地，所述细胞制剂为干细胞制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211236178.7A CN115778918A (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211236178.7A CN115778918A (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115778918A true CN115778918A (zh) | 2023-03-14 |
Family
ID=85432762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211236178.7A Pending CN115778918A (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115778918A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102380103A (zh) * | 2011-10-28 | 2012-03-21 | 复旦大学 | 甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用 |
| CN103789348A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-05-14 | 中国药科大学 | 一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统及其制备方法 |
| CN105602988A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-05-25 | 中南大学湘雅医院 | 一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法 |
| CN106659695A (zh) * | 2014-05-28 | 2017-05-10 | 赢创罗姆有限公司 | 纳米颗粒 |
| WO2018026833A1 (en) * | 2016-08-01 | 2018-02-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Particles for delivery of proteins and peptides |
| CN111973573A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-11-24 | 中山大学附属第七医院(深圳) | 一种磷酸钙纳米颗粒及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-10-10 CN CN202211236178.7A patent/CN115778918A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102380103A (zh) * | 2011-10-28 | 2012-03-21 | 复旦大学 | 甘露糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用 |
| CN103789348A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-05-14 | 中国药科大学 | 一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统及其制备方法 |
| CN106659695A (zh) * | 2014-05-28 | 2017-05-10 | 赢创罗姆有限公司 | 纳米颗粒 |
| CN105602988A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-05-25 | 中南大学湘雅医院 | 一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法 |
| WO2018026833A1 (en) * | 2016-08-01 | 2018-02-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Particles for delivery of proteins and peptides |
| CN111973573A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-11-24 | 中山大学附属第七医院(深圳) | 一种磷酸钙纳米颗粒及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| XIANG LIANG等: ""Chondroitin sulfate modified and adriamycin preloaded hybrid nanoparticles for tumor-targeted chemotherapy of lung cancer"", 《KAOHSIUNG J MED SCI》, vol. 37, no. 5, 19 December 2020 (2020-12-19), pages 411 - 418 * |
| 梁平: ""用于药物传递和药物/基因共传递的多功能有机/无机杂化纳米粒子的研究"", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊） 工程科技I辑》, 31 July 2018 (2018-07-31), pages 016 - 40 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fu et al. | Recent progress in microRNA-based delivery systems for the treatment of human disease | |
| Pinese et al. | Sustained delivery of siRNA/mesoporous silica nanoparticle complexes from nanofiber scaffolds for long-term gene silencing | |
| Cavallaro et al. | Polymeric nanoparticles for siRNA delivery: Production and applications | |
| US10087442B2 (en) | Polycation-functionalized nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing agents | |
| Cohen et al. | Acid-degradable cationic dextran particles for the delivery of siRNA therapeutics | |
| Nikitenko et al. | Non-viral delivery and therapeutic application of small interfering RNAs | |
| JP2017520549A (ja) | 核酸の送達のためのリポソーム製剤 | |
| Aminabhavi et al. | The role of nanotechnology and chitosan-based biomaterials for tissue engineering and therapeutic delivery | |
| Yu et al. | Biomaterial‐based gene therapy | |
| Chen et al. | The Hydrophobicity of AIE Dye Facilitates DNA Condensation for Carrier‐Free Gene Therapy | |
| Abdellatif et al. | Non-coding RNA-directed therapeutics in lung cancer: delivery technologies and clinical applications | |
| Dong et al. | A review of chitosan in gene therapy: Developments and challenges | |
| Dermani et al. | SiRNA delivery technology for cancer therapy: Promise and challenges | |
| EP3372233B1 (en) | Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer | |
| CN115778918A (zh) | 一种基于钙结合多糖和磷酸钙的基因纳米递送系统及其制备方法与应用 | |
| Kuche et al. | Hyaluronic acid as an emerging technology platform for silencing RNA delivery | |
| Li et al. | Hyaluronic modified and amine-functionalized silica nanoparticles as intracellular siRNA delivery carriers in lung cancer gene therapy | |
| Haidar | NanoDentistry: Perspectives on the role of NanoBiotechnology in biomaterials, pharmaceutics and BioDental tissue engineering | |
| Dilsiz | Exosomes as new generation vehicles for drug delivery systems | |
| Barua et al. | siRNA Delivery for Therapeutic Applications Using Nanoparticles | |
| Praça et al. | Recent Advances in Nanocarriers Used for Selective Gene Silencing Therapy | |
| US11266672B2 (en) | Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer | |
| US10689649B2 (en) | Pharmaceutical composition for treating and/or preventing cancer | |
| Sequeira | Internship and Monograph reports entitled” Cell Membrane-Coated Nanosystems for Gene Delivery Applications | |
| Yoon et al. | Y-shaped oligonucleotides: a promising platform for enhanced therapy with siRNA and CpG Oligodeoxyribonucleotides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |