CN105602988A - 一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法 - Google Patents

一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法。所述钙磷盐基因载体包括作为载体本体的钙磷盐，所述钙磷盐表面被聚乙烯亚胺修饰。所述CaP/PEI/DNA纳米载体是由权利要求1至3任一项所述钙磷盐基因载体与质粒结合而成。本发明制备的以CaP为核心的纳米载体的转染率稳定高于50％的纳米载体，已具备投入实际应用的可能。

Description

一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法
技术领域
本发明属于复合材料技术领域，尤其涉及一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法。
背景技术
对于致残及难以恢复的疾病，基因治疗是一种的预防，治疗及可能治愈这类疾病的有前景的根本性革新手段。然而，基因治疗的发展因细胞转染及基因表达的技术不足而被限制。然而，基因治疗的发展因细胞转染及基因表达的技术不足而被限制。
克服基因转染的屏障
基因传递的最终目标是使基因材料安全及有效的到达靶细胞核。达到此目标因外源基因到达细胞核的重重屏障而受阻，而使基因表达以治疗或预防疾病又必须到达细胞核。这类屏障包括载体胞外稳定性，体内分布，细胞的摄取及胞内入核的途径。
理想的载体性质
为克服这些屏障，以介导安全有效的基因传递，基因载体需有以下性质：与基因结合牢固及携带大量基因，保护基因，储存及生物稳定性，靶向运输，被细胞内化的能力及从内涵体逃逸以释放基因，胞内对于核的定向运输及入核，足够的停留时间使基因表达，无毒性，无免疫原性，可生物降解及生物相容性。具有这些性质的载体目前还不存在，目前存在的载体因其一些难以接受的副作用及不足够的转染效率而难以广泛应用。
当前载体的挑战
过去，病毒载体因其本身具备的转染多种细胞的能力而成为一种主要的基因转染载体，但是，病毒载体的应用却因为其制备复杂，低运载量，包括其致炎症反应，具有免疫原性，病毒重组，激活原癌基因及难以控制等潜在安全问题而受限。近期的研究主要专注于非病毒载体，因其低毒，无免疫原性且合成步骤简易，运载量大。但相比较于病毒载体，非病毒载体仍有低转染率及较低的基因表达效率等问题。
非病毒载体包括阳离子脂质体，阳离子聚合物及无机材料以保护基因不被核酶降解及促使基因被细胞摄取，然而这些方式均是非特异性的且载体会在胞外与蛋白结合而消耗了基因。
阳离子脂质体及阳离子聚合物因其能与带负电荷的细胞膜吸附进而被摄取而成为主要研究的非病毒载体。但是，考虑到其毒性，这两类载体在体内模型的基因表达量并不令人满意。阳离子脂质体亦因其不稳定性，免疫应答性及易被血流清除而应用进一步受限。壳聚糖亦具有生物相容性，可降解性，易于合成，及可被带电荷基团连接从而可以结合胞外或胞内靶向配体。然而，目前的壳聚糖及其衍生物的转染侠侣相比于病毒转染效率仍很低。新型纳米颗粒载体例如碳纳米管已被证明重现性好，且可制备出所需的不同粒径及形状的颗粒，然而其低溶解性及潜在毒性限制了它的临床应用。
钙磷盐(CaP)作为基因载体
钙磷盐具备许多能够成为理想载体的特性。钙磷盐还是牙齿及骨骼最主要的成分，因此其有高度生物相容性，且不会导致变态及炎症反应。因带负电荷的基因骨架与Ca2+电荷吸引作用，基因与钙磷盐有很高的亲和性从而发生缩合及包装。同时，也使得钙磷盐能够携带大段的基因调控序列以提高基因表达水平，并使钙磷盐基因复合物能稳定穿过次薄膜。因钙磷盐在酸性条件下溶解，基因在内涵体中与CaP解离。钙磷盐可用于各种不同组织并可通过连接配体实现靶向转运。此外，其可通过简单廉价的方式合成。因此，CaP纳米颗粒具有能够克服多重基因运输屏障的潜力。
尽管钙磷盐有上述多种优势，但因其一些关键性缺陷限制了其成为基因载体：颗粒不均一性，易沉淀，不稳定及分散性差。到目前为止，合成的钙磷盐因其对温度，pH值，钙离子及磷酸根离子浓度，溶液搅拌速率及方式以及添加剂的加入的高度敏感性，其大小，新装，表面电荷及结晶性存在差异。如上所述，形态及理化性质对转染及细胞摄取起到了关键作用。颗粒的不均一性导致转染效果不一致，并可使机体产生难以预测的后果，这将限制其作为基因载体的应用。
快速沉淀法制备CaP
为了制备出形态及理化性质较均一的CaP纳米，Sokolova等人利用快速沉淀法制备CaP纳米，其所制备CaP纳米稳定性好，重复性高，其课题组采用多种修饰方式，在多种细胞系进行转染，然而，其转染率低于50％。
发明内容
本发明旨在克服现有技术上述的不足，提供一种钙磷盐基因载体、CaP/PEI/DNA纳米载体及制备方法
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述钙磷盐基因载体包括作为载体本体的钙磷盐，所述钙磷盐(CaP)表面被聚乙烯亚胺(PEI)修饰。
所述钙磷盐基因载体粒径为245—255nm，电荷在0.2—0.3mv，PDI为0.2—0.3。优选地，所述钙磷盐基因载体粒径为251.6nm，电荷在0.22mv，PDI为0.211。
所述钙磷盐基因载体的制备方法包括如下步骤：
(1)制备钙磷盐：制备浓度为6—6.5mM硝酸钙溶液和浓度为3—4mM磷酸氢二铵溶液，调整硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液的pH为9—9.2，将等体积的硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液混合，形成作为载体本体的钙磷盐溶液；
(2)聚乙烯亚胺修饰钙磷盐：向步骤(1)制备的钙磷盐溶液中加入体积浓度为1.8—2.2mg/mL聚乙烯亚胺溶液，钙磷盐溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比为(9—11)：1，振荡后即得钙磷盐基因载体悬浮液。
优选地，方法中,是将等体积的硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液用蠕动泵以34ml/min的速度同速泵入容器以混合，所述硝酸钙溶液浓度为6.25mM；所述磷酸氢二铵溶液浓度为3.74mM；所述聚乙烯亚胺溶液体积浓度为2mg/mL；所述钙磷盐溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比为10：1。
所述CaP/PEI/DNA纳米载体是由上述钙磷盐基因载体与质粒结合而成。
所述CaP/PEI/DNA纳米载体粒径为225—235nm，电荷在25—30mv，PDI为0.1—0.2。优选地，所述CaP/PEI/DNA纳米载体粒径为233.1nm，电荷在27.7mv，PDI为0.123。
所述CaP/PEI/DNA纳米载体的制备方法是用与钙磷盐基因载体悬浮液等体积的水将钙磷盐基因载体悬浮液稀释，振荡后加入体积浓度为0.8—1.2mg/mL的质粒溶液，稀释后的钙磷盐基因载体悬浮液与质粒溶液的体积比为(34—38)：1，混匀后即得CaP/PEI/DNA纳米载体。优选地，方法中所述质粒溶液的体积浓度为1mg/mL；所述稀释后的钙磷盐基因载体悬浮液与质粒溶液的体积比为36：1。
下面对本发明作进一步说明：
本发明采用以Sokolova等人发明快速沉淀反应制备CaP为核心，该快速沉淀反应将硝酸钙、磷酸氢二铵及PEI用蠕动泵同速(34mL/min)泵入混匀；而本发明调整了硝酸钙溶液及磷酸氢二铵溶液的pH值，硝酸钙溶液及磷酸氢二铵溶液混匀后形成CaP，再加入PEI，利用电荷吸引原理与CaP结合，抑制CaP继续结晶，同时控制了粒径，提高转染系统稳定性提高并使其整体带正电荷，与DNA结合后，转染体系(CaP/PEI/DNA)的使用Nanozs90粒度分析仪测试，粒径为233.1nm，zeta电位为27.7mv。本发明制备的以CaP为核心的纳米载体的转染率稳定高于50％的纳米载体，已具备投入实际应用的可能。
附图说明
图1是质粒与CaP/PEI结合实验结果图，图中：1道：marker2道p-EGFP-N13道CaP/PEI/DNA。
具体实施方式
实施例1
所述钙磷盐基因载体包括作为载体本体的钙磷盐，所述钙磷盐表面被聚乙烯亚胺修饰。所述钙磷盐基因载体粒径为251.6nm，电荷在0.22mv，PDI为0.211。
实施例2
制备实施例1所述钙磷盐基因载体的制备方法包括如下步骤：
(1)制备钙磷盐：制备浓度为6.25mM硝酸钙及3.74mM磷酸氢二铵溶液，采用用超纯水溶解，用0.1M氢氧化钠溶液调整硝酸钙及磷酸氢二铵溶液pH为9—9.2，各取5mlpH调整为9—9.2的6.25mM硝酸钙及3.74mM磷酸氢二铵溶液，利用蠕动泵(34mL/min)同速泵入小烧杯中，混合以形成作为载体本体的钙磷盐溶液，制备过程中用磁力搅拌器搅拌；
(2)聚乙烯亚胺修饰钙磷盐：待硝酸钙及磷酸二氢铵溶液全部泵入小烧杯中，等待5秒，加入体积浓度为2mg/mL聚乙烯亚胺溶液溶液，钙磷盐溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比为10：1，以终止CaP继续结晶，充分振荡30s。取一定量CaP/PEI,加入等体积超纯水稀释，充分振荡30s，振荡后即得钙磷盐基因载体悬浮液。
实施例3
所述CaP/PEI/DNA纳米载体是由实施例1所述钙磷盐基因载体与质粒结合而成。所述CaP/PEI/DNA纳米载体粒径为233.1nm，电荷在27.7mv，PDI为0.123。
实施例4
制备实施例3所述CaP/PEI/DNA纳米载体的制备方法是用与钙磷盐基因载体悬浮液等体积的水将钙磷盐基因载体悬浮液稀释，振荡后加入体积浓度为1mg/mL的质粒溶液，稀释后的钙磷盐基因载体悬浮液与质粒溶液的体积比为36：1，混匀后即得CaP/PEI/DNA纳米载体。
实施例5PEI修饰CaP搭载质粒转染实验报告
1、材料与方法
材料
pEGFP-N1质粒；pEGFP-N-XIAP质粒；293t细胞系；HeLa细胞系；5-8F细胞系)；6-10B细胞系；质粒大量提取盒购自美国Qiagen公司；PBS缓冲液、DMEM高糖培基、0.25％胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；PEI(2.5kD，branched)购自Sigma公司；四水硝酸钙(分析纯)购自国药集团化工试剂有限公司；磷酸氢二铵(分析纯)购自国药集团化工试剂有限公司；lipo2000购自invitrogen公司；DAPI及MTT工作液均购自碧云天公司。
方法
合成CaP/PEI/DNA纳米载体
使用快速沉淀法制备CaP，其方法为：制备浓度为6.25mM硝酸钙及3.74mM磷酸氢二铵溶液，采用用超纯水溶解，用0.1M氢氧化钠溶液调整硝酸钙及磷酸氢二铵溶液pH至9，各取5mlpH调整为9的6.25mM硝酸钙及3.74mM磷酸氢二铵溶液，利用蠕动泵(34ml/min)同速泵入混合以形成CaP，制备过程中用磁力搅拌器搅拌。待硝酸钙及磷酸二氢铵溶液全部泵入小烧杯中，等待数秒，加入一定量浓度为2mg/mlPEI溶液(CaP：PEI体积比为10:1)以终止CaP继续结晶，充分混匀30s。取一定量CaP/PEI,加入等体积超纯水稀释，充分混匀30s，即为用于与载体结合的CaP/PEI悬浮液，加入一定量DNA(CaP/PEI：DNA体积比为36:1)与CaP/PEI悬浮液充分混匀，即制备出用于转染的CaP/PEI/DNA转染液。
纳米载体的粒径及电位
1)取200ulCaP/PEI加入600ul超纯水，超声仪100％能量超声5min，)设置Nanozs90粒度分析仪的分散剂为水，检测样品粒径及电位
2)取200ulCaP/PEI/DNA加入600ul超纯水，超声仪70％能量超声5min，)设置Nanozs90粒度分析仪的分散剂为水，检测样品粒径及电位
质粒与CaP/PEI结合实验
CaP/PEI/DNA悬浮液在4℃下以14000g离心15min，取5ul上清，加入1ulDNA载样液，混匀后加样，以1kbladder为标志行电泳。
细胞培养及转染
用于转染的细胞系为：HeLa细胞系，293T细胞系，5-8F细胞系，6-10B细胞系。HeLa细胞系及293T细胞系采用高糖DMEM培基加入10％胎牛血清，培养于37℃，5％CO2的环境中；5-8F细胞系及6-10B细胞系采用RPMI1640培养基加入10％胎牛血清，培养于37℃，5％CO2的环境中。转染前12h，消化生长到70-80％汇合的细胞，种于24孔板，细胞量为2.5*104/孔，每孔500ml相应细胞培基。
Lipo2000转染过程：按照lipo2000说明书操作：0.8ugDNA溶于50ul无血清高糖DMEM培基(HeLa及293T细胞系)或RPMI1640培基(5-8F及6-10B细胞系)，2ullipo2000溶于50ul相应细胞系所需无血清培基，放置5min后，两者充分混匀，放置25min。更换细胞培基为500ml相应无血清培基，加入转染液，充分混匀，转染5h-6h，更换培基为相应含血清完全培基，培养48h。
CaP/PEI/DNA转染液转染过程：载体携带pEGFP-N1质粒，更换细胞培基为500ml相应无血清培基，每孔加入40ul按上述方法制备的CaP/PEI/DNA转染液，充分混匀，转染7h，更换培基为相应含血清完全培基，培养48h。
DAPI复染细胞核
确认培养细胞有表达之后，吸取每孔的培养基后以PBS每次1ml漂洗3次，每孔加入4％多聚甲醛1ml，固定15min。避光吸取3ulDAPI原液，加入6ml去离子水中，吹打均匀。避光备用。以PBS漂洗3次洗去多聚甲醛后，每孔加入200ul5mg/mlDAPI，孵育4min后，PBS漂洗3次后，每孔再加500ulPBS后于荧光显微镜下观察细胞转染率。
MTT细胞毒性实验
将HeLa细胞，293T细胞，5-8F细胞，6-10B细胞分别消化，接种于96孔板，每孔100ul，细胞量10000/孔，培养12h，更换为无血清培基，每孔加入10ulCaP/PEI/DNA转染液，转染7h后，更换为完全培基，继续培养48h，吸去旧培基，每孔加入200ulPBS漂洗3遍后，重新加入180ul1％FBS培基，再加入20ul5mg/mlMTT液，充分混匀，避光培养4h。设置调零孔及不加转染液对照孔。吸去含MTT的培基，再加入100ulDMSO，避光在摇床上50rpm8min。将96孔板置于酶标仪上，设置主波长490nm，参考波长633nm读板。调零后，按照自身吸光值与对照孔吸光值的比值计算每个处理孔的细胞生存率。
纳米载体携带治疗基因转染
按上述方法制备CaP/PEI/pEGFP-N1-XIAP,在HeLa细胞系进行转染，方法同上。
2、结果
纳米载体的粒径及电位见表1
表1
如表1所示，CaP/PEI粒径均值为251.6nm，PDI为0.211,表明颗粒粒径均一，无明显团聚，但其电位仅为0.22mv，为不稳定体系，放置数小时后可看到明显沉淀形成。CaP/PEI/DNA粒径均值为233.1nm，PDI为0.123,表明加入质粒后可以进一步压缩颗粒，使其粒径减小，且电位上升至27.7mV，体系稳定，放置数日仍无明显沉淀生成，这说明正点位的PEI链条可穿过DNA层或部分PEI重新分不到颗粒的表明使得颗粒整体正电位上升。
质粒与CaP/PEI结合实验
质粒结合实验结果如图1所示，表明CaP/PEI与DNA结合紧密，可携带质粒用于转染。
细胞转染结果及MTT毒性实验见表2
表2
CaP/PEI/DNA在各细胞系转染率虽稍低于Lipo2000转染液，然而其细胞毒性显著小于Lipo2000转染液。
携带治疗基因载体转染结果见表3
表3
携带治疗基因后载体转染率并无明显下降，提示该载体具有携带大片段基因能力，可应用于基因治疗。

Claims (10)

1.一种钙磷盐基因载体，其特征在于，所述钙磷盐基因载体包括作为载体本体的钙磷盐，所述钙磷盐表面被聚乙烯亚胺修饰。
2.如权利要求1所述的钙磷盐基因载体，其特征在于，所述钙磷盐基因载体粒径为245—255nm，电荷在0.2—0.3mv，PDI为0.2—0.3。
3.如权利要求2所述的钙磷盐基因载体，其特征在于，所述钙磷盐基因载体粒径为251.6nm，电荷在0.22mv，PDI为0.211。
4.一种CaP/PEI/DNA纳米载体，其特征在于，所述CaP/PEI/DNA纳米载体是由权利要求1至3任一项所述钙磷盐基因载体与质粒结合而成。
5.如权利要求4所述的CaP/PEI/DNA纳米载体，其特征在于，所述CaP/PEI/DNA纳米载体粒径为225—235nm，电荷在25—30mv，PDI为0.1—0.2。
6.如权利要求5所述的CaP/PEI/DNA纳米载体，其特征在于，所述CaP/PEI/DNA纳米载体粒径为233.1nm，电荷在27.7mv，PDI为0.123。
7.如权利要求1至3任一项所述钙磷盐基因载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备钙磷盐：制备浓度为6—6.5mM硝酸钙溶液和浓度为3—4mM磷酸氢二铵溶液，调整硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液的pH为9—9.2，将等体积的硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液混合，形成作为载体本体的钙磷盐溶液；
(2)聚乙烯亚胺修饰钙磷盐：向步骤(1)制备的钙磷盐溶液中加入体积浓度为1.8—2.2mg/mL聚乙烯亚胺溶液，钙磷盐溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比为(9—11)：1，振荡后即得钙磷盐基因载体悬浮液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述硝酸钙溶液浓度为6.25mM；所述磷酸氢二铵溶液浓度为3.74mM；所述聚乙烯亚胺溶液体积浓度为2mg/mL；所述钙磷盐溶液与聚乙烯亚胺溶液的体积比为10：1；所述将等体积的硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液混合是将等体积的硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液用蠕动泵以34ml/min的速度同速泵入容器以混合。
9.如权利要求4至6任一项所述CaP/PEI/DNA纳米载体的制备方法，其特征在于，所述方法是用与钙磷盐基因载体悬浮液等体积的水将钙磷盐基因载体悬浮液稀释，振荡后加入体积浓度为0.8—1.2mg/mL的质粒溶液，稀释后的钙磷盐基因载体悬浮液与质粒溶液的体积比为(34—38)：1，混匀后即得CaP/PEI/DNA纳米载体。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述质粒溶液的体积浓度为1mg/mL；所述稀释后的钙磷盐基因载体悬浮液与质粒溶液的体积比为36：1。
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