CN101791408B - 一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，该阳离子聚合物基因载体以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链构成，其中聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K。本发明还公开了该阳离子聚合物基因载体的制备方法及应用。本发明提供的接枝共聚物成本较低，具有低的细胞毒性、生物降解性能、较高的细胞转染效率、且转染效率不受血清影响，是一种适用范围较广，极有前景的阳离子聚合物基因载体。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一类以海藻酸钠为骨架、以聚乙烯亚胺为侧链，可生物降解的阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗是将具有治疗意义的遗传物质转移至人体细胞，表达出所需要的多肽和蛋白质，从而达到治病目的的一种新方法。如何利用载体将外源基因准确有效地导入靶细胞是基因治疗成功的关键技术。基因载体包括病毒和非病毒载体。目前的临床实验研究中80％采用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒类载体。病毒载体的优点是转染效率高，缺点是存在免疫原性、毒性、致癌性、宿主DNA插入整合等安全隐患。非病毒载体可克服前者在免疫原性及安全性等方面存在的问题，而且具有物理化学性能可控、重复性好、易于制造、成本较低、装载DNA的能力强，可大规模生产等优点，因此正成为基因载体研究中的一个热点。但非病毒载体的最大问题是转染效率较病毒载体低得多。
非病毒载体包括阳离子脂质体和可降解阳离子聚合物。阳离子脂质体在体外无血清基因转染中有较高的效率，但有血清时则转染效率极低。在体内应用时，它极易被血清迅速清除，并蓄积在肺组织，诱发强烈的炎症反应，导致高水平的毒性。而阳离子聚合物载体具有优异的DNA结合及保护能力，可方便地对其进行靶向性及生物适用性改性，提高其抗血清能力及基因转染效率、降低细胞毒性等，近年成为重要研究领域。
为了提高阳离子聚合物的基因转染效率，研究者从基因治疗过程中的两个重要步骤，即基因传输和基因表达着手，设计了各种解决方案：如采用可降解阳离子聚合物，使DNA/聚合物复合物进入细胞后因聚合物的降解而使质粒更容易和载体分离；在阳离子聚合物中引入内涵体破坏性基团或成分，使复合物能从进入细胞后形成的内涵体中逸出；引入靶向基团，使基因靶向传输到特定细胞，进而 增强复合物受体介导的内吞；引入核定位信号因子，使复合物能在细胞液中接近细胞核并将DNA转运至细胞核等来弥补转染效率不足的缺点，这些方法目前都取得了一定的效果，但仍未达到临床使用要求。
目前用做基因载体的阳离子聚合物包括聚赖氨酸、聚乙烯亚胺及其改性产物、聚酰胺基胺、聚氨基酯、聚脒、壳聚糖及其改性产物、带有阳离子侧基的聚烯烃等。其中聚乙烯亚胺PEI具有优良的DNA装载能力，及可促进DNA从内涵体逃逸至细胞质中的“质子海绵”特性，是目前被研究得最多的具有较高转染效率的阳离子聚合物基因载体，但它不可降解，且分子量越大，转染效率越高，细胞毒性也越大。研究证明，当PEI的分子量为25k时具有较高的基因转染效率、较高的细胞毒性；当PEI的分子量＜2k时，基本无细胞毒性，且可通过代谢排出体外，但它的转染效率也低。因此，研究者对PEI进行了各种改性，以期进一步提高其基因转染效率和降低细胞毒性，适应临床的使用要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，该阳离子聚合物基因载体具有生物相容性好、可控的降解性能、基因转染效率高、细胞毒性低、安全实用、成本低等优点。
本发明的目的还在于提供上述具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物的制备方法，该制备方法工艺简单、易于控制。
本发明的目的还在于提供上述阳离子聚合物在基因治疗中作为基因载体的应用。
本发明提供的一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该阳离子聚合物基因载体以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链构成，其中聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K。
本发明提供的阳离子聚合物基因载体的其中一种制备方法，包括以下步骤：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA溶于水中，得溶液1；
(2)将聚乙烯亚胺PEI溶于水中，用酸液调节pH至6～11，得溶液2；
(3)搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，滴完后，继续搅拌反应；
(4)将(3)中反应液在蒸馏水中透析，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI。
本发明提供的阳离子聚合物基因载体的另一种制备方法，包括以下步骤：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA溶于水中，得溶液1；
(2)将聚乙烯亚胺PEI溶于水中，用酸液调节pH至6～11，得溶液2；
(3)搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，滴完后，继续搅拌反应；
(4)将(3)中反应液用碱液调节pH至7～11，然后加入NaBH4，继续搅拌反应，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱及多醛基海藻酸钠MASA中的醛基，反应产物在蒸馏水中透析，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
上述方法一和方法二的步骤(1)中所述的多醛基海藻酸钠MASA氧化程度为20％～50％，Mη＝15K～40K。
上述方法一和方法二的步骤(2)中所述的聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K。
上述方法一和方法二的步骤(2)中采用0～3M的酸液调节pH至6～11，所述的酸液为盐酸或硫酸。
上述方法一和方法二的步骤(3)中将溶液1缓慢滴入溶液2中，0.5～2小时内滴完，滴完后，在4℃～室温下继续搅拌反应24～48小时。
上述方法一的步骤(4)中反应液在蒸馏水中透析48～72小时。
上述方法二的步骤(4)中采用0～1M的碱液调节反应液的pH至7～11，所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾；步骤(4)中加入的NaBH4的摩尔数与多醛基海藻酸钠MASA中醛基的摩尔数之比为5～100；步骤(4)中将NaBH4加入反应液后继续搅拌反应12～24小时，反应产物在蒸馏水中透析48～72小时。
本发明提供的具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物在基因治疗中作为基因载体的应用。
本发明提供的一类以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链的阳离子聚合物基因载体，它能综合利用PEI对DNA的强的结合和压缩能力及可自发突破吞噬泡的“质子海绵”特性，多醛基海藻酸钠优良的生物相容性、可降解性及降解产物无毒(海藻酸分子量＜80K即可从体内清除)、分子链上存在羧基阴离子(载体进入细胞质降解后，羧基阴离子可中和部分阳离子，降低降解产物的电荷量，从而降低细胞毒性)的优点，提高载体的基因转染效率、降低细胞毒性。实验证明，这种载体基本无细胞毒性，可生物降解，有较高的基因转染效率：在以肝癌细胞BEL7402为靶细胞，GFP为目标基因进行无血清转染实验时，接枝共聚物的最大基因转染效率约为PEI 25k的2倍，和市售的阳离子脂质体lipofectamin相当；有血清转染时，最大转染效率和PEI 25k相当，是一个成本较低、转染效率高、毒性低，具有极好应用前景的阳离子聚合物基因载体。
附图说明
图1.1为聚乙烯亚胺PEI修饰的多醛基海藻酸钠MASA的制备示意图(图中A表示未经还原的PEI修饰的多醛基海藻酸钠；B表示还原的PEI修饰的多醛基海藻酸钠)；
图1.2为接枝共聚物的13C NMR谱图；
图2为接枝共聚物的降解示意图；
图3为MTT法测定接枝共聚物溶液的细胞毒性示意图；
图4为接枝共聚物/DNA复合物的凝胶电泳图；
图5为接枝共聚物/DNA复合物的透射电镜图；
图6为显微镜下不同阳离子载体的基因转染情况图(无血清)；
图7为不同阳离子载体的基因转染效率示意图(无血清)；
图8为不同阳离子载体的基因转染效率示意图(有血清)。
具体实施方式
材料
平均分子量为423、1800和25000的聚乙烯亚胺(PEI)均从Aldrich公司购得。海藻酸钠，粘度300cps(Lot M3H5540，Nacalai tespue INC.，Kyoto，Japan)。携带报告基因的质粒pEGFP-C1，由华西医科大学馈赠，并通过大肠杆菌Escherichia coli DH5-α增殖，并用内毒素去除试剂盒(Qiagen，CA，USA)提纯。DNA浓度由生物分光光度计(Eppendorf 5840R，Germany)测定260nm的紫外吸光度确定。
实验方法与结果
1共聚物的合成
实施例1
1.1聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI的合成
按本申请人的专利方法(见ZL 200610036842.8)合成多醛基海藻酸钠MASA。取多醛基海藻酸钠0.5g(含醛基1.46×10-3mol，氧化程度为0.29，Mη＝33K)，溶于10ml水中，得溶液1。将5.27g聚乙烯亚胺PEI 1.8k(2.92×10-3mol，n醛基/nPEI 1.8k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔)溶于30ml水中，用3M的盐酸 调节pH至8，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2。搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完。滴完后，再在室温下搅拌反应24h。反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到MASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
1.2还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI的合成
先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的NaOH将pH调至8，然后将5g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基。产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到rMASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
实施例2
1.1聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI的合成
按本申请人的专利方法(见ZL 200610036842.8)合成多醛基海藻酸钠MASA。取多醛基海藻酸钠0.5g(含醛基1.46×10-3mol，氧化程度为0.29，Mη＝33K)，溶于10ml水中，得溶液1。将1.24g PEI 423(2.92×10-3mol，n醛基/nPEI0423k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔)溶于30ml水中，用3M的硫酸调节pH至8，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2。搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完。滴完后，再在室温下搅拌反应36h。反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到MASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
1.2还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI的合成
先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的NaOH将pH调至8，然后将2.76g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基。产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到rMASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
实施例3
1.1聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI的合成
按本申请人的专利方法(见ZL200610036842.8)合成多醛基海藻酸钠MASA。取多醛基海藻酸钠0.5g(含醛基1.92×10-3mol，氧化程度为0.38，Mη＝24K)，溶于10ml水中，得溶液1。将6.91g PEI 1.8k(3.84×10-3mol，n醛基/nPEI1.8k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔)溶于30ml水中，用2M的盐酸调节pH 至7，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2。搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完。滴完后，再在室温下搅拌反应36h。反应产物在蒸馏水中透析60h，滤去不溶物，冻干后得到MASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
1.2还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI的合成
先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的KOH将pH调至7，然后将3.6g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA上的醛基。产物在蒸馏水中透析60h，滤去不溶物，冻干后得到rMASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
实施例4
1.1聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI的合成
按本申请人的专利方法(见ZL200610036842.8)合成多醛基海藻酸钠MASA。取多醛基海藻酸钠0.5g(含醛基1.92×10-3mol，氧化程度为0.38，Mη＝24K)，溶于10ml水中，得溶液1。将1.62g PEI 423(3.84×10-3mol，n醛基/nPEI1.8k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔)溶于30ml水中，用3M的盐酸调节pH至7，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2。搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完。滴完后，再在室温下搅拌反应24h。反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到MASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
1.2还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI的合成
先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，用1M的NaOH将pH调至7，然后将0.74g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA上的醛基。产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到rMASA-PEI(反应示意图见图1.1)。
以上实施例1-4合成的接枝共聚物采用元素分析和13C NMR表征MASA-PEI和rMASA-PEI的结构。元素分析法结果表明，MASA中N的重量百分含量为0；接枝PEI后，共聚物中N的重量百分含量为15％～24％。共聚物的13C NMR中出现了亚胺键C＝N(160ppm)的峰，说明PEI被成功引入MASA，因为PEI上的-NH2和MASA上的醛基反应后才形成亚胺键C＝N(图1.2)。下述实验，包括降解、细胞毒性、凝胶电泳、基因转染实验，均选取实施例1所得聚合物作为实验样品。
2接枝共聚物的降解
将接枝共聚物用蒸馏水配制成20mg/mL的溶液，用HCl将pH调节为4.5(模拟内涵体中pH值)，37℃孵育，定期测定溶液的乌氏粘度，考察其粘度(分子量)随时间的变化，结果见图2。图2可见，共聚物的粘度随时间的增加而下降，说明其可生物降解，且MASA-PEI比rMASA-PEI降解更快。原因为：MASA-PEI中的降解可通过2种方式进行，一种是通过易水解的C＝N，另一种是通过MASA上的糖苷键；而rMASA-PEI中的C＝N被还原成了稳定的C-N，降解只能通过MASA上的糖苷键进行。
3接枝共聚物的细胞毒性
以无血清的DMEM 1640(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养液为溶剂，将接枝共聚物配制成浓度为200μg/mL的溶液作为母液备用。用MTT法研究不同浓度的接枝共聚物溶液对人肝癌细胞Bel 7402(中国医学科学院上海细胞库)的毒性。实验以MASA为阳性对照，以PEI 25K为阴性对照，每个样品设4个复孔。细胞毒性实验结果见图3。图中的纵坐标为细胞活力，细胞活力＝OD 样品/ODcontrol×100％，其中OD样品为用聚合物溶液处理的细胞组在490nm处的吸光度值，ODcontrol为只用培养液处理的细胞组在490nm处的吸光度值。图3可见，在所研究的范围内，MASA无细胞毒性，PEI 1.8k在其溶液浓度≤0.05mg/mL时无细胞毒性，其余聚合物溶液的毒性随浓度的增加而增加。PEI1.8K、MASA-PEI、rMASA-PEI的毒性依次增加，但都远远低于PEI 25k。基因载体的毒性主要来源于其上大量的阳离子，由于接枝共聚物的MASA嵌段上每个单体单元均带有一个羧基阴离子，减少了净阳离子的数量，因此接枝共聚物的毒性远小于PEI25k。而与带阴离子的DNA复合后，复合物的净阳离子浓度进一步降低，因此毒性进一步减小。由于接枝共聚物的降解产物为PEI 1.8K和无毒的小分子多糖，因此可以认为接枝共聚物用作基因载体时有可忽略的细胞毒性。
4接枝共聚物载体/DNA复合物的制备
调节接枝共聚物溶液浓度，使共聚物溶液中的氨基基团和等体积40μg/ml的GFP DNA溶液中磷酸基团的摩尔比N/P分别为15、30、45、75、100、130。接枝共聚物和DNA溶液各取50μL，涡旋混合后室温共孵育30min，使阳离子聚合物压缩带负电荷的DNA形成纳米复合物粒子。用凝胶电泳、透射电镜观察复 合物的形成情况。所有接枝共聚物载体/DNA复合物都在使用前即制即用。凝胶电泳结果(图4)表明，接枝共聚物、PEI 25k均在N/P为1.5时，即具有阻滞DNA的能力。透射电镜图(图5)结果表明，接枝共聚物能压缩DNA形成球状、粒径为50～200nm的复合物纳米粒子。图中有的粒子较大且呈不规则球形，这可能因为几个纳米粒子团聚在一起形成的。
5体外细胞Bel 7402转染实验
5.1无血清转染
人肝癌细胞Bel 7402(中国医学科学院上海细胞库)在加入10％(v/v)小牛血清FBS(fetal bovine serum)，1％青霉素-链霉素的DMEM 1640培养液中培养，培养环境为37℃和5％的二氧化碳。
将聚合物载体与pEGFP-C1分别用去离子水配制成一定浓度的溶液后，按N/P为15、30、45、75、100、130等体积混合，涡旋后室温静置30min。将Bel细胞接种到24孔板上，密度为8.0×105个细胞/孔，培养20～24小时，当细胞融合度为70％～80％时，将有血清的培养液更换成不含血清的1640培养液(1ml/孔)，每孔再加入100μl载体/DNA复合物溶液(含2μg质粒)，37℃、5％ CO2下孵育4h。然后将培养介质更换成新鲜含血清的培养液继续培养48小时，用荧光显微镜观察细胞对GFP的表达情况，用流式细胞仪测定每10000个细胞中发荧光的细胞百分数，此即细胞转染效率。图6为荧光显微镜下的细胞转染情况。图中可见，与市售的阳离子脂质体lipofectamin和阳离子聚合物PEI 25k基因载体相比，以接枝共聚物为基因载体时，细胞对GFP的表达多且强。图7为用流式细胞仪测定的细胞转染效率。图中可见，PEI25k和lipofectamin的最高细胞转染效率分别为28.3％(N/P＝10)、50.7％(参照试剂盒说明书进行)，而接枝共聚物的最高细胞转染效率(N/P＝45)，达56.3％(rMASA-PEI)、47.6(MASA-PEI)。
5.2有血清转染
转染方法同上，除了转染前不再将有血清的培养液更换成无血清的培养液。图8为有血清时，PEI25K和rMASA-PEI的基因转染效率。图中可见，当N/P为100时，rMASA-PEI的有血清转染效率最高达52.18％，与PEI25K(55.00％)及无血清转染的最高转染效率(56.3％)基本相当，说明阳离子聚合物不被血清清除，且转染效率基本不受血清影响。但无血清转染的最佳N/P(45)比有血清 时的最佳N/P(100)小，这是因为血清中有很多带负电荷的蛋白质，转染时部分阳离子聚合物被中和，因此达最高转染效率需更高浓度的阳离子聚合物。
综上，本发明提供的接枝共聚物(rMASA-PEI和MASA-PEI)，成本较低，具有低的细胞毒性、生物降解性能、较高的细胞转染效率、且转染效率不受血清影响，是一种适用范围较广，极有前景的阳离子聚合物基因载体。
Claims (9)
1.一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该阳离子聚合物基因载体以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链构成，其中聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K，该阳离子聚合物基因载体通过如下方法制备获得：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.46×10-3mol，氧化程度为0.29，Mη＝33K；将5.27g聚乙烯亚胺PEI1.8K溶于30ml水中，用3M的盐酸调节pH至8，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 1.8K的物质的量为2.92×10-3mol，n醛基/nPEI1.8k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应24h，反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的NaOH将pH调至8，然后将5g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
2.权利要求1所述的具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA 0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.46×10-3mol，氧化程度为0.29，Mη＝33K；将5.27g聚乙烯亚胺PEI1.8K溶于30ml水中，用3M的盐酸调节pH至8，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 1.8K的物质的量为2.92×10-3mol，n醛基/nPEI1.8k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应24h，反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的NaOH将pH调至8，然后将5g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
3.一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该阳离子聚合物基因载体以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链构成，其中聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K，该阳离子聚合物基因载体通过如下方法制备获得：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.46×10-3mol，氧化程度为0.29，Mη＝33K；将1.24g聚乙烯亚胺PEI 423溶于30ml水中，用3M的硫酸调节pH至8，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 423的物质的量为2.92×10-3mol，n醛基/nPEI0.423k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应36h，反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的NaOH将pH调至8，然后将2.76g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
4.权利要求3所述的具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.46×10-3mol，氧化程度为0.29，Mη＝33K；将1.24g聚乙烯亚胺PEI 423溶于30ml水中，用3M的硫酸调节pH至8，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 423的物质的量为2.92×10-3mol，n醛基/nPEI0.423k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应36h，反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的NaOH将pH调至8，然后将2.76g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
5.一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该阳离子聚合物基因载体以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链构成，其中聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K，该阳离子聚合物基因载体通过如下方法制备获得：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.92×10-3mol，氧化程度为0.38，Mη＝24K；将6.91g聚乙烯亚胺PEI1.8K溶于30ml水中，用2M的盐酸调节pH至7，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 1.8K的物质的量为3.84×10-3mol，n醛基/nPEI1.8k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应36h，反应产物在蒸馏水中透析60h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的KOH将pH调至7，然后将3.6g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析60h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
6.权利要求5所述的具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.92×10-3mol，氧化程度为0.38，Mη＝24K；将6.91g聚乙烯亚胺PEI1.8K溶于30ml水中，用2M的盐酸调节pH至7，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 1.8K的物质的量为3.84×10-3mol，n醛基/nPEI1.8k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应36h，反应产物在蒸馏水中透析60h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，再用1M的KOH将pH调至7，然后将3.6g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析60h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
7.一种具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该阳离子聚合物基因载体以多醛基海藻酸钠MASA为骨架、以聚乙烯亚胺PEI为侧链构成，其中聚乙烯亚胺PEI的分子量小于2K，该阳离子聚合物基因载体通过如下方法制备获得：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.92×10-3mol，氧化程度为0.38，Mη＝24K；将1.62g聚乙烯亚胺PEI 423溶于30ml水中，用3M的盐酸调节pH至7，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 423的物质的量为3.84×10-3mol，n醛基/nPEI0.423k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应24h，反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，用1M的NaOH将pH调至7，然后将0.74g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
8.权利要求7所述的具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)取多醛基海藻酸钠MASA0.5g溶于10ml水中，得溶液1，其中MASA含醛基1.92×10-3mol，氧化程度为0.38，Mη＝24K；将1.62g聚乙烯亚胺PEI 423溶于30ml水中，用3M的盐酸调节pH至7，用蒸馏水调节溶液总体积至55ml，此为溶液2，其中PEI 423的物质的量为3.84×10-3mol，n醛基/nPEI0.423k＝1/2，n代表物质的量，单位为摩尔；搅拌下将溶液1缓慢滴入溶液2中，1小时内滴完，滴完后，再在室温下搅拌反应24h，反应产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物MASA-PEI；
(2)先按上述步骤让PEI和MASA反应24h，用1M的NaOH将pH调至7，然后将0.74g NaBH4加入反应溶液中，继续搅拌反应24小时，以还原MASA-PEI中生成的Schiff碱和MASA中的醛基，产物在蒸馏水中透析72h，滤去不溶物，冻干后得到还原聚乙烯亚胺-多醛基海藻酸钠接枝共聚物rMASA-PEI。
9.权利要求1或3或5或7所述的具有低细胞毒性、高转染效率的阳离子聚合物在制备基因治疗中基因载体的应用。
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