CN110403915A - Dna和聚合物的杂化核酸药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA和聚合物的杂化核酸药物载体及其制备方法和应用，首先将丙烯酰胺修饰的带有引发链I的DNA与丙烯酰胺类采用自由基聚合构筑丙烯酰胺类聚合物/DNA杂化纳米凝胶，设计DNA发卡结构H1和H2，H1和H2末端可通过碱基互补配对或者共价连接核酸药物序列。所制备的聚合物/DNA杂化纳米凝胶分散于含有相应发卡结构H1和H2的溶液中，通过原位DNA杂交链式反应，可实现核酸药物在纳米凝胶中的高效组装，从而制备稳定性高、装载效率高的靶向性核酸纳米药物。DNA作为独特的生物高分子，结构精准可调，组装高效可控，可赋予纳米凝胶刺激响应性和可控的释药性能；丙烯酰胺类聚合物稳定性高，易于功能化，可提高纳米凝胶的体内稳定性和肿瘤靶向能力，实现核酸药物在肿瘤部位的高效转染和表达。

Description

DNA和聚合物的杂化核酸药物载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属制药技术领域，特别是涉及一种DNA和聚合物的杂化核酸药物载体及其制备方法和应用。

技术背景

在癌症治疗中，化疗是最常用的手段之一，传统化疗药物存在药物稳定性差、缺乏肿瘤靶向性、副作用大等问题。近年来，随着基因组学的发展和癌症发病基因机制的阐明，核酸药物在癌症治疗领域受到广泛关注。

核酸药物主要有DNA、反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)等，是各国医药科技领域研究的热点。相对于小分子药物和蛋白药物，核酸药物可实现对基因的高效精准调控，在基因水平上实现对细胞功能的调节⁵。核酸药物具有设计性强、特异性好、不易产生耐药性等优点，可用于病毒感染性疾病、心血管系统疾病、代谢类疾病以及肿瘤等多种疾病的治疗。临床数据显示，在前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌等重大疾病的治疗中，核酸药物均取得了传统药物难以达到的疗效。

然而核酸药物实现临床应用仍然存在诸多挑战。截至2017年4月，虽然有超过2400种核酸药物进入临床实验，但只有93种(3.8％)进入了临床三期，而进入临床四期的只有3种(0.1％)。主要原因在于核酸在到达病变部位之前会遇到一系列生理障碍。首先，核酸作为一种阴离子型生物大分子，会快速被血液中的核酸酶降解或被肾脏清除，半衰期不足半小时。其次，降解后的核酸片段很可能会产生脱靶效应或引起免疫反应。最后，核酸药物本身缺乏靶向性，组织渗透能力差，大量的表面负电荷使其难以靠近细胞膜被细胞摄取。因此，如何将核酸药物靶向输送到肿瘤部位并实现其高效、特异性表达，是核酸药物实现临床应用亟待解决的难题。药物载体可以提高核酸药物的体内稳定性，降低免疫反应；增强其在肿瘤部位的富集，促进细胞对核酸药物的摄取；协助核酸药物实现内涵体逃逸，提高基因沉默效果。因此，开发安全高效的核酸药物递送体系是核酸药物实现临床应用的关键。

纳米核酸药物的发展为核酸药物的临床应用带来了新的希望，已成为抗癌新药中的研究热点。目前，一些纳米核酸药物已经进入临床实验阶段，一旦取得突破，将产生巨大的社会效益和经济效益。

利用纳米材料运输核酸药物正在逐渐成为热点，大多的核酸递送体系是利用静电作用将核酸药物实现在纳米载体中的富集和装载，而利用聚合物/DNA杂化纳米组装体递送核酸药物主要在近些年才出现相关文章并都发表在比较有影响力的国际期刊杂志上。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种DNA和聚合物的杂化核酸药物载体。

本发明的另一个目的是提供DNA和聚合物的杂化核酸药物载体的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术方案是：

一种DNA和聚合物的杂化核酸药物载体制备方法,利用丙烯酰胺类单体通过无皂乳液聚合反应合成载体，并利用DNA原位链式杂交反应高效装载核酸药物并形成纳米粒子。

所述丙烯酰胺类单体包括可生成两亲性聚合物的丙烯酰胺衍生物单体。

所述的方法中核酸药物包括DNA、反义核酸(AON)、小干扰RNA(sRNA)和微小RNA(mRNA)。

一种DNA和聚合物的杂化核酸药物载体制备方法，具体包括如下步骤:

(1)将N-异丙基丙烯酰胺、4-丙烯酰胺基苯硼酸、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺功能化的DNA等单体溶于水或者乙醇，制备生溶液；

(2)取不同摩尔比的上述单体混合后，加入引发剂，如过硫酸铵(APS)，搅拌均匀；

(3)通入氮气，在搅拌的条件下升温或者加入催化剂，引发自由基聚合反应0-24小时，生成乳白色乳液；

(4)高速离心10-20分钟，沉淀即为DNA/聚合物杂化纳米凝胶，重新分散在缓冲液中；

(5)设计发卡DNA结构H1和H2，并在发卡结构末端通过碱基互补配对或者共价连接核酸药物序列(如mRNA、siRNA、DNAD等)；

(6)所制得的纳米凝胶分散在含有发卡DNA结构H1和H2的缓冲液中，通过凝胶中的DNA引发链引发H1和H2的杂交链式反应，静置0-24小时，实现核酸药物在纳米凝胶中的原位高效组装；

(7)高速离心10-20分钟，沉淀清洗三次后重新分散在缓冲液中得到载有目标核酸药物的DNA/聚合物杂化纳米凝胶。

所述丙烯酰胺类单体为N-异丙基丙烯酰胺、4-丙烯酰胺基苯硼酸、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酰胺功能化的DNA单体，浓度分别为50-100mM、1-10mM、2-10mM、0-20μM。

所述步骤(2)的引发剂为过硫酸铵(APS)或者偶氮二异丁腈自由基聚合引发剂，引发方式为高温或者紫外光引发方式。所述的APS的浓度为0.1-1％。所述的自由基聚合的引发方法为热引发法，加热温度为50-75℃。

所述的步骤(3)惰性气体为高纯氮气或者氩气。

所述的聚合物应选用生物相容性好、安全性高的聚合物。

所述的DNA杂交链式反应中H1和H2的摩尔比为1:1。

所述离心功率为8000r/min-15000rmin。

所述的搅拌速度没有特定要求，可根据具体实验条件选择。

所述DNA序列H1和H2为可以发生DNA链置换反应的任何DNA序列。

发卡DNA结构H1和H2的浓度没有具体要求，可根据具体需求确定.

所述的发卡DNA与核酸药物序列的连接方式没有具体要求，可利用碱基互补配对或者共价连接。

所述缓冲液为TAE/Mg²⁺，但不限于TAE/Mg²⁺。

所述超声清洗仪的功率没有特殊要求，可根据制备体系大小确定。

上述方法制备得到的DNA和聚合物的杂化核酸药物载体。

DNA和聚合物的杂化核酸药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

有益效果

本发明首先构筑稳定的聚合物/DNA杂化纳米凝胶，通过在DNA双链中设计并引入HCR的引发链序列，原位引发发卡结构H1和H2的链置换反应，通过碱基互补配对，在发卡结构的粘性末端实现核酸药物的原位高效装载。此外，发卡DNA序列的精巧设计可赋予核酸纳米载体多种响应性，实现药物的特异性释放，增强基因治疗效果，降低脱靶效应和毒副作用。本发明使用的丙烯酰胺类高分子单体易于功能化，通过靶向分子的修饰，可进一步改善纳米凝胶的肿瘤靶向能力，使其有选择地在肿瘤组织富集，增加肿瘤细胞对药物的摄取量，增强基因干扰效果。

本发明所选用的方法是利用无皂乳液聚合反应制备DNA/聚合物纳米凝胶，并利用DNA杂交链式反应实现核酸药物在纳米凝胶中的高效组装。所用化学试剂均为市售普通试剂，设备简单，操作过程方便适用，在实验室可以小规模生产，在工厂中也适宜于工业化大规模生产，所用DNA易于合成，可向生物公司订购。

发明人选用si-Actin为核酸药物模型，N-异丙基丙烯酰胺作为制备两亲性聚合物模型的单体(不限于N-异丙基丙烯酰胺)，按照发明人所用的无皂乳液聚合法制备了包载有si-Actin的核酸纳米药物，在体外实验中，显示出了对细胞骨架非常强的抑制作用。

通过自由基聚合制备DNA/聚合物纳米凝胶，并利用核酸的杂交链式反应实现核酸药物的在纳米凝胶中的高效组装，和纳米药物本身靶向性、稳定性、响应性等优点结合起来，增强核酸的体内稳定性、递送效率和基因干扰效果。

附图说明

图1为所制备的载有核酸药物的纳米粒子透射电镜图；

图2为装载有核酸药物序列的纳米粒子的扫描电镜图；

图3为核酸药物序列在DNA和聚合物的杂化纳米凝胶中的装载效果图；

图4为载有DNA和聚合物杂化纳米粒子的细胞毒性效果图；

图5为载有si-Actin核酸药物的纳米药物对细胞中β-Actin蛋白的抑制效果图，A为没有经过任何药物处理的细胞，B为与核酸药物si-Actin共孵育的细胞，C为与装载无关序列纳米粒子共孵育的细胞，D，为与载有si-Actin核酸药物的纳米粒子共孵育的细胞。

具体实施方式

实施例1

采用上述方法制备，以N-异丙基丙烯酰胺、4-丙烯酰胺基苯硼酸、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺功能化的DNA为单体模型，制备聚合物/DNA杂化纳米粒子。

(1)分别吸取467.5μL N-异丙基丙烯酰胺(140mM)水溶液，20μL N,N-亚甲基双丙烯酰胺(130mM)水溶液，20μL APS(5wt％)水溶液于5mL鸡心瓶中，同时加入7μL4-AAPBA(50mM)甲醇溶液和50μL dsDNA-丙烯酰胺(200μM)水溶液，加水补齐至1mL，搅拌混合均匀；

(2)通氮气20min，然后将装置密封，搅拌速度为200rpm；

(3)置于70℃恒温水浴中反应30min；

(4)反应完毕后得到白色纳米凝胶乳液，7000rpm离心10min；

(5)去掉上层溶液，将下层白沉淀重新分散在蒸馏水中，超声分散成乳液，重复洗涤3次；

(6)最后将纳米凝胶分散于1mL TAE/Mg²⁺缓冲液中；

在透射电镜下观察纳米粒子，结果如图1所示，可以看出纳米粒子大小约为200-300nm。

在扫描电镜下观察纳米粒子，结果如图2所示，对纳米粒子的形貌和粒径进行表征，可以看出纳米粒子呈现均匀的球形，粒径大约250nm。

实施例2

采用上述方法，以N-异丙基丙烯酰胺、4-丙烯酰胺基苯硼酸、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺功能化的DNA为单体模型，以发卡DNA H1和H2为链式杂交反应模型，以单链DNA为核酸药物模型，制备高效装载核酸药物的纳米粒子，具体实施方式如下：

(1)将丙烯酰胺功能化的DNAC1和C2溶解于TAE/Mg²⁺缓冲液中，使C1和C2互补，形成双链dsDNA-丙烯酰胺；

(2)分别吸取467.5μLN-异丙基丙烯酰胺(140mM)水溶液，20μL N,N-亚甲基双丙烯酰胺(130mM)水溶液，20μLAPS(5wt％)水溶液于5mL鸡心瓶中，同时加入7μL4-AAPBA(50mM)甲醇溶液和100μLdsDNA-丙烯酰胺(200μM)水溶液，加水补齐至1mL，搅拌混合均匀；

(3)通氮气20min，然后将装置密封，搅拌速度为200rpm；

(4)置于70℃恒温水浴中反应30min；

(5)反应完毕后得到白色纳米凝胶乳液，7000rpm离心10min；

(6)去掉上层溶液，将下层白沉淀重新分散在蒸馏水中，超声分散成乳液，重复洗涤3次；

(7)最后将纳米凝胶分散于1mLTAE/Mg²⁺缓冲液中；

(8)通过碱基互补配位将H2与ssDNA连接起来，组装成HA；

(9)取(6)所制备的纳米粒子100mg分散于H1(5μM)和HA(5μM)的TAE/Mg²⁺缓冲溶液中，反应3-24h，实现核酸药物在纳米粒子中的高效装载。

通过丙烯酰胺凝胶电泳，观察H2与ssDNA的组装和HA在纳米凝胶中的组装，如图3所示，在HA-ssDNA泳道中出现了一条清晰的电泳条带，该泳道的DNA样品比HA和ssDNA的分子量都要大，说明HA与ssDNA成功结合。并且随着HCR反应时间的增加，胶孔中样品的颜色越来越深，说明两个发夹DNA进入纳米凝胶中参与了HCR反应，同时也证明纳米凝胶成功负载了ssDNA。

实施例3将处于对数生长的乳腺癌MDA-MB-231细胞调成1*10³个/孔接种于96孔培养板，加入不同浓度的纳米凝胶(0-400μg/mL)，每种浓度平行5孔。给予10％牛血清RPMI1640或DMEM培养液，每孔加100μL，分别培养24h后，利用MTT法检测所制的粒子对细胞的促凋亡作用效果。实验结果如图4所示。

从实验结果可以看出，相对于所制备的聚合物/DNA没有表现出明显的细胞毒性。

实施例4

将处于对数生长的癌细胞，以乳腺癌MDA-MB-231细胞为例，将细胞调成5*10³个/孔接种于confocal小皿中，给予10％牛血清RPMI1640或DMEM培养液，培养12h，接下来，贴壁培养12小时后，分别用含有游离si-Actin，纳米凝胶负载的无关序列(Negative control)，纳米凝胶负载的si-Actin(Nanogel-si-Actin)的培养基处理细胞，其中siRNA的浓度均为100nM，对照组中不加入材料，细胞继续生长48小时。

用TRITC标记的鬼笔环肽将丝状肌动蛋白β-Actin染色，用DAPI将细胞核染色，然后在荧光显微镜下观察并拍照，与空白对照组相比，游离的si-Actin实验组，细胞中的β-Actin蛋白表达几乎没有降低，同时，纳米凝胶负载的无关序列也没有表现出明显的基因沉默效应，对于纳米凝胶负载的si-Actin，细胞的红色荧光显著减弱，肌动蛋白的表达明显降低(P<0.01)，证实了纳米凝胶负载si-Actin可以有效抑制肌动蛋白的表达，基因沉默效率为45％。

表1实验所用DNA序列

序列表

<110> 天津大学

<120> DNA和聚合物的杂化核酸药物载体及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

taagttcgct gtggcacctg cacg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

caacgtgcag gtgccacagc gtgg 24

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccacgctgtg gcacctgcac gcacccacgt gcaggtgcca cagcgaactt a 51

<210> 4

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tgggtgcgtg caggtgccac agcgtaagtt cgctgtggca cctgcacgtt gactctacct 60

gggggagtat tgcggaggaa ggt 83

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tggcagtgtc ttagctggtt gtaccttcct ccgc 34

Claims (10)

1.一种DNA和聚合物的杂化核酸药物载体制备方法,其特征在于：利用丙烯酰胺类单体通过无皂乳液聚合反应合成载体，并利用DNA原位链式杂交反应高效装载核酸药物并形成纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述丙烯酰胺类单体包括可生成两亲性聚合物丙烯酰胺及其丙烯酰胺衍生物单体。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的方法中核酸药物包括DNA、反义核酸、小干扰RNA和微小RNA。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤:

(1)将丙烯酰胺类单体溶于水、甲醇或乙醇有机溶剂；

(2)取不同摩尔比的上述单体混合后，加入引发剂，搅拌均匀；

(3)惰性气体保护，在搅拌的条件下引发自由基聚合反应，生成乳白色乳液；

(4)高速离心，沉淀即为DNA与聚合物杂化纳米凝胶，将纳米粒子超声分散于缓冲液中；

(5)设计DNA发卡结构H1和H2，并在发卡结构末端连接核酸药物序列；

(6)所制得的纳米凝胶分散在含有发卡DNA结构H1和H2的缓冲液中，通过凝胶中的DNA引发链引发H1和H2的杂交链式反应，实现核酸药物在纳米凝胶中的原位高效组装；

(7)高速离心，沉淀清洗三次后重新分散在缓冲液中得到载有目标核酸药物的DNA与聚合物杂化纳米凝胶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述丙烯酰胺类单体为N-异丙基丙烯酰胺、4-丙烯酰胺基苯硼酸、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酰胺功能化的DNA单体，浓度分别为50-100mM、1-10mM、2-10mM、0-20μM。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的引发剂为过硫酸铵或者偶氮二异丁腈自由基聚合引发剂，引发方式为高温或者紫外光引发方式。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为TAE/Mg²⁺，但不限于TAE/Mg²⁺。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，DNA序列H1和H2为可以发生DNA链置换反应的任何DNA序列。

9.根据权利要求1-8任意一项权利要求所述方法制备得到的DNA和聚合物的杂化核酸药物载体。

10.DNA和聚合物的杂化核酸药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。