CN103976941A - 一种基于核酸适体链接的水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于核酸适体链接的水凝胶及其制备方法与应用，水凝胶可以通过连接不同的核酸适体，实现对不同癌细胞的主动靶向释药，制备步骤为：(1)实现DNA单链和丙烯酰胺的连接，得到聚合物链PS-A和PS-B；(2)将得到的PS-A和PS-B，核酸适体链以及抗癌药物混合，得到载药水凝胶；所述的水凝胶在制备过程中和抗癌药物直接混合在一起，在自组装的过程中实现对药物的包载，该水凝胶在自组装过程中完成对药物的包覆，能够特异性识别癌细胞，实现抗癌药物的靶向释放，适宜用于癌症靶向治疗领域。

Description

一种基于核酸适体链接的水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种水凝胶的制备及其应用，尤其涉及一种基于核酸适体链接的水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

目前在临床上对于癌症的治疗主要是通过西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但是由于抗肿瘤药物及治疗疗法的靶向选择性不高，使其在杀死肿瘤细胞的同时，对正常组织也会产生较大的毒副作用或损害；同时肿瘤细胞易对化疗药物产生多药耐药性，引发自身免疫反应清除药物或阻断其发挥药效。

随着药物释放系统的日益完善，靶向药物载体的设计与合成对于医学以及医疗保健起到了至关重要的作用。与此同时，靶向药物载体材料的创新和纳米技术共同推动了药物递送系统的进步。因此，构建一种靶向药物载体，以提高抗癌药物对癌细胞的高靶向选择性，增强对药物的控释能力以达到长效抑制肿瘤的目的，具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种基于核酸适体链接的水凝胶及其制备方法与应用，制备的水凝胶具有良好的生物相容性，对癌细胞具有高度靶向性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，是通过以下步骤来实现的：

(1)将具有特定碱基序列的单链DNA链A S-A和链B S-B，分别溶于超纯水中，得到S-A和S-B的储备液，分别将S-A和S-B的储备液分别溶于含4％的丙烯酰胺单体的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，抽至真空，溶液保存在干燥器中，再加入终体积1.4％的10％过硫酸铵溶液和终体积1.4％的5％四甲基乙二胺溶液，在干燥器中反应15-20min，得到聚合物链PS-A和PS-B，其中S-A的碱基序列为5'-acrydite-AAA ACA CCA CCG AGA T-3'，如SEQ ID NO.1所示，S-B的碱基序列为5'-acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’，如SEQID NO.2所示；

(2)将聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链，35-42℃条件下反应5-20min，得到一种基于核酸适体链接的水凝胶。

步骤(1)中所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，含200mM NaCl，pH7.4。

优选地，步骤(1)在干燥器中反应的时间为15min。

优选地，步骤(2)中PS-A，PS-B和核酸适体链的摩尔比为1:1:1。

步骤(2)中的最优选反应温度为37℃。

优选地，步骤(2)中的反应时间为15min。

核酸适体链为AS1411或者sgc8。

本发明还提供一种利用上述方法制备的基于核酸适体链接的水凝胶。

本发明还提供一种利用上述方法制备的基于核酸适体链接的水凝胶在作为药物的载体中的应用。

一种基于核酸适体链接的水凝胶的应用，步骤如下：

(1)将聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链与抗癌药物按照摩尔比1:1：1：1混合，35-42℃条件下反应5-20min，得载药水凝胶，取5-10mg载药水凝胶，溶于2mL含200mM NaCl，pH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；

(2)步骤(1)载药水凝胶中加入靶向受体60min后，利用紫外可见分光光度计测定释放的抗癌药物的吸光度，进而得到释放的抗癌药物的浓度。

本发明的有益效果为，

1.水凝胶在包裹药物的过程中通过自组装对药物直接包裹，避免了对药物药效的影响；

2.其中的核酸适体可以实现对特定癌细胞的高度靶向释药，并且可以通过链接不同的核酸适体实现对不同癌细胞的靶向释药；

3.以DNA为水凝胶的骨架，具有良好的生物相容性；

4.DNA的构象能随着环境中的pH变化而改变；

5.DNA自身拥有某一特定的解链温度；

6.可以通过对DNA的修饰，使得DNA具有光响应的能力。

附图说明

图1为本发明水凝胶的合成示意图；

其中，1.丙烯酰胺，2.S-A，3.S-B，4.核酸适体链，5.水凝胶。

图2本发明实施例1中水凝胶包裹药物的示意图；

图3本发明实施例1中水凝胶体外释药的示意图；

图4本发明实施例2中紫杉醇的释药率与时间的关系图；

图5为本发明中丙烯酰胺与DNA的链接反应式。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，而不是限制本发明的范围。

实施例1：

一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，如图1所示，是通过以下步骤来实现的：

(1)将具有特定碱基序列的单链DNA链A S-A和链B S-B，分别溶于超纯水中，得到S-A和S-B的储备液，其中S-A的碱基序列为5'-acrydite-AAA ACA CCA CCG AGA T-3'，如SEQ ID NO.1所示，S-B的碱基序列为5'-acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’，如SEQ IDNO.2所示，将S-A和S-B的储备液的储备液分别溶于含4％的丙烯酰胺单体的10mM含200mM NaCl，pH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的缓冲溶液中，抽至真空，溶液保存在干燥器中，再加入终体积1.4％的10％过硫酸铵溶液和终体积1.4％的5％四甲基乙二胺溶液，在干燥器中反应15min，得到聚合物链PS-A和PS-B；

(2)将聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链AS1411按照摩尔比为1:1:1，37℃条件下反应10min，通过碱基互补配对迅速交联形成水凝胶。

一种基于核酸适体链接的水凝胶的应用，如图2所示，

(1)将实施例1中聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链与阿霉素按照摩尔比1：1：1：1混合，37℃条件下反应10min，实现对阿霉素的包覆，得载药水凝胶，将得到的载药水凝胶5mg加入到10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(200mM NaCl，pH7.4)中；

(2)向其中加入10μL靶向受体蛋白溶液，60min后，利用紫外可见分光光度计检测所得溶液的吸光度，利用紫外可见分光光度计测定释放的阿霉素的吸光度(480nm处有阿霉素的特征峰，以此证明阿霉素被释放出来)，进而得到释放的阿霉素的浓度，结果显示水凝胶的释药率达到了90％，说明当加入靶向受体蛋白以后，DNA成功实现解链，包覆与其中的阿霉素被释放出来。

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100uL，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，细胞贴壁后，于次日将凝胶加入相应的孔中，一般5-7个梯度，每孔100uL，设3-5个复孔；5％CO₂，37℃孵育24-72小时；每孔加入20uL3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h，小心吸去孔内培养液；每孔加入150uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，用仅含有培养基的空白细胞作对照，每孔重复4次。结果显示，24小时后，在凝胶中细胞的存活率达到95％-100％，随着培养时间的延长细胞能够正常的增殖，说明基于核酸适体链接的水凝胶没有细胞毒性。

实施例2：

一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，如图1所示，是通过以下步骤来实现的：

(1)将具有特定碱基序列的单链DNA链A S-A和链B S-B，分别溶于超纯水中，得到S-A和S-B的储备液，其中S-A的碱基序列为5'-acrydite-AAA ACA CCA CCG AGA T-3'，如SEQ ID NO.1所示，S-B的碱基序列为5'-acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’，如SEQ IDNO.2所示，将S-A和S-B的储备液的储备液分别溶于含4％的丙烯酰胺单体的10mM含200mM NaCl，pH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的缓冲溶液中，抽至真空，溶液保存在干燥器中，再加入终体积1.4％的10％过硫酸铵溶液和终体积1.4％的5％四甲基乙二胺溶液，在干燥器中反应20min，得到聚合物链PS-A和PS-B；

(2)将聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链AS1411按照摩尔比为1:1:1，37.5℃条件下反应8min，通过碱基互补配对迅速交联形成水凝胶。

一种基于核酸适体链接的水凝胶的应用，

(1)将实施例2中聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链AS1411和紫杉醇按照摩尔比为1:1:1:1混合，37.5℃条件下反应8min，实现对紫杉醇的包覆，得到载药水凝胶，将得到的载药水凝胶5mg加入到10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(200mM NaCl，pH7.4)中；

(2)向其中加入10μL靶向受体蛋白溶液，60min后，利用紫外可见分光光度计检测所得溶液的吸光度，利用紫外可见分光光度计测定释放的紫杉醇的吸光度，进而得到释放的紫杉醇的浓度，结果显示水凝胶的释药率达到了90％，说明当加入靶向受体蛋白以后，DNA成功实现解链，包覆与其中的紫杉醇被释放出来，其中紫杉醇的释药率与时间的关系图如图3所示。

本发明涉及到的一种基于核酸适体链接的水凝胶在靶向治疗中的应用，在实现对抗癌药物包裹的过程中利用了DNA的碱基互补配对的作用，通过自组装实现了对药物的包裹；以DNA为水凝胶的支撑骨架，保证了水凝胶良好的生物相容性；核酸适体实现了对癌细胞的高度靶向，避免了药物在运输过程中的不必要流失和对正常细胞的毒副作用，实验结果表明，该基于核酸适体链接的水凝胶在靶向治疗中的应用在靶向治疗领域有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，其特征在于，是通过以下步骤来实现的： 

(1)将具有特定碱基序列的单链DNA链A S-A和链B S-B，分别溶于超纯水中，得到S-A和S-B的储备液，分别将S-A和S-B的储备液分别溶于含4％的丙烯酰胺单体的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，抽至真空，溶液保存在干燥器中，再加入终体积1.4％的10％过硫酸铵溶液和终体积1.4％的5％四甲基乙二胺溶液，在干燥器中反应15-20min，得到聚合物链PS-A和PS-B，其中S-A的碱基序列为5'-acrydite-AAA ACA CCA CCG AGA T-3'，S-B的碱基序列为5'-acrydite-AAA ATC ACA GAT GAG T-3’； 

(2)将聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链混合，35-42℃条件下反应5-20min，得到一种基于核酸适体链接的水凝胶。 

2.如权利要求1所述的一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，含200mM NaCl，pH7.4。 

3.如权利要求1所述的一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述在干燥器中反应的时间为15min。 

4.如权利要求1所述的一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述PS-A，PS-B和核酸适体链的摩尔比为1:1:1。 

5.如权利要求1所述的一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述反应温度为37℃。 

6.如权利要求1所述的一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述反应时间为15min。 

7.如权利要求1所述的一种基于核酸适体链接的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述核酸适体链为AS1411或者sgc8。 

8.如权利要求1-7任意一项所述的方法制备的一种基于核酸适体链接的水凝胶。 

9.权利要求8所述的水凝胶的在作为药物的载体中的应用。 

10.如权利要求9所述的一种基于核酸适体链接的水凝胶的应用，其特征在于，步骤如下： 

(1)将聚合物链PS-A，PS-B、核酸适体链与抗癌药物按照摩尔比1:1：1：1混合，35-42℃条件下反应5-20min，得载药水凝胶，取5-10mg载药水凝胶，溶于2mL含200mM NaCl，pH7.4三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液； 

(2)步骤(1)载药水凝胶中加入靶向受体60min后，利用紫外可见分光光度计测定释放的抗癌药物的吸光度，进而得到释放的抗癌药物的浓度。