CN111848981A - 一种新型dna水凝胶及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型的DNA水凝胶及制备方法，制备方法为：(1)以质粒DNA作为模板，在甲基丙烯酰胺基修饰的引物链的作用下，通过PCR技术得到甲基丙烯酰胺基长链DNA；(2)甲基丙烯酰胺基长链DNA在引发剂和催化剂的作用下通过自由基聚合得到DNA水凝胶。本发明制备的DNA水凝胶以酰胺键作为交联点，成胶方式简单，并通过PCR技术得到长链DNA分子，降低DNA水凝胶的合成成本，对DNA水凝胶体系的构建具有指导作用，能用于无细胞蛋白合成、医用敷料、免疫治疗及药物缓释等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型DNA水凝胶及制备方法。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)作为编码、存储和传递遗传信息的生物大分子，是生命系统的核心分子之一[1]。1982年，Seeman[2]首次利用DNA的碱基互补特性设计并合成了十字架形结构，实现了纳米尺度静态结构的设计与精确组装，开启了DNA纳米技术的大门。从材料和化学的角度看，DNA序列可以根据设计要求进行任意的排列组合，且存在一系列成熟的分子生物学方法为DNA的分子操作提供丰富的工具，比如聚合酶链式反应(PCR)，另外还有很多对DNA进行化学修饰的方法，在此基础上DNA具有可设计性、多样性和多功能性[3-4]。近年来，DNA作为生物医学应用的新材料，受到广泛研究。其中，最具有吸引力的生物医学应用之一是DNA水凝胶。水凝胶本身是一种由物理或化学交联的具有三维网络立体结构的亲水性高分子聚合物，其三维网状结构与生物组织相似，且因其含水量高、载药空间大，被广泛的应用于生物医学及药物递送等领域。DNA水凝胶拥有DNA分子和水凝胶的双重特性，实现了水凝胶骨架功能与DNA生物功能的融合统一[5]。按照水凝胶的交联方法进行分类，DNA水凝胶可以分为化学水凝胶和物理水凝胶两类。化学水凝胶就是以化学键作为交联点形成的水凝胶，包括DNA连接酶作用下磷酸二酯键的形成以及化学基团的修饰。物理水凝胶是通过DNA分子间的非共价作用形成的三维网络结构，非共价键作用包括以氢键为主的DNA碱基间的互补配对作用和DNA分子链间的缠绕作用。按照水凝胶的组成成分进行分类，DNA水凝胶可分为纯DNA水凝胶和DNA杂化水凝胶两类。纯DNA水凝胶可以通过酶连接[6]、酶聚合[7]、分子间i-motif结构[8]、以及DNA杂交[9]的方法制备。DNA杂化水凝胶通过引入某些功能成分后提供了额外的分子识别能力，可赋予DNA水凝胶更多特殊的性能[10-11]
DNA水凝胶作为一种形状可控、响应灵敏、生物相容性好、可降解的生物材料越来越受到人们的关注。然而，目前DNA水凝胶研究领域仍然存在着亟待解决的问题，比如一些杂化的DNA水凝胶的生物相容性及生物可降解性还有待改善，DNA水凝胶的合成成本高，从基础研究到应用的转化等。
参考文献
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发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的DNA水凝胶制作成本过高的问题，提供一种新型的DNA水凝胶。
本发明的第二个目的是提供一种制备工艺简单的新型DNA水凝胶的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种新型DNA水凝胶制备方法，包括以下步骤：
(1)以质粒DNA作为模板，在甲基丙烯酰胺基修饰的引物链的作用下，通过PCR技术得到甲基丙烯酰胺基长链DNA；
(2)甲基丙烯酰胺基长链DNA在引发剂和催化剂的作用下通过自由基聚合，在室温下静置，得到DNA水凝胶。
所述甲基丙烯酰胺修饰的引物链为人工合成的DNA。
所述引发剂和催化剂在N2保护下加入。
所述的甲基丙烯酰胺基长链DNA为经PCR产物纯化试剂盒处理之后的回收产物，甲基丙烯酰胺基长链DNA的碱基数在200～10000范围。
优选地，所述甲基丙烯酰胺基长链DNA的碱基数在1000～3000范围。
所述的甲基丙烯酰胺基长链DNA浓度为5～6μmol/L。
所述的引发剂为过硫酸铵或其相似引发剂，质量浓度为1％～2％。
所述的催化剂为四甲基乙二胺或其相似催化剂，质量浓度为0～4％。
优选地，所述的催化剂为四甲基乙二胺，质量浓度为4％。
所述的室温下静置的时间为0-24h。
优选地，所述的室温下静置时间为120min。
所述的方法制备的新型的DNA水凝胶。
本发明的有益效果：本发明采用PCR技术获得甲基丙烯酰胺基修饰的DNA长链，在此基础上通过自由基聚合制备DNA水凝胶，操作过程简便，成本较低。本发明的设计原理是在引发剂的作用下，DNA长链两端修饰的甲基丙烯酰胺基双键部分打开，发生自由基聚合，进一步形成三维网络结构，制备新型DNA水凝胶。本发明的DNA水凝胶，生物相容性好以及材料具有可注射性，可作为医用敷料；制备水凝胶的过程简单、方便，能够应用于医用敷料、药物缓释及无细胞蛋白合成等领域。
附图说明
图1为实施例1制备的带有甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA的电泳图；其中：1-ladder；2-两端为甲基丙烯酰胺基修饰的基因片段(1235bp)；
图2为实施例1制备的DNA水凝胶的数码照片；
图3为实施例1制备的DNA水凝胶的扫描电镜照片；
图4为实施例1制备的DNA水凝胶的流变学测试图片。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例中的质粒DNA可以但不限于质粒pRset-eGFP；
实施例中的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA可以但不限于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。
实施例1
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表1。
表1.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCRMasterMix，15ng的质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(1235bp)，见图1；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(1235bp)浓缩至5μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为1％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。见图2、图3、图4。
结果表明：如图2所示，本实例制备的水凝胶，在日光下为不透明的水凝胶，且在扫描电镜下观察，其具有微米级的三维网络结构(图3)，通过对水凝胶的流变性质表征，其储能模量大于损耗模量，进一步显示其凝胶状态(图4)。
实施例2
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表2。
表2.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCRMasterMix，15ng的质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(1235bp)；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(1235bp)浓缩至5μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为2％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。
实施例3
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表3。
表3.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCRMasterMix，15ng质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(1235bp)；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(1235bp)浓缩至6μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为1％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。
实施例4
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表4。
表4.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCR MasterMix，15ng质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(1235bp)；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(1235bp)浓缩至6μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为2％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。
实施例5
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表5。
表5.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCRMasterMix，15ng质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(2393bp)；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(2393bp)浓缩至5μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为1％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。
实施例6
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表6。
表6.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCRMasterMix，15ng质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(2393bp)；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(2393bp)浓缩至5μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为2％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。
实施例7
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表7。
表7.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCRMasterMix，15ng质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(2393bp)；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(2393bp)浓缩至6μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为1％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。
实施例8
一种新型的DNA水凝胶的制备方法，以质粒pRset-eGFP(购于：PromegaCorporation)作为模板为例，包括如下步骤：
带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA的具体序列见表8。
表8.脱氧核糖核酸序列
(1)加入终浓度为0.4μmol/L的带有甲基丙烯酰胺基修饰的引物链DNA，2×PfuPCRMasterMix，15ng质粒DNA，余量为超纯水，进行PCR反应，得到甲基丙烯酰胺基长链DNA(2393bp)；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列控温程序：
94℃3min
94℃30s
55℃30s
72℃2min回到第二步，继续进行29个循环
72℃10min
4℃Pause
(2)甲基丙烯酰胺基修饰的长链DNA(2393bp)浓缩至6μmol/L，在N2保护下加入质量浓度为2％的引发剂过硫酸铵和质量浓度为4％的催化剂四甲基乙二胺进行自由基聚合，在室温下静置120min，得到DNA水凝胶。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
<110> 天津大学
<120> 一种新型DNA水凝胶及制备方法
<130>
<160> 3
<170>
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taaccgtatt accgcctttg agt 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgggcctct tcgctatta 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctcgtcgtt tggtatggct tc 22
Claims (10)
1.一种新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以质粒DNA作为模板，在甲基丙烯酰胺基修饰的引物链的作用下，通过PCR技术得到甲基丙烯酰胺基长链DNA；
(2)甲基丙烯酰胺基长链DNA在引发剂和催化剂的作用下通过自由基聚合，在室温下静置，得到DNA水凝胶。
2.根据权利要求1所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺修饰的引物链为人工合成的DNA。
3.根据权利要求1所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述引发剂和催化剂在N2保护下加入。
4.根据权利要求1所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酰胺基长链DNA为经PCR产物纯化试剂盒处理之后的回收产物，甲基丙烯酰胺基长链DNA的碱基数在200～10000范围。
5.根据权利要求4所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺基长链DNA的碱基数在1000～3000范围。
6.根据权利要求1所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酰胺基长链DNA浓度为5～6μmol/L。
7.根据权利要求1所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述的引发剂为过硫酸铵及其相似引发剂，质量浓度为1％～2％。
8.根据权利要求7所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述的催化剂为四甲基乙二胺及其相似催化剂，质量浓度为4％。
9.根据权利要求1所述新型DNA水凝胶制备方法，其特征在于，所述的室温下静置的时间为0～24h。
10.根据权利要求1-9任意一项权利要求所述的方法制备的新型的DNA水凝胶。
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