CN113667147A - 一种可注射的GelMA颗粒凝胶及其制备和在三维细胞培养中的应用 - Google Patents

一种可注射的GelMA颗粒凝胶及其制备和在三维细胞培养中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可注射的GelMA颗粒凝胶及其制备和在三维细胞培养中的应用。所述颗粒凝胶是以甲基丙烯酸酐改性明胶为基体，利用高速分散机高速剪切分散化学交联的GelMA大块水凝胶得到。本发明依靠颗粒间的物理相互作用，形成一种可自支撑，可注射，可自愈合，具有良好生物相容性可促进干细胞生长增殖的颗粒凝胶。由于该颗粒凝胶具有可注射性和良好的生物相容性，可用于干细胞的三维培养和干细胞递送。该制备方法简单，后处理简单，适用性强，生物相容性良好，该水凝胶有望应用于细胞治疗及组织工程领域。

Description

一种可注射的GelMA颗粒凝胶及其制备和在三维细胞培养中 的应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料与组织工程技术领域，具体涉及一种可注射的GelMA颗粒凝胶及其制备和在三维细胞培养中的应用。
背景技术
干细胞由于其多能性，具有释放生长因子、调节炎症等利于功能化组织修复的特点，在治疗多种损伤和疾病方面显示出了巨大的潜力。传统的二维贴壁培养是应用最广的干细胞扩增手段，但是二维培养对于干细胞的增殖、分化能力、干性都有一定影响，且与体内细胞生长过程有一定差异性。
三维细胞培养指将细胞包裹在具有三维结构的载体中，使细胞在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，使细胞生长过程更接近于体内生长环境。水凝胶为高保水聚合物网络，具有类细胞外基质结构，可作为三维细胞培养载体。但是宏观支架或大块水凝胶中嵌入的细胞由于扩散速率有限，且与支架外环境各种影响因子距离遥远，细胞间通讯和营养物质交换会受到限制。因此急需开发一种具有生物相容性可注射同时利于细胞增殖的水凝胶。
颗粒凝胶自身具有可注射性和贯通孔结构，是细胞三维培养的良好载体。目前已有许多方法制备颗粒凝胶，如微流控技术、乳液聚合法、机械破碎法等。前两者制备方法复杂，产率低，制备所需的油相、表面活性剂也会产生潜在的细胞毒性。而用高速分散机对大块凝胶进行机械破碎得到的颗粒凝胶无需进行复杂的后处理过程，操作方法简单，产量大，通过调整分散时间也可得到不同粒径大小的颗粒凝胶。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法。本发明以GelMA为基体，利用高速分散机高速分散剪切作用得到具有良好注射性能、生物相容性，促细胞增殖的颗粒凝胶。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的可注射的GelMA颗粒凝胶。
本发明的再一目的在于提供上述可注射的GelMA颗粒凝胶的应用。
为实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：
一种可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将甲基丙烯酸酐改性明胶溶解于水中，得到甲基丙烯酸酐改性明胶(GelMA)溶液；
(2)在步骤(1)所得溶液中加入引发剂，得到水凝胶预聚液；
(3)对步骤(2)所得水凝胶预聚液通N2后加入引发促进剂，静置成胶，纯化，得到纯化的凝胶；
(4)将步骤(3)所得凝胶强烈搅拌，得到大颗粒凝胶，冻干处理，得到冻干粉末；
(5)将步骤(4)所得冻干粉末溶解于去离子水或磷酸缓冲液(PBS)，进行高转速分散，即获得所述可注射的GelMA颗粒凝胶。
优选地，步骤(1)中所述甲基丙烯酸酐改性明胶溶液的浓度为8～10wt％。
优选地，步骤(1)中所述溶解过程的条件为，温度40～45℃，搅拌速度150～200rpm。
优选地，步骤(1)中所述甲基丙烯酸酐改性明胶上双键接枝率为65～90％；所述甲基丙烯酸酐改性明胶是由甲基丙烯酸酐对明胶进行改性得到。
更优选地，所述甲基丙烯酸酐改性明胶通过以下方法制备得到：
1)将明胶在磷酸缓冲液中完全溶解(淡黄色澄清液体)，获得明胶溶液；
2)控制体系pH为7.4-11.0，向明胶溶液中加入甲基丙烯酸酐，反应；用磷酸缓冲液稀释反应以终止反应，用水透析反应液，冷冻干燥，获得甲基丙烯酸酐改性明胶。
优选地，所述明胶与磷酸缓冲液的用量比为2～10g：20～100mL。
优选地，所述明胶与甲基丙烯酸酐的用量比为2～10g：5～20mL。
优选地，所述甲基丙烯酸酐以滴加的方式加入，滴加的速度为4～6s一滴。
优选地，所述反应的条件为温度40～60℃，时间为4～10h。
优选地，所述透析采用截留分子量为8～15KDa的透析袋，用水进行透析。
优选地，步骤(2)中所述引发剂为过硫酸钾(KPS)。
优选地，步骤(2)中所述引发剂的用量为单体质量的0.5～2wt％。
优选地，步骤(2)中所述加入引发剂过程的条件为，温度25～30℃，搅拌速度150～250rpm，搅拌时间10～30min。
优选地，步骤(3)中所述引发促进剂为四甲基乙二胺(TEMED)。
优选地，步骤(3)中所述引发促进剂的用量为溶液质量0.1～0.5wt％。
优选地，步骤(3)中所述加入引发促进剂过程的条件为，温度25～30℃，搅拌速度100～200rpm，搅拌时间3～10min，。
优选地，步骤(3)中所述静置的时间为18～24小时。
优选地，步骤(3)中所述纯化的操作是：将水凝胶在去离子水浸泡4～7天，每天换水2～4次。
优选地，步骤(4)中所述强烈搅拌的条件为，转速8000～16000rpm，时间1～5min。
优选地，步骤(5)中所述冻干粉末的用量按其在溶液中的质量分数为5～10wt％计。
优选地，步骤(5)中所述高转速分散的条件为，转速8000～16000rpm，时间1～5min。
一种可注射的GelMA颗粒凝胶，通过上述制备方法制得。
上述可注射的GelMA颗粒凝胶在三维细胞培养中的应用。
上述可注射的GelMA颗粒凝胶在制备可注射细胞支架中的应用。
优选地，所述的细胞为干细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明利用机械破碎方法得到颗粒凝胶，未使用油相和表面活性剂，有利于提高材料的安全性，具有良好的生物相容性；
(2)本发明所使用的GelMA具有很好的生物相容性和生物降解性能；
(3)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶具有良好的力学性能，生物相容性；
(4)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶相较引发剂引发化学交联大块GelMA凝胶具有可注射性和自愈合性能；
(5)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶相较紫外光引发化学交联大块GelMA凝胶具有更好的生物相容性；
(6)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶具有贯通孔隙结构，利于营养物质传递，促进干细胞增殖；
(7)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶可为干细胞提供三维培养环境，更好地模拟干细胞在体内生长环境；
(8)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶可在注射过程中对细胞进行包裹，防止细胞由于受到剪切力作用而死亡；
(9)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶可通过注射形式应用于不规则的缺损部位；
(10)本发明制备的可注射的GelMA颗粒凝胶制备工艺简单易行，原材料成本低，便于批量生产，有较大应用推广价值。
附图说明
图1是实施例3制备的可注射Gel-s5颗粒凝胶的实物图。
图2是实施例3制备的可注射Gel-s5颗粒凝胶FITC染色后倒置显微镜下观察到的颗粒凝胶图。
图3是不同分散时间制备的颗粒凝胶的37℃频率扫描图；其中Gel-s1，Gel-s3，Gel-s5分别对应实施例1，2，3。
图4是不同分散时间制备的颗粒凝胶的25℃剪切速率粘度图；其中Gel-s1，Gel-s3，Gel-s5分别对应实施例1，2，3。
图5是实施例3制备的颗粒凝胶在37℃应变-时间扫描图。
图6是实施例3制备的颗粒凝胶在1000x放大下的电镜扫描图。
图7是用实施例3制备的可注射Gel-s5颗粒凝胶进行细胞包裹注射后培养1天的共聚焦细胞活死染色图。
图8是不同分散时间制备的颗粒凝胶包裹细胞注射后5小时，1天，3天后的CCK8细胞毒性实验图；其中Gel-s1，Gel-s3，Gel-s5分别对应实施例1，2，3。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明作进一步具体描述，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚，但实施例仅是范例性质的，并不对本发明的范围构成任何限制。
以下实施例所采用的原料来源说明：明胶、甲基丙烯酸甲酯均购自Sigma-Aldrich公司；过硫酸钾、四甲基乙二胺均购自阿拉丁公司。
实施例1
一种可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)GelMA的制备
①称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸缓冲溶液，密封容器，300rpm匀速搅拌，在50℃水浴下溶解30min至烧瓶中明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
②在步骤①所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酸酐(MA)，控制体系pH为7.4-11.0，MA的滴加速率控制为4-6s一滴；
③反应5h，将混合液与磷酸缓冲溶液以1:10的体积混合终止反应，过夜静置混合液后除去沉淀物；再用去离子水透析反应液7d，每天换水2次，透析袋截留分子量为14400，随后取出透析袋中液体冻干，最终得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
(2)GelMA颗粒凝胶的制备
①称取1g的GelMA，溶于去离子水中配成10mL溶液，45℃水浴加热，200rpm下搅拌1小时；
②在步骤①所得溶液中加入0.02g引发剂KPS，搅拌20min；
③将步骤②所得溶液在25℃下，通入N2 30min，加入30μL TEMED，搅拌3min后，静置18小时使成胶完全。再将化学交联的GelMA水凝胶浸入200mL去离子水中，每天换3次水，透析5天。
④使用高速分散机在16000rpm下将步骤③中透析后的凝胶强烈搅拌2min，得到大颗粒凝胶，冻干处理；
⑤将冻干粉末溶解于去离子水中，质量分数为6wt％。再使用高速分散机下在16000rpm分散1min，得到具有可注射性、生物相容性的GelMA颗粒凝胶，记为GelMA-s1。
实施例2
一种可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)GelMA的制备
①称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸缓冲溶液，密封容器，300rpm匀速搅拌，在50℃水浴下溶解30min至烧瓶中明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
②在步骤①所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酸酐(MA)，控制体系pH为7.4-11.0，MA的滴加速率控制为4-6s一滴；
③反应5h，将混合液与磷酸缓冲溶液以1:10的体积混合终止反应，过夜静置混合液后除去沉淀物；再用去离子水透析反应液7d，每天换水2次，透析袋截留分子量为14400，随后取出透析袋中液体冻干，最终得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
(2)GelMA颗粒凝胶的制备
①称取1g的GelMA，溶于去离子水中配成10mL溶液，45℃水浴加热，200rpm下搅拌1小时；
②在步骤①所得溶液中加入0.02g引发剂KPS，搅拌20min；
③将步骤②所得溶液在25℃下，通入N2 30min，加入30μL TEMED，搅拌3min后，静置18小时使成胶完全。再将化学交联的GelMA水凝胶浸入200mL去离子水中，每天换3次水，透析5天。
④使用高速分散机在16000rpm下将步骤③中透析后的凝胶强烈搅拌2min，得到大颗粒凝胶，冻干处理；
⑤将冻干粉末溶解于去离子水中，质量分数为6wt％。再使用高速分散机下在16000rpm分散3min，得到具有可注射性、生物相容性的GelMA颗粒凝胶，记为GelMA-s3。
实施例3
一种可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)GelMA的制备
①称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸缓冲溶液，密封容器，300rpm匀速搅拌，在50℃水浴下溶解30min至烧瓶中明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
②在步骤①所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酸酐(MA)，控制体系pH为7.4-11.0，MA的滴加速率控制为4-6s一滴；
③反应5h，将混合液与磷酸缓冲溶液以1:10的体积混合终止反应，过夜静置混合液后除去沉淀物；再用去离子水透析反应液7d，每天换水2次，透析袋截留分子量为14400，随后取出透析袋中液体冻干，最终得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
(2)GelMA颗粒凝胶的制备
①称取1g的GelMA，溶于去离子水中配成10mL溶液，45℃水浴加热，200rpm下搅拌1小时；
②在步骤①所得溶液中加入0.02g引发剂KPS，搅拌20min；
③将步骤②所得溶液在25℃下，通入N2 30min，加入30μL TEMED，搅拌3min后，静置18小时使成胶完全。再将化学交联的GelMA水凝胶浸入200mL去离子水中，每天换3次水，透析5天。
④使用高速分散机在16000rpm下将步骤③中透析后的凝胶强烈搅拌2min，得到大颗粒凝胶，冻干处理；
⑤将冻干粉末溶解于去离子水中，质量分数为6wt％。再使用高速分散机下在16000rpm分散5min得到具有可注射性、生物相容性的GelMA颗粒凝胶，记为GelMA-s5。
实施例3制备的可注射Gel-s5颗粒凝胶的实物图如图1所示。将该颗粒凝胶FITC染色后倒置显微镜下观察，结果如图2所示。从图中可以看出，凝胶成颗粒状，尺寸较均一，平均尺寸为26μm。
将实施例1，2，3制备的颗粒凝胶的进行37℃频率扫描，结果如图3所示。从图中可以看出，凝胶的力学性能较稳定。
将实施例1，2，3制备的颗粒凝胶的进行25℃剪切速率粘度测定，结果如图4所示。从图中可以看出，随剪切速率增大，凝胶的粘度显著下降，说明该凝胶具有剪切变稀性能，可进行注射。
将实施例3制备的颗粒凝胶进行37℃应变时间扫描，分别在100％应变和1％应变进行应变循环测试，结果如图5所示。从图中可以看出，该颗粒凝胶在高应变剪切成溶胶态后在低应变剪切下模量可很快恢复至原样，说明该颗粒凝胶具有较好的自愈合性能。
将实施例3制备的颗粒凝胶通过液氮淬冷后进行冷冻干燥，通过扫描电镜观察形貌，结果如图6所示。从图中可看出，有块状颗粒凝胶所构成，凝胶存在贯通的孔隙结构，有利于细胞迁移和营养物质输送。
用实施例3制备的可注射Gel-s5颗粒凝胶进行细胞包裹注射后培养1天，进行共聚焦细胞活死染色。将含有5万小鼠脂肪间充质干细胞细胞悬液与300μL凝胶通过涡旋轻轻混合2分钟。随后用针管吸取包裹细胞凝胶并用18G针头注射到48孔板中，加入400μL完全培养基进行培养。培养一天后吸去培养基，并用PBS清洗两遍，加入配置好的钙黄绿素和碘化丙啶溶液200μL，避光静置30分钟后吸走染液并用PBS清洗一遍后，通过莱卡激光共聚焦进行拍摄观察，结果如图7所示。从图中可以看出，在颗粒凝胶内部有许多活细胞存在，无明显的死细胞，说明材料无毒性，可促进包裹在凝胶内部的干细胞增长。
用实施例1、2、3制备的可注射Gel-s5颗粒凝胶包裹细胞注射后5小时，1天，3天后的CCK8细胞毒性实验。将含有5万小鼠脂肪间充质干细胞细胞悬液与300μL不同分散时间凝胶通过涡旋轻轻混合2分钟。随后用针管吸取包裹细胞凝胶并用18G针头注射到48孔板中，加入400μL完全培养基进行培养。分别在培养后5小时、1天、3天后进行CCK8细胞毒性试验，即将培养基吸去后加入PBS清洗两遍，随后以CCK8:完全培养基＝1:10比例配置CCK8溶液。每孔中加入200μL CCK8溶液，避光37摄氏度下静置1小时。随后采用负吸法吸取上层清液100μL到96孔板中，利用酶标仪在450nm处测得吸光度，结果如图8所示。从图中可以看出，随培养时间延长，测得的吸光度值逐渐增大，说明材料无毒性，可促进包裹在凝胶内部的干细胞增长。
实施例4
一种用于干细胞递送的GelMA颗粒凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)GelMA的制备
①称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸缓冲溶液，密封容器，300rpm匀速搅拌，在50℃水浴下溶解30min至烧瓶中明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
②在步骤①所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酸酐(MA)，控制体系pH为7.4-11.0，MA的滴加速率控制为4-6s一滴；
③反应5h，将混合液与磷酸缓冲溶液以1:10的体积混合终止反应，过夜静置混合液后除去沉淀物；再用去离子水透析反应液7d，每天换水2次，透析袋截留分子量为14000，随后取出透析袋中液体冻干，最终得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
(2)GelMA颗粒凝胶的制备
①称取0.5g的GelMA，溶于去离子水中配成10mL溶液，45℃水浴加热，200rpm下搅拌1小时；
②在步骤①所得溶液中加入0.02g引发剂KPS，搅拌20min；
③将步骤②所得溶液在25℃下，通入N2 30min，加入30μL TEMED，搅拌3min后，静置18小时使成胶完全。再将化学交联的GelMA水凝胶浸入200mL去离子水中，每天换3次水，透析5天。
④使用高速分散机在16000rpm下将步骤③中透析后的凝胶强烈搅拌2min，得到大颗粒凝胶，冻干处理；
⑤将冻干粉末溶解于去离子水中，质量分数为6wt％。再使用高速分散机下在16000rpm分散5min，得到具有可注射性、生物相容性的GelMA颗粒凝胶。
对比例1：
一种GelMA大块凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)GelMA的制备
①称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸缓冲溶液，密封容器，300rpm匀速搅拌，在50℃水浴下溶解30min至烧瓶中明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
②在步骤①所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酸酐(MA)，控制体系pH为7.4-11.0，MA的滴加速率控制为4-6s一滴；
③反应5h，将混合液与磷酸缓冲溶液以1:10的体积混合终止反应，过夜静置混合液后除去沉淀物；再用去离子水透析反应液7d，每天换水2次，透析袋截留分子量为14000，随后取出透析袋中液体冻干，最终得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
(2)GelMA大块凝胶的制备
①称取1g的GelMA，溶于去离子水中配成10mL溶液，45℃水浴加热，200rpm下搅拌1小时；
②在步骤①所得溶液中加入0.02g引发剂KPS，搅拌20min；
将步骤②所得溶液在25℃下，通入N2 30min，加入40μL TEMED，搅拌3min后，静置18小时使成胶完全。
③进行可注射实验：将过大块凝胶装进针筒进行注射，无法通过28G针筒。因为凝胶硬度较大，相互作用较强，无剪切变稀和可注射性能。
④进行自愈合实验：将步骤③合成的大块凝胶用小刀切成两块，再挨在一起，不施加外力，在25℃下放置3小时，用镊子夹住两块轻碰即可分开。说明切开的大块凝胶之间氢键等相互作用力较小，比表面积较大，无法通过接触进行自愈合。
对比例2：
一种用于干细胞递送的GelMA颗粒凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)GelMA的制备
①称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸缓冲溶液，密封容器，300rpm匀速搅拌，在50℃水浴下溶解30min至烧瓶中明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
②在步骤①所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酸酐(MA)，控制体系pH为7.4-11.0，MA的滴加速率控制为4-6s一滴；
③反应5h，将混合液与磷酸缓冲溶液以1:10的体积混合终止反应，过夜静置混合液后除去沉淀物；再用去离子水透析反应液7d，每天换水2次，透析袋截留分子量为14000，随后取出透析袋中液体冻干，最终得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
(3)GelMA大块凝胶的制备
①称取1g的GelMA，溶于去离子水中配成10mL溶液，45℃水浴加热，200rpm下搅拌1小时；
②在步骤①所得溶液中加入0.02g引发剂KPS，搅拌20min；
③将步骤②所得溶液在25℃下，通入N2 30min，加入40μL TEMED，搅拌3min后，静置18小时使成胶完全。再将化学交联的GelMA水凝胶浸入200mL去离子水中，每天换3次水，透析5天。
④将步骤③中透析后的凝胶直接冻干处理，所得到的为坚硬、大块泡沫状物体，难以研磨分散，也难以溶于去离子水中，无法进行后续实验操作。
对比例3：
一种用于干细胞递送的GelMA颗粒凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)GelMA的制备
①称取6g明胶于100mL圆底烧瓶中，加入60mL磷酸缓冲溶液，密封容器，300rpm匀速搅拌，在50℃水浴下溶解30min至烧瓶中明胶完全溶解为淡黄色澄清液体；
②在步骤①所得溶液中加入12mL甲基丙烯酸酸酐(MA)，控制体系pH为7.4-11.0，MA的滴加速率控制为4-6s一滴；
③反应5h，将混合液与磷酸缓冲溶液以1:10的体积混合终止反应，过夜静置混合液后除去沉淀物；再用去离子水透析反应液7d，每天换水2次，透析袋截留分子量为14000，随后取出透析袋中液体冻干，最终得到泡沫状固体产物GelMA，-20℃下密封保存备用。
(2)GelMA颗粒凝胶的制备
①称取0.5g的GelMA，溶于去离子水中配成10mL溶液，45℃水浴加热，200rpm下搅拌1小时；
②在步骤①所得溶液中加入0.02g引发剂KPS，搅拌20min；
③将步骤②所得溶液在25℃下，通入N2 30min，加入30μL TEMED，搅拌3min后，静置18小时使成胶完全。再将化学交联的GelMA水凝胶浸入200mL去离子水中，每天换3次水，透析5天。
④使用高速分散机在16000rpm下将步骤③中透析后的凝胶强烈搅拌2min，得到大颗粒凝胶，冻干处理；
⑤将冻干粉末溶解于去离子水中，质量分数为3wt％。再使用高速分散机下在16000rpm分散5min得到具有可注射性、生物相容性的GelMA颗粒凝胶
⑥对步骤⑤随得颗粒凝胶进行性能表征，流变实验表明该颗粒凝胶的模量很小，力学性能差。自愈合实验中，向愈合后的整体中加入PBS，结构很快破坏，无法支撑，难以进行后续细胞实验。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将甲基丙烯酸酐改性明胶溶解于水中，得到甲基丙烯酸酐改性明胶溶液；
(2)在步骤(1)所得溶液中加入引发剂，得到水凝胶预聚液；
(3)对步骤(2)所得水凝胶预聚液通N2后加入引发促进剂，静置成胶，纯化，得到纯化的凝胶；
(4)将步骤(3)所得凝胶强烈搅拌，得到大颗粒凝胶，冻干处理，得到冻干粉末；
(5)将步骤(4)所得冻干粉末溶解于去离子水或磷酸缓冲液，进行高转速分散，即获得所述可注射的GelMA颗粒凝胶。
2.根据权利要求1所述的可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述甲基丙烯酸酐改性明胶溶液的浓度为8～10wt％；
步骤(1)中所述甲基丙烯酸酐改性明胶上双键接枝率为65～90％；
步骤(1)中所述溶解过程的条件为，温度40～60℃，搅拌速度150～300rpm。
3.根据权利要求1所述的可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述引发剂为过硫酸钾；
步骤(2)中所述引发剂的用量为单体质量的0.5～2wt％；
步骤(2)中所述加入引发剂过程的条件为，温度25～30℃，搅拌速度150～250rpm，搅拌时间10～30min。
4.根据权利要求1所述的可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述引发促进剂为四甲基乙二胺；
步骤(3)中所述引发促进剂的用量为溶液质量0.1～0.5wt％；
步骤(3)中所述加入引发促进剂过程的条件为，温度25～30℃，搅拌速度100～200rpm，搅拌时间3～10min；
步骤(3)中所述静置的时间为18～24小时；
步骤(3)中所述纯化的操作是：将水凝胶在去离子水浸泡4～7天，每天换水2～4次。
5.根据权利要求1所述的可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述强烈搅拌的条件为，转速8000～16000rpm，时间1～5min。
6.根据权利要求1所述的可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤(5)中所述冻干粉末的用量按其在溶液中的质量分数为5～10wt％计；
步骤(5)中所述高转速分散的条件为，转速8000～16000rpm，时间1～5min。
7.根据权利要求1所述的可注射的GelMA颗粒凝胶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述甲基丙烯酸酐改性明胶通过以下方法制备得到：
1)将明胶在磷酸缓冲液中完全溶解，获得明胶溶液；
2)控制体系pH为7.4-11.0，向明胶溶液中加入甲基丙烯酸酐，反应；用磷酸缓冲液稀释反应以终止反应，用水透析反应液，冷冻干燥，获得甲基丙烯酸酐改性明胶；
所述明胶与磷酸缓冲液的用量比为2～10g：20～100mL；
所述明胶与甲基丙烯酸酐的用量比为2～10g：5～20mL；
所述甲基丙烯酸酐以滴加的方式加入，滴加的速度为4～6s一滴；
所述反应的条件为温度40～60℃，时间为4～10h；
所述透析采用截留分子量为8～15KDa的透析袋，用水进行透析。
8.一种可注射的GelMA颗粒凝胶，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法制得。
9.权利要求8所述的可注射的GelMA颗粒凝胶在三维细胞培养中的应用。
10.权利要求8所述的可注射的GelMA颗粒凝胶在制备可注射细胞支架中的应用。
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