CN114349990B

CN114349990B - 一种动态特性可调水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114349990B
Application number: CN202210053849.XA
Authority: CN
Inventors: 朱彩虹; 刘长江; 李斌
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2022-01-18
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2042-01-18
Also published as: CN114349990A

Abstract

本发明公开了一种动态特性可调水凝胶及其制备方法与应用，该制备方法包括如下步骤：S1、将甲基丙烯酰化明胶或者水溶性光引发剂溶解于PBS缓冲液中，得到溶液A；S2、按照一定的顺序分别将物质Ⅰ、双官能团分子以及苯硼酸化的亲水大分子材料溶解于S1步骤所制得的的溶液A中，形成溶液B，然后将溶液B的pH调至7‑8，混合均匀并经紫外光照射，即得到动态特性可调水凝胶；当溶液A中的溶质采用甲基丙烯酰化明胶时，物质Ⅰ为水溶性光引发剂，当溶液A中的溶质采用水溶性光引发剂时，物质Ⅰ为甲基丙烯酰化明胶；其中，苯硼酸化的亲水大分子材料为接枝有苯硼酸的亲水大分子材料。本发明的制备方法操作简单，所得水凝胶动态力学特性可调。

Description

一种动态特性可调水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物水凝胶制备的技术领域，特别涉及一种动态特性可调水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

在生物组织中，细胞可以不断地与周围的动态细胞外基质(ECM)相互作用，引起细胞的各种行为，包括扩散、增殖、迁移和分化。除了固有的热力学重排外，生物聚合物的降解和作用力还会引起物理交联的解离和重联，从而导致生物聚合物网络的动态特性。同时，大脑、肝脏、脂肪组织和韧带等生物都表现出动态力学特性。因此，ECM的动态力学特性在组织稳态和再生过程中的细胞行为中发挥重要作用，并与疾病进展有关。因而设计一种动态特性可调的生物材料来模拟ECM动力学的微环境，有助于探索细胞与基质之间的内在联系，有利于促进组织再生。

近年来，不同的动态水凝胶被用于细胞培养，以模拟ECM的微环境，以探索基质动力学如何影响细胞行为。然而，关于细胞与基质相互作用的知识仍然有限，用于模拟细胞微环境的动态水凝胶类型也很少。对于合成水凝胶，由于它们不具有固有的生物活性，因此需要使用RGD来赋予其生物活性，这些都限制了动态水凝胶在组织工程中的应用与发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种动态特性可调水凝胶及其制备方法，该方法操作简单、原料易得，所得动态水凝胶的动态力学特性可调(即水凝胶储存模量和损耗模量单独可调)，具有很好的生物相容性，并具有可注射、自愈合和高粘附性。

本发明的技术方案为：

一种动态特性可调水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

S1、将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或者水溶性光引发剂溶解于PBS缓冲液中，得到溶液A；

S2、按照一定的顺序分别将物质Ⅰ、双官能团分子以及苯硼酸化的亲水大分子材料溶解于S1步骤所制得的的溶液A中，形成溶液B，然后将溶液B的pH调至7-8，混合均匀并经紫外光照射，即得到动态特性可调水凝胶；

当溶液A中的溶质采用甲基丙烯酰化明胶时，物质Ⅰ为水溶性光引发剂，当溶液A中的溶质采用水溶性光引发剂时，物质Ⅰ为甲基丙烯酰化明胶；

其中，苯硼酸化的亲水大分子材料为接枝有苯硼酸的亲水大分子材料，双官能团分子的结构式如下：

n的取值范围为0至6的整数。

优选地，苯硼酸化的亲水大分子材料包括苯硼酸化明胶(Gelatin-PBA)、苯硼酸化透明质酸(HA-PBA)、苯硼酸化壳聚糖(Chitosan-PBA)、苯硼酸化聚赖氨酸和苯硼酸化葡聚糖中至少一种，溶液B中苯硼酸化的亲水大分子材料的质量体积百分浓度为0.5-15％。

优选地，所述双官能团分子为原儿茶醛(DB)，对应的结构式中n的取值为0，醛基直接与苯环相连，所述水溶性光引发剂为苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)或Iragure2959。

优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的取代度为20-60％。

优选地，当溶液A中的溶质采用甲基丙烯酰化明胶时，溶液A中甲基丙烯酰化明胶的质量体积百分浓度为小于等于20％，可根据需要选择甲基丙烯酰化明胶的取代度和浓度，溶液B中水溶性光引发剂的质量体积百分浓度为0.25-5％。

优选地，当溶液A中的溶质采用水溶性光引发剂时，溶液A中水溶性光引发剂的质量体积百分浓度为0.25-5％，溶液B中甲基丙烯酰化明胶的质量体积百分浓度小于等于20％，可根据需要选择甲基丙烯酰化明胶的取代度和浓度。

优选地，溶液B中双官能团分子的物质的量浓度为15-40mmol/L。

优选地，S2步骤中紫外光照射时间为60-180s，对应的紫外光源波长为395-450nm。

一种动态特性可调水凝胶，所述动态特性可调水凝胶采用上述制备方法制得。

本发明提供的动态特性可调水凝胶可应用于体外细胞培养和体内组织工程领域中。

本发明的有益效果是：

(1)本发明采用例如原儿茶醛的双官能团分子，能够与苯硼酸形成动态硼酸酯键，而且与甲基丙烯酰化明胶上的氨基形成动态席夫碱键，本发明通过改变组分浓度能独立调节水凝胶的储存模量和损耗模量，即能够实现水凝胶的宏观强度(存储模量)和微观动态性能(损耗模量)可控；本发明所制备的动态水凝胶体系中，材料的强度由光引发自由基聚合提供，动态席夫碱键和硼酸酯键提供材料的动态性能；

(2)本发明的制备方法作简单、原料易得，所制得的动态水凝胶为浅黄色透明的凝胶状物质，并具有很好的生物相容性，具有促进细胞铺展增殖等优点，还具有可注射性、自愈合性和高粘附性等特点；利用该制备方法可以根据细胞或组织的需要调节其水凝胶的动态特性，可满足细胞培养和组织工程等生物医学领域对水凝胶性能的要求，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例1制备的苯硼酸化明胶的¹H NMR图谱；

图2为本发明实施例1制备的水凝胶流变学性能；

图3为本发明实施例1制备的水凝胶的可注射性实验；

图4为本发明实施例1制备的水凝胶的自愈合实验；

图5为本发明实施例1制备的水凝胶的粘附性实验；

图6为本发明实施例1制备的水凝胶的循环压缩实验；

图7为水凝胶冻干后的微观形貌图；

图8为不同浓度水凝胶的流变学性能；

图9为在水凝胶上2D培养BMSCs在第三天细胞骨架染色的共聚焦显微图像。

图10为在水凝胶上2D培养BMSCs在第三天YAP免疫荧光染色的共聚焦显微图像。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1

(1)制备苯硼酸化明胶

将100mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mg N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基羧二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于6mL二甲基亚砜(DMSO)中，随后加入200mg 4-羧基苯硼酸(4-CPBA)，然后在室温下搅拌5h；将上述得到的溶液滴加到100mL明胶(Gelatin)水溶液(2wt％)中，在室温下反应24h；将所得混合物在去离子水下透析4天((分子量截断为3kDA))，随后冷冻干燥得到Gelatin-PBA，将其放到4℃干燥柜中待用。

(2)制备明胶基动态水凝胶

S1、将GelMA加入到PBS缓冲液中，在50℃下加热至完全溶解，得到溶液A，溶液A中甲基丙烯酰化明胶的质量体积百分浓度为5％，其中GelMA的取代度为60％；

S2、将Gelatin-PBA、光引发剂LAP和DB加入到溶液A并充分搅拌均匀，形成溶液B，溶液B中Gelatin-PBA质量体积百分浓度为5％，LAP质量体积百分浓度为1％，DB物质的量浓度为15mmol/L，然后利用5mol/L的氢氧化钠溶液将溶液B的pH调至7，混合混匀，并在室温下，利用紫外光(405nm)照射60s，即得到明胶基动态水凝胶。

实施例2

本实施例也采用实施例1中的制备方法制备Gelatin-PBA，明胶基动态水凝胶的制备步骤如下：

S1、将LAP溶解于PBS缓冲液中，得到溶液A，溶液A中LAP的质量体积百分浓度为0.5％；

S2、先将GelMA和Gelatin-PBA溶解于S1步骤中所制得的溶液A中，其中GelMA的取代度为60％，然后再加入DB并充分搅拌均匀，形成溶液B，溶液B中GelMA质量体积百分浓度为5％，Gelatin-PBA质量体积百分浓度为15％，DB物质的量浓度为30mmol/L，然后利用1mol/L的氢氧化钠溶液将溶液B的pH调至7，混合混匀，并在室温下，利用紫外光(405nm)照射60s，即得到明胶基动态水凝胶。

实施例3

S1、将LAP溶解于PBS缓冲液中，得到溶液A，溶液A中LAP的质量体积百分浓度为1％；

S2、先将GelMA和Gelatin-PBA溶解于S1步骤中所制得的溶液A中，其中GelMA的取代度为60％，然后再加入DB并充分搅拌均匀，形成溶液B，溶液B中GelMA质量体积百分浓度为15％，Gelatin-PBA质量体积百分浓度为5％，DB物质的量浓度为40mmol/L，然后利用1mol/L的氢氧化钠溶液将溶液B的pH调至7，混合混匀，并在室温下，利用紫外光(405nm)照射60s，即得到明胶基动态水凝胶。

实施例4

(1)制备苯硼酸化透明质酸

将100mg透明质酸(HA)在恒定搅拌下完全溶解在去20mL离子水中，得到HA溶液；然后将47mg 3-氨基苯硼酸(3-APBA)和80mg4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物(DMTMM)分别加入并溶解于HA溶液中，使用1mol/L盐酸溶液将上述得到的溶液的pH值调节至6.5，继续在室温下搅拌72h；将所得混合物在去离子水下透析4天(分子量截断为6-8kDA)，随后冷冻干燥得到HA-PBA，将其放到4℃干燥柜中待用。

(2)制备透明质酸-明胶动态水凝胶

S1、将LAP溶解于PBS缓冲液中，得到溶液A，溶液A中LAP的质量体积百分浓度为5％；

S2、先将HA-PBA和GelMA溶解于S1步骤中所制得的溶液A中，其中GelMA的取代度为60％，然后再加入DB并充分搅拌均匀，形成溶液B，溶液B中HA-PBA质量体积百分浓度为0.5％，GelMA质量体积百分浓度为5％，DB物质的量浓度为20mmol/L，然后利用1mol/L的氢氧化钠溶液将溶液B的pH调至7，混合混匀，并在室温下，利用紫外光(405nm)照射120s，即得到透明质酸-明胶动态水凝胶。

实施例5

(1)制备苯硼酸化壳聚糖

将0.5g 4-CPBA、6.0g NHS和4.5g EDC溶解在300mL去离子水中，用0.1mol/L盐酸溶液将上述制备的溶液的pH值调节至5.5，继续搅拌20min，然后加入0.4g壳聚糖(Chitosan)，反应4h后，使用再生纤维素透析管将所得产物用去离子水透析6天，随后冷冻干燥得到Chitosan-PBA，并放到4℃干燥柜中待用。

(2)制备壳聚糖-明胶动态水凝胶

S2、先将Chitosan-PBA和GelMA溶解于S1步骤中所制得的溶液A中，其中GelMA的取代度为60％，然后再加入DB并充分搅拌均匀，形成溶液B，溶液B中Chitosan-PBA质量体积百分浓度为5％，GelMA质量体积百分浓度为5％，DB物质的量浓度为20mmol/L，然后利用1mol/L的氢氧化钠溶液将溶液B的pH调至7，混合混匀，并在室温下，利用紫外光(405nm)照射120s，即得到壳聚糖-明胶动态水凝胶。

本发明所提及的质量体积百分浓度是指100mL溶液中所含溶质的克数，公式表示为：溶质的质量(g)/溶液的体积(mL)×100％。

本发明实施例1中所制备的Gelatin-PBA的核磁共振氢谱(¹H NMR)如图1所示，该图谱中7.72ppm、7.73ppm、7.77ppm和7.78ppm处的峰为苯环上的质子，表明苯硼酸成功接枝到明胶上。

图2为实施例1制备的动态水凝胶的流变学性能，图中G'对应储存模量，G”对应损耗模量，图中带有“+DB”标注的样品对应实施例1所制备的动态水凝胶，带有“-DB”标注的样品与实施例1所制备的样品相比，制备方法相同，只是不添加DB，由图2可以看出，其他组分相同时，通过在水凝胶中引入小分子DB，可以在保持存储模量不变的情况下，调节其损耗模量。

本发明所制备的水凝胶具有可注射性，以实施例1所制备的动态水凝胶为例，该水凝胶可以通过22号针头成功挤出，具体见图3，该水凝胶可以注射形成想要的模样，这有利于用于缺损组织的填补修复和细胞递送等实验。

本发明所制备的水凝胶还具有自愈合性，以实施例1所制备的动态水凝胶为例，如图4中的A图所示，在切断凝胶并让碎片再次接触后，水凝胶样品可以在37℃下1h后愈合到一起，如图4中的B图所示，该图为流变学结果，储存模量(G')和损耗模量(G”)在低应变区保持不变，直到施加189.52％的高剪切应变，达到水凝胶网络破裂所需的临界应变值，在该应变以上，由于水凝胶网络结构的坍塌，G”成为主导。剪切应变在1％-300％之间的循环实验显示出该水凝胶具有良好的自愈性能。

本发明所制备的水凝胶还具有高粘附性，以实施例1所制备的动态水凝胶为例，如图5中的A图所示，水凝胶显示了对各种表面的粘附能力，如丁腈橡胶(NBR)，玻璃(Glass)，聚丙烯(PP)，组织(Tissue)和钢(Steel)。如图5中的B图所示,通过搭接剪切试验评价了水凝胶的组织粘附性能，发现水凝胶与玻璃的粘附强度最高可达26kPa，而水凝胶对组织的粘附强度最高为20kPa。如图5中的C图所示，当粘附面积为3cm²时，两块玻璃板通过水凝胶粘在一起，能够举起1kg重物，此外，在水中两个玻璃板也没有滑动。

以实施例1所制备的动态水凝胶为例进行循环压缩实验，如图6所示，水凝胶各循环的加/卸载曲线重叠，说明水凝胶经过5次高应变压缩至80％的循环后，能够完全恢复其形状和强度。

图7为水凝胶冻干后的扫描电镜图，图中A、B和C样品的制备方法参见实施例1，与实施例1所制备的样品相比，A、B和C样品的制备过程中只是GelMA和Gelatin-PBA质量体积百分浓度存在区别，具体浓度为A:10％GelMA；B:10％GelMA/5％Gelatin-PBA；C:10％GelMA/10％Gelatin-PBA，从图7中可以看出，随着组分浓度的增加，水凝胶的孔隙变得更致密。

图8为水凝胶的流变学性能，图中的GP代表Gelatin-PBA，GM代表GelMA，该图中对应的样品也是参照实施例1的制备方法，与实施例1所制备的样品相比，只是调节对应的Gelatin-PBA或者GelMA的质量体积百分浓度，从图中可以看出，在GelMA和DB浓度不变的情况下，通过改变Gelatin-PBA浓度，可以在保持G'不变的情况下调节G”。同时，在保持Gelatin-PBA和DB浓度不变的情况下，水凝胶的G'随GM浓度的增加而增加，但G"/G'不变。

图9为实施例1制备的水凝胶与纯GelMA水凝胶2D培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)在第三天的细胞骨架染色共聚焦显微图像，水凝胶上的细胞均显示出良好的细胞活力，且与单纯GelMA水凝胶相比，动态水凝胶能够更好的促进细胞铺展。

图10为实施例1制备的水凝胶与纯GelMA水凝胶2D培养BMSCs在第三天的YAP免疫荧光染色共聚焦显微图像，动态水凝胶能更好的促进YAP核定位的表达。

本发明利用小分子DB作为一个动态交联点，可以在大分子链之间自由移动，有利于动态键的交联和重排，从而促进和有效控制水凝胶的动态性能，本发明的制备方法作简单、原料易得，所制得的动态水凝胶为浅黄色透明的凝胶状物质，该水凝胶并具有很好的生物相容性，具有促进细胞铺展增殖等优点，还具有可注射性、自愈合性和高粘附性等特点；利用该制备方法可以根据细胞或组织的需要调节其水凝胶的动态特性，可满足细胞培养和组织工程等生物医学领域对水凝胶性能的要求，具有广阔的应用前景。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims

1.一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将甲基丙烯酰化明胶或者水溶性光引发剂溶解于PBS缓冲液中，得到溶液A；

其中，苯硼酸化的亲水大分子材料为接枝有苯硼酸的亲水大分子材料，苯硼酸化的亲水大分子材料为苯硼酸化明胶、苯硼酸化透明质酸、苯硼酸化壳聚糖、苯硼酸化聚赖氨酸和苯硼酸化葡聚糖中至少一种；双官能团分子的结构式如下：

n的取值范围为0至6的整数。

2.根据权利要求1所述的一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，溶液B中苯硼酸化的亲水大分子材料的质量体积百分浓度为0.5-15％。

3.根据权利要求1所述的一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，所述双官能团分子为原儿茶醛，所述水溶性光引发剂为苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂或Iragure2959。

4.根据权利要求1所述的一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶的取代度为20-60％。

5.根据权利要求4所述的一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，当溶液A中的溶质采用甲基丙烯酰化明胶时，溶液A中甲基丙烯酰化明胶的质量体积百分浓度小于等于20％，溶液B中水溶性光引发剂的质量体积百分浓度为0.25-5％。

6.根据权利要求4所述的一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，当溶液A中的溶质采用水溶性光引发剂时，溶液A中水溶性光引发剂的质量体积百分浓度为0.25-5％，溶液B中甲基丙烯酰化明胶的质量体积百分浓度小于等于20％。

7.根据权利要求1所述的一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，溶液B中双官能团分子的物质的量浓度为15-40mmol/L。

8.根据权利要求1所述的一种动态特性可调水凝胶的制备方法，其特征在于，S2步骤中紫外光照射时间为60-180s，对应的紫外光源波长为395-450nm。

9.一种动态特性可调水凝胶，其特征在于，所述动态特性可调水凝胶采用如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得。

10.根据权利要求9所述的动态特性可调水凝胶在体外细胞培养和体内组织工程中的应用。