CN114874455B - 一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原和凝胶的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原和凝胶的构建方法，属于生物材料技术领域。首先制备了中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原，且其自组装凝胶可通过烯键链增长或逐步增长的交联方法进一步提高强度。经过改性的胶原蛋白仍然具有自组装能力，并具有低温中性溶解、自组装温度升高的特点。对于改性胶原的交联，硫醇烯反应的交联剂为包含两个或多个巯基的化合物，巯基间可以添加降解位点、超分子作用位点、动态键位点等，以改变纤维凝胶的模量、黏弹性、降解性等生物、物理、化学特征，为胶原纤维凝胶的交联提供全新的可能。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原和凝胶的构建方法。
背景技术
胶原蛋白占脊椎动物体内蛋白质的比例近三分之一，是脊椎动物体内最重要的结构蛋白。除具有可生物降解、低抗原性、生物相容性等众多优秀的特性外，胶原分子还具有独特的自组装特性，即在中性条件下自组装形成纳米纤维并通过纤维堆积形成凝胶。这种凝胶在用于三维培养细胞基质时，优势非常明显。纤维组装的大孔隙相比于分子交联网络更大，有利于细胞的伸展和迁移，纤维上丰富和立体的整联蛋白受体更接近于体内的真实环境。然而，重新形成的胶原纤维，既没有天然胶原高度有序的高级组装结构，又没有经过体内多种酶促反应的交联，体外形成的胶原蛋白凝胶力学性能和稳定性均远低于其体内状态，严重限制了胶原蛋白在生物技术中的应用潜力。此外，中和后的胶原蛋白不稳定，在低温下也难以阻止其组装的趋势，留给混合细胞等组分、凝胶的加工时间都非常短暂。
天然胶原只能溶解于酸性环境，经中和后才能形成纤维凝胶。此外，中和后的胶原不稳定，在低温下也会逐渐发生组装，限制了胶原蛋白的加工时间。琥珀酰化胶原能够解决胶原蛋白的中性溶解问题，但国内外申请的专利中，琥珀酰化的胶原蛋白均失去了自主装性能(US4164559A，CN200410040487.2)。
大量工作报道了胶原蛋白的交联方法，最主要的是以胶原分子的氨基作为交联位点，如戊二醛、京尼平、碳二亚胺、环氧化合物等。以上交联剂广泛应用于胶原组织工程支架中，已经发展出众多的临床产品。然而，对于含细胞的胶原凝胶，细胞表面也有大量的氨基，依靠渗透作用交联氨基的方法对细胞的毒性较大。光交联引发凝胶的特点是从内至外同时引发凝胶反应，反应速度也相对较快。使用核黄素可以实现天然胶原纤维的光交联，但细胞毒性仍然较高。另一种思路则是在胶原分子上修饰烯键，William T.Brinkman等(Biomacromolecules 2003,4,890-895)在胶原分子上修饰了甲基丙烯酸酯键，通过自由基链式聚合反应快速交联胶原纤维。然而，这种胶原仍然是酸性溶解的，不稳定的中和溶液限制了这种胶原的应用，且自由基链式聚合反应的毒性较大。裴仁军等(CN 109553783 A)公开了一种甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的胶原蛋白的制备方法，但这种胶原不能够自组装形成胶原纤维，胶原凝胶是由胶原分子直接交联形成的。郭凯等(CN 113150313 A,ACSAppl.Mater.Interfaces 2021,13,7037-7050)公布了降冰片烯修饰胶原凝胶的方法，硫醇烯反应具有更低的细胞毒性和更快的凝胶速度，但仍然存在同样的问题，未经自组装直接光交联的方式构建的胶原凝胶是由胶原分子交联形成的，即凝胶中没有大孔隙的纤维结构，在一定程度上降低了胶原的优势。
由于硫醇烯反应速度快于烯键间的链式聚合反应，带有两个以上巯基的化合物可以被整合到凝胶网络中，增加凝胶的功能性和灵活性。Z等证明四臂巯基聚乙二醇相比于二硫苏糖醇，交联的降冰片烯明胶具有更高的强度(Biomaterials ence 2014,2(8),1063-1072)。Ouyang L等证明细胞在带有金属蛋白酶降解位点的双巯基交联剂交联的降冰片烯透明质酸凝胶中具有更好的伸展性能(Adv.Mater.2017,1604983)。/>T等使用巯基改性的明胶交联降冰片烯修饰的明胶，证明其相比于二硫苏糖醇反应速度更快(Adv.Healthcare Mater.2021,10,2100206)。因此，硫醇烯反应体系中的巯基交联剂对整个凝胶体系的影响非常关键。本发明中提出将动态键和非共价作用连接交联剂中的巯基，对凝胶机械性能调控，进而调控其中包封细胞的行为。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自组装光固化胶原和凝胶的构建方法，该光固化胶原具有自组装性能且自组装温度提高、并能够低温溶解，通过交联剂等的选择构建凝胶。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原，其特征在于：该改性胶原的分子结构特征为：胶原分子同时修饰了羧基和烯键，其中：羧基由二羧酸引入胶原侧链取代原来的氨基，烯键由二羧酸和/或其他方式引入，烯键由二羧酸引入时位于二羧酸分子上，烯键以其他方式引入时位于胶原侧链。所述烯键包括但不限于降冰片烯基、乙烯基、丙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、烯基、乙烯基等硫醇烯反应活性高的烯键；或者，烯键包括但不限于的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯丙烯酰胺等链增长反应活性较高的烯键。
该改性胶原的分子结构具体包括以下三种形式：
第一种：该改性胶原的分子结构中，修饰胶原的二酸酐带有烯键；该改性胶原的制备包括如下步骤(a)-(d)：
(a)将Ⅰ型胶原溶解于0.1-0.5mol/L的酸溶液中，制备1-10mg/mL的酸溶解型胶原溶液；
(b)将步骤(a)所得酸溶解型胶原溶液使用强碱溶液将稀释后的酸溶解型胶原溶液的pH值调节至7-10，并在0-10℃条件下保存，备用；
(c)将带有烯键的二酸酐溶于丙酮中，获得酸酐溶液，加入步骤(b)调节pH值后的胶原溶液中进行反应，或直接将带有烯键的二酸酐粉末加入到步骤(b)调节pH值后的胶原溶液中进行反应；所述带有烯键的二酸酐包括降冰片烯二酸酐、马来酸酐、(2-甲基-2-丙烯基)琥珀酸酐、烯丙基琥珀酸酐和衣康酸酐中的一种或几种；反应过程中，同时滴加氢氧化钠或三乙胺等使溶液pH维持在7-10，反应温度0～37℃，酸酐和胶原侧链氨基反应形成酰胺键并释放一个自由羧基；
(d)将步骤(c)所得反应产物使用蒸馏水透析，直至胶原在蒸馏水中形成凝胶，再经冻干即得到中性溶解的改性光固化胶原。
第二种：该改性胶原的分子结构中，修饰胶原的二酸酐带有烯键，获得中性溶解能力和固化能力，再引入其他类型的烯键以完成分部固化能力；该改性胶原的制备包括如下步骤(a1)-(d1)：
(a1)将Ⅰ型胶原溶解于0.1-0.5mol/L的酸溶液中，制备1-10mg/mL的酸溶解型胶原溶液；
(b1)将步骤(a)中的酸溶解型胶原溶液使用强碱溶液将稀释后的酸溶解型胶原溶液的pH值调节至7-10，并在0-10℃条件下保存，备用；
(c1)将酸酐溶液或酸酐粉末加入到步骤(b1)中调节pH值后的胶原溶液中进行反应，并在将酸酐溶液或酸酐粉末加入胶原溶液前、加入过程中或加入后将其他带有烯键的分子也加入胶原溶液中进行反应；所述酸酐溶液是将带有烯键的二酸酐溶于丙酮中获得，所述酸酐粉末为带有烯键的二酸酐粉末；所述带有烯键的二酸酐为降冰片烯二酸酐、马来酸酐、(2-甲基-2-丙烯基)琥珀酸酐、烯丙基琥珀酸酐和衣康酸酐中的一种或几种；反应过程中，滴加氢氧化钠或三乙胺等使溶液pH维持在7-10，反应温度0～37℃，加入的带有烯键的二酸酐和胶原侧链氨基反应形成酰胺键并释放一个自由羧基；加入的其他带有烯键的分子使烯键修饰于胶原侧链，所述其他带有烯键的分子为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸N-琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚和烯丙基琥珀酸酐中的一种或几种；完成两种修饰的胶原增加了额外的羧基，并修饰了两种烯键，由于不同烯键在不同反应中的活性和速率不同，此类胶原可能完成分部凝胶；
(d1)将步骤(c1)所得反应产物使用蒸馏水透析，直至胶原在蒸馏水中形成凝胶，再经冻干即得到中性溶解的改性光固化胶原。
第三种：该改性胶原的分子结构中，修饰胶原的二酸酐没有烯键，获得中性溶解能力，再引入烯键以实现固化能力；该改性胶原的制备包括如下步骤(a2)-(d2)：
(a2)将Ⅰ型胶原溶解于0.1-0.5mol/L的酸溶液中，制备1-10mg/mL的酸溶解型胶原溶液；
(b2)将步骤(a2)中的酸溶解型胶原溶液使用强碱溶液将稀释后的酸溶解型胶原溶液的pH值调节至7-10，并在0-10℃条件下保存，备用；
(c2)将酸酐溶液或酸酐粉末加入到步骤(b2)中调节pH值后的胶原溶液中进行反应，并在将酸酐溶液或酸酐粉末加入胶原溶液前、加入过程中或加入后将其他带有烯键的分子也加入胶原溶液中进行反应；所述酸酐溶液是将没有烯键的二酸酐溶于丙酮中获得，所述酸酐粉末为没有烯键的二酸酐粉末；反应过程中滴加氢氧化钠或三乙胺等使溶液pH维持在7-10，反应温度0～37℃；加入的没有烯键的二酸酐和胶原侧链氨基反应形成酰胺键并释放一个自由羧基；加入的其他带有烯键的分子使烯键修饰于胶原侧链，所述其他带有烯键的分子为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸N-琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚和烯丙基琥珀酸酐中的一种或几种；完成两种修饰的胶原增加了额外的羧基，并修饰了烯键；
(d2)将将步骤(c2)所得反应产物使用蒸馏水透析，直至胶原在蒸馏水中形成凝胶，再经冻干即得到中性溶解的改性光固化胶原。
所述胶原蛋白原料为1型，1型胶原为哺乳动物或鱼类等(如鼠尾胶原、牛胶原、猪胶原和人胎盘胶原，包括带有端基和不带有端基的各种胶原蛋白)；所述胶原蛋白原料为酸性溶解，中和后具有自组装性质。
利用上述中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原进行的凝胶的构建方法，包括以下两种方式，第一种方式中添加交联剂和光引发剂，第二种方式则不添加，具体如下：
第一种凝胶的构建方式为：将所述改性胶原通过自组装形成物理凝胶，光作用于凝胶体系中的光引发剂，产生的自由基引发光交联反应得到化学交联的水凝胶。该方法具体包括如下步骤S1-S4：
步骤S1：将改性光固化胶原冻干物溶解于预冷的磷酸盐缓冲液，生理盐水、细胞培养基或动物血清等溶液中，得到浓度为1-100mg/mL的改性胶原溶液，保持4度低温；
步骤S2：在步骤S1所得改性光固化胶原溶液中加入多巯基交联剂和光引发剂，或只加入光引发剂，保持4度低温；
步骤S3：将步骤S2最终所得溶液升温至25-37度，胶原溶液会形成自组装凝胶，其为物理凝胶。
步骤S4：将步骤S3所得凝胶进行光照，光作用于光引发剂产生自由基而引发逐步增长反应或链增长反应，得到强度进一步加强的化学交联的水凝胶。
凝胶的构建过程中，部分烯和巯基反应速率远高于链增长反应，但在自由基和巯基交联剂的存在下，改性胶原纤维优先通过硫醇烯反应交联；所述自由基通过光引发剂和光照产生，所述光引发剂为水溶性，具体所述光引发剂包括紫外光引发剂和可见光引发剂，如苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP)、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Irgacure 2959)、钌吡啶络合物[Ru(II)(bpy)3]2+/硫酸钠(SPS)、曙红Y、核黄素等；。
所述巯基交联剂包含2个以上的自由巯基，其主体包括带有两个或多个巯基的小分子(如二硫苏糖醇)；或者，所述巯基交联剂为经过巯基改性的天然、合成水溶性高分子，具体为带有巯基的聚乙二醇、带有巯基的聚乙烯醇、带有巯基的天然多糖、带有巯基的天然蛋白、带有巯基的合成蛋白和多肽等；或者，所述巯基交联剂为巯基间带有特殊键段的多巯基交联剂；所述带有特殊键段的多巯基交联剂其两端带有自由巯基，巯基间带有一种或多种生物活性位点(如各种酶降解位点)；或者所述带有特殊键段的多巯基交联剂其两端带有自由巯基，巯基间的碳链则由一个或多个动态键连接，所述动态键是在特定条件下可以不断解离并重新形成的共价键类型，具体为腙键、亚胺键或硼酸键等；或者所述带有特殊键段的多巯基交联剂是由一种或几种非共价作用力(如范德华力、π共轭效应、疏水作用、电荷引力、氢键作用)连接巯基间的碳链，所述非共价作用力为各种超分子作用、蛋白质、多肽间相互作用、生物素-亲和素系统、离子键、螯合作用等。
凝胶的构建过程中，改性胶原自组装后的交联反应包括胶原分子内、分子间，胶原纤维内、纤维间的交联反应；改性胶原凝胶体系可以通过胶原浓度、烯取代度、巯基交联剂类型和浓度、引发剂类型和浓度以及光照时间改变最终模量。
凝胶的构建过程中，在自由基的存在下，存在巯基交联剂的情况下，改性胶原自组装后，主要通过硫醇烯反应交联(由于巯基和烯键的比例，硫醇烯反应和自由基链式聚合反应可能会在同一光照过程中先后发生，部分烯键硫醇烯反应速度高于自由基链式聚合反应，因此，硫醇烯反应先发生)；在自由基的存在下，不存在巯基的情况下，改性胶原自组装后，还可以通过自由基链式聚合反应交联(由于不同烯键的聚合效率不同，其凝胶时间和凝胶强度也有不同)；在引发剂和巯基交联剂存在的情况下，胶原分子不经过自组装过程，可以直接通过光照形成胶原分子凝胶，此时发生的主要反应是硫醇烯反应；在引发剂存在的情况下，胶原分子不经过自组装过程，可以直接通过光照形成胶原分子凝胶，此时发生的主要反应是自由基链式聚合反应。
该胶原纤维水凝胶能够固定功能分子，所述功能分子为蛋白质、肽、小分子药物、核酸、碳水化合物或多糖分子等；所述功能分子带有1个或1个以上的反应基团，所述反应基团为自由巯基或/和烯类基团。
该胶原水凝胶可以在自组装后，通过扩散作用、双光子技术、激光或图案化面光等，在凝胶不同的空间位置，固定不同浓度的功能分子。
第二种凝胶的构建方式为：将所述改性胶原直接溶解于中性缓冲液中，升温后自组装形成胶原纤维(物理凝胶)；该方法具体包括如下步骤N1-N4：
步骤N1：在0-10度条件下将改性胶原溶解于中性溶液中；所述中性溶液为磷酸盐缓冲液、生理盐水、细胞培养基或动物血清等；中性溶解的改性胶原能以溶液状态长时间稳定存在；
步骤N2：将中性溶解的改性胶原升温至自组装温度后会发生胶原三股螺旋分子的自组装形成原纤维；自组装温度大于20℃，未改性胶原组装温度则小于10摄氏度；原纤维的特征是具有明暗条带，原纤维可以进一步组装为更大尺度的胶原纤维，胶原纤维的形成和堆积进一步形成胶原纤维水凝胶。
胶原纤维的形成和堆积会引发宏观胶原溶液的凝胶过程；自组装纤维结构是胶原三螺旋分子组装形成的纳米纤维，其孔隙、形貌等可通过离子浓度、组装温度等调控。
当改性胶原不添加任何引发剂和交联剂成分，仍然可以自发的生成自组装凝胶，这种凝胶是物理凝胶。相比于天然胶原，其特点是不需要中和，且组装温度高，低温稳定。
携带细胞或不携带细胞的，不同浓度改性胶原的应用范围包括但不限于组织工程、伤口敷料、给药载体、细胞移植和治疗载体、三维细胞培养基质、生物打印墨水等。胶原中可以包含各种成分如细胞、细胞球、生长因子、药物、纳米颗粒等。
本发明的优点和有益效果如下：
经过本发明改性的胶原蛋白仍然具有自组装能力，并具有低温中性溶解、自组装温度升高的特点。对于改性胶原的交联，硫醇烯反应的交联剂为包含两个或多个巯基的化合物，巯基间可以添加降解位点、超分子作用位点、动态键位点等，以改变纤维凝胶的模量、黏弹性、降解性等生物、物理、化学特征，为胶原纤维凝胶的交联提供全新的可能。
附图说明
图1为天然胶原和实施例1制备的改性胶原的核磁谱图。
图2为天然胶原和实施例1制备的改性胶原的红外吸收谱图。
图3为天然胶原、实施例1制备的改性胶原和明胶的圆二色谱检测结果。
图4为改性胶原进一步构建的水凝胶；其中：(a)直接光交联；(b)升温后自组装；(c)升温自组装再光交联。
图5为改性胶原所构建水凝胶的纤维结构；其中：(a)扫描电镜观察；(b)共聚焦反射模式观察；(c)双光子共聚焦二次谐波直接观察。
图6为实施例1改性胶原和天然胶原的凝胶曲线；其中：(a)天然胶原；(b)改性胶原。
图7为实施例1改性胶原和天然胶原的凝胶曲线；其中：(a)天然胶原；(b)改性胶原。
图8为细胞成活率表征；其中：(a)活细胞；(b)死细胞；(c)拼合。
图9为含细胞的凝胶形态、经鬼笔环肽染色后形态及平滑肌细胞在光固化凝胶中的共聚焦图像；其中：(a)经交联和未交联的凝胶形态；(b)经罗丹明标记的鬼笔环肽染色后光固化胶原中细胞形态；(c)经罗丹明标记的鬼笔环肽染色后天然胶原中细胞形态；(d)平滑肌细胞在光固化凝胶中的共聚焦图像。
图10为凝胶培养人成纤维细胞形貌；其中：(a)降冰片烯EGF；(b)巯基EGF；(c)空白；(d)CCK增殖统计。
图11为细胞成管性能评价；其中：(a)鬼笔环肽；(b)DAPI；(c)拼合。
图12为使用动态交联剂的凝胶过程；其中：(a)动态交联剂的凝胶过程流变情况；(b)凝胶后应力变化。
图13为实施例10中细胞在凝胶中成活率及细胞成管性能；其中：(a)活细胞；(b)死细胞；(c)内皮细胞血管化。
图14为琥珀-甲基丙烯酰化胶原核磁谱图。
图15为降冰片烯-甲基丙烯酰化胶原核磁谱图。
图16为实施例13中高浓度改性胶原剪切变稀特性；其中：(a)胶原剪切变稀流变曲线；(b)打印结构。
图17为实施例14中降冰片烯胶原溶液细胞培养后并经鬼笔环肽染色。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，以下结合实例对本发明进行描述，但实例仅为对本发明的特点和优点做进一步阐述，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明提供一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原，是同时进行羧基和烯键修饰的胶原蛋白，胶原蛋白包含一种或几种烯键，所述烯键在自由基存在下能够发生硫醇烯反应或自由基链式聚合反应。
(1)烯键包括但不限于降冰片烯二酸酐中的烯键、马来酸酐中的烯键，包括但不限于5-降冰片烯-2-基、乙烯基、丙烯基、乙烯基醚、烯丙基醚、烯基、乙烯基等硫醇烯反应活性高的烯键，包括但不限于的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯丙烯酰胺等链增长反应活性较高的烯键。
(2)烯键可以由带有该烯键的二酸酐引入。
(3)烯键可以在引入羧基前、后、中，由其他方式引入胶原侧链，包括同时带有琥珀酰亚胺和烯键的化合物、同时带有异硫氰酸酯和烯键的化合物等、同时带有缩水甘油醚和烯键的化合物等。
胶原蛋白能够中性溶解的原因在于胶原侧链的部分氨基被封闭并引入了额外的羧基，导致胶原蛋白的等电点发生变化。
(1)额外羧基由二酸酐引入，二酸酐和胶原侧链氨基反应后会暴露出一个自由羧基。
(2)二酸酐可以是带有烯键的二酸酐，如降冰片烯二酸酐、马来酸酐和不带有烯键的二酸酐，如琥珀酸酐等。
(3)改性胶原蛋白包括以上一种或几种酸酐引入的羧基。
本发明还提供一种改性胶原交联剂的选择：
1、改性胶原交联剂是带有两个或两个以上自由巯基的小分子、合成高分子或天然高分子，巯基间由共价键连接，如二硫苏糖醇、双巯基聚乙二醇，两侧带有半胱氨酸的合成多肽、巯基修饰的透明质酸等。
2、改性胶原交联剂中的巯基间存在动态共价键连接。此类交联剂可能改变凝胶的松弛时间、自愈性能、黏弹性等，进一步改变其中细胞的行为。例如，巯基间带有腙键、亚胺键、硼酸键等动态键。
3、改性胶原的交联剂带有一个巯基，另一侧带有和氨基反应的基团，如醛基、琥珀酰亚胺酯等。
4、改性胶原交联剂中的巯基间由非共价键产生相互作用。此类交联剂可能改变凝胶的松弛时间、自愈性能、黏弹性等，进一步改变其中细胞的行为。巯基间由一种或几种非共价作用力如范德华力、π共轭效应、疏水作用、电荷引力、氢键作用连接。上述非共价作用力存在但不限于各种超分子作用、蛋白质、多肽间相互作用、生物素-亲和素系统、离子键、螯合作用等。
本发明还提供一种改性胶原凝胶的制备方法：
1、将溶解的改性胶原、光引发剂、巯基交联剂低温混合，升温至溶液形成自组装凝胶，给与一定强度的光照后，凝胶通过硫醇烯反应进一步交联，强度增加。其中，凝胶中可加入各种细胞、活性因子、带有巯基的活性因子等。凝胶中可以添加其他成分。
2、将溶解的改性胶原、光引发剂低温混合，升温至溶液形成自组装凝胶，给与一定强度的光照后，凝胶通过自由基链式聚合反应进一步交联，强度增加。其中，凝胶中可加入各种细胞、活性因子、带有巯基的活性因子等。凝胶中可以添加其他成分。
3、前述1、2中所述两种溶液，可以不经过升温组装的过程，直接低温下光照，即可生成分子凝胶。凝胶中可以添加其他成分。
4、将溶解于D-PBS中的改性胶原直接升温，此时，改性胶原可以同时修饰了羧基和烯键，也可以只修饰羧基而不修饰烯键，生成不经化学交联的天然纤维凝胶。凝胶中可以添加其他成分。
实施例1：
本实施例为降冰片烯胶原的制备，具体如下：
1、酸溶解型胶原溶液的制备：以酶提取的Ⅰ型胶原为原材料，将Ⅰ型胶原加入0.05mol/L的乙酸溶液中，充分溶解后，得到0.3wt％的酸溶解胶原溶液300mL；
2、将酸溶解胶原溶液使用3mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节至9，并在4℃条件下保存，备用；
3、将1.8g降冰片烯二酸酐溶于15mL丙酮中；
4、将酸酐溶液逐滴加入pH值9的胶原溶液中进行反应，同时滴加氢氧化钠溶液使pH维持在9；反应温度4℃。待pH不再变化后，继续搅拌1小时。
5、将所得反应产物使用蒸馏水透析，隔天换水，直至透析袋内胶原形成凝胶。冻干后低温保存。
实施例2：
本实施例为降冰片烯胶原化学表征，具体如下：
1、将天然胶原和实施例1制备的改性胶原溶解于含有0.01mol/L DCl的重水中，检测核磁氢谱。两种胶原核磁谱图如图1所示。
2、将实施例1制备的改性胶原和天然胶原冻干品使用傅里叶红外光谱仪检测中红外波段红外吸收，结果如图2所示，改性胶原仍然存在胶原的红外特征吸收峰。
3、将实施例1降冰片烯胶原、天然胶原和明胶分别溶解于0.01mol/L的HCl水溶液中，充分溶解后，进行圆二色谱检测，如图3所示，220nm处吸收峰表明改性胶原保留了胶原分子的三螺旋结构。
实施例3：
本实施例为降冰片烯胶原凝胶构建，具体过程如下：
1、将实施例1制备的改性胶原冻干物溶解于低温中性的D-PBS中，储存液浓度为0.6wt％，改性胶原可缓慢溶解。
2、将胶原蛋白溶液加入0.025wt％的光引发剂LAP，加入分子量1000的HS-PEG-SH双巯基交联剂1mmol/L和低温D-PBS，胶原终浓度为0.4wt％，后续光引发剂和交联剂沿用此浓度。将混合后的胶原蛋白溶液置于模具中。
3、直接光照，即可得到透明的、由三螺旋胶原分子直接光交联的凝胶，如图4(a)。
4、放入温度为37℃的培养箱中，10分钟后，取出模具，即可制得由胶原纤维自组装形成的水凝胶，如图4(b)。
5、放入温度为37℃的培养箱中，10分钟后，取出模具，以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，即可制得内含胶原纤维并经光交联的水凝胶，如图4(c)。
6、将水凝胶固定后冻干喷金，使用扫描电镜观察凝胶内的纤维结构，结果如图5(a)。使用共聚焦反射模式和双光子共聚焦二次谐波直接观察含水凝胶的纤维结构，结果如图5(b)和图5(c)。
实施例4：
本实施例为降冰片烯胶原的流变学特性表征，具体如下：
1、确定实施例1降冰片烯胶原的凝胶温度，分别将0.4wt％的降冰片烯胶原和中和后的天然胶原置于流变仪底板，夹具下降后，以0.2摄氏度/分钟的速度升温，并设置形变为5％，频率为1Hz。天然胶原的凝胶曲线如图6(a)所示，改性胶原凝胶曲线如图6(b)所示。改性胶原的自组装温度提高至24摄氏度。
2、确定降冰片烯胶原两次凝胶模量，分别将0.4wt％天然中和胶原和0.4wt％含有光引发剂和交联剂的降冰片烯胶原置于流变仪平板，夹具下降后，底板迅速升温至37摄氏度，完全凝胶后，以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，天然胶原凝胶曲线如图7(a)所示，仅有一次自组装凝胶过程。光固化胶原自组装后，还能发生一次光固化凝胶，如图7(b)。
实施例5：
本实施例为细胞在降冰片烯胶原凝胶的成活率，具体如下：
人成纤维细胞消化后，以5×105/mL浓度加入含有光引发剂和交联剂的0.4wt％浓度的降冰片烯胶原溶液，将所得混合液加入48孔板后，置入37摄氏度二氧化碳培养箱中。10分钟后，以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，加入培养基放回培养箱中。1天后，使用D-PBS清洗凝胶，使用死活染色试剂盒表征细胞成活率，如图8所示。经统计，细胞成活率大于95％。
实施例6：
本实施例为含细胞的降冰片烯胶原凝胶的结构稳定性：
人平滑肌细胞消化后，以5×105/mL浓度分别加入0.4wt％浓度的天然中和牛胶原和0.4wt％含有光引发剂和交联剂的降冰片烯胶原，将上述两种混合液加入48孔板后，分别置入37摄氏度二氧化碳培养箱中。10分钟后，光交联组以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，加入培养基放回培养箱中。天然胶原组直接添加培养基。连续培养14天，每两天换液。使用罗丹明标记的鬼笔环肽染色凝胶中的细胞骨架，评价两种细胞伸展性能。经交联的凝胶维持了初始形状，但未交联的凝胶则皱缩严重，如图9(a)所示。经罗丹明标记的鬼笔环肽染色后，光固化胶原中细胞伸展良好，天然胶原则皱缩成团，如图9(b)-(c)所示。图9(d)展示了平滑肌细胞在光固化凝胶中的共聚焦图像。
实施例7：
本实施例为生长因子在降冰片烯胶原中的固定：
使用功能化的生长因子直接混合于胶原溶液中，可以实现生长因子的固定。将巯基化和降冰片烯修饰的人表皮生长因子EGF加入含有光引发剂和巯基交联剂的胶原预凝胶中，终浓度100ng/mL，培养人成纤维细胞。设置对照组，在第一天的培养基中含有100ng/mL的EGF，第二天则换为普通培养基。7天后，染色观察细胞形貌，相比于对照组，巯基化和降冰片烯修饰生长因子组细胞伸展更加明显，如图10(a)-(c)所示。使用细胞增殖试剂盒表征细胞量，结果如图10(d)所示，巯基化和降冰片烯修饰生长因子组细胞活力高于对照组。
实施例8：
本实施例为巯基降解多肽交联纤维凝胶中内皮细胞的成管：
使用加入金属蛋白酶降解合成多肽CGPQGIWGQC作为凝胶交联剂，人脐静脉内皮细胞消化后，以4×106/mL浓度加入0.4wt％含有光引发剂和4mM多肽交联剂的降冰片烯胶原，将上述混合液加入48孔板后，置入37摄氏度二氧化碳培养箱中。10分钟后，以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，加入培养基放回培养箱中。连续培养14天，每两天换液。使用罗丹明标记的鬼笔环肽和DAPI染色凝胶中的细胞骨架和细胞核，评价细胞成管性能。如图11(a)-(c)所示，内皮细胞在光固化凝胶中能够形成血管网络。
实施例9：
本实施例为动态交联剂的使用方法：
使用巯基-聚乙二醇-酰肼(分子量1000Da)和巯基-聚乙二醇-醛基(分子量1000Da)，构建动态交联剂。将两种聚乙二醇衍生物混合，室温反应2小时，替代双巯基聚乙二醇，并加入0.4wt％改性胶原，动态交联剂终浓度为2mM，光引发剂LAP终浓度为0.025wt％。将上述混合液置于4摄氏度流变仪底板，夹具就位后升温至37度，模量稳定后，以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，检测动态交联剂的凝胶过程，其流变结果如图12(a)所示，通过升温和光照能够引发两次凝胶反应。凝胶后，设置形变值为10％，检测应力变化，即应力松弛过程，结果如图12(b)，800秒内，应力降为50％左右，该现象由动态交联剂所致。
实施例10：
动态交联纤维凝胶的细胞成活率和细胞伸展
使用巯基-聚乙二醇-酰肼。巯基-聚乙二醇-醛基，构建动态交联剂。将两种聚乙二醇衍生物混合，替代双巯基聚乙二醇，并加入浓度0.4wt％改性胶原溶液中，动态交联剂终浓度为2mM，光引发剂LAP终浓度为0.025wt％，人成纤维细胞和人脐静脉内皮浓度分别为5×105/mL和4×106/mL。将上述混合液加入48孔板后，置入37摄氏度二氧化碳培养箱中。10分钟后，以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，加入培养基放回培养箱中。1天和7天后，将含有人成纤维细胞的凝胶使用死活染色试剂盒评价细胞在凝胶中的成活率，结果如图13(a)-(b)，几乎没有死细胞被显示出。将含有人脐静脉内皮细胞的凝胶连续培养14天，每两天换液。使用罗丹明标记的鬼笔环肽染色凝胶中的细胞骨架，评价细胞成管性能。如图13(c)，内皮细胞在动态交联的凝胶中形成血管网。
实施例11：
本实施例为琥珀-甲基丙烯酰化胶原及其凝胶的制备：
(1)酸溶解型胶原溶液的制备：以提取的Ⅰ型胶原为原材料，将Ⅰ型胶原加入0.05mol/L的乙酸溶液中，充分溶解后，得到3mg/mL的酸溶解型胶原溶液300mL；
(2)将酸溶解胶原溶液使用3mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节至9，并在4℃条件下保存，备用；
(3)将0.4g甲基丙烯酸酐溶于7mL丙酮中；
(4)将1g琥珀酸酐溶解于7mL丙酮中；
(5)将甲基丙烯酸酐溶液逐滴加入pH值9的胶原溶液中进行反应，同时滴加氢氧化钠溶液使pH维持在9；反应温度4℃。待pH不再变化后，继续加入琥珀酸酐溶液，同时滴加氢氧化钠溶液使pH维持在9，继续搅拌1小时。
(6)将所得反应产物使用蒸馏水透析，隔天换水，直至透析袋内胶原形成凝胶。冻干后低温保存。琥珀-甲基丙烯酰化胶原核磁谱图如图14。
(7)冻干胶原溶解于D-PBS中，将胶原蛋白溶液加入0.025wt％的光引发剂LAP胶原终浓度为0.4wt％。将上述混合液加入48孔板后，置入37摄氏度二氧化碳培养箱中。10分钟后，以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，即可制成由烯键经自由基链式聚合反应交联的纤维凝胶。
实施例12：
本实施例为降冰片烯-甲基丙烯酰化胶原及其凝胶的制备：
(1)酸溶解型胶原溶液的制备：以提取的Ⅰ型胶原为原材料，将Ⅰ型胶原加入0.05mol/L的乙酸溶液中，充分溶解后，得到3mg/mL的酸溶解型胶原溶液300mL；
(2)将酸溶解的胶原溶液使用3mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调节至9，并在4℃条件下保存，备用；
(3)将0.4g甲基丙烯酸酐溶于7mL丙酮中；
(4)将1g降冰片烯二酸酐溶解于7mL丙酮中；
(5)将甲基丙烯酸酐溶液逐滴加入pH值9的胶原溶液中进行反应，同时滴加氢氧化钠溶液使pH维持在9；反应温度4℃。待pH不再变化后，继续加入降冰片烯二酸酐溶液，同时滴加氢氧化钠溶液使pH维持在9，继续搅拌1小时。
(6)将所得反应产物使用蒸馏水透析，隔天换水，直至透析袋内胶原形成凝胶。冻干后低温保存。降冰片烯-甲基丙烯酰化胶原核磁谱图如图15所示。
(7)冻干胶原溶解于D-PBS中，将胶原蛋白溶液加入巯基化表皮生长因子EGF100ng/mL。胶原终浓度为0.4wt％。将上述混合液加入48孔板后，置入37摄氏度二氧化碳培养箱中。10分钟后，胶原溶液形成自组装凝胶，且巯基生长因子通过迈克尔加成反应修饰于胶原蛋白上。将上述凝胶浸泡在含有0.025wt％的光引发剂LAP和1mM双巯基聚乙二醇，10分钟后以5mW/cm2，波长为365nm的光照辐射30s，即可交联纤维凝胶。
实施例13：
本实施例为高浓度胶原挤出式打印：
高浓度改性胶原具有剪切变稀的特性，适合挤出式3D打印。将降冰片烯胶原溶解于D-PBS，终浓度为5wt％，离心除泡后，使用流变仪测量胶原的流变性能，其剪切变稀流变曲线如图16(a)。利用不同浓度改性胶原可以实现纯胶原的载细胞复合打印。使用上述5wt％胶原溶液作为支撑材料，使用0.6wt％胶原作为细胞载体，细胞为成纤维细胞，浓度为5×105/mL，两种胶原中均存在光引发剂和双巯基交联剂，打印结构如图16(b)。
实施例14：
本实施例为含细胞降冰片烯胶原自组装凝胶制备：
人脐静脉内皮细胞消化后，以4×106/mL浓度加入0.4wt％不含巯基交联剂和光引发剂的降冰片烯胶原PBS溶液中，将上述混合液加入48孔板后，置入37摄氏度二氧化碳培养箱中。10分钟后，加入培养基放回培养箱中。连续培养14天，每两天换液。此时，降冰片烯胶原可以代替天然胶原使用。培养14天后，使用鬼笔环肽染色，细胞形成微管道，如图17所示。
Claims (5)
1.一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原，其特征在于：该改性胶原选自以下三种分子结构中的任意一种：
该改性胶原的第一种分子结构为：修饰胶原的二酸酐带有烯键；该改性胶原的制备包括如下步骤（a）-（d）：
（a）将Ⅰ型胶原溶解于0.1-0.5mol/L的酸溶液中，制备1-10mg/mL的酸溶解型胶原溶液；
（b）将步骤（a）所得酸溶解型胶原溶液使用强碱溶液将稀释后的酸溶解型胶原溶液的pH值调节至7-10，并在0-10℃条件下保存，备用；
（c）将带有烯键的二酸酐溶于丙酮中，获得酸酐溶液，加入步骤（b）调节pH值后的胶原溶液中进行反应，或直接将带有烯键的二酸酐粉末加入到步骤（b）调节pH值后的胶原溶液中进行反应；所述带有烯键的二酸酐包括降冰片烯二酸酐、马来酸酐、(2-甲基-2-丙烯基)琥珀酸酐、烯丙基琥珀酸酐和衣康酸酐中的一种或几种；反应过程中，同时滴加氢氧化钠或三乙胺使溶液pH维持在7-10，反应温度0~37℃，酸酐和胶原侧链氨基反应形成酰胺键并释放一个自由羧基；
（d）将步骤（c）所得反应产物使用蒸馏水透析，直至胶原在蒸馏水中形成凝胶，再经冻干即得到中性溶解的改性光固化胶原；
该改性胶原的第二种分子结构为：修饰胶原的二酸酐带有烯键，获得中性溶解能力和固化能力，同时引入其他类型的烯键以完成分步固化能力；该改性胶原的制备包括如下步骤（a1）-（d1）：
（a1）将Ⅰ型胶原溶解于0.1-0.5mol/L的酸溶液中，制备1-10mg/mL的酸溶解型胶原溶液；
（b1）将步骤（a）中的酸溶解型胶原溶液使用强碱溶液将稀释后的酸溶解型胶原溶液的pH值调节至7-10，并在0-10℃条件下保存，备用；
（c1）将酸酐溶液或酸酐粉末加入到步骤（b1）中调节pH值后的胶原溶液中进行反应，并在将酸酐溶液或酸酐粉末加入胶原溶液前、加入过程中或加入后将其他带有烯键的分子也加入胶原溶液中进行反应；所述酸酐溶液是将带有烯键的二酸酐溶于丙酮中获得，所述酸酐粉末为带有烯键的二酸酐粉末；所述带有烯键的二酸酐为降冰片烯二酸酐、马来酸酐、(2-甲基-2-丙烯基)琥珀酸酐、烯丙基琥珀酸酐和衣康酸酐中的一种或几种；反应过程中，滴加氢氧化钠或三乙胺使溶液pH维持在7-10，反应温度0~37℃，加入的带有烯键的二酸酐和胶原侧链氨基反应形成酰胺键并释放一个自由羧基；加入的其他带有烯键的分子使烯键修饰于胶原侧链，所述其他带有烯键的分子为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸 N-琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚和烯丙基琥珀酸酐中的一种或几种；完成两种修饰的胶原增加了额外的羧基，并修饰了两种烯键，由于不同烯键在不同反应中的活性和速率不同，从而完成分步凝胶；
（d1）将步骤（c1）所得反应产物使用蒸馏水透析，直至胶原在蒸馏水中形成凝胶，再经冻干即得到中性溶解的改性光固化胶原；
该改性胶原的第三种分子结构为：修饰胶原的二酸酐没有烯键，获得中性溶解能力，再引入烯键以实现固化能力；该改性胶原的制备包括如下步骤（a2）-（d2）：
（a2）将Ⅰ型胶原溶解于0.1-0.5mol/L的酸溶液中，制备1-10mg/mL的酸溶解型胶原溶液；
（b2）将步骤（a2）中的酸溶解型胶原溶液使用强碱溶液将稀释后的酸溶解型胶原溶液的pH值调节至7-10，并在0-10℃条件下保存，备用；
（c2）将酸酐溶液或酸酐粉末加入到步骤（b2）中调节pH值后的胶原溶液中进行反应，并在将酸酐溶液或酸酐粉末加入胶原溶液前、加入过程中或加入后将其他带有烯键的分子也加入胶原溶液中进行反应；所述酸酐溶液是将没有烯键的二酸酐溶于丙酮中获得，所述酸酐粉末为没有烯键的二酸酐粉末；所述没有烯键的二酸酐为琥珀酸酐，反应过程中滴加氢氧化钠或三乙胺使溶液pH维持在7-10，反应温度0~37℃；加入的没有烯键的二酸酐和胶原侧链氨基反应形成酰胺键并释放一个自由羧基；加入的其他带有烯键的分子使烯键修饰于胶原侧链，所述其他带有烯键的分子为甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸 N-琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚和烯丙基琥珀酸酐中的一种或几种；完成两种修饰的胶原增加了额外的羧基，并修饰了烯键；
（d2）将步骤（c2）所得反应产物使用蒸馏水透析，直至胶原在蒸馏水中形成凝胶，再经冻干即得到中性溶解的改性光固化胶原。
2.利用权利要求1所述的中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原进行的凝胶的构建方法，其特征在于：将所述改性胶原通过自组装形成物理凝胶，光作用于凝胶体系中的光引发剂，产生的自由基引发光交联反应得到化学交联的水凝胶；所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、钌吡啶络合物[Ru(II)(bpy)3]2+/硫酸钠、曙红Y或核黄素；该方法具体包括如下步骤S1-S4：
步骤S1：将改性光固化胶原冻干物溶解于中性预冷的磷酸盐缓冲液，生理盐水、细胞培养基或动物血清溶液中，得到浓度为1-100mg/mL的改性胶原溶液，保持4℃低温；
步骤S2：在步骤S1所得改性光固化胶原溶液中加入多巯基交联剂和光引发剂，或只加入光引发剂，或不添加多巯基交联剂和引发剂，保持4℃低温；
步骤S3：将步骤S2最终所得溶液升温至25-37℃，胶原溶液会形成自组装凝胶，其为物理凝胶；相比于天然胶原，其特点是不需要中和，且组装温度高，低温稳定，这种物理凝胶也能不经光交联直接使用；
步骤S4：将步骤S3所得凝胶进行光照，光作用于光引发剂产生自由基而引发逐步增长反应或链增长反应，得到强度进一步加强的化学交联的水凝胶。
3.利用权利要求2所述的凝胶的构建方法，其特征在于：凝胶固定功能分子，所述功能分子为蛋白质、肽、小分子药物、核酸或多糖分子；所述功能分子带有1个或1个以上的反应基团，所述反应基团为自由巯基或/和烯类基团；胶原水凝胶在自组装后，通过扩散作用、双光子技术、激光或图案化面光，在凝胶不同的空间位置，固定不同浓度的功能分子。
4.利用权利要求2所述的凝胶的构建方法，其特征在于：所述多巯基交联剂包含2个以上的自由巯基，其主体包括带有两个或多个巯基的小分子；或者，所述多巯基交联剂为经过巯基改性的天然、合成水溶性高分子，具体为带有巯基的聚乙二醇、带有巯基的聚乙烯醇、带有巯基的天然多糖、带有巯基的天然蛋白、带有巯基的合成蛋白和多肽；或者，所述多巯基交联剂为巯基间带有特殊键段的多巯基交联剂；所述带有特殊键段的多巯基交联剂其两端带有自由巯基，巯基间带有一种或多种生物活性位点；或者所述带有特殊键段的多巯基交联剂其两端带有自由巯基，巯基间的碳链则由一个或多个动态键连接，所述动态键是在特定条件下能不断解离并重新形成的共价键类型；或者所述带有特殊键段的多巯基交联剂是由一种或几种非共价作用力连接巯基间的碳链，所述非共价作用力为各种超分子作用、蛋白质间相互作用、多肽间相互作用、生物素-亲和素系统、离子键、螯合作用。
5.根据权利要求2所述的凝胶的构建方法，其特征在于：所述凝胶的应用范围为组织工程、伤口敷料、给药载体、细胞移植和治疗载体、三维细胞培养基质、生物打印墨水。
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