CN116515304B - 一种仿生细胞膜及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例提供一种仿生细胞膜及其制备方法、用途。该仿生细胞膜包括膜骨架和膜蛋白；所述膜骨架的至少一部分由膜骨架分子和交联剂聚合形成，所述膜蛋白锁定在由所述膜骨架分子和所述交联剂形成的所述膜骨架中。与现有技术相比，本申请具有如下的有益效果的至少之一：通过光化学反应在选定的时间和区域锁定仿生细胞膜的结构，调控膜蛋白的生理活性，维持膜蛋白的正常功能，提供高机械强度的仿生细胞膜，准确控制自组装入仿生细胞膜的膜蛋白的种类和数量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种仿生细胞膜及其制备方法、用途。
背景技术
仿生细胞膜一般由两亲的有机单分子自组装形成。参与自组装的有机单分子在膜内的流动性为膜蛋白的嵌入组装提供了活性，但也导致了膜蛋白嵌入的种类、数量不可控，使得构建的功能化仿生细胞膜质量低。为了调控膜蛋白自组装，通常通过调整溶液中膜蛋白分子的数量，利用分子动力学来调控膜蛋白自组装的概率，然而该方法仍不能准确控制膜蛋白自组装的数量。此外，使用传统饱和磷脂分子构建的仿生细胞膜缺乏骨架结构，难以重现细胞膜在复杂工况条件下的高机械强度，以及在恶劣环境下的稳定性。
因此，目前仿生细胞膜及其制备方法仍有待改进。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种仿生细胞膜及其制备方法、用途，以解决上述背景技术中提出的问题。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种仿生细胞膜，其包括：膜骨架和膜蛋白；所述膜骨架的至少一部分由膜骨架分子和交联剂聚合形成，所述膜蛋白锁定在由所述膜骨架分子和所述交联剂形成的所述膜骨架中。
进一步地，所述膜蛋白选自孔蛋白、离子选择性蛋白、转运蛋白以及功能性膜蛋白复合体中的至少之一。
进一步地，所述膜骨架分子选自具有C=C键的不饱和磷脂和不饱和两亲性嵌段聚合物中的至少之一。
进一步地，所述不饱和两亲性嵌段聚合物包括不饱和双嵌段两亲聚合物和不饱和三嵌段两亲聚合物中的至少之一。
进一步地，所述不饱和两亲性嵌段聚合物包括亲水段以及疏水段；所述亲水段包括-CH2-CH2-O-重复片段；所述疏水段包括-CH2-CH=CH-CH2-或-CH2-CH(CH=CH2)-重复片段。
进一步地，所述亲水段包括聚环氧乙烷、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸盐中的至少之一。
进一步地，所述疏水段优选地包括聚环氧丙烷、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚丁二烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸甲酯和聚丙烯酸丁酯中的至少之一。
进一步地，所述疏水段更优选地包括聚丁二烯。
进一步地，所述不饱和两亲性嵌段聚合物包括所述亲水段为聚环氧乙烷且所述疏水段为聚丁二烯的双嵌段两亲聚合物，以及所述亲水段为聚丙烯酸且所述疏水段为聚丁二烯的双嵌段两亲聚合物。
进一步地，所述交联剂上含有巯基，并且所述交联剂上的巯基数不小于2。
进一步地，所述交联剂上的巯基数与所述膜骨架分子上的C=C键数的比值不大于1。
进一步地，所述交联剂上的巯基数与所述膜骨架分子上的C=C键数的比值优选地为0.25~0.5。
进一步地，所述交联剂具有如下式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ中的至少之一所示的结构：
更进一步地，所述交联剂优选地具有式Ⅰ所示的结构。
进一步地，所述交联剂选自1,2-乙二硫醇、1,3-丙二硫醇、1,4-丁二硫醇、1,5-戊二硫醇、1,6-己二硫醇、1,7-庚二硫醇、1,8-辛二硫醇、1,9-壬二硫醇、1,10-癸二硫醇、1,11-十一烷二硫醇、1,12-十二烷二硫醇、1,13-十三烷二硫醇、1,14-十四烷二硫醇、1,15-十五烷二硫醇、1,16-十六烷二硫醇以及其异构体中的至少之一。
进一步地，所述交联剂优选地选自1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇、1,6-己二硫醇、1,8-辛二硫醇、1,10-癸二硫醇以及其异构体中的至少之一。
进一步地，所述交联剂更优选地选自1,4-丁二硫醇、1,6-己二硫醇以及其异构体中的至少之一。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备上述仿生细胞膜的方法，该方法包括：将所述膜蛋白、所述膜骨架分子、所述交联剂以及添加剂混合；在光照条件下使所得混合物发生光化学反应，以令所述膜骨架分子和所述交联剂聚合形成所述膜骨架，并将所述膜蛋白锁定在所述膜骨架中。
进一步地，所述添加剂选自光催化剂、光引发剂以及光活化碱中的至少一种。
进一步地，所述光引发剂具有如下式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ和式Ⅶ中的至少之一所示的结构：
其中R1选自H、CH3、C2H5或者CH(CH3)2；R2选自C2H5、CH(CH3)2或者CH(CH3)2C2H5。
进一步地，所述光化学反应是所述膜骨架分子上的C=C键与所述交联剂上的巯基在添加剂和光照的条件下发生的，并且所述光照条件包括UV照射。
进一步地，本发明提供了上述仿生细胞膜或者利用上述方法制备的仿生细胞膜在生物医药领域中的用途。
更进一步地，本发明提供了上述仿生细胞膜或者利用上述方法制备的仿生细胞膜在药物递送、单细胞分析以及单分子分析中的用途。
本发明具有以下有益效果中的至少之一：
1、本发明的仿生细胞膜具有共价交联的膜骨架结构，机械强度高；
2、本发明的制备仿生细胞膜的方法，通过光化学反应在选定的时间和区域锁定仿生细胞膜的结构，调控膜蛋白的生理活性，维持膜蛋白的正常功能，阻断外部膜蛋白的进一步嵌入；
3、本发明的制备仿生细胞膜的方法，能够准确控制自组装入仿生细胞膜的膜蛋白的种类和数量。
上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本申请进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。
附图说明
在附图中，除非另外规定，否则贯穿多个附图相同的附图标记表示相同或相似的部件或元素。这些附图不一定是按照比例绘制的。应该理解，这些附图仅描绘了根据本申请公开的一些实施方式，而不应将其视为是对本申请范围的限制。
图1为制备本发明的仿生细胞膜的方法流程图；
图2为本发明实施例1的膜骨架分子的脂滴表征结果图；
图3为本发明实施例1的膜骨架分子的脂滴聚合情况图；
图4为本发明实施例1的膜骨架分子的脂滴耐受情况图；
图5为本发明实施例1的膜蛋白自组装电生理活性检测图；
图6为本发明实施例2的膜骨架分子的脂滴表征结果图；
图7为本发明实施例2的膜骨架分子的脂滴聚合情况图；
图8为本发明实施例2的膜骨架分子的脂滴耐受情况图；
图9为本发明实施例2的仿生细胞膜电生理活性检测图；
图10为本发明实施例3的仿生细胞膜电生理活性检测图；
图11为本发明对比例1的膜骨架分子的脂滴表征结果图；
图12为本发明对比例1的仿生细胞膜电生理活性检测图；
图13为本发明对比例2的仿生细胞膜电生理活性检测图；
图14为本发明对比例3的仿生细胞膜电生理活性检测图。
具体实施方式
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本申请的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种仿生细胞膜。该仿生细胞膜包括膜骨架和膜蛋白，其中膜骨架的至少一部分是由膜骨架分子和交联剂聚合形成的，并且在膜骨架分子与交联剂发生聚合的过程中，膜蛋白被锁定在聚合形成的膜骨架中。该仿生细胞膜至少具有如下的有益效果：具有共价交联的膜骨架结构，机械强度高。
根据本发明的实施例，仿生细胞膜中膜蛋白的种类和数量不受特别的限制，具体而言，可以根据期望仿生细胞膜的功能对膜蛋白进行选择，例如膜蛋白可以选自孔蛋白、离子选择性蛋白、转运蛋白以及功能性膜蛋白复合体中的至少之一。例如，膜蛋白可以选自Toxin(例如MspA和aHL)，外膜蛋白、孔道蛋白、核苷转运蛋白(例如OmpF、OmpC、LamB、OmpA、OmpG、Tsx等)，离子通道蛋白(例如Nav1.1、Nav1.2、Nav 1.3、Nav1.7、Nav1.8、VDAC等)，离子转运复合体(例如AcrAB-TolC)等。
根据本发明的实施例，膜骨架用于提供仿生细胞膜的骨架结构，其包括膜骨架分子和交联剂。其中膜骨架分子为可以进行交联反应的两亲分子，例如可以为具有不饱和键(例如，C=C键)的两亲分子。具体而言，膜骨架分子可以选自具有C=C键的不饱和磷脂和不饱和两亲性嵌段聚合物，并且优选地为不饱和两亲性嵌段聚合物。其中不饱和两亲性嵌段聚合物可以为不饱和双嵌段两亲聚合物和不饱和三嵌段两亲聚合物，其具有包括-CH2-CH2-O-重复片段的亲水段以及包括-CH2-CH=CH-CH2-或-CH2-CH(CH=CH2)-重复片段的疏水段。
根据本发明的实施例，具有C=C键的不饱和磷脂包括18:1(11-顺式)磷脂酰胆碱、14:1(Δ9-顺式)磷脂酰胆碱、16:1磷脂酰乙醇胺、18:2磷脂酰乙醇胺和18:3磷脂酰乙醇胺，其具体结构如下表1所示。此外，不饱和嵌段两亲聚合物的亲水段可以为选自聚环氧乙烷(EO)、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸(AA)和聚苯乙烯磺酸盐中的至少一种。不饱和嵌段两亲聚合物的疏水段可以为选自聚环氧丙烷、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚丁二烯(Bd)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸甲酯和聚丙烯酸丁酯中的至少一种，并且优选地为聚丁二烯。在具体实施方式中，不饱和两亲性嵌段聚合物优选地包括所述亲水段为聚环氧乙烷且所述疏水段为聚丁二烯的双嵌段两亲聚合物(Bd-EO)，以及所述亲水段为聚丙烯酸且所述疏水段为聚丁二烯的双嵌段两亲聚合物(Bd-AA)。
根据本发明的实施例，交联剂上含有可与膜骨架分子上的C=C键发生聚合反应的巯基，并且交联剂上的巯基数不小于2。具体而言，交联剂可具有如下式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ中的至少之一所示的结构，并且优选地具有式Ⅰ所示的结构。在具体实施方式中，交联剂可选自1,2-乙二硫醇、1,3-丙二硫醇、1,4-丁二硫醇、1,5-戊二硫醇、1,6-己二硫醇、1,7-庚二硫醇、1,8-辛二硫醇、1,9-壬二硫醇、1,10-癸二硫醇、1,11-十一烷二硫醇、1,12-十二烷二硫醇、1,13-十三烷二硫醇、1,14-十四烷二硫醇、1,15-十五烷二硫醇、1,16-十六烷二硫醇以及其异构体中的至少之一。优选地，交联剂选自1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇、1,6-己二硫醇、1,8-辛二硫醇、1,10-癸二硫醇以及其异构体中的至少之一。更优选地，交联剂选自1,4-丁二硫醇、1,6-己二硫醇以及其异构体中的至少之一。
在添加剂存在以及光照条件下，上述膜骨架分子上的C=C键与上述交联剂上的巯基形成共价键，令膜骨架分子与交联剂发生聚合反应，共价交联形成稳定的膜骨架结构。由此，发生聚合反应后形成的膜骨架具有更高的机械强度。特别是两亲性嵌段聚合物，由于其C=C键数目更多，结构更加稳定。相对于磷脂双分子而言，两亲性嵌段聚合物主链形成的膜骨架机械强度更高。此外，在聚合反应发生的同时，膜蛋白被锁定在由膜骨架分子和交联剂共价交联形成的膜骨架中，并且膜蛋白的锁定位点与选取的膜骨架分子和交联剂的种类相关且不受特别的限制，具体地，膜蛋白的锁定位点可以靠近或远离膜骨架分子的C=C键的位置。此外，在具体实施方式中，交联剂上的巯基数与膜骨架分子上的C=C键数的比值不大于1，优选地比值为0.25~0.5，例如0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5。
根据本发明的实施例，膜骨架分子与交联剂发生的化学反应式可以如下式Ⅷ和式Ⅸ所示。
其中x、y、a、b、m、n分别独立地为大于等于0的整数，并且满足下式：
1. ⅓(x+y+1)×(Bd单体分子量)=Bd聚合后平均分子量；
2. ⅓(m+n+1)×(Bd单体分子量)=Bd聚合后平均分子量；
本申请中Bd聚合后平均分子量为600左右。具体地，可为600±10范围内，或600±15、600±20、600±25范围内等。
根据本发明的实施例，该仿生细胞膜可用于生物医药领域，例如可用于包括但不限于药物递送、单细胞分析以及单分子分析。在具体实施方式中，根据组装入膜骨架中的膜蛋白的种类的不同，可获得具有不同用途的仿生细胞膜。例如，可分析膜蛋白与目标分子的作用关系，可包裹纳米颗粒实现药物递送等。
此外，应当注意的是，在选取的膜蛋白的种类不同的情况下，所得仿生细胞膜的电生理活性会受到交联剂种类的影响。即同一交联剂形成的膜骨架中不同膜蛋白的自组装活性不一定相同。
在本发明的另一方面，本发明提供了制备上述仿生细胞膜的方法。参考图1，该方法包括：将膜蛋白、膜骨架分子、交联剂以及添加剂混合；在光照条件下使所得混合物发生光化学反应，以令膜骨架分子和交联剂聚合形成膜骨架，并将膜蛋白锁定在膜骨架中。具体而言，该方法利用光化学反应将膜蛋白锁定在聚合形成的膜骨架中，以形成仿生细胞膜。该方法至少具有如下的有益效果：通过光化学反应在选定的时间和区域锁定仿生细胞膜的结构，调控膜蛋白的生理活性，维持膜蛋白的正常功能，提供高机械强度的仿生细胞膜，准确控制自组装入仿生细胞膜的膜蛋白的种类和数量。
为了方便理解，下面首先对该方法能够实现上述有益效果的原理进行简单说明：
本发明利用光化学反应来形成仿生细胞膜，光化学反应通过光照在温和的条件下即可促使反应发生，在进行光化学反应时，不需要对反应物进行基团保护，并且迅速在反应物间形成稳定的共价键。现有技术形成的仿生细胞膜的分子间作用力为亲疏水作用，本发明制备的仿生细胞膜的膜骨架分子间共价交联，更加稳定。
关于膜蛋白的种类、膜骨架分子的种类以及交联剂的种类，前面已经进行了详细的描述，在此不再赘述。
根据本发明的实施例，交联剂可以选自1,2-乙二硫醇、1,4-丁二硫醇、1,6-己二硫醇、1,8-辛二硫醇或者1,10-癸二硫醇，膜骨架分子可以为双嵌段两亲聚合物Bd-EO或者Bd-AA。例如，在具体实施方式中，在添加剂和光照条件下，交联剂上的巯基可以与Bd-EO或者Bd-AA上的C=C键发生交联，形成稳定的膜骨架。
在具体实施方式中，光照条件包括UV照射，并且UV照射包括使用300-400 nm波长的光进行照射，优选地使用365 nm波长的光；并且照射时间可以为多于3 s，优选地照射时间为3-8 s，例如3 s、3.5 s、4 s、4.5 s、5 s、5.5 s、6 s、6.5 s、7 s、7.5 s以及8 s。
根据本发明的实施例，促进光化学反应发生的添加剂选自光催化剂、光引发剂以及光活化碱中的至少一种，具体而言，可以根据选取的交联剂和膜骨架分子的种类来选择促使反应发生的添加剂。并且当添加剂为光引发剂时，其可以具有如下式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ和式Ⅶ中的至少之一所示的结构，在式Ⅳ和式Ⅵ中，R1选自H、CH3、C2H5或者CH(CH3)2，R2选自C2H5、CH(CH3)2或者CH(CH3)2C2H5。例如，光引发剂可以为具有式Ⅴ所示的结构的1-羟环己基苯酮。
根据本发明的实施例，用于发生光化学反应的膜骨架分子、交联剂以及添加剂的比例不受特别的限制，具体而言，可以根据所选用的膜蛋白种类、期望膜蛋白的含量、膜骨架分子种类、交联剂种类、交联剂上的巯基数与膜骨架分子上的C=C键数的比值、或者所选用的添加剂等适当的改变其比例关系。例如，膜骨架分子、交联剂以及添加剂的质量比可以为（1-5)：(0.4-1)：(0.1-0.2)。
实施例及对比例
下述实施例及对比例为以两亲性嵌段聚合物以及饱和磷脂作为膜骨架分子制备仿生细胞膜的示例性实施例，其中使用的膜蛋白均为大肠杆菌体系表达的MspA蛋白。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂，所用试剂及其货号信息如下表2所示。
实施例1：
本实施例中的膜骨架分子为由polymer source inc.提供的双嵌段两亲聚合物Bd(600)-EO(300)，交联剂为1,6-己二硫醇，添加剂为1-羟环己基苯酮。其中交联剂上的巯基数与Bd(600)-EO(300)上的C=C键数的比值为1。
注：Bd(600)-EO(300)中括号内数字表示聚合后平均分子量。
1.溶液配制：
溶液1：将4 mg Bd(600)-EO(300)、0.87 mg 1,6-己二硫醇以及0.1 mg 1-羟环己基苯酮溶解于0.1 mL三氯甲烷；
溶液2：1 mol/L蔗糖；
溶液3：1 mol/L氯化钾，20 mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)，pH=8；
溶液4：将4 mg Bd(600)-EO(300)溶解于0.4 mL正辛烷。
2.膜骨架分子脂滴检测：
取2块表面镀有氧化铟锡(ITO)且表面电阻约为3-12 Ω/cm2的玻璃基底，将20 μL溶液1涂抹于其中一块玻璃基底的表面，静置10分钟后，将200 μL溶液2加入到溶液1处，用另一块玻璃基底覆盖上述玻璃基底的表面。而后施加交流电：Vpp=4 V；f=10 Hz；温度=35℃；126分钟，以促进脂滴形成。对两块玻璃基底之间的样品进行取样检测。其脂滴表征结果如图2所示，可以看出有许多大小不一的球形脂滴形成。
在常温下365 nm光照条件下照射5 s后对上述两块玻璃基底之间的样品进行取样检测。脂滴聚合情况如图3所示，可以明显看出，在UV照射后，脂滴间相互聚合形成较大的脂滴。在室温下存放28天后，对上述UV照射后的两块玻璃基底之间的样品进行取样，观察脂滴形态，检测其环境耐受强度。结果参考图4，该结果表明聚合后的膜骨架具有高环境耐受能力，常温即可长久保存。
3.膜蛋白自组装电生理活性检测：
取包含有1 μm圆孔的薄膜材料，并用聚四氟乙烯夹具夹紧该薄膜材料的两侧。在该薄膜材料的两侧分别添加溶液3，至液面高于圆孔。向两侧溶液中分别加入1 μL溶液4，静置10分钟后向溶液中添加1 μL MspA蛋白(1 mg/mL)，而后施加交流电，检测膜蛋白在膜骨架分子中的自组装电生理活性。
当施加50-200mV电压时，每一个电流阶跃证明单个膜蛋白的自组装电生理活性。单位时间内电流阶跃数量越多，表明膜蛋白的自组装电生理活性越好。
实验结果如图5所示，横坐标为时间(s)，纵坐标为电流(pA)值。图5中电流阶跃数量多，说明以Bd(600)-EO(300)作为膜骨架分子使得膜蛋白在其中具有非常好的自组装电生理活性。
实施例2：
本实施例中的膜骨架分子为由polymer source inc.提供的双嵌段两亲聚合物Bd(600)-EO(300)，交联剂为1,6-己二硫醇，添加剂为1-羟环己基苯酮。其中交联剂上的巯基数与Bd(600)-EO(300)上的C=C键数的比值为0.5。
1.溶液配制：
溶液1：将2 mg Bd(600)-EO(300)、0.87 mg 1,6-己二硫醇以及0.1 mg 1-羟环己基苯酮溶解于0.1 mL三氯甲烷；
溶液2：1 mol/L蔗糖；
溶液3：1 mol/L氯化钾，20 mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)，pH=8；
溶液4：将2 mg Bd(600)-EO(300)、0.87 mg 1,6-己二硫醇以及0.1 mg 1-羟环己基苯酮溶解于0.4 mL正辛烷。
2.膜骨架分子脂滴检测：
取2块表面镀有氧化铟锡(ITO)且表面电阻约为3-12 Ω/cm2的玻璃基底，将20 μL溶液1涂抹于第一块玻璃基底的表面，静置10分钟后，将200 μL溶液2加入到溶液1处，用另一块玻璃基底覆盖上述玻璃基底的表面。而后施加交流电：Vpp=4 V；f=10 Hz；温度=35℃；126分钟。对两块玻璃基底之间的样品进行取样检测。其脂滴表征结果如图6所示，有球形脂滴形成。
在常温下365 nm光照条件下照射5 s后对上述两块玻璃基底之间的样品进行取样检测。脂滴聚合情况如图7所示，在UV照射后，相比于实施例1中的脂滴聚合情况，本实施例中脂滴间相互聚合概率较低且聚合形成的脂滴也较小。
在室温下存放28天后，对上述UV照射后的两块玻璃基底之间的样品进行取样观察。结果如图8所示，经过28天的存放后，脂滴仍然保持完整，具有较高的稳定性。
3.仿生细胞膜电生理活性检测：
取包含有1 μm圆孔的薄膜材料，并用聚四氟乙烯夹具夹紧该薄膜材料的两侧。在该薄膜材料的两侧分别添加溶液3，至液面高于圆孔。向两侧溶液中分别加入1 μL溶液4，静置10分钟后向溶液中添加1 μL MspA蛋白(1 mg/mL)，而后施加交流电，检测仿生细胞膜电生理活性。并且在观测到目标数量的膜蛋白已经自组装在仿生细胞膜上之后，在常温下365nm光照条件下照射5 s，控制光化学反应的进行，锁定仿生细胞膜的结构，实现膜蛋白的可控组装，继续观察仿生细胞膜电生理活性的变化。
如图9所示，加入膜蛋白后，检测到电流阶跃，仿生细胞膜电生理活性较高，当观测到目标数量的膜蛋白已经构建在仿生细胞膜上后，在常温下365 nm 光照条件下照射5 s以锁定仿生细胞膜的结构，观察到仿生细胞膜电生理活性降低。以上结果表明本实施例能够实现膜蛋白的可控组装。
实施例3
本实施例在实施例2的基础上以1,4-丁二硫醇作为交联剂，对仿生细胞膜电生理活性进行检测。结果如图10所示，当以1,4-丁二硫醇作为交联剂进行反应时，在UV照射之前，仿生细胞膜存在较好的电生理活性；在UV照射之后，仿生细胞膜电生理活性降低，膜蛋白自组装速率降低。
对比例1
本对比例中的膜骨架分子为饱和磷脂(16:0磷脂酰胆碱)。
1.溶液配制
溶液1：将16:0磷脂酰胆碱溶于三氯甲烷中，浓度为20 mg/mL；
溶液2：1 mol/L蔗糖；
溶液3：1 mol/L氯化钾，20 mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)，pH=8；
溶液4：将16:0磷脂酰胆碱溶于正癸烷中，浓度为5 mg/mL；
2.膜骨架分子脂滴检测：
取2块表面镀有氧化铟锡(ITO)且表面电阻约为3-12 Ω/cm2的玻璃基底，将20 μL溶液1涂抹于其中一块玻璃基底的表面，静置10分钟后，将200 μL溶液2加入到溶液1处，用另一块玻璃基底覆盖上述玻璃基底的表面。而后施加交流电：Vpp=4 V；f=10 Hz；温度=35℃；126分钟。对两块玻璃基底之间的样品进行取样检测。脂滴表征结果如图11所示，可以看出有少量脂滴形成。
3.膜蛋白电生理活性检测：
取包含有1 μm圆孔的薄膜材料，并用聚四氟乙烯夹具夹紧该薄膜材料的两侧。在该薄膜材料的两侧分别添加溶液3，至液面高于圆孔。向两侧溶液中分别加入1 μL溶液4，静置10分钟后向溶液中添加1 μL MspA蛋白(1 mg/mL)，而后施加交流电，检测膜蛋白的生理活性。实验结果如图12所示，可以观察到少量的电流阶跃。
对比例2
本对比例在实施例2的基础上，以1,2-乙二硫醇作为交联剂来检测膜蛋白生理活性。结果如图13所示，在UV光照条件下照射进行聚合反应后，仿生细胞膜不稳定，无法进行进一步功能化验证。
对比例3
本对比例在实施例2的基础上以1,10-癸二硫醇作为交联剂，对仿生细胞膜电生理活性进行检测。结果如图14所示，本实施例得到的仿生细胞膜在UV照射前后均不具备电生理活性。
在实施例1与对比例1中：在浓度相同的条件下，与饱和磷脂(16:0磷脂酰胆碱)相比，Bd(600)-EO(300)形成的脂滴的粒径更大、密度更高。此外，Bd(600)-EO(300)形成的仿生细胞膜具有更好的电生理活性，具备更高的电势能耐性、渗透压耐性以及更多的膜蛋白装载性能。此外，Bd(600)-EO(300)形成的仿生细胞膜在UV照射后电生理活性降低，稳定性增强。
在实施例2-3与对比例2-3中，在膜蛋白为大肠杆菌体系表达的MspA蛋白的情况下，以1,6-己二硫醇或1,4-丁二硫醇作为交联剂时，经UV照射后所得仿生细胞膜的电生理活性降低，使得能够实现将膜蛋白可控地组装入膜骨架中；然而以1,2-乙二硫醇或1,10-癸二硫醇作为交联剂时，仿生细胞膜不稳定或不存在电生理活性，无法实现将膜蛋白可控地组装入膜骨架中。
总的来说，本发明提出的仿生细胞膜及其构建方法，通过在参与组装膜骨架的分子上引入光反应基团，在光照条件下发生光化学反应形成膜骨架，将膜蛋白锁定在形成的膜骨架中，形成具有骨架结构且膜蛋白种类和数量可控的仿生细胞膜。本发明能够在选定的时间和区域锁定仿生细胞膜的结构，阻断外部膜蛋白的进一步嵌入，获得机械强度高且膜蛋白种类和数量可控的仿生细胞膜。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (14)
1.一种仿生细胞膜，其特征在于，包括：膜骨架和膜蛋白；
所述膜骨架的至少一部分由膜骨架分子和交联剂聚合形成，所述膜蛋白锁定在由所述膜骨架分子和所述交联剂形成的所述膜骨架中；
所述膜骨架分子为不饱和两亲性嵌段聚合物；
所述不饱和两亲性嵌段聚合物包括亲水段以及疏水段，所述亲水段包括-CH2-CH2-O-重复片段，所述疏水段包括-CH2-CH=CH-CH2-或-CH2-CH(CH=CH2)-重复片段；
所述交联剂上的巯基数与所述膜骨架分子上的C=C键数的比值不大于1；
其中，所述交联剂具有如下式Ⅰ所示的结构：
。
2.根据权利要求1所述的仿生细胞膜，其特征在于，所述膜蛋白选自孔蛋白、离子选择性蛋白、转运蛋白以及功能性膜蛋白复合体中的至少之一。
3.根据权利要求1所述的仿生细胞膜，其特征在于，所述不饱和两亲性嵌段聚合物包括不饱和双嵌段两亲聚合物和不饱和三嵌段两亲聚合物中的至少之一。
4.根据权利要求1所述的仿生细胞膜，其特征在于，满足以下条件的至少之一：
所述亲水段为聚环氧乙烷；
所述疏水段为聚丁二烯。
5.根据权利要求1所述的仿生细胞膜，其特征在于，所述不饱和两亲性嵌段聚合物包括所述亲水段为聚环氧乙烷且所述疏水段为聚丁二烯的双嵌段两亲聚合物。
6.根据权利要求1所述的仿生细胞膜，其特征在于，所述交联剂上的巯基数与所述膜骨架分子上的C=C键数的比值为0.25~0.5。
7.根据权利要求1所述的仿生细胞膜，其特征在于，所述交联剂选自1,4-丁二硫醇、1,5-戊二硫醇、1,6-己二硫醇以及其异构体中的至少之一。
8.根据权利要求1所述的仿生细胞膜，其特征在于，所述交联剂选自1,4-丁二硫醇、1,6-己二硫醇以及其异构体中的至少之一。
9.一种制备权利要求1-8中任一项所述的仿生细胞膜的方法，其特征在于，包括：
将所述膜蛋白、所述膜骨架分子、所述交联剂以及添加剂混合；
在光照条件下使所得混合物发生光化学反应，以令所述膜骨架分子和所述交联剂聚合形成所述膜骨架，并将所述膜蛋白锁定在所述膜骨架中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述添加剂选自光催化剂、光引发剂以及光活化碱中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述光引发剂具有如下式Ⅳ、式Ⅴ、式Ⅵ和式Ⅶ中的至少之一所示的结构：
其中R1选自H、CH3、C2H5或者CH(CH3)2；
R2选自C2H5、CH(CH3)2或者CH(CH3)2C2H5。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述光化学反应是所述膜骨架分子上的C=C键与所述交联剂上的巯基在所述添加剂和光照的条件下发生的，并且所述光照条件包括UV照射。
13.权利要求1-8中任一项所述仿生细胞膜在非治疗目的的药物递送中的用途。
14.权利要求1-8中任一项所述仿生细胞膜在非诊断目的的单细胞分析以及单分子分析中的用途。
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