CN112126080A - 基于巯基-烯点击反应的光固化水凝胶、其制法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于巯基‑烯点击反应的光固化水凝胶、其制法及应用。所述制备方法包括:将巯基修饰到透明质酸上,获得巯基修饰的透明质酸;将马来酸酐与胶原反应,获得双键修饰的胶原;将巯基修饰的透明质酸与双键修饰的胶原于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀,加入光引发剂,之后在光照的作用下,发生巯基‑烯点击反应,获得光固化水凝胶。本发明基于巯基‑烯点击反应获得的光固化水凝胶的生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境,提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种光固化水凝胶,具体涉及一种三维培养干细胞的基于巯基-烯点击反应的光固化水凝胶、其制法,属于组织工程材料制备技术领域。
背景技术
随着科学技术的发展,组织工程已成为修复损伤组织的一种重要手段。相较于其他组织修复技术,利用干细胞的再生功能使其增殖,诱导其朝特定的方向分化。尤其利用三维材料为载体为干细胞提供立体生存环境,在组织工程修复器官方面有诸多优势。
目前已应用于组织工程的主要生物支架有传统的多孔支架以及可注射的水凝胶等。传统的多孔支架是指先在体外制备好支架,并对其进行灭菌处理,再将细胞种植到其上。用这种方法制备的多孔支架在临床应用时会存在一些问题,比如它需要经过手术来将支架植入体内,这一手术过程会增加患者被感染的风险,或制备的支架与缺损部位不相适应,这些都会加大手术失败的风险。而另一种材料可注射的水凝胶,它们可以原位成胶,通过将聚合物前体溶液与细胞共混后注射到体内缺损部位再形成水凝胶。这种修复器官或组织的方法可以修复到非常深的组织中的缺陷,具有很小的侵入性并能提供更好的缺陷边缘适应性,从而可以降低感染风险,减少疤痕,减少疼痛。除此之外,水凝胶还具有某些重要性质,如卓越的生物相容性和透氧性,类似于天然组织的物理特性以及高含水量等。因此,可注射的水凝胶在组织工程中越来越受到欢迎,被研究的越来越多。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于巯基-烯点击反应的光固化水凝胶及其制备方法与应用,以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案是这样实现的:
一种基于胶原的聚合物,所述聚合物为式(3)所示结构的聚合物;
其中,n为大于或等于2的自然数,Col为胶原。
优选的技术方案中,其中n的取值为107~196,Collagen为鼠尾胶原。
本发明的另一目的在于提供一种光固化水凝胶,包括聚合物基质和水,所述聚合物基质为前述的聚合物。
优选的技术方案中,所述光固化水凝胶具有多孔结构,其中所含孔洞的孔径为40~80μm。
优选的技术方案中,所述光固化水凝胶的机械强度在800Pa以上;优选的,所述光固化水凝胶的机械强度在1000Pa以上;优选的,所述光固化水凝胶的机械强度在1000Pa~1200Pa。
本发明的又一目的在于提供一种光固化水凝胶的制备方法,所述方法包括以下步骤:
1)使胶原与马来酸酐发生酰胺化反应,获得式(1)所示的双键修饰的胶原,
其中,Collagen为胶原;
2)使胱胺与透明质酸发生反应,获得式(2)所示巯基修饰的透明质酸;
其中,n为大于或等于2的自然数;
3)将巯基修饰的透明质酸与双键修饰的胶原在光引发剂存在的条件进行反应,形成光固化水凝胶。
优选的技术方案中,步骤1)中所述胶原与马来酸酐的质量比为1:3~5。
优选的,步骤1)中还以碱性物质调节所述反应体系的pH值至8~10的步骤。
优选的,所述碱性物质包括三乙胺。
优选的,步骤1)包括:将马来酸酐以马来酸酐的二甲基亚砜溶液的形式导入反应体系,其中二甲基亚砜与反应体系的体积比为1:10~20,以及,将胶原以胶原的醋酸溶液的形式导入反应体系,其中醋酸溶液的浓度为1~2w/v%。
优选的,步骤1)中酰胺化反应的反应温度控制在0~8℃,反应时间控制在15~30h。
优选的技术方案中,步骤1)还包括在酰胺化反应后对反应产物进行透析的步骤,所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500~14000Da。
优选的,所述透析步骤包括:预先通过丙酮对反应产物进行清洗,清洗后的反应产物在去离子水中透析1~3天。
优选的,所述丙酮的用量为酰胺化反应体系的体积10~20倍。
优选的技术方案中,步骤2)包括使透明质酸与胱胺发生缩合反应,然后加入二硫苏糖醇进行还原反应得到式(2)所示巯基修饰的透明质酸的步骤;其中缩合反应的反应温度控制在0~8℃,反应时间控制在10~30min;还原反应的反应时间控制在6~10h。
优选的,所述缩合反应使用的缩合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和N-羟基琥珀酰亚胺。
优选的,所述缩合剂与透明质酸上的羧基的摩尔比为2~4:1。
优选的,所述胱胺与透明质酸上的羧基的摩尔比为1~5:1。
优选的,所述二硫苏糖醇与胱胺的摩尔比为1:1。
优选的技术方案中,步骤2)还包括在还原反应后对还原反应产物进行透析的步骤,所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500~14000Da。
优选的技术方案中,所述方法中透析步骤包括将还原反应产物依次在pH值为4~5的水溶液,含有3~5g/L的氯化钠的pH值为4~5的水溶液,pH值为4~5的水溶液中透析20~25h的步骤。
优选的技术方案中,步骤3)中所述光引发剂选自2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基丙酮。
优选的,所述光引发反应体系中光引发剂的浓度为0.1~1w/v%;更优选为0.3~0.6w/v%。
本发明的又一目的在于提供一种前述的光固化水凝胶于组织工程领域中的用途。
优选的技术方案中,所述的用途包括以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞培养的步骤。
优选的技术方案中,所述的用途包括以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养,并促使所述干细胞进行增殖。
优选的技术方案中,以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养时,干细胞于所述光固化水凝胶上的负载量为100~1000万个/mL。
本发明聚合物的制备方法采用光固化的方式进行,光固化水凝胶也可以采用类似如图1的工艺路线获得:
如图1,光固化水凝胶的制备方法中先将胶原与马来酸酐混合,获得双键修饰的胶原;与之并列的,可以将胱胺修饰到透明质酸上,获得巯基修饰的透明质酸;最后将所述双键修饰的胶原与巯基修饰的透明质酸于磷酸盐缓冲溶液中混合,并加入光引发剂形成光引发反应体系,之后在光照条件下发生巯基-烯点击反应,获得基于巯基-烯点击反应的光固化水凝胶。
这样获得的光固化水凝胶,包括聚合物基质和水,所述聚合物基质由结构如式(3)所示的聚合物形成:
其中,n的取值为107~196,Col为胶原,优选为鼠尾胶原。
将该光固化水凝胶可以应用于组织工程领域中的细胞培养领域。应用时,以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞的培养。具体的,可以以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养,并促使所述干细胞进行增殖。
与现有技术相比,本发明的有益效果至少在于:
1)本发明提供了一种基于动物胶原如鼠尾胶原制备光固化水凝胶三维支架的方法,并实现与细胞共混凝胶化,胶原具有优异的生物特性但是不溶于水溶液,从而限制了其在生物医学中的应用。本发明通过在胶原表面修饰马来酸酐后,制备可水溶的胶原;利用胶原中的多肽序列,可以提高干细胞在支架表面的粘附;
2)本发明提供的光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低,可以提供三维环境以提高干细胞的增殖;同时制备方法简单,可大量制备。本发明基于巯基-烯点击反应获得的光固化水凝胶的生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境,提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1是本发明一典型实施例中一种基于巯基-烯点击反应的光固化水凝胶的制备机理示意图;
图2是本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶的外观图和微观结构图;
图3是本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶流变图;
图4是本发明干细胞在本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶中生长共聚焦图;
图5是干细胞在本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶中的增殖图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明提供了一种光固化水凝胶,包括聚合物基质和水,所述聚合物基质由结构如式(3)所示的聚合物形成:
其中,n的取值为107~196,Col为鼠尾胶原。
在一些实施例中,所述制备方法包括:将胶原溶于浓度为1~2w/v%的醋酸溶液,之后加入第一溶剂溶解的马来酸酐,并混合均匀,获得第一混合体系,之后使所述第一混合体系于0~8℃反应15~30h,获得双键修饰的胶原。
进一步地,所述胶原与马来酸酐的质量比为1:3~5。
进一步地,所述第一溶剂包括二甲基亚砜。
进一步地,所述第一溶剂与第一混合体系的体积比为1:10~20。
进一步地,所述制备方法还包括:以碱性物质调节所述第一混合体系的pH值至8~10。
进一步地,所述碱性物质包括三乙胺。
进一步地,所述制备方法还包括:在所述第一混合体系的反应结束后,将所获反应混合物加入丙酮中,并收集沉淀,再将沉淀加入去离子水中透析1~3天,之后冷冻干燥,获得双键修饰的胶原。
进一步地,所述丙酮与第一混合体系的体积比为10~20:1。
进一步地,所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500~14000Da。
在一些实施例中,所述制备方法包括:使包含透明质酸和缩合剂的第二混合体系于0~8℃反应10~30min,然后加入胱胺混合均匀形成第二混合体系,使所述第二混合体系于15~30℃反应10~30h,之后向第二混合体系中加入二硫苏糖醇反应6~10h,获得巯基修饰的透明质酸。
进一步地,所述缩合剂与透明质酸上的羧基的摩尔比为2~4:1。
进一步地,所述缩合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和N-羟基琥珀酰亚胺。
进一步地,所述胱胺与透明质酸上的羧基的摩尔比为1~5:1。
进一步地,所述二硫苏糖醇与胱胺的摩尔比为1:1。
进一步地,制备方法还包括:在所述第二混合体系的反应结束后,将所获反应混合物分别在pH值为4~5的水溶液,含有3~5g/L的氯化钠的pH值为4~5的水溶液,pH值为4~5的水溶液中各透析1天,之后冷冻干燥,即得到巯基修饰的透明质酸。
进一步地,所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500~14000Da。
其中,所述基于巯基-烯点击反应党的光固化水凝胶的制备步骤中还包括用波长295~395nm紫外光引发反应,其光强度为5~10mW/cm2,光照时间为1~3min。
作为优选方案之一,所述光固化水凝胶具有多孔结构,其中所含孔洞的孔径为40~80μm。
进一步地,所述光固化水凝胶的机械强度为1000Pa~1200Pa。
藉由上述技术方案,本发明的光固化水凝胶将生物来源胶原材料与常用的材料透明质酸分别进行双键化修饰和巯基姿势,之后复合并与细胞共混,将胶原和透明质酸相结合,提高细胞的粘附作用、细胞的存活率,所获光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境,提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖;同时制备方法简单,可大量制备。
实施例1
步骤一:将胶原(Col)溶解于1w/v%的醋酸溶液中,室温下搅拌过夜使其溶解,然后在冰浴条件下,用三乙胺调节胶原溶液的pH值到8。接着将二甲基亚砜溶解的马来酸酐(MAH)用恒压漏斗缓慢滴加到上述反应液中,滴加过程中溶液pH值维持在8,冰浴反应24h。其中Col与MAH反应的质量比为1:3。
步骤一的反应结束后,将反应液用丙酮(体积为上述反应体系体积的10倍)沉淀后溶于超纯水中并用截留分子量为14000Da的透析袋透析,在4℃去离子水中透析3天,冻干,得到双键修饰的胶原(Col-MAH),结构式如式(1)所示:
步骤二:将透明质酸钠溶于pH值为5的MES缓冲溶液,随后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺冰浴活化30min,然后将含有胱胺的MES缓冲溶液加入上述反应液中,混合均匀,避光搅拌过夜。然后加入二硫苏糖醇(DTT)断裂胱胺中的二硫键,避光过夜反应。其中,透明质酸钠上的羧基、EDC、NHS以及胱胺的反应摩尔比为1:2:2:5。
步骤二反应结束后,将反应液置于截留分子量为3500Da的透析袋中,分别在pH值为5的水溶液,含有4g/L的氯化钠的pH值为5的水溶液,pH值为5的水溶液中各透析1天,最后冻干,可得到巯基修饰的透明质酸(HA-SH),结构式如式(2)所示:
步骤三:将上述双键修饰的胶原和巯基修饰的透明质酸配成浓度不低于15mg/mL的PBS溶液,再加入不低于0.5%的光引发剂I2959,在365nm紫外光光强不低于7mW/cm2下光照交联1min;其中,双键化修饰的胶原与双键化修饰的透明质酸的质量比为1:1。
步骤三的反应结束后,获得所述光固化水凝胶如式(3)所示:
实施例2
步骤一:将胶原溶解于1.5w/v%的醋酸溶液中,室温下搅拌过夜使其溶解,然后在冰浴条件下,用三乙胺调节胶原溶液的pH到9。接着将二甲基亚砜溶解的马来酸酐(MAH)用恒压漏斗缓慢滴加到上述反应液中,滴加过程中溶液pH值维持在9,冰浴反应15h。其中Col与MAH反应的质量比为1:4。
步骤一的反应结束后,将反应液用丙酮(体积为上述反应体系的15倍)沉淀后溶于超纯水中并用截留分子量为14000Da的透析袋透析,在4℃去离子水中透析3天,冻干,得到双键修饰的胶原(Col-MAH),结构式如式(1)所示:
步骤二:将透明质酸钠溶于pH为5.5的MES缓冲溶液,随后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺冰浴活化20min,然后将含有胱胺的MES缓冲溶液加入上述反应液中,混合均匀,避光搅拌过夜。然后加入二硫苏糖醇(DTT)断裂胱胺中的二硫键,避光过夜反应。
其中,透明质酸钠上的羧基、EDC、NHS以及胱胺的反应摩尔比为1:3:3:4。
步骤二的反应结束后,将反应液置于截留分子量为3500Da的透析袋中,分别在pH为4的水溶液,含有5g/L的氯化钠的pH为4的水溶液,pH为4的水溶液中各透析1天,最后冻干,可得到巯基修饰的透明质酸(HA-SH),结构式如式(2)所示。
步骤三:将上述双键修饰的胶原和巯基修饰的透明质酸配成浓度不低于15mg/mL的PBS溶液,再加入不低于0.5%的光引发剂I2959,在365nm紫外光光强5mW/cm2下光照交联2min;其中,双键化修饰的胶原与双键化修饰的透明质酸的质量比为1:1。
步骤三的反应结束后,获得所述光固化水凝胶如式(3)所示:
实施例3
步骤一:将胶原溶解于2w/v%的醋酸溶液中,室温下搅拌过夜使其溶解,然后在冰浴条件下,用三乙胺调节胶原溶液的pH到10。接着将二甲基亚砜溶解的马来酸酐(MAH)用恒压漏斗缓慢滴加到上述反应液中,滴加过程中溶液pH值维持在10,冰浴反应18h。其中Col与MAH反应的质量比为1:5。
步骤一的反应结束后,将反应液用丙酮(体积为上述反应体系的20倍)沉淀后溶于超纯水中并用截留分子量为14000Da的透析袋透析,在4℃去离子水中透析3天,冻干,得到双键修饰的胶原(Col-MAH),结构式如式(1)所示:
步骤二:将透明质酸钠溶于pH为6的MES缓冲溶液,随后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺冰浴活化10min,然后将含有胱胺的MES缓冲溶液加入上述反应液中,混合均匀,避光搅拌过夜。然后加入二硫苏糖醇(DTT)断裂胱胺中的二硫键,避光过夜反应。其中,透明质酸钠上的羧基、EDC、NHS以及胱胺的反应摩尔比为1:4:4:3。
步骤二的反应结束后,将反应液置于截留分子量为3500Da的透析袋中,分别在pH为4.5的水溶液,含有3g/L的氯化钠的pH为4.5的水溶液,pH为4.5的水溶液中各透析1天,最后冻干,可得到巯基修饰的透明质酸(HA-SH),结构式如式(2)所示:
步骤三:将上述双键修饰的胶原和巯基修饰的透明质酸配成浓度不低于15mg/mL的PBS溶液,再加入不低于0.5%的光引发剂I2959,在365nm紫外光光强不低于7mW/cm2下光照交联1min;其中,双键化修饰的胶原与双键化修饰的透明质酸的质量比为1:1。
步骤三的反应结束后,获得所述光固化水凝胶如式(3)所示:
实施例1光固化水凝胶可作为三维培养细胞载体在组织工程中应用。下面通过测试例中项目性能测试展示本实施例所获光固化水凝胶作为细胞三维培养载体的应用优势。
性能测试例一
在场环扫描电镜测试仪上测试本实施例所获光固化水凝胶内部结构及孔径大小,其操作方法包括:将上述光固化水凝胶液氮冷冻干燥24h,20mA喷金3min,扫描电镜观察水凝胶微观形貌图(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出,该光固化水凝胶微观结构多孔,孔径约40~80μm。
性能测试例二
在流变仪测试仪上测试本实施例所获光固化水凝胶的机械性能,通过流变结果图3可以看出,G’>G”且呈线性,说明已成凝胶状态。
性能测试例三
本实施例所获光固化水凝胶对干细胞增殖检测
用钙黄绿素染色法和四唑盐比色法(WST法)来测定本实施例光固化水凝胶在鼠源骨髓干细胞(BMSC细胞)中的细胞存活和细胞增殖,其操作方法包括:将巯基修饰的透明质酸浓度为1.5w/v%溶于浓度为1.5w/v%双键修饰的胶原溶液中,加入0.5w/v%光引发剂I2959,2M的NaOH溶液调整PH至7;将全培养基培养的第4代脐带间充质干细胞(UCMSCs)细胞消化、计数、1000rpm离心4min;将上述双键修饰的胶原与巯基修饰的透明质酸混合液混合确保细胞浓度为1000万/mL;取上述细胞共混液100μL于96孔板中,365nm紫外光光强度为7mW/cm2下照射1min,干细胞与本实施例的光固化水凝胶共混,将该水凝胶转移至24孔板中,加入完全培养基,放入5%CO2、37℃培养箱中培养。
培养1d和7d后将培养基取出,PBS清洗3次,利用Live/dead试剂盒测定,在激光共聚焦488/561激发下观察细胞活性;活细胞被钙黄绿素染色发出绿色荧光,死细胞被染色发出红色荧光。
如图4所示脐带间充质干细胞在本实施例所获光固化水凝胶中存活较好并显示三维结构和明显增殖,表明本发明对细胞增殖无影响且能为细胞提供三维生长环境。
培养1d,3d,5d和7d后将培养基取出,每孔加入450μL新鲜培养基,加50μL WST-1充分混匀,放入5%CO2、37℃培养箱中孵育4h,取100μL于96孔板中酶标仪450nm处测试OD值。
如图5所示BMSC与本实施例所获光固化水凝胶共混后,培养3d细胞存活较好,培养7d细胞呈现明显增殖,表明本实施例所获光固化水凝胶毒性低、生物相容性好。
对比例1:
目前在利用胶原制备组织工程支架的常用方法中都会引入一定的化学交联剂。本对照例通过引入戊二醛、京尼平等来制备基于胶原水凝胶,这会对细胞造成一定的损伤(参考Damink,LHH Olde,et al."Cross-linking of dermal sheep collagen using awater-soluble carbodiimide."Biomaterials 17.8(1996):765-773.)。除此之外,制备水凝胶的时间也较长,因而限制了其生物应用。
与对比例1相比,本发明实施例1-3所获水凝胶基于胶原和透明质酸之间的点击化学反应制备,该反应速率极快,水凝胶可在2min内成型,并且在反应过程中也不需要引入其他添加剂,具有较好的生物相容性。
对比例2:
一般情况下,胶原难溶于水溶液(参考Zhang,Min,et al."A novel strategy tofabricate water-soluble collagen using poly(γ-glutamic acid)-derivatives asdual-functional modifier."Reactive and Functional Polymers 122(2018):131-139.),本对照例将胶原溶于醋酸溶液中交联形成凝胶,通过透析除去醋酸及小分子,冻干形成三维多孔支架材料。但是本对照例获得的凝胶相容性低,它是需要将支架灭菌后再将细胞移植到支架上,从而限制了其在生物医学中的应用。
与对比例2相比,本发明实施例1-3所获水凝胶对鼠尾胶原进行双键化修饰,修饰后的鼠尾胶原可溶于水,较上述醋酸溶液中形成的水凝胶有更广泛的生物应用,例如,本发明实现与细胞共混凝胶化,较上述三维支架材料更易于细胞生长。
综上所述,藉由本发明的上述技术方案,本发明的光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境,提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖,并且实现成骨分化;同时制备方法简单,可大量制备。
此外,本案发明人还参照实施例1-3的方式,以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验,并同样制得了固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境的光固化水凝胶。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (16)
2.根据权利要求1所述的聚合物,其特征在于,其中n的取值为107~196,Collagen为鼠尾胶原。
3.一种光固化水凝胶,包括聚合物基质和水,其特征在于,所述聚合物基质包括权利要求1或2所述的基于胶原的聚合物。
4.根据权利要求3所述的光固化水凝胶光,其特征在于,所述光固化水凝胶具有多孔结构,其中所含孔洞的孔径为40~80μm。
5.根据权利要求3所述的光固化水凝胶,其特征在于,所述光固化水凝胶的机械强度在800Pa以上;优选的,所述光固化水凝胶的机械强度在1000Pa以上;更优选的,所述光固化水凝胶的机械强度在1000Pa~1200Pa范围内。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤1)中所述胶原与马来酸酐的质量比为1:3~5;优选的,步骤1)中还包括以碱性物质调节反应体系的pH值至8~10的步骤;优选的,所述碱性物质包括三乙胺;优选的,步骤1)包括:将马来酸酐以马来酸酐的二甲基亚砜溶液的形式导入反应体系,其中二甲基亚砜与反应体系的体积比为1:10~20;以及,将胶原以胶原的醋酸溶液的形式导入反应体系,其中醋酸溶液的浓度为1~2w/v%;和/或,步骤1)中酰胺化反应的反应温度控制在0~8℃,反应时间控制在15~30h。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤1)还包括在酰胺化反应后对反应产物进行透析的步骤,所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500~14000Da;
优选的,所述透析步骤包括:预先通过丙酮对反应产物进行清洗,清洗后的反应产物在去离子水中透析1~3天;优选的,所述丙酮的用量为酰胺化反应体系的体积10~20倍。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤2)包括使透明质酸与胱胺发生缩合反应,然后加入二硫苏糖醇进行还原反应得到式(2)所示巯基修饰的透明质酸的步骤;其中缩合反应的反应温度控制在0~8℃,反应时间控制在10~30min;还原反应的反应时间控制在6~10h;
优选的,所述缩合反应使用的缩合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸和N-羟基琥珀酰亚胺;所述缩合剂与透明质酸上的羧基的摩尔比为2~4:1,所述胱胺与透明质酸上的羧基的摩尔比为1~5:1;所述二硫苏糖醇与胱胺的摩尔比为1:1。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,步骤2)还包括在还原反应后对还原反应产物进行透析的步骤,所述透析采用的透析袋的截留分子量为3500~14000Da。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述透析步骤包括将还原反应产物依次在pH值为4~5的水溶液,含有3~5g/L的氯化钠的pH值为4~5的水溶液,pH值为4~5的水溶液中透析20~25h的步骤。
12.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤3)中所述光引发剂选自2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基丙酮;优选的,所述光引发反应体系中光引发剂的浓度为0.1~1w/v%,更优选为0.3~0.6w/v%;
优选的,用波长为295~395nm的紫外光引发反应,其光强度为5~10mW/cm2,光照时间为1~3min。
13.权利要求3~5中任一项所述的光固化水凝胶于组织工程领域中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途,其特征在于,所述的用途包括:以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞培养的步骤。
15.根据权利要求13所述的用途,其特征在于,所述的用途包括:以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养,并促使所述干细胞进行增殖。
16.根据权利要求15所述的用途,其特征在于,以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养时,干细胞于所述光固化水凝胶上的负载量为100~1000万个/mL。
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