CN109553783A - 一种光固化水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光固化水凝胶及其制备方法与应用。所述制备方法包括：将胶原与甲基丙烯酸缩水甘油酯按照60～80：1的摩尔比混合，反应15～30h，获得双键修饰的胶原，将透明质酸与甲基丙烯酸酐按照摩尔比为1：10～30混合均匀，冰上反应10～30h，获得双键修饰的透明质酸；将双键修饰的胶原与双键修饰的透明质酸按照质量比为1：10～1：15于磷酸盐缓冲溶液中混合均匀，加入光引发剂，之后在波长295～395nm、光强5～10mW/cm2下进行光引发反应1～5min，获得光固化水凝胶。本发明的光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并且实现成骨分化。
Description
技术领域
本发明涉及一种光固化水凝胶，具体涉及一种三维培养干细胞和分化用的光固化水凝胶及其制备方法与应用，属于组织工程材料制备技术领域。
背景技术
随着科学技术的发展，组织工程已成为修复损伤组织的一种重要手段。相较于其他组织修复技术，利用干细胞的再生功能使其增殖，诱导其朝特定的方向分化。尤其利用三维材料为载体为干细胞提供立体生存环境，在组织工程修复器官方面有诸多优势。
目前常用组织工程中细胞与材料的结合方法包括：细胞接种于材料上和细胞与材料共混成水凝胶，其中细胞与材料共混有利于细胞的生长，尤其是在细胞迁移、粘附、增殖与立体结构方面有诸多优势；此外通过控制共混水凝胶的形状可以提高组织修复的精确度和准确度。但为了确保细胞的活性通常需要寻找具有较高生物相容性的材料。
组织工程中与细胞共混水凝胶的常用的材料包括壳聚糖、聚乙酸、聚乳酸、聚己内酯、透明质酸、海藻酸盐等，利用高分子具有较多的活性官能团，可以将其进行化学修饰，从而用不同的方法成水凝胶；通过改变水凝胶的特性，例如加入细胞外基质于水凝胶，可能会增加细胞的黏附和趋化宿主细胞的迁移，同时也可能会增加种子细胞的分化能力；但多数人工合成高分子材料生物相容性低，降解不彻底，因此，寻找生物相容性好以及可降解的材料作为三维培养细胞的载体尤为重要。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种光固化水凝胶及其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种光固化水凝胶的制备方法，其包括：
将胶原与甲基丙烯酸缩水甘油酯按照60～80：1的摩尔比混合，并于15～30℃反应15～30h，获得双键修饰的胶原；
将透明质酸与甲基丙烯酸酐按照1：10～30的摩尔比混合，于0～10℃反应10～30h，获得双键修饰的透明质酸；
将所述双键修饰的胶原与双键修饰的透明质酸按照1：10～1：15的质量比于磷酸盐缓冲溶液中混合，并加入光引发剂形成光引发反应体系，之后在波长295～395nm、光强5～10mW/cm2的光照条件下反应1～5min，获得光固化水凝胶。
本发明实施例还提供了一种光固化水凝胶，包括聚合物基质，所述聚合物基质由结构如式(3)所示的聚合物形成：
其中，n的取值为107～196，Collagen为鼠尾胶原。
本发明实施例还提供了前述的光固化水凝胶于细胞培养领域中的用途。
优选的，所述的用途包括：以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞的培养。
本发明实施例还提供了前述的光固化水凝胶于组织工程领域中的用途。
优选的，所述的用途包括：以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供了一种基于鼠尾胶原制备光固化水凝胶三维支架的方法，并实现与细胞共混凝胶化，胶原具有优异的生物特性但是不溶于水溶液，从而限制了其在生物医学中的应用。本发明通过在胶原表面修饰GMA后，制备可水溶的胶原；利用胶原中的多肽序列，可以提高干细胞在支架表面的粘附；
2)本发明提供的光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低，可以提供三维环境以提高干细胞的增殖与分化；同时制备方法简单，可大量制备。
附图说明
图1是本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶的制备机理示意图；
图2是本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶的外观图和微观结构图；
图3是本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶流变图；
图4是干细胞在本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶中生长共聚焦图；
图5是干细胞在本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶中的增殖图；
图6是干细胞在本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶中成骨分化碱性磷酸酶显色图；
图7是干细胞在本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶中成骨分化碱性磷酸酶/DNA值示意图；
图8a和图8b是干细胞在本发明一典型实施例中所获光固化水凝胶中生长形貌图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供了一种光固化水凝胶的制备方法，其包括：
将胶原与甲基丙烯酸缩水甘油酯按照60～80：1的摩尔比混合，并于15～30℃反应15～30h，获得双键修饰的胶原，相较于修饰前的胶原，这种经过简单修饰的胶原可溶于水溶液；
将透明质酸与甲基丙烯酸酐按照1：10～30的摩尔比混合，于0～10℃反应10～30h，获得双键修饰的透明质酸；
将所述双键修饰的胶原与双键修饰的透明质酸按照1：10～1：15的质量比于磷酸盐缓冲溶液中混合，并加入光引发剂形成光引发反应体系，之后在波长295～395nm、光强5～10mW/cm2的光照条件下反应1～5min，获得光固化水凝胶。
作为优选方案之一，所述制备方法具体包括：将胶原溶于浓度为1～2w/v％的醋酸溶液，之后加入有机碱、表面活性剂和甲基丙烯酸缩水甘油酯，并混合均匀，获得第一混合体系，之后使所述第一混合体系于15～30℃反应15～30h，获得双键修饰的胶原。
作为优选方案之一，所述有机碱与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1～1.5：1。
进一步的，所述有机碱包括三乙胺，但不限于此。
优选的，所述第一混合体系还包含0.05～0.15v/v％的表面活性剂。亦即，所述表面活性剂与第一混合体系的体积比为0.05～0.15：100。
进一步的，所述表面活性剂包括吐温20，但不限于此。
优选的，所述制备方法还包括：在所述第一混合体系的反应结束后，将所获反应物加入大量乙醇中，并收集沉淀，即为双键修饰的胶原。
作为优选方案之一，所述双键修饰的胶原具有双键结构，所述双键修饰的胶原的结构式如式(1)所示：
其中，COL来源于鼠尾胶原。
作为优选方案之一，所述制备方法具体包括：向浓度为0.5～1.5w/v％的透明质酸水溶液中加入甲基丙烯酸酐并混合均匀，形成第二混合体系，之后使所述第二混合体系在0～10℃反应10～30h，获得双键修饰的透明质酸。
优选的，所述制备方法还包括：以碱性物质调节所述第二混合体系的pH值至6.5～9，之后使所述第二混合体系反应，制得双键修饰的透明质酸。
进一步的，所述碱性物质包括浓度为2～6mol/L的NaOH溶液，但不限于此。
作为优选方案之一，所述制备方法还包括：在所述第二混合体系的反应结束后，将所获反应物加入大量乙醇中，并将所获沉淀以截留分子量为3500～14000KDa的透析袋透析1～3天，之后冷冻干燥，即得到双键修饰的透明质酸。
优选的，所述双键修饰的透明质酸具有双键结构，所述双键修饰的透明质酸的结构式如式(2)所示：
其中，n的取值为107～196。
作为优选方案之一，所述光引发剂位光引发剂I2959，即2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基丙酮，其浓度为0.1～1v/v％，进一步优选为0.3～0.6v/v％。
优选的，所述光固化水凝胶的结构式如式(3)所示：
其中，n的取值为107～196，Collagen为鼠尾胶原。
其中，所述光固化水凝胶的制备步骤中还包括用295～395nm紫外光引发反应，其光强度为5～10mW/cm2，光照时间为2～5min。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种光固化水凝胶，包括聚合物基质，所述聚合物基质由结构如式(3)所示的聚合物形成：
其中，n的取值为107～196，Collagen为鼠尾胶原。
其中，至少一个双键修饰的透明质酸的双键与至少一个双键修饰的胶原的双键交联。
作为优选方案之一，所述光固化水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～400nm，所述光固化水凝胶的机械强度为17～25Pa。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的光固化水凝胶于细胞培养领域中的用途。
优选的，所述的用途包括：以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞的培养。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的光固化水凝胶于组织工程领域中的用途。
优选的，所述的用途包括：以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化。
优选的，干细胞于所述光固化水凝胶上的负载量为100～1000万个/mL。
藉由上述技术方案，本发明的光固化水凝胶将生物来源胶原材料与常用的材料透明质酸进行双键化修饰，之后复合并与细胞共混，将胶原和透明质酸相结合，提高细胞的粘附作用、细胞的存活率，所获光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并且实现成骨分化；同时制备方法简单，可大量制备。
以下通过若干实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
实施例1
步骤一：将鼠尾胶原溶解于1％醋酸溶液中，并依次加入甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺、吐温20室温反应24h。
其中，所述鼠尾胶原与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为75:1，三乙胺的质量与甲基丙烯酸缩水甘油酯质量相等，吐温20的浓度为0.1v/v％。
步骤一的反应结束后，在乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，12000rpm离心5min收沉淀，用PBS溶解上述沉淀，得到双键修饰的胶原溶液，双键修饰的胶原结构式如式(1)所示：
这种双键修饰的胶原是一种由甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的化合物，双键修饰的胶原主要是在胶原分子上修饰上双键，改善了其水溶性，使本只能溶于酸性环境中的胶原溶解在水相中。
步骤二：将透明质酸溶于水，加入甲基丙烯酸酐，冰上反应24h。
其中，甲基丙烯酸酐与透明质酸-NH2的摩尔比为20:1，反应过程中用5mol/L的NaOH溶液维持溶液的pH值在8左右。
步骤二反应结束后，在乙醇中沉淀，得白色沉淀，7000KDa截留量透析除去未反应的甲基丙烯酸酐，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥2d，获得双键修饰的透明质酸，双键修饰的透明质酸的结构式如(2)所示：
这种双键修饰的透明质酸是由甲基丙烯酸酐修饰的化合物，其接枝率为83％。
步骤三：将上述双键修饰的胶原配成浓度不低于3mg/mL的PBS溶液，加入上述双键修饰的透明质酸，透明质酸的浓度为4％，再加入不低于0.5％的光引发剂I2959，在365nm紫外光光强不低于7mW/cm2下光照交联3min；其中，双键化修饰的胶原与双键化修饰的透明质酸的质量比为1:12。
步骤三反应结束后，获得所述光固化水凝胶如式(3)所示：
上述步骤一至步骤三可通过图1表示。
实施例2
步骤一：将鼠尾胶原溶解于1％醋酸溶液中，并依次加入甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺、吐温20室温反应24h。
其中，所述鼠尾胶原与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为60:1，三乙胺的质量与甲基丙烯酸缩水甘油酯质量相等，吐温20的浓度为0.1v/v％。
步骤一的反应结束后，在乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，12000rpm离心5min收沉淀，用PBS溶解上述沉淀，得到双键修饰的胶原溶液，双键修饰的胶原结构式如式(1)所示：
这种双键修饰的胶原是一种由甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的化合物，双键修饰的胶原主要是在胶原分子上修饰上双键，改善了其水溶性，使本只能溶于酸性环境中的胶原溶解在水相中。
步骤二：将透明质酸溶于水，加入甲基丙烯酸酐，冰上反应24h。
其中，甲基丙烯酸酐与透明质酸-NH2的摩尔比为10:1，反应过程中用5mol/L的NaOH溶液维持溶液的pH值在8左右。
步骤二反应结束后，在乙醇中沉淀，得白色沉淀，7000KDa截留量透析除去未反应的甲基丙烯酸酐，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥2d，获得双键修饰的透明质酸，双键修饰的透明质酸的结构式如(2)所示：
这种双键修饰的透明质酸是由甲基丙烯酸酐修饰的化合物，其接枝率为65％。
步骤三：将上述双键修饰的胶原配成浓度不低于3mg/mL的PBS溶液，加入上述双键修饰的透明质酸，透明质酸的浓度为3％，再加入不低于0.5％的光引发剂I2959，在365nm紫外光光强不低于7mW/cm2下光照交联3min；其中，双键化修饰的胶原与双键化修饰的透明质酸的质量比为1:10。
步骤三反应结束后，获得所述光固化水凝胶如式(3)所示：
上述步骤一至步骤三可通过图1表示。
实施例3
步骤一：将鼠尾胶原溶解于1％醋酸溶液中，并依次加入甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺、吐温20室温反应24h。
其中，所述鼠尾胶原与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为80:1，三乙胺的质量与甲基丙烯酸缩水甘油酯质量相等，吐温20的浓度为0.1v/v％。
步骤一的反应结束后，在乙醇中沉淀，得到白色絮状沉淀，12000rpm离心5min收沉淀，用PBS溶解上述沉淀，得到双键修饰的胶原溶液，双键修饰的胶原结构式如式(1)所示：
这种双键修饰的胶原是一种由甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的化合物，双键修饰的胶原主要是在胶原分子上修饰上双键，改善了其水溶性，使本只能溶于酸性环境中的胶原溶解在水相中。
步骤二：将透明质酸溶于水，加入甲基丙烯酸酐，冰上反应24h。
其中，甲基丙烯酸酐与透明质酸-NH2的摩尔比为30:1，反应过程中用5mol/L的NaOH溶液维持溶液的pH值在8左右。
步骤二反应结束后，在乙醇中沉淀，得白色沉淀，7000KDa截留量透析除去未反应的甲基丙烯酸酐，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥2d，获得双键修饰的透明质酸，双键修饰的透明质酸的结构式如(2)所示：
这种双键修饰的透明质酸是由甲基丙烯酸酐修饰的化合物，其接枝率为90％。
步骤三：将上述双键修饰的胶原配成浓度不低于2.67mg/mL的PBS溶液，加入上述双键修饰的透明质酸，透明质酸的浓度为4％，再加入不低于0.5％的光引发剂I2959，在365nm紫外光光强不低于7mW/cm2下光照交联3min；其中，双键化修饰的胶原与双键化修饰的透明质酸的质量比为1:15。
步骤三反应结束后，获得所述光固化水凝胶如式(3)所示：
上述步骤一至步骤三可通过图1表示。
本实施例所获光固化水凝胶可作为三维培养细胞载体在组织工程中应用。
下面，通过几种项目性能测试展示本实施例所获光固化水凝胶作为细胞三维培养载体的应用优势。
性能测试一
在场环扫描电镜测试仪上测试本实施例所获光固化水凝胶内部结构及孔径大小，其操作方法包括：
将上述光固化水凝胶液氮冷冻，-50℃冷冻干燥24h，0.2mA喷金2min，扫描电镜观察水凝胶微观形貌图(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出，该光固化水凝胶微观结构多孔，孔径约100～400nm。
性能测试二
将双键修饰的透明质酸浓度为4w/v％溶于双键修饰的胶原溶液3mg/mL中，加入0.5w/v％光引发剂I2959，365nm下照射3min,成水凝胶，将该水凝胶在流变仪测试仪上测试本实施例所获光固化水凝胶的机械性能，通过流变结果图3可以看出，G’>G”且呈线性，说明已成凝胶状态。
性能测试三
本实施例所获光固化水凝胶对干细胞增殖检测
用钙黄绿素染色法和四唑盐比色法(WST法)来测定本实施例光固化水凝胶在鼠源骨髓干细胞(BMSC细胞)中的细胞存活和细胞增殖，其操作方法包括：
将双键修饰的透明质酸浓度为4w/v％溶于双键修饰的胶原溶液3mg/mL中，加入0.5w/v％光引发剂I2959，2M的NaOH溶液调整PH至7；将全培养基培养的第4代BMSC细胞消化、计数、1000rpm离心4min；将上述双键修饰的胶原与双键修饰的透明质酸混合液混合确保细胞浓度为1000万/mL；取上述细胞共混液100μL于96孔板中，365nm紫外光光强度为7mW/cm2下照射3min，干细胞与本实施例的光固化水凝胶共混，将该水凝胶转移至24孔板中，加入完全培养基，放入5％CO2、37℃培养箱中培养。
培养1d和5d后将培养基取出，PBS清洗3次，利用Live/dead试剂盒测定，在激光共聚焦488/561激发下观察细胞活性；活细胞被钙黄绿素染色发出绿色荧光，死细胞被染色发出红色荧光。
如图4所示鼠源的骨髓干细胞在本实施例所获光固化水凝胶中存活较好并显示三维结构和明显增殖，表明本发明对细胞增殖无影响且能为细胞提供三维生长环境。
培养1d和5d后将培养基取出，每孔加入1mL新鲜培养基，加入100μLWST-1充分混匀，放入5％CO2、37℃培养箱中孵育4h，取100μL于96孔板中酶标仪450nm处测试OD值。
如图5所示BMSC与本实施例所获光固化水凝胶共混后，培养1d细胞存活较好，培养5d细胞呈现明显增殖，表明本实施例所获光固化水凝胶毒性低、生物相容性好。
性能测试四
鼠源骨髓干细胞在本实施例所获光固化水凝胶中成骨分化检测
用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色法来判断干细胞的是否分化。
碱性磷酸酶常被用作成功诱导成骨分化的标志，BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
将鼠源骨髓干细胞与共混水凝胶放入5％CO2、37℃培养箱中培养，隔天换新鲜培养基(该培养基为成骨分化培养基：完全培养基+100mM地塞米松+10mMβ-甘油磷酸钠+.05mM抗坏血酸)，培养14d，取出培养基，PBS洗3次，加入碱性磷酸酶显色液室温避光孵育4h观察共混水凝胶的颜色变化。
如图6所示，与细胞共混水凝胶由无色透明变成蓝色，表明干细胞在本实施例所获光固化水凝胶三维结构中呈现分化。
性能测试五
鼠源骨髓干细胞在本实施例所获光固化水凝胶中分化检测
用碱性磷酸酶检测试剂盒测定细胞中碱性磷酸酶(ALP)含量，picogreeen荧光染色小牛胸腺DNA标准曲线法测定细胞中DNA含量，用ALP/DNA的值来表征干细胞在本实施例所获光固化水凝胶中的分化程度。
第4代鼠源骨髓干细胞分为两组：
第一组与本实施例所获光固化水凝胶共混成骨分化培养基培养作为实验组；
第二组完全培养基培养皿中培养细胞作为对照组(TCP)。
将两组细胞放入5％CO2、37℃培养箱中培养，隔天换新鲜培养基，培养14d。将本实施例所获光固化水凝胶取出加入200μL细胞裂解液4℃裂解5-6h，再次加入200μL细胞裂解液4℃裂解过夜，取50μL裂解液用作细胞内ALP含量测定，取100μL裂解液用作细胞内DNA含量测定；将对照组细胞消化、离心，加入200μL的细胞裂解液冰上裂解30min，取50μL裂解液用作细胞内ALP含量测定，取100μL裂解液用作细胞内DNA含量测定。
如图7所示与本实施例所获光固化水凝胶共混的干细胞较正常培养的干细胞有明显的分化，表明干细胞在本实施例所获光固化水凝胶三维结构上能正常分化，表示本实施例所获光固化水凝胶有非常好的生物相容性和安全性。
性能测试六
鼠源骨髓干细胞在本实施例所获光固化水凝胶生长形貌，用SEM法来观察细胞在本实施例所获光固化水凝胶中生长及分化状态。
将与细胞共混的本实施例所获光固化水凝胶分成两组：
第一组完全培养基培养；
第二组分化培养基培养。
将两组细胞放入5％CO2、37℃培养箱中培养，隔天换新鲜培养基，培养14d，弃去培养基，PBS洗3次，2.5％戊二醛固定30min，-50℃冷冻干燥，20mA喷金2min，扫描电镜观察细胞形貌。
如图8a和图8b所示细胞在本实施例所获光固化水凝胶上形貌完好，且分化培养基培养的细胞有明显的触角，表明干细胞能在本发明水凝胶三维环境中正常生长增殖和分化，表示这种水凝胶具有较好的生物相容性和安全性。
对照例1：
将透明质酸与甲基丙烯酸酐水相中反应获得双键修饰的透明质酸，将双键化的透明质酸与细胞混合，365nm紫外光照射下成水凝胶，作为三维培养细胞的载体。本对照例所获水凝胶未引入鼠尾胶原成分，难以实现干细胞在支架表面的粘附。
与对照例1相比，本发明实施例1-3所获水凝胶较上述水凝胶引入了鼠尾胶原成分，利用胶原中的多肽序列，可以提高干细胞在支架表面的粘附。
对照例2：
一般情况下，胶原难溶于水溶液，常规的做法是将胶原溶于醋酸溶液中交联形成凝胶，通过透析除去醋酸及小分子，冻干形成三维多孔支架材料。但是本对照例获得的凝胶相容性低，且不易于细胞生长，从而限制了其在生物医学中的应用。
与对照例2相比，本发明实施例1-3所获水凝胶对鼠尾胶原进行双键化修饰，修饰后的鼠尾胶原可溶于水，较上述醋酸溶液中形成的水凝胶有更广泛的生物应用，例如，本发明实现与细胞共混凝胶化，较上述三维支架材料更易于细胞生长。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明的光固化水凝胶的固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境，提高干细胞在三维支架上的粘附和增殖，并且实现成骨分化；同时制备方法简单，可大量制备。
此外，本案发明人还参照实施例1-3的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样制得了固化时间短、生物相容性好、毒性低、可给细胞提供三维生存环境的光固化水凝胶。
应当理解的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种光固化水凝胶的制备方法，其特征在于包括：
将胶原与甲基丙烯酸缩水甘油酯按照60～80：1的摩尔比混合，于15～30℃反应15～30h，获得双键修饰的胶原；
将透明质酸与甲基丙烯酸酐按照1：10～30的摩尔比混合，于0～10℃反应10～30h，获得双键修饰的透明质酸；
将所述双键修饰的胶原与双键修饰的透明质酸按照1：10～1：15的质量比于磷酸盐缓冲溶液中混合，并加入光引发剂形成光引发反应体系，之后在波长295～395nm、光强5～10mW/cm2的光照条件下反应1～5min，获得光固化水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括：将胶原溶于浓度为1～2w/v％的醋酸溶液，之后加入有机碱、表面活性剂和甲基丙烯酸缩水甘油酯，并混合均匀，获得第一混合体系，之后使所述第一混合体系于15～30℃反应15～30h，获得双键修饰的胶原；优选的，所述有机碱与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1～1.5：1；优选的，所述有机碱包括三乙胺；优选的，所述表面活性剂包括吐温20；优选的，所述表面活性剂与第一混合体系的体积比为0.05～0.15：100。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其特征在于还包括：在所述第一混合体系的反应结束后，将所获反应混合物加入乙醇中，并收集沉淀，即为双键修饰的胶原；优选的，所述乙醇与第一混合体系的体积比为10～20：1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述双键修饰的胶原的结构式如式(1)所示：
其中，Collagen为鼠尾胶原。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括：向浓度为0.5～1.5w/v％的透明质酸水溶液中加入甲基丙烯酸酐并混合均匀，形成第二混合体系，之后使所述第二混合体系在0～10℃反应10～30h，获得双键修饰的透明质酸；优选的，所述制备方法还包括：以碱性物质调节所述第二混合体系的pH值至6.5～9，之后使所述第二混合体系反应，制得双键修饰的透明质酸；优选的，所述碱性物质包括浓度为2～6mol/L的NaOH溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于还包括：在所述第二混合体系的反应结束后，将所获反应混合物加入乙醇中，并将所获沉淀以截留分子量为3500～14000KDa的透析袋透析1～3天，之后冷冻干燥，即得到双键修饰的透明质酸。
7.根据权利要求1或5或6所述的制备方法，其特征在于，所述双键修饰的透明质酸的结构式如式(2)所示：
其中，n的取值为107～196。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述光引发剂包括2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基丙酮；优选的，所述光引发反应体系中光引发剂的浓度为0.1～1w/v％，尤其优选为0.3～0.6w/v％。
9.一种光固化水凝胶，包括聚合物基质，所述聚合物基质由结构如式(3)所示的聚合物形成：
其中，n的取值为107～196，Collagen为鼠尾胶原。
10.根据权利要求9所述的光固化水凝胶，其特征在于：所述光固化水凝胶具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～400nm；优选的，所述光固化水凝胶的机械强度为17～25Pa。
11.权利要求9-10中任一项所述的光固化水凝胶于细胞培养领域中的用途；优选的，所述的用途包括：以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行细胞的培养。
12.权利要求9-10中任一项所述的光固化水凝胶于组织工程领域中的用途；优选的，所述的用途包括：以所述光固化水凝胶作为三维培养细胞载体进行干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：干细胞于所述光固化水凝胶上的负载量为100～1000万个/mL。
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