CN113304319A - 一种用于膀胱组织修复的生物材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，包括以下步骤：选择明胶，并对进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化水凝胶；选择透明质酸，并进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化透明质酸；选择和制备膀胱无细胞基质，并进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质；按比例混合上述三种材料并促使发生原位交联反应，以获得所述生物材料。本发明所获得的生物材料，其成分大部分来源于膀胱自身，保留有膀胱的生物活性因子，具备较高的生物活性以及良好的生物相容性，能够促进膀胱尿路上皮细胞、膀胱平滑肌细胞、Cajal间质细胞及人脐静脉内皮细胞的再生；与传统的生物材料相比，其力学性能更优异。

Description

一种用于膀胱组织修复的生物材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料的制备及组织工程技术领域，具体涉及一种用于膀胱组织修 复的复合生物材料及其制备方法。
背景技术
底膜是一种重要的细胞外基质，存在于所有的上皮和内皮组织中，能够维持组织的完 整性，并作为不同细胞和分子之间的屏障，将不同的组织类型进行分隔，且具有机械信号 的传导等功能。基底膜的主要成分为层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖以及 多种生长因子、细胞因子、趋化因子和蛋白酶。目前应用广泛的BME/matrigel，是一种由 上皮性肿瘤分离而来的基底膜提取物，成分类似于真正的基底膜。但BME/matrigel存在一 定的缺点：1)由于BME/matrigel是从肿瘤细胞中提取出来的，而动物和组织制备物中的肿瘤大小存在差异，因此会存在批次间的差异；2)直接成胶时还存在强度不够，孔隙大小、硬度和拉伸性无法调整等问题。
膀胱无细胞基质(BAM)是将膀胱进行脱细胞处理后得到的支架材料，具有良好的生物相 容性。动物实验证明，利用BAM进行膀胱替代后，观察到尿路上皮细胞再生良好，BAM替代 区的尿路上皮细胞和膀胱本身的尿路上皮几乎一样(中国专利200810020808.0)。但现有技 术制备的BAM仍然存在一些问题：1)平滑肌细胞再生欠佳，在BAM替代的中心区，平滑肌 细胞较稀少，排列杂乱不规则；2)在BAM的制备过程中，由于脱细胞试剂(曲拉通X-100， 脱氧胆酸纳以及十二烷基硫酸钠等)的使用不当，导致细胞外基质中生物活性因子受到较 大影响；3)现有的BAM制备技术对其超微结构的影响还不明确，膀胱脱细胞基质的孔径及 孔隙率无法人为控制。
发明内容
本发明提供了一种具有适合的多孔结构、良好的力学性能(强度、硬度和延展性)、生 物活性和生物相容性、能够促进膀胱组织修复的生物材料，兼具工艺简单、成本低、无污染等优点。本发明的另一个目的是提供该生物材料的的制备方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
选择明胶，并对所述明胶进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化水凝胶；
选择透明质酸，并对所述透明质酸进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化透明质酸；
选择和制备膀胱无细胞基质，并对所述膀胱无细胞基质进行改性处理，以获得甲基丙 烯酸酰化膀胱无细胞基质；
按比例混合所述甲基丙烯酸酰化水凝胶、所述甲基丙烯酸酰化透明质酸、所述甲基丙 烯酸酰化膀胱无细胞基质形成混合溶液；
促使所述混合溶液发生原位交联反应，以获得所述生物材料。
可选地，所述形成混合溶液包括：
将所述甲基丙烯酸酰化水凝胶和所述甲基丙烯酸酰化透明质酸按照比例混合于第一缓 冲溶液中；
将所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质置于第二缓冲溶液中；
将混合后的第一缓冲溶液加入含有所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质的第二缓冲溶 液中。
可选地，所述混合溶液中：所述甲基丙烯酸酰化水凝胶：所述甲基丙烯酸酰化透明质 酸：所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质的体积比约为2-3:1:6-7。
可选地，所述明胶的改性处理包括：将明胶在碱性环境下与改性剂反应并纯化以获得 改性明胶。
可选地，所述透明质酸的改性处理包括：将透明质酸在碱性环境下与改性剂反应并纯 化以获得改性透明质酸。
可选地，所述碱性环境包括浓度为0.1～0.25M，pH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
可选地，所述改进剂包括甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酐。
可选地，所述原位交联反应包括光致交联反应或温度致交联反应。
可选地，还包括对所述生物材料进行灭菌的步骤。
本发明还提出一种用于膀胱组织修复的生物材料，依据本发明所提出的制备方法所制 备。所述生物材料的成分包含甲基丙烯酸酰化水凝胶(Gel-MA)、甲基丙烯酸酰化透明质酸 (HA-MA)、甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质(BAM-MA)。
可选地，所述甲基丙烯酸酰化水凝胶是一种改性后的明胶。
可选地，所述甲基丙烯酸酰化透明质酸是一种改性后的透明质酸。
可选地，所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质为一种改性后的、多孔的保留有生物活 性因子的膀胱无细胞基质。
可选地，所述生物活性因子包括VEGF，bFGF，PDGF-BB，TGFβ1，KGF，EGF，BMP4等。
可选地，在制备本发明的生物材料时，所述Gel-MA、HA-MA及BAM-MA的混合比例为2-3:1:6-7(体积比)。
可选地，所述Gel-MA、HA-MA及BAM-MA的混合方式为：先将Gel-MA和HA-MA按3:1(V/V)进行混匀，然后将混合液缓慢加入BAM-MA中。本发明所提供的生物材料的制备方 法及所获得的生物材料，其成分大部分来源于膀胱自身，保留有膀胱的生物活性因子，具 备较高的生物活性以及良好的生物相容性，能够促进膀胱尿路上皮细胞、膀胱平滑肌细胞、Cajal间质细胞及人脐静脉内皮细胞的再生；并且与传统的生物材料相比，其力学性能更优异，主要表现为强度更佳、拉伸性能更好；该生物材料可作为一种良好的补材对受损和病变膀胱进行修复，对于膀胱疾病的治疗具有重大的应用价值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式 进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了 使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以 下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。以下各个实 施例的划分是为了描述方便，不应对本发明的具体实现方式构成任何限定，各个实施例在 不矛盾的前提下可以相互结合相互引用。
实施例1
本发明提出一种用于膀胱组织修复的生物材料，所述生物材料的成分包含甲基丙烯酸 酰化水凝胶(Gel-MA)、甲基丙烯酸酰化透明质酸(HA-MA)、甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基 质(BAM-MA)。
具体地，甲基丙烯酸酰化水凝胶是一种改性后的明胶；甲基丙烯酸酰化透明质酸是一 种改性后的透明质酸；甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质为一种改性后的、多孔的保留有生 物活性因子的膀胱无细胞基质；其中，生物活性因子包括VEGF，bFGF，PDGF-BB，TGFβ1，KGF，EGF，BMP4等。
在制备本发明的生物材料时，所述Gel-MA、HA-MA及BAM-MA的混合比例为3:1:6(体积比)。
作为本发明更进一步的方案：所述Gel-MA、HA-MA及BAM-MA的混合方式为：先将Gel-MA 和HA-MA按3:1(V/V)进行混匀，然后将混合液缓慢加入BAM-MA中。
实施例2
本发明还提供了实施例1的生物材料的制备方法，包括如下步骤：
选择明胶，并对所述明胶进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化水凝胶；
选择透明质酸，并对所述透明质酸进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化透明质酸；
选择和制备膀胱无细胞基质，并对所述膀胱无细胞基质进行改性处理，以获得甲基丙 烯酸酰化膀胱无细胞基质；
按比例混合所述甲基丙烯酸酰化水凝胶、所述甲基丙烯酸酰化透明质酸、所述甲基丙 烯酸酰化膀胱无细胞基质形成混合溶液；
促使所述混合溶液发生原位交联反应，以获得所述生物材料。具体地，依照本发明的 一个方面，所述明胶的改性处理包括：将明胶在碱性环境下与改性剂反应并纯化以获得改 性明胶；所述碱性环境包括以碱性缓冲液来提供，所述碱性缓冲液包括浓度为0.1～0.25M， pH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液等，所述改性剂包括甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酐等，所 述纯化包括使用透析、冻干等方法。
依照本发明的另一个方面，所述透明质酸的改性处理包括：将透明质酸在碱性环境下 与改性剂反应并纯化以获得改性透明质酸；所述碱性环境包括以碱性缓冲液来提供，所述 碱性缓冲液包括浓度为0.1～0.25M，pH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液等，所述改性剂包 括甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酐等，所述纯化包括使用乙醇沉淀、脱水、真空干燥等方法。
依照本发明的另一个方面，所述膀胱无细胞基质的制备及改性方法包括如下步骤：
a)将动物(非人)的正常膀胱和部分尿道置于缓冲液中，迅速带到实验室后仔细去除 外表面的脂肪和浆膜组织，经尿道插入输液皮条导管并将其用丝线固定在尿道上，然后经 此输液皮条导管用缓冲液冲洗膀胱，将膀胱腔内的尿液冲洗干净；其中，该缓冲液比如是 10mMTris-Hcl，pH 7.0，含1mM氯化镁，1mM氯化钙和150mM氯化钠。
b)经输液皮条导管向膀胱腔内灌入消化液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸 入此消化液中，室温中振荡消化，然后倒出此消化液；其中，该消化液例如是含有0.25％ 胰蛋白酶的消化液。
c)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
d)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入低渗缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱 完全浸入此低渗缓冲液中，静置过夜，然后倒出此低渗缓冲液；其中，该低渗缓冲液比如 是10mMTris-Hcl缓冲液，pH 7.5,含1mM氯化钙。
e)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；其中，该缓冲液例如是10mMTris-Hcl，pH 7.5，含1mM氯化镁，1mM氯化钙和150mM氯化钠。
f)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入含表面活性剂的高渗缓冲液，夹闭输液皮条导管， 再将整个膀胱完全浸入此含表面活性剂的高渗缓冲液中，室温中振荡洗涤，然后倒出此含 表面活性剂的高渗缓冲液；其中，该高渗缓冲液例如是50mMTris-Hcl，pH 7.5，含500mM 氯化钠，5mM EDTA,1％Triton-100。
g)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
h)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入含核酸酶的缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整 个膀胱完全浸入此含核酸酶的缓冲液中，室温中振荡洗涤，然后倒出此含核酸酶的缓冲液， 得到膀胱无细胞基质；其中，该核酸酶的缓冲液例如是10mM Tris-Hcl，pH 7.5，含1mM氯 化镁，1mM氯化钙和150mM氯化钠，50U/ml I型脱氧核糖核酸酶。
i)将上述的膀胱无细胞基质用缓冲液冲洗；其中，该缓冲液例如是10mM Tris-Hcl，pH 7.0，含1mM氯化镁，1mM氯化钙和150mM氯化钠。j)将上述的膀胱无细胞基质用去离子水 冲洗；
k)将上述的膀胱无细胞基质置于深低温冰箱中冷冻，再在冷冻干燥机中冻干，得到冻 干的膀胱无细胞基质；
l)将上述的冻干的膀胱无细胞基质进行灭菌，得到无菌的膀胱无细胞基质；
m)将膀胱无细胞基质(BAM)在碱性环境下与改性剂反应并纯化以获得改性膀胱无细胞 基质(BAM)，所述碱性环境包括以碱性缓冲液来提供，所述碱性缓冲液包括浓度为0.1～ 0.25M，pH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液等，所述改性剂包括甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酐 等，所述纯化包括使用透析、冻干等方法。
依照本发明的另一个方面，所述三种材料的混合及成型包括：将Gel-MA与HA-MA按比 例混合于缓冲液中；将混合液缓慢加入BAM-MA中，轻柔操作使混合液均匀分布于BAM-MA； 三种材料的原位交联反应。
作为一种选择，所述缓冲液包括10mM Tris-Hcl，pH 7.0-8.0，含1mM氯化镁，1mM氯化钙和150mM氯化钠；或浓度为0.1～0.25mol，pH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
作为一种选择，所述原位交联反应包括光致交联反应、温度致交联反应和引入交联剂。
进一步地，所述光致交联反应包括使用波长为320～480nm(该波段包含紫外光与蓝光)、 光强为5～100mw/cm2的紫外光以及蓝光波段，照射30s～300s。
进一步地，所述温度致交联反应包括将经过光致交联反应处理后的材料置于37℃条 件下1小时进行进一步交联。
进一步地，所述交联剂包括二价离子盐溶液，该二价离子盐溶液例如为氯化钙、氯化 锌。
依照本发明的另一个方面，所述生物材料的灭菌及贮存包括：环氧乙烷灭菌；生物材 料的低温密封保存。
进一步地，所述环氧乙烷灭菌的方法为将生物材料置于环氧乙烷灭菌装置内，插入一 支环氧乙烷灭菌专用剂(内含100％环氧乙烷)，工作温度设置为37℃，工作湿度设置为30％， 灭菌时间设置为4h，解析时间为6h。
进一步地，所述低温密封保存条件为-20℃至4℃。
实施例3
为了验证本发明所提出的生物材料的实际应用，本实施例给出具体应用实例。
应用例1：细胞接种实验：
首先将冻干且无菌的0.6×0.6cm2大小的生物材料放到超低吸附24孔板中；
分别调整膀胱尿路上皮细胞SV-HUC-1密度为5×105个/ml、Cajal间质细胞密度为5×105个/ml、膀胱平滑肌细胞HBdSMC密度为1×107个/ml、人脐静脉内皮细胞HUVEC密度 为5×106个/ml；
分别取100μl细胞悬液加入到不同的生物材料上，使其慢慢水化，只加入培养基而没 有细胞的生物材料作为对照孔，于37℃、5％CO2条件下培养1小时使细胞黏附；
将有细胞或无细胞的生物材料转移到T25的培养瓶中，加入10ml培养基，并将培养瓶 保持直立，继续培养，此后每日更换培养基；
分别于培养1天和培养3天后，取出生物材料，用OCT包埋剂进行包埋，在冰冻切片机内切片(5μm)后HE染色，观察细胞侵入生物材料及在其中的空间分布情况。
结果表明，接种SV-HUC-1、ICC以及HBdSMC并培养1天后，三种细胞均开始向生物材料中心侵入；培养3天后，三种细胞均匀地分布在生物材料中，部分区域还形成细胞团块。接种HUVEC之后1天，HUVEC也快速地向生物材料中心区侵入；培养3天后，HUVEC较均匀 的分布在生物材料中，并形成小管状样结构。
应用例2：制备贴片进行膀胱修复：
按照应用例1中的步骤制备大小为0.6×0.6cm2、培养有多种细胞(SV-HUC-1、ICC、HBdSMC和HUVEC)的生物材料贴片；
准备一个新鲜完整的猪膀胱，利用手术剪等工具在其侧面位置抠出一个0.6×0.6cm2大小的缺口；
采用医用胶将贴片粘合于猪膀胱缺口处，将猪膀胱浸泡于培养基中并于37℃、5％CO2 条件下静置3天；
3天后人工去除医用胶，向猪膀胱中加入一定量的水使其达到充盈状态，随后并没有出 现漏水问题，表明本发明所提供的生物材料可以作为一种膀胱修复的补材。
本发明所提供的生物材料的制备方法及所获得的生物材料，其成分大部分来源于膀胱 自身，保留有膀胱的生物活性因子，具备较高的生物活性以及良好的生物相容性，能够促 进膀胱尿路上皮细胞、膀胱平滑肌细胞、Cajal间质细胞及人脐静脉内皮细胞的再生；并且 与传统的生物材料相比，其力学性能更优异，主要表现为强度更佳、拉伸性能更好；该生 物材料可作为一种良好的补材对受损和病变膀胱进行修复，对于膀胱疾病的治疗具有重大 的应用价值。

Claims (10)

1.一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
选择明胶，并对所述明胶进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化水凝胶；
选择透明质酸，并对所述透明质酸进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化透明质酸；
选择和制备膀胱无细胞基质，并对所述膀胱无细胞基质进行改性处理，以获得甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质；
按比例混合所述甲基丙烯酸酰化水凝胶、所述甲基丙烯酸酰化透明质酸、所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质形成混合溶液；
促使所述混合溶液发生原位交联反应，以获得所述生物材料。
2.根据权利要求1所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，所述形成混合溶液包括：
将所述甲基丙烯酸酰化水凝胶和所述甲基丙烯酸酰化透明质酸按照比例混合于第一缓冲溶液中；
将所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质置于第二缓冲溶液中；
将混合后的第一缓冲溶液加入含有所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质的第二缓冲溶液中。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中：所述甲基丙烯酸酰化水凝胶：所述甲基丙烯酸酰化透明质酸：所述甲基丙烯酸酰化膀胱无细胞基质的体积比约为2-3:1:6-7。
4.根据权利要求1所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，所述明胶的改性处理包括：将明胶在碱性环境下与改性剂反应并纯化以获得改性明胶。
5.根据权利要求1所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，所述透明质酸的改性处理包括：将透明质酸在碱性环境下与改性剂反应并纯化以获得改性透明质酸。
6.根据权利要求4或5所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，所述碱性环境包括浓度为0.1～0.25M，pH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
7.根据权利要求4或5所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，所述改进剂包括甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酐。
8.根据权利要求1所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，所述原位交联反应包括光致交联反应或温度致交联反应。
9.根据权利要求1所述的一种用于膀胱组织修复的生物材料的制备方法，其特征在于，还包括对所述生物材料进行灭菌的步骤。
10.一种用于膀胱组织修复的生物材料，其特征在于，所述生物材料依据权利要求1-9项任一制备方法所制备。
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