CN107998450B - 人工皮肤及人工皮肤的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于皮肤创面修复的人工皮肤及其制备方法和应用。所述人工皮肤的制备方法包括制备天然高分子溶液,制备改性生物可降解高分子材料及溶液,由天然高分子溶液和改性生物可降解高分子溶液混合制成复合凝胶,再将制得的复合凝胶通过三维打印制得所述人工皮肤。所述人工皮肤具有三维网络多孔结构,有利于皮肤细胞的粘附、增殖、长入以及血管化形成。所述人工皮肤需要在磷酸盐缓冲液,或生理盐水中溶胀后使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域,尤其涉及一种应用于皮肤缺损修复领域的人工皮肤及其制备方法。
背景技术
皮肤组织是人体最大的器官,也是人体与外界环境直接接触的第一道屏障。严重皮肤创伤或烧伤导致的皮肤缺损通常难以自行修复以恢复原有的形态和功能,通过手术植入皮肤替代物可以加快愈合速度,提高愈合质量。国内外已有多个人工皮肤替代物应用于临床,包括Apligraf、Integra、Dermafen、Dermagraft、Transcyte、Alloderm、Lyphoderm、Biobrane、Pelnac、安体肤、兰度双层人工皮肤等。人工皮肤替代物的使用使急性创面愈合的速度较传统治疗方法提前了2-5天,也使过去一些久治不愈的慢性难愈合创面的愈合率由既往的60%上升至90%。然而,对于提高创面愈合质量,即减少瘢痕形成和促进皮肤附属器再生,目前的人工皮肤替代物仍显得无能为力,成为临床医生、材料学家、生物学家等迫切需要解决的难题。因此,开发一种新的,有利提高创面愈合质量的人工皮肤替代物具有十分重要的意义。
传统成型技术制备的水凝胶呈块状,吸水后体积膨胀,会对周边组织的神经血管产生额外的压力。同时,块状材料较低的比表面积也不利于细胞迁移长入。而三维打印技术可以实现个性化和精细化成型,制备既定尺寸和厚度的个性化支架。通过改变挤出针管的纤维直径和间隔宽度可以控制其孔径和降解速率。同时,支架中均一的通道能够保证营养物质、氧气、代谢产物等及时交换,有利于细胞向材料内部迁移以及早期血管化,保持细胞正常的增殖行为和代谢功能,促进受损组织快速、有效修复。
发明内容
鉴于上述状况,本发明提供一种应用于皮肤缺损修复领域的人工皮肤及其制备方法。
一种人工皮肤的制备方法,其包括如下步骤:
A.制备天然高分子溶液,所述天然高分子溶液所使用的天然高分子材料为丝胶蛋白、丝素蛋白、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白中的一种或几种组合;
B.制备改性生物可降解高分子材料,所述改性生物可降解高分子材料为甲基丙烯酸或甲基丙烯酸衍生物修饰改性的胶原、明胶、多肽或葡聚糖等中的一种或几种组合;
C.制备改性生物可降解高分子溶液,将步骤B中得到的改性生物可降解高分子材料溶解后得到所述改性生物可降解高分子溶液;
D.制备复合凝胶,将步骤A中得到的天然高分子溶液与步骤C中得到的改性生物可降解高分子溶液混合,制得所述复合凝胶;
E.三维打印人工皮肤,将步骤D中得到的复合凝胶用于三维打印,制得人工皮肤。
优选地,制备所述丝胶蛋白溶液或所述丝素蛋白溶液包括:将蚕茧溶解,取上清液,从上清液中提取丝胶蛋白或丝素蛋白溶液;通过减少溶液中水的含量将提取出的丝胶蛋白或丝素蛋白溶液进一步浓缩。
优选地,制备所述丝胶蛋白溶液进一步包括:所述将蚕茧溶解包括用溴化锂溶液溶解所述蚕茧,所述从上清液中提取丝胶蛋白或丝素蛋白溶液为丝胶蛋白的溴化锂溶液;所述丝胶蛋白的溴化锂溶液与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液混合并透析,得到丝胶蛋白溶液;所述进一步浓缩是用聚乙二醇对溶液进行浓缩。
优选地,制备所述丝素蛋白溶液进一步包括:所述将蚕茧溶解包括用碳酸钠溶液对蚕丝脱胶数次,弃去使用过的碳酸钠溶液,然后用氯化钙溶液溶解脱胶后的蚕丝,得到丝素蛋白溶液;用滤膜过滤所述丝素蛋白溶液,以除去所述丝素蛋白溶液中的Ca离子和Cl离子,直至硝酸银溶液检测滤液中Cl离子完全去除;所述进一步浓缩是用聚乙二醇对溶液进行浓缩。
优选地,制备所述硫酸软骨素溶液包括:将硫酸软骨素溶解于磷酸盐缓冲溶液中,超声分散。
优选地,制备所述改性生物可降解高分子材料包括:用于制备所述改性生物可降解高分子材料的高分子材料为胶原、明胶、多肽、葡聚糖中的一种或几种组合,将所述高分子材料溶解形成高分子材料溶液;在所述高分子材料溶液中滴加甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液来实现分子修饰改性,透析纯化后经冷冻干燥制得所述改性生物可降解高分子材料。
优选地,制备所述改性生物可降解高分子溶液包括:将所述改性生物可降解高分子材料溶解于去离子水,或醋酸溶液,或磷酸盐缓冲溶液中。
优选地,制备所述复合凝胶包括:配制2-20%的改性生物可降解高分子溶液,加入0.2-1.2%的光引发剂,将2~6%的天然高分子溶液与所述改性生物可降解高分子溶液等体积混合,充分混匀,静置备用。
优选地,所述三维打印人工皮肤包括:构建三维结构模型;利用点胶机控制气体压力挤出复合凝胶形成纤维,并用紫外光辐射固化成型;打印结束后的产品用酒精浸泡,增加复合凝胶的结晶度,然后经过冷冻干燥制得干型人工皮肤。
优选地,所述点胶机控制的气压范围为10~50kPa,所述纤维的直径为80-400μm,所述点胶机的移动速率为1-20mm/s,所述纤维间距100-500μm,层高100-2000μm。
一种人工皮肤,所述人工皮肤具有三维网络多孔结构,所述人工皮肤由以上所述的人工皮肤的制备方法制得,所述人工皮肤中的复合凝胶中的天然高分子材料与改性生物可降解高分子材料的比例在2:1~1:4之间。
一种人工皮肤的应用方法,人工皮肤在磷酸盐缓冲液,或生理盐水中溶胀后使用。
由于本发明的人工皮肤使用的原材料是天然高分子材料和可降解高分子材料,并通过三维打印制得,使人工皮肤具有三维网络多孔结构,所以本发明的人工皮肤能促使受损皮肤快速修复,具有良好的生物相容性、机械性能和可降解性,在愈合期间能够维持良好的形态。并且所述人工皮肤三维结构中的均一孔道能够保证培养基中营养物质以及代谢产物、氧气和二氧化碳的及时交换,有助于细胞深入人工皮肤的三维结构进行增殖、分化以及血管化。人永生化角质形成细胞和人成纤维细胞在三维网络多孔结构上能够按照共培养的模式,基本呈现分层生长。
具体实施方式:
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,以进一步阐述本发明。显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种人工皮肤的制备方法,其步骤包括:制备天然高分子溶液,所述天然高分子溶液所使用的天然高分子材料为丝胶蛋白、丝素蛋白、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白中的一种或几种组合;制备改性生物可降解高分子材料,所述改性生物可降解高分子材料为甲基丙烯酸或甲基丙烯酸衍生物修饰改性的胶原、明胶、多肽或葡聚糖等中的一种或几种组合;将所述改性生物可降解高分子材料溶解后得到所述改性生物可降解高分子溶液,溶解所述改性生物可降解高分子材料的溶剂为去离子水、醋酸溶液或磷酸盐缓冲溶液中的一种;将所述天然高分子溶液与所述改性生物可降解高分子溶液混合,制得复合凝胶;三维打印人工皮肤,将所述复合凝胶用于三维打印,制得人工皮肤。所述人工皮肤中的复合凝胶中的天然高分子材料与改性生物可降解高分子材料的比例在2:1~1:4之间。
三维打印参数:气压范围为10~50kPa,纤维的直径为80-400μm,移动速率为1-20mm/s,纤维间距100-500μm,层高100-2000μm。
制备所述复合凝胶包括:配制2-20%的改性生物可降解高分子溶液,加入0.2-1.2%的光引发剂,将2~6%的天然高分子溶液与所述改性生物可降解高分子溶液等体积混合,充分混匀,静置备用。
下面通过实施例来对本发明的人工皮肤的制备方法进行具体说明。
实施例1
(1)制备天然高分子溶液。
在本实施例中,所述天然高分子溶液为丝胶蛋白溶液。
称取1g蚕茧,剪碎,溶于40mL 6mol/L的溴化锂(LiBr)溶液中。在37℃水浴下搅拌溶解24h。用离心机以4000rpm的速度将混合物离心10min,过滤上清液,除去不溶性物质。在所述上清液中加入10mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris-HCl),所述Tris-HCl溶液的物质的量浓度为1mol/L,其pH值为9.0。将所述上清液与所述Tris-HCl溶液的混合溶液转入预处理好的截留分子量为3500道尔顿(Dalton,Da)的透析袋中。将所述混合溶液的透析袋放在含有超纯水的大容器中透析48h,每隔6h换水。每次换水将超纯水的pH调节至6.5~7.0以防止丝胶蛋白凝聚。透析后溶液若出现有沉淀,即离心滤除沉淀物,最后收集澄清丝胶蛋白溶液,用分子量为6000的聚乙二醇(polyethylene glycol 6000,PEG6000)浓缩至质量百分比浓度2%~4%的丝胶蛋白溶液。用干燥法测定浓缩后的丝胶蛋白溶液的浓度,然后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)法检测浓缩后的丝胶蛋白溶液中的丝胶蛋白分子量。在制备复合凝胶之前,将丝胶蛋白溶液置于4℃冰箱中保存待用,两天内需使用。
(2)制备改性生物可降解高分子材料。
在本实施例中,所述改性生物可降解高分子材料为分子修饰改性明胶。
取10g猪皮来源的明胶,在100mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液(phosphate buffersaline,PBS)(50℃水浴)中充分溶解至溶液透明,得到明胶溶液。按0.5mL/min的速率滴加3mL甲基丙烯酸酐溶液至所述明胶溶液中,在50℃下反应4h。加400mL pH 7.4的PBS缓冲液终止反应。将溶液转入截留分子量为14kDa的透析袋中,用超纯水(40℃)透析4天,每隔6h换水。溶液经冷冻干燥得到甲基丙烯酸接枝改性明胶,经核磁共振氢谱测得甲基丙烯酸接枝率为16%。所述甲基丙烯酸接枝改性明胶即为所述分子修饰改性明胶。
(3)制备改性生物可降解高分子溶液。
在本实施例中,所述改性生物可降解高分子溶液为分子修饰改性明胶溶液,溶解所述改性生物可降解高分子材料的溶剂为去离子水。
将步骤(2)中制得的甲基丙烯酸接枝改性明胶置于适量去离子水中,加热至50℃,搅拌直至溶解,加入一定量的去离子水配制成质量百分比浓度20%的分子修饰改性明胶溶液。
(4)制备复合凝胶。
在本实施例中,所述复合凝胶为丝胶蛋白/明胶复合凝胶。
将质量百分比浓度3%的由步骤(1)制得的丝胶蛋白溶液和质量百分比浓度20%的由步骤(3)制得的分子修饰改性明胶溶液按照不同的体积比(1:1,1:2,1:3,1:4)充分混合,加入质量百分比浓度0.4~0.8%的光引发剂,搅拌溶解。注入打印针筒中,置于4℃,避光保存2小时,然后取出针筒观察是否能挤出纤维,以及挤出纤维能否保持较稳定形态。如果打印针筒能够挤出纤维并且挤出的纤维能够保持较稳定的形态,则复合凝胶制备完成;如果打印针筒不能挤出纤维,则需继续避光保存。制得复合凝胶后,用紫外辐照灯照射30~120s,观察材料的交联固化情况。选择合适比例以及适宜的紫外光辐照时间的实验组进行后述人工皮肤的三维打印成型。
(5)三维打印人工皮肤。
在本实施例中,首先进行三维建模,编写人工皮肤的整体参数以及打印喷嘴的移动路径,利用AutoCAD来构建支架的三维木堆结构模型,以便控制气浮平台的三轴运动。三维模型具体参数设置为:纤维直径为130μm,纤维间距为200×200μm2(X,Y方向),层高为130μm,模型边长为10×10mm2(X,Y方向),层数10层。采用自行组装的三维打印系统,将预先装了由步骤(4)制得的复合凝胶的打印针筒接上喷嘴,固定在三轴联动的支架上,在20℃常温环境中按预先编写好的路径进行层层打印,利用点胶机控制气体压力挤出针筒内的复合凝胶,形成纤维,并同时辅以紫外光辐照交联固化成型。用于复合凝胶成型的气压范围为10~25kPa,在本实施例中打印喷嘴为圆锥状,在其他实施例中,打印喷嘴也可以是其他形状,所述打印喷嘴的直径为150μm,移动速率为10~15mm/s,三维打印的纤维间距180×180μm2,层高110μm。人工皮肤的三维结构实际尺寸约为10×10×1mm3。
用复合凝胶打印成型后的产品相继用50%、75%、90%、100%的酒精分别浸泡10min,增加复合凝胶结晶度,最后经低温冷冻干燥法制得干型人工皮肤待用。
实施例2
(1)制备天然高分子溶液。
在本实施例中,所述天然高分子溶液为丝素蛋白溶液。
称取1g的蚕丝,投入到固液比为1∶50(g/mL),质量分数分别为0.4%的碳酸钠溶液中,煮沸脱胶两次,每次脱胶时间为30min,第一次脱胶后用自来水进行清洗,第二次用去离子水充分清洗干净。
在温度为100℃,固液比为1∶10(g/mL),时间为10min的条件下,将脱胶后的蚕丝投入到质量分数为50%的氯化钙溶液中,待溶解结束后取上清液,得到含有丝素蛋白的溶液。
将含有丝素蛋白的溶液离心、过滤去除不溶物,然后用滤膜过滤以除去溶液中的Ca、Cl等离子,本实施例所使用的滤膜为截留分子量为1000(molecular weight cutoff=1000,MWCO=1000)的超滤膜。用AgNO3溶液检测滤液中Cl离子是否完全去除,得到无色、无臭、无味的丝素蛋白溶液。继而用PEG 6000将丝素蛋白溶液浓缩至质量百分比为2%~4%的浓度。用干燥法测定浓缩后的丝素蛋白溶液浓度,然后用SDS-PAGE法检测浓缩后的丝素蛋白溶液中的丝素蛋白分子量。然后将制得的丝素蛋白溶液置于4℃冰箱中保存待用,两天内需使用。
(2)制备改性生物可降解高分子材料。
在本实施例中,所述改性生物可降解高分子材料为分子修饰改性明胶,其制备方法和实施例1相同。
(3)制备改性生物可降解高分子溶液。
在本实施例中,所述改性生物可降解高分子溶液为分子修饰改性明胶溶液,其制备方法和实施例1相同。
(4)制备复合凝胶。
在本实施例中,所述复合凝胶为丝素蛋白/明胶复合凝胶。
将质量百分比浓度2.6%的由步骤(1)制得的丝素蛋白溶液和质量百分比浓度20%的由步骤(3)制得的分子修饰改性明胶溶液按照不同的体积比(2:1,1:1,1:2,1:3)充分混合,加入质量百分比浓度0.3~0.6%的光引发剂,搅拌溶解。注入打印针筒中,置于4℃,避光保存2小时待用。取出针筒观察是否能挤出纤维,以及挤出纤维能否保持较稳定形态。如果打印针筒能够挤出纤维并且挤出的纤维能够保持较稳定的形态,则复合凝胶制备完成;如果打印针筒不能挤出纤维,则需继续避光保存。制得复合凝胶后,用紫外辐照灯照射30~120s,观察复合凝胶的交联固化情况。选择合适比例以及适宜的紫外光辐照时间的实验组进行后述人工皮肤的三维打印成型。
(5)三维成型所述人工皮肤支架。
编写人工皮肤的整体参数以及打印喷嘴的移动路径,在本实施例中,具体参数设置为:纤维直径为150μm,纤维间距为230×230μm2(X,Y方向),层高为150μm,支架边长为10×10mm2(X,Y方向),层数20层。将预先装了由步骤(4)制得的复合凝胶的打印针筒接上喷嘴,固定在三轴联动的支架上,在20℃常温环境中按预先编写好的路径进行层层打印,利用点胶机控制气体压力挤出针筒内的复合凝胶,形成纤维,并同时辅以紫外光辐照交联固化。气压范围为20~35kPa,在本实施例中打印喷嘴为圆柱状,在其他实施例中打印喷嘴也可以是其他形状,所述打印喷嘴的直径为160μm,移动速率为5~10mm/s,纤维间距200×200μm2,层高120μm。人工皮肤的三维结构实际尺寸约为10×10×2mm3。
打印成型后的产品用75%的酒精分别浸泡10min,增加复合凝胶的结晶度,最后经低温冷冻干燥法干燥待用。
实施例3
(1)制备天然高分子溶液。
在本实施例中,所述天然高分子溶液为硫酸软骨素溶液。
将硫酸软骨素溶解于pH为7.4的PBS溶液中,制成质量百分比浓度为6%的溶液,超声分散,得到硫酸软骨素溶液。
(2)制备改性生物可降解高分子材料。
在本实施例中,所述改性生物可降解高分子材料为分子修饰改性胶原。
取20g质量百分比浓度2.6%的胶原蛋白凝胶,向溶液中缓慢加入1.2mL三乙胺,边滴加边搅拌,直至胶原溶解呈澄清溶液,将3mL甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液以0.5mL/min的速率缓慢滴加至上述胶原溶液中,常温下反应8h。用0.2%的醋酸调节pH值至6.8,终止反应。将溶液转入截留分子量为14kDa的透析袋中,用超纯水透析4天,每隔6h换水。最后透析完成后的溶液经低温冷冻干燥得到甲基丙烯酸接枝改性胶原,经核磁共振氢谱测得甲基丙烯酸接枝率为13%。所述甲基丙烯酸接枝改性胶原即为所述分子修饰改性胶原。
(3)制备改性生物可降解高分子溶液。
在本实施例中,所述生物可降解高分子溶液为分子修饰改性胶原溶液,溶解所述生物可降解高分子材料的溶剂为醋酸溶液。
将步骤(2)制得的甲基丙烯酸接枝改性胶原溶于0.2%的醋酸溶液,制成质量百分比浓度2.8%的甲基丙烯酸接枝改性胶原溶液。所述甲基丙烯酸接枝改性胶原溶液及为所述分子修饰改性胶原溶液。
(4)制备复合凝胶。
在本实施例中,所述复合凝胶为硫酸软骨素/胶原复合凝胶。
将质量百分比浓度6%的由步骤(1)制得的硫酸软骨素溶液和质量百分比浓度2.8%的由步骤(3)制得的分子修饰改性明胶溶液按照不同的体积比(1:1,1:2,1:3)充分混合,加入质量百分比浓度0.2~0.4%的光引发剂,搅拌溶解。将混合后的溶液注入打印针筒中,置于4℃,避光保存过夜待用。取出针筒观察是否能挤出纤维,以及挤出纤维能否保持较稳定形态。如果打印针筒能够挤出纤维并且挤出的纤维能够保持较稳定的形态,则复合凝胶制备完成;如果打印针筒不能挤出纤维,则需继续避光保存。制得复合凝胶后,用紫外辐照灯照射30~120s,观察材料的交联固化情况。选择合适比例以及适宜的紫外光辐照时间的实验组进行后述支架的三维打印成型。
(5)三维打印人工皮肤。
编写人工皮肤的整体参数以及打印喷嘴的移动路径,在本实施例中,具体参数设置为:纤维直径为130μm,纤维间距为200×200μm2(X,Y方向),层高为130μm,支架边长为15×15mm2(X,Y方向),层数20层。将预先装了由步骤(4)制得的复合凝胶的打印针筒接上喷嘴,固定在三轴联动的支架上,在20℃常温环境中按预先编写好的路径进行层层打印,利用点胶机控制气体压力挤出针筒内的复合凝胶,形成纤维,并同时辅以紫外光辐照交联。气压范围为15~35kPa,打印喷嘴为圆柱状,直径为140μm,移动速率为10~20mm/s,纤维间距220×220μm2,层高120μm。人工皮肤的三维结构实际尺寸约为10×10×2.1mm3。
实施例4
(1)制备改性生物可降解高分子材料。
在本实施例中,所述改性生物可降解高分子材料为分子修饰可生物降解多肽。
可生物降解多肽可根据具体需求设计不同长度和氨基酸组成的多肽序列,序列中至少含有具有自组装形成纳米纤维水凝胶的多肽段和促细胞粘附多肽段(参考专利“止血材料及其制备方法和应用”,专利号:201511022802.3),本实施例的多肽以
H2N-VEAKVEAKVEAKGRGDS-OH序列为例,参考专利“止血材料及其制备方法和应用,专利号:201511022802.3”制备而成,具体描述如下:
取1.0g的2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度0.88mmol/g,1%二乙烯基苯,divinylbenzene,DVB)于固相合成柱中,用8mL DMF溶胀1小时,排出DMF溶剂。取10mL含0.63g FMOC-Ser(tBu)-OH的DMF溶液加入上述溶胀后的树脂中,继续加入1.0mL DIEA,搅拌反应1.5小时,排出反应液,用10mL二甲基甲酰胺(N-dimetylformamide,DMF)洗涤四次。
取8mL浓度为20%的哌啶(Piperidine)/DMF溶液加入上述反应柱中,反应20分钟,脱除氨基端的FMOC保护基,用10mL DMF洗涤四次,继续加入12mL含0.67g FMOC-Asp(OtBu)-OH、0.75g HBTU、0.26g HOBt和0.5mL N,N-二异丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine,DIEA)的DMF溶液,搅拌反应2小时,排出溶剂,用10mL DMF洗涤四次。取1mL 10mg/mL的茚三酮/甲醇溶液加入到上述的少量树脂中,加热煮沸数分钟,呈无色,表明缩合完全,继续延长肽链,反之,继续进行氨基酸缩合步骤。重复上述FMOC脱除步骤、氨基酸缩合步骤、以及茚三酮检色步骤延长肽链至N端氨基酸缩合完成,并脱除FMOC端基。加入10mL含1.2mL甲基丙烯酸酐和1.5mL DIEA的DMF溶液,搅拌反应3小时,排出溶剂,用10mL DMF洗涤四次。取1mL10mg/mL的茚三酮/甲醇溶液加入到上述的少量树脂中,加热煮沸数分钟,呈无色,表明缩合完全,反之,继续进行上述甲基丙烯酸酐缩合步骤。
将上述连接多肽的固相树脂经二氯甲烷洗涤四次,于常温下真空干燥24小时,继而加入30mL的三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/水(体积比为95:2.5:2.5),反应1.5小时,收集滤液及TFA洗涤液,浓缩后用冷乙醚沉淀,抽滤、洗涤、干燥后得到白色粉末,用一定体积的去离子水溶解、经反向高效液相色谱分离,低温冷冻干燥得到所述分子修饰可生物降解多肽。
(2)制备改性生物可降解高分子溶液。
在本实施例中,所述改性生物可降解高分子溶液为分子修饰改性多肽溶液。
将步骤(1)制得的分子修饰可生物降解多肽溶解于pH为7.4的PBS溶液中,制成质量百分比浓度2.0%的分子修饰改性改性多肽溶液。
(3)制备天然高分子溶液。
在本实施例中,所述天然高分子溶液为硫酸软骨素溶液,其制备方法和实施例3相同。
(4)制备复合凝胶。
在本实施例中,所述复合凝胶为硫酸软骨素/多肽复合物凝胶。
将质量百分比浓度6%的由步骤(3)制得的硫酸软骨素溶液和质量百分比浓度2.0%的由步骤(2)制得的分子修饰改性多肽溶液按照不同的体积(1:1,1:2,1:3,1:4)充分混合,加入质量百分比浓度0.6~1.0%的光引发剂,搅拌溶解。将混合后的溶液注入打印针筒中,置于4℃,避光保存30min待用。取出针筒观察是否能挤出纤维,以及挤出纤维能否保持较稳定形态。如果打印针筒能够挤出纤维并且挤出的纤维能够保持较稳定的形态,则复合凝胶制备完成;如果打印针筒不能挤出纤维,则需继续避光保存。制得复合凝胶后,用紫外辐照灯照射20~60s,观察材料的交联固化情况。选择合适比例以及适宜的紫外光辐照时间的实验组进行后述人工皮肤的三维打印成型。
(5)三维打印人工皮肤。
本实施例的三维打印人工皮肤的方法和实施例3相同。
本发明的人工皮肤是由实施例1到实施例4中描述的人工皮肤的制备方法制得。所述人工皮肤具有三维网络多孔结构。所述人工皮肤的结构包括80~400μm的支架纤维直径、100~500μm的支架纤维间距及规则的孔隙。所述人工皮肤的体外降解周期为14~28天,不同材料组成及配比的人工皮肤的降解周期有所不同,含丝素或丝胶组分的人工皮肤降解周期更长,稳定性更好。
所述人工皮肤在磷酸盐缓冲液,或0.9%生理盐水中溶胀后使用,在溶胀的前30min所述人工皮肤的质量增加速率最快,60min之后基本达到溶胀平衡,溶胀率达到最高值,为450%~750%。
由于本发明的人工皮肤使用的原材料是天然高分子材料和可降解高分子材料,并通过三维打印使制得,使人工皮肤具有三维网络多孔结构,所以本发明的人工皮肤能促使受损皮肤快速修复,具有良好的生物相容性、机械性能和可降解性,在愈合期间能够维持良好的形态。并且所述人工皮肤三维结构中的均一孔道能够保证培养基中营养物质以及代谢产物、氧气和二氧化碳的及时交换,有助于细胞深入人工皮肤的三维结构进行增殖。人永生化角质形成细胞和人成纤维细胞在丝胶/明胶三维多孔支架材料上能够按照共培养的模式,基本呈现分层生长。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照以上较佳实施方式对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (11)
1.一种人工皮肤的制备方法,其包括如下步骤:
A.制备天然高分子溶液,所述天然高分子溶液所使用的天然高分子材料选自丝胶蛋白、丝素蛋白、硫酸软骨素、透明质酸或弹性蛋白中的一种或几种组合;
B.制备改性生物可降解高分子材料,所述改性生物可降解高分子材料选自甲基丙烯酸或甲基丙烯酸衍生物修饰改性的胶原、明胶或葡聚糖中的一种或几种组合;
C.制备改性生物可降解高分子溶液,将步骤B中得到的改性生物可降解高分子材料溶解后得到所述改性生物可降解高分子溶液;
D.制备复合凝胶,将步骤A中得到的天然高分子溶液与步骤C中得到的改性生物可降解高分子溶液以及光引发剂混合,制得所述复合凝胶,所述复合凝胶中天然高分子溶液与改性生物可降解高分子溶液的体积比在2:1~1:4之间;
E.三维打印步骤D中得到的复合凝胶,紫外光辐照交联固化成为人工皮肤。
2.如权利要求1所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,制备所述丝胶蛋白溶液或所述丝素蛋白溶液包括:
将蚕茧溶解,取上清液,从上清液中提取丝胶蛋白或丝素蛋白溶液;
通过减少溶液中水的含量将提取出的丝胶蛋白或丝素蛋白溶液进一步浓缩。
3.如权利要求2所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述将蚕茧溶解包括用溴化锂溶液溶解所述蚕茧,所述从上清液中提取丝胶蛋白溶液为丝胶蛋白的溴化锂溶液;
所述丝胶蛋白的溴化锂溶液进一步与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液混合并透析,得到丝胶蛋白溶液;
所述进一步浓缩是用聚乙二醇对溶液进行浓缩。
4.如权利要求2所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述将蚕茧溶解为用碳酸钠溶液对蚕丝脱胶数次,然后用氯化钙溶液溶解脱胶后的蚕丝,得到丝素蛋白溶液;
进一步用滤膜过滤所述丝素蛋白溶液,以除去所述丝素蛋白溶液中的Ca离子和Cl离子,直至硝酸银溶液检测滤液中Cl离子完全去除;
所述进一步浓缩是用聚乙二醇对溶液进行浓缩。
5.如权利要求1所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,制备硫酸软骨素溶液包括:将硫酸软骨素溶解于磷酸盐缓冲溶液中,超声分散。
6.如权利要求1所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,制备所述改性生物可降解高分子溶液包括将所述改性生物可降解高分子材料溶解于去离子水,或醋酸溶液,或磷酸盐缓冲溶液中。
7.如权利要求1所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,制备所述复合凝胶包括:配制质量百分比浓度为2-20%的改性生物可降解高分子溶液,加入质量百分比浓度为0.2-1.2%的光引发剂,将质量百分比浓度为2~6%的天然高分子溶液与所述改性生物可降解高分子溶液等体积混合,充分混匀,静置备用。
8.如权利要求1所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,三维打印人工皮肤包括:
构建三维结构模型;
利用点胶机控制气体压力挤出复合凝胶形成纤维,并用紫外光辐射固化成型;
打印结束后的产品用酒精浸泡,增加复合凝胶的结晶度,然后经过冷冻干燥制得干型人工皮肤。
9.如权利要求8所述的人工皮肤的制备方法,其特征在于,所述点胶机控制的气压范围为10~50kPa,纤维的直径为80-400μm,所述点胶机的移动速率为1-20mm/s,所述纤维间距100-500μm,层高100-2000μm。
10.一种人工皮肤,所述人工皮肤具有三维网络多孔结构,其特征在于,所述人工皮肤由权利要求1-9中任何一项所述的人工皮肤的制备方法制得。
11.一种人工皮肤的应用方法,其特征在于,所述人工皮肤为权利要求10所述的人工皮肤,所述人工皮肤在磷酸盐缓冲液,或生理盐水中溶胀后使用。
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