CN110607076A - 一种基于丝素蛋白和透明质酸的3d打印材料制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于丝素蛋白和透明质酸的高强度3D打印材料制备方法，包括丝素蛋白提炼、透明质酸修饰及生物墨水制备的步骤，本技术方案将实现基于天然高分子材料的高强度3D打印，打印结构清晰稳定，打印环境容错率高，不受温度湿度影响，打印的支架强度同目前常用的天然高分子支架相比有显著提升。降解速率更慢，可以支撑支架在体内的长期功效。打印原料简单易得，不需要大量的化学反应，适合工业推广。

Description

一种基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法

技术领域

本技术领域属于3D打印技术领域，特别是指一种基于丝素蛋白和透明质酸的高强度3D打印材料制备方法。

背景技术

随着近几年3D打印技术的进步，在临床医疗与科研领域，3D打印逐渐发挥越来越多的作用。在临床应用中，基于金属3D打印的骨组织修复已经获得广泛的应用。和传统金属支架相比，3D打印支架可以基于患者的受损区域个性化订制支架，使得产品和缺损区相匹配，有利于组织再生和患者的术后康复。金属材料的机械强度高，可以有效弥补缺损组织的缺失功能，同时避免组织再生过程中由于强度导致的修复失败。和金属3D打印相比，软组织3D打印目前在临床上尚无应用案例。在基础科学研究中，尽管软组织3D打印可以实现器官的打印，并实现器官的部分功能，但是限制其临床转化的主要因素之一就是机械强度不足。

目前软组织3D打印使用的主要材料包括明胶、海藻酸盐、胶原蛋白、PEGDA等几种材料。这些材料虽然可以实现打印，但是均具有较大缺陷。海藻酸盐在体内使用会产生炎症反应，其水解速率也较快。胶原蛋白虽然生物相容性很好，但是打印条件严苛，蛋白类材料活性高不易保存，成本也很昂贵。明胶是目前使用最为广泛的生物3D打印材料，但是作为蛋白充分水解的产物，明胶在体液环境下受蛋白酶酶解调控，降解较快，而明胶的打印也受温度和湿度影响。PEGDA作为聚乙二醇的衍生高分子聚合物，打印稳定条件简单，力学强度好。但是PEGDA的降解非常缓慢，长达数年。在损伤组织自愈的过程中，过慢的降解速度会导致组织愈合不充分，为二次组织损伤埋下阴影。

丝素蛋白作为生物高分子材料，降解产物没有毒副作用，提取方式简单，仅需要通过碱热除去蚕茧中的丝胶蛋白即可。同其他生物大分子材料相比，丝素蛋白力学强度优异，干膜的弹性模量可以达到2GPa，是理想的高强度生物高分子支架的材料选择。然而目前以丝素蛋白为主体材料研发的生物墨水尚不多见。

除了丝素蛋白外，透明质酸也是目前常用的一类生物大分子。透明质酸作为人体内的固有成分之一，降解快，降解产物没有毒性，已经广泛用于整形外科手术中。和其他多糖类材料相比，透明质酸免疫原性低，更适用于人体内的使用。但是透明质酸由于强度差粘度高，需要使用高浓度的透明质酸或者进行复杂的交联反应才能实现成胶。

基于丝素蛋白的生物墨水只有Joao等人于2017年在Advanced HealthcareMaterials上发表《Fast Setting Silk Fibroin Bioink for Bioprinting of Patient-Specifc Memory-Shape Implants》一篇文章。在该文中，作者使用高浓度的丝素蛋白溶液(大于10％)，通过酶交联的形式成胶后，通过剪切稀化的方式进行3D打印。在透明质酸3D打印的领域，主要的工作都是由Burdick组完成。在《3D Printing of shear-thinninghyaluronic acid hydrogels with secondary crosslinking》一文中，他们利用主客体反应分别对透明质酸链进行修饰，再以剪切稀化的形式进行初步打印，然后利用光交联进行二次固化。

尽管两篇文章均可以实现丝素蛋白和透明质酸的3D打印，但是各自均存在较大的局限，限制了其进一步的应用和商业推广。Joao一文中实现3D打印的方法需要极高的丝素蛋白浓度，一方面高浓度的蛋白会降解极其缓慢，一方面这也会加快丝素蛋白变性的过程，使得反应原料很不稳定。而在Burdick一文中，他们需要先对透明质酸进行双键的修饰，再对支架进行环糊精和金刚烷的修饰，制样周期极长。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于丝素蛋白和透明质酸的高强度3D打印材料制备方法，以解决现有技术丝素蛋白和透明质酸在3D打印领域的缺陷问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，包括以下步骤：

1)丝素蛋白提炼

将蚕茧加入到煮沸之后的0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，保持煮沸状态并搅拌溶解20-60min，将固体物质取出，水洗并在室温下烘干，得到丝素蛋白；

按丝素蛋白与溴化锂的质量比为1：4称取溴化锂，并配备9.3mol/L的溴化锂水溶液；

将溴化锂水溶液加入到放置有丝素蛋白的容器内，令溴化锂水溶液完全覆盖所述丝素蛋白，在50-70℃下搅拌3-5h；

将获得的黄褐色粘稠溶液进行透析，将收集液离心处理，保留上清液；

将上清液利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到海绵状丝素蛋白；

2)透明质酸修饰

制备质量百分比浓度为1％的透明质酸钠水溶液，过夜搅拌并置于冰浴中；

按透明质酸钠与甲基丙烯酸酐1：1.5-10的摩尔比例称取相应的甲基丙烯酸酐，滴加到透明质酸钠水溶液中，使用氢氧化钠调整pH值8-11，放置设定时间后密封避光保存15-36小时；

按1：4体积比将上述溶液加入到乙醇中并离心，保留白色絮状沉淀物，并重复两次，将得到的沉淀物在水中透析，得到的透明溶液即为透明质酸修饰液；

将透明质酸溶液冷冻干燥，得到甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸海绵；

3)生物墨水制备

将步骤2)制备的透明质酸修饰海绵配成质量百分比浓度为1-2％的溶液，作为A溶液；

将步骤1)制备的海绵状丝素蛋白溶解成质量百分比浓度为4-16％的溶液，并加入设定量的紫外光引发剂，溶解充分后离心除去杂质，作为B溶液；

将A溶液与B溶液按计算的比例进行混合、搅拌后经过离心除气泡，将下清液收集即获得生物墨水。

步骤1)中9.3mol/L溴化锂溶液的配制为，先计算好溴化锂溶液的体积，称取60％的水冰浴，边搅拌边将溴化锂缓慢加入水中，待溴化锂完全溶解后将水补充至计算值。

步骤1)中透析的方法为，每12h换一次水，三天后收集透析液在4℃离心转速为9000rpm离心两次，收集上清液。

步骤2)中，离心处理在4℃下离心10min。

步骤2)中的透析为每12小时换水一次，透析两天。

所述紫外光引发剂包括但不限于Irgacure 2929或LAP。

所述生物墨水还包括打印前处理，具体为：

将生物墨水加入到注射器内，并推入3D打印管，将3D打印管用紫外交联箱进行0.5-1小时光照，使生物墨水实现光交联，在交联结束后好可进行3D打印。

4)3D打印支架的二次交联

将步骤3)得到的材料进行打印并将支架冻干，并在乙醇中浸泡1小时以上，并取出在酒精中保存。

本发明的有益效果是：

本技术方案将实现基于天然高分子材料的高强度3D打印，打印结构清晰稳定，打印环境容错率高，不受温度湿度影响，打印的支架强度同目前常用的天然高分子支架相比有显著提升。降解速率更慢，可以支撑支架在体内的长期功效。打印原料简单易得，不需要大量的化学反应，适合工业推广。

附图说明

图1为丝素蛋白-透明质酸制备的生物墨水的3D打印效果图，其中，(a)为打印的40*10*1mm³的长条状支架，(b)为打印的长条支架经过乙醇二次交联后得到的支架，(c)为包裹罗丹明的20*20*1mm³的支架，(d)显示的打印并冷冻处理的支架具有很好的力学性质；

图2a为明胶与丝素蛋白两种支架的压缩应力应变曲线图；

图2b为明胶与丝素蛋白支架的拉伸应力应变曲线图；

图3为明胶与丝素蛋白支架的体外水解曲线图；

图4为透明质酸-丝素蛋白的红外光谱表征曲线图，其中曲线a为光固化透明质酸凝胶，b为丝素蛋白和透明质酸共混后光交联的结构变化，c为交联后通过冷冻干燥处理再利用乙醇浸泡得到的最终支架的结构。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

本申请提供一种基于丝素蛋白和透明质酸的高强度3D打印材料制备，包括以下步骤：

1)丝素蛋白提炼

将10g蚕茧用剪刀剪成小块，并当0.02mol/L的无水碳酸钠溶液(2L)煮沸之后投入，保持煮沸状态下搅拌溶解30min，将得到的白色棉花状固体取出，多次水洗，并在室温下烘干。干燥充分后，称重，并以丝素蛋白：溴化锂＝1：4的质量比例称取相应的溴化锂，配备9.3mol/L的溴化锂水溶液(先计算好液体体积，之后称取60％左右的水，冰浴，同时将溴化锂缓慢加入正在搅拌的水中，完全溶解后补足体积至计算值)，并将溶液灌入装有丝素蛋白的烧杯中，令溴化锂溶液完全覆盖蛋白，之后在60℃下搅拌4h，随后将得到的黄褐色粘稠溶液进行透析，每12h换一次水，3天之后收集并进行离心，离心转速为9000rpm，保持温度在4℃，离心两次，弃去杂质，只保留上清液，将收获的上清液分装后利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到的海绵状丝素蛋白可在室温干燥环境下长期保存。

2)透明质酸修饰

称取透明质酸钠，制备质量百分比为1％的水溶液，过夜搅拌，完全溶解后，将溶液置于冰浴之中；按透明质酸钠：甲基丙烯酸酐＝1：1.5的摩尔比例称取相应的甲基丙烯酸酐，逐滴加入到透明质酸钠溶液中，pH通过氢氧化钠调整为8，待全部滴加完且pH长时间稳定后，密封避光保存在4℃下。12h后取出，并以1：4的体积比将溶液加入到相应体积的乙醇中，在4℃下离心10min，弃去上清液，保留白色絮状沉淀，重复上述醇洗过程两次，将最后得到的沉淀在水中透析2天，12小时换水一次，将得到的透明溶液冻干并避光保存。

3)生物墨水制备

将步骤2)制备的透明质酸修饰液配成质量百分比浓度为2％的溶液，作为A溶液。

将步骤1)制备的海绵状丝素蛋白溶解成质量百分比浓度为10％的溶液，并加入设定量的Irgacure 2929紫外光引发剂，溶解充分后离心4000rpm离心10分钟，除去杂质，作为B溶液。将A液和B液按照计算的比例进行混合，并用手持式搅拌器快速搅拌30秒，搅拌充分的混合液装入离心管中，1000rpm离心1min除气泡收集下清溶液即为生物墨水。

将下清溶液倒入注射器中，并推入3D打印管，填料结束后，将3D打印管用紫外交联箱进行30分钟-1小时不等的光照，使打印墨水实现充分光交联，交联结束后即可进行打印，生物墨水可以在4度环境下保存3-5天。

4)透明质酸-丝素蛋白生物墨水的3D打印

生物墨水装管预交联后，通过剪切稀化的形式进行打印，选用0.20-0.80mm不等的圆锥形TT点胶针。已使用3D打印的机器包括德国Envision Tec的3D bioplotter和中国上普的ALPHA桌面3D打印机，如图1所示。打印结束后，将支架放入-20摄氏度以下的温度进行冷冻，并通过冷冻干燥的方式获得干支架。支架经过冻干处理后，浸入乙醇中处理2小时，随后取出放入酒精中进行消毒。需要使用进行细胞实验时，将支架取出，用灭菌的PBS进行浸泡，多次换液以便除去残留酒精。

测试与表征方法

将冻干过的支架在去离子水中充分溶胀1天后取出，通过力学测试仪对其进行压缩测试及拉伸试验。

如图2a,压缩测试开始前，样品切割成1.5cm×1.5cm×1.0cm左右的块状，对每一个样品都施加一个0.1N左右的初始力，确保压缩面和样品充分接触。压缩速度为0.5mm/min，实验的载荷和位移全部收集并绘制应力-应变曲线，其中应力＝载荷/截面积，应变＝行程位移/初始厚度；压缩模量Ec＝Δ_应力/Δ_应变，计算时取应变前20％区域呈线性上升的部分，E_c为该区域的斜率。

如图2b，拉伸试验开始前将样品切割成5cm×1cm×0.5cm左右的长条状，对样品施加初始长度5％的初始应力，使其充分延展，拉伸速度为3mm/min。弹性模量EY＝Δ_应力/Δ_应变，计算方法同上。每组样品包含四个平行组，以确保实验的可重复性。最终模量、伸长量等值以均值±标准差的形式呈现。

将支架打印成直径约1cm，高3-5mm的块状后冻干称重，得到W₁.随后将支架浸没入2mL的酶溶液中(水解实验中只将支架浸泡在PBS缓冲液中)。酶溶液由2mL蛋白酶K溶液(0.1U/mL)组成。酶溶液每两天换液。分别在0d，1d，2d，3d，4d，5d取样(水解实验的取样时间延长到21天，分别在0、1、2、3、5、7、10、13、17、21天取样)，先在大体积去离子水中浸泡过夜，随后取出冻干并称重得到W₂。酶解程度以质量残留率＝(W₁-W₂)/W₁×100％来表示。每个时间点均重复三次。最终数据以均值±标准差的形式表示。

支架的红外结构表征使用Affinity-1S红外光谱仪进行检测。检测前用液氮处理样品，并碾碎成粉末，之后通过KBr法进行制样。扫描范围为400cm^-1到4000cm^-1，扫描精度为4cm^-1。

图1所示为通过本技术方案的生物墨水进行3D打印后的形貌示意图。打印的结构清晰规整，打印的线宽为打印针内径的1.25倍，打印条件简便，不受环境温度湿度的影响，打印时不需要调整平台温度或者在打印的过程中进行二次交联，打印迅速。

为表征3D打印支架的理化性能，我们用力学测试仪对支架的压缩和拉伸性能进行了实验，同时利用体外水解和酶解实验对支架的降解能力进行表征。明胶作为目前使用最为广泛的打印材料，被用来与本发明的支架进行对照。同明胶相比，支架在25度环境下的压缩模量稍弱于明胶，只有7.16±1.51kPa，明胶达到13.3±1.47kPa，但是支架的弹性区间达到12.7％，远高于明胶的6.24％。支架的拉伸模量达到130±1.63kPa，远远高于明胶的29.6±1.82kPa，如图2a和图2b所示。

在支架的降解能力表征对比上，明胶在冻干后覆水时，伴随溶胀会有一定比例没有交联的明胶溶解在水中，因此在第一天会有显著的水解现象，待已经水解的未交联明胶溶解后，明胶在水中保持未降解的状态。相比之下，透明质酸/丝素蛋白支架在水中保持稳定，21天也没有任何水解现象发生。而在酶解实验中，明胶支架第一天就发生完全降解，而丝素蛋白支架直到第六天才实现完全降解，如图3所示。

为了探究丝素蛋白添加入透明质酸形成复合凝胶这一过程中发生的反应，我们将透明质酸支架、透明质酸/丝素蛋白复合凝胶以及其中间体(仅进行光固化交联而不进行冷冻乙醇处理)分别进行了红外表征。如图4所示，没有丝素蛋白的情况下，光交联的透明质酸在Amide I区(1700-1600cm^-1)只有两个强峰，分别位于1667cm^-1及1600cm^-1，另外在1656cm^-1处有一肩峰。而进行光交联及冷冻乙醇处理后的复合凝胶，由于蛋白的浓度远高于透明质酸，因此透明质酸的峰几乎都被蛋白的峰所掩盖。在Amide I区，复合凝胶的峰与丝素蛋白醇处理海绵的峰位几乎相同。相比之下，当我们仅仅将溶液进行光固化处理便冻干表征，可以看到在1628cm^-1处有一明显的强峰，这表明即便没有进行乙醇处理，光固化反应依旧可以诱导部分丝素蛋白出现β-sheet结构，如图4所示。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求极其等同限定。

Claims (7)

1.一种基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)丝素蛋白提炼

将蚕茧加入到煮沸之后的0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，保持煮沸状态并搅拌溶解20-60min，将固体物质取出，水洗并在室温下烘干，得到丝素蛋白；

按丝素蛋白与溴化锂的质量比为1：4称取溴化锂，并配备9.3mol/L的溴化锂水溶液；

将溴化锂水溶液加入到放置有丝素蛋白的容器内，令溴化锂水溶液完全覆盖所述丝素蛋白，在50-70℃下搅拌3-5h；

将获得的黄褐色粘稠溶液进行透析，将收集液离心处理，保留上清液；

将上清液利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到海绵状丝素蛋白；

2)透明质酸修饰

制备质量百分比浓度为1％的透明质酸钠水溶液，过夜搅拌并置于冰浴中；

按透明质酸钠与甲基丙烯酸酐1：1.5-10的摩尔比例称取相应的甲基丙烯酸酐，滴加到透明质酸钠水溶液中，使用氢氧化钠调整pH值8-11，放置设定时间后密封避光保存15-36小时；

按1：4体积比将上述溶液加入到乙醇中并离心，保留白色絮状沉淀物，并重复两次，将得到的沉淀物在水中透析，得到的透明溶液即为透明质酸修饰液；

将透明质酸溶液冷冻干燥，得到甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸海绵；

3)生物墨水制备

将步骤2)制备的透明质酸修饰海绵配成质量百分比浓度为1-2％的溶液，作为A溶液；

将步骤1)制备的海绵状丝素蛋白溶解成质量百分比浓度为4-16％的溶液，并加入设定量的紫外光引发剂，溶解充分后离心除去杂质，作为B溶液；

将A溶液与B溶液按计算的比例进行混合、搅拌后经过离心除气泡，将下清液收集即获得生物墨水；

4)3D打印支架的二次交联

将步骤3)得到的材料进行打印，并将支架冻干，并在乙醇中浸泡1小时以上，并取出在酒精中保存。

2.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，其特征在于，步骤1)中9.3mol/L溴化锂溶液的配制为，先计算好溴化锂溶液的体积，称取60％的水冰浴，边搅拌边将溴化锂缓慢加入水中，待溴化锂完全溶解后将水补充至计算值。

3.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，其特征在于，步骤1)中透析的方法为，每12h换一次水，三天后收集透析液在4℃离心转速为9000rpm离心两次，收集上清液。

4.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，其特征在于，步骤2)中，离心处理在4℃下离心10min。

5.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，其特征在于，步骤2)中的透析为每12小时换水一次，透析两天。

6.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，其特征在于，所述紫外光引发剂包括但不限于Irgacure 2929或LAP。

7.根据权利要求1所述的基于丝素蛋白和透明质酸的3D打印材料制备方法，其特征在于，所述生物墨水还包括打印前处理，具体为：

将生物墨水加入到注射器内，并推入3D打印管，将3D打印管用紫外交联箱进行0.5-1小时光照，使生物墨水实现光交联，在交联结束后好可进行3D打印。