CN114949346A - 用于软骨修复的3d打印功能化丝素蛋白/透明质酸支架 - Google Patents

用于软骨修复的3d打印功能化丝素蛋白/透明质酸支架 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于软骨修复的3D打印功能化丝素蛋白/透明质酸支架，其制备方法包括，将甲基丙烯酸化透明质酸溶液和含丝素蛋白与光引发剂的溶液按一定比例混合，经紫外线交联制备得到丝素蛋白/透明质酸材料；将所述丝素蛋白/透明质酸材料进行3D打印，制备得到丝素蛋白/透明质酸支架；将上述丝素蛋白/透明质酸支架连接多肽，即制备得到功能化丝素蛋白/透明质酸支架。该功能化支架具有良好的生物相容性、有利于促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化，在软骨修复方面具有良好的应用前景。

Description

用于软骨修复的3D打印功能化丝素蛋白/透明质酸支架
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种用于软骨修复的3D打印功能化丝素蛋白/透明质酸支架。
背景技术
由各种原因如疾病、交通事故等导致的软骨组织损伤，是骨科临床一种常见症状。由于软骨没有血管、神经，其自我修复能力非常有限，需要植入填充物以促进软骨的再生修复。组织工程为临床解决关节软骨修复问题提供了新的思路，人工修复材料有望取代天然骨成为新的修复填充材料。
目前的科研工作中，常见的替代填充物多为以PLGA、PLA等可降解聚酯，纳米羟基磷灰石(n-HA)、磷酸三钙(TCP)等无机钙盐材料制备的复合膜或支架为主。但目前的修复支架常常难以兼顾植入物的形状、厚度及力学强度与天然软骨的匹配度，导致缺损区的恢复、再生情况不佳；或者具有不适合细胞的生长、治愈修复能力不足的缺点。3D打印技术不仅可用于构建与缺损匹配的材料模型，通过选用合适的3D打印材料，有希望获得更适合细胞的生长，提升创伤的治愈修复能力的用于软骨修复的支架。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于软骨修复的3D打印功能化丝素蛋白/透明质酸支架，本发明提供的功能化丝素蛋白/透明质酸支架的制备方法简单，其微观形貌、多肽结合率和酶降解情况等材料特征符合软骨修复的要求，并且经动物试验验证具有优良的软骨修复功能。
为此，本发明的第一方面，提供一种功能化丝素蛋白/透明质酸支架的制备方法，包括，将甲基丙烯酸化透明质酸溶液和含丝素蛋白与光引发剂的溶液按一定比例混合，经紫外线交联制备得到丝素蛋白/透明质酸材料；将所述丝素蛋白/透明质酸材料进行3D打印，制备得到丝素蛋白/透明质酸支架；向所述丝素蛋白/透明质酸支架连接多肽，即制备得到功能化丝素蛋白/透明质酸支架。
进一步，所述含丝素蛋白与光引发剂的溶液中，所述光引发剂的浓度为0.5-1％，例如0.5％、0.8％、1％等；所述丝素蛋白的浓度为2-5％，例如2％、3％、4％、5％等。
进一步，所述光引发剂为光引发剂2959。
进一步，所述丝素蛋白的制备步骤包括：将蚕茧去除丝胶，然后依次经溴化锂溶解、去离子水透析，制备得到所述丝素蛋白。
进一步，所述去除丝胶包括：将所述蚕茧在碳酸钠溶液中煮沸。
进一步，所述溴化锂溶解的温度条件为50-70℃，例如50℃、60℃、70℃等。
在一些实施方式中，所述丝素蛋白的制备步骤包括：将蚕茧切片后于碳酸钠溶液中煮沸20-40min去除丝胶，得到脱胶蚕茧；将所述脱胶蚕茧于8.5-9.5M溴化锂溶液中煮沸25-40min，然后用10K透析袋用去离子水透析3-4d，透析结束后在4-6℃下离心，制备得到所述丝素蛋白。
进一步，所述甲基丙烯酸化透明质酸的制备步骤包括：使甲基丙烯酸酐与透明质酸在碱性溶液条件下反应，然后依次经醇洗沉淀、去离子水透析，制备得到所述甲基丙烯酸化透明质酸。
在一些实施方式中，所述甲基丙烯酸化透明质酸的制备步骤包括：将甲基丙烯酸酐滴加到透明质酸溶液中，在0℃、pH8-11，搅拌条件下反应20-28h，得到反应产物；将所述反应产物在冷乙醇中以3500-4500rpm离心5-15min沉淀，然后用去离子水透析3-4d，制备得到所述甲基丙烯酸化透明质酸。
进一步，所述甲基丙烯酸化透明质酸溶液和所述含丝素蛋白与光引发剂的溶液的体积比为1-1.2：1-1.2，例如1：1、1：1.2、1.2：1等。
进一步，所述甲基丙烯酸化透明质酸溶液中，甲基丙烯酸化透明质酸的浓度为0.3-0.5％，例如0.3％、0.35％、0.4％、0.5％等。
进一步，所述紫外线交联之前还包括以下步骤：去除气泡和杂质。
在一些实施方式中，所述丝素蛋白/透明质酸材料的制备步骤包括：将所述甲基丙烯酸化透明质酸溶液和含丝素蛋白与光引发剂的溶液按1-1.2：1-1.2的体积比混合，得到混合溶液；将所述混合溶液以800-1200rpm的速度离心1-2min以去除气泡和杂质，然后将去除气泡和杂质后的混合溶液于254nm紫外光条件下交联30-50min，即制备得到所述丝素蛋白/透明质酸材料。
进一步，所述多肽为E7短肽，其包括以下氨基酸序列：EPLQLKM。
进一步，向所述丝素蛋白/透明质酸支架连接多肽的步骤包括：将所述丝素蛋白/透明质酸支架浸入1,6-己二胺中进行第一孵育，然后用PBS缓冲液洗涤；将经过第一孵育的所述丝素蛋白/透明质酸支架浸入Sulfo-SMCC溶液中进行第二孵育，然后用PBS缓冲液洗涤；将经过第二孵育的所述丝素蛋白/透明质酸支架浸入所述肽的溶液进行第三孵育。
进一步，所述第一孵育的温度条件为35-37℃，时间为1-1.5h。
进一步，所述第二孵育的温度条件为35-37℃，时间为1-1.5h。
进一步，所述第三孵育的温度条件为4-6℃，时间为8-14h。
本发明的第二方面，提供根据本发明第一方面所述的制备方法制备得到的功能化丝素蛋白/透明质酸支架在制备软骨修复材料方面的应用。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下进步：
本发明所用的原料具有良好的生物相容性，制备得到的功能化支架具有良好的肽结合率，并且其酶降解情况满足软骨修复的要求，E7短肽有利于促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化。该功能化支架在动物实验中有效促进了软骨再生与修复。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：甲基丙烯酸化透明质酸的合成途径；
图2：丝心蛋白自组装成β-折叠结构；
图3：通过Sulfo-SMCC在支架上缀合肽；
图4：甲基丙烯酸化透明质酸的质子NMR光谱；
图5：SF/MAHA支架制备过程中丝心蛋白在FTIR光谱中的结构转变；
图6：对于不同的肽浓度，支架上肽结合率的测量结果；
图7：本发明提供的SF/MAHA/E7支架的显微镜观察结果；图中比例尺为1mm；
图8：本发明提供的SF/MAHA/E7支架的某一面的照片；图中比例尺为5mm；
图9：本发明提供的SF/MAHA/E7支架的另一面的照片；图中比例尺为5mm；
图10：本发明提供的SF/MAHA/E7支架的扫描电镜成像结果；图中比例尺分别为：(a)500μm，(b)500μm，(c)500μm，(d)50μm，(e)50μm，(f)50μm；
图11：不同丝素蛋白浓度下SF/MAHA材料的流变性能随时间的变化；
图12：相同透明质酸浓度下，不同丝素蛋白浓度下SF/MAHA材料粘弹性变化；
图13：不同浓度丝素蛋白制备得到的SF/MAHA/E7支架的降解速率变化；
图14：用本发明提供的SF/MAHA/E7支架进行软骨修复的动物实验的HE、甲苯胺蓝和免疫组化染色结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
以下实施例所使用的试剂和仪器，均可通过常规的商购途径获得。其中，透明质酸钠购自中国远野生物技术；甲基丙烯酸酐、碳酸钠、溴化锂购自Macklin(China)；Irgacure2959购自德国巴斯夫。
实施例1
本实施例提供一种用于软骨修复的3D打印功能化丝素蛋白/透明质酸支架，按照以下步骤制备得到：
(1)丝素蛋白的纯化
将15g家蚕茧切成片，在0.02M Na2CO3溶液中煮沸30min去除丝胶，得到丝素蛋白；将提取的丝素蛋白在9.3M LiBr溶液中在60℃下溶解4h，然后用10K透析袋用去离子水透析3d；然后在4℃下离心(9000rpm)20min两次，及制备得到纯化后的丝素蛋白，可将产品分装并冻干以供长期储存。
(2)甲基丙烯酸化透明质酸的制备
在0℃下将甲基丙烯酸酐滴加到透明质酸溶液中，将混合物的pH值保持在8-11之间；在0℃搅拌24h后，将甲基丙烯酸化的透明质酸在冷乙醇中以4000rpm离心10min沉淀，然后用水透析3d，得到将纯化的甲基丙烯酸化透明质酸，可将其冻干储存。
(3)用于3D打印的丝素蛋白/透明质酸的制备
取步骤(2)制备得到的甲基丙烯酸化透明质酸，用去离子水配制为浓度为0.35％的溶液，将其记为A溶液；用去离子水配制光引发剂2959浓度为0.8％的溶液，然后将丝素蛋白溶解于该光引发剂溶液中，使丝素蛋白的浓度为3％，将得到的溶液记为B溶液。将A溶液和B溶液按照1：1的体积比混合并以1000rpm的速度离心1min以去除气泡和杂质；将去除气泡和杂质后的混合物倒入打印管中并在CL-1000紫外线交联盒(UVP，美国)中交联40min，即制备得到用于3D打印的丝素蛋白/透明质酸材料，简称SF/MAHA材料。
(4)3D打印
将步骤(3)制备得到的SF/MAHA材料作为3D打印材料，用3D bioplotter(EnvisionTec.,Germany)进行以下打印步骤：选择带有圆柱形尖端的23G点胶针，打印压力在2.5bar和4.0bar之间，打印速度在6mm/s和15mm/s之间，即制备得到丝素蛋白/透明质酸支架，简称SF/MAHA支架。将干燥的SF/MAHA支架浸入乙醇中2h。短期储存SF/MAHA支架可以放在75％的酒精中。在种植细胞之前，应使用无菌PBS清洗支架3天，以去除残留的乙醇。
(5)功能化连接多肽
通过商业合成(Scilight-Peptide Ink.,Beijing,China)得到E7(EPLQLKM-C)，制备为浓度为0.25mg/mL的肽溶液。将步骤(4)制备得到的SF/MAHA支架浸入37℃的1,6-己二胺(10wt％的异丙醇溶液)中1h，然后用PBS缓冲液洗涤3次；然后将其浸入Sulfo-SMCC溶液(2mg/mL PBS缓冲液)中37℃孵育1h，用PBS缓冲液洗涤3次。将与Sulfo-SMCC反应后的支架分别浸入上述肽溶液中，在4℃下孵育过夜；然后用PBS缓冲液彻底清洗，即制备得到功能化丝素蛋白/透明质酸支架，简称SF/MAHA/E7支架，冻干保存。
实施例2傅里叶红外光谱分析
本实施例对实施例1的制备过程中丝素蛋白在傅里叶红外光谱(FTIR)中的结构转变进行分析。
将丝素蛋白、步骤(3)制备得到的SF/MAHA材料、步骤(4)3D打印得到的SF/MAHA支架分别冻干后用研钵研碎成粉末，然后按照1：100的质量比与溴化钾固体进行混合研磨，压制成薄片；用傅里叶变红外光谱仪分析蛋白的二级结构，扫描波数为4000-400cm-1，扫描精度为4cm-1，单个样品扫描五次取平均值。丝素蛋白在FTIR光谱中的结构转变结果如图5所示。
实施例3肽结合率的测量
本实施例对SF/MAHA/E7支架的肽结合率进行测量。
按照实施例1的制备方法，并且选用FITC标记的E7肽溶液，制备得到SF/MAHA/E7支架。具体地：首先打印尺寸为10mm×10mm×1mm的SF/MAHA支架，冻干后记录支架的干重，将支架浸入0.05mg/mL至0.35mg/mL不同浓度的1mL肽溶液中，结合后制备得到SF/MAHA/E7支架。然后彻底清洗SF/MAHA/E7支架并用2mL蛋白酶K溶液(0.4U/mL)消化3天。
使用Varioskan Flash reader(Thermo Fisher Scientific Inc.,USA)在490nm(激发)和525nm(发射)测量消化的荧光强度。基于FITC-E7标准曲线计算消化中FITC-E7的浓度。检测结果如图6所示(n＝3，＊p<0.05)。
实施例4扫描电镜成像
本实施例对实施例1制备得到的SF/MAHA/E7支架的电镜结构特征进行观察。
将SF/MAHA/E7支架通过Gatan Model 691PIPS(Gatan，USA)冻干和镀金，然后用JSM-7900F扫描电子显微镜在3kV加速电压下观察SF/MAHA/E7支架的形态。扫描电镜成像的成像结果如图10所示。
实施例5酶降解分析
本实施例对SF/MAHA/E7支架的酶降解情况进行分析。
按照实施例1的制备方法，并且在不同丝素蛋白浓度下，制备得到SF/MAHA/E7支架。记录冻干SF/MAHA/E7支架的干重(W0)后，将其浸入蛋白酶K(Biofroxx，Germany)溶液(2mL，0.04U/mL)，于37℃条件下进行体外酶降解。酶降解的分析结果如图11-13所示。
实施例6动物试验
选择2.5-3.0kg发育成熟的日本大耳白兔，进行以下处理：采用关节内侧入路，切开皮肤和皮下组织，暴露关节囊，小心切开关节囊，将膝关节髌骨向外侧脱位，暴露出股骨滑车；用准备好的4mm角膜环钻在股骨滑车中心区域钻取深约1.5mm缺损区域，注意不要钻透软骨下骨。
对照组(MF组)进行常规微骨折处理：修整软骨缺损基底为平面，用1ml注射器针头穿透到软骨下骨，释放骨髓血液进入缺损区域。
实验组分为HA/SFG和HA/SFG+E7两组，其中，HA/SFG+E7组采用实施例1制备得到的SF/HA/E7支架；HA/SFG组采用HA/SFG支架，该支架与SF/MAHA/E7支架的区别主要在于该支架为单纯生物支架，无多肽连接，没有干细胞募集功能。对于两个实验组，分别在进行微骨折的基础上置入相应的支架；待血凝块有所凝固后小心复位关节，屈伸活动膝关节15次后观察支架没有移位，逐层缝合；术后自由活动，不固定患肢体，三天内每日给予肌注青霉素20万单位，笼养6、12、24周后取材。取材后进行HE、甲苯胺蓝和免疫组化染色。动物实验的HE、甲苯胺蓝和免疫组化染色结果如图14所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种功能化丝素蛋白/透明质酸支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括，将甲基丙烯酸化透明质酸溶液和含丝素蛋白与光引发剂的溶液按一定比例混合，经紫外线交联制备得到丝素蛋白/透明质酸材料；将所述丝素蛋白/透明质酸材料进行3D打印，制备得到丝素蛋白/透明质酸支架；向所述丝素蛋白/透明质酸支架连接多肽，即制备得到功能化丝素蛋白/透明质酸支架。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含丝素蛋白与光引发剂的溶液中，所述光引发剂的浓度为0.5-1％；所述丝素蛋白的浓度为2-5％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为光引发剂2959。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，述丝素蛋白的制备步骤包括：将蚕茧去除丝胶，然后依次经溴化锂溶解、去离子水透析，制备得到所述丝素蛋白；
优选地，所述去除丝胶包括：将所述蚕茧在碳酸钠溶液中煮沸；
优选地，所述溴化锂溶解的温度条件为50-70℃。
优选地，所述丝素蛋白的制备步骤包括：将蚕茧切片后于碳酸钠溶液中煮沸20-40min去除丝胶，得到脱胶蚕茧；将所述脱胶蚕茧于8.5-9.5M溴化锂溶液中煮沸25-40min，然后用10K透析袋用去离子水透析3-4d，透析结束后在4-6℃下离心，制备得到所述丝素蛋白。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化透明质酸的制备步骤包括：使甲基丙烯酸酐与透明质酸在碱性溶液条件下反应，然后依次经醇洗沉淀、去离子水透析，制备得到所述甲基丙烯酸化透明质酸；
优选地，所述甲基丙烯酸化透明质酸的制备步骤包括：将甲基丙烯酸酐滴加到透明质酸溶液中，在0℃、pH8-11，搅拌条件下反应20-28h，得到反应产物；将所述反应产物在冷乙醇中以3500-4500rpm离心5-15min沉淀，然后用去离子水透析3-4d，制备得到所述甲基丙烯酸化透明质酸；
优选地，所述甲基丙烯酸化透明质酸溶液中，甲基丙烯酸化透明质酸的浓度为0.3-0.5％。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化透明质酸溶液和所述含丝素蛋白与光引发剂的溶液的体积比为1-1.2：1-1.2。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述紫外线交联之前还包括以下步骤：去除气泡和杂质；
优选地，所述丝素蛋白/透明质酸材料的制备步骤包括：将所述甲基丙烯酸化透明质酸溶液和含丝素蛋白与光引发剂的溶液按1-1.2：1-1.2的体积比混合，得到混合溶液；将所述混合溶液以800-1200rpm的速度离心1-2min以去除气泡和杂质，然后将去除气泡和杂质后的混合溶液于254nm紫外光条件下交联30-50min，即制备得到所述丝素蛋白/透明质酸材料。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多肽为E7短肽，其包括以下氨基酸序列：EPLQLKM。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，向所述丝素蛋白/透明质酸支架连接多肽的步骤包括：将所述丝素蛋白/透明质酸支架浸入1,6-己二胺中进行第一孵育，然后用PBS缓冲液洗涤；将经过第一孵育的所述丝素蛋白/透明质酸支架浸入Sulfo-SMCC溶液中进行第二孵育，然后用PBS缓冲液洗涤；将经过第二孵育的所述丝素蛋白/透明质酸支架浸入所述肽的溶液进行第三孵育；
优选地，所述第一孵育的温度条件为35-37℃，时间为1-1.5h；
优选地，所述第二孵育的温度条件为35-37℃，时间为1-1.5h；
优选地，所述第三孵育的温度条件为4-6℃，时间为8-14h。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的功能化丝素蛋白/透明质酸支架在制备软骨修复材料方面的应用。
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