CN109054047A - 一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶及其制备方法和应用，将甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白溶液与氧化石墨烯共混，而后加入光引发剂在紫外光照射下交联，制备得到具有良好机械性能及成骨诱导性能的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶。所得丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶具有良好生物相容性和生物可降解性以及高机械强度和成骨诱导作用，可用于药物及细胞的搭载，以及组织工程修复等方面。

Description

一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用复合材料领域，具体指一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备方法和应用，该复合水凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，能够促进骨组织生长，在组织损伤修复方面具有良好的应用前景。
背景技术
大面积骨缺损在临床上十分常见，主要由创伤、感染、肿瘤、病理性骨折等引起，是目前骨科临床上亟待解决的难题之一。传统的骨缺损治疗方法有自体移植、异体移植、人工骨植入等。自体移植虽然具有良好的骨诱导作用但供体来源有限、需要二次手术。异体移植则存在免疫排斥反应需要克服。人工骨如生物陶瓷，钛合金等也面临着成骨困难等问题。随着组织工程与再生医学的快速发展，骨组织工程材料的研发为骨缺失的临床治疗提供了新的研究方向。
骨组织工程是采用组织工程的技术，在体外构建出支架材料与细胞和生长因子的复合体，移植至骨缺损处，通过细胞增殖、组织增生最终实现骨的形态和功能修复。骨组织工程能够克服目前传统骨缺损治疗方法供体不足，免疫排斥反应等缺陷，对于临床上骨损伤治疗领域具有重要意义。
骨组织工程研究中支架材料的构建尤为重要，目前常见的骨组织工程支架材料依据来源不同可分为无机材料、人工合成高分子材料和天然高分子材料。无机材料主要包括：生物降解类陶瓷、羟基磷灰石。人工合成高分子材料主要包括：聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）。天然高分子材料主要包括：胶原蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、丝素蛋白等。理想的骨组织工程材料不仅需要良好的生物相容性、能够促进细胞的黏附和增殖，还需具有一定的力学性能和骨诱导性。丝胶蛋白作为一种新兴的天然高分子蛋白材料，以其优良的生物相容性和低免疫原性在神经、皮肤、心肌、软骨修复等方面均取得了较好的治疗效果。我们采用丝胶作为主体材料，添加能够增强机械性能和骨诱导性的氧化石墨烯，发明了一种能够促进骨组织修复的复合水凝胶，用于骨缺失的治疗。
本发明构建的复合水凝胶主体材料丝胶是包裹在丝素纤维外的一种天然活性蛋白，由丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸等18种氨基酸共同构成，具有良好的水溶性，它含有的丰富的极性氨基酸和功能基团易于修饰，同时它还能够促进细胞的黏附和增殖，具有较低的免疫原性和良好的生物相容性。本发明中另外一种添加材料氧化石墨烯是一种具有良好的力学性能和生物相容性、可用于增强生物材料力学性能的人工材料。目前已有研究表明氧化石墨烯可诱导干细胞的分化。将丝胶蛋白与氧化石墨烯共混制备成复合水凝胶，有效增强了水凝胶的力学性能，同时我们的研究结果表明该水凝胶具有良好的生物相容性、生物可降解性以及促进细胞黏附、增殖、迁移等特性，同时该水凝胶可诱导干细胞分化为成骨细胞，进一步促进病损区域骨组织的再生。在动物实验中，相较于对照组，该复合水凝胶可有效促进大鼠颅骨缺损区域骨组织的再生。该水凝胶的研发为骨缺失的临床治疗提供了新的研究方向，具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶及其制备方法和应用，所得的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时具备高机械强度和成骨诱导作用，可用于药物、细胞搭载，以及组织工程修复等方面的研究。
本发明提供了一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备方法，该方法是将甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白溶液与氧化石墨烯溶液共混，而后加入光引发剂在紫外光照射下交联，制备出具有良好机械性能及成骨诱导性能的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶，制备方法简单易行。
本发明制备的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶，具有良好的生物相容性和生物可降解性，自发荧光特性，能够搭载多种细胞，同时促进细胞的黏附和增殖。
本发明还提供了所述丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶在骨损伤修复方面的应用。
本发明还提供了所述丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶在其他组织修复中的应用。
本发明还提供了一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架的制备方法。
本发明提供的一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备方法，主要包括以下步骤：
1）提取和纯化丝胶蛋白
称取1-5 g丝素缺失型蚕茧（140 Nd-s）,剪碎，用去离子水清洗后去除水分，将其置于20-1000 mL浓度为0.01-0.02 mol/L的Na2CO3溶液中，80-100 ℃条件下搅拌反应0.5-1小时，使丝胶完全溶解；
离心去除上述溶液中的不溶性沉淀，收集上清透析2-3天，得到澄清的丝胶溶液；冻干得到丝胶蛋白粉末。
）制备甲基丙烯酸酐修饰的丝胶
将步骤1）中得到的丝胶以0.02-1 g/mL的比例完全溶解于10-100 mL磷酸缓冲液（pH7-10）中，搅拌使其完全溶解；
按照每1 g丝胶蛋白粉末对应0.146-2.344 g的比例加入甲基丙烯酸酐，常温下搅拌反应12-72小时；
将反应后的溶液透析24-72小时，冻干得到甲基丙烯酸酐修饰的丝胶。
）制备丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液
将步骤2）中得到的甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶于去离子水中制成10-20 %（W/V， g/mL）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶液；
将氧化石墨烯溶于去离子水中制成2.0-8.0 mg/mL的氧化石墨烯分散液，超声10-30分钟使其与水分散均匀；
将超声分散的氧化石墨烯分散液分别按0.1-2.0 mg/mL的浓度与甲基丙烯酸修饰的丝胶蛋白溶液配成质量比为1:1500-1:75的混合溶液；
4）制备光引发剂Irgacure 2959溶液
称取1-10 g Irgacure 2959粉末溶于10-1000 mL去离子水中，金属浴60-80 ℃加热10-30分钟，配制成浓度为0.1-1 % (W/V) Irgacure 2959溶液；
5）制备丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶
按1:0.01-0.1的体积比将3)中得到的丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液与0.5-10%Irgacure 2959溶液充分混匀，通过紫外光照射得到丝胶蛋白氧化石墨烯复合水凝胶。
进一步的，在本申请的方案中，所述甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶液的浓度为0.1-0.5 g/mL。
更进一步的，在本申请的方案中，丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液中氧化石墨烯的浓度为0.1-2.0 mg/mL。
更进一步的，在本申请的方案中，所述Irgacure 2959溶液的浓度为0.005-0.1 g/mL 。
更进一步的，在本申请的方案中，使用的紫外光照射强度为1-20 mV/cm2。
更进一步的，在本申请的方案中，使用的紫外光照射时间为1-10 min。
本发明的方案具有以下优点：
1）本发明以丝素缺失型突变蚕茧为原料，采用高温碱提法提取出丝胶，而后在丝胶上修饰甲基丙烯酸酐增加其交联位点，甲基丙烯酸修饰的丝胶可采用过滤的方式进行灭菌，并通过冻干的方式长期保存。
2）本发明首次将甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白与不同浓度梯度的氧化石墨烯溶液进行混合，利用紫外光交联制备成不同比例的复合水凝胶，制备方法简单可行。同时该复合水凝胶兼具丝胶蛋白的良好生物相容性和生物可降解性以及氧化石墨烯的高机械强度和成骨诱导作用，可用于药物及细胞的搭载，以及组织工程修复等方面的研究。
3）本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶可通过控制丝胶修饰甲基丙烯酸酐的取代度、修饰后的丝胶溶液浓度、氧化石墨烯的浓度、光引发剂的用量以及反应温度来控制成胶速度。
4）本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶可作为一种自发荧光的示踪材料，其荧光性能可通过丝胶蛋白和氧化石墨烯的剂量比进行调控，并可通过皮下注射或肌肉注射注入体内进行材料的体内示踪。
5）本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶作为细胞载体，能够促进细胞黏附增殖，同时可通过皮下注射注入体内进行相关治疗。
6）本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶具有良好的骨修复功能。
7）本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶具有良好的软组织修复功能。
8）本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶可通过控制加入的石墨烯的量对水凝胶力学性能进行调控，用于制备不同组织损伤修复材料。
附图说明
图1A为不同比例的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶实物图。
图1B为不同比例的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）的压缩模量统计。
图1C为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）冻干支架的红外光谱。
图1D为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）的体外降解曲线。
图2为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）冻干支架的扫描电镜。
图3A为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）冻干支架荧光图。
图3B、C、D为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）的荧光光谱。
图4为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）的体内荧光成像。
图5为BMSCs种植于丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）表面的形态图。
图6为丝胶/氧化石墨烯混合溶液促BMSCs的增殖统计图。
图7为丝胶/氧化石墨烯混合溶液调控BMSCs成骨基因ALP、OCN、Col表达统计图。
图8为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）修复大鼠颅骨损伤不同时间点的microCT图。
图9为丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）修复大鼠颅骨损伤不同时间点的HE染色图。
具体实施方式
实施例1 本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备
步骤1）丝胶蛋白的提取
1)称取10 g丝素缺失型突变蚕茧140 N-ds，剪成1 cm2的碎片，置于干净烧杯中，用去离子水清洗3遍，离心去除多余水分；
2)将步骤1）中得到的蚕茧碎片加入到200-400 mL摩尔浓度为 0.02 mol/L的Na2CO3溶液中， 100 ℃水浴锅中搅拌反应1小时，使丝胶完全溶解，得到丝胶溶液；
3)将步骤2）中得到的丝胶溶液置于50 mL离心管中3500 rpm离心5分钟，去除不溶性沉淀，得到澄清的丝胶溶液；
4)将步骤3）中得到的丝胶溶液加入到截留分子量为3.5 kDa的透析袋中，置于含1 L去离子水中的烧杯中搅拌透析，每隔6小时换一次水，透析2-3天，得到纯丝胶溶液；
5)将步骤4）中得到的丝胶溶液置于50 mL离心管中，3500 rpm离心5分钟，去除不溶性沉淀；
6)将步骤5）中得到的丝胶溶液冻干，置于-20 ℃冰箱保存。
步骤2）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶的制备
1)称取5 g丝胶粉末完全溶解于30 mL磷酸盐缓冲液 (pH 8.5)中；
2)称取2.93 g甲基丙烯酸酐加入到步骤1）中的溶液中，室温搅拌反应24小时；
3)将步骤2）得到的溶液置于截留分子量为3.5 kDa的透析袋中，放置于含1 L去离子水的烧杯中；将该烧杯置于搅拌器上缓慢搅拌透析，每隔6小时换一次水，透析2-3天，得到甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白溶液；
4)将步骤3）中得到的甲基丙烯酸酐修饰的丝胶冻干置于-20 ℃冰箱保存。
步骤3）丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液的制备
1)称取3 g甲基丙烯酸酐修饰的丝胶粉末溶于20 mL去离子水中制成15 %（W/V）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶液；
2)称取40 mg氧化石墨烯溶于10 mL去离子水中制成4 mg/mL的氧化石墨烯分散液，超声10-30分钟使其分散均匀；
3)将氧化石墨烯分散液按0.1 mg/mL的浓度与甲基丙烯酸修饰的丝胶溶液充分混合。
步骤4）制备光引发剂Irgacure 2959溶液
1)称取1 g Irgacure 2959粉末溶于100 mL去离子水中；
2)将该混合液体置于60-80 ℃金属浴加热1小时使Irgacure 2959完全溶解，配制成浓度为1 % (W/V) Irgacure 2959溶液。
步骤5）丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备
1)按照体积比:将丝胶/氧化石墨烯复合溶液与Irgacure 2959溶液按体积比5:1-20:1的比例充分混匀；
2)将步骤1）中的混合液置于紫外光照射下 ( 6 mV/cm2，4 min)得到丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶。
实施例2 本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备
本实施例中丝胶/氧化石墨烯混合溶液与实施例1的制备方法相同，不同之处在于，步骤3）按以下进行：
1)称取3 g甲基丙烯酸酐修饰的丝胶粉末溶于20 mL去离子水中制成15 %（W/V）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶液；
2)称取40 mg氧化石墨烯分散于10 mL去离子水中制成4 mg/mL的氧化石墨烯分散液，超声10-30分钟使其分散均匀；
3)将超声分散的氧化石墨烯分散液与甲基丙烯酸修饰的丝胶蛋白溶液按体积比1:17的比例配成混合溶液，具体即200μL体系中含4 mg/mL 氧化石墨烯10 μL及15 %丝胶溶液170 μL；
4)将Irgacure 2959粉末溶于去离子水中配成1 % (W/V)的溶液；
5)每200 μL反应体系加入20 μL 1% Irgacure 2959溶液；
6)充分搅拌混匀后置于紫外光照射（6 mV/cm2，4 min）得到丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶SerMA/GO-1。
实施例3 本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备
本实施例中丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液与实施例1的制备方法相同，不同之处在于，步骤3）按以下进行：
1)称取3 g甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白粉末溶于20 mL去离子水中制成15 %（W/V）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白溶液；
2)称取40 mg氧化石墨烯溶于10 mL去离子水中制成4 mg/mL的氧化石墨烯分散液，超声10-30分钟使其与水分散均匀；
3)将超声分散的氧化石墨烯分散液与甲基丙烯酸修饰的丝胶蛋白溶液按体积比1:8的比例配成混合溶液，具体即200μL体系中含4 mg/mL 氧化石墨烯20 μL及15 %丝胶蛋白溶液160 μL；
4)将Irgacure 2959粉末溶于去离子水中配成1 % (W/V)的溶液；
5)每200 μL反应体系加入20 μL 1% Irgacure 2959溶液；
6)充分搅拌混匀后置于紫外光照射（6 mV/cm2，4 min）得到丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶SerMA/GO-2。
实施例4 本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备
本实施例中丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液与实施例1的制备方法相同，不同之处在于，步骤3）按以下进行：
1)称取3 g甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白粉末溶于20 mL去离子水中制成15 %（W/V）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白溶液；
2)称取40 mg氧化石墨烯溶于10 mL去离子水中制成4 mg/mL的氧化石墨烯分散液，超声10-30分钟使其与水分散均匀；
3)将超声分散的氧化石墨烯分散液与甲基丙烯酸修饰的丝胶蛋白溶液按体积比2:7的比例配成混合溶液，具体即200 μL体系中含4 mg/mL 氧化石墨烯40 μL及15 %丝胶蛋白溶液140 μL；
4)将Irgacure 2959粉末溶于去离子水中配成1 % (W/V)的溶液；
5)每200 μL反应体系加入20 μL 1% Irgacure 2959溶液；
6)充分搅拌混匀后置于紫外光照射（6 mV/cm2，4 min）得到丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶。
实施例5 本发明提供的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备
本实施例中丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液与实施例1的制备方法相同，不同之处在于，步骤3）按以下进行：
1)称取3 g甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白粉末溶于20 mL去离子水中制成15 %（W/V）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白溶液；
2)称取40 mg氧化石墨烯溶于10 mL去离子水中制成4 mg/mL的氧化石墨烯分散液，超声10-30分钟使其与水分散均匀；
3)将超声分散的氧化石墨烯分散液与甲基丙烯酸修饰的丝胶蛋白溶液按体积比1:3的比例配成混合溶液，具体即200 μL体系中含4 mg/mL 氧化石墨烯50 μL及15 %丝胶蛋白溶液150 μL；
4)将Irgacure 2959粉末溶于去离子水中配成1 % (W/V)的溶液；
5)每200μL反应体系加入20 μL 1% Irgacure 2959溶液；
6)充分搅拌混匀后置于紫外光照射（6 mV/cm2，4 min）得到丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶。
实施例6 本发明提供的丝胶蛋白水凝胶的制备
本实施例中丝胶蛋白溶液与实施例1的制备方法相同，不同之处在于，步骤3）按以下进行：
1)称取3 g甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白粉末溶于20 mL去离子水中制成15 %（W/V）甲基丙烯酸酐修饰的丝胶蛋白溶液；
2)将Irgacure 2959粉末溶于去离子水中配成1 % (W/V)的溶液；
3)每200 μL反应体系加入20 μL 1% Irgacure 2959溶液；
4)充分搅拌混匀后置于紫外光照射（6 mV/cm2，4 min）得到丝胶蛋白水凝胶SerMA。
实施例7 丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架的制备
1)将制备的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2立即置于-80℃冰箱冷冻24小时；
2)将步骤1）所得样本置于真空冷冻干燥机中进行冻干，得到三种不同孔径的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架。
实施例8 丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶及冻干支架的表征测试
图1 A为本申请实施例1-6制成的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶实物图。
结果如图1 A所示，该丝胶/氧化石墨烯水凝胶整体呈浅灰色，且其颜色随着加入的氧化石墨烯的量的增加而加深。
图1 B为实施例2、3、6制成的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2的压缩模量图。
结果如图1 B所示，该丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶具有良好的机械性能，且其机械性能与氧化石墨烯含量成正比。
图1 C为实施例2、3、6制成的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2冻干支架红外光谱。
利用傅里叶变换红外光谱仪测定丝胶水凝胶以及丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架在4000-650 cm-1的特征峰。
结果如图1 C所示，从特征峰酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ可以看出，丝胶水凝胶与丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶(SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2)的红外光谱基本相同，表明它们的多肽二级结构相似，氧化石墨烯的加入不改变丝胶的天然结构。
图1 D为实施例2、3、6制成的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2的降解曲线。
将丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶浸泡于磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)中，置于37 ℃温箱中，在不同时间点取出烘干并称重，计算得到降解曲线。
结果如图1 D所示，丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶在磷酸盐缓冲液中匀速降解，在第45天时分别降解73.46%，42.60%，38.78%，且其降解速率可通过控制加入的氧化石墨烯的量进行调控。
图2为实施例2、3、6制成的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）在扫描电子显微镜下的内部结构。
结果如图2所示，在扫描电子显微镜下可观察到各浓度的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2冻干支架的内部具有大量空洞结构，且各组支架的孔洞大小和孔隙率存在差异，统计结果可知其孔径和孔隙率可通过加入的氧化石墨烯的量进行调控；同时该复合水凝胶内部的孔洞结构是它能够作为细胞及药物载体的有利条件。
实施例9 丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的体外荧光特性
1.丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）荧光特性测试
制备丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶膜,用荧光光谱测试仪检测该水凝胶膜在320 nm-600 nm波长间的荧光光谱。
丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）冻干支架荧光特性
分别制备丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）的冻干支架；用激光共聚焦显微镜观察该水凝胶冻干支架的荧光图。
结果分析
如图3B、3C、3D所示，丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶与纯丝胶水凝胶相比荧光光谱并没有发生明显的变化，说明氧化石墨烯的加入并没有影响丝胶的自发荧光特性，该复合水凝胶仍保持丝胶蛋白的荧光特性；
如图3A所示，激光共聚焦结果表明丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架仍保持丝胶的荧光特性。
实施例10 丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的体内荧光示踪
1.丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）在小鼠体内荧光示踪
分别取丝胶/氧化石墨烯混合溶液（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）各200 μL通过皮下注射的方式注射到C57小鼠背部，紫外照射下（6 mV/cm2，4 min）体内成胶；1小时后用小动物活体成像仪观察其在激发光420 nm，发射光520 nm波长处的荧光分布。
实验分析
结果如图4所示，丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）在C57小鼠体内仍具有自发荧光特性，可利用该荧光特性进行体内荧光示踪。
实施例11 丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶细胞相容性测试
1.BMSCs的黏附实验
取丝胶/氧化石墨烯混合溶液（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）各200 μL置于96孔细胞板中，紫外照射下（6 mV/cm2，4 min）成胶；将骨髓间充质干细胞BMSCs植于复合水凝胶表面，每孔细胞数约6000；第1、2、3、5天在显微镜下观察细胞在各复合水凝胶上的形貌。
实验结果
结果如图5所示，丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶（SerMA、SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）可支持细胞在其上表面黏附并长期增殖生长，表面其具有良好的细胞相容性。
实施例12促细胞增殖的实验
1.丝胶/氧化石墨烯混合溶液对BMSCs的促增殖实验
将骨髓间充质干细胞BMSCs植于96孔细胞培养板中，每孔细胞数约6000，于37 ℃，5 %CO2培养箱中培养24小时；吸出原培养基，将丝胶蛋白粉末和氧化石墨烯混合溶于无血清IMDM培养基中制成IMDM+10%FBS、IMDM+0%FBS、IMDM+0.2%SerMA/GO、IMDM+0.4%SerMA/GO、IMDM+0.8%SerMA/GO、IMDM+1.0%SerMA/GO这5组与细胞进行共孵育；培养24、48小时后采用MTT法检测细胞活力变化。
实验结果
结果如图6所示，丝胶/氧化石墨烯混合溶液（SerMA/GO-1、SerMA/GO-2）可促进BMSCs的增殖生长，并可部分替代血清的作用,表明其具有促细胞增殖的作用。
实施例13促进细胞成骨分化的实验
1.丝胶/氧化石墨烯混合溶液促进BMSCs的成骨分化实验
将骨髓间充质干细胞BMSCs消化植于6孔细胞培养板中，每孔细胞数约60000，于37 ℃，5 % CO2培养箱中培养24小时；吸出原培养基，将丝胶/氧化石墨烯混合溶于含10% FBS的IMDM培养基中制成IMDM+SerMA、IMDM+SerMA/GO、IMDM+GO这3组与细胞进行共孵育；培养24小时后收集并提取各组细胞的RNA，采用RT-qPCR法检测成骨基因ALP、OCN、Col的表达。
实验结果
结果如图7所示，丝胶/氧化石墨烯混合溶液可有效上调细胞中成骨基因的表达，表明其具有促细胞成骨分化的作用。
实施例14 丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶应用于骨缺失修复
1.SD大鼠颅骨损伤模型的构建
采用10%水合氯醛溶液腹腔注射对SD大鼠进行麻醉，剪去其头部毛发，酒精消毒，铺无菌巾；取大鼠颅骨正中纵行切口，逐层切开皮肤及皮下组织，暴露颅骨；于颅骨中缝外下象限用钻头钻出直径4 mm的圆形颅骨全层缺损，避免伤及脑膜。
丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶应用于骨缺失修复
将消毒后的无菌丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶植入颅骨缺损处，固定后碘酒消毒，缝合伤口；术后第4、8、12周分别处死大鼠，取其颅骨组织进行microCT 重构和HE切片染色。
实验结果
结果如图8、图9所示，丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶组大鼠颅骨的伤口尺寸在手术后第4、8、12周时明显小于空白组，此外HE结果也显示其恢复效果良好；结果证明丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶具有良好的促进骨损伤修复的作用，可作为骨组织工程材料应用于骨缺失的临床治疗。

Claims (10)

1.一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1）提取和纯化丝胶蛋白
称取1-5 g丝素缺失型蚕茧，剪碎，用去离子水清洗后去除水分，将其置于20-1000 mL浓度为0.01-0.02 mol/L的Na2CO3溶液中，80-100 ℃条件下搅拌反应0.5-1小时，使丝胶完全溶解；
离心去除上述溶液中的不溶性沉淀，收集上清透析2-3天，得到澄清的丝胶溶液；冻干得到丝胶蛋白粉末；
2）制备甲基丙烯酸酐修饰的丝胶
将步骤1）中得到的丝胶蛋白粉末以0.02-1 g/mL的比例完全溶解于10-100 mL的 pH7-10的磷酸缓冲液中，搅拌使其完全溶解；
按照每1 g丝胶蛋白粉末对应0.146-2.344 g的比例加入甲基丙烯酸酐，常温下搅拌反应12-72小时；
将反应后的溶液透析24-72小时，冻干得到甲基丙烯酸酐修饰的丝胶；
3）制备丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液
将步骤2）中得到的甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶于去离子水中制成10-20 g/100mL甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶液；
将氧化石墨烯溶于去离子水中制成2.0-8.0 mg/mL的氧化石墨烯分散液，超声10-30分钟使其与水分散均匀；
将上述超声分散的氧化石墨烯分散液与甲基丙烯酸修饰的丝胶蛋白溶液配成质量比为1:1500-1:75的混合溶液；
4）制备光引发剂Irgacure 2959溶液
称取1-10 g Irgacure 2959粉末溶于10-1000 mL去离子水中，金属浴60-80 ℃加热10-30分钟，配制成浓度为0.1-10 g/100 mL的Irgacure 2959溶液；
5）制备丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶
按1:0.01-0.1的体积比将3)中得到的丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液与4) 中所述Irgacure 2959溶液充分混匀，通过紫外光照射得到丝胶蛋白/氧化石墨烯复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述甲基丙烯酸酐修饰的丝胶溶液的浓度为0.1-0.5 g/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：丝胶蛋白氧化石墨烯混合溶液中氧化石墨烯的浓度为0.1-2.0 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Irgacure 2959溶液的浓度为0.005-0.1 g/mL 。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：使用的紫外光照射强度为1-20 mV/cm2。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：使用的紫外光照射时间为1-10 min。
7.由权利要求1-6所述的任意制备方法制得的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶。
8.权利要求7所述的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶在制备人体组织修复材料中的应用。
9.权利要求7所述的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶在制备骨损伤修复材料中的应用。
10.一种丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架，由下法制得：
将权利要求7所述的丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶置于-80 ℃冰箱冷冻24小时；
将步骤1）所得冷冻物置于真空冷冻干燥机中进行冻干，得到丝胶/氧化石墨烯复合水凝胶冻干支架。
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